CN109134643A - 一种复杂结构膜蛋白-脂质体的体外重组方法 - Google Patents

一种复杂结构膜蛋白-脂质体的体外重组方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种复杂结构膜蛋白‑脂质体的体外重组方法，该方法尤其适用于人源γ‑氨基丁酸A型受体的体外重组，具体包括以下步骤：S1、在体外通过细胞工程方法进行诱导表达、纯化膜蛋白受体；S2、在体外经通过控制稀释速度的方法分阶段使纯化后的膜蛋白受体从由detergent混合脂质体形成的micelle状态过渡到共存于micelle和形成的脂质体的中间状态，并最终完全地锚定于脂质体上得到所述膜蛋白‑脂质体；S3、通过超速离心法将重组到脂质体膜上的膜蛋白收集、重悬浮于缓冲液中。与现有技术相比，该方法可根据需要的灵活利用该技术路线，体外活性重组诸如人神经离子通道等具有挑战性的膜蛋白受体到人工脂质体上，具有可操作性强、适用范围广等优点。

Description

一种复杂结构膜蛋白-脂质体的体外重组方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种复杂结构膜蛋白-脂质体的体外重组方法。
背景技术
神经介质离子通道受体位于神经元后突触，是一大类接受前突触神经元释放的神经递质 刺激而打开本身的离子通道、调节神经电位传导的受体。以人γ-氨基丁酸A型受体为例的神 经介质激活的门控离子通道结构图如图1所示，图中，A为以人γ-氨基丁酸A型受体的五聚 体侧视图，胞外区是神经介质结合的部位；穿膜区(处于磷脂双层膜的部分)由每个亚基四个α 螺旋二级结构组成，图中指示了药物调节分子通常结合的靶部位；B为五聚体的胞外区俯视 图，对于通常由异源型门控离子通道受体，以γ-氨基丁酸A型受体为例，通常由二种或三种 不同的亚基组成，亚基穿膜区中间围成整个离子通道；C为五聚体的穿膜区接近胞外部分横 截面俯视图。从图1中可以看到每个亚基提供四个穿膜α螺旋围成离子通道的跨膜部分。重 要受体包括乙酰胆碱受体(acetylcholine receptors，nAChR)，甘氨酸受体(Glycine Receptors， GlyR)，5-羟色胺受体，谷氨酸受体(Glutamate receptor，GluCl)，γ-氨基丁酸A型受体 (γ-Aminobutyric Acid Type A Receptors，GABAAR)等。这些受体在中枢神经系统分布不同，亚 基组成不同，所起到的功能亦不同。各种遗传性、后天发作神经类疾病都和这些受体息息相 关。例如，医学研究表明γ-氨基丁酸A型受体和阿尔海默病(Alzheimer’s disease)，癫痫 (epilepsy)，自闭症(autism)有紧密联系，包括受体本身关键位点的突变，或者受体在大脑特定 部位表达量的减少。基础研究表明抗这些疾病的相关神经药物的靶受体就是γ-氨基丁酸A型 受体。甘氨酸受体则和自闭症(autism)、惊跳症(hyperekplexia)紧密相关。因此，现在有关各 种神经药理研究、药物设计、离子通道门控机制都要涉及探明这些蛋白的结构，药物的靶位， 和药物、配体引发受体异构化的门控开关机制。
然而，上述离子通道也是膜蛋白领域最难研究的一类蛋白分子，都属于Cys-loop五聚体 蛋白受体家族。其特点是由五个异源或同源型亚基围绕垂直于细胞膜的近似对称轴 (pseudo-symmetric axis)形成五聚体结构，所以又称为五聚体配体门控离子通道(pentameric ligand-gated ion channel，pGLIC)。研究难点是对于大多数异源型五聚体蛋白现在仍然不能通 过蛋白结晶的方式直接解析其结构。而且，现有结晶的蛋白由于解析度及结晶蛋白本身结构 受晶格架构的限制，这些受体在真实的细胞膜上的真实动态结构无从知晓。而且异源型受体 的不同亚基间的细微空间结构变化是各种药物的靶向特异性的决定因素。这可以在各种麻醉 药物、痉挛剂、抗痉挛剂、镇静剂的靶位点涉及γ-氨基丁酸A型受体，乙酰胆碱受体、甘氨 酸受体本身不同的亚基空间组合，并随着该离子通道不同阶段的空间变化亲和性不同，已得 到广泛的验证。现有技术中，研究这些神经介质受体的主要方法有电生理方法、提取天然受 体表达细胞膜进行配体生化结合实验，以及通过光敏感衍生药物标记实验确定药物在受体的 靶位点及瞬时标记确定药物结合和受体结合的时效性。这些方法的共同点是能和一些现有同 源受体的晶体结构能互补推测相关的药物靶向机制和门控机制，但是仍然缺乏信服的直接相 关结构、动态学变化证据。因此，亟需一种体外重组相关受体、并保持其活性的方法，能够 直接把特定组成的离子通道受体重组到模拟细胞膜的磷脂膜上，从而展开相关的结构和药理 学分子机制研究。
天然存在的神经介质离子通道蛋白在大脑皮层表达量非常稀少，例如哺乳类γ-氨基丁酸 受体从大脑匀浆中的提取浓度时fmol级(10-15mol)，远远达不到结晶所需的mmol级(10-3 mol)。通过细胞工程学方法表达的蛋白现报道几乎都是“人工受体”，即受体是同源亚基型， 是由单一的亚基组成，无法再现药理学研究要求的异源型亚基组成。以HEK293细胞表达的 异源型受体-氨基丁酸受体((α1)2/(β3)3)，和(α1)2/(β3)2/γ2达到pmol级(10- 12mol)，是到目前 为止能通过细胞工程学手段达到的最好结果，然而相对于提纯、重组、收集每一步的损失， 和该受体的体外不稳定性，依然无法达到通常高精度结构检测标准或药理学实验的数量要求。
神经介质离子通道蛋白的提纯通常需要经历细胞膜的溶解(solubilization)，亲和层析柱的 摄取，经过清洗后最后被洗脱下来。溶解阶段通常需要先向表达有受体的细胞膜中添加 detergent促进带有大量疏水区的蛋白被溶解到缓冲液中，而后进行下一步结合到亲和柱上。 洗脱液中也会存在一定浓度的detergent辅助蛋白的稳定性。纯化蛋白的体外重组(in vitro reconstitution)实际上是除去detergent，最大限度地将受体结合到磷脂双层膜上的过程。现阶 段在所有涉及体外重组的方法中上尚未有一种普遍适用的方法。例如，对于体外研究乙酰胆 碱受体，通常采用的是加州电鳐身上大量存在的乙酰胆碱受体，这种受体表达量巨大而且相 对于人胆碱受体，其蛋白性质稳定，所以通常采用的是用先稀释后透析的方法去除 detergent(十二烷基-β-D-麦芽糖苷(n-dodecyl-β-D-maltopyranoside，DDM)或者cholate)的方 法。这种方法通常需要几天的时间，蛋白的损失量巨大，而且由于重组过程对蛋白脂质体的 形成过程没有有效的控制措施，所产生的蛋白脂质体的大小和分布不均一。显然，这种方法 不能有效用于微量表达的人源神经介质受体。另一种是提纯、重组细菌源(Gloeobacter Violaceus)同源型配体门控离子通道蛋白(Homologous ligand gated ion channel proteins，GLIC)： 处于DDM微团包裹的纯化蛋白，和预先形成的脂质体混合，蛋白、磷脂分子、DDM组成混 合微团(micelle)，通过疏水的bio-beads去除DDM后促进蛋白脂质体的形成。其优点在于能 够彻底去除detergent，然而却也存在类似于前一种方法的缺陷：不能控制去除的速率，而且 蛋白的损失量大依然不可避免。有报道用牛的大脑提纯出来的γ-氨基丁酸A型受体，通过凝 胶过滤层析柱去除提纯时所用detergent–3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐 (3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]propanesulfonate，CHAPS)，最后形成重组蛋白脂 质体；但不能有效控制蛋白脂质体形成的关键阶段，造成脂质体形成效率不高和上面方法固 有的缺点依然不能避免。
基于此，必须开发一种具有普遍代表意义的体外重组方法能快速、高效率得到活性重组 膜蛋白到人工脂膜上的技术体系。
膜蛋白重组技术的开发，首先要了解膜蛋白如何从被detergent/脂质体分子包围的微团状 态(micelle)过渡到最后的蛋白脂质体(proteoliposome)结构。理论研究表明膜蛋白从细胞 膜溶解下来和重组蛋白到磷脂膜上实际是一个逆向镜像过程。这个过程分为三个可逆阶段， 以人γ-氨基丁酸A型受体为例的膜蛋白由被detergent(CHAPS)/脂质体分子包围的微团状 态(micelle)过渡到最后的蛋白脂质体(proteoliposome)结构为例，其过程如图2所示：阶 段III：detergent(CHAPS)、膜蛋白(人γ-氨基丁酸A型受体，图中简单标识为受体)、脂质 体(磷脂分子)实际处在一种微团混合体状态，随着detergent的降低，当低于临界胶束浓度 (critical micelle concentration，CMC：micelle形成关键浓度，由每一种detergent自身固有性质 决定)，微团开始向脂质体形成过渡；阶段II：主要由上述各种分子混合形成的微团向detergent 饱和的蛋白脂质体演化阶段；阶段I：存在的是蛋白脂质体，随着detergent浓度的降低，蛋 白脂质体中的detergent逐渐被剔出。这一理论表明了蛋白脂质体形成的过程和detergent/磷脂 分子浓度比例、detergent本身的CMC，有着紧密的关联性。因此，若能巧妙地利用这一过程 将有望找出一种能够快速、高效实现体外重组膜蛋白-脂质体的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够快速、高效实现体外重组复杂结构膜蛋白-脂质体的方法， 该方法能够在体外将位于神经元后突触受神经介质刺激的离子通道受体蛋白活性重组到人工 脂质体的方法；该方法尤其适用于以人源γ-氨基丁酸A型受体的体外重组及其它结构同源五 亚基门控神经离子通道受体，如体外表达的乙酰胆碱受体(nAChR)，甘氨酸受体(GlyR)、谷氨 酸受体(GluCl)、5羟色胺3受体(5-hydroxytryptamine 3receptor，5-HT3R)。
一种复杂结构膜蛋白-脂质体的体外重组方法，包括以下步骤：
S1、在体外通过细胞工程方法进行诱导表达、纯化膜蛋白受体；
S2、在体外经通过控制稀释速度的方法分阶段使纯化后的膜蛋白受体从由detergent混合 脂质体形成的micelle状态过渡到共存于micelle和形成的脂质体的中间状态，并最终完全地 锚定于脂质体上得到所述膜蛋白-脂质体。
从上述描述可知，本发明的有益效果在于：本发明方案将处于detergent/micelle包裹的膜 蛋白受体进行分步稀释后，将所述膜蛋白受体重组到脂质体上，形成所述膜蛋白-脂质体，通 过分步、可控重组速率的方法创新性地实现了体外重组的目的，并且较其它重组方法具有简 洁、快速、高效、保持天然受体药物调节性等优点。该方法是综合考虑了以往关于正向膜蛋 白重组(reconstitution)、逆向从细胞膜上溶解(solubilization)膜蛋白所经历动态、中间结构 状态的普遍原理，根据不同神经介质离子通道受体的生化、生物物理特性，及纯化选用 detergent/脂分子的特异性，可根据需要灵活利用该技术路线，体外活性重组到人工脂质体上， 具有可操作性强，适用范围广，能有效克服低表达量神经介质激活的离子通道受体蛋白的体 外重组技术障碍、并保持受体天然活性、靶向药物可调控性等难题。
进一步地，所述步骤S1中，所述膜蛋白包括神经介质离子通道受体、多聚体蛋白、多穿 膜区膜蛋白或膜蛋白复合体。
进一步地，所述神经介质离子通道受体包括人γ-氨基丁酸A型受体、人甘氨酸受体、 C.Elegans谷氨酸受体、人乙酰胆碱受体、人5-羟色胺受体、细菌GloeobacterViolaceus同源 受体GLIC和/或细菌Erwinia chrysanthemi同源受体。
进一步地，所述步骤S1中，纯化操作如下：通过detergent最大限度地让膜蛋白受体保 持原始活性并被溶解到缓冲液中，在亲和层析柱上进行detergent的替换并加入包含在 detergent形成的micelle中的磷脂分子维持其结构的完整。
进一步地，所述步骤S1中，所述膜蛋白为人γ-氨基丁酸A型受体，所述detergent为DDM 或CHAPS，所述磷脂分子为大豆磷脂(Asolectin)。
从上述描述可知，本发明的有益效果在于：第一个模块中将细胞工程表达的人γ-氨基丁 酸A型受体用detergent：DDM溶解到缓冲液中，然后用亲和层析柱纯化，并在洗脱过程中 更换detergent和添加后续重组需要的磷脂组分，最后将受体蛋白洗脱下来，准备下一步的重 组；这个过程是下一步重组到磷脂分子脂质体的镜像逆向过程：即将处在细胞膜上的受体离 子通道膜蛋白溶解(solubilization)下来，此时的受体蛋白和磷脂分子、detergent混合呈微团 (micelle)状态。DMM、CHAPS、asolectin分别是神经介质五聚体离子通道蛋白非常有效的溶 解、提纯、重组用detergent和磷脂组分。
进一步地，所述Asolectin包括一类头部基团为胆碱的磷脂分子。
从上述描述可知，本发明的有益效果在于：大豆磷脂中所包含的磷脂分子是细胞膜重要 的组分，通常含有等比例的卵磷脂(lecithin)、脑磷脂(cephalin)和磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol)，这些磷脂分子可以辅助γ-氨基丁酸离子通道通体受体纯化、重组， 维持神经介质受体中功能和结构的稳定性。
进一步地，所述人γ-氨基丁酸A型受体(GABAAR)，其组成包括所述GABAAR的两种亚基(α1)2和(β3)3，或者三种亚基(α1)2/(β3)2/γ2异源型多亚基五聚体受体及其它亚基组成的 GABAAR，所述其它亚基组成结构：(α1-6)2(β1–3)2X，其中，X是γ2orδ。
从上述描述可知，本发明方案的有益效果在于：本发明方案适用于各种人γ-氨基丁酸A 型受体，尽管γ-氨基丁酸A型受体蛋白在工程细胞中的表达量提高，但依然是神经介质五聚 体离子通道中表达量最低、纯化难度最高、且活性在体外降低最快的一类神经介质离子通道 受体，本发明方案中选用温和的DDM作为溶解用detergent，可以最大限度地将天然膜上的 受体溶解下来，在后面的纯化阶段，添加磷脂组分“asolectin”能充分地保持其体外功能并提 高纯化效率，这为下面的重组积累了一个高效的物质基础，也避免了需提前准备预先形成的 脂质体，而是直接从微团状态起始重组，简化了程序，提高了效率。
进一步地，所述人γ-氨基丁酸A型受体α1亚基的Uniprot蛋白序列库的序列号为P14867， 具体氨基酸序列如SeqNo.1所示，其相应的基因序列如SeqNo.2所示；所述人γ-氨基丁酸A 型受体β3亚基的Uniprot蛋白序列库的序列号为P28472，具体氨基酸序列如SeqNo.3所示； 所述的人γ-氨基丁酸A型受体γ2亚基的Uniprot蛋白序列库的序列号为P18507，具体氨基酸 序列如SeqNo.5所示，其相应的基因序列如SeqNo.6所示。
从上述描述可知，本发明的有益效果在于：γ-氨基丁酸A型受体蛋白，尤其是异源亚基 型五聚体，在整个五聚体门控神经离子通道同源受体家族中体外研究难度最大，因而本发明 方法在这一类结构、功能类似的受体重组中有代表性，具备推广价值。
进一步地，所述步骤S2中，所述控制稀释速度的方法具体包括以下步骤：
将所述步骤S1纯化后的膜蛋白受体通过三个连续阶段以不同速度梯度稀释逐步形成重 组的膜蛋白-脂质体，所述三个连续阶段具体为：
A、Detergent、脂质体和纯化的膜蛋白受体三者开始处于混合的微团(micelle)状态；
B、微团和膜蛋白、脂质体共存中间阶段；
C、单一的受体脂质体阶段；
稀释操作中，选择相邻阶段转换的detergent的临界浓度作为每一阶段的起始点或稀释 终点，并在脂质体和微团混合中间阶段保持缓慢且匀速稀释。
从上述描述可知，本发明的有益效果在于：将所述步骤S1制备的纯化人γ-氨基丁酸A 型受体的通过三个连续阶段以不同速度梯度稀释，各阶段遵循脂质体溶解、重组共经历的可 逆过程的客观规律；操作中，选择相邻阶段转换的detergent的临界浓度作为每一阶段的起始 点或稀释终点，并在脂质体和微团混合中间阶段保持慢匀速稀释，保证蛋白脂质体的充分形 成，避免蛋白的聚集化损失。本发明方案采用了细胞膜上蛋白的溶解和逆向但为其镜像过程 的蛋白脂质体重组都必经的三个阶段作为设计理论依据，选取特定的起点浓度和稀释后的终 点浓度对应的各相邻阶段的分界。不同种类的同源受体的重组，即使选取的detergent种类不 同，添加磷脂也不同，都可以同样针对性地在三个阶段对应的临界浓度，按照同样的方法重 组。
进一步地，所述方法还包括步骤S3、通过超速离心法将重组到脂质体膜上的膜蛋白收集、 重悬浮于缓冲液中。
从上述描述可知，本发明的有益效果在于：稀释后的重组人γ-氨基丁酸A型受体蛋白脂 质体通过超速离心法积淀下来，而后重新悬浮于缓冲液中，由于重组在磷脂膜上的受体理化 性质相对于detergent包围下的微团状态更稳定，可以经历二次重新悬浮离心，同时可以达到 两个目的：浓缩所得重组膜蛋白-脂质体和最大限度地去除单体游离的detergent分子。分步稀 释后用超速离心快速收集重组通道蛋白脂质体，快速、高效，实验证明能很好地回收重组受 体。
附图说明
图1为现有技术中五聚体神经介质激活的门控离子通道的结构示意图；
图2为人GABAAR不同亚基(α1、α4、β2、β3、γ2、δ)、人GlyR不同亚基(α1、β)、 人β3同源GABAAR五聚结晶GLIC受体(pdb、4NPP)亚基与细菌Gloeobacter结晶GLIC 受体(pdb，4NPP)亚基、细菌Erwinia chrysanthemi结晶ELIC受体(pdb，3RQW)亚基及 线虫c.eleganGluCl晶体(pdb，3RHW)受体亚基间的蛋白序列及二级结构对比图；
图3(A)为本发明实施例中将人γ-氨基丁酸A型受体(GABAAR)重组到磷脂双层膜上过 程中的光学密度-detergent关系图；
(B)为本发明实施例中将人γ-氨基丁酸A型受体(GABAAR)重组到磷脂双层膜上过程中 的detergent(CHAPS)-磷脂分子浓度关系线性拟合及预测的detergent上下限浓度-磷脂分子 浓度关系图；
(C)为本发明实施例中分阶段稀释detergent浓度-稀释时间关系图,其中将人γ-氨基丁酸 A型受体根据(B)的预测上、下限选择作为稀释步骤I、II的detergent终点浓度；
图4(a)为经过亲和层析纯化后的γ-氨基丁酸A型受体(包括((α1)2(β3)3和((α1)2(β3)2/γ2)) 蛋白SDS-PAGE图；
(b)为纯化的γ-氨基丁酸A型受体不同亚基(α1/β3/γ2)的western blot图；
(c)为重组前及重组到磷脂膜上的GABAAR((α1)2/(β3)2/γ2)的SDS-PAGE图；
图5为本发明实施例中重组到脂质体上的γ-氨基丁酸A型受体(α1)2(β3)3的负染电镜照 片；
图6为本发明实施例各受体结合配体[3H]muscimol受R-etomidate的调控作用关系图；
图7为本发明实施例各受体结合配体[3H]muscimol受R-mTFD-MPAB的调控作用关系 图；
图8为本发明实施例中结合配体[3H]muscimol受etomidate调控的GABAAR穿膜区截去 胞外区后的正俯视图；
图9为本发明实施例结合配体[3H]muscimol受R-mTFD-MPAB调控的GABAAR穿膜区截去胞外区后的正俯视图。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配 合附图详予说明。
本发明的关键构思在于：本发明提供了一种可以应用于γ-氨基丁酸A型受体为代表的五 聚体神经介质离子通道复杂膜蛋白的体外活性重组方法，该方法包括以下步骤：1)神经介质 离子通道受体在体外通过细胞工程方法进行诱导表达。通过特定的detergent最大限度的让离 子通道受体保持原始活性被溶解到缓冲液中，并在其和层析柱上进行detergent的替换，及加 入由包含在detergent形成的micelle中的磷脂分子维持其结构的完整；2)在体外经通过控制 稀释速度的方法，分阶段使纯化的离子通道蛋白从由detergent混合脂质体形成的micelle状态， 到共存于前面的micelle和形成的脂质体的中间状态，最后到完全地锚定于脂质体上；3)通 过超速离心法将重组到脂质体膜上的蛋白收集、重悬浮于缓冲液中。
本发明方法尤其适用于以人源γ-氨基丁酸A型受体的体外重组及其它结构同源，如体外 表达的乙酰胆碱受体(nAChR)，甘氨酸受体(GlyR)、谷氨酸受体(GluCl)、5羟色胺3受体 (5-hydroxytryptamine 3 receptor，5-HT3R)，如图2所示，图2中不同程度的阴影区域代表同 源的二级结构，长方形框区为高度保守序列部分，从图2中可以看出人源神经递质激活同源 受体亚基和其它细菌类、线虫类同源神经递质受体亚基间的序列、结构同源且具有相似性。 所述用于位于后突触起抑制负调控作用的人γ-氨基丁酸A型受体，其组成二种亚基 (α1)2/(β3)3，或者三种亚基(α1)2/(β3)2/γ2异源型多亚基五聚体受体(其它亚基组成的GABAAR 也同样适用，(α1-6)2(β1-3)2X，X是γ2orδ)。所述人γ-氨基丁酸A型受体α1亚基的Uniprot 蛋白序列库的序列号为P14867，具体氨基酸序列如SeqNo.1所示，其中，第1～27个氨基酸、 第261及第319个氨基酸为α1亚基信号肽残基序列，其相应的基因序列如SeqNo.2所示，信 号肽相应的编码子为碱基215～295；所述人γ-氨基丁酸A型受体β3亚基的Uniprot蛋白序列 库的序列号为P28472，具体氨基酸序列如SeqNo.3所示，其中第1～25个氨基酸为亚基β3信 号肽序列，其相应的基因序列如SeqNo.4所示；所述的人γ-氨基丁酸A型受体γ2亚基的Uniprot 蛋白序列库的序列号为P18507，具体氨基酸序列如SeqNo.5所示，其中，第1～39个氨基酸 为γ2亚基信号肽序列，其相应的基因序列如SeqNo.6所示，信号肽相应的编码子为碱基 226～342，成熟蛋白的编码为碱基343～1627。
所述重组受体所用detergent成分：对于人γ-氨基丁酸离子通道A型受体，这两类化学组 分选自以下：(a)n-dodecyl-β-D-maltopyranoside，(DDM)，CAS Number 69227-93-6，Molecular Formula：C24H46O11；(b)3-[(3-Cholamidopropyl)-Dimethylammonio]-1-Propane Sulfonate]· N,N-Dimethyl-3-Sulfo-N-[3-[[3α,5β,7α,12α)-3,7,12-Trihydroxy-24-Oxocholan-24-yl]Amino]propy l]-1-Propanaminium Hydroxide,InnerSalt，(CHAPS)，CAS Number：75621-03-3，Molecular Formula:C32H58N2O7S；
所用脂分子的种类：Asolectin，包括一类头部基团为胆碱的不同的磷脂分子，这类分子 是细胞膜重要的组分，通常含有等比例的卵磷脂(lecithin)、脑磷脂(cephalin)和磷脂酰肌醇 (phosphatidylinositol)，可用于辅助人γ-氨基丁酸离子通道受体纯化，重组的磷脂复合组分， 也是在提纯、重组其它神经介质受体中起维持功能、结构稳定性的重要磷脂分子。
本发明的实施例一为：一种膜蛋白-脂质体的体外重组方法，所述膜蛋白为人γ-氨基丁酸 受体蛋白，所述脂质体组分为Asolectin脂分子，所述脂质体重组包括以下步骤：
第一阶段，人γ-氨基丁酸离子通道受体纯化：
将贴壁HEK293细胞经过诱导表达的细胞从15cm×25cm培养皿上用添加蛋白酶抑制剂 的缓冲液(HEPES，10mM，EDTA 1mM pH7.4 1mM PMSF protease inhibitor cocktailmixture) 将细胞刮下来。用玻璃研磨器将细胞打破，用超速离心(40000g，30min)将细胞膜碎片小块状 收集。重新添加缓冲液，重复上述过程，收集细胞膜。然后用27号注射器针头反复推进膜碎 片使之均匀化，完成后在-80℃保存。
溶解准备的细胞膜：在4℃冷室中，通过逐滴向细胞膜悬浮液中加入溶解缓冲液，其组 分为：(Tris-HCl、50mM NaCl、150mM CaCl2、2mM KCl、5mM MgCl2、4mM EDTA、30mM DDM、30mM glycerol(10％)和所述蛋白酶抑制剂。用磁搅拌子充分混合，超离心收集溶解 受体的上清液。
将溶解在缓冲液中的受体装载入载入相应的纯化亲和层析柱上，对于γ-氨基丁酸A型受 体，通过连系有Anti-FLAG抗体亲和层析柱结合溶液中的受体蛋白。Anti-FLAG亲和层析柱 的处理可参加相关商用说明书。蛋白和亲和层析柱的结合时间是2个小时。在4℃通过摇床 的转动保证上述体系的混匀。
受体蛋白在洗脱下来前需要洗涤掉杂蛋白和其他杂质。洗涤采用的含有detergent的缓冲 液(Tris-HCl、50mM NaCl、150mM CaCl2、2mMKCl、5mM MgCl2、4mM EDTA、5mM CHAPS、17mM Asolectin、8mM 10％glycerol)，洗涤两次，每次的液体体积大于或等于6倍柱床体积/ 次，充分摇匀混合后更换洗涤液组分(Tris-HCl、50mM NaCl、150mM CaCl2、2mM KCl、5mM MgCl2、4mM EDTA、5mM CHAPS、100μM Asolectin、10％glycerol)；继续洗涤3(也可以 为4或5次，每次充分混合层析柱和洗涤缓冲液。在此步骤中，对于验证重组受体的结构异 构性、药理学特异性，将GABAAR(α1)2(β3)3M286C需要用MTSL标记，标记1小时，余下步骤相同。
在上述最后的洗涤缓冲液中添加FLAG八聚小肽 (N-Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-C)，浓度为0.1mg/ml。每次将洗脱液和层析柱介质充 分在4℃要床上充分混合1小时，最大限度地洗脱挂在层析柱上的受体蛋白。第一次收集完 洗脱蛋白后，再用同样模式洗脱缓冲液重复洗脱蛋白第二次，收集蛋白，而后在液氮中冷冻 保存。
第二阶段：将纯化的受体重组到以asolectin为磷脂组分的脂质体上：
为了将detergent除去，采用分段稀释的方法，通过多种方式表征稀释过程中的变化，如 图3所示。图3(A)为通过光散射测量溶液光学密度(optical density，OD)的方法显示：如果 开始时，受体蛋白已经在脂质体上，随着溶液体系中总detergent浓度的增加，磷脂分子、 detergent、受体蛋白的构成的蛋白脂质体(proteoliposome)经历三个结构状态：阶段I、蛋白 锚定在磷脂脂质体双层膜上，detergent在液相和磷脂膜上分布呈现递增趋势直至饱和。但 此阶段由于蛋白脂质体保持完整性，溶液光学密度不变；阶段II、detergent在脂质体上过饱 和后破坏脂质体的结构，在溶液中开始形成脂分子、蛋白、detergent三者混合的微团 (micelle)，此时detergent浓度的增加导致蛋白脂质体的渐少，溶液逐渐澄清，溶液光学密度 成线性下降；阶段III、当detertegent浓度增加跨过detergent的CMC浓度(critical micelle concentration)后，脂质体不复存在，溶液中只有以脂分子为主要成分、混合蛋白、detergent的 微团(micelle)。此后OD降到最低，并达到稳态。洗脱纯化的受体蛋白处于detergent(CHAPS) 和asolectin包围形成的微团状态(图3B中黑色三角所示)。CHAPS和磷脂分子的相互浓度和 脂质体/微团的分阶段转换有数量上的对应关系。在相邻阶段的相变分界磷脂分子、CHAPS 浓度有良好的线性关系。根据已有用光散射测量的CHAPS和磷脂分子(9:1摩尔比混合的 phosphatidylcholine和phosphatidic acid)的micelle、micelle/脂质体混合、单纯脂质体的线性相 变分界(如图3B所示)，计算出对应的两个分界的detergent浓度。图3B为根据上述方法、原 理绘制的随detergent(以CHAPS为例)、磷脂分子浓度的变化，各阶段分相时的临界对应 浓度，并将CHAPS和磷脂分子的对应关系线性化拟合。图中从上至下的第二根实线和第三 根实线，分别代表阶段III开始过渡到阶段II、阶段II过渡到阶段I的脂分子、CHAPS对 应浓度的线性关系，作为分相的临界值；平行于各线性拟合直线的两条线分别代表数量拟合 置信度为95％的预测上、下限。为了保证最大限度保证脂质体在阶段II的形成，以最上方 的实线和最下方的虚线对应的CHAPS浓度分别代表实际稀释时detergent在此稀释阶段的 起始和终止浓度。大黑色三角形坐标代表实例中开始稀释重组时CHAPS和磷脂的相对浓 度，说明作为起点蛋白处于CHAPS、磷脂包裹的微团micelle状态。由于asolectin组分与 上述(光散射测量时)所用脂分子不同，本方法采用了置信度为95％的线性估测来分别选定微 团micelle(阶段III)向脂质体/微团混合(阶段II)过渡和最后向单一脂质体相变(阶段I)的 CHAPS浓度。当纯化的蛋白处于5mMCHAPS和100μM asolectin微团(micelle)状态时，其具 体浓度分界值分别对应为CHAPS4mM，稀释到低于此浓度时，微团micelle过渡到micelle 和脂质体的混合状态，当进一步低于1.8mM时，溶液体系中只有单一的脂质体。
稀释过程如图3(C)所示，同样以人γ-氨基丁酸A型受体(GABAAR)为例，根据图3(B) 的预测上限选择作为稀释步骤I的CHAPS终点浓度，即CHAPS对应相应脂分子浓度的特定 CMC值，该阶段稀释速度较快，快速的降低CHAPS的浓度到实际的CMC以下，时间5分 钟；第二步是阶段III向阶段II的关键阶段，稀释速度慢、混合要求充分、均匀，时间是60 分钟，终点浓度根据图3(B)的预测下限得出。第三步是在阶段I蛋白脂质体已经形成，通 过快速、充分、均匀稀释将CHAPS从磷脂层双层上去除，时间5分钟，特点是稀释速度快。 稀释CHAPS总浓度倍数≥10倍。本发明方案的稀释过程中，第一步是快速稀释：快速稀释包 裹在asolectin和CHAPS形成的micelle微团直到相变的上限：起点和终点CHAPAS浓度分别 是5mM、4mM，时间长度是5分钟，稀释缓冲液的注入速率控制在3.75～5ml/分钟；第二步 是慢匀速稀释：通过缓慢和均匀的稀释，有利于脂质体均匀的形成，和受体蛋白最大限度地 整合到脂质体上。这一步涉及阶段II向阶段I的转变，起点和终点CHAPAS浓度分别是4mM 和1.8mM，时间长度为60分钟，稀释缓冲液注入速率控制在0.4～0.5ml/分钟；第三步是快速均匀混合：因为这个阶段脂质体已经完全形成处于阶段I，这时上面还有CHAPS存留在脂质体上，这个阶段是通过继续稀释去除CHAPS。这个过程起点CHAPAS浓度为1.8mM。终点 是CHAPS在溶液中的总浓度稀释至少10倍，而由于CHAPS在脂膜双层上的分配系数(partitioncoefficient)算出此时在脂膜上的浓度远低于1μM。大量的CHAPS以单体的形式 溶于液相溶液中，可以通过下一步的超高速离心，将停留在上清液中的被去除。因此，这一 步CHAPS总的起点、终点浓度是1.8mM、0.5mM。稀释时间是5分钟，稀释缓冲液速率控 制在10～15ml/分钟。
第三阶段，通过超高速离心的方法收集重组后的受体蛋白脂质体：将人γ-氨基丁酸A型 受体，每次提纯60个15cm*25cm的培养皿的细胞，最终的蛋白洗脱液体积大约为36ml，稀 释后的体积为180ml左右，因此，通常分成6等份用40ml离心管和转子AH-629以110，000 g超高速离心大约6小时，离心得到的重组蛋白脂质体小团块(pellet)用8ml缓冲液(Tris-HCl、 50mM NaCl、150mM CaCl2、2mM KCl、5mM MgCl2、4mM EDTA、10％glycerol)悬浮。
通常为了进一步减少残留在脂质体上的CHAPS和进一步浓缩得到的重组蛋白，进行二 次超离心，离心用的是TST 60.4转子，140，000g离心6小时。而后，样品可以根据实际实验需要的浓度加入上述缓冲液重新悬浮，而后放入液氮中储存。通常情况下超离心步骤收 集纯化、重组的蛋白效率在90％以上。
用SDS-PAGE鉴定提纯的人γ-氨基丁酸A型受体，结果如图4(A)所示，受体 (α1)2(β3)2(γ2)1或(α1)2(β3)3经过提纯后在detergent为CHAPS/asolectin混合成微团(micelle) 的溶液中。SDS-PAGE在8.5％SDS-PAGE蛋白凝胶电泳中进行。完毕后经过考马斯亮蓝 250进行染色、脱色，观察蛋白条带，确定受体的纯化，亚基的位置。
用western-blot鉴定提纯后、重组后组成人γ-氨基丁酸A型受体的α1、β3、γ2亚基，如 图4(B)所示；将SDS-PAGE凝胶电泳完毕后将蛋白转移到PVDF膜上，用脱脂奶粉封闭后分别加入抗Flag-peptide(GABAAR，Flag-α1)、抗(GABAAR，β3)、抗(GABAAR，γ2-1D4) 一抗，结合过夜，然后加入辣根过氧化物酶标记的二抗，进行化学荧光染色；为了鉴定受体 是否糖基化，平行于上述实验，对每个样品加入糖基化消化酶PNGase F对其进行糖基链消化，而后通过SDS-PAGE和western blot检验蛋白分子量的变化对蛋白糖基化做出判断。
为了进一步本方法超速离心后收集的重组受体脂质体，将本发明方法纯化的受体(α1)2(β3)2(γ2)1蛋白和稀释离心后收集到的脂质体做8.5％SDS-PAGE电泳，结果如图4(C)所示，比较纯化在CHAPS微团(micelle)状态下和重组在脂质体上的蛋白组分是否一致。从图 4中可以看出重组前后蛋白组分上具有良好的稳定性。需要说明的是由于蛋白上样量的不同， 这里条带的强弱不代表重组效率低，配体结合实验证明重组效率≥85％。
用负染电镜(negative staining microscopy)来鉴定重组的人γ-氨基丁酸A型受体蛋白脂 质体(如图5所示，图中矩形窗内的类五边形为重组到膜上的受体，线状比例尺代表10nm， 该影像图放大了108倍)；由于是将样品的背景染色以突显样品，因此被称之为负染。将5μl 的重组受体(0.5mg/ml)放在由纯碳支持膜(Carbon stabilized FormvarSupport films)覆盖的载物 铜网(200mesh copper grids)上，停留30秒。然后用滤纸吸取多于液体，立即用1％乙酸双氧 铀(uranyl acetate)染色，滤纸吸取多于液体后，空气干燥(室温，60％的湿度)。将准备好的样 品用FEI Tecnai Spirit Bio Twin透射电子显微镜检测。由图5可以明显看出，人γ-氨基丁酸 ((α1)2(β3)3)成功重组到以脂分子asoletin为成分的脂质体上。
将以上测量纯化蛋白的数量、计算稀释重组方法前后的效率都采用放射性标记的配体结 合实验测定人γ-氨基丁酸A型受体的活性浓度；表达γ-氨基丁酸A型受体蛋白的细胞膜、纯 化或者重组后的受体悬浮液与[3H]标记的muscimol(γ-氨基丁酸A型受体的激活配体，和γ- 氨基丁酸同样结合受体的胞外区)共同在室温下混合10～15分钟，然后加入到0.5％w/v poly (ethyleneimine)处理过的GF/B玻璃纤维滤纸上。蛋白结合到滤纸后用10ml分析用的冷缓冲 液(1×PBS，200mM KCl，1mM EDTA)洗涤，用抽真空吸干水分。用灯完全烘干后加入液态闪 光用液剂Liquiscint(Atlanta，GA)，充分混合后用液体闪光计数仪(Tri-Carb 1900，Liquid Scintillation analyzer，Perkin-Elmer/Packard，Waltham，MA)来测定结合受体的放射性配体的 数量值(指定为A)。为准确检测放射性配体的结合受体的特异性，需要减去非特异的结合配 体。方法是在上述结合反应体系中添加GABA，来竞争除去特异结合在人γ-氨基丁酸A型受 体上的[3H]muscimol,这种形况下的计算出非特异结合配体(指定为B)需从原计算数量值A 减去，最后的净值是特异结合受体的配体数量。
麻醉药物对重组配体特异结合的调控实验：
用人γ-氨基丁酸A型受体特异靶向性麻醉药物来鉴定重组受体的活性和药物增强配体结 合的异构化效应。医用麻醉药物通常是人γ-氨基丁酸A型受体的调节增强剂，其通常结合于 受体的穿膜区β3/α1亚基间的间隙，结合后可以增强受体胞外区结合配体引发的门控开关作 用。表观上增加了配体γ-氨基丁酸(GABA)或其它激活配体诸如muscimol对受体的亲和强 度。以上是神经介质受体尤其是五聚体神经介质刺激离子通道激活机制的核心内容，可概括 为蛋白异构化机制，即两个不相邻的蛋白结构域随着各自结合调节分子的结合可以跨距离 影响另一个结构域。本专利采用这一方法来鉴定重组人γ-氨基丁酸A型受体的活性。
向配体和受体结合反应体系中分别添加一系列浓度的靶向人γ-氨基丁酸A型受体的麻醉 药物R-etomidate(结果如图6所示)和调节分子苯巴比妥类似物p-mTFD-MPAB(结果如图 7所示)。重组配体与两种麻醉药物的结合情况分别如图8和9所示，M286/β3为临床静脉用 麻醉药物R-etomidate在GABAAR的主要靶向位点，位于受体穿膜区β3和α1亚基之间，当 此位点被突变成胱氨酸或其他氨基酸残基后对药物结合的活性将产生较大的影响；GABAAR(α1)2(β3)3M286C-MTSL是在受体蛋白该突变位点标记上一个化学基团(如本例中的S-(1-oxyl-2,2,5,5-tetramethyl-2,5-dihydro-1H-pyrrol-3-yl)methylmethanesulfonothioate， MTSL)，起到进一步阻碍etomidate对受体的结合、影响其胞外区结合配体。R-mTFD-MPAB 是barbiturate类似物，作用和etomidate十分相似，但是靶向部位和etomidate相邻，如图 9所示，位于受体穿膜区α1和β3亚基之间。通过同一受体对不同靶部位药物分子的敏感 性的比较来证明重组受体的配体结合可调控性(结构异构性)、和药理学特性。
用放射性配体结合实验来测定每个对应药物浓度下配体与受体的结合程度，比较药物增强 的程度和相应受体和药物的亲和性。本实施例中选用的R-etomidate的系列测试浓度是： 0.001～1600μM。p-mTFD-MPAB的系列测试浓度是：0.01～300μM。从图6可以看出测试各受 体结合配体[3H]muscimol受R-etomidate的调控作用比较，受体分别是：在细胞膜上的野 生型受体(α1)2(β3)3和突变受体(α1)2(β3)3M286C及重组到asolectin脂质体上的在β3亚 基M286C位点标记有MTSL的受体(α1)2(β3)3M286C-MTSL。相对于野生型(α1)2(β3)3受 体，(α1)2(β3)3M286C在细胞膜上对etomidate的亲和性显著降低，它们EC50的值分别为～0.28μM和～110μM。脂质体上的(α1)2(β3)3M286C-MTSL失去了对etomidate的结合活性，这也表明M286/β3确实是对etomidate敏感的位点。测试上述受体结合[3H]muscimol受 R-mTFD-MPAB调控作用的比较过程中发现，野生型(α1)2(β3)3受体、(α1)2(β3)3M286C在细 胞膜上对R-mTFD-MPAB亲和性相同：～28/29μM。对于最高的三个测试R-mTFD-MPAB浓 度：30、100、300μM，该药物对纯化前的细胞膜上的突变体(α1)2(β3)3M286C和纯化后 重组到的(α1)2(β3)3M286C-MTSL结合配体的增强作用具有较强的可比性，这表明重组后的 受体与天然细胞膜上的受体活性有高度可比性。
神经介质离子通道蛋白是一种相对脆弱的蛋白，所以在提纯时detergent的选取应该选取 温和且尽小可能不变性蛋白。磷脂对蛋白的相对比率不能太小，太小则造成蛋白的聚集，脂 质体易泄露；Detergent移除的速率在脂质体形成阶段应选择慢速，有利于形成均匀分布的蛋 白脂质体。重组阶段需要移除detergent，高CMC的detergent由于当浓度降到低于CMC时在 溶液体系中以单体存在，故容易剔出。本专利中选用DDM和CHAPS，这两者在五亚基配体 激活门控离子通道受体蛋白(GLIC,GlyR,GABAAR)的溶解(solubilization)阶段和重组开始的 蛋白处于micelle阶段都有报道，二者兼顾温和、溶解效率高优点。DDM在GABAAR的溶解 过程中对受体的保护效率最高(溶解效率80％)，CHAPS是一种高CMC的两性离子 (zwitterionic)detergent，容易通过透析、凝胶过滤、稀释法、bio-beads吸附去除，适合做为重 组开始时以微团状态稳定神经介质离子通道蛋白的detergent。
从图3A中可以看出，通过光散射方法测定的CHAPS溶解脂质体的过程，表明每一种脂 分子浓度，从脂质体溶解的开始到最后形成micelle的包围状态，分别对应不同的CHAPS总 浓度，而且这种对应关系随脂分子在溶液的总浓度变化成线性对应关系。这两个线性关系也 界定了如图3B所示的蛋白脂质体从溶解状态向形成的三个阶段(I、II、III)所对应的detergent (CHAPS)在这些相变分界上的‘阈值’。这个现象说明可以根据实际的蛋白和脂分子的对 应比例，通过逐步分阶段降低detergent(CHAPS)浓度的方式来控制micelle微团结构，经由 中间关键过渡混合状态(micelle微团和CHAPS饱和的蛋白脂质体脂质体共存)向蛋白脂质体 形成的过程。比较以往其他诸如透析、普通稀释、凝胶过滤、bio-beads吸附法，第一次根据 上述三个阶段，采用分步、每段可控速率的稀释方式降低重组溶液体系中的detergent浓度， 精确的控制蛋白脂质体的形成，结合超速离心阶段高效率的回收，这是一种有效的具有普遍 示范意义的对低表达量、蛋白稳定性弱、排斥其他重组去detergent方法的创新。尤其适用于 现阶段尚无先例的体外重组细胞工程表达的人源γ-氨基丁酸A型受体。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明 书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域， 均同理包括在本发明的专利保护范围内。
序列表
<110> 五邑大学
<120> 一种复杂结构膜蛋白-脂质体的体外重组方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 467
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Met Ser Ser Pro Asn Ile Trp Ser Thr Gly Ser Ser Val Tyr Ser Thr
1 5 10 15
Pro Val Phe Ser Gln Lys Met Thr Val Trp Ile Leu Leu Leu Leu Ser
20 25 30
Leu Tyr Pro Gly Phe Thr Ser Gln Lys Ser Asp Asp Asp Tyr Glu Asp
35 40 45
Tyr Ala Ser Asn Lys Thr Trp Val Leu Thr Pro Lys Val Pro Glu Gly
50 55 60
Asp Val Thr Val Ile Leu Asn Asn Leu Leu Glu Gly Tyr Asp Asn Lys
65 70 75 80
Leu Arg Pro Asp Ile Gly Val Lys Pro Thr Leu Ile His Thr Asp Met
85 90 95
Tyr Val Asn Ser Ile Gly Pro Val Asn Ala Ile Asn Met Glu Tyr Thr
100 105 110
Ile Asp Ile Phe Phe Ala Gln Thr Trp Tyr Asp Arg Arg Leu Lys Phe
115 120 125
Asn Ser Thr Ile Lys Val Leu Arg Leu Asn Ser Asn Met Val Gly Lys
130 135 140
Ile Trp Ile Pro Asp Thr Phe Phe Arg Asn Ser Lys Lys Ala Asp Ala
145 150 155 160
His Trp Ile Thr Thr Pro Asn Arg Met Leu Arg Ile Trp Asn Asp Gly
165 170 175
Arg Val Leu Tyr Thr Leu Arg Leu Thr Ile Asp Ala Glu Cys Gln Leu
180 185 190
Gln Leu His Asn Phe Pro Met Asp Glu His Ser Cys Pro Leu Glu Phe
195 200 205
Ser Ser Tyr Gly Tyr Pro Arg Glu Glu Ile Val Tyr Gln Trp Lys Arg
210 215 220
Ser Ser Val Glu Val Gly Asp Thr Arg Ser Trp Arg Leu Tyr Gln Phe
225 230 235 240
Ser Phe Val Gly Leu Arg Asn Thr Thr Glu Val Val Lys Thr Thr Ser
245 250 255
Gly Asp Tyr Val Val Met Ser Val Tyr Phe Asp Leu Ser Arg Arg Met
260 265 270
Gly Tyr Phe Thr Ile Gln Thr Tyr Ile Pro Cys Thr Leu Ile Val Val
275 280 285
Leu Ser Trp Val Ser Phe Trp Ile Asn Lys Asp Ala Val Pro Ala Arg
290 295 300
Thr Ser Leu Gly Ile Thr Thr Val Leu Thr Met Thr Thr Leu Ser Thr
305 310 315 320
Ile Ala Arg Lys Ser Leu Pro Lys Val Ser Tyr Val Thr Ala Met Asp
325 330 335
Leu Phe Val Ser Val Cys Phe Ile Phe Val Phe Ser Ala Leu Val Glu
340 345 350
Tyr Gly Thr Leu His Tyr Phe Val Ser Asn Arg Lys Pro Ser Lys Asp
355 360 365
Lys Asp Lys Lys Lys Lys Asn Pro Ala Pro Thr Ile Asp Ile Arg Pro
370 375 380
Arg Ser Ala Thr Ile Gln Met Asn Asn Ala Thr His Leu Gln Glu Arg
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Asp Glu Glu Tyr Gly Tyr Glu Cys Leu Asp Gly Lys Asp Cys Ala Ser
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Phe Pro Thr Ala Phe Cys Leu Phe Asn Leu Val Tyr Trp Val Ser Tyr
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Leu Tyr Leu
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
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ggcagagcga ggacgcccct ctgctctggc gcgcccggac tcggactcgc agactcgcgc 120
tggctccagt ctctccacga ttctctctcc cagacttttc cccggtctta agagatcctg 180
tgtccagagg gggccttagc tgctccagcc cgcgatgagg aaaagtccag gtctgtctga 240
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tacaagagca gaagttgttt atgaatggac cagagagcca gcacgctcag tggttgtagc 840
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agtctccttc tggctcaaca gagagtctgt accagcaaga actgtctttg gagtaacaac 1080
tgtgctcacc atgacaacat tgagcatcag tgccagaaac tccctcccta aggtggctta 1140
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cttaaagaat ttgaaagttt ccttattttc ataattcatt taagacaaga gacccctgtc 1740
tg 1742
<210> 3
<211> 473
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Met Trp Gly Leu Ala Gly Gly Arg Leu Phe Gly Ile Phe Ser Ala Pro
1 5 10 15
Val Leu Val Ala Val Val Cys Cys Ala Gln Ser Val Asn Asp Pro Gly
20 25 30
Asn Met Ser Phe Val Lys Glu Thr Val Asp Lys Leu Leu Lys Gly Tyr
35 40 45
Asp Ile Arg Leu Arg Pro Asp Phe Gly Gly Pro Pro Val Cys Val Gly
50 55 60
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65 70 75 80
Asp Tyr Thr Leu Thr Met Tyr Phe Gln Gln Tyr Trp Arg Asp Lys Arg
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Leu Ala Tyr Ser Gly Ile Pro Leu Asn Leu Thr Leu Asp Asn Arg Val
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Leu Thr Ser Leu Glu Val His Asn Glu Met Asn Glu Val Ser Gly Gly
370 375 380
Ile Gly Asp Thr Arg Asn Ser Ala Ile Ser Phe Asp Asn Ser Gly Ile
385 390 395 400
Gln Tyr Arg Lys Gln Ser Met Pro Arg Glu Gly His Gly Arg Phe Leu
405 410 415
Gly Asp Arg Ser Leu Pro His Lys Lys Thr His Leu Arg Arg Arg Ser
420 425 430
Ser Gln Leu Lys Ile Lys Ile Pro Asp Leu Thr Asp Val Asn Ala Ile
435 440 445
Asp Arg Trp Ser Arg Ile Val Phe Pro Phe Thr Phe Ser Leu Phe Asn
450 455 460
Leu Val Tyr Trp Leu Tyr Tyr Val Asn
465 470
<210> 4
<211> 1634
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 4
cgtcgcgacg gcggcggggc gccccctccc ccgtgccggg gcgcggcgga gggatgtggg 60
gccttgcggg aggaaggctt ttcggcatct tctcggcccc ggtgctggtg gctgtggtgt 120
gctgcgccca gagtgtgaac gatcccggga acatgtcctt tgtgaaggag acggtggaca 180
agctgttgaa aggctacgac attcgcctaa gacccgactt cgggggtccc ccggtctgcg 240
tggggatgaa catcgacatc gccagcatcg acatggtttc cgaagtcaac atggattata 300
ccttaaccat gtattttcaa caatattgga gagataaaag gctcgcctat tctgggatcc 360
ctctcaacct cacgcttgac aatcgagtgg ctgaccagct atgggtgccc gacacatatt 420
tcttaaatga caaaaagtca tttgtgcatg gagtgacagt gaaaaaccgc atgatccgtc 480
ttcaccctga tgggacagtg ctgtatgggc tcagaatcac cacgacagca gcatgcatga 540
tggacctcag gagatacccc ctggacgagc agaactgcac tctggaaatt gaaagctatg 600
gctacaccac ggatgacatt gagttttact ggcgaggcgg ggacaaggct gttaccggag 660
tggaaaggat tgagctcccg cagttctcca tcgtggagca ccgtctggtc tcgaggaatg 720
ttgtcttcgc cacaggtgcc tatcctcgac tgtcactgag ctttcggttg aagaggaaca 780
ttggatactt cattcttcag acttatatgc cctctatact gataacgatt ctgtcgtggg 840
tgtccttctg gatcaattat gatgcatctg ctgctagagt tgccctcggg atcacaactg 900
tgctgacaat gacaaccatc aacacccacc ttcgggagac cttgcccaaa atcccctatg 960
tcaaagccat tgacatgtac cttatgggct gcttcgtctt tgtgttcctg gcccttctgg 1020
agtatgcctt tgtcaactac attttctttg gaagaggccc tcaaaggcag aagaagcttg 1080
cagaaaagac agccaaggca aagaatgacc gttcaaagag cgaaagcaac cgggtggatg 1140
ctcatggaaa tattctgttg acatcgctgg aagttcacaa tgaaatgaat gaggtctcag 1200
gcggcattgg cgataccagg aattcagcaa tatcctttga caactcagga atccagtaca 1260
ggaaacagag catgcctcga gaagggcatg ggcgattcct gggggacaga agcctcccgc 1320
acaagaagac ccatctacgg aggaggtctt cacagctcaa aattaaaata cctgatctaa 1380
ccgatgtgaa tgccatagac agatggtcca ggatcgtgtt tccattcact ttttctcttt 1440
tcaacttagt ttactggctg tactatgtta actgagtgac tgtacttgat ttttcaaaga 1500
cttcatttaa cactgagtga aatattactc tgcctgtcaa gtttttatac ctgtacacac 1560
acagacacac aagcagacac acacatatat acatacgcaa ttgtatatat atgtgaactt 1620
ctcagcatat atat 1634
<210> 5
<211> 467
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
Met Ser Ser Pro Asn Ile Trp Ser Thr Gly Ser Ser Val Tyr Ser Thr
1 5 10 15
Pro Val Phe Ser Gln Lys Met Thr Val Trp Ile Leu Leu Leu Leu Ser
20 25 30
Leu Tyr Pro Gly Phe Thr Ser Gln Lys Ser Asp Asp Asp Tyr Glu Asp
35 40 45
Tyr Ala Ser Asn Lys Thr Trp Val Leu Thr Pro Lys Val Pro Glu Gly
50 55 60
Asp Val Thr Val Ile Leu Asn Asn Leu Leu Glu Gly Tyr Asp Asn Lys
65 70 75 80
Leu Arg Pro Asp Ile Gly Val Lys Pro Thr Leu Ile His Thr Asp Met
85 90 95
Tyr Val Asn Ser Ile Gly Pro Val Asn Ala Ile Asn Met Glu Tyr Thr
100 105 110
Ile Asp Ile Phe Phe Ala Gln Thr Trp Tyr Asp Arg Arg Leu Lys Phe
115 120 125
Asn Ser Thr Ile Lys Val Leu Arg Leu Asn Ser Asn Met Val Gly Lys
130 135 140
Ile Trp Ile Pro Asp Thr Phe Phe Arg Asn Ser Lys Lys Ala Asp Ala
145 150 155 160
His Trp Ile Thr Thr Pro Asn Arg Met Leu Arg Ile Trp Asn Asp Gly
165 170 175
Arg Val Leu Tyr Thr Leu Arg Leu Thr Ile Asp Ala Glu Cys Gln Leu
180 185 190
Gln Leu His Asn Phe Pro Met Asp Glu His Ser Cys Pro Leu Glu Phe
195 200 205
Ser Ser Tyr Gly Tyr Pro Arg Glu Glu Ile Val Tyr Gln Trp Lys Arg
210 215 220
Ser Ser Val Glu Val Gly Asp Thr Arg Ser Trp Arg Leu Tyr Gln Phe
225 230 235 240
Ser Phe Val Gly Leu Arg Asn Thr Thr Glu Val Val Lys Thr Thr Ser
245 250 255
Gly Asp Tyr Val Val Met Ser Val Tyr Phe Asp Leu Ser Arg Arg Met
260 265 270
Gly Tyr Phe Thr Ile Gln Thr Tyr Ile Pro Cys Thr Leu Ile Val Val
275 280 285
Leu Ser Trp Val Ser Phe Trp Ile Asn Lys Asp Ala Val Pro Ala Arg
290 295 300
Thr Ser Leu Gly Ile Thr Thr Val Leu Thr Met Thr Thr Leu Ser Thr
305 310 315 320
Ile Ala Arg Lys Ser Leu Pro Lys Val Ser Tyr Val Thr Ala Met Asp
325 330 335
Leu Phe Val Ser Val Cys Phe Ile Phe Val Phe Ser Ala Leu Val Glu
340 345 350
Tyr Gly Thr Leu His Tyr Phe Val Ser Asn Arg Lys Pro Ser Lys Asp
355 360 365
Lys Asp Lys Lys Lys Lys Asn Pro Ala Pro Thr Ile Asp Ile Arg Pro
370 375 380
Arg Ser Ala Thr Ile Gln Met Asn Asn Ala Thr His Leu Gln Glu Arg
385 390 395 400
Asp Glu Glu Tyr Gly Tyr Glu Cys Leu Asp Gly Lys Asp Cys Ala Ser
405 410 415
Phe Phe Cys Cys Phe Glu Asp Cys Arg Thr Gly Ala Trp Arg His Gly
420 425 430
Arg Ile His Ile Arg Ile Ala Lys Met Asp Ser Tyr Ala Arg Ile Phe
435 440 445
Phe Pro Thr Ala Phe Cys Leu Phe Asn Leu Val Tyr Trp Val Ser Tyr
450 455 460
Leu Tyr Leu
465
<210> 6
<211> 1745
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 6
cctgacgctt tgatggtatc tgcaagcgtt tttgctgatc ttatctctgc cccctgaata 60
ttaattccct aatctggtag caatccatct ccccagtgaa ggacctacta gaggcaggtg 120
gggggagcca ccatcagatc atcaagcata agaataatac aaaggggagg gattcttctg 180
caaccaagag gcaagaggcg agagaaggaa aaaaaaaaaa aaagcgatga gttcaccaaa 240
tatatggagc acaggaagct cagtctactc gactcctgta ttttcacaga aaatgacggt 300
gtggattctg ctcctgctgt cgctctaccc tggcttcact agccagaaat ctgatgatga 360
ctatgaagat tatgcttcta acaaaacatg ggtcttgact ccaaaagttc ctgagggtga 420
tgtcactgtc atcttaaaca acctgctgga aggatatgac aataaacttc ggcctgatat 480
aggagtgaag ccaacgttaa ttcacacaga catgtatgtg aatagcattg gtccagtgaa 540
cgctatcaat atggaataca ctattgatat attttttgcg caaatgtggt atgacagacg 600
tttgaaattt aacagcacca ttaaagtcct ccgattgaac agcaacatgg tggggaaaat 660
ctggattcca gacactttct tcagaaattc caaaaaagct gatgcacact ggatcaccac 720
ccccaacagg atgctgagaa tttggaatga tggtcgagtg ctctactccc taaggttgac 780
aattgatgct gagtgccaat tacaattgca caattttcca atggatgaac actcctgccc 840
cttggagttc tccagttatg gctatccacg tgaagaaatt gtttatcaat ggaagcgaag 900
ttctgttgaa gtgggcgaca caagatcctg gaggctttat caattctcat ttgttggtct 960
aagaaatacc accgaagtag tgaagacaac ttccggagat tatgtggtca tgtctgtcta 1020
ctttgatctg agcagaagaa tgggatactt taccatccag acctatatcc cctgcacact 1080
cattgtcgtc ctatcctggg tgtctttctg gatcaataag gatgctgttc cagccagaac 1140
atctttaggt atcaccactg tcctgacaat gaccaccctc agcaccattg cccggaaatc 1200
gctccccaag gtctcctatg tcacagcgat ggatctcttt gtatctgttt gtttcatctt 1260
tgtcttctct gctctggtgg agtatggcac cttgcattat tttgtcagca accggaaacc 1320
aagcaaggac aaagataaaa agaagaaaaa ccctgcccct accattgata tccgcccaag 1380
atcagcaacc attcaaatga ataatgctac acaccttcaa gagagagatg aagagtacgg 1440
ctatgagtgt ctggacggca aggactgtgc cagttttttc tgctgttttg aagattgtcg 1500
aacaggagct tggagacatg ggaggataca tatccgcatt gccaaaatgg actcctatgc 1560
tcggatcttc ttccccactg ccttctgcct gtttaatctg gtctattggg tctcctacct 1620
ctacctgtga ggaggtatgg gttttactga tatggttctt attcactgag tctcatggag 1680
agatgtctgt tctaagtcca cttaaataat cctctatgtg gttgataagt atctgaatct 1740
gtttc 1745

Claims (9)

1.一种复杂结构膜蛋白-脂质体的体外重组方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、在体外通过细胞工程方法进行诱导表达、纯化膜蛋白受体；
S2、在体外经通过控制稀释速度的方法分阶段使纯化后的膜蛋白受体从由detergent混合脂质体形成的micelle状态过渡到共存于micelle和形成的脂质体的中间状态，并最终完全地锚定于脂质体上得到所述膜蛋白-脂质体。
2.根据权利要求1所述的复杂结构膜蛋白-脂质体的体外重组方法，其特征在于：所述步骤S1中，所述膜蛋白包括神经介质离子通道受体、多聚体蛋白、多穿膜区膜蛋白或膜蛋白复合体。
3.根据权利要求2所述的复杂结构膜蛋白-脂质体的体外重组方法，其特征在于：所述神经介质离子通道受体包括人γ-氨基丁酸A型受体、人甘氨酸受体、C.Elegans谷氨酸受体、人乙酰胆碱受体、人5-羟色胺受体、细菌Gloeobacter Violaceus同源受体GLIC和/或细菌Erwinia chrysanthemi同源受体ELIC。
4.根据权利要求1所述的复杂结构膜蛋白-脂质体的体外重组方法，其特征在于：所述步骤S1中，纯化操作如下：通过detergent最大限度地让膜蛋白受体保持原始活性并被溶解到缓冲液中，在亲和层析柱上进行detergent的替换并加入由包含在detergent形成的micelle中的磷脂分子维持其结构的完整。
5.根据权利要求4所述的复杂结构膜蛋白-脂质体的体外重组方法，其特征在于：所述步骤S1中，所述膜蛋白为人γ-氨基丁酸A型受体，所述detergent为DDM或CHAPS，所述磷脂分子为大豆磷脂为脂分子。
6.根据权利要求5所述的复杂结构膜蛋白-脂质体的体外重组方法，其特征在于：所述人γ-氨基丁酸A型受体，其组成包括所述GABAAR的两种亚基(α1)2和(β3)3，或者三种亚基(α1)2/(β3)2/γ2异源型多亚基五聚体受体及其它亚基组成的GABAAR，所述其它亚基组成结构为(α1-6)2(β1–3)2X，其中，X是γ2orδ。
7.根据权利要求1所述的复杂结构膜蛋白-脂质体的体外重组方法，其特征在于：所述人γ-氨基丁酸A型受体α1亚基的Uniprot蛋白序列库的序列号为P14867，具体氨基酸序列如SeqNo.1所示，其相应的基因序列如SeqNo.2所示；所述人γ-氨基丁酸A型受体β3亚基的Uniprot蛋白序列库的序列号为P28472，具体氨基酸序列如SeqNo.3所示；所述的人γ-氨基丁酸A型受体γ2亚基的Uniprot蛋白序列库的序列号为P18507，具体氨基酸序列如SeqNo.5所示，其相应的基因序列如SeqNo.6所示。
8.根据权利要求1-7任一项所述的复杂结构膜蛋白-脂质体的体外重组方法，其特征在于：所述步骤S2中，所述控制稀释速度的方法具体包括以下步骤：
将所述步骤S1纯化后的膜蛋白受体通过三个连续阶段以不同速度梯度稀释逐步形成重组的膜蛋白-脂质体，所述三个连续阶段具体为：
A、Detergent、脂质体和纯化的膜蛋白受体三者从混合状态下的起始微团形态；
B、微团和膜蛋白、脂质体共存中间阶段；
C、单一的受体脂质体阶段；
稀释操作中，选择相邻阶段转换的detergent的临界浓度作为每一阶段的起始点或稀释终点，并在脂质体和微团混合中间阶段保持缓慢且匀速稀释。
9.根据权利要求1-7任一项所述的复杂结构膜蛋白-脂质体的体外重组方法，其特征在于：所述方法还包括步骤S3，通过超速离心法将重组到脂质体膜上的膜蛋白收集、重悬浮于缓冲液中。
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