CN112239766B - 一种hla-g全长蛋白及其表达载体、表达工程菌和制备方法 - Google Patents

一种hla-g全长蛋白及其表达载体、表达工程菌和制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种HLA‑G全长蛋白及其表达载体、表达工程菌和制备方法，所述表达载体的表达区的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；所述工程菌包含所述的HLA‑G全长蛋白表达载体。所述HLA‑G全长蛋白由所述的HLA‑G全长蛋白表达工程菌经诱导表达和纯化制备得到。本发明采用优化的大肠杆菌表达系统，体外表达人HLA‑G全长蛋白，实现了人HLA‑G全长蛋白的高产量、高纯度表达；本发明提供人HLA‑G全长蛋白，包含跨膜区，且经过ELISA验证具有与天然蛋白相似的结构，该方法可以制备出高产量、高纯度、具有结构活性的人HLA‑G全长蛋白。

Description

一种HLA-G全长蛋白及其表达载体、表达工程菌和制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种HLA-G全长蛋白及其表达载体、表达工程菌和制备方法。
背景技术
HLA-G是由Geraghty于1987年首次克隆出来的位于6号染色体短臂的一类免疫耐受分子，属于人类一种非经典的主要组织相容性复合体(major histocompatibilitycomplex， MHC)的I类分子，选择性高表达于侵入子宫蜕膜的绒毛外滋养细胞。妊娠被认为是成功的同种异体移植，很多妊娠相关疾病与滋养细胞异常增殖、浸润、胎盘形成不良有关。HLA- G基因与经典的HLA I类基因具有高度同源性，均含有8个外显子、7个内含子和3'非翻译区(3'UTR)。HLA-G初始转录产物经选择性剪切产生7种mRNA异构体，分别编码4种膜结合型HLA-G分子(HLA-G1-HLA-G4)和3种可溶型HLA-G分子(HLA-G5-HLA-G7)。到目前为止，临床上检测到的HLA-G主要是HLA-G1和HLA-G5分子。HLA-G由含α1、α2和α3结构域的重链以非共价键结合15号染色体编码的轻链蛋白B2M及抗原肽，组成抗原肽复合物结构。其作用是将内源性加工处理的抗原肽呈递给T细胞供其识别。在缺少B2M的情况下，HLA-G也可以不结合B2M，而以游离的重链或以二硫键连接两条重链形成同源二聚体的形式存在于细胞表面。早期发现HLA-G由羊膜细胞、红系前体细胞、细胞滋养层等分泌，其主要作用是抑制NK细胞的功能，避免NK细胞攻击具有抗原性的同种异体的胎儿。研究发现妊娠失败率的升高与胎盘HLA-G的表达减少有关。在健康人群体中发现HILA-G蛋白质仅在角膜、胰岛细胞、胸腺等组织器官中表达。有人认为 HLA-G可能与血管生成和(或)胎盘形成有关，普遍接受的观点认为HLA-G是一种免疫耐受分子，可以直接结合各种抑制性受体对免疫系统起到免疫抑制作用，也可以使T细胞分化为抑制性T细胞，从而发挥免疫抑制作用。后续研究陆续发现，HLA-G在病理状态如习惯性流产，先兆子痫，感染性疾病，肿瘤，移植排斥和其他免疫相关性疾病等情况时也能被诱导异常表达。目前普遍认为，HLA-G抗原可诱导胎儿逃避母体的免疫识别，由于它主要在母胎界面表达，其限制性表达、多态性及稳定性能阻断宫内NK细胞的杀伤功能，因此能保护胎儿滋养层细胞免受NK细胞杀伤。如果滋养层细胞HLA-G表达下降，就会激活NK细胞介导的溶胞作用，造成母体对胚胎抗原的免疫攻击而导致流产。先兆子痫(pre-eclampsia，PE)患者HLA-G基因第8外显子的插入/缺失多态性分布显著性偏离Hardy-Weinberg平衡，表现为杂合度过高，且在多数PE患者的胎盘中HLA-G缺乏或表达水平降低，说明HLA-G的表达对PE也有一定的影响。据认为在抗感染方面对各种炎性紊乱性疾病如多发性硬化症、颅内出血、肠胃炎、皮肤病、风湿性疾病、哮喘等HLA-G具有免疫调节作用。在如CMV，HSV-1、HIV-1、狂犬病毒、HCV、甲流感病毒等病毒感染中， HLA-G具有逃逸免疫监视的作用。HLA-G表达于实体肿瘤，如黑素瘤、肉瘤和淋巴瘤等。在原发性黑素瘤细胞和转移细胞表面高表达各种HLA-G异构体。这些HLA-G分子使肿瘤细胞能逃避NK细胞和CTL细胞的杀伤，溶解作用，这是一种新的肿瘤细胞逃脱免疫监视的机制。非实体肿瘤，绒毛膜癌的发生也可能与HLA-G分子抑制NK细胞的杀伤作用有关。HLA-G可能通过抑制NK细胞和(或)CTL细胞激活而下调移植排斥反应。HLA-G 分子的参与有助于在供受者HLA不相配时提高移植受者生存率，并可能抑制异种移植排斥。HLA-G是一种免疫耐受分子，其在习惯性流产、先兆子痫、感染性疾病、肿瘤、移植排斥和其他免疫相关性疾病发生中的作用及应用受到了广泛关注。同时，HLA-G具有抗原呈递功能，可与NK、T、B细胞等免疫细胞上的抑制性受体ILT2/ILT4/KIR2DL4结合，参与调控免疫炎症反应，抑制NK、T、B细胞的增殖；在母亲血液、卵泡液、生殖道，胎盘的胚胎及滋养层细胞及父亲精液中的综合表达在妊娠免疫调节中发挥着重要作用。说明 HLA-G是一个很有前景的研发靶点，有非常大的潜在价值。然而因HLA-G是跨膜蛋白，其全长蛋白难以体外表达纯化。
目前市面上仅有很少的几个截短型HLA-G重组蛋白，且表达量低，无活性检测。截短型HLA-G重组蛋白是HLA-G蛋白的一部分氨基酸表达出来的，不具有HLA-G蛋白的完整构象，在蛋白的活性、作用研究及相应药物筛选等方面有很大的缺陷。全长重组蛋白具有HLA-G蛋白的完整构象，对于蛋白的活性及作用研究更具有说服力，对于相关药物筛选能起到更好的协助作用。然而目前市场上无论是截短型HLA-G重组蛋白还是全长蛋白都处于一个空缺阶段，说明目前体外表达HLA-G重组蛋白具有一定的困难性。
因此迫切需要开发一种体外表达HLA-G全长蛋白，对目前HLA-G的相关病理研究、诊断及治疗等提供一定的帮助。
发明内容
为了解决所述技术问题，本发明提供了一种HLA-G全长蛋白及其表达载体、表达工程菌和制备方法，本发明提供人HLA-G全长蛋白，包含跨膜区，且经过ELISA验证具有与天然蛋白相似的结构，所述方法制备得到的人HLA-G全长蛋白高产量、高纯度并具有结构活性。
在本发明的第一方面，提供了一种HLA-G全长蛋白表达载体，所述表达载体的表达区的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
进一步地，所述表达载体的表达区的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
在本发明的第二方面，提供了所述的HLA-G全长蛋白表达载体的制备方法，所述方法包括：
获得HLA-G全长蛋白的优化密码子片段，所述优化密码子片段的核苷酸序列如SEQID NO.3所示；
获得表达载体，将所述HLA-G全长蛋白的优化密码子片段插入到所述表达载体的表达区，获得HLA-G全长蛋白表达载体。
进一步地，所述获得HLA-G全长蛋白的优化密码子片段，具体包括：
合成得到含有所述HLA-G全长蛋白的优化密码子片段的载体，以所述载体为模板，采用如SEQ ID NO.4-5所示的引物对进行PCR，获得HLA-G全长蛋白的优化密码子片段。
进一步地，所述表达载体为pET-28a-sumo载体。
进一步地，所述将所述HLA-G全长蛋白的优化密码子片段插入到所述表达载体的表达区，获得HLA-G全长蛋白表达载体，具体包括：
将所述pET-28a-sumo载体采用CpoI/NotI双酶切，获得酶切载体；
将所述HLA-G全长蛋白的优化密码子片段采用CpoI/NotI双酶切，获得酶切片段；
将所述酶切载体与所述酶切片段进行酶连，获得HLA-G全长蛋白表达载体。
在本发明的第三方面，提供了一种HLA-G全长蛋白表达工程菌，所述工程菌包含所述的HLA-G全长蛋白表达载体。
进一步地，所述工程菌的制备方法为：用所述的HLA-G全长蛋白表达载体转化大肠杆菌感受态细胞，筛选转化子，获得所述HLA-G全长蛋白表达工程菌。
在本发明的第四方面，提供了一种HLA-G全长蛋白，所述HLA-G全长蛋白由所述的HLA-G全长蛋白表达工程菌经诱导表达和纯化制备得到。
进一步地，所述HLA-G全长蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
本发明提供的一种HLA-G全长蛋白及其表达载体、表达工程菌和制备方法，本发明首次体外制备得到了人HLA-G全长蛋白，所述人HLA-G全长蛋白包含跨膜区，且经过 ELISA验证具有与天然蛋白相似的结构，所述方法制备得到的人HLA-G全长蛋白高产量、高纯度并具有结构活性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为实施例1中PCR产物回收图；
图2为实施例1中载体回收图；
图3为实施例1中转化后的挑斑检测图；
图4为实施例1中的HU-HLA-G-pET28a-SUMO质粒图谱；
图5为实施例2中小量表达上清SDS-PAGE检测图；
图6为实施例2中小量表达上清Western Blot检测图；
图7为实施例2中浓缩后的人HLA-G蛋白SDS-PAGE检测图；
图8为HLA-G与B2M蛋白结合的EC50图；
图9为对比例1中小量表达上清SDS-PAGE检测图；
图10为对比例1中小量表达上清使用Sumo tag Monoclonal Antibody，1/1000进行的 Western Blot检测图。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
本发明实施例提供的技术方案为解决上述技术问题，总体思路如下：
(1)本发明实施例首先将人HLA-G密码子优化，使得采用本发明的表达系统进行蛋白表达时，对密码子偏爱性好，优化后基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
(2)获得HLA-G全长蛋白的表达工程菌
合成得到含有所述HLA-G全长蛋白的优化密码子片段的载体，以所述载体为模板，采用如SEQ ID NO.4-5所示的引物对进行PCR，获得HLA-G全长蛋白的优化密码子片段。
将所述pET-28a-sumo载体采用CpoI/NotI双酶切，获得酶切载体；
将所述HLA-G全长蛋白的优化密码子片段采用CpoI/NotI双酶切，获得酶切片段；
将所述酶切载体与所述酶切片段进行酶连，获得HLA-G全长蛋白表达载体。
用所述的HLA-G全长蛋白表达载体转化大肠杆菌感受态细胞，筛选转化子，获得所述HLA-G全长蛋白表达工程菌。
(3)将所述的HLA-G全长蛋白表达工程菌经诱导表达和纯化制备得到HLA-G全长蛋白。
本发明首次体外制备得到了人HLA-G全长蛋白，所述人HLA-G全长蛋白包含跨膜区，且经过ELISA验证具有与天然蛋白相似的结构，所述方法制备得到的人HLA-G全长蛋白高产量、高纯度并具有结构活性。现有技术中尚没有体外表达的人HLA-G全长蛋白，难以得到具有与天然蛋白相似的结构，或者活性不高纯度低等技术难点。
根据本发明的一种典型实施方式，提供了一种HLA-G全长蛋白表达载体，所述表达载体的表达区的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
作为优选的实施方式，所述表达载体的表达区的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
根据本发明的另一种典型实施方式，提供了所述的HLA-G全长蛋白表达载体的制备方法，所述方法包括：
获得HLA-G全长蛋白的优化密码子片段(具体包括：合成得到含有所述HLA-G全长蛋白的优化密码子片段的载体，以pET-28a-sumo载体为模板，采用如SEQ ID NO.4-5所示的引物对进行PCR，获得HLA-G全长蛋白的优化密码子片段)，所述优化密码子片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
获得表达载体，将所述HLA-G全长蛋白的优化密码子片段插入到所述表达载体的表达区，获得HLA-G全长蛋白表达载体；具体包括：
将所述pET-28a-sumo载体采用CpoI/NotI双酶切，获得酶切载体；
将所述HLA-G全长蛋白的优化密码子片段采用CpoI/NotI双酶切，获得酶切片段；
将所述酶切载体与所述酶切片段进行酶连，获得HLA-G全长蛋白表达载体。
本实施例中HLA-G全长蛋白表达载体具体为HU-HLA-G-pET28a-SUMO的测序结果为：核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
根据本发明的另一种典型实施方式，提供了一种HLA-G全长蛋白表达工程菌，所述工程菌包含所述的HLA-G全长蛋白表达载体。
所述工程菌的制备方法为：用所述的HLA-G全长蛋白表达载体转化大肠杆菌感受态细胞，筛选转化子，获得所述HLA-G全长蛋白表达工程菌。
根据本发明的另一种典型实施方式，提供了一种HLA-G全长蛋白，所述HLA-G全长蛋白由所述的HLA-G全长蛋白表达工程菌经诱导表达和纯化制备得到。
本实施例中，所述HLA-G全长蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
下面将结合实施例及实验数据对本申请的效果进行详细说明。
实施例1 HLA-G质粒制备
1、人HLA-G密码子优化
根据NCBI编号BC021708.2，选择人HLA-G核酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的氨基酸为如SEQ ID NO.2所示。
考虑到不同表达系统进行蛋白表达时，对密码子偏爱性不同，本申请人对上述密码子进行优化，优化后基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2、人HLA-G基因片段的获得
所述优化后的基因片段由武汉金开瑞生物工程有限公司进行基因合成。根据人HLA-G 优化后的核酸序列设计引物，引物如表1所示。
表1
Figure BDA0002734695880000061
以合成的所述优化后的基因片段为模板，采用如SEQ ID NO.4-5所示的引物对进行PCR 反应，反应体系如表2所示。
表2
Figure BDA0002734695880000062
Figure BDA0002734695880000071
PCR反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性30sec，52℃退火45sec，72℃延伸90sec，共30个循环；72℃延伸10min；15℃保温5min。反应结束后，以1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。目的片段长度为942bp，与预期的一致，见图1。Marker从大到小依次为：5000、3000、 2000、1500、1000、750、500、250、100(bp)。
根据目的片段的大小切胶，放置干净离心管。离心管放置-80℃冰箱，15min后取出室温溶解，用1mL蓝色枪头将胶捣碎，12000r/min，2min。离心后上清移至的新空白EP管，备用。
3、载体的酶切CpoI/NotI
选择优化的pET-28a-sumo载体使用的双酶切体系(150μl)如表3所示(单位：μL)
表3
项目 体积
载体 20μL
Buffer O 15μL
CpoI 4μL
NotI 4μL
加水至 150μL
用枪轻轻吹吸混合均匀，37℃水浴酶切20h以上为佳
4、载体回收
采用常规方法进行载体pET-28a-sumo(约5.6Kb)回收后，1％琼脂糖凝胶电泳检测回收产物。目的载体长度为5633bp，与预期的一致，见图2。Marker从大到小依次为：5000、3000、 2000、1500、1000、750、500、250、100(bp)。
5、连接反应
目的片段HLA-G和载体pET-28a-sumo的酶切产物分别经过回收后做连接反应，反应体系(10μL)如表4所示，后于冰上15min后转化后得到HU-HLA-G-pET28a-SUMO。
表4
项目 体积
目的片段HLA-G 4μL
载体pET-28a-sumo 1μL
Buffer 0.2μL
连接酶 2.5μL
加水至 10μL
6、转化和阳性克隆筛选
从-80℃冰箱中取出感受态细胞，打开盖子，加入连接产物HU-HLA-G-pET28a-SUMO(10μl)；轻轻吹吸并旋转小枪头，使DNA与感受态细胞充分混匀，冰上30min，42℃热击90s，冰上1min；加入700μl预热的LB培养基，置37℃摇床中158r/1.5h。
6000r离心4min，在超净台里面吸掉700μl上清，剩余菌液混匀，涂至含有卡那霉素的平板上；倒置平板，于37℃恒温培养箱中培养，12～16h后可出现菌落。
挑斑检测，挑斑检测体系中上游引物选择通用引物T7，下游引物用R，经过PCR扩增后条带大小约为1407bp。泳道Lane 2、Lane 3、Lane 4与预期一致，见图3。Marker从大到小依次为：5000、3000、2000、1500、1000、750、500、250、100(bp)。
选择Lane 2、Lane 3的单克隆菌液接种至3mL加相应抗生素的LB培养基中培养过夜，第二天进行保种，送测。测序无误后提取质粒得HU-HLA-G-pET28a-SUMO质粒。HU-HLA-G-pET28a-SUMO质粒图谱如图4所示。
HU-HLA-G-pET28a-SUMO的测序结果为：核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
实施例2 HLA-G全长蛋白的表达与纯化
准备大肠杆菌表达宿主菌Rosetta(DE3)至冰上融化，加入HU-HLA-G-pET28a-SUMO质粒。冰上30min；42℃热击90s、冰上1min、加入800μL预热的LB培养基，置37℃摇床中158r/120min。6000r离心4min，超净台里面吸掉800μL上清，剩余菌液混匀，涂至含有K+ 的平板上；倒置平板，于37℃恒温培养箱中培养过夜。
挑取单菌落加入对应抗性的LB(3mL)试管中，放入摇床培养3h后，取700μL悬液加入到100μL(C＝50％)的保种甘油中，震匀，放入冰箱(-20℃)冻存。然后再剩余的菌液中加入IPTG诱导表达。SDS-PAGE检测表达结果。
检测后上清用镍离子亲和层析纯化，分别用60mM咪唑，200mM咪唑，500mM咪唑洗脱，融合蛋白大部分被200mM咪唑洗脱下来，200mm咪唑洗脱峰浓缩，进行SDS-PAGE检测。
1、HU-HLA-G-pET28a-SUMO小量表达SDS-PAGE检测结果
小量表达上清SDS-PAGE检测如图5所示：泳道3在50kD左右检测到目的条带，分子量与理论相符。其中1：Marker，2：空白对照，3：HU-HLA-G-pET28a-SUMO小量表达结果。Marker从上自下一依次为：116kD、66.2kD、45kD、35kD、25kD、18kD、14.4kD。
2、HU-HLA-G-pET28a-SUMO小量表达Western Blot检测
小量表达上清使用Sumo tag Monoclonal Antibody，1/1000进行Western Blot检测。结果如图6所示：1：原液上样10μl，2：原液上样5μl在52kD左右检测到目的条带，与SDS-PAGE分子量相符。
3、人HLA-G蛋白纯化浓缩后SDS-PAGE检测
人HLA-G蛋白纯化浓缩后，SDS-PAGE如图7所示，纯度大于85％，产量大于10mg/L。Marker从上自下一依次为：116kD、66.2kD、45kD、35kD、25kD、18kD、14.4kD。
实施例3 ELISA检测蛋白活性
将B2M蛋白(Cusabio，CSB-NP057841h)用CB缓冲稀释成10μg/ml后加入到ELISA板中， 4℃包被过夜；倾掉包被液后，以PBS洗3次，4％PBSM(PBS含4％脱脂牛奶)封闭1h；以PBS洗1次后，每孔加入100μL 4％PBSM稀释后的人HLA-G蛋白(人HLA-G蛋白从200μg/ml 开始2倍梯度稀释18个梯度)，于37℃反应1h；用PBS和PBST各洗3次后；每孔加入100μL Sumotag Monoclonal Antibody(Cusabio，CSB-MA000132M0m，以4％PBSM按1：1000稀释)，于37℃反应1h；用PBS和PBST各洗3次后，每孔加入100μL Goat Anti-Mouse IgG(H+L) Antibody；HRP conjugated(Cusabio，CSB-PA573747，以4％PBSM按1：5000稀释)，37℃保温1h；用PBST和PBS洗涤三次，加入100μL TMB底物溶液，避光反应15min，加入25μL H2SO4(2mol/L)终止反应，用酶标仪测定OD450nm值。
吸光度值读出后，进行数据分析，将实验组浓度1-浓度18数据复制到Graphpad软件里面，作图，读取EC50数据，绘制曲线图。所述人HLA-G蛋白ELISA检测结果如表5和图8所示。
表5
Figure BDA0002734695880000091
Figure BDA0002734695880000101
B2M蛋白(Cusabio，CSB-NP057841h)包被10μg/ml，人HLA-G蛋白从200μg/ml开始2倍梯度稀释18个梯度，对照组正常的情况下，HLA-G与B2M蛋白结合的EC50为1.58- 2.00μg/ml。说明我们制备的HLA-G蛋白结构与天然蛋白结构相似，可以与B2M蛋白结合。
对比例1
该对比例没有进行密码子优化，其他方法均同实施例1，体外表达人HLA-G全长蛋白存在难以表达获得的缺点。
小量表达上清SDS-PAGE检测如图9所示：泳道3在50kD左右未检测到明显的目的条带。其中1：Marker，2：空白对照，3：没有进行密码子优化的载体小量表达结果。Marker 从上自下一依次为：116kD、66.2kD、45kD、35kD、25kD、18kD、14.4kD。
小量表达上清使用Sumo tag Monoclonal Antibody，1/1000进行Western Blot检测。结果如图10所示：1：原液上样10μl在52kD左右检测到较弱目的条带，与理论分子量相符；2：原液上样5μl未检测到明显的目的条带。
综上可知，本发明采用优化的大肠杆菌表达系统，体外表达人HLA-G全长蛋白，实现了人HLA-G全长蛋白的高产量、高纯度表达。并通过B2M蛋白进行ELISA验证，说明其具有活性。同时本方法也适用于制备结构相似的HLA其他系列全长蛋白。本发明提供人 HLA-G全长蛋白，包含跨膜区，且经过ELISA验证具有与天然蛋白相似的结构，该方法可以制备出高产量、高纯度的人HLA-G全长蛋白的，并具有结构活性。现有技术中尚没有体外表达的人HLA-G全长蛋白，最大的技术难点就是难以得到具有与天然蛋白相似的结构，或者活性不高纯度低。
最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
序列表
<110> 武汉华美生物工程有限公司
<120> 一种HLA-G全长蛋白及其表达载体、表达工程菌和制备方法
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 942
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggctcccact ccatgaggta tttcagcgcc gccgtgtccc ggcccagccg cggggagccc 60
cgcttcatcg ccatgggcta cgtggacgac acgcagttcg tgcggttcga cagcgactcg 120
gcgtgtccga ggatggagcc gcgggcgccg tgggtggagc gggaggggcc agagtattgg 180
gaagaggaga cacggaacac caaggcccac gcacagactg acagaatgaa cctgcagacc 240
ctgcgcggct actacaacca gagcgaggcc agttctcata ccctccagtg gatgattggc 300
tgcgacctgg ggtccgacgg acgcctcctc cgcgggtatg aacagtatgc ctacgatggc 360
aaggattacc tcgccctgaa cgaggacctg cgctcctgga ccgcagcgga cactgcggct 420
cagatctcca agcgcaagtg tgaggcggcc aatgtggctg aacaaaggag agcctacctg 480
gagggcacgt gcgtggagtg gctccacaga tacctggaga acgggaagga gatgctgcag 540
cgcgcggacc cccccaagac acacgtgacc caccaccctg tctttgacta tgaggccacc 600
ctgaggtgct gggccctggg cttctaccct gcggagatca tactgacctg gcagcgggat 660
ggggaggacc agacccagga cgtggagctc gtggagacca agcctgcagg ggatggaacc 720
ttccagaagt gggcagctgt ggtggtgcct tctggagagg agcagagata cacgtgccat 780
gtgcagcatg aggggctgcc ggagcccctc atgctgagat ggaagcagtc ttccctgccc 840
accatcccca tcatgggtat cgttgctggt ctggttgtcc ttgcagctgt agtcactgga 900
gctgcggtcg ctgctgtgct gtggaggaag aagagctcag at 942
<210> 2
<211> 314
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Ser Ala Ala Val Ser Arg Pro Ser
1 5 10 15
Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Met Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln
20 25 30
Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ser Ala Cys Pro Arg Met Glu Pro Arg
35 40 45
Ala Pro Trp Val Glu Arg Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Glu Glu Glu Thr
50 55 60
Arg Asn Thr Lys Ala His Ala Gln Thr Asp Arg Met Asn Leu Gln Thr
65 70 75 80
Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Ser Ser His Thr Leu Gln
85 90 95
Trp Met Ile Gly Cys Asp Leu Gly Ser Asp Gly Arg Leu Leu Arg Gly
100 105 110
Tyr Glu Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Leu Ala Leu Asn Glu
115 120 125
Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ala Gln Ile Ser Lys
130 135 140
Arg Lys Cys Glu Ala Ala Asn Val Ala Glu Gln Arg Arg Ala Tyr Leu
145 150 155 160
Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu His Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys
165 170 175
Glu Met Leu Gln Arg Ala Asp Pro Pro Lys Thr His Val Thr His His
180 185 190
Pro Val Phe Asp Tyr Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe
195 200 205
Tyr Pro Ala Glu Ile Ile Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln
210 215 220
Thr Gln Asp Val Glu Leu Val Glu Thr Lys Pro Ala Gly Asp Gly Thr
225 230 235 240
Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln Arg
245 250 255
Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Glu Pro Leu Met Leu
260 265 270
Arg Trp Lys Gln Ser Ser Leu Pro Thr Ile Pro Ile Met Gly Ile Val
275 280 285
Ala Gly Leu Val Val Leu Ala Ala Val Val Thr Gly Ala Ala Val Ala
290 295 300
Ala Val Leu Trp Arg Lys Lys Ser Ser Asp
305 310
<210> 3
<211> 942
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggttctcatt ccatgcgtta tttttccgct gcggtttctc gtccgtctcg tggtgaaccg 60
cgtttcatcg ccatgggtta cgttgatgat acccagttcg ttcgttttga ctccgattcc 120
gcatgtccgc gtatggaacc tcgtgcaccg tgggtagaac gtgaaggtcc ggaatactgg 180
gaagaagaga ctcgtaacac caaagctcac gcgcaaacgg accgtatgaa cctgcagact 240
ctgcgtggtt actacaacca gtctgaagca agctcccaca ccctgcagtg gatgattggc 300
tgtgatctgg gttctgatgg tcgtctgctg cgcggttatg agcagtacgc gtacgacggt 360
aaggattatc tggctctgaa tgaagatctg cgttcttgga ctgcggccga cactgcagca 420
cagatctcca aacgcaaatg cgaagcggct aacgtagctg aacagcgtcg tgcttacctg 480
gaaggtacct gcgtggaatg gctgcatcgt tacctggaaa atggcaaaga gatgctgcag 540
cgtgctgacc cgccgaaaac ccatgttact catcatccgg tattcgacta tgaagctact 600
ctgcgttgct gggccctggg tttctacccg gctgaaatca ttctgacttg gcagcgtgat 660
ggcgaagatc agacccagga cgtggaactg gtcgaaacga aaccggcagg tgacggcact 720
tttcagaaat gggcggcagt ggtggttccg agcggtgaag aacagcgcta tacctgccac 780
gttcagcacg agggtctgcc ggagcctctg atgctgcgtt ggaagcagtc ctctctgccg 840
acgattccga tcatgggcat cgtagctggt ctggtggttc tggctgcggt agttaccggt 900
gctgcagtag cagccgtcct gtggcgtaag aaatcttctg ac 942
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atccgaattc cggaccggtt ctcattccat 30
<210> 5
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tgctcgagtg cggccttagt cagaagattt cttacg 36
<210> 6
<211> 1425
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gggggcatgg tgagcggata cattcccctc tagaataatt ttgtttaact ttaagaagga 60
gatataccat ggctcaccat catcatcatc atatgtcgga ctcagaagtc aatcaagaag 120
ctaagccaga ggtcaagcca gaagtcaagc ctgagactca catcaattta aaggtgtccg 180
atggatcttc agagatcttc ttcaagatca aaaagaccac tcctttaaga aggctgatgg 240
aagcgttcgc taaaagacag ggtaaggaaa tggactcctt aagattcttg tacgacggta 300
ttagaattca agctgatcag acccctgaag atttggacat ggaggataac gatattattg 360
aggctcacag agaacagatt ggtggtggat ccgaattccg gaccggttct cattccatgc 420
gttatttttc cgctgcggtt tctcgtccgt ctcgtggtga accgcgtttc atcgccatgg 480
gttacgttga tgatacccag ttcgttcgtt ttgactccga ttccgcatgt ccgcgtatgg 540
aacctcgtgc accgtgggta gaacgtgaag gtccggaata ctgggaagaa gagactcgta 600
acaccaaagc tcacgcgcaa acggaccgta tgaacctgca gactctgcgt ggttactaca 660
accagtctga agcaagctcc cacaccctgc agtggatgat tggctgtgat ctgggttctg 720
atggtcgtct gctgcgcggt tatgagcagt acgcgtacga cggtaaggat tatctggctc 780
tgaatgaaga tctgcgttct tggactgcgg ccgacactgc agcacagatc tccaaacgca 840
aatgcgaagc ggctaacgta gctgaacagc gtcgtgctta cctggaaggt acctgcgtgg 900
aatggctgca tcgttacctg gaaaatggca aagagatgct gcagcgtgct gacccgccga 960
aaacccatgt tactcatcat ccggtattcg actatgaagc tactctgcgt tgctgggccc 1020
tgggtttcta cccggctgaa atcattctga cttggcagcg tgatggcgaa gatcagaccc 1080
aggacgtgga actggtcgaa acgaaaccgg caggtgacgg cacttttcag aaatgggcgg 1140
cagtggtggt tccgagcggt gaagaacagc gctatacctg ccacgttcag cacgagggtc 1200
tgccggagcc tctgatgctg cgttggaagc agtcctctct gccgacgatt ccgatcatgg 1260
gcatcgtagc tggtctggtg gttctggctg cggtagttac cggtgctgca gtagcagccg 1320
tcctgtggcg taagaaatct tctgactaag gccgcactcg agcaccacca ccaccaccac 1380
tgagatccgg ctgctaacaa agcccgaaag gaagctgagg ggccc 1425
<210> 7
<211> 426
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Met Ala His His His His His His Met Ser Asp Ser Glu Val Asn Gln
1 5 10 15
Glu Ala Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu Thr His Ile
20 25 30
Asn Leu Lys Val Ser Asp Gly Ser Ser Glu Ile Phe Phe Lys Ile Lys
35 40 45
Lys Thr Thr Pro Leu Arg Arg Leu Met Glu Ala Phe Ala Lys Arg Gln
50 55 60
Gly Lys Glu Met Asp Ser Leu Arg Phe Leu Tyr Asp Gly Ile Arg Ile
65 70 75 80
Gln Ala Asp Gln Thr Pro Glu Asp Leu Asp Met Glu Asp Asn Asp Ile
85 90 95
Ile Glu Ala His Arg Glu Gln Ile Gly Gly Gly Ser Glu Phe Arg Thr
100 105 110
Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Ser Ala Ala Val Ser Arg Pro Ser
115 120 125
Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Met Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln
130 135 140
Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ser Ala Cys Pro Arg Met Glu Pro Arg
145 150 155 160
Ala Pro Trp Val Glu Arg Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Glu Glu Glu Thr
165 170 175
Arg Asn Thr Lys Ala His Ala Gln Thr Asp Arg Met Asn Leu Gln Thr
180 185 190
Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Ser Ser His Thr Leu Gln
195 200 205
Trp Met Ile Gly Cys Asp Leu Gly Ser Asp Gly Arg Leu Leu Arg Gly
210 215 220
Tyr Glu Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Leu Ala Leu Asn Glu
225 230 235 240
Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ala Gln Ile Ser Lys
245 250 255
Arg Lys Cys Glu Ala Ala Asn Val Ala Glu Gln Arg Arg Ala Tyr Leu
260 265 270
Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu His Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys
275 280 285
Glu Met Leu Gln Arg Ala Asp Pro Pro Lys Thr His Val Thr His His
290 295 300
Pro Val Phe Asp Tyr Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe
305 310 315 320
Tyr Pro Ala Glu Ile Ile Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln
325 330 335
Thr Gln Asp Val Glu Leu Val Glu Thr Lys Pro Ala Gly Asp Gly Thr
340 345 350
Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln Arg
355 360 365
Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Glu Pro Leu Met Leu
370 375 380
Arg Trp Lys Gln Ser Ser Leu Pro Thr Ile Pro Ile Met Gly Ile Val
385 390 395 400
Ala Gly Leu Val Val Leu Ala Ala Val Val Thr Gly Ala Ala Val Ala
405 410 415
Ala Val Leu Trp Arg Lys Lys Ser Ser Asp
420 425

Claims (1)

1.一种HLA-G全长蛋白的体外制备方法，其特征在于，所述方法包括：
获得HLA-G全长蛋白的优化密码子片段，所述优化密码子片段的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示；
获得HLA-G全长蛋白的表达工程菌：合成得到含有所述HLA-G全长蛋白的优化密码子片段的载体，以所述载体为模板，采用如SEQ ID NO.4-5所示的引物对进行PCR，获得HLA-G全长蛋白的优化密码子片段；将pET-28a-sumo载体采用CpoI /NotI双酶切，获得酶切载体；将所述HLA-G全长蛋白的优化密码子片段采用CpoI /NotI双酶切，获得酶切片段；将所述酶切载体与所述酶切片段进行酶连，获得HLA-G全长蛋白表达载体；用所述的HLA-G全长蛋白表达载体转化大肠杆菌感受态细胞，筛选转化子，获得所述HLA-G全长蛋白表达工程菌；
将所述的HLA-G全长蛋白表达工程菌经诱导表达和纯化制备得到HLA-G全长蛋白。
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可溶性HLA-G1、-G2的原核表达及其蛋白质产物的功能检测;池永斌等;《现代免疫学》;20050720;第25卷(第04期);第293-296,314页 *
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