WO2018181538A1 - ナノディスクとその製造方法 - Google Patents

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WO2018181538A1
WO2018181538A1 PCT/JP2018/012899 JP2018012899W WO2018181538A1 WO 2018181538 A1 WO2018181538 A1 WO 2018181538A1 JP 2018012899 W JP2018012899 W JP 2018012899W WO 2018181538 A1 WO2018181538 A1 WO 2018181538A1
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nanodisk
lipid
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lipopeptide biosurfactant
solution
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PCT/JP2018/012899
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恵広 柳澤
忠夫 辻
井村　知弘
敏彰 平
明 遠藤
Original Assignee
株式会社カネカ
国立研究開発法人産業技術総合研究所
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    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
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    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J13/00—Colloid chemistry, e.g. the production of colloidal materials or their solutions, not otherwise provided for; Making microcapsules or microballoons
    • B01J13/02—Making microcapsules or microballoons

Definitions

  • the present invention relates to a nanodisk that can be easily manufactured and can disperse a hydrophobic compound well in water, and a simple method for manufacturing the nanodisk.
  • compositions such as cosmetics and pharmaceutical compositions are hydrophobic and are difficult to disperse in aqueous solvents. It is conceivable to use organic solvents to disperse hydrophobic compounds, but for personal care and pharmaceutical compositions applied to the human body, even ethanol and isopropanol can be used in reduced amounts or avoided. Tend to. Therefore, surfactants are frequently used to disperse hydrophobic compounds in aqueous solvents, particularly in personal care compositions.
  • the hydrophobic compound may not be sufficiently dispersed by simply blending the surfactant. Therefore, various techniques for improving the dispersibility of the hydrophobic compound have been developed. For example, it is known that when the concentration of a surfactant in an aqueous solution increases, micelles and vesicles in which the hydrophilic portion of the surfactant is gathered outward are formed, and the hydrophobic portion in the interior is hydrophobic. It is known that a hydrophobic compound can be dispersed by encapsulating the compound. Vesicles formed with phospholipids are called liposomes. Further, in the invention described in Patent Document 1, a liposome is made into a multi-membrane structure by blending a water-soluble polymer, and the membrane formation efficiency and membrane stability are enhanced.
  • nanodisks having a lipid bilayer structure similar to liposomes have been developed.
  • the nanodisk has a structure in which the hydrophobic side surface of a disk composed of a lipid bilayer is coated with an amphiphilic membrane scaffold protein (Non-patent Documents 1, Patent Documents 1 and 2).
  • the thickness is several nanometers, and the diameter is very small, less than 10 nm. Therefore, the nanodisk dispersion is very transparent.
  • the lipid bilayer membrane of Nanodisc is the same as the lipid bilayer membrane of cells, it is considered that the membrane protein contained in Nanodisc retains its structure and activity in the cell membrane as it is. It is expected that research on membrane proteins will progress dramatically.
  • an object of the present invention is to provide a nanodisk that can be easily produced and that can favorably disperse a hydrophobic compound in water, and a simple method for producing the nanodisk.
  • a nanodisk comprising a lipid bilayer and a lipopeptide biosurfactant.
  • a method for producing a nanodisk comprising a step of mixing a lipid and a lipopeptide biosurfactant in an aqueous solvent.
  • a cosmetic comprising the nanodisk according to any one of [1] to [5] above.
  • lipopeptide biosurfactant is surfactin represented by the following formula (I) or a salt thereof.
  • formula (I) an amino acid residue selected from leucine, isoleucine and valine; R 1 represents a C 9-18 alkyl group]
  • a method for dispersing a hydrophobic compound in an aqueous solvent comprising a step of producing a nanodisk containing a hydrophobic compound, a lipid bilayer and a lipopeptide biosurfactant in an aqueous solvent. how to.
  • the membrane scaffold protein used in the conventional nanodisks takes time and effort to design and manufacture.
  • the lipopeptide biosurfactant used in the present invention is produced by a microorganism and can be produced relatively easily.
  • the nanodisk according to the present invention can be manufactured by a very simple method as compared with the conventional nanodisk that could not be manufactured without complicated processes. Furthermore, if the nanodisk according to the present invention is used, it is possible to disperse the hydrophobic compound well in an aqueous solvent to obtain a visually transparent composition, and the transdermal characteristics of the hydrophobic compound are remarkably improved.
  • the nanodisk of the present invention having a lipid bilayer structure similar to cells may significantly improve the transdermal properties of hydrophilic compounds present in the vicinity thereof. Therefore, the present invention is very excellent industrially as a technique that contributes to the development of personal care compositions and pharmaceutical compositions having excellent characteristics.
  • FIG. 1 is a photograph of the appearance of a liposome dispersion and a nanodisk dispersion according to the present invention.
  • FIG. 2 is a graph showing changes over time in the transmittance of a liposome dispersion to which a predetermined amount of surfactin sodium solution is added.
  • FIG. 3 is a chromatogram showing the result of analyzing the nanodisk dispersion prepared by adding a predetermined amount of surfactin sodium solution to the liposome dispersion by size exclusion chromatography.
  • FIG. 4 is a transmission electron micrograph of a nanodisk dispersion prepared by adding a predetermined amount of surfactin sodium solution to a liposome dispersion.
  • FIG. 5 is a chromatogram showing the result of analyzing the coenzyme Q10-containing nanodisk dispersion prepared by adding a predetermined amount of surfactin sodium solution to a liposome dispersion containing coenzyme Q10 by size exclusion chromatography and purified. It is a particle size distribution map of a nano disk fraction.
  • FIG. 6 is a transmission electron micrograph of a nanodisk dispersion containing coenzyme Q10 prepared by adding a predetermined amount of surfactin sodium solution to a liposome dispersion containing coenzyme Q10.
  • FIG. 6 is a transmission electron micrograph of a nanodisk dispersion containing coenzyme Q10 prepared by adding a predetermined amount of surfactin sodium solution to a liposome dispersion containing coenzyme Q10.
  • FIG. 7 is a chromatogram showing the result of analyzing a mixed solution of phospholipid and surfactin sodium by size exclusion chromatography, and a particle size distribution diagram of the purified Nanodisc fraction.
  • FIG. 8 shows (1) a liposome dispersion containing catechin, which is a hydrophobic compound, (2) a nanodisc solution prepared via liposomes, and (3) a nanodisc solution prepared in a short process not via liposomes. It is an appearance photograph.
  • FIG. 9 is an appearance photograph of a nanodisk solution before lyophilization containing a hydrophobic compound, a lyophilized nanodisk, and a solution obtained by adding water to the lyophilized nanodisk.
  • FIG. 10 is an appearance photograph of a mixture obtained by redispersing freeze-dried nanodisks in water.
  • the nanodisk according to the present invention includes a lipid bilayer and a lipopeptide biosurfactant.
  • a typical nanodisk is stabilized with a structure in which the hydrophobic part of the membrane scaffold protein, which is amphiphilic, is bonded to the side hydrophobic part of the lipid bilayer, and the hydrophilic part faces outward.
  • the nanodisk according to the present invention is stabilized with a structure in which the hydrophobic part of the lipopeptide biosurfactant is bonded to the side hydrophobic part of the lipid bilayer and coated, and the hydrophilic part faces outward. Conceivable.
  • examples are also known in which a cyclic peptide is stuck in the lipid bilayer as an ion channel, or a lipid having a bulky hydrophobic portion and a surfactant compound having a bulky hydrophilic portion form a bilayer. Therefore, even in the nanodisk according to the present invention, there is a possibility that some lipopeptide biosurfactants form a bilayer together with lipids.
  • the nanodisk according to the present invention may have a thickness of 2 nm to 10 nm and a diameter of 5 nm to 20 nm in a single layer state.
  • the thickness is preferably 3 nm or more, more preferably 4 nm or more, and preferably 8 nm or less, more preferably 6 nm or less.
  • the diameter is preferably 6 nm or more, more preferably 7 nm or more, and is preferably 15 nm or less, more preferably 12 nm or less.
  • the lipid constituting the lipid bilayer is a compound having a hydrophilic head and a hydrophobic tail, and is not particularly limited as long as it can form a lipid bilayer.
  • glycerophospholipid, sphingophospholipid, sugar Examples thereof include lipids, synthetic lipids, sterols, long chain fatty acids, long chain fatty alcohols, glycerin fatty acid esters, and carboxylic acid type lipids.
  • a synthetic lipid what is marketed can be used, for example.
  • Glycerophospholipid is a phospholipid having a structure in which two fatty acids, glycerin, phosphoric acid and choline are combined.
  • dioleoylphosphatidylcholine DOPC
  • DLPC dilauroylphosphatidylcholine
  • DMPC dimyristoylphosphatidylcholine
  • Examples include palmitoyl phosphatidylcholine (DPPC), distearoyl phosphatidylcholine (DSPC), 1-palmitoyl-2-oleoyl phosphatidylcholine (POPC), 1-stearoyl-2-myristoyl phosphatidylcholine, dilinoleyl phosphatidylcholine, and the like.
  • phosphatidylcholine is also called lecithin, and egg yolk or soybean-derived lecithin or a derivative thereof such as hydrogenated lecithin may be used.
  • examples of the glycerophospholipid include glycerophospholipids represented by the above formula (II).
  • examples of the C 10-24 alkyl group include n-decyl, 8-methylnonyl, n-undecyl, 9-methyldecyl, n-dodecyl, 10-methylundecyl, n-tridecyl, 11- Examples include methyldodecyl, n-tetradecyl, n-pentadecyl, n-hexadecyl, n-heptadecyl, n-octadecyl, n-nonadecyl, n-icosyl, n-docosyl, n-tetracosyl and the like.
  • Examples of the C 10-24 alkenyl group include decenyl, dodecenyl, tetradecenyl, hexadecenyl, octadecenyl, icocenyl, dococenyl, tetracocenyl and the like.
  • sphingophospholipids include sphingomyelin.
  • glycolipids include mannosyl erythritol lipid, sophorolipid, sulfoxyribosyl glyceride, diglycosyl diglyceride, digalactosyl diglyceride, galactosyl diglyceride, glycosyl diglyceride, galactosyl cerebroside, lactosyl cerebroside, ganglioside and the like.
  • sterols examples include sterols derived from animals such as cholesterol succinic acid, lanosterol, dihydrolanosterol, desmosterol and dihydrocholesterol; sterols derived from plants (phytosterol) such as stigmasterol, sitosterol, campesterol and brassicasterol; And sterols derived from microorganisms such as ergosterol.
  • animals such as cholesterol succinic acid, lanosterol, dihydrolanosterol, desmosterol and dihydrocholesterol
  • sterols derived from plants (phytosterol) such as stigmasterol, sitosterol, campesterol and brassicasterol
  • sterols derived from microorganisms such as ergosterol.
  • the long chain fatty acid and the long chain fatty alcohol a fatty acid having 10 or more carbon atoms and an aliphatic alcohol can be used.
  • the upper limit of the carbon number of the long chain fatty acid and the long chain fatty alcohol is not particularly limited, but is preferably 30 or less from the viewpoint of more reliably forming the lipid bilayer.
  • long chain fatty acids and long chain fatty alcohols include saturated long chain fatty acids such as palmitic acid, stearic acid, lauric acid, myristic acid, arachidic acid, docosanoic acid, tetracosanoic acid; palmitoleic acid, oleic acid, Unsaturated long chain fatty acids such as arachidonic acid, vaccenic acid, linoleic acid, linolenic acid, arachidonic acid; long chain aliphatic alcohols such as oleyl alcohol, stearyl alcohol, lauryl alcohol, myristyl alcohol, cetyl alcohol, linolyl alcohol Can do.
  • saturated long chain fatty acids such as palmitic acid, stearic acid, lauric acid, myristic acid, arachidic acid, docosanoic acid, tetracosanoic acid
  • palmitoleic acid, oleic acid Unsaturated long chain fatty acids such as arachi
  • glycerin fatty acid esters include monoacyl glycerides, diacyl glycerides, and triacyl glycerides.
  • carboxylic acid type lipid examples include 1,5-O-dihexadecyl-N-succinyl-L-glutamate (DHSG).
  • one kind of lipid may be used or two or more lipids may be used in combination, but one kind of lipid is preferably used.
  • a lipid DMPC and / or POPC are preferable, and DMPC is more preferable.
  • lecithin and hydrogenated lecithin derived from soybeans and egg yolk are preferred, lecithin is more preferred, and soybean-derived lecithin is even more preferred.
  • Lipopeptide biosurfactant has a peptide containing a hydrophobic group and a hydrophilic part, exhibits a surface-active action, and is produced by a microorganism.
  • examples of the lipopeptide biosurfactant include surfactin, arthrofactin, iturin, fendicine, serawetin, lykesin, and viscosin.
  • the lipopeptide biosurfactant is preferably surfactin represented by the above formula (I) or a salt thereof (hereinafter referred to as “surfactin (I)”).
  • surfactin (I) the root of the carboxymethyl group and the carboxyethyl group represents an optically active point.
  • X represents any one amino acid residue selected from leucine, isoleucine and valine.
  • the amino acid residue as X may be L-form or D-form, but L-form is preferred.
  • R 1 represents a C 9-18 alkyl group.
  • the “C 9-18 alkyl group” refers to a linear or branched monovalent saturated hydrocarbon group having 9 to 18 carbon atoms.
  • One or two or more of the above surfactins (I) may be used.
  • it may contain a plurality of surfactins (I) in which the C 9-18 alkyl group of R 1 is different.
  • Surfactin (I) can be isolated from the culture solution of microorganisms such as Bacillus subtilis according to a known method, and can be used as a purified product or an unpurified product.
  • the culture solution can be used as it is.
  • what is obtained by a chemical synthesis method can be used similarly.
  • Surfactin (I) salts can also be used.
  • the counter cation constituting the salt is not particularly limited, and examples thereof include alkali metal ions and ammonium ions.
  • the alkali metal ion that can be used for the salt of Surfactin (I) is not particularly limited, and represents a lithium ion, a sodium ion, a potassium ion, or the like. Further, the two alkali metal ions may be the same as or different from each other.
  • Examples of the substituent of ammonium ion include alkyl groups such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, and t-butyl; aralkyl groups such as benzyl, methylbenzyl, and phenylethyl; phenyl, toluyl, xylyl, and the like And an organic group such as an aryl group.
  • Examples of ammonium ions include tetramethylammonium ions, tetraethylammonium ions, pyridinium ions, and the like.
  • the two counter cations may be the same or different from each other.
  • One of the carboxy groups may be in the state of —COOH or —COO 2 — .
  • the amount of lipopeptide biosurfactant used may be appropriately adjusted within the range in which the nanodisk is formed.
  • the amount of the lipopeptide biosurfactant with respect to the phospholipid can be 0.4 times mol or more and 1.2 times mol or less. If the amount is 0.4 times mole or more, nanodisks are more reliably formed, and if the amount is 1.2 times moles or less, the amount of lipopeptide biosurfactant not involved in the formation of nanodisks is so much. It is economical, not excessive.
  • the nanodisk according to the present invention may contain components other than lipids and lipopeptide biosurfactants.
  • an aqueous solvent is mainly used as a solvent for cosmetics and pharmaceutical compositions, but there is a problem that a hydrophobic compound is difficult to disperse in an aqueous solvent.
  • a hydrophobic compound can be taken in and dispersed in an aqueous solvent, so that a highly transparent composition can be obtained.
  • the “aqueous solvent” refers to water and a mixed solvent of water-miscible organic solvent and water.
  • the water-miscible organic solvent refers to an organic solvent miscible with water without limitation, and examples thereof include C 1-3 alcohol, preferably ethanol or isopropanol.
  • a ratio of the water-miscible organic solvent in the said mixed solvent 10 mass% or less is preferable, 5 mass% or less is more preferable, and 2 mass% or less is more preferable.
  • the aqueous solvent may be a buffer solution, and the pH is not particularly limited.
  • Hydrophobic compound means a compound having a hydrophobic group, hardly soluble in water and soluble in oil.
  • “slightly soluble” means that 100 mL or more of water is required to dissolve 1 g of the hydrophobic compound at 20 ⁇ 5 ° C.
  • the hydrophobic compound used in the present invention is not particularly limited as long as it is an active ingredient to be blended in cosmetics and pharmaceutical compositions.
  • Agents, vitamins, amino acids and the like are examples of the like.
  • fat-soluble vitamins such as tocopherol, coenzyme Q10, reduced coenzyme Q10, and derivatives thereof; oils such as squalane; steroidal anti-inflammatory drugs such as hydrocortisone, prednisolone, dexamethasone, betamethasone; acetyl Non-steroidal anti-inflammatory drugs such as salicylic acid, ibuprofen, indomethacin, loxoprofen; antibiotics; antifungal agents; antiseptics such as methylparaben; fragrances such as menthol; and pigments such as alizanin.
  • oils such as squalane
  • steroidal anti-inflammatory drugs such as hydrocortisone, prednisolone, dexamethasone, betamethasone
  • acetyl Non-steroidal anti-inflammatory drugs such as salicylic acid, ibuprofen, indomethacin, loxoprofen
  • antibiotics antifungal agents
  • antiseptics such as
  • Arbutin and its derivatives L-ascorbic acid and its derivatives; Hydroquinone and its derivatives; Glutathione and its derivatives; Placental extract; Pantothenic acid and its derivatives; Tranexamic acid and its derivatives; Kojic acid and its derivatives; Derivatives; plant extracts such as chamomile extract and licorice extract; carotenoids such as beta carotene; astaxanthin and derivatives thereof; flavonoids; catechin and derivatives thereof; vitamin A and derivatives thereof; ⁇ -lipoic acid and derivatives thereof; glycyrrhizic acid Thiotaurine and derivatives thereof; urea and derivatives thereof; glycerin derivatives; salicylic acid and derivatives thereof; nicotinic acid and derivatives thereof; L-amino acids and derivatives thereof; Nosyn and its derivatives; plant female hormone-like components such as isoflavones; grabrizine and its derivatives; magnolignan and its derivative
  • the nanodisk according to the present invention may contain a membrane protein.
  • Membrane proteins are proteins that are bound to biological membranes, mainly biological membranes other than covalent bonds, such as endogenous membrane proteins, at least part of which are present in biological membranes, such as hydrophobic interactions and electrostatic interactions.
  • superficial membrane proteins that are bound to Conventionally when a membrane protein present in a biological membrane such as a cell membrane is isolated, the higher-order structure is changed and the original function is lost. Therefore, research on the function of the membrane protein has been considered very difficult.
  • the nanodisk according to the present invention has a lipid bilayer similar to a biological membrane, and the membrane protein is considered to maintain the structure in the biological membrane in the lipid bilayer. There is a possibility that research on functions will progress dramatically, and industrial use of membrane proteins, which has been difficult, will become possible.
  • the nanodisk according to the present invention may contain a hydrophilic compound.
  • the hydrophilic compound is not particularly limited as long as it is a compound showing affinity for water molecules. Many hydrophilic compounds exhibit water-solubility, and water-soluble hydrophilic compounds can be dissolved in an aqueous solvent, but they may be further stabilized by being adsorbed on the hydrophilic portion of the nanodisk. is there. It may also be possible to disperse the active ingredient, such as a metal oxide, which is hydrophilic but insoluble in water, in an aqueous solvent by adsorbing the hydrophilic part of the nanodisk. In some cases, a plurality of nanodisks are laminated together to form a multilayer structure. In this case, the hydrophilic compound may be present between the lipid bilayers.
  • hydrophilic compounds include ultraviolet scattering agents such as titanium oxide particles and zinc oxide particles; inorganic pigments such as bengara, titanium oxide, and iron oxide; water-soluble vitamins such as ascorbic acid and derivatives thereof; locust bean gum and guar gum Examples thereof include thickeners such as derivatives, carrageenan, pectin, xanthan gum, gellan gum, and alginic acid.
  • the amount of lipid and lipopeptide biosurfactant components in the nanodisk according to the present invention may be adjusted as appropriate.
  • the ratio of lipopeptide biosurfactant to 1 mol of lipid is 0.2 times mol or more and 1.5 times mol. It can be as follows.
  • the nanodisk according to the present invention can be produced by an extremely simple method of mixing at least a lipid and a lipopeptide biosurfactant in an aqueous solvent.
  • the lipid concentration in the reaction solution may be adjusted as appropriate. For example, it may be 0.1 mM or more and 100 mM or less, and preferably 0.5 mM or more and 50 mM or less.
  • the concentration of lipopeptide biosurfactant in the reaction solution can also be 0.1 mM or more and 100 mM or less, preferably 0.5 mM or more and 50 mM or less.
  • the amount of the hydrophobic compound and the hydrophilic compound is preferably 0.1 parts by mass or more and 100 parts by mass or less with respect to 100 parts by mass of the lipid, respectively. More preferably, not less than 50 parts by mass and more preferably not less than 1 part by mass and not more than 20 parts by mass.
  • the reaction conditions of the lipid and lipopeptide biosurfactant may be adjusted as appropriate within a range in which the formation of the nanodisk proceeds favorably.
  • the reaction temperature may be room temperature.
  • a phospholipid such as DMPC
  • reaction time can be 2 minutes or more and 50 hours or less.
  • nanodisks may not be formed by simply mixing each component, but even in such a case, the reaction temperature is relatively high, for example, 40 ° C. or higher.
  • the temperature is 80 ° C. or lower, a nanodisk may be formed.
  • 70 degrees C or less or 60 degrees C or less is preferable, and 50 degrees C or less or 40 degrees C or less is preferable.
  • the nanodisk according to the present invention can be produced by first preparing a liposome from a lipid and then adding a lipopeptide biosurfactant. That is, the lipid is dissolved in a lower alcohol solvent such as methanol, ethanol, and isopropanol, or an organic solvent such as chloroform, and then the organic solvent is distilled off to form a lipid film. An aqueous solvent is added and stirred to form liposomes.
  • the concentration of the liposome dispersion at this time may be adjusted as appropriate, and can be, for example, 0.1 mM or more and 100 mM or less, preferably 0.5 mM or more and 50 mM or less.
  • nanodisks can be obtained by adding lipopeptide biosurfactant.
  • concentration of the lipopeptide biosurfactant in the reaction solution may be appropriately adjusted. For example, it can be 0.1 mM or more and 100 mM or less, and preferably 0.5 mM or more and 50 mM or less.
  • a surfactant such as cholic acid
  • formation of the nanodisk may be facilitated by setting the temperature at which the lipopeptide biosurfactant is added to be relatively high, for example, 40 ° C. or more and 80 ° C. or less.
  • the hydrophilic compound may be added to the aqueous solvent as appropriate. It is preferable that the hydrophobic compound, the membrane protein, and the water-insoluble hydrophilic compound coexist with at least the lipid in the aqueous solvent.
  • the amount of the hydrophobic compound and the hydrophilic compound is preferably 0.1 parts by mass or more and 100 parts by mass or less, more preferably 0.5 parts by mass or more and 50 parts by mass or less, with respect to 100 parts by mass of lipid, respectively. More preferably, it is more than 20 parts by weight.
  • Lipids which are biomolecules, exhibit a surface-active action, thus assisting the dispersion of these compounds in an aqueous solvent.
  • a membrane protein it is also possible to bind the membrane protein to the nanodisk by cell-free synthesis of the membrane protein in the presence of the nanodisk according to the present invention.
  • the freeze-dried nanodisk may be dissolved again in an aqueous solvent.
  • the nanodisk concentration of the redissolved solution can be arbitrarily adjusted.
  • the nanodisk according to the present invention in particular, can incorporate a hydrophobic compound into the inside thereof and disperse it well in an aqueous solvent, and since it is very fine, the dispersion in the aqueous solvent is visually sufficient. It appears to be transparent and has high permeability to skin tissue.
  • the nanodisk according to the present invention is very effective particularly as a component of personal care compositions such as cosmetics and pharmaceutical compositions containing a hydrophobic compound as an active ingredient.
  • Example 1 Manufacture of nanodisks
  • DMPC Dimyristoylphosphatidylcholine
  • chloroform 0.5 mL
  • argon gas was blown into the test tube to remove chloroform, thereby forming a lipid film on the wall of the test tube.
  • a phosphate buffer solution pH 7.4, 3 mL
  • FIG. 1A shows the result of visual observation of a DMPC liposome dispersion liquid diluted with a phosphate buffer and adjusted to a concentration of 5 mM. Since the liposome has a large particle size, the dispersion becomes cloudy as is apparent from FIG.
  • SFNa surfactin sodium
  • 1 mL of the obtained 5 mM DMPC liposome dispersion so as to be 0.5-fold molar amount or 1-fold molar amount with respect to DMPC constituting the liposome, respectively.
  • 1 mL of each solution was added. This solution was stirred with a vortex mixer for 3 minutes, and then incubated at 25 ° C. for 12 hours using a constant temperature shake incubator (“BioShaker M-BR-022UP” manufactured by TAITEC). The results of visual observation of the dispersion are shown in FIGS. 1 (b) to 1 (c).
  • FIGS. 1 (b) to 1 (c) When SFNa is added in a 0.5-fold molar amount (FIG.
  • Example 2 Temporal change in turbidity of DMPC liposome dispersion by addition of SFNa
  • Addition reduces the turbidity of the dispersion. Therefore, not only visual observation but also the spectrophotometer (“V520” manufactured by JASCO Corporation) was used to evaluate the formation of nanodisks by tracking the temporal change in light transmittance at 650 nm.
  • FIG. 2 shows the change in turbidity over time when a predetermined amount of SFNa solution is added to a 5 mM DMPC liposome dispersion.
  • Example 3 Evaluation of Nanodisc Formation by Size Exclusion Chromatography Using a chromatography system ("AKTA purifier 900" manufactured by GE Healthcare), the formation of Nanodiscs by addition of SFNa was evaluated by size exclusion chromatography (SEC). did.
  • SEC size exclusion chromatography
  • As the column a gel filtration chromatography column ("Superose 6 10/300 GL” manufactured by GE Healthcare) was used, the detection wavelength was set to 220 nm, and the flow rate was set to 0.5 mL / min.
  • FIG. 3 shows the SEC elution curve of each dispersion prepared in the same manner as in Example 1. In addition, the hydrodynamic diameter was calculated from the retention time using a standard protein.
  • the liposome was eluted as it was at a position where the retention time was 15.5 minutes (excluded volume).
  • SFNa alone, peaks attributable to SFNa were observed at positions where the retention time was 33.1 minutes and 38.1 minutes. From FIG. 3, the retention time is 30.4 minutes when SFNa is added in a 0.5-fold molar amount to DMPC constituting the liposome, and the retention time is added when a 1.0-fold molar amount is added. A peak was observed at 31.1 minutes.
  • Example 4 Observation of nanodisks with a transmission electron microscope
  • a dispersion obtained by adding 0.5 or 1.0-fold molar amount of SFNa to DMPC liposomes An observation image with a transmission electron microscope (NS-TEM) is shown in FIG.
  • TEM observation H-7650 manufactured by Hitachi High-Technologies Corporation was used, and negative staining with sodium phosphotungstate was used.
  • the acceleration voltage was set to 120 kV, and the grid used was copper, 200 mesh, and carbon reinforced.
  • a 1% sodium phosphotungstate solution as a staining solution was prepared by weighing 50 mg of sodium phosphotungstate, adding 5 mL of ultrapure water, and stirring for 5 minutes in the dark.
  • the pH of the 1% sodium phosphotungstate solution was adjusted to pH 6.8 with 5M aqueous sodium hydroxide solution. Then, what was filtered with a 0.1 micrometer or 0.22 micrometer PVDF syringe filter was used. From FIG. 4, spherical particles observed when the nanodisk was observed from directly above and laminated particles recognized when observed from the side were confirmed.
  • the size of the disk is about 10-30 nm when SFNa is added in a 0.5-fold molar amount, and about 11-25 nm when SFNa is added in a 1.0-fold molar amount. It was also found that the larger the amount, the smaller the nanodisk particle size.
  • Example 5 Encapsulation of Coenzyme Q10 in Nanodisk First, coenzyme Q10, which is a hydrophobic compound (hereinafter abbreviated as “CoQ10”), was encapsulated in a liposome serving as a nanodisk precursor.
  • DMPC 20 mg
  • CoQ10 2.6 mg
  • Other operations were the same as in Example 1 to prepare liposomes.
  • the composition was such that 0.5 mM of CoQ10 was 1/10 with respect to 5 mM of DMPC liposomes.
  • a 1-fold molar amount of SFNa with respect to DMPC was added to the obtained liposome dispersion, and an attempt was made to prepare a nanodisk in the same manner as in Example 1.
  • the resulting dispersion was evaluated by size exclusion chromatography (SEC).
  • SEC size exclusion chromatography
  • measurement was also performed at 275 nm in order to detect CoQ10.
  • the SEC elution curve of the dispersion is shown in FIG.
  • a peak was obtained at a retention time of 32.8 minutes (hydrodynamic diameter of 11.3 nm) at an absorption wavelength of 220 nm attributable to SFNa.
  • a peak was obtained at a position with a retention time of 32.5 minutes (hydrodynamic diameter: 11.7 nm).
  • FIG. 6 shows the results of observation of CoQ10-encapsulated nanodisks by the same operation as in Example 4 using a negative staining method transmission electron microscope (NS-TEM). 6. From FIG. 6, even when CoQ10 was enclosed, spherical particles observed when the nanodisk was observed from directly above and laminated particles recognized when observed from the side were confirmed.
  • NS-TEM transmission electron microscope
  • Example 6 Preparation of nanodisks in a short process Unlike Example 1, it was attempted to prepare nanodisks without going through precursor liposomes.
  • DMPC 3.4 mg
  • equimolar amount of SFNa 5.2 mg
  • 2 mL of phosphate buffer (pH 7.4) was added thereto, and the mixture was incubated at 25 ° C. for 12 hours using a constant-temperature shaking incubator (“BioShaker M-BR-022UP” manufactured by TAITEC).
  • DMPC powder was confirmed at least 3 hours after the start of incubation, but became a clear solution after 12 hours.
  • Example 3 the formation of nanodisks was confirmed by size exclusion chromatography (SEC) using a chromatography system (“AKTA purifier 900” manufactured by GE Healthcare). The results are shown in FIG. As shown in FIG. 7 (a), a peak was detected at a position having a retention time of 31.0 minutes (hydrodynamic diameter: 13.2 nm) which was almost the same as that of the dispersion liquid added with 1.0-fold molar amount of SFNa in Example 3. It was. Moreover, when the dynamic light scattering (DLS) measurement of the solution fractionated from SEC was performed (FIG.7 (b)), the nanodisk whose average particle diameter is 12.3 +/- 2.9nm was confirmed.
  • DLS dynamic light scattering
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • Example 7 Encapsulation of hydrophobic compound in Nanodisc (1) Production method via liposome A catechin mixture (3.1 mg, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and DMPC (51.84 mg) were placed in a 15 mL falcon tube, and Methanol (1 mL) was added and dissolved. The mixture was dried by blowing argon gas while stirring the mixture using a vortex mixer, and then further dried for 3 hours in a desiccator. After drying, PBS buffer (5 mL, pH 7.4) was added, allowed to stand for 10 minutes, and then stirred for 3 minutes using a vortex mixer to prepare a liposome dispersion.
  • (2) Production method by short process Catechin mixture (3.1 mg), DMPC (51.84 mg) and SFNa (81.04 mg) were put in a 15 mL falcon tube, and PBS buffer (10 mL, pH 7.4) was further added. The mixture was stirred for 5 minutes using a vortex mixer and then stirred at 180 rpm and 25 ° C. for 20 hours using a shaker.
  • FIG. 8 An appearance photograph of the above-mentioned liposome dispersion, the nanodisk solution prepared via the liposome, and the nanodisk solution prepared by a short process not via the liposome is shown in FIG.
  • the liposomes were cloudy, the nanodisk solution was transparent while being an aqueous solvent containing catechin, which is a hydrophobic compound, and at least the insoluble component could not be confirmed visually.
  • Other hydrophobic compounds Nanodisks were prepared in the same manner except that the hydrophobic compound (3.1 mg) shown in Table 1 was used instead of the catechin mixture.
  • the solvent used at the time of producing a liposome was changed according to the solubility with respect to the hydrophobic compound to be used.
  • the hydrophobicity may be particularly high, and the reaction temperature was raised to 70 ° C. or 80 ° C.
  • the results are shown in Table 1.
  • “ ⁇ ” indicates that the liquid is transparent
  • “ ⁇ ” indicates that the liquid is translucent
  • “X” indicates that the liquid is opaque.
  • the nanodisk dispersion containing ceramide 3 and curcumin was translucent.
  • a transparent solution was obtained by preparing a nanodisk via a liposome.
  • Example 8 Examination of lipids Dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC, 103.67 mg, 14.1 mM) and SFNa (147.25 mg, 14.1 mM) were placed in a 15 mL falcon tube, and PBS buffer (10 mL, pH 7.4) was further added. added. The mixture was stirred for 5 minutes using a vortex mixer, and then stirred at 200 rpm and 25 ° C. for 17 hours using a shaker (“BioShaker BR-23FP” manufactured by TAITEC). In addition, the lipid was changed to those shown in Table 2, and the experiment was performed in the same manner.
  • DPPC Dipalmitoylphosphatidylcholine
  • SFNa 147.25 mg, 14.1 mM
  • Example 9 Re-dissolution of dry nanodisk encapsulating hydrophobic compound Retinol (3.1 mg) and DMPC (51.84 mg) were placed in a 15 mL falcon tube and further dissolved by adding chloroform (1 mL). The mixture was dried by blowing argon gas while stirring the mixture using a vortex mixer, and then further dried in a desiccator. After drying, PBS buffer (5 mL, pH 7.4) was added, allowed to stand for 10 minutes, and then stirred for 3 minutes using a vortex mixer to prepare a liposome dispersion. A solution prepared by dissolving SFNa (81.04 mg) in PBS buffer (5 mL, pH 7.4) was added to the liposome dispersion (5 mL).
  • the mixture was stirred for 5 minutes using a vortex mixer, and then stirred at 180 rpm and 25 ° C. for 1 hour using a small-sized constant-temperature shaking incubator (“BioShaker BR-23FP” manufactured by TAITEC).
  • BioShaker BR-23FP constant-temperature shaking incubator
  • the particle size distribution of the nanodisk was measured with a light scattering photometer (“DLS-7000” manufactured by Otsuka Electronics Co., Ltd.), and the average particle diameter was measured. Asked.
  • the scattering angle was set to 90 degrees.
  • the prepared Nanodisc solution was transferred to a 20 mL vial, frozen, and then lyophilized for 2 days using a freeze dryer (“VD-55OR” manufactured by TAITEC).
  • Ultrapure water (“Direct-Q 3UV” manufactured by MILLIPORE, 10 mL, 18.2 M ⁇ ⁇ cm, 25 ° C.) was added to the freeze-dried Nanodisc powder.
  • the mixture was stirred with a vortex mixer for about 1 minute, the original transparent lipodisc solution was obtained.
  • a similar experiment was conducted with reduced CoQ10 and ceramide 3.
  • the appearance photograph of each solution and the freeze-dried product is shown in FIG. 9, and the average particle diameter of each nanodisk is shown in Table 3. As shown in FIG.
  • the nanodisk according to the present invention can be made into a powder, and the average particle diameter tends to increase after lyophilization. It was shown that dissolution is also possible. Therefore, it was found that the nanodisk according to the present invention is convenient for transporting and storing hydrophobic compounds.
  • Example 10 Re-dissolution of dried Nanodisc DMPC (51.84 mg) was placed in a 15 mL falcon tube and further chloroform (1 mL) was added to dissolve. The mixture was dried by blowing argon gas while stirring the mixture using a vortex mixer, and then further dried in a desiccator. After drying, PBS buffer (5 mL, pH 7.4) was added, allowed to stand for 10 minutes, and then stirred for 3 minutes using a vortex mixer to prepare a liposome dispersion. A solution prepared by dissolving SFNa (81.04 mg) in PBS buffer (5 mL, pH 7.4) was added to the liposome dispersion (5 mL).
  • the mixture was stirred for 5 minutes using a vortex mixer, and then stirred at 180 rpm and 25 ° C. for 1 hour using a small-sized constant-temperature shaking incubator (“BioShaker BR-23FP” manufactured by TAITEC).
  • the obtained nanodisc solution was transferred to a 20 mL vial, frozen, and then lyophilized for 2 days using a freeze dryer (“VD-55OR” manufactured by TAITEC). Water was added to the freeze-dried Nanodisc powder (40 mg) to a concentration of 1.28 to 4.0% by mass, and the mixture was stirred with a vortex mixer for about 1 minute.
  • the external appearance of each mixture is shown in FIG. When the nanodisk concentration was 4.0% by mass, a viscous cloudy dispersion was obtained.
  • the nanodisk concentration was 3.0 mass% and 1.28 mass%, the nanodisk was completely dissolved, and a transparent and uniform solution was obtained.
  • the nanodisk of the present invention can be used even at a high concentration of 3.0% by mass at room temperature (25 ° C.) It was proved that the transparent state can be maintained.

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Abstract

本発明は、容易に製造することができ、疎水性化合物を水中に良好に分散させることが可能なナノディスク、および当該ナノディスクの簡便な製造方法を提供することを目的とする。本発明に係るナノディスクは、脂質二重層およびリポペプチドバイオサーファクタントを含むことを特徴とする。また、本発明に係るナノディスクの製造方法は、水系溶媒中、脂質とリポペプチドバイオサーファクタントを混合する工程を含むことを特徴とする。

Description

ナノディスクとその製造方法
　本発明は、容易に製造することができ、疎水性化合物を水中に良好に分散させることが可能なナノディスク、および当該ナノディスクの簡便な製造方法に関するものである。
　化粧料などのパーソナルケア組成物や医薬組成物などに含まれる有効成分の多くは疎水性を示し、水系溶媒中に分散させ難いものである。疎水性化合物を分散させるには有機溶媒を使うことが考えられるが、人体に適用するパーソナルケア組成物や医薬組成物には、エタノールやイソプロパノールでさえ、使用量が低減されたり使用が避けられたりする傾向がある。よって、特にパーソナルケア組成物には、疎水性化合物を水系溶媒中に分散させるため界面活性剤が多用されている。
　しかし、単に界面活性剤を配合するのみでは疎水性化合物を十分に分散できないことがある。そこで、疎水性化合物の分散性を高める技術が種々開発されている。
　例えば、界面活性剤の水溶液中濃度が高まると、界面活性剤の親水性部分が外側を向いて集合したミセルやベシクルが形成されることが知られており、その内部の疎水性部分に疎水性化合物を内包させることにより疎水性化合物を分散できることが知られている。リン脂質で形成されたベシクルは、リポソームと呼ばれる。特許文献１に記載の発明ではさらに、水溶性高分子を配合することによりリポソームを多重膜構造とし、膜形成効率と膜安定性を高めている。
　ところが、リポソームのサイズは比較的大きく、通常、リポソームの分散液は白濁したものとなる。そこで、近年、リポソームと同じく脂質二分子膜構造を有するナノディスクと呼ばれる非常に微細な粒子が開発されている。
　ナノディスクは、脂質二重膜からなるディスクの疎水性側面が両親媒性の膜スキャフォールドタンパク質で被覆された構造を有し（非特許文献１，特許文献１，２）、一層のナノディスクの厚さは数ｎｍ、直径は１０ｎｍ足らずと非常に微細なものである。よって、ナノディスクの分散液は非常に透明性が高い。また、ナノディスクの脂質二重膜は細胞の脂質二重膜と同様のものであるため、ナノディスクに含まれる膜タンパク質は細胞膜での構造や活性をそのまま保持していると考えられ、ナノディスクにより膜タンパク質の研究が飛躍的に進むことが期待されている。
特開２００８－９４８０９号公報 特表２００７－５２５４９０号公報 特表２０１６－５０４３１２号公報
Ｂａｙｂｕｒｔ，Ｔ．Ｈ．ら，Ｎａｎｏ　Ｌｅｔｔ．，２（８），ｐｐ．８５３－８５６（２００２） Ｓｔｅｐｈｅｎ　Ｇ．Ｓｌｉｇａｒ，"Ｎａｎｏｄｉｓｃ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｆｏｒ　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｎａｎｏｄｉｓｃｓ"，［online］，２００８年３月４日，［平成２７年２月２８日検索］，インターネット＜ＵＲＬ：http://sligarlab.life.uiuc.edu/nanodisc/protocols.html＞
　上述したように、脂質二重層を含む微細なナノディスクが開発されており、ナノディスクを用いれば水系溶媒中に疎水性化合物を良好に分散できると考えられる。
　しかし、ナノディスクの形成に用いられる膜スキャフォールドタンパク質としては、配列の一部を欠失させたアポリポタンパク質が用いられるなど、そのデザインや製造自体に手間や時間がかかる。また、従来のナノディスクは、リン脂質からなるリポソームの分散液に界面活性剤であるコール酸ナトリウムを加え、さらに膜スキャフォールドタンパク質の溶液を加えた後に透析やイオン交換樹脂などを使って界面活性剤を除去するという非常に煩雑な方法により製造されている（非特許文献２）。
　そこで本発明は、容易に製造することができ、疎水性化合物を水中に良好に分散させることが可能なナノディスク、および当該ナノディスクの簡便な製造方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、従来の膜スキャフォールドタンパク質の代わりにリポペプチドバイオサーファクタントを用いれば、非常に簡便にナノディスクを製造できることを見出して、本発明を完成した。
　以下、本発明を示す。
　［１］　脂質二重層およびリポペプチドバイオサーファクタントを含むことを特徴とするナノディスク。
　［２］　上記リポペプチドバイオサーファクタントが、下記式（Ｉ）で表されるサーファクチンまたはその塩である上記［１］に記載のナノディスク。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 ［式中、
　Ｘは、ロイシン、イソロイシンおよびバリンから選択されるアミノ酸残基を示し；
　Ｒ1はＣ9-18アルキル基を示す］
　［３］　複数の上記脂質二重層が互いに積層されている上記［１］または［２］に記載のナノディスク。
　［４］　さらに疎水性化合物を含む上記［１］～［３］のいずれかに記載のナノディスク。
　［５］　さらに親水性化合物を含む上記［１］～［４］のいずれかに記載のナノディスク。
　［６］　さらに膜タンパク質を含む上記［１］～［３］のいずれかに記載のナノディスク。
　［７］　水系溶媒中、脂質とリポペプチドバイオサーファクタントを混合する工程を含むことを特徴とするナノディスクの製造方法。
　［８］　上記リポペプチドバイオサーファクタントとして下記式（Ｉ）で表されるサーファクチンまたはその塩を用いる上記［７］に記載の製造方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 ［式中、
　Ｘは、ロイシン、イソロイシンおよびバリンから選択されるアミノ酸残基を示し；
　Ｒ1はＣ9-18アルキル基を示す］
　［９］　上記脂質に対して０．４倍モル以上、１．２倍モル以下の上記リポペプチドバイオサーファクタントを用いる上記［７］または［８］に記載の製造方法。
　［１０］　上記脂質として下記式（ＩＩ）で表されるグリセロリン脂質を用いる上記［７］～［９］のいずれかに記載の製造方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 ［式中、Ｒ2とＲ3は独立してＣ10-24アルキル基またはＣ10-24アルケニル基を示す］
　［１１］　上記脂質によりリポソームを形成した後、上記リポペプチドバイオサーファクタントを加える上記［７］～［１０］のいずれかに記載の製造方法。
　［１２］　上記［７］～［１０］のいずれかに記載の方法によりナノディスクを製造する工程、
　上記ナノディスクを凍結乾燥する工程、および、
　凍結乾燥した上記ナノディスクに水系溶媒を加えて再溶解する工程を含むことを特徴とするナノディスク溶液の製造方法。
　［１３］　上記［１］～［５］のいずれかに記載のナノディスクを含むことを特徴とする化粧料。
　［１４］　疎水性化合物を水系溶媒中に分散するための、脂質二重層およびリポペプチドバイオサーファクタントを含むナノディスクの使用。
　［１５］　上記リポペプチドバイオサーファクタントが、下記式（Ｉ）で表されるサーファクチンまたはその塩である上記［１４］に記載の使用。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 ［式中、
　Ｘは、ロイシン、イソロイシンおよびバリンから選択されるアミノ酸残基を示し；
　Ｒ1はＣ9-18アルキル基を示す］
　［１６］　ナノディスク中、複数の上記脂質二重層が互いに積層されている上記［１４］または［１５］に記載の使用。
　［１７］　ナノディスクがさらに親水性化合物を含む上記［１４］～［１６］のいずれかに記載の使用。
　［１８］　疎水性化合物を水系溶媒中に分散するための方法であって、水系溶媒中、疎水性化合物、脂質二重層およびリポペプチドバイオサーファクタントを含むナノディスクを製造する工程を含むことを特徴とする方法。
　［１９］　上記リポペプチドバイオサーファクタントが、下記式（Ｉ）で表されるサーファクチンまたはその塩である上記［１８］に記載の方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 ［式中、
　Ｘは、ロイシン、イソロイシンおよびバリンから選択されるアミノ酸残基を示し；
　Ｒ1はＣ9-18アルキル基を示す］
　［２０］　ナノディスク中、複数の上記脂質二重層が互いに積層されている上記［１８］または［１９］に記載の方法。
　［２１］　ナノディスクがさらに親水性化合物を含む上記［１８］～［２０］のいずれかに記載の方法。
　従来のナノディスクに用いられていた膜スキャフォールドタンパク質は、そのデザインや製造に手間や時間がかかるものであった。それに対して本発明で用いられるリポペプチドバイオサーファクタントは微生物が生産するものであり、比較的容易に製造が可能である。また、本発明に係るナノディスクは、煩雑な工程を経なければ製造できなかった従来のナノディスクに比べ、非常に簡単な方法で製造することが可能である。さらに、本発明に係るナノディスクを用いれば、疎水性化合物を水系溶媒に良好に分散させ、目視上透明な組成物を得ることも可能であるし、疎水性化合物の経皮特性が顕著に向上する可能性もあり得る。また、細胞と同じく脂質二重膜構造を有する本発明のナノディスクは、その近傍に存在する親水性化合物の経皮特性を顕著に向上させる可能性もあり得る。よって本発明は、優れた特性を有するパーソナルケア組成物や医薬組成物の開発に寄与する技術として、産業上非常に優れている。
図１は、リポソーム分散液と本発明に係るナノディスクの分散液の外観写真である。 図２は、所定量のサーファクチンナトリウム溶液を添加したリポソーム分散液の透過率の経時変化を示すグラフである。 図３は、リポソーム分散液に所定量のサーファクチンナトリウム溶液を添加して調製したナノディスク分散液をサイズ排除クロマトグラフィーで分析した結果を示すクロマトグラムである。 図４は、リポソーム分散液に所定量のサーファクチンナトリウム溶液を添加して調製したナノディスク分散液の透過型電子顕微鏡写真である。 図５は、コエンザイムＱ１０を含むリポソーム分散液に所定量のサーファクチンナトリウム溶液を添加して調製したコエンザイムＱ１０含有ナノディスク分散液をサイズ排除クロマトグラフィーで分析した結果を示すクロマトグラムと、精製されたナノディスクフラクションの粒度分布図である。 図６は、コエンザイムＱ１０を含むリポソーム分散液に所定量のサーファクチンナトリウム溶液を添加して調製したコエンザイムＱ１０含有ナノディスク分散液の透過型電子顕微鏡写真である。 図７は、リン脂質とサーファクチンナトリウムとの混合液をサイズ排除クロマトグラフィーで分析した結果を示すクロマトグラムと、精製されたナノディスクフラクションの粒度分布図である。 図８は、（１）疎水性化合物であるカテキンを含む、リポソーム分散液、（２）リポソームを経由して作製したナノディスク溶液、および（３）リポソームを経由しない短工程で作製したナノディスク溶液の外観写真である。 図９は、疎水性化合物を含む凍結乾燥前のナノディスク溶液、凍結乾燥ナノディスク、および凍結乾燥ナノディスクへ水を加えた溶液の外観写真である。 図１０は、凍結乾燥したナノディスクを水に再分散した混合物の外観写真である。
　本発明に係るナノディスクは、脂質二重層およびリポペプチドバイオサーファクタントを含む。
　一般的なナノディスクは、脂質二重層の側面疎水部に、両親媒性である膜スキャフォールドタンパク質の疎水性部分が結合して被覆し且つ親水性部分が外側を向いている構造で安定化している。それに対して本発明に係るナノディスクは、脂質二重層の側面疎水部にリポペプチドバイオサーファクタントの疎水性部分が結合して被覆し且つ親水性部分が外側を向いている構造で安定化していると考えられる。さらに、環状ペプチドがイオンチャネルとして脂質二重層に刺さっていたり、嵩高い疎水性部分を有する脂質と嵩高い親水性部分を有する界面活性化合物が二重層を形成している例も知られていることから、本発明に係るナノディスクでも、一部のリポペプチドバイオサーファクタントが脂質と共に二重層を形成している可能性もあり得る。
　２以上のナノディスクが互いに積層して多層構造を形成している場合がある。本発明に係るナノディスクの大きさとしては、単層の状態で、厚さが２ｎｍ以上、１０ｎｍ以下、直径が５ｎｍ以上、２０ｎｍ以下であってよい。当該厚さとしては３ｎｍ以上が好ましく、４ｎｍ以上がより好ましく、また、８ｎｍ以下が好ましく、６ｎｍ以下がより好ましい。当該直径としては、６ｎｍ以上が好ましく、７ｎｍ以上がより好ましく、また、１５ｎｍ以下が好ましく、１２ｎｍ以下がより好ましい。
　脂質二重層を構成する脂質は、親水性の頭部と疎水性の尾部を有する化合物であり、脂質二重層を形成できるものであれば特に制限されないが、例えば、グリセロリン脂質、スフィンゴリン脂質、糖脂質、合成脂質、ステロール、長鎖脂肪酸、長鎖脂肪族アルコール、グリセリン脂肪酸エステル、カルボン酸型脂質などを挙げることができる。
　合成脂質としては、例えば市販されているものを用いることができる。
　グリセロリン脂質は、２つの脂肪酸、グリセリン、リン酸およびコリンが複合した構造を有するリン脂質であり、例えば、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジラウロイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、１－ステアロイル－２－ミリストイルホスファチジルコリン、ジリノレイルホスファチジルコリンなどを挙げることができる。なお、ホスファチジルコリンはレシチンとも呼ばれ、卵黄や大豆由来のレシチンや、水添レシチンなどその誘導体を用いてもよい。
　さらに、グリセロリン脂質としては、上記式（ＩＩ）で表されるグリセロリン脂質を挙げることができる。上記式（ＩＩ）中、Ｃ10-24アルキル基としては、例えば、ｎ－デシル、８－メチルノニル、ｎ－ウンデシル、９－メチルデシル、ｎ－ドデシル、１０－メチルウンデシル、ｎ－トリデシル、１１－メチルドデシル、ｎ－テトラデシル、ｎ－ペンタデシル、ｎ－ヘキサデシル、ｎ－ヘプタデシル、ｎ－オクタデシル、ｎ－ノナデシル、ｎ－イコシル、ｎ－ドコシル、ｎ－テトラコシルなどが挙げられる。Ｃ10-24アルケニル基としては、例えば、デセニル、ドデセニル、テトラデセニル、ヘキサデセニル、オクタデセニル、イコセニル、ドコセニル、テトラコセニルなどが挙げられる。
　スフィンゴリン脂質としては、例えば、スフィンゴミエリンを挙げることができる。
　糖脂質としては、例えば、マンノシルエリスリトールリピッド、ソホロリピッド、スルホキシリボシルグリセリド、ジグリコシルジグリセリド、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド、グリコシルジグリセリド、ガラクトシルセレブロシド、ラクトシルセレブロシド、ガングリオシドなどを挙げることができる。
　ステロールとしては、例えば、コレステロールコハク酸、ラノステロール、ジヒドロラノステロール、デスモステロール、ジヒドロコレステロールなどの動物由来のステロール；スチグマステロール、シトステロール、カンペステロール、ブラシカステロールなどの植物由来のステロール（フィトステロール）；チモステロール、エルゴステロールなどの微生物由来のステロールなどを挙げることができる。
　長鎖脂肪酸および長鎖脂肪族アルコールとしては、炭素数１０以上の脂肪酸および脂肪族アルコールを使用することができる。長鎖脂肪酸および長鎖脂肪族アルコールの炭素数の上限は特に制限されないが、脂質二重層をより確実に形成する観点から、３０以下が好ましい。そのような長鎖脂肪酸および長鎖脂肪族アルコールとしては、例えば、パルミチン酸、ステアリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、アラキジン酸、ドコサン酸、テトラコサン酸などの飽和長鎖脂肪酸；パルミトレイン酸、オレイン酸、アラキドン酸、バクセン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸などの不飽和長鎖脂肪酸；オレイルアルコール、ステアリルアルコール、ラウリルアルコール、ミリスチルアルコール、セチルアルコール、リノリルアルコールなどの長鎖脂肪族アルコールを挙げることができる。
　グリセリン脂肪酸エステルとしては、モノアシルグリセリド、ジアシルグリセリド、トリアシルグリセリドを挙げることができる。
　カルボン酸型脂質としては、１，５－Ｏ－ジヘキサデシル－Ｎ－スクシニル－Ｌ－グルタメート（ＤＨＳＧ）を挙げることができる。
　本発明では、１種の脂質を用いてもよいし、２以上の脂質を組合わせて併用してもよいが、１種の脂質を用いることが好ましい。また、脂質としては、ＤＭＰＣおよび／またはＰＯＰＣが好ましく、ＤＭＰＣがより好ましい。更に、大豆や卵黄などに由来するレシチンや水添レシチンも好ましく、レシチンがより好ましく、大豆由来レシチンがより更に好ましい。
　リポペプチドバイオサーファクタントは、疎水性基と、親水性部分を含むペプチドを有し、界面活性作用を示すものであり、微生物が生産するものをいう。リポペプチドバイオサーファクタントとしては、例えば、サーファクチン、アルスロファクチン、イチュリン、フェンジシン、セラウェッチン、ライケシン、ビスコシンを挙げることができる。
　リポペプチドバイオサーファクタントとしては、上記式（Ｉ）で表されるサーファクチンまたはその塩（以下、「サーファクチン（Ｉ）」という）が好ましい。式（Ｉ）中、カルボキシメチル基およびカルボキシエチル基の根元は光学活性点を表す。
　Ｘは、ロイシン、イソロイシンおよびバリンから選択されるいずれか１種のアミノ酸残基を表す。Ｘとしてのアミノ酸残基は、Ｌ体でもＤ体でもよいが、Ｌ体が好ましい。
　Ｒ1は、Ｃ9-18アルキル基を表す。ここで、「Ｃ9-18アルキル基」は、炭素数が９以上、１８以下の直鎖状または分枝鎖状の一価飽和炭化水素基をいう。例えば、ｎ－ノニル、６－メチルオクチル、７－メチルオクチル、ｎ－デシル、８－メチルノニル、ｎ－ウンデシル、９－メチルデシル、ｎ－ドデシル、１０－メチルウンデシル、ｎ－トリデシル、１１－メチルドデシル、ｎ－テトラデシル、ｎ－ペンタデシル、ｎ－ヘキサデシル、ｎ－ヘプタデシル、ｎ－オクタデシルなどが挙げられる。
　上記サーファクチン（Ｉ）は１種、または２種以上使用してもよい。例えば、Ｒ1のＣ9-18アルキル基が異なる複数のサーファクチン（Ｉ）を含むものであってもよい。
　サーファクチン（Ｉ）は、公知方法に従って、微生物、例えばバチルス・ズブチリスに属する菌株を培養し、その培養液から分離することができ、精製品であっても未精製品であっても使用できる。例えば培養液のまま使用することもできる。また、化学合成法によって得られるものでも同様に使用できる。
　サーファクチン（Ｉ）の塩も用いることができる。当該塩を構成するカウンターカチオンは特に制限されないが、例えばアルカリ金属イオンやアンモニウムイオンが挙げられる。
　サーファクチン（Ｉ）の塩に使用できるアルカリ金属イオンは特に限定されないが、リチウムイオン、ナトリウムイオン、カリウムイオンなどを表す。また、２つのアルカリ金属イオンは、互いに同一であってもよいし、異なっていてもよい。
　アンモニウムイオンの置換基としては、例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、ｔ－ブチル等のアルキル基；ベンジル、メチルベンジル、フェニルエチル等のアラルキル基；フェニル、トルイル、キシリル等のアリール基等の有機基が挙げられる。アンモニウムイオンとしては、例えば、テトラメチルアンモニウムイオン、テトラエチルアンモニウムイオン、ピリジニウムイオン等が挙げられる。
　なお、サーファクチン（Ｉ）の塩中、二つのカウンターカチオンは互いに同一であってもよいし、異なっていてもよいものとする。また、一方のカルボキシ基が－ＣＯＯＨまたは－ＣＯＯ-の状態になっていてもよいものとする。
　リポペプチドバイオサーファクタントの使用量は、ナノディスクが形成される範囲で適宜調整すればよい。例えば、リン脂質に対するリポペプチドバイオサーファクタントの量を０．４倍モル以上、１．２倍モル以下とすることができる。上記量が０．４倍モル以上であれば、ナノディスクがより確実に形成され、上記量が１．２倍モル以下であれば、ナノディスクの形成に関与しないリポペプチドバイオサーファクタントの量がそれほど過剰にならず、経済的である。
　本発明に係るナノディスクは、脂質およびリポペプチドバイオサーファクタント以外の成分を含んでいてもよい。例えば、化粧料や医薬組成物などの溶媒としては主に水系溶媒が用いられるが、疎水性化合物は水系溶媒中に分散させ難いという課題がある。しかし本発明に係るナノディスクを用いれば、おそらくは疎水性化合物を内部に取り込んで水系溶媒中に分散させることができるため、透明性の高い組成物とすることができる。なお、本発明において「水系溶媒」とは、水、および水混和性有機溶媒と水との混合溶媒をいう。水混和性有機溶媒は、水と制限無く混和可能な有機溶媒をいい、例えば、Ｃ1-3アルコールを挙げることができ、好ましくはエタノールまたはイソプロパノールである。なお、上記混合溶媒における水混和性有機溶媒の割合としては、１０質量％以下が好ましく、５質量％以下がより好ましく、２質量％以下がよりさらに好ましい。また、水系溶媒は、緩衝液であってもよく、そのｐＨは特に制限されない。
　疎水性化合物は、疎水性基を有し、水に難溶で且つ油に可溶である化合物をいう。ここで難溶とは、１ｇの疎水性化合物を２０±５℃で溶解するために１００ｍＬ以上の水を要することをいう。本発明で用いる疎水性化合物は、化粧料や医薬組成物などに配合する有効成分であれば特に制限されないが、例えば、美白剤、抗老化剤、抗酸化剤、保湿剤、育毛剤、細胞賦活剤、ビタミン類、アミノ酸類などが挙げられる。より具体的には、例えば、トコフェロール、コエンザイムＱ１０、還元型コエンザイムＱ１０、およびそれらの誘導体などの脂溶性ビタミン類；スクワランなどのオイル；ヒドロコルチゾン、プレドニゾロン、デキサメタゾン、ベタメタゾンなどのステロイド系抗炎症薬；アセチルサリチル酸、イブプロフェン、インドメタシン、ロキソプロフェンなどの非ステロイド系抗炎症薬；抗生物質；抗真菌剤；メチルパラベンなどの防腐剤；メントールなどの香料；アリザニンなどの色素を挙げることができる。その他、アルブチン及びその誘導体；Ｌ－アスコルビン酸およびその誘導体；ハイドロキノンおよびその誘導体；グルタチオンおよびその誘導体；胎盤抽出物；パントテン酸およびその誘導体；トラネキサム酸およびその誘導体；コウジ酸およびその誘導体；システインおよびその誘導体；カミツレエキス、カンゾウ抽出物などの植物抽出物；ベータカロチン等のカロテノイド類；アスタキサンチンおよびその誘導体；フラボノイド類；カテキンおよびその誘導体；ビタミンＡおよびその誘導体；α－リポ酸およびその誘導体；グリチルリチン酸およびその誘導体；チオタウリンおよびその誘導体；尿素およびその誘導体；グリセリン誘導体；サリチル酸およびその誘導体；ニコチン酸およびその誘導体；Ｌ－アミノ酸およびその誘導体；アデノシンおよびその誘導体；イソフラボン等の植物性女性ホルモン様成分；グラブリジンおよびその誘導体；マグノリグナンおよびその誘導体；ミノキシジルおよびその誘導体；フィナステリドおよびその誘導体；フラバノン類；塩化カルプロニウムおよびその誘導体；フェルラ酸およびその誘導体；フラーレンおよびその誘導体；ラクトフェリン；Ｄ－アミノ酸およびその誘導体；オリゴ糖およびその誘導体；核酸およびその誘導体；Ｄ－グルコサミンおよびその誘導体；コンドロイチン硫酸ナトリウムおよびその誘導体；ジプロピレングリコールおよびその誘導体；セラミドおよびその誘導体；ソルビトールおよびその誘導体；トレハロースおよびその誘導体；ヒアルロン酸およびその誘導体；プロピレングリコール脂肪酸エステルおよびその誘導体；マルチトールおよびその誘導体；ラフィノースおよびその誘導体；アルギン酸およびその誘導体；カフェインおよびその誘導体；カルボキシビニルポリマーおよびその誘導体；キサンタンガムおよびその誘導体；ヒドロキシエチルセルロースおよびその誘導体；ポリビニルピロリドンおよびその誘導体；ケラチン分解物およびその誘導体；シルクタンパク質分解物およびその誘導体；γ－アミノ酪酸およびその誘導体；アラントインおよびその誘導体；γ－オリザノールおよびその誘導体；Ｌ－カルニチンおよびその誘導体；β－１，３－グルカンおよびその誘導体；ビオチンおよびその誘導体などが挙げられる。
　本発明に係るナノディスクは、膜タンパク質を含むものであってもよい。膜タンパク質は生体膜に結合しているタンパク質であり、主に、その少なくとも一部が生体膜内に存在する内在性膜タンパク質と、疎水性相互作用や静電相互作用など共有結合以外で生体膜に結合している表在性膜タンパク質とに分類される。従来、細胞膜などの生体膜に存在する膜タンパク質を単離すると高次構造が変化してしまい、本来の機能が喪失してしまうため、膜タンパク質の機能に関する研究は非常に難しいとされていた。しかし本発明に係るナノディスクは生体膜と同様の脂質二重層を有し、膜タンパク質は当該脂質二重層中で生体膜中における構造を維持していると考えられるので、本発明により膜タンパク質の機能に関する研究が飛躍的に進行し、困難であった膜タンパク質の産業利用が可能となる可能性がある。
　また、本発明に係るナノディスクは、親水性化合物を含んでいてもよい。親水性化合物は、水分子に対して親和性を示す化合物であれば特に制限されない。親水性化合物は水溶性を示すものが多く、水溶性の親水性化合物は水系溶媒に溶解することも可能であるが、ナノディスクの親水性部分に吸着してより一層安定化している可能性がある。また、金属酸化物など、親水性ではあるが水に対して不溶性である有効成分をナノディスクの親水性部分に吸着させることにより、水系溶媒中に分散させることも可能になり得る。なお、複数のナノディスクが互いに積層されて多層構造を形成している場合があるが、この場合、親水性化合物は脂質二重層間に存在している可能性もある。
　親水性化合物としては、例えば、酸化チタン粒子や酸化亜鉛粒子などの紫外線散乱剤；ベンガラ、酸化チタン、酸化鉄などの無機顔料；アスコルビン酸やその誘導体などの水溶性ビタミン類；ローカストビーンガム、グァーガム誘導体、カラギーナン、ペクチン、キサンタンガム、ジェランガム、アルギン酸などの増粘剤を挙げることができる。
　本発明に係るナノディスクにおける脂質およびリポペプチドバイオサーファクタントの成分の量は適宜調整すればよいが、例えば、脂質１モルに対するリポペプチドバイオサーファクタントの割合を０．２倍モル以上、１．５倍モル以下とすることができる。
　本発明に係るナノディスクは、水系溶媒中、少なくとも脂質とリポペプチドバイオサーファクタントを混合するという極めて簡便な方法で製造することができる。
　反応液中の脂質の濃度は適宜調整すればよいが、例えば、０．１ｍＭ以上、１００ｍＭ以下とすることができ、０．５ｍＭ以上、５０ｍＭ以下が好ましい。リポペプチドバイオサーファクタントの反応液中濃度も、０．１ｍＭ以上、１００ｍＭ以下とすることができ、０．５ｍＭ以上、５０ｍＭ以下が好ましい。疎水性化合物および／または親水性化合物を添加する場合、疎水性化合物および親水性化合物の量は、それぞれ脂質１００質量部に対して０．１質量部以上、１００質量部以下が好ましく、０．５質量部以上、５０質量部以下がより好ましく、１質量部以上、２０質量部以下がより更に好ましい。
　脂質とリポペプチドバイオサーファクタントの反応条件も、ナノディスクの形成が良好に進行する範囲で適宜調整すればよく、例えば反応温度は常温でも構わない。例えば、脂質としてＤＭＰＣなどのリン脂質を用いた場合には、その一般的な相転移温度付近である２０℃以上、３０℃以下とすることができる。また、反応時間は、２分間以上、５０時間以下とすることができる。なお、後記のリポソームを経由する製造方法に比べ、単に各成分を混合するのみではナノディスクが形成されない場合があるが、そのような場合であっても反応温度を比較的高く、例えば４０℃以上、８０℃以下にすることにより、ナノディスクが形成される場合がある。当該温度としては、７０℃以下または６０℃以下が好ましく、５０℃以下または４０℃以下が好ましい。
　また、本発明に係るナノディスクは、先ず脂質からリポソームを調製し、次にリポペプチドバイオサーファクタントを加えて製造することもできる。即ち、脂質をメタノール、エタノール、イソプロパノールなどの低級アルコール溶媒やクロロホルムなどの有機溶媒に溶解した後に有機溶媒を留去して脂質フィルムとし、水系溶媒を加えて攪拌することによりリポソームを形成させる。この際のリポソーム分散液の濃度は適宜調整すればよいが、例えば、０．１ｍＭ以上、１００ｍＭ以下とすることができ、０．５ｍＭ以上、５０ｍＭ以下が好ましい。次に、リポペプチドバイオサーファクタントを加えることにより、ナノディスクとすることができる。当該反応液におけるリポペプチドバイオサーファクタントの濃度も適宜調整すればよいが、例えば、０．１ｍＭ以上、１００ｍＭ以下とすることができ、０．５ｍＭ以上、５０ｍＭ以下が好ましい。なお、従来のナノディスクを製造する場合にはコール酸などの界面活性剤の使用とその除去が必要であるが、本発明の場合、リポペプチドバイオサーファクタント以外の界面活性剤は特に必要としない。また、リポペプチドバイオサーファクタントを添加する際の温度を比較的高く、例えば４０℃以上、８０℃以下にすることにより、ナノディスクの形成がより容易になる場合がある。
　脂質とリポペプチドバイオサーファクタント以外の成分は、適時添加すればよい。例えば親水性化合物は、水系溶媒に適時添加すればよい。疎水性化合物、膜タンパク質および水不溶性の親水性化合物は、水系溶媒中で少なくとも脂質と共存させることが好ましい。疎水性化合物および親水性化合物の量は、それぞれ脂質１００質量部に対して０．１質量部以上、１００質量部以下が好ましく、０．５質量部以上、５０質量部以下がより好ましく、１質量部以上、２０質量部以下がより更に好ましい。生体分子である脂質は界面活性作用を示すことから、これら化合物の水系溶媒中への分散を補助する。また、膜タンパク質の場合、本発明に係るナノディスクの存在下で膜タンパク質を無細胞合成することにより、膜タンパク質をナノディスクに結合させることも可能である。
　ナノディスクは、凍結乾燥した後、凍結乾燥したナノディスクを再び水系溶媒に溶解させてもよい。再溶解液のナノディスク濃度は、任意に調整することができる。
　本発明に係るナノディスクは、特に疎水性化合物をその内部に取り込み、水系溶媒中に良好に分散させることができる上に、非常に微細であることから、その水系溶媒中分散液は目視上十分に透明に見え、また、皮膚組織などへの浸透性も高いと考えられる。なお、特に化粧品業界においては、一般的に、分散質が目視で確認できなくなり、分散液が目視上透明になった状態を「可溶化」という場合がある。よって本発明に係るナノディスクは、特に疎水性化合物を有効成分とする化粧料などのパーソナルケア組成物や医薬組成物の成分として、非常に有効であるといえる。
　本願は、２０１７年３月３１日に出願された日本国特許出願第２０１７－７３０５７号に基づく優先権の利益を主張するものである。２０１７年３月３１日に出願された日本国特許出願第２０１７－７３０５７号の明細書の全内容が、本願に参考のため援用される。
　以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
　実施例１：　ナノディスクの製造
　先ず、ナノディスクの前駆体となるリポソームを調製した。ジミリストイルホスファチジルコリン（以下、「ＤＭＰＣ」と略記する）（４０ｍｇ）を試験管に秤量し、クロロホルム（０．５ｍＬ）を加えることでＤＭＰＣを溶解させた。ボルテックスミキサーで撹拌しながら試験管内にアルゴンガスを吹き付け、クロロホルムを除去することにより、試験管の壁面に脂質フィルムを形成させた。デシケーター中で一昼夜静置した後、リン酸緩衝液（ｐＨ７．４，３ｍＬ）を加え、室温で１０分間水和させた。その後、３分間ボルテックスミキサーで撹拌することで、２０ｍＭのＤＭＰＣリポソーム分散液を調製した。なお、ＤＭＰＣの濃度は、リン脂質定量キット（「リン脂質Ｃ－テストワコー」和光純薬社製）を用いて定量した。リン酸緩衝液で希釈して濃度を５ｍＭに調整したＤＭＰＣリポソーム分散液の目視観察結果を図１（ａ）に示す。リポソームは粒子径が大きいため、その分散液は、図１（ａ）より明らかなように白濁する。
　次に、得られた５ｍＭのＤＭＰＣリポソーム分散液１ｍＬに、リポソームを構成するＤＭＰＣに対してそれぞれ０．５倍モル量または１倍モル量となるようにサーファクチンナトリウム（以下、「ＳＦＮａ」と略記する）の溶液を１ｍＬずつ添加した。この溶液を３分間ボルテックスミキサーで撹拌した後、恒温振とう培養器（「ＢｉｏＳｈａｋｅｒ　Ｍ－ＢＲ－０２２ＵＰ」ＴＡＩＴＥＣ社製）を使って２５℃で１２時間インキュベーションした。分散液の目視観察結果を図１（ｂ）～図１（ｃ）に示す。ＳＦＮａを０．５倍モル量（図１（ｂ））または１．０倍モル量（図１（ｃ））のＳＦＮａを添加した場合には、濁度は大きく低下して透明な溶液となった。かかる結果から、所定量のＳＦＮａの添加によって、リポソームからナノディスクが形成することが示唆された。
　実施例２：　ＳＦＮａの添加によるＤＭＰＣリポソーム分散液の濁度の経時変化
　粒子径が大きいＤＭＰＣリポソームの白濁分散液から微細なナノディスクが形成されると実施例１で示唆されたように、ＳＦＮａの添加により分散液の濁度が低下する。そこで目視観察だけでなく、分光光度計（「Ｖ５２０」日本分光社製）を用い、６５０ｎｍの光透過率の経時変化を追跡することで、ナノディスクの形成を評価した。５ｍＭのＤＭＰＣリポソーム分散液に所定量のＳＦＮａ溶液を添加した際の濁度の経時変化を図２に示す。ＤＭＰＣに対してＳＦＮａを０．５倍モル量添加すると、７分程度で透過率は約９０％まで上昇し、速やかにナノディスクが形成することが示唆された。ＳＦＮａを１．０倍モル量添加した場合、２分程度で透過率が約９０％まで上昇し、より迅速にナノディスクが形成することが示唆された。
　実施例３：　サイズ排除クロマトグラフィーによるナノディスクの形成評価
　クロマトグラフィーシステム（「ＡＫＴＡ　ｐｕｒｉｆｉｅｒ　９００」ＧＥヘルスケア社製）を用い、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によりＳＦＮａの添加によるナノディスクの形成を評価した。カラムとしては、ゲルろ過クロマトグラフィーカラム（「Ｓｕｐｅｒｏｓｅ　６　１０／３００　ＧＬ」ＧＥヘルスケア社製）を用い、検出波長は２２０ｎｍ、流速は０．５ｍＬ／ｍｉｎに設定した。実施例１と同様に調製した各分散液のＳＥＣの溶出曲線を図３に示す。また、標準タンパク質を用い、その保持時間から流体力学的直径も算出した。まず、予備的な検討により、ＤＭＰＣリポソーム単独では、保持時間が１５．５分の位置（排除体積）にリポソームがそのまま溶出した。一方で、ＳＦＮａ単独では、保持時間が３３．１分および３８．１分の位置にＳＦＮａに起因するピークが認められた。
　図３より、リポソームを構成するＤＭＰＣに対してＳＦＮａを０．５倍モル量添加した場合には保持時間が３０．４分の位置に、１．０倍モル量添加した場合には保持時間が３１．１分の位置にピークが観察された。それぞれのピーク保持時間は、１４．２ｎｍおよび１３．３ｎｍの流体力学的直径に相当することから、各分散液ではナノディスクが形成されていると考えられる。かかる結果から、所定量のＳＦＮａを添加することにより、ナノディスクが形成することが確認された。
　実施例４：　透過型電子顕微鏡によるナノディスクの観察
　実施例１と同様の操作で、ＤＭＰＣリポソームに対してＳＦＮａを０．５倍モル量または１．０倍モル量添加した分散液のネガティブ染色法透過型電子顕微鏡（ＮＳ－ＴＥＭ）による観察像を図４に示す。ＴＥＭ観察では、日立ハイテクノロジーズ社製のＨ－７６５０を用い、リンタングステン酸ナトリウムによるネガティブ染色法を用いた。なお、加速電圧は１２０ｋＶに設定し、使用グリッドとしては銅製、２００メッシュ、カーボン補強処理したものを用いた。染色液である１％リンタングステン酸ナトリウム溶液は、リンタングステン酸ナトリウムを５０ｍｇ秤量し、超純水を５ｍＬ加え、遮光下で５分間撹拌して調製した。１％リンタングステン酸ナトリウム溶液のｐＨを、５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ６．８に調整した。その後、０．１μｍまたは０．２２μｍＰＶＤＦシリンジフィルターにより、濾過したものを用いた。
　図４より、ナノディスクを真上から観察した場合に認められる球状の粒子と、横から観察した場合に認められる積層体状の粒子が確認された。なお、ディスクの大きさは、ＳＦＮａを０．５倍モル量添加した場合は１０～３０ｎｍ程度の範囲であり、ＳＦＮａを１．０倍モル量添加した場合は１１～２５ｎｍ程度となり、ＳＦＮａの添加量が多いほど、ナノディスクの粒子径は小さくなる傾向があることも判明した。
　実施例５：　ナノディスクへのコエンザイムＱ１０の封入
　先ず、疎水性化合物であるコエンザイムＱ１０（以下、「ＣｏＱ１０」と略記する）をナノディスクの前駆体となるリポソームに封入させた。試験管にＤＭＰＣ（２０ｍｇ）とＣｏＱ１０（２．６ｍｇ）を秤量した。その他の操作は、実施例１と同様となるようにリポソームを調製した。ＤＭＰＣリポソーム５ｍＭに対して、ＣｏＱ１０が１／１０の０．５ｍＭ封入される組成とした。得られたリポソーム分散液に、ＤＭＰＣに対して１倍モル量のＳＦＮａを添加して、実施例１と同様の操作でナノディスクの調製を試みた。
　得られた分散液を、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により評価した。実施例３と同様の検出波長である２２０ｎｍに加えて、ＣｏＱ１０を検出するため２７５ｎｍでも測定を行った。分散液のＳＥＣの溶出曲線を図５（ａ）に示す。ＳＦＮａに起因する吸収波長２２０ｎｍにおいて、保持時間３２．８分（流体力学的直径１１．３ｎｍ）の位置にピークが得られた。さらに、ＣｏＱ１０に起因する吸収波長２７５ｎｍにおいても、保持時間３２．５分（流体力学的直径１１．７ｎｍ）の位置にピークが得られた。このように、両ピークの位置は一致しており、同時に溶出されたことが分かる。溶出液を分取し、紫外可視吸収スペクトルを測定したところ、ナノディスクのフラクションからＣｏＱ１０に起因する波長２７５ｎｍ付近におけるＵＶ吸収があることが確認された。これらのことから、ナノディスク内部へのＣｏＱ１０の封入が確認された。
　次に、分取されたピークフラクションの動的光散乱（ＤＬＳ）測定を行った。光散乱光度計（「ＤＬＳ－７０００」大塚電子社製）を用い、粒度分布を測定した。その際、光源にはＡｒレーザー（λ＝４８８ｎｍ）を用い、散乱角度は９０度に設定した。結果を図５（ｂ）に示す。図５（ｂ）より、粒子の平均粒子径は１８．０±３．６ｎｍであり、ナノディスクの大きさに合致することが確認された。
　また、ネガティブ染色法透過型電子顕微鏡（ＮＳ－ＴＥＭ）を用いて、ＣｏＱ１０封入ナノディスクを実施例４と同様の操作で観察した結果を図６に示す。図６より、ＣｏＱ１０が封入されてもナノディスクを真上から観察した場合に認められる球状の粒子と、横から観察した場合に認められる積層体状の粒子が確認された。
　実施例６：　ナノディスクの短工程調製
　実施例１とは異なり、前駆体のリポソームを経由せずに、ナノディスクを調製することを試みた。ＤＭＰＣ（３．４ｍｇ）と等モル量のＳＦＮａ（５．２ｍｇ）を試験管に秤量した。これに２ｍＬのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を加え、恒温振とう培養器（「ＢｉｏＳｈａｋｅｒ　Ｍ－ＢＲ－０２２ＵＰ」ＴＡＩＴＥＣ社製）を使って２５℃で１２時間インキュベーションした。インキュベーション開始から少なくとも３時間後ではＤＭＰＣの粉末が確認されたが、１２時間後には透明な溶液となった。
　実施例３と同様に、クロマトグラフィーシステム（「ＡＫＴＡ　ｐｕｒｉｆｉｅｒ　９００」ＧＥヘルスケア社製）を用い、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によりナノディスクの形成を確認した。結果を図７（ａ）に示す。図７（ａ）の通り、実施例３で１．０倍モル量のＳＦＮａを添加した分散液とほぼ同じ保持時間３１．０分（流体力学的直径１３．２ｎｍ）の位置にピークが検出された。また、ＳＥＣより分取した溶液の動的光散乱（ＤＬＳ）測定を行ったところ（図７（ｂ））、平均粒子径が１２．３±２．９ｎｍのナノディスクが確認された。
　なお、一般的なアニオン界面活性剤であるドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いて、比較検討を行った。ＳＦＮａの際と同様に、ＤＭＰＣに対して等モル量のＳＤＳを添加しても、分散液は白濁しており、１２時間後も変化はなく、ナノディスクは形成されないことが分かった。
　以上より、ＳＦＮａとＤＭＰＣの粉末を混合して分散するだけで、前駆体のリポソームを経由しなくても短工程でナノディスクが形成されることが明らかになった。
　実施例７：　ナノディスクへの疎水性化合物の封入
　（１）リポソームを経由する製造方法
　カテキン混合物（３．１ｍｇ，和光純薬社製）とＤＭＰＣ（５１．８４ｍｇ）を１５ｍＬファルコンチューブに入れ、さらにメタノール（１ｍＬ）を加えて溶解した。ボルテックスミキサーを使って混合物を攪拌しながらアルゴンガスを吹き付けて乾燥させた後、デシケーターに入れてさらに３時間乾燥させた。乾燥後、ＰＢＳバッファー（５ｍＬ，ｐＨ７．４）を加え、１０分間静置してからボルテックスミキサーを使って３分間撹拌することにより、リポソーム分散液を作製した。
　上記リポソーム分散液（５ｍＬ）に、ＳＦＮａ（８１．０４ｍｇ）をＰＢＳバッファー（５ｍＬ，ｐＨ７．４）で溶解した溶液を加えた。ボルテックスミキサーを使って混合物を５分間攪拌した後、振とう機を使って１８０ｒｐｍ、２５℃で１時間攪拌した。
　（２）短工程による製造方法
　カテキン混合物（３．１ｍｇ）、ＤＭＰＣ（５１．８４ｍｇ）およびＳＦＮａ（８１．０４ｍｇ）を１５ｍＬファルコンチューブに入れ、さらにＰＢＳバッファー（１０ｍＬ，ｐＨ７．４）を加えた。ボルテックスミキサーを使って混合物を５分間攪拌した後、振とう機を使って１８０ｒｐｍ、２５℃で２０時間攪拌した。
　上記リポソーム分散液、リポソームを経由して作製したナノディスク溶液、およびリポソームを経由しない短工程で作製したナノディスク溶液の外観写真を図８に示す。図８に示す通り、リポソームは白濁していたが、ナノディスク溶液は、疎水性化合物であるカテキンを含む水系溶媒でありながら透明なものであり、少なくとも目視では不溶成分は確認できなかった。
　（３）その他の疎水性化合物
　カテキン混合物の代わりに表１に示す疎水性化合物（３．１ｍｇ）を用いた以外は同様にしてナノディスクを作製した。なお、リポソームを作製する際に用いる溶媒は、使用する疎水性化合物に対する溶解度に応じて変更した。また、セラミド３とクルクミンの場合には、疎水性が特に高いこともあり、反応温度を７０℃または８０℃に上げた。結果を表１に示す。表中、「○」は液が透明であることを示し、「△」は液が半透明であることを示し、「×」は液が不透明であることを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　表１に示す結果の通り、リポソームを経由する短工程の場合には、セラミド３とクルクミンを含むナノディスク分散液は半透明であった。しかし何れの疎水性化合物の場合も、リポソームを経由してナノディスクを作製することにより、透明な溶液が得られた。
　実施例８：　脂質の検討
　ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ，１０３．６７ｍｇ，１４．１ｍＭ）およびＳＦＮａ（１４７．２５ｍｇ，１４．１ｍＭ）を１５ｍＬファルコンチューブに入れ、さらにＰＢＳバッファー（１０ｍＬ，ｐＨ７．４）を加えた。ボルテックスミキサーを使って混合物を５分間攪拌した後、振とう機（「ＢｉｏＳｈａｋｅｒＢＲ－２３ＦＰ」ＴＡＩＴＥＣ社製）を使って２００ｒｐｍ、２５℃で１７時間攪拌した。
　また、脂質を表２に示すものに変更し、同様に実験を行った。脂質としてＤＰＰＣとＤＳＰＣを用いた場合には、表２に示す温度に加温し、ボルテックスミキサーを使って攪拌し、常温で５時間静置した後に外観を観察した。結果を表２に示す。表中、「○」は液が透明であることを示し、「△」は液が半透明であることを示し、「×」は液が不透明であることを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　表２に示す結果の通り、ＳＦＮａと様々な脂質を混合して溶媒中に分散するだけで押し並べてナノディスクが形成されて混合物が透明になることが分かった。
　実施例９：　疎水性化合物を封入した乾燥ナノディスクの再溶解
　レチノール（３．１ｍｇ）とＤＭＰＣ（５１．８４ｍｇ）を１５ｍＬファルコンチューブに入れ、さらにクロロホルム（１ｍＬ）を加えて溶解した。ボルテックスミキサーを使って混合物を攪拌しながらアルゴンガスを吹き付けて乾燥させた後、デシケーターに入れてさらに乾燥させた。乾燥後、ＰＢＳバッファー（５ｍＬ，ｐＨ７．４）を加え、１０分間静置してからボルテックスミキサーを使って３分間撹拌することにより、リポソーム分散液を作製した。
　上記リポソーム分散液（５ｍＬ）に、ＳＦＮａ（８１．０４ｍｇ）をＰＢＳバッファー（５ｍＬ，ｐＨ７．４）で溶解した溶液を加えた。ボルテックスミキサーを使って混合物を５分間攪拌した後、小型恒温振とう培養機（「ＢｉｏＳｈａｋｅｒ　ＢＲ－２３ＦＰ」ＴＡＩＴＥＣ社製）を使って１８０ｒｐｍ、２５℃で１時間攪拌した。
　得られたナノディスクの溶液をＰＶＤＦフィルター（孔径：０．４５μｍ）で濾過した後、ナノディスクの粒度分布を光散乱光度計（「ＤＬＳ－７０００」大塚電子社製）で測定し、平均粒子径を求めた。その際、光源にはＡｒレーザー（λ＝４８８ｎｍ）を用い、散乱角度は９０度に設定した。
　次いで、調製したナノディスク溶液を２０ｍＬバイアル瓶に移し、凍結後、凍結乾燥機（「ＶＤ－５５ＯＲ」ＴＡＩＴＥＣ社製）を使って２日間凍結乾燥した。
　凍結乾燥したナノディスク粉末に超純水（「Ｄｉｒｅｃｔ－Ｑ　３ＵＶ」ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製，１０ｍＬ，１８．２ＭΩ・ｃｍ，２５℃）を加えた。混合物をボルテックスミキサーで１分程度攪拌したところ、元の透明なリポディスク溶液となった。
　還元型ＣｏＱ１０およびセラミド３でも、同様に実験を行った。
　各溶液と凍結乾燥品の外観写真を図９に、各ナノディスクの平均粒子径を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
 　図９と表３に示す結果の通り、本発明に係るナノディスクは粉末にすることが可能であり、また、凍結乾燥後では平均粒子径が大きくなる傾向があるものの、凍結乾燥ナノディスクは再溶解も可能であることが示された。よって、本発明に係るナノディスクは、疎水性化合物の運搬や保存に便利であることが分かった。
　実施例１０：　乾燥ナノディスクの再溶解
　ＤＭＰＣ（５１．８４ｍｇ）を１５ｍＬファルコンチューブに入れ、さらにクロロホルム（１ｍＬ）を加えて溶解した。ボルテックスミキサーを使って混合物を攪拌しながらアルゴンガスを吹き付けて乾燥させた後、デシケーターに入れてさらに乾燥させた。乾燥後、ＰＢＳバッファー（５ｍＬ，ｐＨ７．４）を加え、１０分間静置してからボルテックスミキサーを使って３分間撹拌することにより、リポソーム分散液を作製した。
　上記リポソーム分散液（５ｍＬ）に、ＳＦＮａ（８１．０４ｍｇ）をＰＢＳバッファー（５ｍＬ，ｐＨ７．４）で溶解した溶液を加えた。ボルテックスミキサーを使って混合物を５分間攪拌した後、小型恒温振とう培養機（「ＢｉｏＳｈａｋｅｒ　ＢＲ－２３ＦＰ」ＴＡＩＴＥＣ社製）を使って１８０ｒｐｍ、２５℃で１時間攪拌した。
　得られたナノディスクの溶液を２０ｍＬバイアル瓶に移し、凍結後、凍結乾燥機（「ＶＤ－５５ＯＲ」ＴＡＩＴＥＣ社製）を使って２日間凍結乾燥した。
　凍結乾燥したナノディスク粉末（４０ｍｇ）に、濃度が１．２８～４．０質量％となるよう水を添加し、混合物をボルテックスミキサーで１分程度攪拌した。各混合物の外観を図１０に示す。
　ナノディスク濃度が４．０質量％の場合、粘性のある白濁分散液となった。一方、ナノディスク濃度が３．０質量％および１．２８質量％の場合には、ナノディスクは完全に溶解し、透明で均一な溶液が得られた。なお、リポソームの３．０質量％という高濃度溶液を透明に保つことは技術的に考えられないが、本発明のナノディスクであれば、３．０質量％という高濃度でも室温（２５℃）で透明な状態を維持できることが実証された。

Claims (13)

  1. 　脂質二重層およびリポペプチドバイオサーファクタントを含むことを特徴とするナノディスク。
  2. 　上記リポペプチドバイオサーファクタントが、下記式（Ｉ）で表されるサーファクチンまたはその塩である請求項１に記載のナノディスク。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     ［式中、
    　Ｘは、ロイシン、イソロイシンおよびバリンから選択されるアミノ酸残基を示し；
    　Ｒ1はＣ9-18アルキル基を示す］
  3. 　複数の上記脂質二重層が互いに積層されている請求項１または２に記載のナノディスク。
  4. 　さらに疎水性化合物を含む請求項１～３のいずれかに記載のナノディスク。
  5. 　さらに親水性化合物を含む請求項１～４のいずれかに記載のナノディスク。
  6. 　さらに膜タンパク質を含む請求項１～３のいずれかに記載のナノディスク。
  7. 　水系溶媒中、脂質とリポペプチドバイオサーファクタントを混合する工程を含むことを特徴とするナノディスクの製造方法。
  8. 　上記リポペプチドバイオサーファクタントとして下記式（Ｉ）で表されるサーファクチンまたはその塩を用いる請求項７に記載の製造方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     ［式中、
    　Ｘは、ロイシン、イソロイシンおよびバリンから選択されるアミノ酸残基を示し；
    　Ｒ1はＣ9-18アルキル基を示す］
  9. 　上記脂質に対して０．４倍モル以上、１．２倍モル以下の上記リポペプチドバイオサーファクタントを用いる請求項７または８に記載の製造方法。
  10. 　上記脂質として下記式（ＩＩ）で表されるグリセロリン脂質を用いる請求項７～９のいずれかに記載の製造方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     ［式中、Ｒ2とＲ3は独立してＣ10-24アルキル基またはＣ10-24アルケニル基を示す］
  11. 　上記脂質によりリポソームを形成した後、上記リポペプチドバイオサーファクタントを加える請求項７～１０のいずれかに記載の製造方法。
  12. 　請求項７～１０のいずれかに記載の方法によりナノディスクを製造する工程、
    　上記ナノディスクを凍結乾燥する工程、および、
    　凍結乾燥した上記ナノディスクに水系溶媒を加えて再溶解する工程を含むことを特徴とするナノディスク溶液の製造方法。
  13. 　請求項１～５のいずれかに記載のナノディスクを含むことを特徴とする化粧料。
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