CN105188672A - Salipro颗粒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供纳米级颗粒，包含脂质结合多肽、脂质和疏水试剂，该疏水试剂不同于该脂质，并且该脂质结合多肽是鞘脂激活蛋白类蛋白或其衍生物或截短形式。本发明还提供制备包含脂质和鞘脂激活蛋白类蛋白或其衍生物或截短形式的颗粒的方法，包括以下步骤：a)在液体环境下使鞘脂激活蛋白类蛋白或其衍生物或截短形式与溶液化的脂质接触，b)在pH5.0-10.0下使得自组装成所述颗粒。本发明还提供药物组合物，包含本发明的颗粒以用于递送疏水试剂至需要该疏水试剂的个体，本发明还包括该颗粒在预防、治疗疾病或减轻疾病严重程度中的应用，或在诊断方法、美容处理中的应用，作为疏水试剂递送颗粒、作为用于药物研发、药物筛选、膜蛋白研究的工具或作为疫苗接种制剂的应用。

Description

Salipro颗粒
技术领域
本发明涉及脂蛋白颗粒，其用作疏水试剂(如疏水性药物或膜蛋白)的递送或载体系统，本发明还涉及用于制备该盘状脂蛋白的方法。
背景技术
膜蛋白和疏水性的化合物非常难以处理，并且制药和生命科学研究和应用中具有两个主要的挑战：(i)为不可溶的疏水化合物或膜蛋白提供在水溶液中的可溶性，以及(ii)将这类疏水性物质作为治疗剂和诊断剂施用。
膜蛋白由全部ORF的大约30％编码(参见文献“WallinandvonHeijne,ProteinScience1998Apr；7(4):1029-38”)，并且由于大部分(即，大于60％)药物实际上靶向这类蛋白，因此其代表了一类重要的药物靶点(参见文献“Overingtonetal.,NatureReviewsDrugDiscovery5,993-996(December2006)”)。膜蛋白在许多生物过程中发挥重要作用，如信号转导、分子和能量运输、识别和细胞通讯。然而，当将膜蛋白从其天然脂双层环境中提取出来后，膜蛋白由于其不溶性和趋于聚集的性质而难以研究。为了维持膜蛋白的完整性，需要人造的疏水环境。在此，去垢剂胶束是最常使用的，然而其会对生物相容性产生负作用，能够对膜蛋白的活性产生不利影响，并且可能会干扰检验的实验条件。
另一个主要的药理学挑战是，施用和递送疏水性化合物和/或疏水性蛋白作为治疗剂或诊断剂。由于这些疏水性试剂的溶解度有限，它们趋于聚集，这将导致局部药物颗粒浓度高，从而会导致高的毒性、不希望的免疫反应，并且会使药物失活(参见文献“AllenandCullis,SCIENCE,303(5665):1818-1822,MAR19,2004”)。
因此，非常需要将诸如膜蛋白、药物或诊断化合物等疏水试剂纳入可溶性的颗粒中的应用。目前，解决这两个挑战的方法主要涉及脂质体和重组高密度脂蛋白(rHDL)颗粒(参见文献“ChanandBoxer,CurrentOpinioninchemicalBiology11:1-7,2007”)。
EP1596828B1公开了盘状生物活性试剂运送颗粒，包含以双带样形式紧密包围脂双层的载脂蛋白。上述颗粒的内部由脂双层的疏水区域形成。这与具有含水内部的封闭球状双层壳的脂质体不同。EP1596828B1中公开的盘状生物活性试剂运送颗粒的斯托克斯直径约为10nm，并且提出了将其用作疏水性药物如两性霉素B或喜树碱的递送载体。
EP1345959B1公开了相似类型的直径约10nm、高度约5.5nm的纳米颗粒。该颗粒为盘状，并且由(i)人工膜脚手架蛋白、(ii)磷脂双分子层和(iii)至少一种疏水性或部分疏水性膜蛋白组成。所述膜脚手架蛋白也以双带样式包围脂双层，并且是人载脂蛋白A-1的衍生物或截短形式，缺少人载脂蛋白A-1的N-末端球状结构域，其是两亲性的并且形成至少一个α螺旋，并且在水环境中会与磷脂或磷脂的混合物自组装成所述盘状的纳米颗粒。这种工程化的膜脚手架蛋白(MSP)将为纳米级盘状脂蛋白颗粒提供稳定性、尺寸均匀性以及有用的功能性。
然而，目前可用的纳米盘技术存在一些缺点，例如，在颗粒的组装过程中需要去除去垢剂。除此之外，在现有技术的方法中，由载脂蛋白衍生的MSP的紧密双带样形式提供的尺寸均匀性似乎导致了这样的代价：固定的最小颗粒尺寸，和限制了可获得的最大直径。
鞘脂激活蛋白(saposin)家族包括4种小(大约80个氨基酸)蛋白，包括鞘脂激活蛋白A到D，其与脂结合和/或相互作用，并且在鞘脂代谢中作为一些溶酶体酶的重要辅因子(参见“Bruhn,BiochemJ.(2005)389,249-257”和其所引用的文献)。据描述，鞘脂激活蛋白更偏好带负电荷的脂质和低pH值，在酸性pH环境中显示出明显提高的活性，最佳pH值为溶酶体内4.75的pH值。鞘脂激活蛋白A、B、C和D由单一的大的前体蛋白鞘脂激活蛋白原(prosaposin)通过蛋白水解作用水解而得。已经报道了鞘脂激活蛋白A、B、C和D的完整氨基酸序列、以及鞘脂激活蛋白原的基因组结构和cDNA序列(请参见“O'Brienetal.(1988)Science241,1098-1101；Furst等(1992)BiochimBiophysActa1126:1-16”)。
鞘脂激活蛋白C在酸性环境中能够诱导含磷脂的载体发生膜融合(参见“ArchivesofBiochemistryandBiophysics2003Jul1；415(1):43-53”)，其他鞘脂激活蛋白没有表现出该特征。文献“Qietal.(2009)ClinCancerRes15(18):5840–5851”报道了鞘脂激活蛋白C偶联的二油酰基磷脂酰丝氨酸纳米载体(SapC-DOPS)，其具有含水内部、大约190nm的平均直径，并且在体内表现出肿瘤靶向活性。在SapC-DOPS中，鞘脂激活蛋白C或其衍生肽作为其结合的脂质体的导向肽(homingpeptide)。鞘脂激活蛋白C而后靶向脂质体到细胞膜外叶暴露有磷酯酰丝氨酸的癌细胞。作者认为，由于溶酶体酶的细胞外泄漏而导致的癌细胞周围的独特酸性微环境使得肿瘤组织成为鞘脂激活蛋白C的最佳靶标。根据Qi等人所述，SapC-DOPS溶酶体通过以下方法制备：在N2(g)下干燥溶剂溶解的磷脂，将干燥的磷脂分散在含有纯化的鞘脂激活蛋白C的酸性缓冲液(pH5)中，在生理水溶液中将混合物稀释50倍，以及通过后续的超声处理促进纳米载体组装。
文献“Popovicetal.,PNAS,Vol.109,No.8(2012)2908-2912”报道了鞘脂激活蛋白A去垢剂盘的结构。鞘脂激活蛋白A以可溶的、脂/去垢剂-结合的状态存在。在脂质缺乏时，鞘脂激活蛋白A采取封闭的无配体(apo)构象。相反，Popovic等报道的鞘脂激活蛋白A去垢剂盘结构显示了开放构象的鞘脂激活蛋白A的两条链，其包裹了40个内部结合的去垢剂分子，它们被组织在高度有序的双层样疏水核心中。
除了鞘脂激活蛋白A去垢剂盘的结晶作用，Popovic等还描述了可溶性脂-鞘脂激活蛋白A复合物的制备，其在4.75的pH下通过需要多步的方法进行。首先，通过如下方式制备均匀级分的大单层脂质体载体：在N2(g)下干燥用氯仿溶解的脂质，通过涡旋混合将干燥的脂质分散在酸性缓冲液(50mM乙酸钠pH4.8，150mMNaCl)中，对悬浮液进行10个冻融循环，在涡旋混合器中混合5分钟，将混合物挤压通过200nm过滤器。在酸性缓冲液中将由此制备的大单层脂质体载体与纯化的鞘脂激活蛋白A混合，由此获得可溶的脂质-鞘脂激活蛋白A颗粒。该颗粒表现出窄的尺寸分布，即，大约平均3.2nm的流体动力学(斯托克斯)半径，并且每个鞘脂激活蛋白A链含有大约5:1的脂质分子。颗粒的精确大小仅适度地受到脂质与蛋白的摩尔比以及脂质体的组成的影响。无论在脂质体混合物中是否存在阴离子磷脂、胆固醇或鞘糖脂，作者均观察到了相似的3.2nm的颗粒。在所有情况下，在3.2nm斯托克斯半径的尺寸范围内观察到了单一的峰，这提示了相对窄的种类分布。因此，该文献公开的技术限制于4.75的pH值、上述颗粒大小以及包括繁复的上游脂质体制备步骤。
在该背景下，需要一种可靠且易于实施的制备稳定的特定脂蛋白-颗粒组合物的方法，以使膜蛋白和其他疏水化合物溶液化。考虑到现有技术中所公开的用于制备盘状脂蛋白颗粒的方法费事且具有多个步骤，因此尤其具有这样的需求。
多种疏水试剂能够潜在地从现有技术中记载的载脂蛋白-或鞘脂激活蛋白A-衍生的纳米盘技术中获益。然而，由于鞘脂激活蛋白A衍生颗粒具有3.2nm大小的限制，似乎(如果有的话)只有小分子可以在其中所公开的酸性pH值下被纳入所述颗粒。尽管体积大的疏水化合物和大的生物分子如(寡聚)膜蛋白能够被纳入现有技术中的载脂蛋白A衍生的纳米盘，但是可行的最大直径仍然受到这些颗粒的双带样载脂蛋白A的周长的限制。此外，10nm的载脂蛋白A衍生纳米盘对于某些应用而言可能过大。因此，需要先进的纳米盘技术和更优的具有灵活可控的尺寸范围的脂蛋白颗粒，使得能够适应待被纳入脂蛋白颗粒中的疏水试剂的各自的尺寸。这样的颗粒应当可以简单地整合膜蛋白和其他疏水组分，所述其他疏水组分例如可以为具有药学或生物学活性的化合物或诊断化合物。
发明内容
本发明所要解决的问题是提供一种纳米级脂蛋白颗粒，其大小可控和/或其大小适应于被纳入的分子的性质，并且其易于制备并且随着时间的推移能够保持均一的大小、品质和组成。
该问题通过这样的颗粒而得以解决，该颗粒包含脂质结合多肽、至少一种脂质和一种疏水试剂，其中所述疏水试剂不同于所述至少一种脂质，并且其中所述脂质结合多肽是鞘脂激活蛋白类蛋白或其衍生物或截短形式。
本发明还提供了一种药物组合物或诊断用组合物，其包含本发明所述的颗粒。
本发明还提供了用于制备包含脂质结合多肽和脂质的颗粒的方法，其中所述脂质结合多肽为鞘脂激活蛋白类蛋白或其衍生物或截短形式，并且其中所述方法包括以下步骤：在液体环境中使所述脂质结合多肽与溶液化的脂质接触；并且在pH值为5.0-10下使得自组装成所述颗粒。
最终，本发明所述颗粒能够作为疏水试剂递送载体、作为药物研发、药物筛选、膜蛋白研究的工具、以及作为疫苗接种制剂。
不限于此理论，疏水试剂与脂质以及鞘脂激活蛋白类蛋白或其衍生物或截短形式的结合看来提供了坚固的结构，其在广泛pH范围(特别是生理pH值)的水性溶液中稳定存在，并且使得能够获得比现有技术中3.2nm的鞘脂激活蛋白A衍生的脂蛋白颗粒更大的颗粒。本发明所述的颗粒是通过本发明的方法获得的，该方法在pH5.0至10下操作，这样使得能够自组装成本发明所述的颗粒。
能够通过本发明所述方法获得的鞘脂激活蛋白类蛋白-脂蛋白颗粒(本文称为“Salipro颗粒”)在多个特征上与现有技术中的颗粒不同，例如，它们具有内在的尺寸可变性，并且能够适应于待被纳入脂蛋白颗粒中的疏水试剂的各自的尺寸。
与鞘脂激活蛋白-脂蛋白颗粒应当在或接近于鞘脂激活蛋白的最佳4.75的天然pH值下进行最佳的组装的预期不同，发现在制备鞘脂激活蛋白-脂蛋白颗粒的过程中，保持更加中性或碱性的pH能够获得具有改进的性能和更广的应用范围的鞘脂激活蛋白-脂蛋白颗粒。令人惊讶的是，发现在pH从5.0到10以及存在溶液化的脂质时，纯化的鞘脂激活蛋白类蛋白或其衍生物或截短形式自组装成稳定的脂蛋白颗粒，而不需要繁琐的上游脂质体制备步骤。当尝试在鞘脂激活蛋白的最优4.75的天然pH下或者在缺乏脂质下进行颗粒的组装时，该简单且可靠的制备方法不能获得满意的结果。
本发明所述Salipro颗粒被证明在生理pH值下能够纳入各种脂质、膜蛋白和疏水化合物，从而产生在水性环境中可溶且稳定的纳米复合物。
本发明所述Salipro颗粒在经受标准离心过滤单元进行浓缩、以及冷冻和解冻时是坚固的。此外，实际实验表明本发明所述Salipro颗粒展现出一定程度的热稳定性。除此之外，可以对本发明所述颗粒进行冷冻干燥、储存和再水化，而不会观察到任何大的品质劣化。
具体实施方式
脂质结合多肽是鞘脂激活蛋白类蛋白(SAPLIP)或其衍生物或截短形式。本文所用的术语“鞘脂激活蛋白类蛋白”(SAPLIP)是本领域熟知的，并且包括脂质相互作用蛋白的鞘脂激活蛋白类蛋白(SAPLIP)家族的所有成员。SAPLIP家族的特征是具有鞘脂激活蛋白折叠，其为通过高度保守的分子内二硫键保持稳定的保守的α螺旋三维结构(参见文献“Munford等.(1995),JournalofLipidResearch,vol.36,no.8,1653–1663”和“Bruhn(2005),BiochemJ389(15):249–257”)。本发明所述的鞘脂激活蛋白类蛋白(SAPLIP)家族的成员的例子在文献“Munfordetal.(1995),JournalofLipidResearch,vol.36,no.8,1653–1663”和“Bruhn(2005),BiochemJ389(15):249–257”中有所描述，在此通过引用的方式将其全部内容并入本文。
在无配体(即，无去垢剂/无脂质)的“封闭”状态下，SAPLIP采取单体紧凑四螺旋束型结构，即，鞘脂激活蛋白折叠。该折叠可以列举以下结构：人脂激活蛋白A的封闭无配体形式的结构(蛋白数据库(PDB)ID编号:2DOB,参见“Ahnetal.(2006)ProteinSci.15:1849-1857”)或鞘脂激活蛋白C的结构(PDBID编号:1M12；参见“deAlbaetal.(2003)Biochemistry42,14729–14740”)、NK-细胞溶素的结构(PDBID编号:1NKL；参见“Liepinshetal.(1997)Nat.Struct.Biol.4,793–795”)、阿米巴穿孔素A(amoebaporeA)的结构(PDBID编号:1OF9)和颗粒溶素(granulysin)的结构(PDBID编号:1L9L；参见“Andersonetal.(2003)J.Mol.Biol.325,355–365”)，它们的结构均几乎相同并且易于重叠(super-imposable)。
SAPLIP在结合至配体(例如脂质或去垢剂分子)后发生构象变化。在配体结合“开放”构象中，SAPLIP采取V形或飞旋标形构象，暴露出与所结合的脂质接触的疏水表面。该开放构象可列举以下结构：现有技术中的鞘脂激活蛋白A去垢剂盘结构(PDBID编号:4DDJ；参见“Popovic等.,PNAS,Vol.109,No.8(2012)2908-2912”)、和结合至SDS去垢剂胶束的鞘脂激活蛋白C的结构(PDBID编号:1SN6；参见“Hawkinsetal.(2005)J.Mol.Biol.346:1381-1392”)。
在本发明的颗粒中，脂质结合多肽优选为两亲性的，其结构的一部分或多或少是亲水的并且面向水性溶剂，另一部分或多或少是疏水的并且面向所述颗粒的包含脂质的疏水中心。脂质结合多肽优选具有如下特点：具有这样的两亲性α螺旋，其具有更多的主要位于螺旋的一面上的疏水残基(如A、C、F、G、I、L、M、V、W或Y)、以及更多的位于螺旋的另一面上的极性或带电荷的残基(如D、E、N、Q、S、T、H、K或R)。
本文所述氨基酸残基的缩写如下：A,Ala,丙氨酸；V,Val,缬氨酸；L,Leu,亮氨酸；I,lie,异亮氨酸；P,Pro,脯氨酸；F,Phe,苯丙氨酸；W,Trp,色氨酸；M,Met,甲硫氨酸；G,Gly,甘氨酸；S,Ser,丝氨酸；T,Thr,苏氨酸；C,Cys,半胱氨酸；Y,Tyr,酪氨酸；N,Asn,天冬酰胺；Q,Gln,谷氨酰胺；D,Asp,天冬氨酸；E,Glu,谷氨酸；K,Lys,赖氨酸；R,Arg,精氨酸；和H,His,组氨酸。
与现有技术中的载脂蛋白衍生纳米盘不同，本发明所述脂质结合多肽不以双带样形式包封脂质(参见图1)，相反，本发明所述颗粒通过包含脂质的核心保持在一起，所述脂质被两个或更多个近似V形或飞旋标形状的以头-尾方向排列的脂质结合多肽围绕，并且在本发明所述颗粒中，每个所述脂质结合多肽之间实质上没有直接的蛋白与蛋白的接触(参见图2-7)。希望不限于理论，认为本发明的颗粒中的脂质结合多肽和脂质的这种排列方式提供了尺寸可变性，这在体积大的疏水试剂或量增加的脂质被纳入本发明的颗粒中时可以观察到。
尽管SAPLIP具有与脂质相互作用的能力以及上述的两亲性性质，并且三维结构高度保守，但是它们在氨基酸序列水平上是高度多变的，其序列同一性低于定义同源性通常所用的25-30％同一性的阈值范围(参见“Bruhn(2005),BiochemJ389(15):249–257”的图4A和4B中的序列比对，本文以引用方式特别将其附图并入本文)。
在本发明所述脂蛋白颗粒中，脂质结合多肽主要作为结构蛋白，为本发明所述脂蛋白颗粒提供盘状结构框架。由于这个原因，与仅仅为序列决定相比，结构特征、特别是SAPLIP的鞘脂激活蛋白折叠这一特征对于限定本发明的脂质结合多肽更加重要。
本发明所述SPLIP的例子为鞘脂激活蛋白A、B、C或D(例如以下来源的：人(Homosapiens)[参见SEQIDNO.1-4]、马(Equuscaballus)、牛(Bostaurus)、小家鼠(Musmusculus)、家兔(Oryctolaguscuniculus)、大家鼠(Rattusnorvegicus)或非洲爪蟾(Xenopuslaevis))；表面活性蛋白B(例如以下来源的：人、家犬(Canisfamiliaris)、小家鼠、家兔、绵羊(Ovisaries)或大家鼠)；粒溶素(例如人源的，参见SEQIDNO.5)；NK细胞溶素(如野猪(Susscrofa)源的；参见SEQIDNO.6)；NK细胞溶素直系同源物(orthologues)(如马或牛来源的)；阿米巴穿孔素(如溶组织内阿米巴(Entamoebahistolytica)来源的)；阿米巴穿孔素直系同源物(如迪斯帕内阿米巴(Entamoebadispar)或侵袭内阿米巴(Entamoebainvadens)来源的)；阿米巴穿孔素样蛋白(如肝片吸虫(Fasciolahepatica)来源的)；耐格里属阿米巴穿孔素(Naegleriapores)(如福氏耐格里阿米巴(Naegleriafowleri)来源的)；Clornorin(如华支睾吸虫(Clonorchissinensis)来源的)；鞘脂激活蛋白原(如人、马、牛、小家鼠、家兔、大家鼠或非洲爪蟾来源的)和MSAP(如人源的)。
本发明所用的特定的SAPLIP的序列在文献“Bruhn(2005)，BiochemJ389(15)：249-257”的图4A和4B中给出，其中所述附图和序列特意通过引用方式并入本文。本发明所用的特定SAPLIP的序列在如下序列中给出：SEQIDNO.1鞘脂激活蛋白A[人]；SEQIDNO.2鞘脂激活蛋白B[人]；SEQIDNO.3鞘脂激活蛋白C[人]；SEQIDNO.4鞘脂激活蛋白D[人]；SEQIDNO.5颗粒溶素[人]；SEQIDNO.6NK-细胞溶素[野猪]。
本发明所用SAPLIP也可以是包含鞘脂激活蛋白折叠作为多结构域蛋白的一部分的多肽。例如以下情况：酸性鞘磷脂酶(来自人、秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)、玻璃海鞘(Cionaintestinalis)、疟蚊(Anopheles)、果蝇(Drosophila)、小家鼠或大家鼠)；GDSL(Gly-Asp-Ser-Leu)脂酶，如酰氧基水解酶(人或大家鼠来源)；Countin(盘基网柄菌(Dictyosteliumdiscoideum)来源)；J3-晶状体蛋白(加勒比海箱形水母(Tripedaliacystophora)来源)和植物天冬氨酸蛋白酶(植物界(Viridiplantae)来源)。本发明所用SAPLIP还可以是细菌素AS-48。细菌素AS-48具有抗菌活性，也能够结合脂质并且与其他SAPLIP家族成员具有相同的折叠，但是缺乏二硫键桥。
尽管以下本发明更加详细地描述了鞘脂激活蛋白A或其衍生物或截短形式作为脂质结合多肽，以及尽管鞘脂激活蛋白A或其衍生物或截短形式作为脂质结合多肽是优选实施方案，但是本发明不限于此。实际上，本发明明确地延及鞘脂激活蛋白类蛋白(SAPLIPs)的整个家族作为本发明的脂质结合多肽。由于SAPLIP之间的高度的结构和功能保守性，因此可以预期的是，本发明中一些使用鞘脂激活蛋白A作为脂质结合多肽的实施方案的特征和优点也适用于使用其他SAPLIP或其衍生物或截短形式作为本发明所述脂质结合多肽的实施方案。
根据优选的实施方案，SAPLIP是鞘脂激活蛋白A、B、C或D，特别地为选自(人、马、牛、小家鼠、家兔、大家鼠或非洲爪蟾)鞘脂激活蛋白A、鞘脂激活蛋白B、鞘脂激活蛋白C或鞘脂激活蛋白D中的鞘脂激活蛋白。在一个实施方案中，SAPLIP是(人、马、牛、小家鼠、家兔、大家鼠或非洲爪蟾)鞘脂激活蛋白A、鞘脂激活蛋白B或鞘脂激活蛋白D。
在鞘脂激活蛋白中，鞘脂激活蛋白C的特殊性在于其能够诱导膜融合，其他鞘脂激活蛋白没有显示该特征。并不总是希望具有膜融合活性。根据本发明特定的实施方案，脂质结合多肽为鞘脂激活蛋白类蛋白(SAPLIP)或其衍生物或截短形式，前提是SAPLIP不是鞘脂激活蛋白C，或者前提是SAPLIP不是鞘脂激活蛋白C或其衍生物或截短形式。
在一实施方案中，SAPLIP是人源的(即，人SAPLIP)。
在一优选实施方案中，SAPLIP是鞘脂激活蛋白A，优选为(人、马、牛、小家鼠、家兔、大家鼠或非洲爪蟾)鞘脂激活蛋白A，特别优选为人鞘脂激活蛋白A，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。鞘脂激活蛋白A为已知的蛋白。其作为LDAO-去垢剂复合物的表达、纯化和结晶在(例如)文献“PNAS,Vol.109,No.8(2012)2908-2912(Popovicetal.)”中有所描述。
根据本发明一实施方案，脂质结合多肽包含SAPLIP的全长序列。在另一实施方案中，脂质结合多肽是SAPLIP的衍生物，具体为包含与相应的SAPLIP的全长序列具有至少20％、至少30％、至少40％、至少50％或至少60％、优选至少75％同一性的氨基酸序列的多肽。特别地，脂质结合多肽可以包含与SAPLIP的全长序列具有至少80％、85％、90％或95％同一性的序列。
本文使用的术语“序列同一性”是指蛋白之间的相同程度，其可以使用诸如文献“HenikoffS.andHenikoffJG.,P.N.A.S.USA1992,89:10915-10919”中描述的Blosum62矩阵等得分矩阵，通过序列最佳比对来计算。可以使用GeneticsComputerGroup(GCG,Madison,WI,USA)的GAP程序，使用该程序的默认参数进行利用Blosum62相似矩阵和Needleman和Wunsch的算法(J.Mol.Biol.1970,48:443-453)所作的两个序列的百分同一性计算和最佳比对。
作为氨基酸比对的比较，使用了EMBL在线工具“EMBOSSStretcher”(http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_stretcher/)，使用程序的默认设置。
在另一实施方案中，SAPLIP衍生物为包含这样的序列的多肽，在相应的SAPLIP的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸缺失、添加、插入和/或替换。例如，SAPLIP衍生物可以为包含特定的SAPLIP序列的多肽，所述特定的SAPLIP序列中有1到40个、优选1到30个、以及特别为1到20个或1到15个氨基酸被删除、添加、插入和/或替换。
本文所用术语“删除”是指从各自的起始序列中移除1、2、3、4、5或更多个氨基酸残基。
本文所用术语“插入”或“添加”是指向各自起始序列中插入或添加1、2、3、4、5或更多个氨基酸残基。
本文所用术语“替换”是指将位于某一位点的氨基酸残基置换为不同的氨基酸残基。
根据本发明另一个实例方案，脂质结合多肽是包含一个或多个SEQIDNO.1的片段的鞘脂激活蛋白A衍生物。优选的片段对应于鞘脂激活蛋白A的螺旋α1、α2、α3和α4，其中螺旋α1由以下氨基酸“SLPCDICKDVVTAAGDMLK”的连续序列形成；其中螺旋α2由以下氨基酸“ATEEEILVYLEKTCDWL”的连续序列形成；其中螺旋α3由以下氨基酸“PNMSASCKEIVDSYLPVILDIIKGEMS”的连续序列形成；其中α4螺旋由以下氨基酸“PGEVCSAL”的连续序列形成。根据本发明的特定实施方案，鞘脂激活蛋白A的衍生物为包含选自鞘脂激活蛋白A的螺旋α1、α2、α3、α4及其组合中的序列的多肽，特别地，其中所述多肽包含鞘脂激活蛋白A的螺旋α1、α2和α3的序列。鞘脂激活蛋白A的片段(例如其螺旋α1、α2、α3、α4)可以在氨基酸序列中具有一或多个氨基酸删除、添加、插入和/或替换。
根据本发明，当鞘脂激活蛋白A的衍生物或截短形式被用作脂质结合多肽时，所述衍生物或截短形式应当是两亲性的，形成至少一个α螺旋，并且当应用于以下详细描述的本发明所述的制备方法时，能够与溶液化的脂质一起自组装成脂蛋白颗粒。本文所用术语“两亲性”是指多肽或分子既具有亲水区域又具有疏水区域。
优选的，如果使用SAPLIP的衍生物，应当存在与SAPLIP的基础成员鞘脂激活蛋白A中的六个半胱氨酸相对应的六个半胱氨酸残基。这方面可参见文献“Bruhn(2005),BiochemJ389(15):249–257”的图4A和4B的序列比对中的半胱氨酸的位置，特别将其附图以引用方式并入本文。
本发明所述脂质结合多肽也可以包含一个或多个非天然氨基酸、氨基酸类似物或肽模拟物(peptidomimetic)结构(其中肽键被更加耐受代谢降解的结构取代)。
根据本发明的另一实施方案，脂质结合多肽在N端或C端包含附加的标签，例如His6标签、Strep标签、Avi标签、Myc标签、Gst标签、JS标签、半胱氨酸(cysteine)标签、FLAG标签或其他现有技术中已知的标签。
本发明所述脂质结合多肽也可以是嵌合多肽。本文所述“嵌合”指的是两个或多个能够独立存在的分子结合在一起形成具有其所有构成分子的所需功能的单一分子。嵌合分子的构成分子可以以合成方式通过化学连接结合，或者，在构成分子均为多肽或其类似物的情况中，编码这些多肽的多聚核苷酸可以重组地融合在一起从而表达单一的连续多肽。这样的嵌合分子也被称为“融合蛋白”。嵌合多肽的各成分可以直接彼此连接，或者可以通过一个或多个连接物而偶联。
在一个实施方案中，脂质结合多肽是还包含功能部分如靶向部分或生物活性部分的嵌合多肽。
当本发明所述颗粒被用作药物递送载体时，所述靶向部分可以(例如)将本发明所述颗粒靶向至特定的细胞或组织类型，或靶向到其感染物。在一个实施方案中，颗粒包括与脂质结合多肽或脂质成分连接的靶向部分。在一些实施方案中，被纳入颗粒的疏水试剂具有靶向能力。靶向部分可以例如具有受体识别性质，由此颗粒能够靶向到特定的细胞表面受体。举例来说，例如通过调整颗粒的脂质结合多肽成分以便为其提供与位于靶标细胞类型表面的受体相互作用的能力，本发明所述颗粒可以靶向到已知具有特定类型的感染物的特定细胞类型。在一个实施方案中，靶向部分选自由天然或合成的配体、抗体和抗体片段或其他适用于靶向目的的生物分子组成的组中。
当脂质结合多肽包含生物活性部分时，该生物活性部分可以选自例如药物、细胞毒性试剂、酶、标签、荧光基团、造影剂和放射性标签。
适合用于本发明目的的脂质可以选自天然存在的脂质、合成的脂质、被修饰的脂质、脂肪、蜡、固醇、脂溶性维生素、单酸甘油酯、二甘油酯、甘油三酯、磷脂、脂肪酸、甘油脂(glycerolipid)、甘油磷脂(glycerophospholipid)、鞘脂、糖脂(saccharolipid)、聚酮、固醇脂和戊烯醇脂(prenollipid)或其组合。
本文使用的术语“脂质”是公知的，并且指的是生物来源或合成来源的物质，其在有机溶剂中可溶或部分可溶，或者当存在水相时其分层进入疏水环境中。
本文使用的术语“脂质”并非意味着本发明所述颗粒中只有单一一个脂质分子。实际上，其表示颗粒中存在多个相同的脂质分子或多个至少两种不同的脂质分子。
根据优选的实施方案，脂质是脂双层形成脂质和/或生物相容性脂质。
本文所用术语“生物相容性”表示生物学上相容的，其在活的组织中不产生毒性、损伤、或者免疫反应。
本文使用的“脂双层形成脂质”指的是能够形成具有疏水内部和亲水外部的脂双层的脂质。根据本发明，可以使用任何能够与SALIP或其衍生物或截短形式结合以组装成盘状结构的脂双层形成脂质。脂双层形成脂质包括，但不限于，磷脂、鞘脂、糖脂、烷基磷脂、醚脂和缩醛磷脂。可以使用一种类型的脂双层形成脂质，或者可以使用两种或多种的组合。
颗粒还可以包含不属于脂双层形成脂质的那些脂质。这样的脂质包括，但不限于，胆固醇、双磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺(在某些条件下该脂质可能形成双分子层)、氧固醇(oxysterol)、植物甾醇、麦角固醇、谷甾醇、阳离子脂质、脑苷脂、鞘氨醇、神经酰胺、二酰基甘油、单酰基甘油、三酰甘油、神经节苷脂、醚脂、烷基磷脂、缩醛磷脂、前列腺素和溶血磷脂。
根据优选实施方案，脂质为真核生物的脂质和/或存在于脑白质和灰质中的脂质。优选的脂质例如为，磷脂、鞘糖脂、固醇、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸(PS)、2-油酰基-1-棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(POPC)、2-油酰基-1-棕榈酰基-sn-甘油基-3-甘油(POPG)、2-油酰基-1-棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(POPE)、二酰基甘油、胆固醇、鞘磷脂、半乳糖神经酰胺、神经节甘脂、磷脂酰肌醇和硫代半乳糖神经酰胺或其组合。优选的脂质为真核生物的脂质。特别优选的脂质是磷脂酰丝氨酸(PS)。
在一个实施方案中，脂质包含磷脂或由磷脂组成。合适的磷脂的例子包括但不限于，DMPC、DMPG、POPC、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸(DPPS)、心磷脂、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二硬酯酰磷脂酰甘油(DSPG)、蛋黄磷脂酰胆碱(eggPC)、大豆磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇、磷脂酸、鞘磷脂、和阳离子磷脂。
在一些实施方案中，本发明所述颗粒中所包含的脂质可以是包含一个或多个所结合的功能性部分的被修饰的脂质，所述功能性部分例如为上述的靶向部分或生物活性部分。
本文使用的术语“去垢剂”是本领域熟知的并且不包括在本文所用“脂质”的定义中。
虽然许多脂质具有与去垢剂相似的两亲性的总体结构，即，极性亲水头部和非极性疏水尾部，但是脂质在单体的形状、在溶液中所形成的聚集体的类型、以及聚集所需的浓度范围这些方面与去垢剂并不相同。脂质在结构上通常基本上为柱状；疏水尾部所占体积与极性头部所占体积相似。去垢剂单体通常更像圆锥状；疏水尾部所占体积比极性头部所占体积小。去垢剂倾向于聚集成球形或椭圆形的水溶性胶束，并且在缺乏脂质时不形成双层结构(参见Anatrace的手册"Detergentsandtheirusesinmembraneproteinscience",www.anatrace.com)。
本文使用的术语“去垢剂”所涵盖的化合物的例子包括：阴离子去垢剂，例如烷基苯磺酸盐或胆汁酸；阳离子去垢剂和非离子或两性离子去垢剂，例如十二烷基-二甲胺-氧化物(LDAO)；Fos-胆碱；CHAPS/CHAPSO；烷基苷，例如短、中或长链烷基麦芽苷和葡糖苷。
本发明所述颗粒还包含疏水试剂，其不同于包含在颗粒中的其他脂质。这就是说，如果疏水试剂本身是脂质或经修饰的脂质，那么颗粒中包含的大多数脂质(即，大于颗粒中所存在的脂质的总量的50mol％)应当与形成疏水试剂的脂质不同。在本发明一个实施方案中，疏水试剂不是脂质；在本发明另一实施方案中，疏水试剂既不是脂质也不是去垢剂。
能被纳入本发明所述颗粒的疏水试剂可以是疏水有机化合物和/或疏水生物分子。其可以为有治疗活性或生物活性的疏水试剂，或者为简单地使本发明颗粒的盘状形状保持稳定的疏水试剂。所述疏水试剂是这样的试剂(即，化合物和/或生物分子)，其不完全渗入水中和/或在水中不完全保持可溶，和/或当其存在于水相中时，其倾向于聚集和/或分层进入疏水环境。通过被包含在本发明所述颗粒中，疏水试剂被有效地溶解于颗粒的疏水内部。因此，其能够保持其天然的功能性，诸如(例如)催化活性或配体结合活性。
包含于本发明所述颗粒中的疏水试剂通常包含至少一个能够结合或整合到脂双层的疏水部分中的疏水(如亲脂的)区域。因此，该疏水试剂还可以是嵌合分子，其中能够结合或整合到脂双层的疏水部分的疏水(如亲脂的)部分、模块或化合物已与另一个分子相连。例如，脂质-或脂肪酸-偶联的复合物、特别是脂质-或脂肪酸-偶联的药物可以被用作本发明所述的疏水试剂。在这些情况中，复合物或药物本身不一定必须是疏水的。在一些实施方案中，疏水试剂的至少一部分插入颗粒内部的脂质分子的疏水部分(如脂肪酰链)之间，或渗入颗粒内部的脂质分子的疏水部分(如脂肪酰链)中。
疏水试剂可以例如为生物活性试剂、药物、药物的活性成分、美容产品的活性成分、植物保护产品的活性成分、膳食和/或营养补剂、诊断探针、造影剂、标签和/或指示剂。
可以包含于本发明的颗粒中并且可以给有需求的患者施用的疏水药物可以是在水性环境中具有低溶解度的任何药物。在水性环境中的低溶解度可以只在某些条件下变得明显，如某些pH或温度范围，或者当疏水试剂的浓度超过特定阈值时。
举例来说，可以包含于本发明的颗粒中并且可以给有需求的患者施用的药物特别是那些用于治疗癌症、炎症或感染病症、心血管疾病、神经失调和风湿病的药物。疏水试剂可以为抗氧化剂、维生素、抗增殖剂、激素、类固醇、或酶。其可以为除草化合物或杀真菌化合物。
可以纳入本发明的颗粒中的疏水性药物的一些具体的例子包括：姜黄素；磺胺类药物，如磺胺、磺胺甲基异噁唑和磺胺醋酰；三甲氧苄二氨嘧啶，特别是与磺胺甲基异噁唑联用；喹啉，如诺氟沙星和环丙沙星；β-内酰胺化合物，包括青霉素(如青霉素G、青霉素V、氨苄西林、阿莫西林和哌拉西林)、头孢菌素(如头孢菌素C、先锋霉素、头孢西丁和头孢他啶)、其他β-内酰胺类抗生素(如亚胺培南、和氨曲南)；β-内酰胺酶抑制剂，如克拉维酸；氨基糖苷类药物，如庆大霉素、丁胺卡那霉素、妥布霉素、新霉素、卡那霉素和奈替米星；四环素，如金霉素和强力霉素；氯霉素；大环内酯类药物，如红霉素；或混合型抗生素(miscellaneousantibiotics)，如氯林可霉素、多粘菌素和杆菌肽(用于抗菌，在某些情况下用于抗真菌感染)；多烯类抗生素，如两性霉素B、制霉菌素、和哈霉素；氟胞嘧啶；咪唑或三唑类，如酮康唑、咪康唑、伊曲康唑和氟康唑；用于抗真菌疾病(如曲霉病、念珠菌病(candidaisis)或组织胞浆菌病)的灰黄霉素；用于抗病毒疾病的齐多夫定、阿昔洛韦、更昔洛韦、阿糖腺苷、碘苷、三氟胸苷、干扰素(例如干扰素α-2a或干扰素α-2b)和三氮唑核苷；阿司匹林、保泰松、非那西丁、醋胺酚、布洛芬、吲哚美辛、舒林酸、吡罗昔康、双氯芬酸；用于炎症性疾病(例如关节炎)的金和甾体类抗炎药；ACE抑制剂，如卡托普利、依那普利和赖诺普利；有机硝酸盐、如亚硝酸戊酯、硝化甘油和二硝酸异山梨醇酯；钙通道阻滞剂，如地尔硫卓、硝苯地平、和异搏定；β肾上腺素拮抗剂，如用于心血管疾病的普萘洛尔；利尿剂，如噻嗪化物，例如，苯并噻二嗪，或髓袢利尿剂，如利尿磺胺；交感神经阻断剂，如甲基多巴、可乐定、胍那苄(gunabenz)、胍乙啶和利血平；血管扩张剂，如肼酞嗪和米诺地尔；钙通道阻断剂如维拉帕米；ACE抑制剂，如用于治疗高血压的卡托普利；用于治疗心律失常的奎尼丁、普鲁卡因胺、利多卡因、恩卡胺、普萘洛尔、艾司洛尔、溴苄胺和地尔硫卓；用于治疗低脂蛋白血症的洛弗斯塔特因、立普妥、安妥明、考来烯胺(cholestryamine)、普罗布考、和烟酸；蒽环类药物如阿霉素、柔红霉素和去甲氧基柔红霉素；共价结合DNA的化合物、共价结合DNA的化合物和铂化合物，如顺铂和卡铂；叶酸拮抗剂，如氨甲喋呤和三甲曲沙；抗代谢药物和嘧啶拮抗剂，如氟尿嘧啶、5-氟尿嘧啶与氟脱氧尿苷；抗代谢和嘌呤拮抗剂，如巯嘌呤、6-巯嘌呤和硫鸟嘌呤；抗代谢药物和糖修饰类似物，如阿糖胞苷和氟达拉滨；抗代谢药物和核糖核苷酸还原酶抑制剂，如羟基脲；共价结合DNA的化合物和氮芥化合物，如环磷酰胺和异环磷酰胺；共价结合DNA的化合物和烷基磺酸盐，如白消安；亚硝基脲，如卡莫司汀；共价结合DNA的化合物和甲基化剂，如甲基苄肼；共价结合DNA的化合物和氮丙啶，如丝裂霉素；非共价结合DNA的化合物；非共价结合DNA的化合物，如米托蒽醌、博莱霉素；染色质功能抑制剂和拓扑异构酶抑制剂，如依托泊苷、替尼泊苷、喜树碱和盐酸托泊替康；染色质功能抑制剂和微管抑制剂，如长春花生物碱(包括长春新碱、长春碱、长春地辛(vindisine))、和特素紫杉醇(paclitaxel)、泰索帝或其他紫杉烷；影响内分泌功能的化合物，如强的松、强的松龙、他莫西芬、亮丙瑞林、乙炔基雌二醇；抗体，如赫赛汀；基因，如p-53基因、p16基因、MIT基因、和E-cadherin基因；细胞因子如白细胞介素、特别是IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8和IL-12；肿瘤坏死因子，如肿瘤坏死因子-α和肿瘤坏死因子-β；集落刺激因子，如粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；干扰素，如干扰素-α、干扰素-β1、干扰素-β2、和干扰素-γ；用于治疗癌症的全反式维甲酸或其他维甲酸；免疫抑制剂，如：环孢霉素、免疫球蛋白、和柳氮磺胺吡啶、甲氧沙林和沙利度胺；用于治疗糖尿病的胰岛素、胰高血糖素；用于治疗骨质疏松症、高血钙症和佩吉特氏病的降钙素、阿伦磷酸钠；吗啡和鸦片类药物；哌替啶或同类物质；美沙酮或同类物质；鸦片去疼药，如烯丙吗啡；中枢活性镇咳药，如右美沙芬(dexthromethrophan)；用于疼痛管理的四氢大麻酚或屈大麻酚、利多卡因和布比卡因(bupivicaine)；氯丙嗪、丙氯拉嗪；大麻素，如四氢大麻酚；苯丁酮，如氟哌利多；用于治疗恶心和呕吐的苯甲酰胺，如甲氧普胺；作为抗凝剂、抗血栓形成或抗血小板药物的肝素、香豆素、链激酶、组织型纤溶酶原激活因子(t-PA)；用于治疗炎症性肠病的肝素、柳氮磺胺砒啶、尼古丁和类固醇以及肿瘤坏死因子-α；用于治疗烟瘾的尼古丁；用于激素治疗的生长荷尔蒙(growthhormone)、促黄体生成素、促肾上腺皮质激素和生长激素(somatotropin)；以及用于过敏反应的肾上腺素。
通过如下述实施例(如实施例9)中所描述的方法，本领域技术人员可以通过实验容易地确定某化合物是否被良好地纳入了本发明的颗粒中。对于光谱法不能检测到的复合物，本领域技术人员可以借助如LC-MS或薄层层析来确定某化合物是否能够被良好地纳入本发明颗粒中。
将疏水试剂包入本发明颗粒的优点是，它们在颗粒的稳定结构中有效地成为溶液化的，由此，颗粒在(例如)存在于大多数体液和组织的水性环境中能够成为疏水试剂的储存体和/或递送载体。与通过去垢剂或有机溶剂实现溶液化的经典方式相比，本发明的颗粒提供了这样的优点：从外部来说其是亲水的，同时疏水试剂被有效地溶解于颗粒的疏水内部，这意味着疏水试剂能够保持其天然的功能性，诸如(例如)催化活性或配体结合活性。此外，与大多数去垢剂和有机溶剂不同，本发明颗粒看来是生物相容性的。
除了疏水有机化合物，已经证明了本发明的脂蛋白颗粒能够稳定地纳入疏水生物分子，例如包含疏水部分的蛋白。根据本发明，包含疏水部分的蛋白例如可以选自膜蛋白、整合跨膜蛋白、单中心整合膜蛋白、外周膜蛋白、处于脂质结合状态的双向性蛋白(amphitropicprotein)、脂质锚定蛋白和具有融合的疏水和/或跨膜结构域的嵌合蛋白。
整合膜蛋白是持久地结合到脂双层的膜蛋白，其通常需要去垢剂或非极性溶剂才能从膜上移除。跨膜蛋白是横跨膜至少一次的整合膜蛋白。能被纳入本发明所述颗粒的跨膜蛋白的例子是G蛋白偶联受体(GPCR)、搬运蛋白(porter)(如单向搬运蛋白、同向搬运蛋白、或逆向搬运蛋白)、通道(如铁离子通道)或酶。
单中心整合膜蛋白仅从一侧持久地结合到膜上并且不横跨膜。这类蛋白包括通过α螺旋跨膜锚而被束缚到膜上的膜蛋白。例子包括细胞色素P450氧化酶和血型糖蛋白A。
外周膜蛋白只暂时或间接地结合脂双层或纳入脂双层中的整合膜蛋白。外周膜蛋白通常在伴随提高的pH或高盐浓度的条件下用极性试剂处理后会从膜上分离。外周膜蛋白的例子包括磷脂酶A2或C、脂肪氧合酶和细胞色素c。
脂锚定蛋白通过脂化、特别是异戊二烯化、或GPI锚定氨基酸残基而结合到脂双层。例子包括细菌脂蛋白、G蛋白和某些激酶。
双向性蛋白是这样的蛋白，其以至少两种构象状态存在，即：不含脂的可溶于水的状态、以及脂质结合状态。通过与脂质结合，双向性蛋白发生构象改变，这使得它们变为可逆或不可逆的膜结合状态。双向性蛋白的例子为成孔毒素和抗菌肽。
通常认为本发明所述颗粒为盘状，斯托克斯半径(流体动力学半径)RS在2nm至200nm、特别是3nm至150nm、优选3nm至100nm的范围内。本领域技术人员知道如何确定斯托克斯半径。这优选通过分析用凝胶过滤(分子排阻层析)，并与标准的已知斯托克斯半径进行比较的方式来实施。特别地，可以在室温下用例如Superdex200HR1030凝胶过滤柱，并且用合适的缓冲液在7.5的pH以及0.5ml/分钟下进行洗脱，由此对颗粒进行凝胶过滤步骤。在280nm下监测蛋白的吸光度。使用已知斯托克斯半径的蛋白标准品混合物来校准该柱，所述蛋白标准品混合物例如为(例如)甲状腺球蛋白669kDa(RS＝8.5nm)、铁蛋白440kDa(RS＝6.1nm)、过氧化氢酶232kDa(RS＝4.6nm)、乳酸脱氢酶140kDa(RS＝4.1nm)、牛血清白蛋白66kDa(RS＝3.55nm)和马心细胞色素c12.4kDa(RS＝1.8nm)。标准蛋白的RS值跨度应当涵盖高于和低于所关注的颗粒的RS值。通过绘制与标准蛋白的RS对应的洗脱位置来生成标准曲线。通常会产生近似线性的图，但若不是这样，则可以根据所关注的蛋白在标准曲线上的洗脱位置通过在两点之间画线来读取其RS。
在一些实施方案中，例如，当颗粒中存在体积大的疏水试剂或更多量的脂质时，斯托克斯半径会大于3.2nm，具体地，至少3.5nm，至少5.0nm或至少10.0nm。
本发明的颗粒(特别是基本上为盘状的颗粒)还可以通过透射电子显微镜来检测，或者，如果颗粒足够大，可以通过下述实施例12所述的负染色电子显微镜和单颗粒分析来检测。
结构分析表明在本发明的颗粒中，脂质在颗粒内部组装成不连续尺寸的盘状双分子层样结构。脂质结合多肽成分大体上限定了盘状双分子层的边界，并为颗粒提供了结构及稳定性。在大多数实施方案中，颗粒的内部包括疏水区域(如，由脂质脂肪酰链构成)。与脂质体不同，本发明的颗粒通常不包含亲水或水性核心。颗粒通常为盘形，具有扁平的、盘状、近似圆形的脂双层，该脂双层被由两个或更多个脂质结合多肽提供的两亲性α螺旋限制，该α螺旋围绕盘外周与所述双层的疏水表面结合。附图2-7示意性示出了本发明盘状颗粒的示例。
本发明颗粒的盘状形状可以近似柱体，其最大高度与最大直径(长轴长度)之比为至少1.0:1.1，特别地为1.0:1.5或1.0:2.0。盘状颗粒的最大高度通常为至少3.5nm，特别地为至少5nm，该尺寸通过透射电镜确定，或者当颗粒足够大时，通过负染色电子显微镜和单颗粒分析确定。本发明的颗粒有顶面、底面和周向侧表面，顶面和底面的最大直径(长轴长度)大于周向侧表面的高度。在本发明颗粒的一些实施方案中，脂质结合多肽至少部分地定位成围绕颗粒的周向侧表面。
在本发明的一些实施方案中，本发明的盘状颗粒的最大直径(长轴长度)(通过透射电子显微镜确定，或者如果颗粒足够大，通过负染色电镜和单颗粒分析确定)为2nm至200nm之间，特别地为3nm至150nm，优选为3nm至100nm。在另一实施方案中，盘状颗粒的最大直径(长轴长度)为3nm至80nm，特别地为3nm至60nm。实际实验表明，通过本发明方法，最大直径(长轴长度)为3nm至20nm的颗粒特别容易获得。
在本发明的优选实施方案中，颗粒由基本上单分散的盘状结构群(population)限定，如(例如)利用HiLoadSuperdexTM20016/60GL柱得到的凝胶过滤洗脱图谱所评估的那样。
通常，在颗粒中，脂质结合多肽与脂双层之间的主要相互作用是，脂质结合多肽分子的两亲性α螺旋的疏水面上的残基与在位于生物活性试剂递送颗粒的外周的所述双层的边缘上的脂质的疏水面(如磷脂脂肪酰链)之间的相互作用。脂质结合多肽分子的两亲性α螺旋包括与位于颗粒外周的脂双层的疏水表面接触的疏水表面，以及面向颗粒外部并且在颗粒悬浮在水性介质中时与水性环境接触的亲水表面。
在一些实施方案中，颗粒在水性溶液中是稳定的，并且可以被冻干以长期储存，而后在水性溶液中重构(reconstitution)。本文使用的表述“稳定性”或“稳定的”是指在颗粒的制备、运输和储存过程中，颗粒破裂的程度为低水平至检测不到，聚集或品质劣化的程度为低水平至检测不到。
在优选的实施方案中，如(例如)通过目测(澄清无沉淀的溶液)或分析用凝胶过滤(少于50％、具体为1％至40％的颗粒破裂)所确定的那样，本发明的颗粒在水性溶液中在5.0至8.0的pH以及-210℃至4℃的温度下保持稳定达至少1天，至少2天，至少7天，至少2周，至少1个月，至少6个月或至少12个月。实际的实验表明，如(例如)通过目测(澄清无沉淀的溶液)或分析用凝胶过滤(少于50％、具体为1％至40％的颗粒破裂)所确定的那样，本发明的颗粒在水性溶液中，在4℃到40℃的温度、5.0至8.0的pH下也保持稳定达至少1天，至少2天，至少7天，至少2周，至少1个月，至少3个月。如(例如)通过目测(澄清无沉淀的溶液)或分析用凝胶过滤(少于50％、具体为1％至40％的颗粒破裂)所确定的那样，本发明的颗粒还被证明可在水性溶液中，在5.0至8.0的pH以及40℃至75℃的温度下，保持稳定达至少10分钟。在一些实施方案中，颗粒可以被冻干以长期储存，而后在水性溶液中重构。在一些实施方案中，如在pH7.5的合适的缓冲液中重构后通过(例如)分析凝胶过滤(少于50％、具体为少于40％或1％至40％的颗粒破裂)所确定的那样，本发明的颗粒在冻干形式下在-210℃至4℃，特别是-210℃至25℃下保持稳定达至少1天，至少2天，至少7天，至少2周，至少1个月，至少6个月或至少12个月。本文使用的表述“破裂”意为，在凝胶过滤洗脱图谱中，与新制备的本发明颗粒的峰尺寸相比，对应于本发明颗粒的峰尺寸(即峰高)降低，而出现了游离的非脂质结合的SAPLIP和/或游离脂质和/或聚集体的峰尺寸。因此，(例如)40％破裂意为，与储存前的峰尺寸(100％)相比，峰尺寸降低了40％，其中峰尺寸即凝胶过滤洗脱图谱中峰的高度。
实际的实验表明，本发明的颗粒在基本上无去垢剂的水性溶液中也是特别稳定的。基本上无去垢剂意为，基于水性溶液的总体积而言，水性溶液包含少于0.001％(w/v)的去垢剂。
在另一个方面，本发明提供了用于制造包含脂质结合多肽和脂质的颗粒的方法，其中所述脂质结合多肽是SAPLIP或其衍生物或截短形式。所述方法包括以下步骤：
(a)在液体环境中使所述脂质结合多肽与溶液化的脂质接触；以及
(b)在5.0至10、或5.0至8.5、特别是6.0至8.0、最优选7.0至8.0的pH下，使得自组装成所述颗粒。
在所述方法的一些实施方案中，脂质结合多肽和脂质如上所述。
在本发明方法的一个实施方案中，在步骤(a)中脂质结合多肽与溶液化的脂质在水性液体中接触。在一些实施方案中，所述水性液体为pH为5.0至10.0或5.0至8.5，特别是6.0至8.0并且最优选7.0至8.0的缓冲溶液。
在本发明方法的特定实施方案中，脂质通过有机溶剂或去垢剂被溶液化。优选的，步骤(a)使用的脂质处于被去垢剂溶液化的状态。实际的实验表明，广泛种类的去垢剂均可以用来使本发明的方法中所用的脂质溶液化。例如，本发明的方法在脂质溶解在包含0.01％至5.0％(特别是0.1％至1.0％)的烷基糖苷(例如短或长链的烷基麦芽苷和葡糖苷)的溶液中时非常有效。然而，根据所用的脂质的种类，也可以使用其他合适的去垢剂。给定的去垢剂使给定的脂质或脂质混合物溶液化的能力可以通过视觉观察形成了没有聚集体、沉淀或相分离的澄清溶液而容易地检测出来。
与现有技术的方法不同，脂质能够直接用于本发明的方法，而不需要上游的脂质体制备步骤。由于其简化了SAPLIP脂蛋白颗粒的制造方法，因此是有益的。鉴于在本发明方法的步骤(a)中用作起始物质的脂质被溶液化的性质，认为所述脂质实质上不是脂质体的形式。
实际实验表明，本发明的脂质结合多肽在纯化、储存或处理过程中一般不需要去垢剂或其他溶剂。然而，可选择的，步骤(a)所用的脂质结合多肽也可以为被去垢剂溶液化的状态。
在本发明方法的一个实施方案中，在步骤(a)中，脂质结合多肽与脂质的摩尔比为至少1:1，特别是至少1:3，优选至少1:5或1:10。
在本发明方法的步骤(b)中，5.0至10.0、优选5.0至8.5的pH使得在步骤(a)中彼此接触的各成分自组装成本发明的颗粒。与基于现有技术的SAPLIP脂蛋白颗粒应当在或接近于鞘脂激活蛋白的最佳4.75的天然pH下发生最佳组装的预期不同，发现如果在颗粒制备时保持更加中性或碱性的pH，则可以通过简单且可靠的方法获得SAPLIP脂蛋白颗粒。令人惊讶的是，发现在5.0至10的pH以及溶液化的脂质存在下，纯化的鞘脂激活蛋白类蛋白或其衍生物或截短形式自组装成稳定的脂蛋白颗粒，而不需要上游脂质体制备步骤。当尝试在鞘脂激活蛋白的最佳4.75的天然pH下或不存在脂质的情况下进行颗粒组装时，所述简单且可靠的制备方法未能获得满意的结果。
本发明方法的步骤(b)可以包括用去垢剂含量比步骤a)获得的混合物中的去垢剂含量少的液体稀释步骤a)中获得的混合物。实际实验表明，这样的稀释步骤进一步诱导并促进了本发明的颗粒自组装。不希望限于该理论，认为这样的稀释步骤有效地从脂质结合多肽和脂质的疏水表面去除了溶剂或去垢剂分子，由此通过各成分的增强的疏水相互作用而引发本发明的颗粒自组装过程。
虽然颗粒自组装步骤(b)可以完全就在步骤(a)所制备的组合物中进行，但是实际实验表明，步骤(b)优选包括有机溶剂/去垢剂去除或稀释步骤。步骤(b)可以(例如)为凝胶过滤步骤。在一些实施方案中，对步骤(a)获得的混合物进行凝胶过滤步骤，由此凝胶过滤缓冲液或其他溶液为去垢剂含量比步骤(a)获得的混合物中的去垢剂含量少的液体。
本发明步骤(a)和/或(b)的过程优选在1℃至95℃、特别是15℃至80℃、特别优选30℃至40℃的温度下进行，和/或在接近所使用的脂质的凝胶至液晶的相转变温度下进行。所使用的脂质的所述相转变温度可以很容易的在文献中找到或通过量热法确定。
根据本发明方法的一个实施方案，在步骤(b)中或在可选的后续步骤(c)中，通过至少部分除去游离脂质和/或游离的脂质结合多肽来纯化本发明的颗粒。合适的纯化方法为层析法，特别是分子排阻层析、超速离心、透析、接触去垢剂结合型生物珠子，使用浓缩器、亲和层析、磁珠和/或薄膜/过滤器，从而去除未结合的/未纳入的脂质和/或疏水化合物。
本发明方法的产品为包含脂质结合多肽和脂质成分的颗粒。本发明的这些颗粒在本发明的进一步描述中称为Salipro颗粒，并且在一些实施方案中，可以具有上述的包含脂质结合多肽、脂质和疏水试剂的Salipro颗粒的任意或全部特征。
本发明的方法还可以用于将疏水试剂纳入到Salipro颗粒中，由此获得包含脂质结合多肽、脂质和疏水试剂的颗粒产品。疏水试剂可以具有上述可被包含于本发明颗粒中的各种疏水试剂的任意或全部特征。
如果需要制备纳入有疏水试剂的Salipro颗粒，那么这样简单地改变本发明方法的步骤a)：在包含待纳入颗粒内的疏水试剂的液体环境中，使脂质结合多肽与脂质接触。实际实验表明，本发明的方法使得疏水有机化合物(诸如(例如)姜黄素)和单体或寡聚的膜蛋白均能够稳定地被纳入本发明的颗粒。
根据特定实施方案，步骤(a)和/或(b)优选在20℃至80℃，特别是20℃至70℃，特别优选30℃至70℃的温度下进行。尽管在步骤(a)和/或(b)中，30℃至40℃之间的温度对大多数化合物而言已足够，但实际实验证明，对于某些疏水试剂来说，被纳入本发明颗粒中的疏水试剂的加载量可以通过将步骤(a)和/或(b)中的温度提高至更高的温度(例如50℃至70℃的范围内)而得到增加。通过本文教导的方法，本领域技术人员能够根据所用的化合物、脂质和蛋白的温度稳定性以及目的应用所需的疏水试剂的加载量来确定最佳孵育温度。
在一个实施方案中，在用于步骤(a)之前，用合适的有机溶剂(诸如(例如)DMSO、甲醇和/或氯仿)或去垢剂使疏水试剂溶液化。优选的，步骤(a)使用的疏水试剂为被去垢剂溶液化的状态。该去垢剂可以与用于使脂质溶液化的去垢剂相同或不同。
在本发明的一个实施方案中，用于使步骤(a)所用的脂质和/或疏水试剂溶液化的去垢剂不以实质的量被载入本发明的最终的颗粒中。特别地，在能够通过本发明的方法获得的颗粒中，去垢剂的量可以为低值至检测不到。在一个实施方案中，本发明的颗粒不包含任何实质量的去垢剂，基于颗粒的重量，去垢剂的量特别为小于0.1wt-％,优选小于0.01wt-％，特别优选小于0.001wt-％。颗粒中存在的去垢剂的量可以通过例如质谱法检测。
如果步骤(a)所用的疏水试剂处于被去垢剂溶液化的状态，则实际实验表明，使用具有短链到中链的疏水尾部的去垢剂使疏水试剂纯化和/或溶液化是有益的。当膜蛋白作为疏水试剂被纳入时，特别是这样。本文使用的“短链疏水尾部”是指C2至C9，诸如(例如)n-壬基-β-麦芽苷(NM)中的疏水尾部；本文使用的“中链疏水尾部”是指C10至C15，诸如(例如)n-癸基-β-麦芽苷(DM)或n-十二烷基-β-麦芽苷(DDM)中的疏水尾部。在一个实施方案中，用于使疏水试剂纯化和/或溶液化的去垢剂在其疏水的尾部具有2至12个碳原子，优选在其疏水的尾部具有2至10个碳原子，并且最优选具有2至9个碳原子。
在一些实施方案中，在步骤(a)中，脂质结合多肽与疏水试剂的摩尔比为至少1:0.5，优选至少1:2或至少1:5，特别优选至少1:10。在另一个实施方案中，在步骤(a)中，脂质结合多肽与疏水试剂的摩尔比为1:0.5至1:10000，特别是1:0.5至1:1000或1:0.5至1:500。实际实验表明，各成分的化学计量和所得颗粒的大小能够通过相应地调节起始成分的比例来控制。
对于大多数待纳入本发明所述颗粒中的疏水试剂来说，如果步骤(a)中，脂质和疏水试剂的摩尔比为10000:1至1:1000，特别为10:1至0.5:1，则会获得最优结果。
本发明还涉及能够通过本发明上述方法获得的颗粒，即，与用于制备该颗粒实际所用的方法无关。能够通过本发明所述方法获得的颗粒在多个特征方面不同于现有技术的颗粒，例如，它们具有内在的尺寸可变性以及能够适应于待纳入脂蛋白颗粒中的疏水试剂各自的尺寸的能力。
本发明还提供了用于将疏水试剂递送到需要该疏水试剂的个体中的药物组合物，其中所述组合物包含本发明的颗粒，并且其中疏水试剂是活性成分，和/或其中除了该疏水试剂还存在一种活性成分。
除了本发明所述颗粒，所述药物组合物可以任选包含(其他)药学可接受的赋形剂(vehicle)、载体(carrier)或佐剂。
当本发明的颗粒用于药物组合物时，颗粒和药物组合物的各个成分应当是药学上可接受的。本文使用的术语“药学上可接受的”是指在健全的医疗判断范围内，成分、化合物或试剂适合用于接触人体和低等动物的组织，而不会引起异常毒性、刺激、过敏反应等，并且相应地具有合理的受益/风险比率。
在另一方面，本发明提供了使用治疗有效量的上述药物组合物对需要治疗的个体进行治疗的方法。本文所述药物组合物的“治疗有效量”为：治疗或减轻待治疗的疾病或病症的严重程度的有效量。本文所使用的术语“个体”是指动物，如哺乳动物，更具体是人。
本发明的药物组合物可根据待治疗的疾病或病症的严重程度，通过以下方式作为气溶胶、口或鼻喷雾等施用给人和其他动物：经口、经直肠、不经肠、脑池内(intracisternally)、阴道内、腹膜内、经局部(例如以粉末、软膏或滴剂)，经面颊(bucally)。特别地，所述药物组合物可被配制为经肠内、不经肠和/或经局部给药。其可以以胶囊、输注或注射、可涂刷或可饮用的组合物来施用，或者以气溶胶来施用。在本发明的药物组合物的一些实施方案中，本发明的颗粒以固体形式、作为分散液或溶液的形式存在。
本发明的颗粒对诊断和/或美容应用也是有用的。例如，含有可检测物质的颗粒可用作诊断试剂并用于诊断目的，所述可检测物质例如为标签、标记或指示剂。标签、标记或指示剂可以本身包含在疏水试剂中，或由疏水试剂形成，然而它们也可以附连至颗粒的脂质结合多肽或脂质成分上。本发明所述的诊断工具和生命科学研究工具的例子包括：纳入有带标记的疏水蛋白的颗粒、具有标记的脂质结合多肽的颗粒、具有标记的脂质的颗粒、纳入有荧光基团或造影剂(例如用于MR成像)的颗粒。标签可以是(例如)荧光标签。
进一步的，本发明的颗粒作为用于药物开发、药物筛选和/或膜蛋白研究的工具也是有用的。
例如，膜蛋白药物靶标(如细胞表面受体或离子通道)可以被纳入到本发明的颗粒中，从而使其溶液化。然后，该颗粒可以用于检验以研究药物靶标膜蛋白在其天然的脂双层环境中的活性，或用于药物筛选来鉴定新药。
此外，本发明的颗粒也能够被固定在固体支持物上，从而使其可用于诸如表面等离子共振(SPR)等应用或生物传感器应用。
本发明的颗粒通常可用于在近似天然的双分子层微环境中使不可溶的膜蛋白可溶于水性溶液。因此，本发明提供了膜蛋白研究中的多种新应用。例如，本发明的颗粒使得可以通过以下方法研究被纳入本发明的颗粒中的膜蛋白：例如，核磁共振(NMR)、X射线晶体学、电镜(EM)、质谱、等温滴定量热法(ITC)、差示光散射、小角X射线散射(SAXS)等。
在另一方面，本发明的颗粒作为疫苗接种制剂、疫苗接种制剂的载体或药物递送载体是有用的。许多在接种疫苗中特别有效的致病抗原暴露在病原体的细胞外膜表面和/或包含于其中(即，来源于病原脂质、其他疏水生物分子或膜蛋白)。例如，流感病毒上的主要抗原存在于整合膜蛋白血凝素中。通过使用本发明的颗粒，这种疏水性病原生物分子能够有效地被纳入到颗粒中，从而其可以用作疫苗接种制剂中的抗原呈递递送载体。根据这些，本发明的颗粒也可以用于作为抗原呈递递送载体以在合适的宿主动物(诸如兔子、山羊或羊驼)中生产抗疏水试剂或生物分子的抗体。
进一步的，本发明的颗粒可以用于美容产品，特别地，其中本发明的颗粒包含皮肤滋养和/或营养试剂，例如维他命和/或抗氧化剂。
附图说明
以下参照附图以非限制性例子的方式详细描述本发明的一些实施方案，本发明的进一步的特征和优点将变得明显，其中：
图1为现有技术的(如上述的EP1596828B1)包含载脂蛋白A-1的纳米盘颗粒的形状和分子构造的示意图。
图2为本发明所述的包含疏水有机化合物的Salipro颗粒及其制备的示意图；a)为侧视图，b)为俯视图。
图3为本发明所述的包含膜蛋白的Salipro颗粒及其制备的示意图；a)为侧视图，b)为俯视图。
图4为本发明所述的包含膜蛋白和疏水有机化合物的Salirpo颗粒及其制备的示意图；a)为侧视图，b)为俯视图。
图5为本发明所述包含寡聚膜蛋白的Salipro颗粒的示意图；a)为侧视图，b)为俯视图。
图6为本发明所述包含靶标成分(如抗体)和疏水有机化合物的Salirpo颗粒及其制备的示意图。
图7为本发明所述Salipro颗粒及其制备的示意图；a)为侧视图，b)为俯视图。
图8为实施例2中描述的本发明的Salipro颗粒(“Saposin+脂质pH7.5”)、以及比较实验(“Saposin+脂质pH4.75”；“SaposinpH7.5”)的凝胶过滤洗脱图谱。
图9为实施例3中描述的本发明的Salipro颗粒(“Saposin+LDAO+脂质pH7.5”)以及比较实验(“Saposin+LDAOpH7.5”；“Saposin+LDAOpH4.75”；“Saposin+LDAO+脂质pH4.75”)的凝胶过滤洗脱图谱。
图10为实施例4中描述的使用多种不同脂质的本发明的Salipro颗粒的凝胶过滤洗脱图谱。
图11为实施例5中描述的本发明的包含膜蛋白YbgH的Salipro颗粒(“Saposin+去垢剂+脂质+膜蛋白YbgHpH7.5”)、以及比较实验(“Saposin+去垢剂+脂质+膜蛋白YbgHpH4.75”；“Saposin+去垢剂+膜蛋白YbgHpH7.5”；“Saposin+去垢剂+膜蛋白YbgHpH4.75”)的凝胶过滤洗脱图谱。
图12为实施例6中描述的本发明的Salipro颗粒(“Saposin+去垢剂+脂质”)和包含膜蛋白MATE的Salipro颗粒(“Saposin+去垢剂+脂质+膜蛋白MATE”)、以及比较实验(“Saposin”；“Saposin+去垢剂+膜蛋白MATE”)的凝胶过滤洗脱图谱。
图13为实施例7中描述的本发明的Salipro颗粒(“Saposin+脂质”)或包含同源四聚体膜蛋白POT1的Salipro颗粒(“Saposin+脂质+膜蛋白POT1”)的凝胶过滤洗脱图谱。
图14为实施例8描述的本发明的Salipro颗粒(“Saposin+脂质”)或包含人膜蛋白突触素(Synaptophysin)的Salipro颗粒(“Saposin+脂质+膜蛋白SYP”)的凝胶过滤洗脱图谱。
图15为实施例9描述的本发明的Salipro颗粒(“仅含脂质的Salipro”)或包含亲脂性药物姜黄素的Salipro颗粒(“Salipro-姜黄素”)的凝胶过滤洗脱图谱。
图16为实施例10描述的利用不同量的脂质制备的本发明的Salipro颗粒(“仅含脂质的Salipro”)的凝胶过滤洗脱图谱。
图17为实施例11中描述的本发明的Salipro颗粒(“仅含脂质的Salipro”)和包含POT1或突触素的Salipro颗粒(“Saposin-POT1”；“Saposin-SYP”)的凝胶过滤洗脱图谱。
图18示出实施例12中描述的用负染色电子显微镜进行的Salipro-POT1颗粒的单颗粒分析，其中a)示出了电子显微照片，b)示出Salipro-POT1颗粒的类平均(classaverage)。c)和d)分别示出了Salipro-POT1的表面三维重构(surfacerendered3Dreconstruction)的俯视图和侧视图。
图19为实施例13描述的经过不同热处理的本发明的Salipro颗粒的凝胶过滤洗脱图谱。
图1示意性示出了现有技术中(如前述EP1596828B1)含有载脂蛋白A-1的纳米盘颗粒10的形状和分子构造。现有技术中的颗粒10是盘状，包含载脂蛋白脚手架蛋白11，其以双带样的形式紧密围绕由脂质3形成的脂双层。所述颗粒的内部由脂双层中的脂质3的疏水区域形成。该颗粒10的斯托克斯直径在10nm的范围内。
图2示意性示出了根据本发明的包含疏水有机化合物4的Salipro颗粒1的制备、以及形状和分子构造，其中a)为侧视图，b)为俯视图。
本发明所述颗粒1通过如下方法制备：将纯化的脂质结合多肽2与待纳入的脂质3以及疏水有机化合物4混合，并且在约5.0到约10.0的pH下使得自组装成颗粒1。脂质结合多肽2是鞘脂激活蛋白类蛋白(SAPLIP)，并且包括4个以圆柱体表示的两亲性螺旋。脂质3是两亲性的并且包含亲水头部基团(以圆形表示)和疏水的尾部如脂肪酰链(以锯齿形线表示)。颗粒1以及其脂质3和SAPLIP2组分的通用结构特征的详细描述可参见下文对图7中所示的本发明的仅含脂质的基础Salipro颗粒的描述，该情况对下图3至6也适用。
在颗粒1中，疏水的有机化合物4嵌入由脂质3形成的脂双层的疏水部分中。疏水的有机化合物4可以例如为生物活性试剂、药物、药物的活性成分、美容产品的活性成分、植物保护产品的活性成分、膳食和/或营养补充剂、诊断探针、造影剂、标签和/或指示剂。
图3示意性示出了根据本发明的包含整合单体膜蛋白(integralmonomericmembraneprotein)5的Salipro颗粒1的制备、以及形状和分子构造，a)为侧视图，b)为俯视图。膜蛋白5可以是如图3和图4所示的单体形式的整合跨膜蛋白。然而，其也可以为图5所示的低聚状态，或者为外周膜蛋白、脂质结合状态的双向性蛋白、脂质锚定蛋白或具有融合的疏水和/或跨膜结构域的嵌合蛋白，它们均可以为单体或低聚状态。
本发明所述颗粒1由以下方法制备：将纯化的SALIP2与待纳入的脂质3和膜蛋白5混合，并且在大约5.0至10.0的pH下使得自组装成颗粒1。膜蛋白5能够与去垢剂分子6和/或脂质12结合。去垢剂分子6可以来自膜蛋白5的纯化和/或溶液化过程。与膜蛋白5结合的脂质12可以是来自膜蛋白在纯化之前的天然脂质环境的遗留物。在颗粒1中，膜蛋白5被嵌入脂双层的疏水部分中，并且采取与其天然膜结合状态相似的构象。颗粒1可以任选包含源自纯化的膜蛋白5的脂质12和/或去垢剂分子6。在一些实施方案中，颗粒1不包含任何实质量的去垢剂分子6，特别地，基于颗粒的重量，包含小于0.1wt％的去垢剂分子。
本发明的颗粒1在大小上是可变的。图2至7的示意图并非按比例绘制。根据被纳入颗粒1中的膜蛋白5的大小，图3中所示的颗粒实质上可以大于图7所示的仅含脂质的颗粒或图2中所示的包含低分子量有机疏水化合物4的颗粒。通常，颗粒大小的增加也会通过每个颗粒中的SAPLIP分子2的数目(可以多于两个)反应出来。本发明的颗粒可以(例如)包含2至20个，特别是2至10个SAPLIP分子2。颗粒1的大小也可受到在其制备步骤(a)中添加的脂质3的量的影响。
图4示意性示出了根据本发明的包含整合单体膜蛋白5和疏水有机化合物4的Salipro颗粒1的制备以及形状和分子构造，a)为侧视图，b)为俯视图。本发明的颗粒1通过以下方法制备：将纯化的SAPLIP2与待纳入的脂质3、膜蛋白5和疏水有机化合物4混合；以及在约5.0至约10.0的pH值下使得自组装成颗粒1。
图5示意性示出了根据本发明的包含低聚膜蛋白7的Salipro颗粒1；a)为侧视图，b)为俯视图。该颗粒1在尺寸上是可变的并且适应于纳入其中的疏水试剂7的大小。在图5所示的实施方案中，颗粒1的每个颗粒包含3个以头-尾形式排列的SAPLIP分子2。取决于纳入其中的疏水试剂，包含3个SAPLIP分子的颗粒的流体动力学半径在5-20nm的范围内。
图6示意性示出了根据本发明的包含靶向成分如抗体8和疏水有机化合物4的Salipro颗粒1的制备以及形状和分子构造。靶向成分8可以是图6所示的脂质锚定蛋白的形式，或者是具有融合的疏水和/或跨膜结构域的嵌合蛋白的形式。靶向成分也可以附着于脂质结合多肽2、脂质3之一和/或疏水化合物4上，或包含于脂质结合多肽2、脂质3之一和/或疏水化合物4中。
图7示意性示出了根据本发明的Salipro颗粒的制备以及形状和分子构造。本发明颗粒1通过以下方法制备：将纯化的SAPLIP2和脂质3混合，在约5.0至约10.0的pH下使得自组装成颗粒1。脂质3是两亲性的，包含亲水的头部基团(以圆形表示)和疏水的尾部如脂肪酰链(以锯齿形线表示)。在“封闭”的无配体状态(参见图7a左侧)，SAPLIP2的构象与其在本发明的颗粒1中的脂质结合“开放”构象不同(参见图7a右侧)。在封闭状态中，SAPLIP2采取4螺旋束型结构，其中，其两亲性螺旋的疏水部分面向4螺旋束的内侧。在颗粒1的“开放”脂质结合构象中，SAPLIP2采取V形或飞旋标形状的构象(参见图7b和图7a右侧)，其中，其两亲性螺旋的疏水部分接触脂双层中的脂质3的疏水区域。
图7a是示出了颗粒1及其制备的侧视图，图7b是俯视图。本发明的颗粒1近似盘状，具有扁平、盘形、大体上圆形至方形的脂双层，该脂双层由两个SAPLIP分子2的两亲性α-螺旋限制。脂质3在颗粒1内部组装成不连续大小的盘状双层样结构。SAPLIP2限定了颗粒1中盘状双层的边界，该盘状双层的内部是疏水的，即，由脂质脂肪酰链构成，并且缺乏亲水或水性的核心。颗粒1主要通过颗粒1的双层核心中的脂质3的疏水相互作用、以及脂质3与SAPLIP2的两亲性螺旋面向颗粒内部的疏水部分之间的疏水相互作用保持在一起。SAPLIP2以头-尾形式排列，并且在颗粒1中，SAPLIP2之间没有实质上的分子间蛋白-蛋白接触。在其最小的形式中，认为颗粒1包含两个SAPLIP分子2和至少约10个脂质分子3。然而，本发明颗粒1在大小上是可变的。根据其大小以及在其制备中所用的成分的摩尔比，其能够相应地具多个(如大于两个)SAPLIP分子2、更多的脂质3以及任选的其他成分。例如，所述颗粒可以包含2至20个，特别是2至10个SAPLIP分子2。
Salipro颗粒1在其仅含脂质的形式中的最大高度相当于脂双层的高度，大约为5nm。颗粒1具有顶部(见图7b)、底部和周向侧表面，顶部和底部表面的最大直径(长轴长度)大于周向侧表面的高度。
实施例
以下例子旨在具体参照一些实施方案和附图以更详细的方式进一步说明本发明，而并不旨在限制本发明。
I
缩写
使用如下缩写：
POT1：原核膜蛋白，肽转运蛋白
POT2：原核膜蛋白，肽转运蛋白
MATE：原核膜蛋白，MATE转运蛋白
SYP：人膜蛋白
YbGH：原核膜蛋白(来自大肠杆菌(Escherichiacoli))，肽转运蛋白(也被称为DtpD)
DDM：十二烷基-β-D-麦芽糖苷
LDAO：N,N-二甲基十二烷胺-N-氧化物
PS：磷脂酰丝氨酸
POPC：2-油酰基-1-棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱
POPG：2-油酰基-1-棕榈酰基-sn-甘油基-3-甘油
TEV：烟草蚀刻病毒
TCEP：三(2-羧乙基)膦
RT：室温
SaposinA：1.2mg/mlsaposinA(人),20mMHepespH7.5,150mMNaCl
脑脂溶液：5mg/ml脑脂,50mMHepespH7.5,150mMNaCl,0.28％(w/v)DDM
脑脂：Sigma-Aldrich公司,来自牛脑的脑提取物，I型，FolchFractionI；B-1502
GF缓冲液pH7.5：50mMHepespH7.5,150mMNaCl
GF缓冲液pH4.75：50mM醋酸钠pH4.75,150mMNaCl
II
saposinA的纯化
实施例1
纯化的saposinA由以下方法制备。SaposinA蛋白的表达通过以下方法进行：使用将人SaposinA(SEQIDNO.1)的编码区插入pNIC-Bsa4质粒的载体，并将其转染入大肠杆菌E.coliRosettagami-2(DE3)(Novagen公司)菌株中进行表达。在补充有四环素、氯霉素和卡那霉素的TB培养基中，在37℃下培养细胞，并利用0.7mMIPTG诱导。诱导后3小时，通过12000×g离心15分钟收集细胞。上清弃掉，细胞团利用裂解缓冲液(20mMHepespH7.5,150mMNaCl,20mMImidazol)重悬，并且通过超声使其破裂。裂解物经过26000×g离心30分钟，上清于85℃加热10分钟，而后26000×g再次离心30分钟。利用NiSepharoseTM6FastFlow介质，颠倒旋转60分钟，从而对上清进行分批吸附，由此进行初步IMAC纯化。在saposinA结合到IMAC树脂后，将层析介质装入10mm(内径(i.d.))的开口重力流柱中，利用15柱床体积的裂解缓冲液进行清洗以去除未结合的蛋白。用15柱床体积的清洗缓冲液WB2(20mMHepespH7.5,150mMNaCl,40mMImidazol)清洗树脂。添加5柱床体积的洗脱缓冲液EB(20mMHepespH7.5,150mMNaCl,400mMImidazol)来洗脱SaposinA。洗脱液利用pH7.5的补充有重组TEV蛋白酶的凝胶过滤缓冲液GF(20mMHepespH7.5,150mMNaCl)透析过夜。通过使洗脱液经过2ml的IMAC树脂来从其中除去含有不可剪切的His标签的TEV蛋白酶。利用离心过滤单元将剪切后的靶标蛋白浓缩至5ml体积，并且利用10层析系统上柱至HiLoadSuperdexTM20016/60GL柱(均得自GEHealthcare公司)。合并(pool)峰组分并浓缩至1.2mg/ml蛋白。蛋白样品在液氮中快速冷冻，并于-80℃储藏。
III
Salipro颗粒的制造
实施例2
为了重构(reconstruction)Salipro颗粒(图8中表示为Saposin+脂质pH7.5)，将10μl纯化的saposinA(1.2mg/ml，20mMHepespH7.5,150mMNaCl)与1.6μl1％(w/v)的LDAO-去垢剂溶液和4μl的脑脂溶液(5mg/ml脑脂(Sigma-Aldrich公司)，50mMHepespH7.5,150mMNaCl,0.28％(w/v)DDM)混合，并且37℃孵育10分钟。随后，向混合物中加入49.4μl的GF缓冲液pH7.5，从而获得65μl的最终反应体积。在室温下孵育10分钟后，利用配有AutosamplerA-905(其能够自动注入25μl含有蛋白的样品)的层析系统，利用SuperdexTM2005/150GL分析用凝胶过滤柱(均得自GEHealthcare公司)对所述混合物进行凝胶过滤步骤。分析用凝胶过滤程序在4℃下，在pH为7.5的GF缓冲液中，以0.2ml/分钟的流速进行。
比较例2
再次进行实施例2，不同之处在于，使用GF缓冲液pH4.75代替GF缓冲液pH7.5(图8中表示为"Saposin+脂质pH4.75")。
作为阴性对照(图8中表示为"SaposinpH7.5")，将10μl纯化的SaposinA在37℃下孵育10分钟。随后，将55μl的pH7.5的GF缓冲液添加到混合物中，获得65μl的最终反应体积。10分钟室温孵育后，使混合物经历如上文所述的凝胶过滤步骤。
如实施例2所述的将saposinA与脑脂在pH7.5下孵育导致了峰向较大分子量的稳定的脂-蛋白颗粒移动(参见图8"Saposin+脂质pH7.5")。形成对比的是，如比较例2中所述在pH4.75下与脑脂孵育后，没有观察到稳定的脂-蛋白颗粒(参见图8"Saposin+脂质pH4.75")。
实施例3
本实验的目标是评估脂质的存在对本发明所述方法的重要性。
将10μl的纯化的saposinA(1.2mg/ml,20mMHepespH7.5,150mMNaCl)与1.6μl的1％(w/v)LDAO-去垢剂溶液和4μl的脑脂溶液(5mg/ml脑脂(Sigma-Aldrich公司)，50mMHepespH7.5,150mMNaCl,0.28％(w/v)DDM)混合，在37℃孵育10分钟。随后，将49.4μl的pH7.5的GF缓冲液添加到混合物中，获得65μl的最终反应体积。在10分钟室温孵育之后，利用GF缓冲液7.5，对混合物进行上述凝胶过滤步骤(参见图9"Saposin+LDAO+脂质pH7.5")
比较例3
将10μl纯化的saposinA与1.6μl的LDAO-去垢剂(1％)和4μl的脑脂溶液混合，并在37℃孵育10分钟。随后，将49.4μlGF缓冲液pH4.75添加到混合物中，获得65μl的最终反应体积。10分钟室温孵育之后，利用GF-缓冲液4.75，对混合物进行上述凝胶过滤步骤(参见图9"Saposin+LDAO+脂质pH4.75")
为了通过本发明的方法制造稳定的saposinA-去垢剂颗粒(图9中表示为"Saposin+LDAOpH7.5")，将15μl的纯化的saposinA(1.2mg/ml,20mMHepespH7.5,150mMNaCl)与1.6μl的1％(w/v)LDAO-去垢剂溶液混合，37℃孵育10分钟。随后，将48.4μl的GF缓冲液pH7.5添加到混合物中，获得65μl的最终反应体积。室温孵育10分钟之后，利用配有AutosamplerA-905(其能够自动注入25μl含有蛋白的样品)的层析系统，利用SuperdexTM2005/150GL分析用凝胶过滤柱(均得自GEHealthcare公司)对所述混合物进行凝胶过滤步骤。分析用凝胶过滤程序在4℃下，在pH为7.5的GF缓冲液中，以0.2ml/分钟的流速进行。
如前面段落所述，再次进行实验，不同之处在于，使用GF缓冲液pH4.75代替GF缓冲液pH7.5(参见图9"Saposin+LDAOpH4.75")。
图9中的实验结果证明，根据本发明的制备Salipro颗粒的方法需要脂质的存在(参见实施例3和图9"Saposin+LDAO+脂质pH7.5"，以及比较例3和图9的"Saposin+LDAOpH7.5")，并且如比较例3中所示，在4.75的溶酶体pH下不能产生稳定的颗粒(参见图9中"Saposin+LDAO+脂质pH7.5"和"Saposin+LDAO+脂质pH4.75")。然而，去垢剂的存在没有阻碍形成稳定的Salipro颗粒，在去垢剂单独存在时，不能获得本发明所述的颗粒(参见实施例3和图9"Saposin+LDAO+脂质pH7.5"，以及比较例3和图9的"Saposin+LDAOpH7.5")。
实施例4
将POPG、POPC、脑脂和PS(得自Sigma-Aldrich公司或AvantiPolarLipids公司,均为粉末形式)溶解在补充有1％(w/v)DDM的GF缓冲液pH7.5中至20mg/ml，于37℃孵育1小时，伴随中度涡旋混合，并且储存于-80℃。使用时，用补充有0.03％(w/v)DDM的pH7.5的GF缓冲液将脂溶液稀释至5mg/ml，获得最终组成：5mg/ml脂质、50mMHepespH7.5、150mMNaCl、0.28％(w/v)DDM。
将10μl纯化的saposinA(1.2mg/ml,20mMHepespH7.5,150mMNaCl)与5μl的各脂溶液(PG、PC、脑脂、PS)分别混合，并且37℃孵育10分钟。随后将45μl补充有0.03％(w/v)DDM的pH7.5的GF缓冲液添加到混合物中，获得65μl的最终反应体积。室温孵育10分钟之后，利用配有AutosamplerA-905(其能够自动注入25μl含有蛋白的样品)的层析系统，利用SuperdexTM2005/150GL分析用凝胶过滤柱(均得自GEHealthcare公司)对所述混合物进行凝胶过滤步骤。分析用凝胶过滤程序在4℃下，在pH为7.5的GF缓冲液中，以0.2ml/分钟的流速进行(参见图10的"Saposin+PG"、"Saposin+PC"、"Saposin+脑脂"和"Saposin+PS")。
作为阴性对照，将10μl纯化的saposinA于37℃孵育10分钟。随后，将55μlpH7.5的GF缓冲液添加到混合物中，获得65μl最终反应体积。10分钟室温孵育之后，如上文所述，对混合物进行凝胶过滤步骤(参见图10的“Saposin”)。
图10中描述的结果证明了根据本发明的用于制备Salipro颗粒的方法适用于多种不同的脂质。需要注意的是，Salipro颗粒的大小是可变的，并且可受到(例如)颗粒制备中所用的脂质的影响(参见图10)。
IV
包含蛋白疏水试剂的Salipro颗粒
为了证明Salipro颗粒能够作为用于疏水生物分子的载体，利用与上述相同的方法将膜蛋白纳入本发明所述的Salipro纳米颗粒，即，在生理pH下将纯化的saposinA与脂质和待纳入的膜蛋白混合，而后凝胶过滤。
实施例5
为了重构含有细菌膜蛋白YbgH的Salipro颗粒(Salipro-YbgH，图11中表示为"Saposin+去垢剂+脂质+膜蛋白YbgHpH7.5")，将10μl纯化的saposinA(1.2mg/ml,20mMHepespH7.5,150mMNaCl)与1.6μl的1％(W/V)LDAO-去垢剂溶液和4μl的脑脂溶液(5mg/ml脑脂(Sigma-Aldrich公司)，50mMHepespH7.5,150mMNaCl,0.28％(w/v)DDM)以及2.6μl纯化的膜蛋白YbgH(10mg/ml,20mMHepespH7.5,150mMNaCl,5％甘油,0.03％(w/v)DDM,0.5mMTCEP)混合，并且37℃孵育10分钟。随后，将46.8μl的GF缓冲液pH7.5添加到混合物中，获得65μl的最终反应体积。室温孵育10分钟之后，利用配有AutosamplerA-905(其能够自动注入25μl含有蛋白的样品)的层析系统，利用SuperdexTM2005/150GL分析用凝胶过滤柱(均得自GEHealthcare公司)对所述混合物进行凝胶过滤步骤。分析用凝胶过滤程序在4℃下，在pH为7.5的GF缓冲液中，以0.2ml/分钟的流速进行。
比较例5
如上文所述再次进行实施例5，不同之处在于，使用GF缓冲液pH4.75代替GF缓冲液pH7.5(参见图11"Saposin+去垢剂+脂质+膜蛋白YbgHpH4.75")。
此外，将10μl纯化的saposinA与1.6μl的1％(W/V)LDAO-去垢剂溶液以及2.6μl纯化的膜蛋白YbgH(10mg/ml,20mMHepespH7.5,150mMNaCl,5％甘油,0.03％(w/v)DDM,0.5mMTCEP)混合，并且37℃孵育10分钟。随后，将50.8μl的GF缓冲液pH7.5添加到混合物中，获得65μl的最终反应体积。室温孵育10分钟之后，如上文所述对混合物进行凝胶过滤步骤(参见图11"Saposin+去垢剂+膜蛋白YbgHpH7.5")。
最终，将10μl的纯化的saposinA与1.6μl的1％(W/V)LDAO-去垢剂溶液以及2.6μl纯化的膜蛋白YbgH(10mg/ml,20mMHepespH7.5,150mMNaCl,5％甘油,0.03％(w/v)DDM,0.5mMTCEP)混合，并且37℃孵育10分钟。随后，将50.8μl的GF缓冲液pH4.75添加到混合物中，获得65μl的最终反应体积。室温孵育10分钟之后，利用pH4.75的GF缓冲液，如上文所述对混合物进行凝胶过滤步骤(参见图11"Saposin+去垢剂+膜蛋白YbgHpH4.75")。
图11中描述的结果表明，根据本发明所述的制备Salipro颗粒的方法允许向颗粒中额外纳入膜蛋白(参见实施例5)。Salipro-YbgH的洗脱图谱(参见图11“Saposin+去垢剂+脂质+膜蛋白YbgHpH7.5”)展现出两个主峰，洗脱体积为1.5ml处的第一峰对应于纳入Salipro颗粒中的膜蛋白，1.8ml处的第二峰对应于仅含脂质的Salipro颗粒，其在如之前所观察到的相同的体积处洗脱(参见图10，仅含脂质的Salipro颗粒)。由于本发明所述的方法，saposinA、脂质以及膜蛋白自组装成水可溶的、纳入了膜蛋白的脂-蛋白颗粒。
此外，结果表明，根据本发明所述的用于制造含有疏水试剂的Salipro颗粒的方法也需要脂质存在(参见实施例5和图11“Saposin+去垢剂+脂质+膜蛋白YbgHpH7.5”，以及比较例5和图11中的“Saposin+去垢剂+膜蛋白YbgHpH7.5”)，并且在4.75的溶酶体pH下不能产生稳定的颗粒(参见比较例5和图11的“Saposin+去垢剂+脂质+膜蛋白YbgHpH4.75”)。在不存在脂质时(参见比较例5和图11的“Saposin+去垢剂+膜蛋白YbgHpH7.5”)，洗脱图谱与纯化的saposinA的具有上升肩部(ascendingshoulder)的洗脱图谱对应，后者很可能是由单独的YbgH所形成的。
实施例6
制备了含有另一种原核膜蛋白(MATE转运蛋白)的Salipro颗粒(Salipro-MATE，参见图12“Saposin+去垢剂+脂质+膜蛋白MATE”)。
将10μl的纯化的saposinA(1.2mg/ml,20mMHepespH7.5,150mMNaCl)与2μl的1％(w/v)DDM-去垢剂溶液、5μl的脑脂溶液(5mg/ml脑脂(Sigma-Aldrich公司)，50mMHepespH7.5,150mMNaCl,0.28％(w/v)DDM)以及7μl纯化的膜蛋白MATE(9mg/ml,20mMHepespH7.5,150mMNaCl,5％甘油,0.01％DMNG,0.5mMTCEP)混合，并且37℃孵育10分钟。随后，将41μl的GF缓冲液pH7.5添加到混合物中，获得65μl的最终反应体积。室温孵育10分钟之后，利用配有AutosamplerA-905(其能够自动注入25μl含有蛋白的样品)的层析系统，利用SuperdexTM2005/150GL分析用凝胶过滤柱(均得自GEHealthcare公司)对所述混合物进行凝胶过滤步骤。分析用凝胶过滤程序在4℃下，在pH为7.5的GF缓冲液中，以0.2ml/分钟的流速进行(参见图12“Saposin+去垢剂+脂质+膜蛋白MATE”)。
比较例6
将10μl的纯化的saposinA与2μl的1％(w/v)DDM-去垢剂溶液以及7μl纯化的膜蛋白MATE(9mg/ml,20mMHepespH7.5,150mMNaCl,5％甘油,0.01％DMNG,0.5mMTCEP)混合，并且37℃孵育10分钟。随后，将46μl的GF缓冲液pH7.5添加到混合物中，获得65μl的最终反应体积。10分钟室温孵育之后，如上文所述对混合物进行凝胶过滤步骤(参见图12"Saposin+去垢剂+膜蛋白MATE")。
作为仅含脂质的Salipro颗粒对照，将10μl的纯化的saposinA与2μl的DDM-去垢剂(1％w/v)、5μl的脑脂溶液混合，并且37℃孵育10分钟。随后，将48μl的GF缓冲液pH7.5添加到混合物中，获得65μl的最终反应体积。10分钟室温孵育之后，如上文所述对混合物进行凝胶过滤步骤(参见图12"Saposin+去垢剂+脂质")。
作为阴性对照，将10μl的纯化的saposinA在37℃孵育10分钟。随后，将55μl的GF缓冲液pH7.5添加到混合物中，获得65μl的最终反应体积。10分钟室温孵育之后，如上文所述对混合物进行凝胶过滤步骤(参见图12"Saposin")。
图12中描述的结果证明，原核膜蛋白MATE也能够通过本发明所述的方法被容易地纳入Salipro颗粒中。Salipro-MATE的洗脱图谱(参见实施例6和图12的“Salipro+去垢剂+脂质+膜蛋白MATE”)在1.5ml洗脱体积处显示一个主峰，其对应于纳入Salipro颗粒的膜蛋白，并且在1.8ml洗脱体积处具有一个较小的较低分子量的峰，其对应于仅含脂质的Salipro颗粒，其与仅含脂质的Salipro颗粒在相同的体积处洗脱(参见仅含脂质的Salipro颗粒对照“Saposin+去垢剂+脂质”以及图10)。
实施例7
制备了含有另一种原核膜蛋白(奥奈达胡希瓦氏菌(S.oenidensis)肽转运蛋白POT1)的Salipro颗粒(Salipro-POT1，参见图13的“Saposin+脂质+膜蛋白POT1”)。
将230μl的脑脂溶液(5mg/ml脑脂(Sigma-Aldrich公司)，50mMHepespH7.5,150mMNaCl,0.28％(w/v)DDM)于37℃孵育10分钟，添加250μl纯化的膜蛋白POT1(10mg/ml，20mMHepespH7.5，150mMNaCl，5％甘油，0.3％NM，0.5mMTCEP)，并且于37℃孵育30s。随后，添加460μl纯化的saposinA(1.2mg/ml,20mMHepespH7.5,150mMNaCl)，于37℃孵育1分钟，加入630μlpH7.5的GF缓冲液。室温孵育10分钟后，添加2mlpH7.5的GF缓冲液，在14000rpm下离心样品2分钟。采用10层析系统，利用HiLoadSuperdexTM20016/60GL柱(均得自GEHealthcare)，利用pH为7.5的GF缓冲液对上清进行凝胶过滤步骤(参见图13中“Saposin+脂质+膜蛋白POT1”)。
如前一段落所述再次进行实验，不同之处在于不添加POT1(参见图13"Saposin+脂质")。
Salipro-POT1的洗脱图谱显示了一个对应于纳入Salipro颗粒中的膜蛋白的主峰，以及一个较小的较低分子量的峰，其对应于仅含脂质的Salipro颗粒。因此，saposinA、脂质和膜蛋白以这种方式结合，形成含有纳入的膜蛋白的水溶性颗粒。
实施例8
制备包含真核膜蛋白(纯化的人突触素(SYP))的Salipro颗粒(Salipro-SYP，参见图14的"Saposin+脂质+膜蛋白SYP")。
将500μl脑脂溶液(5mg/ml脑脂(Sigma-Aldrich公司)，50mMHepespH7.5,150mMNaCl,0.28％(w/v)DDM)在37℃孵育10分钟，添加800μl纯化的膜蛋白SYP(4.2mg/ml,20mMHepespH7.5,150mMNaCl,5％甘油,0.03％(w/v)DDM)，并且在37℃孵育5分钟。随后，添加900μl纯化的saposinA(1.2mg/ml,20mMHepespH7.5,150mMNaCl)，于37℃孵育1分钟，添加900μlGF缓冲液pH7.5。室温孵育10分钟之后，添加1.9mlGF缓冲液pH7.5，14000rpm离心样品2分钟。采用10层析系统，利用HiLoadSuperdexTM20016/60GL柱(均得自GEHealthcare)，利用pH为7.5的GF缓冲液对上清进行凝胶过滤步骤(参见图14"Saposin+脂质+膜蛋白SYP")。
将230μl脑脂溶液(5mg/ml脑脂(Sigma-Aldrich公司)，50mMHepespH7.5,150mMNaCl,0.28％(w/v)DDM))37℃孵育10分钟。之后添加460μl纯化的saposinA(1.2mg/ml,20mMHepespH7.5,150mMNaCl)，将该混合物于37℃孵育1分钟，随后利用630μlGF缓冲液pH7.5稀释。室温孵育10分钟之后，添加2ml的GF缓冲液pH7.5，14000rpm离心样品2分钟。采用10层析系统，利用HiLoadSuperdexTM20016/60GL柱(均得自GEHealthcare)，利用pH为7.5的GF缓冲液对上清进行凝胶过滤步骤(参见图14"Saposin+脂质")。
Salipro-SYP被洗脱出来，为单一的具有小的下降肩部的峰，这表明该位置存在仅含脂质的Salipro颗粒(参见图14的"Saposin+脂质+膜蛋白SYP"和"Saposin+脂质")。
V
含疏水有机化合物的Salipro颗粒
为了评估Salipro颗粒作为疏水化合物(例如亲脂性药物)的载体的能力，评价了是否可通过与上文所述的纳入膜蛋白相同的方法，将该化合物纳入本发明所述Salipro颗粒中，即，在生理pH条件下将纯化的saposinA与脂质以及待纳入的化合物混合，并随后进行凝胶过滤步骤。
实施例9
使用姜黄素作为用于测试利用本发明的方法纳入Salipro颗粒中的疏水模式药物。最初选择姜黄素是因为其具有多种药学作用(例如抗癌、抗炎、抗氧化以及抗增殖活性)，并且其在脂质环境中具有荧光性。利用其在脂质环境中的UV吸光度以及荧光特性(420nm激发，500nm发射)，可以容易地追踪姜黄素被纳入Salipro颗粒的情况。
将1μl姜黄素(10mg/ml,在DMSO中)与60μl脑脂溶液(5mg/ml脑脂(Sigma-Aldrich公司)，50mMHepespH7.5,150mMNaCl,0.28％(w/v)DDM)混合，并且37℃孵育15分钟。随后，添加100μl纯化的saposinA(1.2mg/ml,20mMHepespH7.5,150mMNaCl)，37℃孵育10分钟，并且添加89μlGF缓冲液pH7.5，而后室温孵育该混合物10分钟。而后添加250μlGF缓冲液pH7.5，并且采用10层析系统，利用SuperdexTM20010/300GL柱(均得自GEHealthcare)，利用pH为7.5的GF缓冲液对样品进行凝胶过滤步骤。在280nm(蛋白)和420nm(姜黄素)下检测UV吸光度，参见图15的“Salipro-姜黄素”。
如前一段落所述再次进行实验，不同之处在于不添加姜黄素(参见图15的"仅含脂质的Salipro")。
图15中描述的结果表明，可以将姜黄素纳入本发明所述Salipro颗粒，这正如以下结果所示：280nm处存在吸收峰，并且在存在特征性Salipro-蛋白吸收峰的准确位置处存在荧光峰，而仅含脂质的Salipro颗粒仅显示出微小的荧光峰(参见图15的“仅含脂质的Salipro”)。当记录在500nm下的姜黄素发射时，获得了相似的结果。在280nm下，纯化的Salipro-姜黄素颗粒显示出单分散峰，其与仅含脂质的Salipro颗粒几乎相同(参见图15的“Salipro-姜黄素”和“仅含脂质的Salipro”)。
进一步的实验表明，在不存在saposinA时，包含脂质和姜黄素的混合物不能自组装成可溶性的脂质-姜黄素复合物。通过将在其他情况下不可溶的亲脂性化合物纳入本发明所述的Salipro纳米级颗粒的脂环境，本发明所述的Salipro颗粒能够为所述的在其他情况下不可溶的亲脂性化合物提供可溶性。
VI
Salipro颗粒适应于被纳入的分子的大小/性质
实施例10
上述实施例4的结果表明，能够通过本发明的方法获得的Salipro颗粒在尺寸上具有内在的可变性(参见图10的不同脂质用于制备颗粒的效果)。这可以通过后续的在根据本发明所述的方法制备Salipro颗粒的实验中，增加脂质的量来确认。
将不同量("脂质5":1μl，"脂质12.5":2.5μl，"脂质25":5μl，"脂质50":10μl，"脂质100":20μl)的脑脂溶液(5mg/ml脑脂(Sigma-Aldrich公司)，50mMHepespH7.5,150mMNaCl,0.28％(w/v)DDM)在37℃孵育10分钟。添加10μl纯化的saposinA，37℃孵育1分钟，并且添加GF缓冲液pH7.5至终体积为41μl。室温孵育10分钟之后，添加24μlGF缓冲液pH7.5，利用配有AutosamplerA-905(其能够自动注入25μl含有蛋白的样品)的层析系统，利用SuperdexTM2005/150GL分析用凝胶过滤柱(均得自GEHealthcare公司)对样品进行凝胶过滤步骤。分析用凝胶过滤程序在4℃下，在pH为7.5的GF缓冲液中，以0.2ml/分钟的流速进行(参见图16的“Saposin+脂质5”，“Saposin+脂质12.5”，“Saposin+脂质25”，“Saposin+脂质50”，“Saposin+脂质100”)。
作为阴性对照，将10μl纯化的saposinA(1.2mg/ml,20mMHepespH7.5,150mMNaCl)于37℃孵育1分钟，并且添加31μlGF缓冲液pH7.5。室温孵育10分钟之后，添加24μlGF缓冲液pH7.5，利用配有AutosamplerA-905(其能够自动注入25μl含有蛋白的样品)的层析系统，利用SuperdexTM2005/150GL分析用凝胶过滤柱(均得自GEHealthcare公司)对样品进行凝胶过滤步骤。分析用凝胶过滤程序在4℃下，在pH为7.5的GF缓冲液中，以0.2ml/分钟的流速进行(参见图16的“Saposin”)。
图16中描述的结果表明，可通过本发明的方法获得的Salipro颗粒的尺寸是可变的，因此，其大小能够(例如)通过在颗粒制备过程中所添加的脂质的量来控制。
实施例11
通过将不同大小的膜蛋白纳入本发明的Salipro颗粒的实验，也将使Salipro颗粒尺寸的内在的可变性变得明显。
如实施例7和8中所述，制备包含小的(27kDa)人突触素(Saposin-SYP)、四聚(4×56kDa)大肠杆菌肽转运蛋白POT1(Saposin-POT1)和仅含脂质的Salipro颗粒。采用10层析系统，利用HiLoadSuperdexTM20016/60GL柱(均得自GEHealthcare)，利用pH为7.5的GF缓冲液对样品进行凝胶过滤。
由图17中的洗脱图谱的比较可以明显看出，本发明所述的Salipro颗粒的大小是可变的，并且看起来适应于被纳入其中的疏水试剂的大小。“空的”(即，仅含脂质的)Salipro颗粒的平均流体动力学半径为约3nm，然而，包含寡聚物POT1转运蛋白的Salipro颗粒增大并显示出大约10nm的平均流体动力学半径。
VII
Salipro颗粒的可视化
如实施例7所述，制备纳入了细菌肽转运蛋白(Salipro-POT1)的Salipro颗粒，并且利用负染色电镜进行分析。
实施例12
将Salipro-POT1的样品施加于涂覆有薄碳膜的辉光放电铜网，利用甲酸双氧铀染色。利用JEOLJEM2100F电镜在200kV加速电压下成像。将显微照片记录在4kCCD相机中。图18a)中示出了示例性的纯化的Salipro-POT1的电子显微镜相片。Salipro-POT组装成大体方形的颗粒，其在网上呈现出各种取向，即，颗粒的侧视图或俯视图/底视图等多种视图是可见的，这使得能够进行3D单颗粒重构。
从显微照片中挑选单一的Salipro-POT1颗粒，利用EMAN2套件(EMAN2suite)进行处理。为了3D重构，未使用对称性。图18b)描述了颗粒的类平均，图18c)和d)分别以俯视图和测试图的方式提供了Salipro-POT1的表面3D重构。
方形Salipro-POT1盘的外观和尺寸与由细菌肽转运蛋白POT1在其天然细菌膜环境下所形成的同源四聚体膜蛋白复合物高度相符。盘的厚度大约为5nm，这暗示了脂双层的尺寸，并且与由POT1的已知结构(主要由跨膜螺旋组成，并且缺乏大的细胞质结构域)所得到的预期值一致。直径和最大直径(主轴长度)在的范围内。鉴于Salipro-POT1颗粒的尺寸和表观化学计量，每个颗粒看来是由4个POT1蛋白和4个saposinA分子组成。这表明了saposinA具有一定的可变性，可适应于所纳入的疏水试剂的尺寸而组装成均匀且稳定的脂蛋白复合物。
因此，Salipro颗粒可以包含2个围绕空的仅含脂质状态的、或者装载有低分子量和/或单体疏水试剂的脂质/去垢剂核心的saposinA分子(参见图2-4和6-7)，也可以包含多个围绕较大的疏水脂质/蛋白组装物的saposinA分子(如同源四聚体POT1的例子中的情况那样)(参见图5和18)。
VIII
Salipro颗粒的稳定性
如上述实施例所证明，Salipro颗粒能够在生理pH下纳入多种多样的脂质、膜蛋白以及疏水化合物，从而使得纳米级复合物在水性环境下可溶。为了确定本发明所述Salipro颗粒的实际应用性能，测试了它们随着时间、温度和不同的处理条件时各自的稳定性。
实施例13
为了评估热稳定性，将如上述实施例7所述制备的只含脂质的Salipro颗粒样品(各65μl)迅速冷冻，储存于-80℃，解冻，并且在0℃、37℃、50℃、73℃或95℃下孵育10分钟。随后利用配有AutosamplerA-905(其能够自动注入25μl含有蛋白的样品)的层析系统，利用SuperdexTM2005/150GL分析用凝胶过滤柱(均得自GEHealthcare公司)通过凝胶过滤步骤进行分析。分析用凝胶过滤程序在4℃下，在pH为7.5的GF缓冲液中，以0.2ml/分钟的流速进行。
图19中描述的结果证明，本发明所述的Salipro颗粒表现出一定的热稳定性。
进一步的实验表明，本发明所述Salipro颗粒在经过用标准离心过滤单元浓缩、以及冷冻和解冻之后仍然坚固。此外，可以对Salipro颗粒进行冻干、储存和再水化，而不会发生明显的品质劣化。

Claims (20)

1.一种颗粒，其包含：
脂质结合多肽，
脂质，和
疏水试剂，
其中所述疏水试剂不同于所述脂质，并且
其中所述脂质结合多肽是鞘脂激活蛋白类蛋白或其衍生物或截短形式。
2.根据权利要求1所述的颗粒，其中所述颗粒基本上是盘状的。
3.根据前述权利要求中任一项所述的颗粒，其中所述颗粒的最大直径为2nm至200nm，特别为3nm至150nm，优选为3nm至100nm。
4.根据前述权利要求中任一项所述的颗粒，其中所述疏水试剂选自由疏水有机化合物和疏水生物分子组成的组。
5.根据权利要求4所述的颗粒，其中所述疏水有机化合物和/或所述疏水生物分子选自由生物活性试剂、药物、药物的活性成分、美容产品的活性成分、植物保护产品的活性成分、膳食和/或营养补充剂、诊断探针、造影剂、标签和指示剂组成的组。
6.根据权利要求4或5任一项所述的颗粒，其中所述疏水生物分子为含有疏水部分的蛋白质，特别是选自由膜蛋白、整合跨膜蛋白、单中心整合膜蛋白、外周膜蛋白、脂质结合状态的双向性蛋白、脂质锚定蛋白和具有融合的疏水和/或跨膜结构域的嵌合蛋白组成的组中的蛋白质。
7.根据前述权利要求中任一项所述的颗粒，其中所述脂质为脂双层形成的脂质和/或生物相容性脂质。
8.根据前述权利要求中任一项所述的颗粒，其中所述脂质选自由真核脂质、磷脂和/或存在于大脑的白质和灰质中的脂质组成的组，特别是，其中所述脂质选自由以下物质组成的组：磷脂、鞘糖脂、固醇、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸(PS)、2-油酰基-1-棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(POPC)、2-油酰基-1-棕榈酰基-sn-甘油基-3-甘油(POPG)、2-油酰基-1-棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(POPE)、二酰基甘油、胆固醇、鞘磷脂、半乳糖神经酰胺、神经节甘脂、磷脂酰肌醇和硫代半乳糖神经酰胺、或其组合，特别优选的是，其中所述脂质包含磷脂酰丝氨酸(PS)。
9.根据前述权利要求中任一项所述的颗粒，其中所述脂质结合多肽为还包含诸如靶向部分或生物活性部分等功能部分的嵌合多肽。
10.根据前述权利要求中任一项所述的颗粒，其中所述脂质结合多肽为鞘脂激活蛋白A或其衍生物或截短形式，特别地为包含与SEQIDNO.1具有至少60％序列同一性的氨基酸序列的鞘脂激活蛋白A的衍生物。
11.一种用于制备包含脂质结合多肽和脂质的颗粒的方法，其中所述脂质结合多肽为鞘脂激活蛋白类蛋白或其衍生物或截短形式，所述方法包括以下步骤：
a)在液体环境中使所述脂质结合多肽与溶液化的脂质接触；
b)在pH值为5.0-10.0下使得自组装成所述颗粒。
12.根据权利要求11所述的方法，其中步骤a)所用的脂质处于被去垢剂溶液化的状态。
13.根据权利要求12所述的方法，其中步骤b)包括：用去垢剂含量比步骤a)获得的混合物中的去垢剂含量少的液体稀释步骤a)中获得的混合物。
14.根据权利要求11-13中任一项所述的方法，其中所述方法在步骤b)中或作为后续步骤c)包括：通过至少部分除去游离脂质和/或游离的脂质结合多肽来纯化颗粒，其中可选的是，所述纯化通过以下方式来进行：层析，特别是分子排阻层析；超速离心；透析；接触去垢剂结合型生物珠子；使用浓缩器；亲和层析；磁珠和/或薄膜/过滤器，从而去除未结合的/未纳入的脂质和/或疏水化合物。
15.根据权利要求11-14中任一项所述的方法，其中所述颗粒如权利要求2或3中任一项所定义，所述脂质如权利要求7或8所定义和/或所述脂质结合多肽如权利要求9或10所定义。
16.根据权利要求11-15中任一项所述的方法，用于制备根据权利要求1-10中任一项所述的颗粒，其中在步骤a)中，在包含待纳入所述颗粒内的疏水试剂的液体环境中，使所述脂质结合多肽与脂质接触，并且可选的是，其中所述疏水试剂如权利要求4-6所定义。
17.一种颗粒，其能够根据权利要求11-16中任一项所述的方法得到。
18.一种用于将疏水试剂递送到需要该疏水试剂的个体中的药物组合物，包含根据权利要求1-10或17中任一项所述的颗粒，其中所述疏水试剂为活性成分，和/或其中除了所述疏水试剂外，还存在一种活性成分。
19.根据权利要求1-10或17中任一项所述的颗粒在医药中的应用，特别是在预防、治疗疾病或减轻疾病的严重程度中的应用，或在诊断方法或美容处理中的应用。
20.根据权利要求1-10或17中任一项所述的颗粒作为疏水试剂递送颗粒的应用，作为用于药物研发、药物筛选、膜蛋白研究的工具的应用，或作为疫苗接种制剂的应用。
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