CN112552378A - 一种膜支架蛋白、磷脂纳米盘和纳米颗粒及其制备方法 - Google Patents
一种膜支架蛋白、磷脂纳米盘和纳米颗粒及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明实施例提供了一种膜支架蛋白、磷脂纳米盘和纳米颗粒及其制备方法，所述膜支架蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述磷脂纳米盘为圆盘状的磷脂双层，所述磷脂纳米盘的制备原料包括所述的膜支架蛋白、脂质溶液和缓冲液；其中，所述脂质溶液为用50～100mM胆酸钠溶液溶解脂质至终浓度为45～55mM所获得的溶液。所述纳米颗粒的制备原料包括所述的磷脂纳米盘和膜蛋白。本发明实施例采用所述磷脂纳米盘和膜蛋白制备得到的纳米颗粒，可使得膜蛋白保持较大的蛋白活性，可保持其相关生物学功能；所述方法纯化得到的膜蛋白具有高纯度并具有高活性。
Description
技术领域
本发明实施例属于生物技术领域，涉及一种膜支架蛋白、磷脂纳米盘和纳米颗粒及其制备方法。
背景技术
就生物新药研发而言，膜蛋白是重要的靶点对象，GPCR、离子通道蛋白、转运蛋白等在细胞间联系、接收外部信号以及接收其他物质等方法发挥重要作用。近年来，膜蛋白研究取得了明显的进展，这离不开研究膜蛋白的相关工具和试剂的进步。为了更深入的研究膜蛋白的结构和功能，正确提取膜蛋白并将膜蛋白组装入类膜环境是至关重要的。通过应用纳米圆盘技术能有效提高膜蛋白在体外环境中的稳定性，并能够更好的模拟膜蛋白与天然细胞膜中同样的结构及维持其生物学功能，可以更好的满足细胞功能学等多方面的膜蛋白研究。目前主要的类膜环境有：bicelles,micelles,liposomes和nanodiscs。其中，liposomes和nanodiscs应用最广泛。Liposomes是两亲性脂双层的囊泡。制备liposomes有许多方法，其中最有名最不要求设备的方法是Bangham法。将目的脂质溶解于挥发性有机溶剂中，在惰性气流下干燥。用水溶性缓冲涡旋所得的薄层脂质，然后通过各种方法，例如超声、均质化和用尺寸已知的过滤器挤出(一般为100-200nm孔径尺寸)，最后转化为单层囊泡。这也导致了liposomes非常明显的劣势，不稳定、不均质、难以复制等。Liposomes易于聚集和融合，通常在长时间或在某些物理操作下是不稳定的，例如停止流动或剧烈混合。通过挤出机制备的liposomes尺寸并不是均质的，不同批次制备可能存在明显差异。组装入liposomes中的膜蛋白通常会导致样品浑浊和粘稠，这可能会限制一些生物化学分析技术的应用。Nanodiscs技术在膜蛋白的分离、纯化、结构研究和功能表征方面展现了重要的优势。Nanodiscs的主要成分是合成磷脂和两亲性螺旋蛋白(amphipathic helicalprotein)，也叫做膜支架蛋白(membrane scaffold protein，MSP)。膜支架蛋白与血清载脂蛋白相关，而血清载脂蛋白是高密度脂蛋白的主要成分。
将liposomes或者Nanodiscs对膜蛋白进行重构是目前恢复膜蛋白结构和功能的主要策略。通过将纯化后的膜蛋白重新插入脂膜内部，保护膜蛋白的结构和功能，能够有效避免膜蛋白脱离膜层后发生的失活现象。使用这些膜支架蛋白以稳定、分散和溶解完全或部分疏水的蛋白质(如外周、包埋或整合膜蛋白)同时保持这些膜蛋白的生物学活性，或稳定、分散和溶解膜片段的方法有很多；然而现有技术中的膜支架蛋白构成的磷脂纳米盘用于稳定、分散和溶解完全或部分疏水的蛋白质时，活性损失大，以质膜蛋白为例，经过一系列纯化步骤后，蛋白活性仅为30％左右，重构过程最多也只将其活性提高至60％。
因此，迫切需要开发一种膜支架蛋白、磷脂纳米盘和纳米颗粒及其制备方法，使得膜蛋白保持较大的蛋白活性，成为亟待解决的技术问题。
发明内容
为了解决所述技术问题，本发明实施例提供了一种膜支架蛋白、磷脂纳米盘和纳米颗粒及其制备方法，使得膜蛋白保持较大的蛋白活性，可保持其相关生物学功能。
在本发明实施例的第一方面，提供了一种膜支架蛋白，所述膜支架蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在本发明实施例的第二方面，提供了所述的膜支架蛋白的制备方法，所述方法包括：
获得编码如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的基因片段；
将所述基因片段克隆到pET28a载体的NcoI和HindIII酶切位点之间，获得重组载体pET28a-MPS1D1；
将所述重组载体pET28a-MPS1D1转化后，诱导表达和纯化，获得所述膜支架蛋白。
在本发明实施例的第三方面，提供了一种磷脂纳米盘，所述磷脂纳米盘的制备原料包括膜支架蛋白溶液、脂质溶液和去垢剂DPC；其中，所述膜支架蛋白溶液为所述的膜支架蛋白与缓冲液混匀获得的溶液；所述脂质溶液为用50～100mM胆酸钠溶液溶解脂质至终浓度为45～55mM所获得的溶液。
进一步地，所述脂质包括DMPC、POPC、DOPC、DMPG、DOPG、DOPE、PL E.coli和TL E.coli中的一种。
进一步地，所述膜支架蛋白与所述DMPC溶液的摩尔浓度比为1:(78～82)；
所述膜支架蛋白与所述POPC溶液的摩尔浓度比为1:(53～57)；
所述膜支架蛋白与所述DOPC溶液的摩尔浓度比为1:(28～32)；
所述膜支架蛋白与所述DMPG溶液的摩尔浓度比为1:(68～72)；
所述膜支架蛋白与所述DOPG溶液的摩尔浓度比为1:(28～32)；
所述膜支架蛋白与所述DOPE溶液的摩尔浓度比为1:(28～32)；
所述膜支架蛋白与所述PL E.coli溶液的摩尔浓度比为1:(38～42)；
所述膜支架蛋白与所述TL E.coli溶液的摩尔浓度比为1:(38～42)。
进一步地，所述缓冲液包括PBS缓冲液、Tris盐缓冲中的一种。
进一步地，所述去垢剂DPC的终浓度为0.15～0.25％(优选为0.2％)；
在本发明实施例的第四方面，提供了所述的磷脂纳米盘的制备方法，所述方法包括：
获得所述的膜支架蛋白；将所述膜支架蛋白与缓冲液混合，获得蛋白溶液；
将50～100mM胆酸钠溶液溶解脂质，获得脂质终浓度为45～55mM的脂质溶液；
将所述膜支架蛋白溶液、所述脂质溶液和去垢剂DPC混匀，获得组装液；
将所述组装液经透析，后固液分离获得液体，即为所述磷脂纳米盘。
在本发明实施例的第五方面，提供了一种纳米颗粒，所述纳米颗粒的制备原料包括所述的磷脂纳米盘和膜蛋白。
进一步地，所述膜蛋白包括外周膜蛋白、包埋膜蛋白、整合膜蛋白、受体蛋白和G-蛋白偶联受体中的至少一种。
进一步地，所述整合膜蛋白包括6次跨膜蛋白aqpZ，所述6次跨膜蛋白aqpZ的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述6次跨膜蛋白aqpZ的终浓度为500～1000μM。
本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
本发明实施例提供的一种膜支架蛋白、磷脂纳米盘和纳米颗粒及其制备方法，(1)本发明实施例提供的膜支架蛋白-MSP1D1蛋白去掉了与形成纳米圆盘结构无关的N端11个氨基酸，可以重复制备符合组装要求的膜支架蛋白。(2)本发明实施例的磷脂纳米盘采用最佳组装体系，按照该摩尔比制备的磷脂纳米圆盘成功率高，批间差小，可确保不同批次的组分间实验可以复制。对于纯化膜支架蛋白的成功组装，最重要的因素是目的蛋白的有效溶解和避免产生聚集。这些条件可以通过使用正确的总体化学计量，参数包括去垢剂的选择、去垢剂的浓度，膜支架蛋白与脂质的摩尔浓度比。(3)采用所述磷脂纳米盘和膜蛋白制备得到的纳米颗粒，可使得膜蛋白保持较大的蛋白活性，可保持其相关生物学功能。所述方法纯化得到的膜蛋白具有高纯度并具有高活性。将膜蛋白组装入纳米圆盘内，避免了最终去垢剂的使用，去垢剂对膜蛋白稳定性具有危害，过量的胶束相会干扰许多测活技术，并且去垢剂在膜蛋白操作过程中也会造成障碍，它们通常与靶蛋白共浓缩，能导致蛋白的失活或变性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明实施例的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1是实施例11-实施例17中的反应体系中的上清中apqZ的电泳分析结果；其中，Marker泳道:Marker从上到下分别为116.0,66.2,45.0,35.0,25.0,18.4,14.4kDa；泳道1:实施例11上清；泳道2:实施例12上清；泳道3:实施例13上清；泳道4:实施例14上清；泳道5:实施例15上清；泳道6:实施例16上清；泳道7:实施例17上清；泳道8:对比例1沉淀；
图2是实施例11-实施例17中的反应体系中的沉淀中apqZ的电泳分析结果；Marker泳道:Marker从上到下分别为116.0,66.2,45.0,35.0,25.0,18.4,14.4kDa泳道1:阴性对照；泳道2:对比例1沉淀；泳道3:实施例11沉淀；泳道4:实施例12沉淀；泳道5:实施例13沉淀；泳道6:实施例14沉淀；泳道7:实施例15沉淀；泳道8:实施例16沉淀；泳道9:实施例17沉淀；
图3是实施例11中的nanodiscs-aqpZ纯化结果；
图4是实验例2提供的nanodiscs-aqpZ与ytfE测活结果；
图5为实施例2中获得的MSP1D1蛋白的SDS-PAGE图；Marker:Marker从上到下分别为116.0,66.2,45.0,35.0,25.0,18.4,14.4kDa；泳道1:MSP1D1蛋白。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明实施例，本发明实施例的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明实施例，而非限制本发明实施例。
在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明实施例所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
除非另有特别说明，本发明实施例中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
本发明实施例提供的技术方案为解决上述技术问题，总体思路如下：
根据本发明实施例的一种典型实施方式，提供了一种膜支架蛋白，所述膜支架蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本申请发明人经实验发现：去掉与形成纳米圆盘结构无关的N端11个氨基酸，可以重复制备符合组装要求的膜支架蛋白。
根据本发明实施例的另一种典型实施方式，提供了所述的膜支架蛋白的制备方法，所述方法包括：
获得编码如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的基因片段；
将所述基因片段克隆到pET28a载体的NcoI和HindIII酶切位点之间，获得重组载体pET28a-MPS1D1；
将所述重组载体pET28a-MPS1D1转化后，诱导表达和纯化，获得所述膜支架蛋白。
根据本发明实施例的另一种典型实施方式，提供了一种磷脂纳米盘，所述磷脂纳米盘的制备原料包括膜支架蛋白溶液、脂质溶液和去垢剂DPC；其中，所述膜支架蛋白溶液为所述的膜支架蛋白与缓冲液混匀获得的溶液；所述脂质溶液为用50～100mM胆酸钠溶液溶解脂质至终浓度为45～55mM所获得的溶液。
本发明实施例的磷脂纳米盘采用最佳组装体系，按照该摩尔比制备的磷脂纳米圆盘成功率高，批间差小，可确保不同批次的组分间实验可以复制。对于纯化膜支架蛋白的成功组装，最重要的因素是目的蛋白的有效溶解和避免产生聚集。这些条件可以通过使用正确的总体化学计量，参数包括去垢剂的选择、去垢剂的浓度，膜支架蛋白与脂质的摩尔浓度比。
根据本发明实施例的另一种典型实施方式，提供了所述的磷脂纳米盘的制备方法，所述方法包括：
获得所述的膜支架蛋白；将所述膜支架蛋白与缓冲液混合，获得蛋白溶液；
将50～100mM胆酸钠溶液溶解脂质，获得脂质终浓度为45～55mM的脂质溶液；
将所述膜支架蛋白溶液、所述脂质溶液和去垢剂DPC混匀，获得组装液；
将所述组装液经透析，后固液分离获得液体，即为所述磷脂纳米盘。
该实施方式中，
将50～100mM胆酸钠溶液溶解脂质，获得脂质终浓度为45～55mM的脂质溶液，可放置于37℃培养基中30min轻柔震荡，使溶解更充分。当悬浮液变澄清时溶解完全。储存于-20℃中，使用前在冰上溶解；
DPC是一种去垢剂，维持缓冲中含有的去垢剂。透析的过程，DPC会逐渐透析出去。从而引发nanodiscs的自组装。当缓冲中没有去垢剂的时候(即经过透析后)，膜支架蛋白和lipid才会自组装；
所述脂质包括DMPC、POPC、DOPC、DMPG、DOPG、DOPE、PLE.coli和TLE.coli中的一种。
当所述脂质溶液为DMPC溶液时，所述膜支架蛋白与所述DMPC溶液的摩尔浓度比为1:78～82；
当所述脂质溶液为POPC溶液时，所述膜支架蛋白与所述POPC溶液的摩尔浓度比为1:53～57；
当所述脂质溶液为DOPC溶液时，所述膜支架蛋白与所述DOPC溶液的摩尔浓度比为1:28～32；
当所述脂质溶液为DMPG溶液时，所述膜支架蛋白与所述DMPG溶液的摩尔浓度比为1:68～72；
当所述脂质溶液为DOPG溶液时，所述膜支架蛋白与所述DOPG溶液的摩尔浓度比为1:28～32；
当所述脂质溶液为DOPE溶液时，所述膜支架蛋白与所述DOPE溶液的摩尔浓度比为1:28～32；
当所述脂质溶液为PLE.coli溶液时，所述膜支架蛋白与所述PLE.coli溶液的摩尔浓度比为1:38～42；
当所述脂质溶液为TLE.coli溶液时，所述膜支架蛋白与所述TL E.coli溶液的摩尔浓度比为1:38～42。
所述去垢剂DPC的终浓度为0.15～0.25％(优选为0.2％)；
经试验发现，本发明实施例的磷脂纳米盘采用的组装体系，按照该摩尔比制备的磷脂纳米圆盘成功率高，批间差小，可确保不同批次的组分间实验可以复制。对于纯化膜支架蛋白的成功组装，最重要的因素是目的蛋白的有效溶解和避免产生聚集。若所述膜支架蛋白与所述脂质溶液的摩尔浓度比、去垢剂DPC的终浓度、将50～100mM胆酸钠溶液溶解脂质，获得脂质终浓度为45～55mM的脂质溶液等参数不在所述范围内，膜支架蛋白难以组装成功。
所述膜支架蛋白与所述DMPC溶液的摩尔浓度比是有固定范围的，去垢剂DPC的终浓度是有固定范围的。所述膜支架蛋白溶液为所述的膜支架蛋白与缓冲液混匀获得的溶液，所以缓冲液用量也是可以是根据其他组分的比例唯一确定的。
需要说明的是，所述摩尔浓度比也叫物质的量浓度，是溶液中溶剂和溶质的相对含量，是一种常用的溶液浓度的表示方法。
根据本发明实施例的另一种典型实施方式，提供了一种纳米颗粒，所述纳米颗粒的制备原料包括所述的磷脂纳米盘和膜蛋白。
所述膜蛋白包括外周膜蛋白、包埋膜蛋白、整合膜蛋白、受体蛋白和G-蛋白偶联受体中的至少一种。
所述整合膜蛋白包括6次跨膜蛋白aqpZ；
所述6次跨膜蛋白aqpZ的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述磷脂纳米盘的终浓度为500-1000μM这为常规的使用浓度，越高越好，但是从实验使用胶图的效果来说，500μM以上即满足要求。
下面将结合实施例及实验数据对本申请的效果进行详细说明。
实施例1重组载体pET28a-MPS1D1的制备
1、膜支架蛋白MPS1D1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2、膜支架蛋白MPS1D1基因片段的获得
所述基因片段由武汉金开瑞生物工程有限公司进行基因合成。设计引物，引物如表1所示。
表1
以合成的所述基因片段为模板，采用如SEQ ID NO.3-4所示的引物对进行PCR反应，反应体系如表2所示。
表2
| 项目 | 体积 |
| 模板 | 4μL |
| 上游引物(F) | 2μL |
| 下游引物(R) | 2μL |
| 10×Buffer | 20μL |
| dNTPs | 16μL |
| pFu酶 | 2μL |
| 加水至 | 200μL |
PCR反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性30sec，52℃退火45sec，72℃延伸90sec，共30个循环；72℃延伸10min；15℃保温5min。反应结束后，以1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。目的片段长度为651bp，与预期的一致。
根据目的片段的大小切胶，放置干净离心管。离心管放置-80℃冰箱，15min后取出室温溶解，用1mL蓝色枪头将胶捣碎，12000r/min，2min。离心后上清移至的新空白EP管，备用。
3、载体的酶切NcoI和HindIII
选择优化的pET-28a载体使用的双酶切体系(150μL)如表3所示(单位：μL)
表3
| 项目 | 体积 |
| 载体 | 20μL |
| Buffer O | 15μL |
| NcoI | 4μL |
| HindIII | 4μL |
| 加水至 | 150μL |
用枪轻轻吹吸混合均匀，37℃水浴酶切20h以上为佳
4、载体回收
采用常规方法进行载体pET-28a-sumo回收后，1％琼脂糖凝胶电泳检测回收产物。
5、连接反应
目的片段MPS1D1和载体pET-28a的酶切产物分别经过回收后做连接反应，反应体系(10μL)如表4所示，后于冰上15min后转化后得到pET28a-MSP1D1。
表4
| 项目 | 体积 |
| 目的片段MPS1D1 | 4μL |
| 载体pET-28a | 1μL |
| Buffer | 0.2μL |
| 连接酶 | 2.5μL |
| 加水至 | 10μL |
6、转化和阳性克隆筛选
从-80℃冰箱中取出感受态细胞，打开盖子，加入连接产物pET28a-MSP1D1(10μl)；轻轻吹吸并旋转小枪头，使DNA与感受态细胞充分混匀，冰上30min，42℃热击90s，冰上1min；加入700μl预热的LB培养基，置37℃摇床中158r/1.5h。
6000r离心4min，在超净台里面吸掉700μl上清，剩余菌液混匀，涂至含有卡那霉素的平板上；倒置平板，于37℃恒温培养箱中培养，12～16h后可出现菌落。
挑斑检测，挑斑检测体系中上游引物选择通用引物T7，下游引物用R，经过PCR扩增后条带大小约为651bp，与预期一致。将阳性单克隆菌液接种至3mL加相应抗生素的LB培养基中培养过夜，第二天进行保种，送测。测序无误后提取质粒得pET28a-MSP1D1质粒。
实施例2膜支架蛋白MPS1D1蛋白的表达与纯化
1、载体pET28a-MPS1D1蛋白的表达
准备大肠杆菌表达宿主菌Rosetta(DE3)至冰上融化，加入pET28a-MSP1D1质粒。冰上30min；42℃热击90s、冰上1min、加入800μL预热的LB培养基，置37℃摇床中158r/120min。6000r离心4min，超净台里面吸掉800μL上清，剩余菌液混匀，涂至含有K+的平板上；倒置平板，于37℃恒温培养箱中培养过夜。
挑取单菌落加入对应抗性的LB(3mL)试管中，放入摇床培养3h后，取700μL悬液加入到100μL(C＝50％)的保种甘油中，震匀，放入冰箱(-20℃)冻存。然后再剩余的菌液中加入1mMIPTG诱导表达。诱导后温度降到30℃，再继续培养4h收菌。SDS-PAGE检测表达结果。
2、载体pET28a-MPS1D1蛋白的纯化
1、用50ml Buffer MSP-A重悬菌体，加入终浓度为1mM PMSF。超声破碎15min。超声后12000rpm，4℃离心30min，得到裂解液上清，上清用0.45μm的过滤膜过滤，准备上柱纯化。
2、用Buffer MSP-A平衡柱子(Ni-NTA，Qiagen)。过滤后的裂解液上柱。依次用Buffer MSP-A,B,C,D洗柱子，各洗5柱。
表5
| Buffer MSP-A | 20mM Tris-HCl，pH8.0，500mM NaCl，1％TritonX-100(v/v) |
| Buffer MSP-B | 20mM Tris-HCl，pH8.5，500mM NaCl，100mM cholic acid |
| Buffer MSP-C | 20mM Tris-HCl，pH8.0，500mM NaCl |
| Buffer MSP-D | 20mM Tris-HCl，pH8.0，500mM NaCl，20mM咪唑 |
| Buffer MSP-E | 20mM Tris-HCl，pH8.0，500mM NaCl，500mM咪唑 |
| Buffer MSP-F(dialysis) | 20mM Tris-HCl，pH8.0，500mM NaCl，10％甘油(v/v) |
3、用Buffer MSP-E洗脱目的蛋白。通常可以得到20-30ml MSP(浓度约1.5mg/ml)。加入终浓度为10％(v/v)的甘油防止沉淀。
4、采用5L Buffer MSP-F透析，3小时后换一次buffer，4℃过夜。
5、采用Bradford检测蛋白的浓度，确定蛋白的浓度，分装，液氮速冻，-80℃可以保存几个月。实施例2中获得的MSP1D1蛋白的SDS-PAGE图如图5所示，条带清晰无杂带，表明纯度高。
实施例3磷脂纳米盘1
1、用50～100mM胆酸钠溶液溶解DMPC至终浓度50mM，可放置于37℃培养基中30min轻柔震荡，使溶解更充分。当悬浮液变澄清时溶解完全。储存于-20℃中，使用前在冰上溶解。
2、获得实施例2所述的膜支架蛋白；将所述膜支架蛋白与缓冲液混合，获得蛋白溶液；
3、将所述膜支架蛋白溶液、所述DMPC溶液和去垢剂DPC混匀，获得组装液；
所述膜支架蛋白与所述DMPC溶液的摩尔浓度比为1:78～82；DPC的终浓度为0.2％(w/v)。
4、通过透析诱发nanodisc的组装，透析袋是10kDa的Slide-A-Lyzers。4℃透析12h，换新鲜PBS，4℃继续透析24h。推荐换3次buffer。离心12000rpm，20min，得到上清，上清即组装成功的磷脂纳米盘Nanodiscs。
实施例4磷脂纳米盘2
1、用50～100mM胆酸钠溶液溶解POPC至终浓度50mM，可放置于37℃培养基中30min轻柔震荡，使溶解更充分。当悬浮液变澄清时溶解完全。储存于-20℃中，使用前在冰上溶解。
2、获得实施例2所述的膜支架蛋白；将所述膜支架蛋白与缓冲液混合，获得蛋白溶液；
3、将所述膜支架蛋白溶液、所述POPC溶液和去垢剂DPC混匀，获得组装液；
所述膜支架蛋白与所述POPC溶液的摩尔浓度比为1:53～57；DPC的终浓度为0.2％(w/v)。
4、通过透析诱发nanodisc的组装，透析袋是10kDa的Slide-A-Lyzers。4℃透析12h，换新鲜PBS，4℃继续透析24h。推荐换3次buffer。离心12000rpm，20min，得到上清，上清即组装成功的磷脂纳米盘Nanodiscs。
实施例5磷脂纳米盘3
1、用50～100mM胆酸钠溶液溶解DOPC至终浓度50mM，可放置于37℃培养基中30min轻柔震荡，使溶解更充分。当悬浮液变澄清时溶解完全。储存于-20℃中，使用前在冰上溶解。
2、获得实施例2所述的膜支架蛋白；将所述膜支架蛋白与缓冲液混合，获得蛋白溶液；
3、将所述膜支架蛋白溶液、所述DOPC溶液和去垢剂DPC混匀，获得组装液；
所述膜支架蛋白与所述DOPC溶液的摩尔浓度比为1:28～32；DPC的终浓度为0.2％(w/v)。
4、通过透析诱发nanodisc的组装，透析袋是10kDa的Slide-A-Lyzers。4℃透析12h，换新鲜PBS，4℃继续透析24h。推荐换3次buffer。离心12000rpm，20min，得到上清，上清即组装成功的磷脂纳米盘Nanodiscs。
实施例6磷脂纳米盘4
1、用50～100mM胆酸钠溶液溶解DMPG至终浓度50mM，可放置于37℃培养基中30min轻柔震荡，使溶解更充分。当悬浮液变澄清时溶解完全。储存于-20℃中，使用前在冰上溶解。
2、获得实施例2所述的膜支架蛋白；将所述膜支架蛋白与缓冲液混合，获得蛋白溶液；
3、将所述膜支架蛋白溶液、所述DMPG溶液和去垢剂DPC混匀，获得组装液；
所述膜支架蛋白与所述DMPG溶液的摩尔浓度比为1:68～72；DPC的终浓度为0.2％(w/v)。
4、通过透析诱发nanodisc的组装，透析袋是10kDa的Slide-A-Lyzers。4℃透析12h，换新鲜PBS，4℃继续透析24h。推荐换3次buffer。离心12000rpm，20min，得到上清，上清即组装成功的磷脂纳米盘Nanodiscs。
实施例7磷脂纳米盘5
1、用50～100mM胆酸钠溶液溶解DOPG至终浓度50mM，可放置于37℃培养基中30min轻柔震荡，使溶解更充分。当悬浮液变澄清时溶解完全。储存于-20℃中，使用前在冰上溶解。
2、获得实施例2所述的膜支架蛋白；将所述膜支架蛋白与缓冲液混合，获得蛋白溶液；
3、将所述膜支架蛋白溶液、所述DOPG溶液和去垢剂DPC混匀，获得组装液；
所述膜支架蛋白与所述DOPG溶液的摩尔浓度比为1:28～32；DPC的终浓度为0.2％(w/v)。
4、通过透析诱发nanodisc的组装，透析袋是10kDa的Slide-A-Lyzers。4℃透析12h，换新鲜PBS，4℃继续透析24h。推荐换3次buffer。离心12000rpm，20min，得到上清，上清即组装成功的磷脂纳米盘Nanodiscs。
实施例8磷脂纳米盘6
1、用50～100mM胆酸钠溶液溶解DOPE至终浓度50mM，可放置于37℃培养基中30min轻柔震荡，使溶解更充分。当悬浮液变澄清时溶解完全。储存于-20℃中，使用前在冰上溶解。
2、获得实施例2所述的膜支架蛋白；将所述膜支架蛋白与缓冲液混合，获得蛋白溶液；
3、将所述膜支架蛋白溶液、所述DOPEG溶液和去垢剂DPC混匀，获得组装液；
所述膜支架蛋白与所述DOPE溶液的摩尔浓度比为1:28～32；DPC的终浓度为0.2％(w/v)。
4、通过透析诱发nanodisc的组装，透析袋是10kDa的Slide-A-Lyzers。4℃透析12h，换新鲜PBS，4℃继续透析24h。推荐换3次buffer。离心12000rpm，20min，得到上清，上清即组装成功的磷脂纳米盘Nanodiscs。
实施例9磷脂纳米盘7
1、用50～100mM胆酸钠溶液溶解PL E.coli至终浓度50mM，可放置于37℃培养基中30min轻柔震荡，使溶解更充分。当悬浮液变澄清时溶解完全。储存于-20℃中，使用前在冰上溶解。
2、获得实施例2所述的膜支架蛋白；将所述膜支架蛋白与缓冲液混合，获得蛋白溶液；
3、将所述膜支架蛋白溶液、所PL E.coli溶液和去垢剂DPC混匀，获得组装液；
所述膜支架蛋白与所述PL E.coli溶液的摩尔浓度比为1:38～42；DPC的终浓度为0.2％(w/v)。
4、通过透析诱发nanodisc的组装，透析袋是10kDa的Slide-A-Lyzers。4℃透析12h，换新鲜PBS，4℃继续透析24h。推荐换3次buffer。离心12000rpm，20min，得到上清，上清即组装成功的磷脂纳米盘Nanodiscs。
实施例10磷脂纳米盘8
1、用50～100mM胆酸钠溶液溶解TL E.coli至终浓度50mM，可放置于37℃培养基中30min轻柔震荡，使溶解更充分。当悬浮液变澄清时溶解完全。储存于-20℃中，使用前在冰上溶解。
2、获得实施例2所述的膜支架蛋白；将所述膜支架蛋白与缓冲液混合，获得蛋白溶液；
3、将所述膜支架蛋白溶液、所TL E.coli溶液和去垢剂DPC混匀，获得组装液；
所述膜支架蛋白与所述TL E.coli溶液的摩尔浓度比为1:38～42；DPC的终浓度为0.2％(w/v)。
4、通过透析诱发nanodisc的组装，透析袋是10kDa的Slide-A-Lyzers。4℃透析12h，换新鲜PBS，4℃继续透析24h。推荐换3次buffer。离心12000rpm，20min，得到上清，上清即组装成功的磷脂纳米盘Nanodiscs。
实施例11纳米颗粒1(纳米盘-膜蛋白复合物)
1、使用该试剂盒表达6次跨膜蛋白aqpZ，所述6次跨膜蛋白aqpZ的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
2、向实施例3获得磷脂纳米盘体系中加入所述6次跨膜蛋白aqpZ，获得nanodiscs-aqpZ纳米盘-膜蛋白复合物。所述磷脂纳米盘的终浓度为10μM。
3、纳米盘-膜蛋白复合物nanodiscs-aqpZ的纯化
(1)用Buffer MSP-C平衡镍柱(Ni-NTA，Qiagen)洗5柱体积
(2)将样品加入已平衡好的镍柱中，控制流速，让样品缓慢滴下，样品过镍柱至少2遍。
(3)接穿透。
(4)用Buffer MSP-D洗杂，接一滴液体用G250检测对比颜色，当颜色变浅与对照一致，表明可以洗脱目的蛋白。
(5)用Buffer MSP-E洗脱，用超滤管(MWCO 10kDa，Millipore)3500rpm，4℃离心至合适体积。
(6)送SDS-PAGE检测，Bradford检测蛋白的浓度，确定蛋白的浓度。
实施例12纳米颗粒2
该实施例中所述磷脂纳米盘的终浓度为20μM；其余步骤均同实施例11。
实施例13纳米颗粒3
该实施例中所述磷脂纳米盘的终浓度为40μM；其余步骤均同实施例11。
实施例14纳米颗粒4
该实施例中所述磷脂纳米盘的终浓度为60μM；其余步骤均同实施例11。
实施例15纳米颗粒5
该实施例中所述磷脂纳米盘的终浓度为80μM；其余步骤均同实施例11。
实施例16纳米颗粒6
该实施例中所述磷脂纳米盘的终浓度为100μM；其余步骤均同实施例11。
实施例17纳米颗粒7
该实施例中所述磷脂纳米盘的终浓度为120μM；其余步骤均同实施例11。
对比例1
该对比例中不加入磷脂纳米盘，无细胞体系表达apqZ，沉淀；具体步骤为同实施例11，不加入纳米圆盘即可，其他步骤一致。
实验例1
将实施例11-实施例17中的反应体系中的上清和沉淀中apqZ的进行电泳分析，其中实施例11-实施例17中的反应体系中的上清中apqZ的电泳分析结果如图1所示，实施例11-实施例17中的反应体系中的沉淀中apqZ的电泳分析结果如图2所示。
由图1-图2可知，对比例1中反应体系中没有nanodiscs，aqpZ均在沉淀中(图1.泳道8和图2泳道2)。随着反应体系中nanodiscs浓度的增加，上清中逐步出现aqpZ蛋白。加入20μM Nanodsics时，即可达到良好的组织效果，几乎大部分apqZ都在上清中，图2泳道4开始沉淀中的aqpZ已经很少了。实验结果表达nanodiscs制备成功，膜蛋白可成功组装入nanodscs中。
图3是纯化后的nanodiscs-aqpZ。表明纯度达到85％以上表明本发明实施例提供的磷脂纳米盘可将6次跨膜蛋白aqpZ成功可溶表达，并纯化出蛋白。
实验例2 nanodiscs-aqpZ与ytfE活性检测
将实施例11的纳米颗粒nanodiscs-aqpZ用CB缓冲稀释成5μg/ml后加入到ELISA板中，4℃包被过夜；倾掉包被液后，以PBS洗3次，4％PBSM(PBS含4％脱脂牛奶)封闭1h；以PBS洗1次后，每孔加入100μL 4％PBSM稀释后的ytfE(Cusibio，CSB-EP303998ENV)(ytfE重组蛋白稀释到1000μg/ml作为最高浓度，并按照2倍梯度逐一稀释成18个浓度组)，于37℃反应1h；用PBS和PBST各洗3次后；每孔加入100μL GST鼠单抗抗体(Cusabio，CSB-MA000031M0m，以4％PBSM按1：1000稀释)，于37℃反应1h；用PBS和PBST各洗3次后，每孔加入100μL羊抗鼠IgG抗体；(以4％PBSM按1：10000稀释)，37℃保温1h；用PBST和PBS洗涤三次，加入100μL TMB底物溶液，避光反应15min，加入25μL H2SO4(2mol/L)终止反应，用酶标仪测定OD450nm值。吸光度值读出后，导出EXCEL表格。将对应分组标记好，然后将实验组浓度1-浓度18数据复制到Graphpad软件里面，作图，读取EC50数据，最后导出曲线图。
表14
| 浓度(μg/ml) | 浓度对数 | 复孔1 | 复孔2 | 平均值 |
| 10000 | 4.000 | 3.3543 | 3.1324 | 3.24335 |
| 5000 | 3.699 | 3.2119 | 3.1475 | 3.1797 |
| 2500 | 3.398 | 3.072 | 3.1121 | 3.09205 |
| 1250 | 3.097 | 3.2477 | 3.0779 | 3.1628 |
| 625 | 2.796 | 2.4915 | 2.6583 | 2.5749 |
| 312.5 | 2.495 | 1.8657 | 2.0594 | 1.96255 |
| 156.25 | 2.194 | 1.2082 | 1.4425 | 1.32535 |
| 78.125 | 1.893 | 0.822 | 0.7898 | 0.8059 |
| 39.0625 | 1.592 | 0.5339 | 0.5151 | 0.5245 |
| 19.53125 | 1.291 | 0.2725 | 0.2812 | 0.27685 |
| 9.765625 | 0.990 | 0.1688 | 0.1547 | 0.16175 |
| 4.8828125 | 0.689 | 0.1094 | 0.1123 | 0.11085 |
图4是实施例11的nanodiscs-aqpZ与ytfE(Cusibio，CSB-EP303998ENV)Elisa检测其功能活性。固定nanodiscs-aqpZ浓度5μg/ml，最后检测EC50为197.90-259.70μg/ml。
由表4和图4的数据可知：利用nanodiscs技术，我们可以成功的将膜蛋白组装入纳米圆盘中，得到高活性的可溶性蛋白。
最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已描述了本发明实施例的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明实施例范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明实施例进行各种改动和变型而不脱离本发明实施例的精神和范围。这样，倘若本发明实施例的这些修改和变型属于本发明实施例权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明实施例也意图包含这些改动和变型在内。
序列表
<110> 武汉华美生物工程有限公司
<120> 一种膜支架蛋白、磷脂纳米盘和纳米颗粒及其制备方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
His Met Tyr Ile Ser Ser Gly Asp Tyr Asp Ile Pro Thr Thr Glu Asn
1 5 10 15
Leu Tyr Phe Gln Gly Ser Thr Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu Gly
20 25 30
Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu Gly
35 40 45
Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys Val
50 55 60
Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu
65 70 75 80
Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu Gly
85 90 95
Ala Arg Gln Lys Leu His Glu Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu Gly
100 105 110
Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala Arg Ala His Val Asp Ala Leu Arg Thr
115 120 125
His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala Arg
130 135 140
Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr His
145 150 155 160
Ala Lys Ala Thr Glu His Leu Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro
165 170 175
Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe
180 185 190
Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn
195 200 205
Thr Gln His His His His His His His
210 215
<210> 2
<211> 231
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Phe Arg Lys Leu Ala Ala Glu Cys Phe Gly Thr Phe Trp Leu Val
1 5 10 15
Phe Gly Gly Cys Gly Ser Ala Val Leu Ala Ala Gly Phe Pro Glu Leu
20 25 30
Gly Ile Gly Phe Ala Gly Val Ala Leu Ala Phe Gly Leu Thr Val Leu
35 40 45
Thr Met Ala Phe Ala Val Gly His Ile Ser Gly Gly His Phe Asn Pro
50 55 60
Ala Val Thr Ile Gly Leu Trp Ala Gly Gly Arg Phe Pro Ala Lys Glu
65 70 75 80
Val Val Gly Tyr Val Ile Ala Gln Val Val Gly Gly Ile Val Ala Ala
85 90 95
Ala Leu Leu Tyr Leu Ile Ala Ser Gly Lys Thr Gly Phe Asp Ala Ala
100 105 110
Ala Ser Gly Phe Ala Ser Asn Gly Tyr Gly Glu His Ser Pro Gly Gly
115 120 125
Tyr Ser Met Leu Ser Ala Leu Val Val Glu Leu Val Leu Ser Ala Gly
130 135 140
Phe Leu Leu Val Ile His Gly Ala Thr Asp Lys Phe Ala Pro Ala Gly
145 150 155 160
Phe Ala Pro Ile Ala Ile Gly Leu Ala Leu Thr Leu Ile His Leu Ile
165 170 175
Ser Ile Pro Val Thr Asn Thr Ser Val Asn Pro Ala Arg Ser Thr Ala
180 185 190
Val Ala Ile Phe Gln Gly Gly Trp Ala Leu Glu Gln Leu Trp Phe Phe
195 200 205
Trp Val Val Pro Ile Val Gly Gly Ile Ile Gly Gly Leu Ile Tyr Arg
210 215 220
Thr Leu Leu Glu Lys Arg Asp
225 230
<210> 3
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
taagaaggag atataccatg ggtcatcatc atcatcatca tca 43
<210> 4
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgagtgcggc cgcaagcttt tactgggtat tcagctttt 39
Claims (10)
1.一种膜支架蛋白，其特征在于，所述膜支架蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种权利要求1所述的膜支架蛋白的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
获得编码如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的基因片段；
将所述基因片段克隆到pET28a载体的NcoI和HindIII酶切位点之间，获得重组载体pET28a-MPS1D1；
将所述重组载体pET28a-MPS1D1转化后，诱导表达和纯化，获得所述膜支架蛋白。
3.一种磷脂纳米盘，其特征在于，所述磷脂纳米盘为圆盘状的磷脂双层，所述磷脂纳米盘的制备原料包括膜支架蛋白溶液、脂质溶液和去垢剂DPC；其中，所述膜支架蛋白溶液为权利要求1所述的膜支架蛋白与缓冲液混匀获得的溶液；所述脂质溶液为用50～100mM胆酸钠溶液溶解脂质至终浓度为45～55mM所获得的溶液。
4.如权利要求3所述的一种磷脂纳米盘，其特征在于，所述脂质包括DMPC、POPC、DOPC、DMPG、DOPG、DOPE、PL E.coli和TL E.coli中的一种。
5.如权利要求4所述的一种磷脂纳米盘，其特征在于，
所述膜支架蛋白与所述DMPC溶液的摩尔浓度比为1:(78～82)；
所述膜支架蛋白与所述POPC溶液的摩尔浓度比为1:(53～57)；
所述膜支架蛋白与所述DOPC溶液的摩尔浓度比为1:(28～32)；
所述膜支架蛋白与所述DMPG溶液的摩尔浓度比为1:(68～72)；
所述膜支架蛋白与所述DOPG溶液的摩尔浓度比为1:(28～32)；
所述膜支架蛋白与所述DOPE溶液的摩尔浓度比为1:(28～32)；
所述膜支架蛋白与所述PL E.coli溶液的摩尔浓度比为1:(38～42)；
所述膜支架蛋白与所述TL E.coli溶液的摩尔浓度比为1:(38～42)。
6.如权利要求3所述的一种磷脂纳米盘，其特征在于，所述缓冲液包括PBS缓冲液和Tris盐缓冲液中的一种。
7.如权利要求3所述的一种磷脂纳米盘，其特征在于，所述去垢剂DPC的终浓度为0.15～0.25％。
8.一种权利要求3-7任一所述的磷脂纳米盘的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
获得权利要求1所述的膜支架蛋白；将所述膜支架蛋白与缓冲液混合，获得蛋白溶液；
将50～100mM胆酸钠溶液溶解脂质，获得脂质终浓度为45～55mM的脂质溶液；
将所述膜支架蛋白溶液、所述脂质溶液和去垢剂DPC混匀，获得组装液；
将所述组装液经透析，后固液分离获得液体，即为所述磷脂纳米盘。
9.一种纳米颗粒，其特征在于，所述纳米颗粒的制备原料包括权利要求3-7任一所述的磷脂纳米盘和膜蛋白。
10.权利要求9所述的纳米颗粒，其特征在于，所述膜蛋白包括外周膜蛋白、包埋膜蛋白、整合膜蛋白、受体蛋白和G-蛋白偶联受体中的至少一种；所述整合膜蛋白包括6次跨膜蛋白aqpZ，所述6次跨膜蛋白aqpZ的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述磷脂纳米盘的终浓度为500～1000μM。
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