CN108444876B - 一种纳米颗粒表面吸附蛋白配体状态的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种纳米颗粒表面吸附蛋白配体状态的测定方法，所述方法通过计算出标准比对值D0，然后通过将待测表面吸附蛋白配体的纳米颗粒分散液的待测比对值D1与之比较，判定纳米颗粒表面吸附蛋白配体状态。本发明通过测定了包覆有配体的纳米颗粒表面配体个数，获得了配体的存在状态，为研究纳米颗粒与蛋白的相互作用，以及研究吸附蛋白的生物活性起到了关键作用；测试方法简单，重复性好，偏差小。
Description
技术领域
本发明涉及纳米颗粒检测领域，具体涉及一种纳米颗粒表面吸附蛋白配体状态的测定方法。
背景技术
CPS离心粒度仪为圆盘离心式纳米粒度分析仪，采用的是差示沉淀法进行颗粒粒度的测量和分析。CPS离心粒度仪在高速旋转的离心转盘中建立起梯度溶液，常用的梯度液是蔗糖的水溶液，测试步骤具体为：
(1)配制梯度溶液：准备两种不同浓度的梯度液，并按照不同比例混合两种浓度的溶液从而配制梯度溶液；
(2)建立梯度：先向旋转的转盘中注入高浓度溶液，并依次逐步降低注入溶液浓度，最后注入最低浓度梯度液；在转盘中外侧溶液浓度高、内侧溶液浓度低，由于高速旋转，不同浓度溶液短时间(可维持8小时)内可保持梯度而不会混合；
(3)上样测试：待梯度液稳定后用进样注射器将样品从转盘中间进样口加入，颗粒由中心向周围沉降；由于大颗粒沉降较快，小颗粒沉降较慢，通过检测沉降速度，得到样品的粒度分布信息。
根据斯托克斯定律(Stokes Law)，如果颗粒在液体内的一个重力场中沉淀，沉淀速度与颗粒粒度直径的平方成正比，粒度相差百分之几的颗粒之间都会有非常显著的沉淀速度差，因而该方法测试粒度分辨力高。该方法测试得到的粒度值一般统称为stokes粒径。
CPS离心粒度仪测试系统在一般情况下可以分辨粒度差别小于5％的颗粒，最小可分辨的粒度差为2％，这比同类其他分析方法的精度都要高很多。CPS标定颗粒的大小是通过直接物理测量方法校正过的，而且标定颗粒都与美国标准和技术研究院NIST的其它标准进行过交叉对比，确保均值、峰值宽度或者半峰宽度等方面的误差在±2％之内。
尺寸在1～100nm范围内的纳米颗粒在生物成像、药物输送、癌症治疗等重要领域都有很重要的应用前景。由于纳米颗粒具有极高的比表面积，因此其具有非常活跃的表面化学性，故当纳米颗粒进入到生物体液中就很容易被覆盖一层复杂的生物分子(如蛋白质，天然有机高分子，表面活性剂，酶等)，形成生物分子包覆层，这些生物分子可称为纳米颗粒的表面配体。该配体改变了纳米颗粒的表面性质，影响了纳米颗粒与生物体液环境的相互作用。因此，研究纳米颗粒表面吸附的配体状态对纳米颗粒在生物系统中的应用有着至关重要的作用。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种纳米颗粒表面吸附蛋白配体状态的测定方法，所述方法包括如下步骤：
(1)配制浓度为1011个/L的裸纳米颗粒分散液，并在梯度溶液中，采用CPS离心粒度仪测定裸纳米颗粒的stokes粒径dc；
(2)配制系列的至少12个标准蛋白配体分散液，并记录每个标准蛋白配体分散液的摩尔浓度C；
(3)将裸纳米颗粒分散液分别与每个标准蛋白配体分散液混合，制备系列标准表面吸附蛋白配体的纳米颗粒分散液；
(4)对于系列标准表面吸附蛋白配体的纳米颗粒分散液，测量其中每个表面吸附蛋白配体的纳米颗粒分散液的纳米颗粒表面吸附蛋白配体的平均个数N，测定方法为：
在与步骤(1)相同的梯度溶液中，采用CPS离心粒度仪测定所述标准表面吸附蛋白配体的纳米颗粒的表观stokes粒径d；
根据式(I)计算配体层的厚度Δl：
其中，d是标准表面吸附蛋白配体的纳米颗粒的表观stokes粒径；dc是裸纳米颗粒的stokes粒径；Δl是配体层的厚度；ρs是裸纳米颗粒的材质密度；ρp为梯度溶液的平均密度；
根据式(II)计算蛋白配体的个数N：
其中，Rc是标准表面吸附蛋白配体的纳米颗粒的总体粒径，其中Rc＝dc+2Δl；dc是裸纳米颗粒的stokes粒径；Mr是配体的分子量，ρ是配体蛋白的密度，NA是阿伏伽德罗常数；
(5)用纳米颗粒的理论表面积除以蛋白配体的平铺横截面积为蛋白分子全部为平铺状态吸附在纳米颗粒表面时的理论个数，记为A；
绘制系列蛋白配体分散液的摩尔浓度的对数值与蛋白配体的个数N的关系曲线，并记录曲线与y＝A的交叉点的横坐标，并换算为蛋白配体分散液的浓度，记为B0；
根据式(III)得到标准比对值D0：
D0＝B0×NA/1011 式(III)；
其中，NA是阿伏伽德罗常数，D0为标准比对值，B0是蛋白配体分散液的浓度，mol/L；
(6)判定步骤：
待判定表面吸附蛋白配体的纳米颗粒分散液中，蛋白配体的摩尔浓度为B’1，纳米颗粒的个数浓度为B’2，根据式(IV)计算待测比对值D1：
D1＝B’1×NA/B’2 式(IV)；
其中，NA是阿伏伽德罗常数，D1为待测比对值，B’1是待判定表面吸附蛋白配体的纳米颗粒分散液中蛋白配体的摩尔浓度，mol/L；B’2是待判定表面吸附蛋白配体的纳米颗粒分散液中纳米颗粒的个数浓度，个/L；
当D1大于D0时，纳米颗粒表面吸附蛋白配体状态为平铺和垂直同时存在；
当D1小于D0时，纳米颗粒表面吸附蛋白配体状态为平铺。
本发明所述标准蛋白配体分散液意指作为蛋白配体分散液的浓度对数值-配体的个数N的关系曲线的点值，并非指国家标准的标准蛋白。
优选地，所述ρp≤0.25ρs，例如0.01ρs、0.08ρs、0.1ρs、0.13ρs、0.16ρs、0.19ρs、0.21ρs、0.24ρs等，优选ρp≤0.1ρs。
步骤(1)和步骤(2)梯度溶液的梯度个数为6～12，例如7、8、9、10、11等，优选9。
优选地，步骤(1)和步骤(4)所述CPS离心粒度仪的转速为10000～20000转/min，例如10200转/min、10900转/min、11500转/min、14600转/min、16000转/min、18500转/min、19000转/min等。
优选地，步骤(1)和步骤(4)所述CPS离心粒度仪的离心时间为5～10min，例如6min、7min、8min、9min等。
本发明步骤(1)CPS离心粒度仪测定裸纳米颗粒的stokes粒径dc过程中，裸纳米颗粒以溶液形式上样，上样量为90～110μL，优选100μL。
本发明步骤(4)CPS离心粒度仪测定所述测量其中每个表面吸附蛋白配体的纳米颗粒分散液的纳米颗粒表面吸附蛋白配体的平均个数N过程中，标准表面吸附蛋白配体的纳米颗粒分散液上样量为90～110μL，优选100μL。
优选地，所述将纳米颗粒分散液分别与每个标准蛋白配体分散液混合的体积比为1:1。
优选地，所述将纳米颗粒分散液分别与每个标准蛋白配体分散液混合的混合方式为37℃下在100转/min条件下，震荡孵育0.5h。
优选地，所述标准蛋白配体分散液的浓度范围为10-15～10-3mol/L。
优选地，所述系列标准蛋白配体分散液为在10-15～10-3mol/L浓度范围内等比设置的至少12个浓度点值。
优选地，所述纳米颗粒包括金纳米颗粒、银纳米颗粒、二氧化硅纳米颗粒中的任意1种或至少2种的组合。
优选地，所述蛋白包括胎牛血清蛋白BSA、转铁蛋白TFR中的任意1种。
作为优选技术方案，本发明所述纳米颗粒配体状态的测定方法包括如下步骤：
(1)配制浓度为1011个/L的裸纳米颗粒分散液；之后利用CPS离心粒度仪，在具有9个梯度的梯度溶液中，上样裸纳米颗粒的溶液，上样量为90～110μL，测定裸纳米颗粒的stokes粒径dc；
(2)配制系列的至少12个标准蛋白配体分散液，并记录每个标准蛋白配体分散液的摩尔浓度C；
(3)以体积比1:1的比例将裸纳米颗粒分散液分别与每个标准蛋白配体分散液混合，37℃下在100转/min条件下，震荡孵育0.5h，制备系列标准表面吸附蛋白配体的纳米颗粒分散液；
(4)对于系列标准表面吸附蛋白配体的纳米颗粒分散液，测量其中每个表面吸附蛋白配体的纳米颗粒分散液的纳米颗粒表面吸附蛋白配体的平均个数N，测定方法为：
利用CPS离心粒度仪，在与步骤(1)相同的具有9个梯度的梯度溶液中，上样系列标准表面吸附蛋白配体的纳米颗粒，上样量为90～110μL，测定所述标准表面吸附蛋白配体的纳米颗粒的表观stokes粒径d；
根据式(I)计算配体层的厚度Δl：
其中，d是标准表面吸附蛋白配体的纳米颗粒的表观stokes粒径；dc是裸纳米颗粒的stokes粒径；Δl是配体层的厚度；ρs是裸纳米颗粒的材质密度；ρp为梯度溶液的平均密度；
根据式(II)计算蛋白配体的个数N：
其中，Rc是标准表面吸附蛋白配体的纳米颗粒的总体粒径，其中Rc＝dc+2Δl；dc是裸纳米颗粒的粒径；Mr是配体的分子量，ρ是配体蛋白的密度，NA是阿伏伽德罗常数；
(5)用纳米颗粒的理论表面积除以蛋白配体的平铺横截面积为蛋白分子全部为平铺状态吸附在纳米颗粒表面时的理论个数，记为A；
绘制系列蛋白配体分散液的摩尔浓度的对数值与蛋白配体的个数N的关系曲线，并记录曲线与y＝A的交叉点的横坐标，并换算为蛋白配体分散液的浓度，记为B0；
根据式(III)得到标准比对值D0：
D0＝B0×NA/1011 式(III)；
其中，NA是阿伏伽德罗常数，D0为标准比对值，B0是蛋白配体分散液的浓度，mol/L；
(6)判定步骤：
待判定表面吸附蛋白配体的纳米颗粒分散液中，蛋白配体的摩尔浓度为B’1，纳米颗粒的个数浓度为B’2，根据式(IV)计算待测比对值D1：
D1＝B’1×NA/B’2 式(IV)；
其中，NA是阿伏伽德罗常数，D1为待测比对值，B’1是配制待判定表面吸附蛋白配体的纳米颗粒分散液使用的蛋白配体的摩尔浓度，mol/L；B’2是配制待判定表面吸附蛋白配体的纳米颗粒分散液使用的纳米颗粒的个数浓度，个/L；
当D1大于D0时，纳米颗粒表面吸附蛋白配体状态为平铺和垂直同时存在；
当D1小于D0时，纳米颗粒表面吸附蛋白配体状态为平铺。
本发明提供的纳米颗粒配体状态的测定方法所适用的纳米颗粒的粒径范围不做具体限定，只要是纳米尺寸的纳米颗粒均可用于本发明，优选所述纳米颗粒的粒径为10～120nm(例如12nm、14nm、17nm、19nm、22nm、25nm、28nm、33nm、38nm、43nm、48nm、53nm、58nm、63nm、68nm、73nm、78nm、83nm、88nm、93nm、98nm、103nm、108nm、113nm、118nm等)，更优选用于测试18～60nm粒径的纳米颗粒表面包覆配体状态的测定方法。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明通过测定了包覆有配体的纳米颗粒表面配体个数，获得了配体的存在状态，为纳米颗粒在外界环境中的存在状态的判断起到了关键作用；
(2)测试方法简单，重复性好，偏差小。
附图说明
图1是实施例1的蛋白配体分散液的浓度对数值-配体的个数N的关系曲线，曲线1―■―为18nm金颗粒表面吸附蛋白分子实验测量值，曲线2―――为y＝A；
图2是实施例2的蛋白配体分散液的浓度对数值-配体的个数N的关系曲线，曲线1―■―为29nm金颗粒表面吸附蛋白分子实验测量值，曲线2―――为y＝A；
图3是实施例3的蛋白配体分散液的浓度对数值-配体的个数N的关系曲线，曲线1―■―为39nm金颗粒表面吸附蛋白分子实验测量值，曲线2―――为y＝A；
图4是实施例4的蛋白配体分散液的浓度对数值-配体的个数N的关系曲线，曲线1―■―为58nm金颗粒表面吸附蛋白分子实验测量值，曲线2―――为y＝A。
具体实施方式
为便于理解本发明，本发明列举实施例如下。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
一种包覆有胎牛血清蛋白(BSA)配体的18nm粒径的金纳米颗粒(GNP)表面配体层厚度的测定方法，所述方法包括如下步骤：
第一步，测定标准比对值D0：
(1)配制梯度溶液，并建立梯度：
配制16wt％的蔗糖水溶液，密度为1.06g/cm3；之后以该浓度为中间值配制9个梯度的梯度溶液，浓度分别为8％、10％、12％、14％、16％、18％、20％、22％、24％；
开启CPS的转盘旋转，由高到低依次注入梯度溶液，从而建立梯度；
(2)制备裸纳米金颗粒的水分散液：
取500μL的GNP，再加500μL超纯水稀释，并超声分散，得到浓度为1011个/mL的GNP分散液；
(3)上样测定裸纳米金颗粒的粒径：
待步骤(1)的梯度液稳定后，用进样注射器从转盘中间注入100μL的裸纳米金颗粒的水分散液进行上样，裸纳米金颗粒由中心向周围沉降，读取CPS测得的裸纳米金颗粒的stokes粒径dc为18nm，重复测试偏差约0.5％；
(4)配制浓度为依次为10-15mol/L、10-14mol/L、10-13mol/L、10-12mol/L、10-11mol/L、10-10mol/L、10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L、10-4mol/L、10-3mol/L的13个系列标准胎牛血清蛋白配体分散液；
(5)裸纳米金颗粒表面包覆胎牛血清蛋白配体：
以体积比1:1混合步骤(2)的裸纳米金颗粒的水分散液和浓度依次为10-15mol/L、10-14mol/L、10-13mol/L、10-12mol/L、10-11mol/L、10-10mol/L、10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L、10-4mol/L、10-3mol/L的13个系列标准胎牛血清蛋白水溶液，37℃下在100转/min条件下，震荡孵育0.5h，得到系列标准GNP@BSA(表面吸附胎牛血清蛋白配体的纳米金颗粒)的分散液；
(5)测定纳米颗粒表面吸附蛋白配体的总个数N，测定方法为：
在与步骤(1)相同的梯度溶液中，用进样注射器从转盘中间注入100μL的GNP@BSA分散液进行上样，GNP@BSA由中心向周围沉降，读取CPS测得的表观stokes粒径d依次为17.3nm、17.0nm、17.0nm、17.0nm、17.0nm、17.0nm、17.0nm、17.0nm、17.0nm、16.0nm、15.0nm、15.0nm、15nm(分别对应于10-15mol/L、10-14mol/L、10-13mol/L、10-12mol/L、10-11mol/L、10- 10mol/L、10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L、10-4mol/L的胎牛血清蛋白水溶液)，重复测试偏差约0.5％；
带入公式
计算得配体层厚度Δl为0.7472nm、1.1601nm、1.1601nm、1.1601nm、1.1601nm、1.1601nm、1.1601nm、1.1601nm、1.1601nm、2.6000nm、4.438nm、4.438nm、4.438nm(分别对应于10- 15mol/L、10-14mol/L、10-13mol/L、10-12mol/L、10-11mol/L、10-10mol/L、10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L、10-4mol/L、10-3mol/L的胎牛血清蛋白水溶液)；
继续带入公式
计算配体的个数N为10、16、16、16、16、16、16、16、16、43、88、88、88(对应于10-15mol/L、10-14mol/L、10-13mol/L、10-12mol/L、10-11mol/L、10-10mol/L、10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L、10-4mol/L、10-3mol/L的胎牛血清蛋白水溶液)；
(5)用纳米颗粒的理论表面积除以蛋白配体的平铺横截面为蛋白分子全部平铺在纳米颗粒表面时的理论个数，记为A＝18；
绘制蛋白配体分散液的浓度对数值-配体的个数N的关系曲线(如图1)，并记录曲线与y＝A的交叉点的横坐标，并换算为蛋白配体分散液的近似浓度10-7mol/L，记为B0；
根据D0＝B0×NA/1011计算标准比对值D0为105；
第二步，测定待测表面吸附蛋白配体的纳米颗粒分散液：
(1)配制GNP@BSA分散液，步骤为：
取500μL的粒径为18nm的GNP，再加500μL超纯水稀释，并超声分散，得到浓度为1011个/mL的GNP分散液；
配制浓度为10-9mol/L的胎牛血清蛋白配体分散液；
以体积比1:1混合裸纳米金颗粒的水分散液和浓度为10-9mol/L的胎牛血清蛋白水溶液，37℃下在100转/min条件下，震荡孵育0.5h，得到GNP@BSA(表面吸附胎牛血清蛋白配体的纳米金颗粒)的分散液；
按照D1＝B’1×NA/B’2分别计算GNP@BSA分散液的D1值为103，并进行判定D1小于D0，结果为纳米颗粒表面吸附蛋白配体状态为平铺。
实施例2～4提供了与实施例1类似的包覆有胎牛血清蛋白(BSA)配体的金纳米颗粒(GNP)配体状态的测定方法，所述方法与实施例1的区别仅在于步骤(3)纳米金裸颗粒的粒径依次为29nm、39nm和58nm经测定，依次计算配体的个数，29nm GNP表面吸附BSA蛋白分子个数是：0、0、0、0、0、0、0、0、39、91、160、160、256；39nm GNP表面吸附BSA蛋白分子个数是：21、0、68、68、68、68、68、68、68、152、256、256、339；58nm GNP表面吸附BSA蛋白分子个数是：0、0、0、97、149、97、149、97、204、516、911、824、1002。
分别计算蛋白分子全部平铺在纳米颗粒表面时的理论个数A，具体为在29nm GNP表面吸附的理论蛋白分子数目是47；在39nm GNP表面吸附的理论蛋白分子数目是85；在58nm GNP表面吸附的理论蛋白分子数目是193。
依次绘制蛋白配体分散液的浓度对数值-配体的个数N的关系曲线，并记录曲线与y＝A的交叉点的横坐标，并换算为蛋白配体分散液的近似浓度10-7mol/L，记为B0；如图2(实施例2)、图3(实施例3)、图4(实施例4)、所示。
根据D0＝B0×NA/1011计算标准比对值D0为105。
判定例1：
取500μL的粒径为29nm的GNP，再加500μL超纯水稀释，并超声分散，得到浓度为1011个/mL的GNP分散液；
配制浓度为10-5mol/L的胎牛血清蛋白配体分散液；
以体积比1:1混合裸纳米金颗粒的水分散液和浓度为10-5mol/L的胎牛血清蛋白水溶液，37℃下在100转/min条件下，震荡孵育0.5h，得到GNP@BSA(表面吸附胎牛血清蛋白配体的纳米金颗粒)的分散液。
按照D1＝B’1×NA/B’2计算GNP@BSA分散液的D1值是107，并进行判定D1大于D0，结果为纳米颗粒表面吸附蛋白配体状态为平铺和垂直同时存在。
判定例2：
取500μL的粒径为39nm的GNP，再加500μL超纯水稀释，并超声分散，得到浓度为1011个/mL的GNP分散液；
配制浓度为10-6mol/L的胎牛血清蛋白配体分散液；
以体积比1:1混合裸纳米金颗粒的水分散液和浓度为10-6mol/L的胎牛血清蛋白水溶液，37℃下在100转/min条件下，震荡孵育0.5h，得到GNP@BSA(表面吸附胎牛血清蛋白配体的纳米金颗粒)的分散液。
按照D1＝B’1×NA/B’2计算GNP@BSA分散液的D1值是106，并进行判定D1大于D0，结果为纳米颗粒表面吸附蛋白配体状态为平铺和垂直同时存在。
判定例3：
取500μL的粒径为58nm的GNP，再加500μL超纯水稀释，并超声分散，得到浓度为1011个/mL的GNP分散液；
配制浓度为10-6mol/L的胎牛血清蛋白配体分散液；
以体积比1:1混合裸纳米金颗粒的水分散液和浓度为10-4mol/L的胎牛血清蛋白水溶液，37℃下在100转/min条件下，震荡孵育0.5h，得到GNP@BSA(表面吸附胎牛血清蛋白配体的纳米金颗粒)的分散液。
按照D1＝B’1×NA/B’2计算GNP@BSA分散液的D1值是108，并进行判定D1大于D0，结果为纳米颗粒表面吸附蛋白配体状态为平铺和垂直同时存在。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺设备和工艺流程，但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程，即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺设备和工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (16)
1.一种纳米颗粒表面吸附蛋白配体状态的测定方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)配制浓度为1011个/L的裸纳米颗粒分散液，并在梯度溶液中，采用CPS离心粒度仪测定裸纳米颗粒的stokes粒径dc；
(2)配制系列的至少12个标准蛋白配体分散液，并记录每个标准蛋白配体分散液的摩尔浓度C；
(3)将裸纳米颗粒分散液分别与每个标准蛋白配体分散液混合，制备系列标准表面吸附蛋白配体的纳米颗粒分散液；
(4)对于系列标准表面吸附蛋白配体的纳米颗粒分散液，测量其中每个表面吸附蛋白配体的纳米颗粒分散液的纳米颗粒表面吸附蛋白配体的平均个数N，测定方法为：
在与步骤(1)相同的梯度溶液中，采用CPS离心粒度仪测定所述标准表面吸附蛋白配体的纳米颗粒的表观stokes粒径d；
根据式(I)计算配体层的厚度Δl：
其中，d是标准表面吸附蛋白配体的纳米颗粒的表观stokes粒径；dc是裸纳米颗粒的stokes粒径；Δl是配体层的厚度；ρs是裸纳米颗粒的材质密度；ρp为梯度溶液的平均密度；
根据式(II)计算蛋白配体的个数N：
其中，Rc是标准表面吸附蛋白配体的纳米颗粒的总体粒径，其中Rc＝dc+2Δl；dc是裸纳米裸颗粒的stokes粒径；Mr是配体的分子量，ρ是配体蛋白的密度，NA是阿伏伽德罗常数；
(5)用纳米颗粒的理论表面积除以蛋白配体的平铺横截面积为蛋白分子全部为平铺状态吸附在纳米颗粒表面时的理论个数，记为A；
绘制系列蛋白配体分散液的摩尔浓度的对数值与蛋白配体的个数N的关系曲线，并记录曲线与y＝A的交叉点的横坐标，并换算为蛋白配体分散液的浓度，记为B0；
根据式(III)得到标准比对值D0：
D0＝B0×NA/1011 式(III)；
其中，NA是阿伏伽德罗常数，D0为标准比对值，B0是蛋白配体分散液的浓度，mol/L；
(6)判定步骤：
待判定表面吸附蛋白配体的纳米颗粒分散液中，蛋白配体的摩尔浓度为B’1，纳米颗粒的个数浓度为B’2，根据式(IV)计算待测比对值D1：
D1＝B’1×NA/B’2 式(IV)；
其中，NA是阿伏伽德罗常数，D1为待测比对值，B’1是配制待判定表面吸附蛋白配体的纳米颗粒分散液使用的蛋白配体分散液的摩尔浓度，mol/L；B’2是配制待判定表面吸附蛋白配体的纳米颗粒分散液使用的纳米颗粒分散液的个数浓度，个/L；
当D1大于D0时，纳米颗粒表面吸附蛋白配体状态为平铺和垂直同时存在；
当D1小于D0时，纳米颗粒表面吸附蛋白配体状态为平铺。
2.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述ρp≤0.25ρs；
步骤(1)和步骤(4)梯度溶液的梯度个数为6～12。
3.如权利要求2所述的测定方法，其特征在于，所述ρp≤0.1ρs；
步骤(1)和步骤(4)梯度溶液的梯度个数为9。
4.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(4)所述CPS离心粒度仪的转速为10000～20000转/min。
5.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(4)所述CPS离心粒度仪的离心时间为5～10min。
6.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤(1)CPS离心粒度仪测定裸纳米颗粒的stokes粒径dc过程中，裸纳米颗粒分散液上样量为90～110μL。
7.如权利要求6所述的测定方法，其特征在于，步骤(1)CPS离心粒度仪测定裸纳米颗粒的stokes粒径dc过程中，裸纳米颗粒分散液上样量为100μL。
8.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤(4)CPS离心粒度仪测定所述测量其中每个表面吸附蛋白配体的纳米颗粒分散液的纳米颗粒表面吸附蛋白配体的平均个数N过程中，标准表面吸附蛋白配体的纳米颗粒分散液上样量为90～110μL。
9.如权利要求8所述的测定方法，其特征在于，步骤(4)CPS离心粒度仪测定所述测量其中每个表面吸附蛋白配体的纳米颗粒分散液的纳米颗粒表面吸附蛋白配体的平均个数N过程中，标准表面吸附蛋白配体的纳米颗粒分散液上样量为100μL。
10.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述将裸纳米颗粒分散液分别与每个标准蛋白配体分散液混合的体积比为1:1。
11.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述将裸纳米颗粒分散液分别与每个标准蛋白配体分散液混合的混合方式为37℃下在100转/min条件下，震荡孵育0.5h。
12.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述标准蛋白配体分散液的浓度范围为10-15～10-3mol/L。
13.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述系列标准蛋白配体分散液为在10-15～10-3mol/L浓度范围内等比设置的至少12个浓度点值。
14.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述纳米颗粒包括金纳米颗粒、银纳米颗粒、二氧化硅纳米颗粒中的任意1种或至少2种的组合。
15.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述蛋白包括胎牛血清蛋白BSA、转铁蛋白TFR中的任意1种。
16.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)配制浓度为1011个/L的裸纳米颗粒分散液；之后利用CPS离心粒度仪，在具有9个梯度的梯度溶液中，上样裸纳米颗粒的溶液，上样量为90～110μL，测定裸纳米颗粒的stokes粒径dc；
(2)配制系列的至少12个标准蛋白配体分散液，并记录每个标准蛋白配体分散液的摩尔浓度C；
(3)以体积比1:1的比例将裸纳米颗粒分散液分别与每个标准蛋白配体分散液混合，37℃下在100转/min条件下，震荡孵育0.5h，制备系列标准表面吸附蛋白配体的纳米颗粒分散液；
(4)对于系列标准表面吸附蛋白配体的纳米颗粒分散液，测量其中每个表面吸附蛋白配体的纳米颗粒分散液的纳米颗粒表面吸附蛋白配体的平均个数N，测定方法为：
利用CPS离心粒度仪，在与步骤(1)相同的具有9个梯度的梯度溶液中，上样系列标准表面吸附蛋白配体的纳米颗粒，上样量为90～110μL，测定所述标准表面吸附蛋白配体的纳米颗粒的表观stokes粒径d；
根据式(I)计算配体层的厚度Δl：
其中，d是标准表面吸附蛋白配体的纳米颗粒的表观stokes粒径；dc是裸纳米颗粒的stokes粒径；Δl是配体层的厚度；ρs是裸纳米颗粒的材质密度；ρp为梯度溶液的平均密度；
根据式(II)计算蛋白配体的个数N：
其中，Rc是标准表面吸附蛋白配体的纳米颗粒的总体粒径，其中Rc＝dc+2Δl；dc是裸纳米裸颗粒的粒径；Mr是配体的分子量，ρ是配体蛋白的密度，NA是阿伏伽德罗常数；
(5)用纳米颗粒的理论表面积除以蛋白配体的平铺横截面积为蛋白分子全部为平铺状态吸附在纳米颗粒表面时的理论个数，记为A；
绘制系列蛋白配体分散液的摩尔浓度的对数值与蛋白配体的个数N的关系曲线，并记录曲线与y＝A的交叉点的横坐标，并换算为蛋白配体分散液的浓度，记为B0；
根据式(III)得到标准比对值D0：
D0＝B0×NA/1011 式(III)；
其中，NA是阿伏伽德罗常数，D0为标准比对值，B0是蛋白配体分散液的浓度，mol/L；
(6)判定步骤：
待判定表面吸附蛋白配体的纳米颗粒分散液中，蛋白配体的摩尔浓度为B’1，纳米颗粒的个数浓度为B’2，根据式(IV)计算待测比对值D1：
D1＝B’1×NA/B’2 式(IV)；
其中，NA是阿伏伽德罗常数，D1为待测比对值，B’1是待判定表面吸附蛋白配体的纳米颗粒分散液中蛋白配体的摩尔浓度，mol/L；B’2是待判定表面吸附蛋白配体的纳米颗粒分散液中纳米颗粒的个数浓度，个/L；
当D1大于D0时，纳米颗粒表面吸附蛋白配体状态为平铺和垂直同时存在；
当D1小于D0时，纳米颗粒表面吸附蛋白配体状态为平铺。
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