CN114846136A - 源自鲎的重组G因子及使用该重组G因子的β-葡聚糖的测定方法 - Google Patents

源自鲎的重组G因子及使用该重组G因子的β-葡聚糖的测定方法 Download PDF

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Abstract

本发明的课题在于提供被β‑葡聚糖依赖性激活的源自鲎的G因子及使用该G因子的高灵敏度的β‑葡聚糖的测定方法。本发明涉及一种“异源二聚体、使用该异源二聚体的β‑葡聚糖的测定方法及包含该异源二聚体的β‑葡聚糖测定用试剂盒，该异源二聚体为含有与序列号2或序列号4表示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的G因子α亚基和含有与序列号6、8、10、12、14或16中的任一个表示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的G因子β亚基的组合”。

Description

源自鲎的重组G因子及使用该重组G因子的β-葡聚糖的测定 方法
技术领域
本发明涉及一种由源自鲎的新型的G因子α亚基和G因子β亚基组成的异源二聚体、使用该异源二聚体的β-葡聚糖(以下，缩写为“BG”。)的测定方法及包含该异源二聚体的试剂盒。
背景技术
在内脏、血液系统及淋巴系统中产生的深部真菌病为抵抗力减弱的状态，例如免疫缺陷状态的患者罹患的机会性感染的一种，患者往往会成为极其严重的病情。作为深部真菌病的病原体菌的代表例，可以举出念珠菌、曲霉菌，在其任何一种的细胞壁中都共同存在BG。因此，检测并测定血中BG是有用的。在临床诊断领域中，血浆或血清中BG的浓度被用作深部真菌感染病的早期诊断、治疗效果及预后判定的指标。
BG为以β(1→3)键合的葡萄糖重复结构为主链的多糖，是几千～100万左右的高分子量的物质。也存在具有(1→6)键合或(1→4)键合的支链的情况。在鲎的血细胞提取物(变形细胞裂解液、Amebocyte Lysate，以下，缩写为“裂解液”。)中存在作为由G因子α亚基和G因子β亚基构成的异源二聚体的G因子。BG具有与G因子α亚基的BG结合结构域(domain)部分结合的性质。
作为测定BG的方法，例如已知有如下所述的合成底物法，其利用上述裂解液中的G因子介导的反应途径并使用合成肽底物。
若BG与G因子α亚基的BG结合结构域部分结合，则G因子成为具有蛋白酶活性的活性G因子。活性G因子通过其蛋白酶活性而使存在于裂解液中的凝固酶原(Proclottingenzyme)转化为凝固酶(Clotting enzyme)(非专利文献1)。凝固酶将合成肽底物(例如Boc-DEL-pNA)的合成底物进行酰胺水解而使pNA游离。因此，通过测定生成的显色物质(pNA)的吸光度，能够将BG进行定量。
源自中华鲎属鲎(Tachypleus tridentatus)的G因子α亚基及β亚基已被克隆(非专利文献2、专利文献1)。
在专利文献2中，使用非专利文献2及专利文献1中所记载的G因子，在未添加BG的状态下测定蛋白酶活性。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利第4832134号公报
专利文献2：国际公开第WO2008/004674号小册子
非专利文献
非专利文献1：T.Morita et al.,FEBS Lett.,1981,vol.129,p.318-321
非专利文献2：N.Seki et al.,J.Biol.Chem.,1994,vol.269,No.2,p.1370-1374
发明内容
发明要解决的技术课题
专利文献1、专利文献2等中所记载的技术使用非专利文献2中所确定的基因序列来进行，其使用昆虫细胞培养培养基。然而，已知在昆虫细胞培养培养基中存在来自酵母提取液的BG污染。并且，在专利文献1中，没有在未添加BG的状态下测定蛋白酶活性的试验。因此，在专利文献1中所制作的源自中华鲎属鲎的G因子是否被BG特异性激活是不明确的。
实际上，根据由本发明人等使用将BG设为检测限以下的培养基进行的验证，如由后述的实施例1的结果明确可知，利用非专利文献2及专利文献2中所记载的方法制作的源自中华鲎属鲎的重组G因子即使存在BG，也无法确认蛋白酶活性。即，使用这些文献中所记载的DNA序列，难以制作转化为在BG的存在下具有蛋白酶活性的活性G因子的G因子(前体)。
此外，在专利文献3中记载有以几ng量级的检测灵敏度测定出了BG。然而，在临床诊断上，在血浆或血清中BG的测定中要求以几pg量级进行测定，因此几ng量级的检测灵敏度不具有足以用于临床诊断的性能。
鉴于上述状况，本发明的课题在于提供被BG依赖性激活的源自鲎的G因子及使用该G因子的高灵敏度的BG的测定方法。
用于解决技术课题的手段
本发明是为了解决上述课题而完成的，其由以下构成组成。
[1]一种异源二聚体，其为含有与序列号2或序列号4表示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的G因子α亚基和含有与序列号6、8、10、12、14或16中的任一个表示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的G因子β亚基的组合。
[2]根据所述[1]所述的异源二聚体，其选自下述异源二聚体：
(i)含有序列号2表示的氨基酸序列的G因子α亚基和含有序列号6表示的氨基酸序列的G因子β亚基的组合的异源二聚体；
(ii)含有序列号2表示的氨基酸序列的G因子α亚基和含有序列号8表示的氨基酸序列的G因子β亚基的组合的异源二聚体；
(iii)含有序列号2表示的氨基酸序列的G因子α亚基和含有序列号12表示的氨基酸序列的G因子β亚基的组合的异源二聚体；
(iv)含有序列号2表示的氨基酸序列的G因子α亚基和含有序列号14表示的氨基酸序列的G因子β亚基的组合的异源二聚体；
(v)含有序列号4表示的氨基酸序列的G因子α亚基和含有序列号10表示的氨基酸序列的G因子β亚基的组合的异源二聚体；
(vi)含有序列号4表示的氨基酸序列的G因子α亚基和含有序列号16表示的氨基酸序列的G因子β亚基的异源二聚体。
[3]根据所述[2]所述的异源二聚体，其选自(i)、(ii)或(v)。
[4]一种β-葡聚糖的测定方法，其使用试样以及含有序列号2或序列号4表示的氨基酸序列的G因子α亚基和含有与序列号6、8、10、12、14或16中的任一个表示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的G因子β亚基的组合的异源二聚体。
[5]一种G因子α亚基，其含有序列号2或序列号4表示的氨基酸序列。
[6]一种G因子β亚基，其含有与序列号6、8、10、12、14或16中的任一个表示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列。
[7]一种β-葡聚糖测定用试剂盒，其包含异源二聚体，该异源二聚体含有与序列号2或序列号4表示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的G因子α亚基和含有与序列号6、8、10、12、14或16中的任一个表示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的G因子β亚基的组合。
并且，本发明可以包括以下构成。
[8]一种载体，其整合有具有编码与序列号2、4、6、8、10、12、14或16中的任一个表示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的碱基序列的核酸分子。
[9]一种载体，其整合有具有编码与序列号2或序列号4表示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的碱基序列的核酸分子及具有编码与序列号6、8、10、12、14或16中的任一个表示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的碱基序列的核酸分子这两者。
[10]一种转化体，其整合有具有编码与序列号2、4、6、8、10、12、14或16中的任一个表示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的碱基序列的核酸分子。
[11]一种转化体，其整合有具有编码与序列号2或序列号4表示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的碱基序列的核酸分子及具有编码与序列号6、8、10、12、14或16中的任一个表示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的碱基序列的核酸分子这两者。
[12]一种从试样中去除BG的方法，其中，使含有BG的试样和含有与序列号2或序列号4表示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的G因子α亚基接触来进行处理。
[13]根据所述[12]所述的去除BG的方法，其中，所述G因子α亚基承载于不溶性载体上。
[14]一种β-葡聚糖去除用试剂盒，其包含含有与序列号2或序列号4表示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的G因子α亚基。
本发明人等为了解决上述问题而进行了深入研究的结果，开发出在BG存在下具有蛋白酶活性的G因子，并发现若使用该G因子，则能够进行高灵敏度的BG的测定，从而完成了本发明。
发明效果
本发明的异源二聚体具有在BG存在下发挥蛋白酶活性的BG依赖性的蛋白酶活性。并且，若使用本发明的异源二聚体进行BG浓度的测定，则与以往的BG测定法相比，能够进行高灵敏度的BG的测定。此外，本发明的异源二聚体由于是重组子，因此不存在批间差，发挥能够低价且大量地制造的效果。
附图说明
图1表示实施例1中所获得的PSM-J1培养基或/和使用本发明的G因子α亚基B处理的PSM-J1培养基中的BG的浓度的测定结果。
图2是实施例1中所获得的表示试样中的香菇多糖浓度与吸光度的关系的校准曲线。
图3是在实施例3中使用本发明的G因子α亚基A与G因子β亚基βi2的异源二聚体获得的表示试样中的香菇多糖浓度与吸光度的关系的校准曲线。
图4是在实施例3中使用本发明的G因子α亚基B与G因子β亚基β2的异源二聚体获得的表示试样中的香菇多糖浓度与吸光度的关系的校准曲线。
图5表示使用实施例4中所获得的本发明的G因子α亚基A与G因子β亚基βi2的异源二聚体测定试样中的香菇多糖浓度而获得的试样中的BG浓度的测定结果。
具体实施方式
1.本发明所涉及的BG
作为本发明所涉及的BG，可以举出包含BG作为其构成成分且具有引起鲎血细胞提取物的酶反应的性质的多糖类。具体而言，例如可以举出从各种细菌类(例如，产碱菌(Alcaligenes)属、农杆菌(Agrobacterium)属等)、酵母类(例如，酵母(Saccharomyces)属、念珠菌(Candida)属、银球菌(Cry ptococcus)属、丝孢酵母(Trichosporon)属、红酵母(Rhodotorula)属等)、霉菌类(曲霉(Aspergillus)属、毛霉(Mucor)属、青霉(Penicillium)属、毛癣菌(Trichophyton)属、孢子丝菌(Sporothrix)属、瓶霉(Phialophora)属等)、放线菌类(放线菌(Actinomyces)属、诺卡氏菌(Nocardia)属等)、蘑菇类(例如，香菇、裂褶菌、云芝等)等的细胞壁等获得的天然多糖，具体而言，例如为凝胶多糖、茯苓多糖、核盘菌多糖、香菇多糖、裂裥多糖、云芝多糖等，或者藻类(例如，褐藻、眼虫藻、硅藻等)的贮藏性多糖，具体而言，例如为昆布多糖、副淀粉等。
2.本发明的G因子α亚基
本发明的G因子α亚基为含有与序列号2或序列号4表示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的蛋白质。
本发明的G因子α亚基具有与BG结合的性质。
作为本发明的G因子α亚基的来源，优选源自美洲鲎(Limulus polyphem us)。
作为与序列号2或序列号4表示的氨基酸序列实质上相同的氨基酸序列，可以举出与序列号2或序列号4表示的氨基酸序列具有约80％以上、优选约90％以上、更优选约95％以上、进一步优选约97％以上的同源性且具有与BG结合的性质的蛋白质的氨基酸序列。
并且，作为与序列号2或序列号4表示的氨基酸序列实质上相同的氨基酸序列，可以举出在序列号2或序列号4表示的氨基酸序列中1～5个、优选1～3个、更优选1～2个、进一步优选1个氨基酸被取代、缺失、插入或附加的氨基酸序列。取代、缺失、插入或附加可以在一个氨基酸序列的一个部位或多个部位同时发生。只要具有该氨基酸序列的蛋白质具有上述G因子α亚基的性质，则对序列号2或序列号4表示的氨基酸序列进行取代、缺失、插入、附加等的位置及数量是任意的。
作为本发明的G因子α亚基的优选具体例，可以举出含有序列号2或序列号4表示的氨基酸序列的G因子α亚基蛋白质。
更优选含有序列号2表示的氨基酸序列的G因子α亚基蛋白质。
本发明的G因子α亚基可以在其N末端或C末端连结有His标签、FLAG标签、Hat标签、SUMO标签等公知的标签肽或所谓的间隔物(spacer)。并且，可以在其N末端具有氨基酸1～几个，例如1～3个左右的信号肽的片段。
以下，有时将含有与序列号2表示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的蛋白质缩写为“G因子α亚基A”或仅缩写为“α亚基A”。
以下，有时将含有与序列号4表示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的蛋白质缩写为“G因子α亚基B”或仅缩写为“α亚基B”。
当仅记载为“G因子α亚基”时，是指包括“G因子α亚基A”和“G因子α亚基B”这两者的本发明的G因子α亚基的总称。
并且，当仅记载为“G因子α亚基的氨基酸序列”时，是指上述“与序列号2或序列号4表示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列”的总称。
3.本发明的G因子β亚基
本发明的G因子β亚基为含有与序列号6、8、10、12、14及16中的任一个表示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的蛋白质。
本发明的G因子β亚基具有丝氨酸蛋白酶的结构域，但不具有酶活性，当与前述本发明的G因子α亚基形成了异源二聚体时发挥蛋白酶活性。
作为本发明的G因子β亚基的来源，优选源自美洲鲎。
作为与序列号6、8、10、12、14及16中的任一个表示的氨基酸序列实质上相同的氨基酸序列，可以举出与序列号6、8、10、12、14或16中的任一个表示的氨基酸序列具有约80％以上、优选约90％以上、更优选约95％以上、进一步优选约97％以上的同源性且具有上述G因子β亚基的性质的蛋白质的氨基酸序列。
并且，作为与序列号6、8、10、12、14及16中的任一个表示的氨基酸序列实质上相同的氨基酸序列，可以举出在序列号6、8、10、12、14或16中的任一个表示的氨基酸序列中1～5个、优选1～3个、更优选1～2个、进一步优选1个氨基酸被取代、缺失、插入或附加的氨基酸序列。取代、缺失、插入或附加可以在一个氨基酸序列的一个部位或多个部位同时发生。只要具有该氨基酸序列的蛋白质具有上述G因子β亚基的性质，则在序列号6、8、10、12、14及16中的任一个表示的氨基酸序列中进行取代、缺失、插入、附加等的位置及数量是任意的。
作为本发明的G因子β亚基的优选具体例，可以举出含有序列号6、8、10、12、14及16中的任一个表示的氨基酸序列的G因子β亚基蛋白质。
更优选含有序列号6、8或10中的任一个表示的氨基酸序列的G因子β亚基蛋白质。
进一步优选含有序列号6或8表示的氨基酸序列的G因子β亚基蛋白质。
本发明的G因子β亚基可以在其N末端或C末端连结有His标签、FLAG标签、Hat标签、SUMO标签等公知的标签肽或所谓的间隔物。并且，可以在其N末端具有氨基酸1～几个，例如1～3个左右的信号肽的片段。
关于含有与本发明的序列号6、8、10、12、14及16中的任一个表示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的蛋白质，分别如下述那样命名。
·含有与序列号6表示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的本发明的G因子β亚基：G因子β亚基βi2、
·含有与序列号8表示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的本发明的G因子β亚基：G因子β亚基βi3、
·含有与序列号10表示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的本发明的G因子β亚基：G因子β亚基β2、
·含有与序列号12表示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的本发明的G因子β亚基：G因子β亚基β5、
·含有与序列号14表示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的本发明的G因子β亚基：G因子β亚基βC1、
·含有与序列号16表示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的本发明的G因子β亚基：G因子β亚基βC2。
有时分别将“G因子β亚基βi2”缩写为“β亚基βi2”，将“G因子β亚基βi3”缩写为“β亚基βi3”，将“G因子β亚基β2”缩写为“β亚基β2”，将“G因子β亚基β5”缩写为“β亚基β5”，将“G因子β亚基βC1”缩写为“β亚基βC1”，将“G因子β亚基βC2”缩写为“β亚基βC2”。
并且，当仅记载为“G因子β亚基的氨基酸序列”时，是指上述“与序列号6、8、10、12、14及16中的任一个表示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列”的总称。
4.本发明的异源二聚体
本发明的异源二聚体为“含有与序列号2或序列号4表示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的G因子α亚基和含有与序列号6、8、10、12、14或16中的任一个表示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的G因子β亚基的组合的异源二聚体”。
换言之，本发明的异源二聚体为“由含有与序列号2或序列号4表示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的G因子α亚基和含有与序列号6、8、10、12、14或16中的任一个表示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的G因子β亚基组成的异源二聚体”。
“含有与序列号2或序列号4表示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的G因子α亚基”及“含有与序列号6、8、10、12、14或16中的任一个表示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的G因子β亚基”的具体例如上述“2.本发明的G因子α亚基”项及“3.本发明的G因子β亚基”项中所说明。
本发明的异源二聚体在BG的存在下具有蛋白酶活性。
将构成本发明的异源二聚体的G因子α亚基和G因子β亚基的组合的具体例示于下述表1。
[表1]
Figure BDA0003687919030000101
作为本发明的异源二聚体的优选的G因子α亚基和G因子β亚基的组合，可以举出上述表1的组合编号1、2、3、4、5、6、8、9或12的组合。
更优选上述表1的组合编号1、2、4、5、9或12的组合。
进一步优选上述表1的组合编号1、2或9的组合。
尤其优选上述表1的组合编号1或2的组合。
构成本发明的异源二聚体的G因子α亚基及G因子β亚基可以在其N末端或C末端结合有His标签、FLAG标签、Hat标签、SUMO标签等公知的标签肽或所谓的间隔物。并且，构成异源二聚体的G因子α亚基及G因子β亚基可以在其N末端具有氨基酸1～几个，例如1～3个左右的信号肽的片段。
5.本发明所涉及的核酸分子
(1)编码本发明的G因子α亚基的核酸分子
作为编码本发明的G因子α亚基的核酸分子，可以举出含有编码与序列号2或序列号4表示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的碱基序列的核酸分子。“与序列号2或序列号4表示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列”的具体例如上述“2.本发明的G因子α亚基”项中所说明。
作为编码本发明的G因子α亚基的核酸分子的具体例，例如可以举出下述(i)及(ii)。
(i)含有与序列号1或序列号3表示的碱基序列相同或实质上相同的碱基序列的核酸分子
含有与序列号1表示的碱基序列相同或实质上相同的碱基序列的核酸分子编码与序列号2表示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列。
含有与序列号3表示的碱基序列相同或实质上相同的碱基序列的核酸分子编码与序列号4表示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列。
作为“含有与序列号1或序列号3表示的碱基序列实质上相同的碱基序列的核酸分子”的碱基序列，可以举出与序列号1或序列号3表示的碱基序列具有约80％以上、优选约90％以上、更优选约95％以上、进一步优选约97％以上的同源性的碱基序列。
并且，作为“含有与序列号1或序列号3表示的碱基序列实质上相同的碱基序列的核酸分子”的碱基序列，可以举出在序列号1或序列号3表示的碱基序列中1～5个、优选1～3个、更优选1～2个、进一步优选1个碱基被取代、缺失、插入或附加的碱基序列。取代、缺失、插入或附加可以在一个碱基序列的一个部位或多个部位同时发生。
在上述核酸分子之中，优选含有序列号1或序列号3表示的碱基序列的核酸分子，更优选含有序列号1表示的碱基序列的核酸分子。
含有与序列号1或序列号3表示的碱基序列相同或实质上相同的碱基序列的核酸分子可以附加有编码所谓的信号肽的碱基序列。以下本说明书中所记载的信号肽及编码该信号肽的碱基序列并不受特别限定。
作为编码“附加有编码信号肽的碱基序列的本发明的G因子α亚基”的核酸分子的具体例，例如可以举出含有与序列号17或序列号19表示的碱基序列相同或实质上相同的碱基序列的核酸分子。
作为“含有与序列号17或序列号19表示的碱基序列实质上相同的碱基序列的核酸分子”的碱基序列，可以举出与序列号17或序列号19表示的碱基序列具有约80％以上、优选约90％以上、更优选约95％以上、进一步优选约97％以上的同源性的碱基序列。
并且，作为“含有与序列号17或序列号19表示的碱基序列实质上相同的碱基序列的核酸分子”的碱基序列，可以举出在序列号17或序列号19表示的碱基序列中1～5个、优选1～3个、更优选1～2个、进一步优选1个碱基被取代、缺失、插入或附加的碱基序列。取代、缺失、插入或附加可以在一个碱基序列的一个部位或多个部位同时发生。
在上述核酸分子之中，优选含有序列号17或序列号19表示的碱基序列的核酸分子，更优选含有序列号17表示的碱基序列的核酸分子。
(ii)含有编码与序列号2或序列号4表示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的碱基序列的核酸分子，该核酸分子在使含有与序列号2或序列号4表示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的蛋白质通过基因工程学方法表达时，含有根据表达该核酸分子的宿主细胞的种类而最优化的碱基序列。
在上述核酸分子之中，更优选含有编码序列号2或序列号4表示的氨基酸序列的碱基序列的核酸分子，该核酸分子在使含有序列号2或序列号4表示的氨基酸序列的蛋白质通过基因工程学方法表达时，含有根据表达该核酸分子的宿主细胞的种类而最优化的碱基序列。
进一步优选含有编码序列号2表示的氨基酸序列的碱基序列的核酸分子，该核酸分子在使含有序列号2表示的氨基酸序列的蛋白质通过基因工程学方法表达时，含有根据表达该核酸分子的宿主细胞的种类而最优化的碱基序列。
例如，作为为了将昆虫细胞用作宿主并表达含有编码与该序列号2或序列号4表示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的碱基序列的核酸分子而最优化的碱基序列，例如可以举出含有与序列号33或序列号34表示的碱基序列相同或实质上相同的碱基序列的核酸分子。
作为“含有与序列号33或序列号34表示的碱基序列实质上相同的碱基序列的核酸分子”的碱基序列，可以举出与序列号33或序列号34表示的碱基序列具有约80％以上、优选约90％以上、更优选约95％以上、进一步优选约97％以上的同源性的碱基序列。
并且，作为“含有与序列号33或序列号34表示的碱基序列实质上相同的碱基序列的核酸分子”的碱基序列，可以举出在序列号33或序列号34表示的碱基序列中1～5个、优选1～3个、更优选1～2个、进一步优选1个碱基被取代、缺失、插入或附加的碱基序列。取代、缺失、插入或附加可以在一个碱基序列的一个部位或多个部位同时发生。
在上述核酸分子之中，优选含有序列号33或序列号34表示的碱基序列的核酸分子，尤其优选含有序列号33表示的碱基序列的核酸分子。
含有与序列号33或序列号34表示的碱基序列相同或实质上相同的碱基序列的核酸分子可以附加有编码所谓的信号肽的碱基序列。作为这种核酸分子的具体例，可以举出含有与序列号41或序列号42表示的碱基序列相同或实质上相同的碱基序列的核酸分子。
作为“含有与序列号41或序列号42表示的碱基序列实质上相同的碱基序列的核酸分子”的碱基序列，可以举出与序列号41或序列号42表示的碱基序列具有约80％以上、优选约90％以上、更优选约95％以上、进一步优选约97％以上的同源性的碱基序列。
并且，作为“含有与序列号41或序列号42表示的碱基序列实质上相同的碱基序列的核酸分子”的碱基序列，可以举出在序列号41或序列号42表示的碱基序列中1～5个、优选1～3个、更优选1～2个、进一步优选1个碱基被取代、缺失、插入或附加的碱基序列。取代、缺失、插入或附加可以在一个碱基序列的一个部位或多个部位同时发生。
在上述核酸分子之中，优选含有序列号41或序列号42表示的碱基序列的核酸分子。更优选含有序列号41表示的碱基序列的核酸分子。
编码本发明的G因子α亚基的核酸分子可以为cDNA等DNA或RNA。
并且，编码本发明的G因子α亚基的核酸分子可以为单链，也可以为双链。在双链的情况下，例如为由序列号1、3、17、18、33、34、41或42表示的碱基序列及其互补链组成的核酸分子等。
并且，编码本发明的G因子α亚基的核酸分子可以在其5'末端或3'末端连结有编码His标签、FLAG标签、Hat标签、SUMO标签等公知的标签肽或所谓的间隔物的碱基序列。并且，可以在该5’末端连结有编码信号肽的碱基序列。
作为本发明所涉及的“编码本发明的G因子α亚基的核酸分子”的优选具体例，可以举出含有序列号1、3、17、19、33、34、41或42中的任一个表示的碱基序列的核酸分子。
在上述核酸分子之中，优选含有序列号1、17、33或41中的任一个表示的碱基序列的核酸分子。
以下，有时将上述编码本发明的G因子α亚基的核酸分子总括缩写为“核酸分子α”。
(2)编码本发明的G因子β亚基的核酸分子
作为编码本发明的G因子β亚基的核酸分子，可以举出含有编码与序列号6、8、10、12、14或16中的任一个表示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的碱基序列的核酸分子。“与序列号6、8、10、12、14或16中的任一个表示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列”的具体例如上述“3.本发明的G因子β亚基”项中所说明。
作为编码本发明的G因子β亚基的核酸分子的具体例，例如可以举出下述(i)及(ii)。
(i)含有与序列号5、7、9、11、13或15中的任一个表示的碱基序列相同或实质上相同的碱基序列的核酸分子
含有与序列号5表示的碱基序列相同或实质上相同的碱基序列的核酸分子编码与序列号6表示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列。编码G因子β亚基βi2的氨基酸序列。
含有与序列号7表示的碱基序列相同或实质上相同的碱基序列的核酸分子编码与序列号8表示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列。编码G因子β亚基βi3的氨基酸序列。
含有与序列号9表示的碱基序列相同或实质上相同的碱基序列的核酸分子编码与序列号10表示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列。编码G因子β亚基β2的氨基酸序列。
含有与序列号11表示的碱基序列相同或实质上相同的碱基序列的核酸分子编码与序列号12表示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列。编码G因子β亚基β5的氨基酸序列。
含有与序列号13表示的碱基序列相同或实质上相同的碱基序列的核酸分子编码与序列号14表示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列。编码G因子β亚基βC1的氨基酸序列。
含有与序列号15表示的碱基序列相同或实质上相同的碱基序列的核酸分子编码与序列号16表示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列。编码G因子β亚基βC2的氨基酸序列。
作为“含有与序列号5、7、9、11、13或15中的任一个表示的碱基序列实质上相同的碱基序列的核酸分子”的碱基序列，可以举出与序列号5、7、9、11、13或15中的任一个表示的碱基序列具有约80％以上、优选约90％以上、更优选约95％以上、进一步优选约97％以上的同源性的碱基序列。
并且，作为“含有与序列号5、7、9、11、13或15中的任一个表示的碱基序列实质上相同的碱基序列的核酸分子”的碱基序列，可以举出在序列号5、7、9、11、13或15中的任一个表示的碱基序列中1～5个、优选1～3个、更优选1～2个、进一步优选1个碱基被取代、缺失、插入或附加的碱基序列。取代、缺失、插入或附加可以在一个碱基序列的一个部位或多个部位同时发生。
在上述核酸分子之中，优选含有序列号5、7、9、11、13或15中的任一个表示的碱基序列的核酸分子，更优选含有序列号5、7或9中的任一个表示的碱基序列的核酸分子，进一步优选含有序列号5或7表示的碱基序列的核酸分子。
含有与序列号5、7、9、11、13或15中的任一个表示的碱基序列相同或实质上相同的碱基序列的核酸分子可以附加有编码所谓的信号肽的碱基序列。作为编码“附加有编码信号肽的碱基序列的本发明的G因子β亚基”的核酸分子的具体例，可以举出含有与序列号21、23、25、27、29或31中的任一个表示的碱基序列相同或实质上相同的碱基序列的核酸分子。
作为“含有与序列号21、23、25、27、29或31中的任一个表示的碱基序列实质上相同的碱基序列的核酸分子”的碱基序列，可以举出与序列号21、23、25、27、29或31中的任一个表示的碱基序列具有约80％以上、优选约90％以上、更优选约95％以上、进一步优选约97％以上的同源性的碱基序列。
并且，作为“含有与序列号21、23、25、27、29或31中的任一个表示的碱基序列实质上相同的碱基序列的核酸分子”的碱基序列，可以举出在序列号21、23、25、27、29或31中的任一个表示的碱基序列中1～5个、优选1～3个、更优选1～2个、进一步优选1个碱基被取代、缺失、插入或附加的碱基序列。取代、缺失、插入或附加可以在一个碱基序列的一个部位或多个部位同时发生。
在上述核酸分子之中，优选含有序列号21、23、25、27、29或31中的任一个表示的碱基序列的核酸分子，更优选含有序列号21、23或25中的任一个表示的碱基序列的核酸分子，进一步优选含有序列号21或23表示的碱基序列的核酸分子。
(ii)含有编码与序列号6、8、10、12、14或16中的任一个表示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的碱基序列的核酸分子，该核酸分子在使含有与序列号6、8、10、12、14或16中的任一个表示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的蛋白质通过基因工程学方法表达时，具有根据表达该核酸分子的细胞的种类而最优化的碱基序列
在上述核酸分子之中，优选含有编码序列号6、8、10、12、14或16中的任一个表示的氨基酸序列的碱基序列的核酸分子，该核酸分子在使含有序列号6、8、10、12、14或16中的任一个表示的氨基酸序列的蛋白质通过基因工程学方法表达时，具有根据表达该核酸分子的细胞的种类而最优化的碱基序列。
更优选含有编码序列号6、8或10中的任一个表示的氨基酸序列的碱基序列的核酸分子，该核酸分子在使含有序列号6、8或10中的任一个表示的氨基酸序列的蛋白质通过基因工程学方法表达时，具有根据表达该核酸分子的细胞的种类而最优化的碱基序列。
进一步优选含有编码序列号6或8表示的氨基酸序列的碱基序列的核酸分子，该核酸分子在使含有序列号6或8表示的氨基酸序列的蛋白质通过基因工程学方法表达时，具有根据表达该核酸分子的细胞的种类而最优化的碱基序列。
例如，作为为了将昆虫细胞用作宿主并表达含有编码与该6、8、10、12、14或16中的任一个表示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的碱基序列的核酸分子而最优化的碱基序列，可以举出含有与序列号35～40或69中的任一个表示的碱基序列相同或实质上相同的碱基序列的核酸分子。
作为“含有与序列号35～40或69中的任一个表示的碱基序列实质上相同的碱基序列的核酸分子”的碱基序列，可以举出与序列号35～40或69中的任一个表示的碱基序列具有约80％以上、优选约90％以上、更优选约95％以上、进一步优选约97％以上的同源性的碱基序列。
并且，作为“含有与序列号35～40或69中的任一个表示的碱基序列实质上相同的碱基序列的核酸分子”的碱基序列，可以举出在序列号35～40或69中的任一个表示的碱基序列中1～5个、优选1～3个、更优选1～2个、进一步优选1个碱基被取代、缺失、插入或附加的碱基序列。取代、缺失、插入或附加可以在一个碱基序列的一个部位或多个部位同时发生。
在上述核酸分子之中，优选含有序列号35～40或69中的任一个表示的碱基序列的核酸分子，更优选含有序列号35、36、37或69中的任一个表示的碱基序列的核酸分子，进一步优选含有序列号35、36或69中的任一个表示的碱基序列的核酸分子。
含有与序列号35～40中的任一个表示的碱基序列相同或实质上相同的碱基序列的核酸分子可以附加有编码所谓的信号肽的碱基序列。作为这种核酸分子的例子，可以举出含有与序列号43～48中的任一个表示的碱基序列实质上相同的碱基序列的核酸分子。并且，可以举出含有与后述的具有信号肽和标签序列的序列号68表示的碱基序列实质上相同的碱基序列的核酸分子。
作为“含有与序列号43～48或68中的任一个表示的碱基序列实质上相同的碱基序列的核酸分子”的碱基序列，可以举出与序列号43～48或68中的任一个表示的碱基序列具有约80％以上、优选约90％以上、更优选约95％以上、进一步优选约97％以上的同源性的碱基序列。
并且，作为“含有与序列号43～48或68中的任一个表示的碱基序列实质上相同的碱基序列的核酸分子”的碱基序列，可以举出在序列号43～48或68中的任一个表示的碱基序列中1～5个、优选1～3个、更优选1～2个、进一步优选1个碱基被取代、缺失、插入或附加的碱基序列。取代、缺失、插入或附加可以在一个碱基序列的一个部位或多个部位同时发生。
在上述核酸分子之中，优选含有序列号43～48或68中的任一个表示的碱基序列的核酸分子，更优选含有序列号43、44、45或68中的任一个表示的碱基序列的核酸分子，进一步优选含有序列号43或44表示的碱基序列的核酸分子。
编码本发明的G因子β亚基的核酸分子可以为cDNA等DNA或RNA。
并且，编码本发明的G因子β亚基的核酸分子可以为单链，也可以为双链。在双链的情况下，例如为由序列号5、7、9、11、13、15、21、23、25、27、29、31、35～40、43～48、68或69表示的碱基序列及其互补链组成的核酸分子等。
并且，编码本发明的G因子β亚基的核酸分子可以在其5'末端侧或3'末端连结有编码His标签、FLAG标签、Hat标签、SUMO标签等公知的标签肽或所谓的间隔物的碱基序列。并且，可以在该5’末端连结有编码信号肽的碱基序列。
作为本发明所涉及的“编码本发明的G因子β亚基的核酸分子”的优选具体例，可以举出含有序列号5、7、9、11、13、15、21、23、25、27、29、31、35～40、43～48、68或69中的任一个表示的碱基序列的核酸分子。
优选含有序列号5、7、9、21、23、25、35、36、37、43、44、45、68或69中的任一个表示的碱基序列的核酸分子。
更优选含有序列号5、7、21、23、35、36、43、44、68或69中的任一个表示的碱基序列的核酸分子。
以下，有时将上述编码本发明的G因子β亚基的核酸分子总括缩写为“核酸分子β”。
(3)本发明所涉及的核酸分子
此外，有时将上述“核酸分子α”及“核酸分子β”总括缩写为“本发明所涉及的核酸分子”。
并且，如上所述，本发明所涉及的核酸分子可以在其5'末端或3'末端连结有编码His标签、FLAG标签、Hat标签、SUMO标签等公知的标签肽或所谓的间隔物的碱基序列。
例如，可以举出将在序列号1、3、5、7、9、11、13、15、17，19、21、23、25、27、29、31中的任一个表示的碱基序列上连结有编码标签的碱基序列的碱基序列根据要表达的细胞的种类而最优化的核酸分子。
例如，可以举出设计从5′末端侧以信号序列、Hat标签、SUMO标签、G因子β亚基i2(氨基酸序列：序列号6)的顺序配置的氨基酸序列(序列号67)，编码该氨基酸序列，且具有以昆虫细胞用最优化的序列号68表示的碱基序列的核酸分子。在序列号68表示的碱基序列中，编码G因子β亚基i2的碱基序列为序列号69表示的碱基序列。
本发明所涉及的核酸分子可以为cDNA等DNA或RNA。
作为编码构成本发明的异源二聚体的本发明的G因子α亚基和G因子β亚基的组合的核酸分子α和核酸分子β的组合，例如可以举出下述表2中所记载的组合。
[表2]
Figure BDA0003687919030000201
作为优选的(核酸分子α-核酸分子β)的序列号的组合，可以举出上述表2的组合编号1、2、3、4、5、6、8、9、12、13、14、15、16、17、18、20、21、24、25、26、27、28、29、30、32、33、36、37、38、39、40、41、42、44、45、48或49的组合。
更优选上述表2的组合编号1、2、4、5、9、12、13、14、16、17、21、24、25、26、28、29、33、36、37、38、40、41、45、48或49的组合。
进一步优选上述表2的组合编号1、2、9、13、14、21、25、26、33、37、38、45或49的组合。
尤其优选上述表2的组合编号1、2、13、14、25、26、37、38或49的组合。
6.本发明的异源二聚体的获取方法
作为本发明的异源二聚体的获取方法，例如可以举出下述的三种方法。
(1)基于共表达的获取方法
(2)通过分别获取α亚基和β亚基之后使其结合而获取的方法
(3)基于化学合成的获取方法
其中，若考虑异源二聚体的产率等，则优选“(1)基于共表达的获取方法”。
(1)基于共表达的获取方法
本发明的异源二聚体能够利用使用如下的基因重组技术的周知的方法来获得：“将本发明所涉及的核酸分子(核酸分子α及核酸分子β)整合到适当的病毒或质粒等表达载体中，通过使用该重组表达载体的常规方法来转化(或转导)适当的宿主细胞。培养所获得的转化体(转导体)，使本发明的G因子α亚基和本发明的G因子β亚基共表达，使本发明的异源二聚体分泌到细胞外或细胞内。”
作为上述方法，可以举出利用使用一般的昆虫细胞、哺乳动物细胞、酵母菌等真核细胞的表达系统或使用大肠杆菌之类的原核生物的表达系统的方法。
以下，作为通过共表达获得本发明的异源二聚体的方法的一例，举例利用杆状病毒-昆虫细胞的表达系统的方法进行说明。
1)整合有本发明所涉及的核酸分子的本发明所涉及的重组体的制备
利用杆状病毒-昆虫细胞的表达系统的本发明所涉及的重组体的制备通常通过将本发明所涉及的核酸分子(核酸分子α或核酸分子β)暂时整合到转移载体(transfervector)之后，与杆状病毒基因组DNA一同共转染到成为宿主的昆虫细胞来进行。
用于本方法的核酸分子α及核酸分子β的具体例如上述“5.本发明所涉及的核酸分子”项中所记载。
作为用于本方法的核酸分子α的优选例，可以举出含有序列号1、3、17、19、33、34、41或42中的任一个表示的碱基序列的核酸分子。更优选含有序列号33、34、41或42中的任一个表示的碱基序列的核酸分子。尤其优选含有序列号41或42表示的碱基序列的核酸分子。作为核酸分子的种类，更优选cD NA。
作为用于本方法的核酸分子β的优选例，可以举出含有序列号5、7、9、11、13、15、21、23、25、27、29、31、35～40、43～48、68或69中的任一个表示的碱基序列的核酸分子。更优选含有序列号35～40、43～48、68或69中的任一个表示的碱基序列的核酸分子。尤其优选含有序列号43～48或68中的任一个表示的碱基序列的核酸分子。作为核酸分子的种类，更优选cDNA。
作为获得本发明所涉及的核酸分子(核酸分子α及核酸分子β)的方法，并不受特别限定，能够利用如下方法获得作为目标的本发明所涉及的核酸分子：通过本身公知的化学合成法进行制备的方法；或使用在DNA的合成中通常使用的DNA合成器，通过通常的亚磷酰胺法合成寡核苷酸，并通过使用阴离子交换柱色谱的常规方法来纯化的方法。
作为用于使用杆状病毒-昆虫细胞的表达系统的杆状病毒，优选核型多角体病毒(Nuclear Polyhedrosis Virus、NPV)。例如，可以举出作为感染甘蓝夜蛾科昆虫的病毒的苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus、AcNPV)等。
作为成为宿主的昆虫细胞，可以举出源自草地贪夜蛾(S.frugiperda)的expresSF+TM(Protein Science公司制造)、源自草地贪夜蛾(Spodoptera Frugiperda)的Sf9、Sf21等、源自粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)的High 5、BTI-TN-5B1-4(Invitrogen公司制造)等。
作为转移载体，可以举出pIEx/Bac-1、pIEx/Bac-3(Novagen公司制)、pVL1392、pVL1393、pBlueBacIII(以上为Invitrogen公司制造)、pBacPAK9等昆虫细胞用载体。
整合有本发明所涉及的核酸分子的转移载体例如能够通过使用cDNA作为本发明所涉及的核酸分子(核酸分子α或/和核酸分子β)，将该cDNA整合到如上所述的转移载体中而获得。该转移载体的获取只要通过常规方法进行即可。
另外，作为整合到转移载体中的核酸分子α或核酸分子β的cDNA可以根据目的在直接被限制性内切酶消化之后或附加用于将cDNA整合到转移载体中的连接体(linker)之后使用。
并且，为了容易检测或纯化本发明的异源二聚体，可以使作为目标的本发明的异源二聚体表达为与其他标签肽或蛋白质等公知的标志物的融合蛋白。作为要融合的标签肽，可以举出FLAG标签、3XFLAG标签、His标签(His tag，例如6×His标签)、Hat标签、SUMO标签等，作为蛋白质，可以举出β-半乳糖苷酶(β-Gal)、绿色荧光蛋白(GFP)、麦芽糖结合蛋白(MBP)等。
在该情况下，例如可以使用具有在核酸分子α或/和核酸分子β的碱基序列的5’末端侧或3'末端侧连结有His标签基因的碱基序列的序列的cDNA来表达本发明的异源二聚体。具体而言，例如在转移载体中预先整合具有这种序列的cDNA即可。如此一来，本发明的异源二聚体表达为与His标签蛋白质的融合蛋白。因此，通过确认该His标签的表达，能够容易确认本发明的异源二聚体的表达。
在本发明所涉及的重组体的制备中，当将整合有核酸分子的转移载体与杆状病毒基因组DNA一同共转染到作为宿主的昆虫细胞时，通常使用ScreenFect TMA plus(FUJIFILMWako Pure Chemical Corporation制造)等转染试剂进行共转染即可。例如，可以通过热休克法、磷酸钙法(日本特开平2-227075号公报)、脂质体转染法(Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,84,7413,1987)等常规方法进行共转染。
共转染后3～10天之后回收培养上清液，通过有限稀释法、空斑法(plaqu emethod)等常规方法选择并纯化重组杆状病毒。
利用以上方法，可获得作为目标的整合有核酸分子α的碱基序列的重组杆状病毒或整合有核酸分子β的碱基序列的重组杆状病毒(本发明所涉及的重组体)。
2)基于宿主细胞的转染的本发明所涉及的转化体的制备
使上述中所获得的重组杆状病毒(本发明所涉及的重组体)利用以下方法转染到成为宿主的昆虫细胞中。
即，将整合有核酸分子α的重组杆状病毒和整合有核酸分子β的重组杆状病毒加入到宿主细胞的培养基中。优选以转染量(volume of infection，以下缩写为VOI。)＝1/400～1/200的比例加入整合有核酸分子α的重组杆状病毒且以VOI＝1/200～1/100的比例加入整合有核酸分子β的重组杆状病毒，并且相对于G因子β亚基的表达量，抑制G因子α亚基的表达量。在该情况下，若以感染复数(Multiplicity of Infection，以下缩写为MOI)换算，则大致成为G因子α亚基:G因子β亚基＝0.4～0.8:0.9～1.8的比率。
利用以上方法，能够获得用作为本发明所涉及的重组体的重组杆状病毒转染的、作为本发明所涉及的转化体的宿主细胞。
并且，利用未使用杆状病毒的下述方法，也能够获得本发明所涉及的转化体。
首先，将本发明所涉及的核酸分子α或核酸分子β例如按照常规方法整合到载体DNA中。所谓的表达载体是有用的。
作为表达载体，只要能够在原核细胞和/或真核细胞的各种宿主细胞中保持复制或自我增殖且具有表达并产生本发明的多核苷酸的功能，则不受特别限制。包含质粒载体、噬菌体载体等。
作为这种载体，具体而言，作为在昆虫细胞表达系统中使用的质粒，例如可以举出pIZT/V5-His、pIB/V5-His(Termo Fisher Scientific公司)、pIEx及pIEx Bac系列(例如，pIEx-Bac-1，Merck Millipore公司)，作为源自大肠杆菌(Escherichia coli.)的质粒，例如可以举出pUC119(TAKARA SHUZO CO.,LTD.制造)、pQE-TRI质粒(Qiagen公司制造)、pBluescript II KS+(Stra tagene公司制造)、pBR322(TAKARA SHUZO CO.,LTD.制造)、pGEM、pGEX、pUC、pBS、pET、pGEM-3ZpMAL等，作为源自酵母的质粒，例如可以举出pB42AD、pESP、pESC等，作为源自枯草菌的质粒，例如可以举出pH T926、pTB51、pHY481等。作为源自乳动物细胞的质粒，可以举出pCAT3、pcDNA3.1、pCMV、pCAG等。
并且，作为噬菌体，可以举出λENBL3(Stratagene公司制造)，λDASHII(FunakoshiCo.,Ltd.制造)、λgt10、λgt11(均为TOYOBOSEKI CO.,LTD.制造)等λ噬菌体等细菌噬菌体、Charomid DNA(Wako Pure Chemical Industri es,Ltd.制造)、Lorist6(Wako PureChemical Industries,Ltd.制造)等粘粒载体等。
整合有本发明所涉及的核酸分子的重组表达载体能够通过利用常规方法将本发明所涉及的核酸分子整合到上述载体等中来制备。作为这种载体，可以举出整合有核酸分子α的载体、整合有核酸分子β的载体或整合有核酸分子α和核酸分子β的载体。
本发明所涉及的转化体能够通过将上述重组表达载体等导入到宿主细胞中来制备。作为这种转化体，可以举出整合有核酸分子α的转化体、整合有核酸分子β的转化体或整合有核酸分子α和核酸分子β的转化体。
3)宿主细胞的培养
本发明的异源二聚体能够通过如下来制造：将利用上述方法获得的转染的宿主细胞(本发明所涉及的转化体)在与该宿主细胞相对应的适当的培养基中进行培养，使本发明的G因子α亚基和本发明的G因子β亚基在培养物中共表达，并将所获得的本发明的异源二聚体从该培养物中分离并进行纯化。
转染的宿主细胞的培养只要通过在该领域中已知的方法进行即可。培养条件，例如温度、培养基的pH及发酵时间只要适当设定为可获得本发明的异源二聚体的最高滴度即可。
当宿主为昆虫细胞时，作为培养基，例如可以举出PSFM-J1培养基(FUJI FILMWako Pure Chemical Corporation制造)、TNM-FH培养基、Grace′s Ins ectMedium培养基〔Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,(1985)82,8404〕、Sf-100 II SFM培养基(LifeTechnologies公司制造)、ExCell400、ExCell405(均为JR H Biosciences公司制造)等。其pH优选为5～8。
另外，为了防止血清中所包含的BG的混入，培养基优选使用未添加胎牛血清(FCS)等的无血清培养基。
并且，也可以使用利用后述的使用本发明的G因子α亚基的BG的去除方法去除了混在的BG的培养基。
转染的宿主细胞的培养通常在20～40℃下、优选在25～30℃下进行约12小时～10天。根据需要，可以进行通气、搅拌、旋转培养。
在此，例如，当连结有His标签序列作为标志物时，能够通过使用抗His抗体的ELISA等来确认获得了目标的整合有核酸分子α及核酸分子β的转化体。
4)本发明的异源二聚体的制备
本发明的异源二聚体能够由通过上述培养而获得的培养物以如下方式获取。
即，当本发明的异源二聚体分泌到转化体的细胞质外时，对上述“3)宿主细胞的培养”中所获得的本发明所涉及的转化体的培养物通过过滤或离心分离等常规方法去除细胞，获得培养滤液或培养上清液。接着，按照为了分离及纯化天然或合成蛋白质而一般使用的常规方法，从该培养滤液或培养上清液分离本发明的异源二聚体并进行纯化。
并且，当本发明的异源二聚体存在于转化体的周质空间或细胞质内时，对上述3)中所获得的本发明所涉及的转化体的培养物实施过滤或离心分离等常规方法而收集菌体或细胞，将其悬浮于适当的缓冲液中，例如利用表面活性剂处理、超声波处理、溶菌酶处理、冻融等方法破坏细胞等的细胞壁和/或细胞膜之后，利用离心分离或过滤等方法获取含有本发明的异源二聚体的粗提取液。然后，按照为了分离及纯化天然或合成蛋白质而一般使用的常规方法，从该粗提取液分离本发明的异源二聚体并进行纯化。
并且，当使用编码如上所述的His tag基因标签肽等标志物的序列与本发明的核酸分子连结的cDNA时，能够利用与该标志物相对应的公知的方法分离表达的蛋白质并利用上述方法进行纯化。
作为本发明的异源二聚体的分离/纯化方法，可以举出公知的盐析、溶剂沉淀法等利用溶解度的方法、透析、超滤、凝胶过滤色谱、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳等利用分子量差的方法、离子交换色谱等利用电荷的方法、亲和色谱等利用特异亲和性的方法、反相高效液相色谱等利用疏水性差的方法、等电聚焦电泳等利用等电点差的方法等。
(2)通过分别获取α亚基和β亚基之后使其结合而获取的方法
作为本发明的异源二聚体的另一种获取方法，可以举出“分别获得本发明的G因子α亚基及本发明的G因子β亚基。接着，使所获得的本发明的G因子α亚基与本发明的G因子β亚基结合。”的方法。
1)本发明的G因子α亚基(本发明的G因子α亚基A、本发明的G因子α亚基B)的获取
本发明的G因子α亚基例如能够利用如下方法来获取。
使用本发明所涉及的核酸分子α，利用上述“6.(1)基于共表达的获取方法”的“1)整合有本发明所涉及的核酸分子的本发明所涉及的重组体的制备”中所记载的方法获得整合有核酸分子α(可以包含编码信号肽或His标签序列等标志物的碱基序列)的重组杆状病毒。
接着，使该重组杆状病毒转染到成为宿主的昆虫细胞中。培养转染的宿主细胞，对培养液进行离心等处理并回收上清液。昆虫细胞的转染及培养方法的详细内容如上述“6.2)～3)”中所记载。
通过常规方法从回收的上清液分离及纯化蛋白质，获得本发明的G因子α亚基。例如，当本发明所涉及的核酸分子α的碱基序列上连结有编码His标签序列等标志物的碱基序列时，表达的蛋白质与His标签序列连结。因此，利用使用抗His-Tag抗体的常规方法进行亲和纯化，能够从培养上清液纯化蛋白质(G因子α亚基)。
作为用于本方法的核酸分子α的优选例，可以举出含有序列号1、3、17、19、33、34、41或42中的任一个表示的碱基序列的核酸分子。更优选含有序列号33、34、41或42中的任一个表示的碱基序列的核酸分子。尤其优选含有序列号41或42表示的碱基序列的核酸分子。作为核酸分子的种类，更优选cDNA。
2)本发明的G因子β亚基(βi2、βi3、β2、β5、βC1或βC2)的获取本发明的G因子β亚基例如能够利用如下方法来获取。
使用本发明所涉及的核酸分子β，利用上述“6.(1)基于共表达的获取方法”的“1)整合有本发明所涉及的核酸分子的本发明所涉及的重组体的制备”中所记载的方法获得整合有核酸分子β(可以包含编码信号肽或His标签序列等标志物的碱基序列)的重组杆状病毒。
接着，使该重组杆状病毒转染到成为宿主的昆虫细胞中。培养转染的宿主细胞，对培养液进行离心等处理并回收上清液。昆虫细胞的转染及培养方法的详细内容如上述“6.2)～3)”中所记载。
通过常规方法从回收的上清液分离及纯化蛋白质，获得本发明的G因子β亚基。例如，当本发明所涉及的核酸分子β的碱基序列上连结有编码His标签序列等标志物的碱基序列时，表达的蛋白质与His标签序列连结。因此，利用使用抗His-Tag抗体的常规方法获取并进行亲和纯化，能够从培养上清液纯化蛋白质(G因子β亚基)。
作为用于本方法的核酸分子β的优选例，可以举出含有序列号5、7、9、11、13、15、21、23、25、27、29、31、35～40、43～48、68或69中的任一个表示的碱基序列的核酸分子。更优选含有序列号35～40、43～48、68或69中的任一个表示的碱基序列的核酸分子。尤其优选含有序列号43～48或68中的任一个表示的碱基序列的核酸分子。作为核酸分子的种类，更优选cDNA。
3)异源二聚体的获取
接着，将纯化的G因子α亚基A和G因子βi2亚基分别溶解于不含BG的10mM MOPS缓冲液之后，分别混合成等摩尔，在搅拌下使其反应几小时～一昼夜，由此能够获得本发明的异源二聚体。
作为用于上述方法的溶解G因子α亚基及G因子β亚基的溶剂，可以举出注射用蒸馏水等水，例如在pH5.0～10.0、优选pH6.0～8.5的中性附近具有缓冲作用的例如磷酸缓冲液、Tris缓冲液、Good's缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸缓冲液、MOPS缓冲液等。并且，作为这些缓冲液中的缓冲剂浓度，通常从10～500mM、优选从10～300mM的范围适当选择。
(3)基于化学合成的获取方法
并且，本发明的异源二聚体能够按照其氨基酸序列，通过一般的化学合成法来制造。例如，通过芴基甲氧基羰基法(Fmoc法)、叔丁氧基羰基法(tBoc法)等通常的化学合成法，能够获得本发明的异源二聚体。并且，也能够使用市售的肽合成仪进行化学合成。
7.BG的测定方法
作为使用本发明的异源二聚体测定BG的方法，可以举出所谓的合成底物法。
在合成底物法中，首先，使含有BG的试样、本发明的异源二聚体及合成肽底物进行反应。BG活化本发明的异源二聚体，活化的异源二聚体通过其蛋白酶活性将凝固酶原(Proclotting enzyme)活化为凝固酶(Clotting enzyme)。凝固酶通过其酶活性水解合成肽底物，显色基团从合成肽底物游离而产生显色。通过将所产生的显色进行比色定量来计算出试样中的BG量。
用于本发明所涉及的BG的测定方法的本发明的异源二聚体的具体例、获取方法及其优选例如上述“1.”～“6.”中所记载。
作为用于本发明所涉及的BG的测定方法的合成肽底物，例如可以举出在C末端结合有对硝基苯胺(pNA)之类的显色基团且通过凝固酶的酶作用断裂而产生显色的合成肽底物。合成肽底物也可以化学合成，但已市售有各种产品，因此使用该市售品即可。
具体而言，例如可以举出Boc-Leu-Gly-Arg-pNA、Boc-Glu-Gly-Arg-pNA、Ac-Ile-Glu-Gly-Arg-pNA、Boc-Thr-Gly-Arg-pNA等。
作为合成底物法的测定装置，例如使用酶标仪(Microplate Reader)或分光光度计。
本发明所涉及的BG的测定方法的具体例如下。
即，使含有BG的试样10～50μL(含有0.1pg～1μg的BG)与含有本发明的异源二聚体的溶液20～100μL(含有0.1ng～0.1mg的本发明的异源二聚体)、凝固酶原及Boc-Thr-Gly-Arg-pNA等合成肽底物1μM～10mM在4～40℃下反应3分钟～300分钟。然后，测定反应液在例如405nm(测定波长)和492nm(次波长)下的吸光度。通过将所获得的测定值适用于对浓度预先已知的BG溶液使用与上述相同的试剂进行相同的操作而获得的表示测定值与BG量的关系的校准曲线，能够求出试样中的BG量。
作为用于本发明所涉及的BG的测定方法的试样，例如可以举出血液，血清，血浆，尿，淋巴液，脑脊液，胸水，腹水等临床标本、医药品、医疗器械、食品等，但并不限定于这些。
另外，本发明所涉及的BG的测定能够利用使用手动操作法或自动分析装置的测定系统来实施。关于使用手动操作法或自动分析装置进行测定时的试剂类等的组合等，并没有特别制约，根据要适用的自动分析装置的环境、机种或考虑其他因素适当选择使用认为最良好的试剂类等的组合即可。
8.本发明的β-葡聚糖测定用试剂盒
作为本发明的β-葡聚糖测定用试剂盒，可以举出包含含有与序列号2或序列号4表示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的G因子α亚基和含有与序列号6、8、10、12、14或16中的任一个表示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的G因子β亚基的组合的异源二聚体的试剂盒。
该试剂盒中的本发明的异源二聚体可以为溶解于水或缓冲液中的溶液，也可以为冷冻干燥品。作为溶解本发明的异源二聚体的溶剂，优选注射用蒸馏水、例如在pH5.0～10.0、优选在pH6.5～8.5的中性附近具有缓冲作用的例如磷酸缓冲液、Tris缓冲液、Good′s缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸缓冲液、MOPS缓冲液等。并且，作为这些缓冲液中的缓冲剂浓度，通常从10～500mM、优选从10～300mM的范围适当选择。
并且，本发明的β-葡聚糖测定用试剂盒中可以包含凝固酶原和/或上述合成肽底物作为构成试剂。其具体例如上所述。
并且，本发明的β-葡聚糖测定用试剂盒的构成试剂中还可以包含缓冲剂或碱土金属盐等在该领域中通常使用的其他适当的试剂类，这些试剂类只要从所谓的生化反应等中使用的试剂中适当选择使用即可。
并且，本发明的β-葡聚糖测定用试剂盒可以设为组合了校准曲线制作用标准BG的试剂盒。该标准BG可以使用由FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp oration等制造的市售的BG的标准品，也可以使用按照日本特开平08-075751号中所记载的方法制造的标准BG。并且，这些试剂试剂盒中的试剂类可以为冷冻干燥品。
9.BG的去除方法
通过使含有BG的试样与本发明的G因子α亚基(α亚基A或α亚基B)接触而进行处理，能够从试样中去除BG。
用于本方法的本发明的G因子α亚基的具体例如上述“2.本发明的G因子α亚基”项中所说明。
更优选G因子α亚基B。
作为具体的处理方法，可以举出混合含有BG的试样和承载有本发明的G因子α亚基的不溶性载体的方法、使含有BG的试样通过填充了承载有本发明的G因子α亚基的填充剂的柱的方法等。并且，作为柱法，可以举出遵照一般的液相色谱法进行的方法。
当使用细胞或细菌等的培养用培养基作为含有BG的试样时，优选“混合含有BG的试样和承载有本发明的G因子α亚基的不溶性载体的方法”。
以下，以“混合含有BG的试样和承载有本发明的G因子α亚基的不溶性载体的方法”为例子更具体地进行说明。
首先，将试样与承载有本发明的G因子α亚基的不溶性载体进行混合，优选进行振荡。或者，将试样与悬浮有承载有本发明的G因子α亚基的不溶性载体的溶剂优选一边搅拌一边混合。然后，若将试样和承载有本发明的G因子α亚基的不溶性载体分离，则能够从试样中去除BG。
进行该处理时的承载有G因子α亚基的不溶性载体的量越多，越能够充分去除试样中的夹杂物，但太多也会造成浪费，不经济。因此，若考虑经济用量，则例如承载有G因子α亚基的不溶性载体与试样的使用量比为1:1000～1:3、优选为1:10～1:3左右即可。另外，该比率可以为重量比(W/W)、容量比(V/V)、容量/重量比(V/W)中的任一种。
并且，使试样与承载有G因子α亚基的不溶性载体接触的时间只要为足以使试样中的BG与G因子α亚基结合的时间即可，例如为5分钟～1天，优选为1～8小时。
为了将试样和承载有G因子α亚基的不溶性载体分离，例如使用过滤、倾析等适当的方法即可。
作为用于上述方法的将本发明的G因子α亚基固定化的不溶性载体，可以举出琼脂糖(Sepharose)、聚苯乙烯、聚丙烯、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸缩水甘油酯，聚氯乙烯、聚乙烯、聚氯碳酸酯、硅酮树脂、硅橡胶等合成高分子化合物、例如多孔性玻璃、毛玻璃、陶瓷、氧化铝、硅胶、活性炭、金属氧化物等无机物质等。优选琼脂糖等。
并且，作为不溶性载体的形态，可以举出珠子、微粒、胶乳粒子等形态的载体，但珠子状的载体由于容易使用而优选。并且，其粒径并不受特别限定。
作为市售的琼脂糖珠，例如可以举出CNBr-activated Sepharose 4B(GEHealthcare公司制造)等。
作为使G因子α亚基固定化于不溶性载体的方法，通过使G因子α亚基与不溶性载体接触来进行即可，并不受特别限定。
并且，当使用市售的不溶性载体时，按照在该操作说明书中推荐的固定化方法使G因子α亚基固定化于不溶性载体即可。
具体而言，将G因子α亚基承载于不溶性载体的方法例如通过如下来进行：使通常以0.1μg/mL～20mg/mL、优选以1μg/mL～5mg/mL的范围包含本发明的G因子α亚基的溶液与含有预处理的CNBr-activated Sepharose 4B(GE Health care公司制造)0.05～2g的溶液接触，在适当的温度下一边优选翻转混合一边使其反应规定时间。为了使未反应活性基团失活，可以进行将其再次悬浮于另一新的溶剂中进行温育的处理。
昆虫细胞用培养基中通常包含酵母提取液，因此被BG污染。并且，已知通常的重组蛋白质表达用的动物细胞用培养基例如FreeStyleTM 293ExpressionMedium或FreeStyleTMCHO Expression Medium也被BG污染。根据本发明所涉及的BG的去除方法，能够从这些培养基中去除BG来去除BG的污染。
并且，根据本发明所涉及的BG的去除方法，能够去除共存于培养基中的、使用G因子的BG测定的阻碍因素。
此外，本发明所涉及的BG的去除方法不仅能够去除培养基的BG污染，还能够在以下用途中应用。
即，例如在使用培养细胞等的实验中，当培养细胞为容易受到BG的影响的性质时，能够用于排除所使用试剂的BG的污染。
作为本发明的BG去除用试剂盒，可以举出包含含有与序列号2或序列号4表示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的G因子α亚基的试剂盒，其能够用于上述去除方法。
以下，举出实施例对本发明进行进一步详细的说明，但本发明并不受这些实施例的任何限定。
实施例
实施例1.本发明的异源二聚体的获取-1
＜1.使用下一代测序仪的源自鲎的G因子RNA的分析＞
以下，将“下一代测序仪、Next Generation Sequencer”缩写为“NGS”。
另外，在此所说的NGS并不仅表示下一代测序仪设备其本身，还表示包括通过从使用下一代测序仪进行的样品制备开始，并行执行几百万个测序反应而序列确定处理量增大的测序方法，其后的在PC上进行的序列分析在内的系统整体。
1-1.总RNA的回收
使用RNA提取用试剂ISOGEN(FUJIFILM Wako Pure Chemical Corpora tion制造)，按照该产品附带的实验方案，利用如下所述的方法从鲎属鲎血细胞回收了总RNA。
首先，在研钵内用液氮将鲎属鲎(美洲鲎，美国产)血细胞冷冻之后，捣碎并破碎。向其中加入ISOGEN(FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation制造)，使破碎物悬浮，并提取了RNA。
将所获得的提取液移到管中，在室温下温育5分钟之后，添加氯仿，以使其成为40％(v/v)。接着，搅拌15秒钟，在室温下进一步温育了3分钟。然后，将提取液以4℃、12000×g离心分离15分钟之后，将水相移到新的管中。接着，添加并搅拌3.5mL的异丙醇之后，在室温下温育了10分钟。接着，将提取液以4℃、12000×g离心分离10分钟，获得了沉淀物。将所获得的沉淀物用7mL的70％乙醇清洗并进行干燥，获得了RNA沉淀物。将所获得的RNA沉淀物溶解于70μL无菌水中。测定所获得的RNA水溶液的吸光度，并测定了所获得的总RNA的浓度。总RNA的浓度为919.8ng/μL，从鲎属鲎血细胞获得了64μg的总RNA。
1-2.基于NGS的编码G因子亚基的DNA序列的确认
使用上述1-1中所获得的源自鲎属鲎的血细胞的总RNA并使用TruSeq Str andedmRNA sample Prep kit(Illumina,Inc.制造)，按照Kit中所记载的说明书制作出序列文库(Sequence Library)。将所制作的序列文库用于使用下一代测序仪HiSeq 2500的分析。
根据通过使用HiSeq 2500的分析而获得的序列数据，将接头序列和质量值低的碱基进行修剪处理之后，通过使用Trinity软件的常规方法进行了组装。然后，进行组装处理中所获得的重叠群(Contig)序列的ORF的预测，确定了文库的序列编码的氨基酸序列。
接着，进行了上述组装中所获得的氨基酸序列与中华鲎属G因子α亚基的氨基酸序列(Accession No.BAA04044.1(Protein ID)、序列号52、DNA序列：序列号51)或中华鲎属G因子β亚基的氨基酸序列(Accession No.BAA04045.1(Protein ID))的同源性搜索(blastp)。
进行与编码中华鲎属G因子α亚基的氨基酸序列的同源性搜索的结果，确认到与编码中华鲎属G因子α亚基的氨基酸序列具有同源性的两种氨基酸序列(id：TR44185 c2_g1_i1、id：TR44185 c2_g1_i2)和编码该两种氨基酸序列的两种DNA序列(序列号53、序列号54)。
所获取的序列号53及序列号54的DNA序列不包含终止密码子，因此推断不是鲎属G因子α亚基的整个氨基酸序列，而编码其N末端侧的部分序列。
并且，进行与编码中华鲎属G因子β亚基的氨基酸序列的同源性搜索的结果，确认到与中华鲎属G因子β亚基的氨基酸序列具有同源性的两种氨基酸序列和DNA序列，即id：TR39550_c0_g1_i2(氨基酸序列：序列号22、DNA序列：序列号21)及id：TR39550_c0_g1_i3(氨基酸序列：序列号24、DNA序列：序列号23)，并且推断两种均为编码鲎属G因子β亚基的氨基酸序列的DNA序列。
关于公知的中华鲎属G因子α亚基和中华鲎属G因子β亚基的同源物的存在，并没有报道。但是，根据以上的结果，由NGS的分析结果判明了中华鲎属G因子α亚基和中华鲎属G因子β亚基分别具有至少两种以上的同源物。
＜2.G因子α亚基全长碱基序列的获取＞
对于具有上述＜1.＞中确认到的源自鲎属G因子α亚基的两种氨基酸序列及DNA序列的G因子α亚基，利用以下方法确定了所有DNA序列。
首先，根据上述1-2中所获得的编码两种氨基酸序列的DNA序列(序列号53、序列号54)的编码N末端侧的DNA序列部分(包含起始密码子序列)的序列，作为正向(Forward)引物，设计并合成了下述引物F1。
引物F1 5'-GATTACGCCAAGCTTgccagaatgtcgattccatc-3'(序列号55)
大写文字：在对载体的in-fusion反应时使用的附加序列
小写文字：源自序列号53及序列号54的序列
2-1.基于3’RACE法的PCR片段的获取
使用SMARTerTM RACE 5'/3'Kit(Takara Bio Inc.制造)，将上述1-1中所获得的源自鲎属鲎的血细胞的总RNA逆转录成1st strand cDNA而制作出cDNA文库。
使用本kit附带的UPM short primer mix、上述中所获得的引物F1及Pri meSTARTMMax DNA Polymerase(Takara Bio Inc.制造)进行了PCR。将PC R溶液的组成示于下述表3，将PCR条件示于下述表4。
[表3]
Figure BDA0003687919030000351
[表4]
Figure BDA0003687919030000352
将上述PCR中所获得的PCR反应液施用于将琼脂糖S以成为1.0(w/v)％的方式溶解于TAE缓冲液中并硬化而成的凝胶上，在TAE缓冲液中以100V进行了50分钟琼脂糖电泳。电泳结束后，用稀释5000倍的SAFELOOKTMpre-green核酸染色液(FUJIFILM Wako PureChemical Corporation制造)染色30分钟之后，用LED Transilluminator gel Mieru观察了条带的位置。
切取约2.2kbp尺寸的条带，使用NucleoSpinTM Gel and PCR Clean-up(TakaraBio Inc.制造)获取PCR片段并进行了纯化。
2-2.带有G因子α亚基的3’侧片段的载体的制作
混合上述2-1中所获得的PCR片段、Linearized pRACE载体(Takara BioInc.制造)及5×In-Fusion HD Enzyme Premix(Takara Bio Inc.制造)，并在50℃下使其反应15分钟而获得了in-fusion反应溶液。将所获得的in-fusion反应溶液2.5μL添加到50μL的ECOSTMCompetent E.coli DH5α(FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation制造)中，在冰上温育了5分钟。在42℃下热休克处理45秒之后，将其涂布于含有100μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂培养基上。在37℃下温育一晩，形成了菌落。
将所形成的菌落拾取并植入约3mL的含有100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，在37℃下振荡培养(200rpm)了一晩。确认悬浮有培养液，将培养液以10000×g离心1分钟，去除上清液，获取了菌体(相当于培养液约3mL的量)。使用QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen公司)，按照附在试剂盒中的说明书，从所获得的菌体中提取了质粒。
2-3.G因子α亚基的3’侧片段的Sanger序列分析
将上述2-2中所获得的质粒与M13-20及M13-P5(通用引物，Takara Bio Inc.制造)混合，并进行了Sanger序列分析。
M13-20正向引物：5'-gtaaaacgacggccagt-3'(序列号56)
M13-P5反向(Reverse)引物：5'-caggaaacagctatgac-3'(序列号57)
修剪所获得的序列数据的结果，确认到序列号58表示的碱基序列。分析该序列号58表示的碱基序列的结果，确认到终止密码子及多聚A信号和多聚A位点的序列。由此，判断序列号58表示的碱基序列为编码上述＜1.＞中所确认到的两种氨基酸序列中的一个的DNA序列的3’末端侧的序列。此外，将该序列号58的碱基序列与上述＜1.＞中所确认到的两种DNA序列即序列号53的碱基序列及序列号54的碱基序列执行了重叠群。其结果，可知序列号58的碱基序列确认到与序列号54的碱基序列100％重叠的部位，因此能够在PC上构建全长。因此，利用Vector NTI软件(Invitrogen公司)进行了序列号58的碱基序列的修剪和重叠群。
以上的结果，确认到编码上述＜1.＞中所确认到的两种氨基酸序列中的一种G因子α亚基的全长氨基酸序列的全长DNA序列。
但是，在上述＜1.＞中的NGS的分析结果中设想了存在两个克隆，但在此只有一个克隆获取了碱基序列。
因此，基于上述＜1.＞中所确认到的两种DNA序列即序列号53及序列号54的碱基序列设计包含起始密码子的引物F2，并基于序列号58的3’末端侧的碱基序列设计并合成了包含终止密码子的引物R2。
引物F2 5′-TATTTACAATCCATGGCAatgtttctgtgttatgttg-3′(序列号59)
大写文字：在对载体的in-fusion反应时使用的附加序列
小写文字：源自序列号53及序列号54的序列
引物R2 5′-GGAGCTCCTGCGGCCGCctaaacctttgtaatcttaatc-3′(序列号60)
大写文字：在对载体的in-fusion反应时使用的附加序列
小写文字：源自序列号58的序列
接着，利用以下方法再次进行了获取cDNA全长的试验。
将上述2-2中所获得的质粒作为模板，使用引物F2和引物R2并使用KO D DNApolymerase(TOYOBO CO.,LTD.制造)进行了PCR。将PCR溶液的组成示于表5，将PCR条件示于表6。
[表5]
Figure BDA0003687919030000381
[表6]
Figure BDA0003687919030000382
PCR反应结束后，对PCR反应溶液进行琼脂糖电泳，通过常规方法确认了条带的位置。切取约2.2kbp尺寸的条带，使用NucleoSpinTM Gel and PCR Clean-up(Takara BioInc.制造)获取PCR片段并进行了纯化。利用与上述“2-1.基于3’RACE法的PCR片段的获取”项中所记载的方法相同的方法来进行了琼脂糖电泳、染色及条带的观察。
混合上述中所获得的PCR片段、用限制性内切酶NcoI和NotI处理的Line arizedpIEx/BacTM-1载体(Novagen公司)及5×In-Fusion HD Enzyme Premix(Takara Bio Inc.制造)，在50℃下使其反应15分钟，获得了in-fusion反应溶液。将所获得的in-fusion反应溶液2.5μL添加到50μL的ECOSTM CompetentE.coli DH5α(FUJIFILM Wako Pure ChemicalCorporation制造)中，在冰上温育5分钟，并在42℃下热休克处理45秒之后，将其涂布于含有100μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂培养基上。在37℃下温育一晩，形成了菌落。
利用与上述“2-2.带有G因子α亚基的3’侧片段的载体的制作”项中所记载的方法相同的方法来进行了从菌落细胞获取质粒。
设计出下述pIEx/Bac-1载体侧的正向引物及反向引物。将该正向引物和反向引物与上述中所获得的质粒混合，并进行了Sanger序列分析。
pIEx/Bac-1载体侧的正向引物：cgcgttggttttagagggca(序列号61)
pIEx/Bac-1载体侧的反向引物：acgtcgccaactcccattgt(序列号62)
修剪所获得的序列数据，并进行了重叠群。利用Vector NTI软件(Invitro gen公司)来进行了修剪和重叠群。其结果，获取了编码上述＜1.＞中所确认到的两种鲎属G因子α亚基的全长氨基酸序列的全长DNA的碱基序列。所获取的碱基序列为序列号17表示的碱基序列及序列号19表示的碱基序列。
＜3.G因子β亚基的序列确认＞
通过上述“1-2.本发明的G因子亚基的氨基酸序列及碱基序列等的获取”的工序，获取了G因子β亚基βi2及G因子β亚基βi3的全长cDNA的碱基序列，即序列号21及序列号23表示的碱基序列。为了进行确认，基于该碱基序列的5’末端侧和3’末端侧的碱基序列设计出下述引物。
引物F3 5′-AACCAAGTGACCatgaaaaccactctatggacttt-3'(序列号63)
引物R3 5'-GATGGTGGTGCTCGAGTtaaaatactggcacaacttc-3′(序列号64)
3-1.G因子β亚基序列的全长DNA序列的获取
使用上述1-1中所获得的源自鲎属鲎的血细胞的总RNA和SuperScriptTM VILOTMMaster Mix(Invitrogen公司)，通过常规方法制作出cDNA文库。
将该cDNA文库作为模板，使用引物F3及引物R3进行了PCR。将PCR溶液的组成示于下述表7，将PCR条件示于下述表8。
[表7]
PCR溶液的制备 制备量
cDNA文库 1μL
PrimeSTAR Max Premix(2×) 12.5μL
引物F3 10μM 1μL
引物R3 10μM 1μL
H<sub>2</sub>O 9.5μL
总量 25μL
[表8]
Figure BDA0003687919030000401
3-2.带有G因子β亚基的全长cDNA的转移载体的制作
混合上述3-1中所获得的PCR片段、用限制性内切酶NcoI和XhoI处理的LinearizedpIExTM-4载体(Novagen公司)及5×In-Fusion HD Enzyme Premix(Takara Bio Inc.)，在50℃下使其反应15分钟，获得了in-fusion反应溶液。将所获得的in-fusion反应溶液2.5μL添加到50μL的ECOSTM Competent E.col i DH5α(FUJIFILM Wako Pure ChemicalCorporation制造)中，在冰上温育5分钟，并在42℃下热休克处理45秒之后，将其涂布于含有100μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂培养基上。在37℃下温育一晩，形成了菌落。利用与上述“2-2.带有G因子α亚基的3’侧片段的载体的制作”项中所记载的方法相同的方法来进行了从菌落细胞获取质粒。
3-3.G因子β亚基的全长cDNA序列的Sanger序列分析
使用pIEx/Bac-1载体侧的正向引物(序列号61)及pIEx/Bac-1载体侧的反向引物(序列号62)，利用与上述“2-3.G因子α亚基的3’侧片段的Sanger序列分析”中所记载的方法相同的方法来进行了上述3-2中所获得的序列数据的获取。
使用Vector NTI软件(Invitrogen公司)修剪所获得的序列数据来进行了重叠群。
其结果，获取了编码鲎属G因子β亚基的6种DNA序列，即序列号21、23、25、27、29及31表示的碱基序列。
＜4.重组杆状病毒载体的制作＞
4-1.转移载体的构建
将前项＜2.＞及＜3.＞中所确认到的碱基序列即序列号17、19、21、23、25、27、29及31分别翻译成氨基酸序列。
分析所获得的氨基酸序列的结果，确认到在这些氨基酸序列的N末端侧具有信号肽序列的区域。
设计出在翻译的包含信号肽的G因子α亚基的氨基酸序列的C末端侧连结有PA标签序列(序列号65：GVAMPGAEDDVV)及6×His标签序列的氨基酸序列和未连结这些标签的氨基酸序列。为了在昆虫细胞中表达设计的氨基酸序列的蛋白质，将基因序列的密码子最优化。
并且，设计出在翻译的G因子β亚基的氨基酸序列的C末端侧连结有PA标签序列及6×His标签序列的氨基酸序列。为了在昆虫细胞中表达设计的氨基酸序列的蛋白质，将基因序列的密码子最优化。
在下述表9中汇总示出通过以上操作获得的下述信息。但是，表9中所记载的各氨基酸序列及碱基序列不包含标签序列。
另外，下述表9中的各项目分别为以下含义。
·亚基名称：G因子亚基蛋白质的名称、
·氨基酸序列号：G因子亚基蛋白质氨基酸序列的序列号(信号肽序列除外)、
·碱基序列号：编码G因子亚基蛋白质的氨基酸序列的碱基序列的序列号(编码信号肽序列的碱基序列除外)、
·氨基酸序列号(包含信号序列)：G因子亚基蛋白质氨基酸序列的序列号(包含信号肽序列)、
·碱基序列号(包含信号序列)：编码G因子亚基蛋白质的氨基酸序列的碱基序列的序列号(包含编码信号肽序列的碱基序列)、
·最优化的碱基序列号：为了在昆虫细胞中表达G因子亚基蛋白质而最优化的碱基序列的序列号(编码信号肽序列的碱基序列除外)、
·碱基序列号(包含信号序列)：为了在昆虫细胞中表达G因子亚基蛋白质而最优化的碱基序列的序列号(包含编码信号肽序列的碱基序列)。
[表9]
Figure BDA0003687919030000421
委托GENEWIZ公司合成具有序列号41、42、43、44、45、46、47或48表示的碱基序列的cDNA，将该cDNA插入pIEx/Bac-1载体(Novagen公司)的NcoI-NotI位点，获取了转移载体。
4-2.共转染
在接种于25cm2烧瓶中的1.0×106个Sf9细胞(invitorgen公司)中添加了包含上述4-1中所获得的各种转移载体2μg、Linear AcNPV DNA 90ng及Scre enFectTM A plus(FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation制造)3μL的无血清PSFM-J1培养基(FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation制造)100μL。在28℃下静置培养7天之后，回收培养上清液，将其作为重组杆状病毒载体溶液。
所获得的重组杆状病毒载体保持有编码G因子α亚基A、G因子α亚基B、G因子β亚基βC1、G因子β亚基βi2、G因子β亚基βi3、G因子β亚基β2、G因子β亚基β5或G因子β亚基βC2中的任一个氨基酸序列的cDNA。
将含有所获得的重组杆状病毒载体的溶液用作“共转染溶液”。
＜5.已去除BG的无血清PSFM-J1培养基的制作＞
在此，利用以下方法，使用承载有本发明的G因子α亚基B的珠子处理昆虫细胞用培养基，制作出在维持培养基性能的状态下去除了BG的细胞培养用培养基。
5-1.G因子α亚基B的制作
使用利用上述4-1及上述4-2中所记载的方法获得的、具有编码PA标签序列(序列号65：GVAMPGAEDDVV)及6×His标签序列连结于C末端侧的G因子α亚基B的cDNA(序列号66)的重组杆状病毒载体溶液(共转染溶液)，进行了以下操作。
用无血清培养基PSFM-J1(pH5.5～6.2，FUJIFILM Wako Pure ChemicalCorporation制造)将昆虫细胞expresSF+TM(Protein Science公司制造)稀释成1.5×106个/ml，在2000ml三角烧瓶中准备了800ml。向其中加入上述中所获得的共转染溶液4ml，并在130rpm、27℃下振荡培养了3天。培养后，将培养液以3,000×g、4℃离心60分钟，分离成上清液和沉淀。回收该培养上清液，将其作为G因子α亚基B表达培养上清液。
5-2.G因子α亚基B的纯化
上述5-1中表达的蛋白质在C末端侧连结有6×His标签序列。因此，使用cOmpleteTMHis-Tag Purification Resin(Sigma-Aldrich公司)，遵照所附手册中所记载的方法进行亲和纯化，从上述5-1中所获得的G因子α亚基B表达培养上清液纯化了G因子α亚基B蛋白质。
5-3.G因子α亚基B的珠子固定
使CNBr-activated Sepharose 4B(GE公司)1g在1mM HCl中悬浮，并且用200mL进行了清洗。将已清洗的CNBr-activated Sepharose 4B 4ml net与溶解于偶联缓冲液(200mM NaHCO3，500mM NaCl，pH8.3)中的上述5-2中所获得的G因子α亚基B16mg混合，并在4℃下一边翻转混合一边温育了一晩。为了使未反应活性基团失活而回收珠子，在Tris-HCl缓冲液中在pH8.0下再次悬浮，并在4℃下温育了2小时。利用以上方法获得了G因子α亚基B固定化珠子的悬浮液。
5-4.从无血清PSFM-J1培养基的BG去除
在1000mL无血清PSFM-J1培养基中加入上述5-3中所获得的G因子α亚基B固定化珠子的悬浮液0.5mL net，在室温下用搅拌振荡机搅拌了4小时。然后，通过0.22μM的PES过滤器，进行了珠子的去除和灭菌处理。
5-5.BG去除的确认
1)BG去除的确认1-BG的去除
使用5-4中所获得的G因子α亚基B固定化珠子处理培养基或未处理培养基，制备下述表10中所记载的组成的反应溶液，将其依次添加到反应用板中。接着，在37℃下进行200分钟反应，反应结束后，将0.04％亚硝酸钠(1.0M盐酸溶液)、0.3％氨基磺酸铵、0.07％N-1-萘基乙二胺二盐酸盐(14％N-1-甲基-2-吡咯烷酮溶液)各自依次添加0.05mL而进行重氮偶联，并利用酶标仪(设备名称：Spark(Tecan公司制造))在540nm(对照波长：630nm)下测定了吸光度。
另外，在此使用的含有源自鲎的天然G因子的溶液使用了按照日本专利第2564632号中所记载的方法从粗LAL分离的一部分(fraction)。
[表10]
Figure BDA0003687919030000451
将结果示于图1。
由图1明确可知，在无血清PSFN-J1培养基中包含350pg/mL以上的BG，但若用G因子α亚基B进行处理，则BG浓度成为几pg/mL以下，成为检测限附近的值。
由以上可知，通过用本发明的G因子α亚基B处理培养基，能够将BG去除至检测限。
2)BG去除的确认2-阻碍因素的去除
利用注射用水将香菇多糖(以下称为LNT)溶解成0、5、10、30、60pg/mL，将其作为“校准曲线用溶液”。即，“校准曲线用溶液”不包含培养基。
并且，将LNT以成为0、10、30pg/mL的方式添加到利用上述5-4的方法进行了G因子α亚基B固定化珠子处理的无血清PSFM-J1培养基或未处理无血清PSFM-J1培养基中而制备出溶液。成为0pg/mL时使用了注射用水。将所制备的该溶液作为“已制备的测定对象培养基”。另外，LNT使用了将用于静脉注射的香菇多糖1mg“Ajinomoto”溶解在1N NaOH中而制备的LNT。
接着，制备下述表11中所记载的组成的反应溶液，并将其依次添加到反应用板中。接着，在37℃下进行200分钟反应，反应结束后，将0.04％亚硝酸钠(1.0M盐酸溶液)、0.3％氨基磺酸铵、0.07％N-1-萘基乙二胺二盐酸盐(14％N-1-甲基-2-吡咯烷酮溶液)各自依次添加0.05mL而进行重氮偶联，并利用酶标仪(设备名称：Spark(Tecan公司制造))在540nm(对照波长：630nm)下测定了吸光度。
表11中使用的含有源自鲎的天然G因子的溶液使用了按照日本专利第2564632号中所记载的方法从粗LAL分离的一部分。
[表11]
Figure BDA0003687919030000461
将结果汇总示于图2中。
在图2中，--◇--表示使用校准曲线用溶液获得的结果，-▲-表示使用利用本发明的G因子α亚基B进行了BG去除处理的PSM-J1培养基获得的结果，-◆-表示使用未处理的PSM-J1培养基获得的结果。
由图2可知，使用未处理的无血清PSFM-J1培养基获得的校准曲线(◆，y＝0.004X+0.1266)的斜率(0.004)成为低于使用校准曲线用溶液获得的校准曲线(◇，y＝0.0071X+0.032)的斜率(0.007)的值。该结果暗示着，在无血清PSFM-J1培养基中存在G因子的阻碍因素。
另一方面，利用使用本发明的G因子α亚基B珠子进行了BG去除处理的无血清PSFM-J1培养基获得的校准曲线(▲，y＝0.0065X+0.0048)的斜率为0.065，成为近似于使用校准曲线用溶液获得的校准曲线的斜率(0.007)的值。该结果暗示着，通过本BG去除处理方法还去除了对使用G因子的BG测定产生影响的阻碍因素。
另外，虽未示出数据，但作为为了从昆虫细胞用培养基进行BG去除而去除BG活性的方法，进行了作为一直以来进行的技术的高压釜处理(121℃，20分钟)、使用Posidyne过滤器的处理(Pall公司制造)、使用Zeta PlusTM吸附深度过滤器的处理，但无法维持培养基性能的同时去除BG。
由以上可知，使用本发明的G因子α亚基B去除培养基中的BG的方法作为能够维持培养基性能的同时以比以往简单的方法去除BG的方法，是极其优异的方法。
＜6.重组G因子α亚基和β亚基的组合确认试验＞
6-1.表达试验用重组杆状病毒溶液的制作
用已去除BG的无血清培养基PSFM-J1(pH5.5～6.2)将昆虫细胞expresS F+TM(Protein Science公司制造)稀释成1.5×106cells/ml，在125ml三角烧瓶中准备了50ml。
向其中加入上述4-2中所获得的各共转染溶液0.250ml，并在130rpm、27℃下振荡培养了3天。培养后，将培养液以3,000×g、4℃离心30分钟，分离成上清液和沉淀。回收该培养上清液，将其作为“表达试验用重组杆状病毒溶液”。
另外，利用上述“5.已去除BG的无血清PSFM-J1培养基的制作”的方法来获得了上述中所使用的“已去除BG的无血清培养基PSFM-J1”。
6-2.表达试验用重组杆状病毒溶液的滴度测定
以重组G因子α亚基A和β亚基βi2为代表，利用以下方法测定了上述6-1中所制作的表达试验用重组杆状病毒溶液的滴度。
将2.0×106cells的Sf9细胞(Invtrogen公司)接种在直径60mm的培养皿中，在28℃下静置1小时，使细胞粘接于底面。
将上述6-1中所获得的具有“编码G因子α亚基A(在C末端侧未连结有PA标签序列及6×His标签序列)的cDNA”的表达试验用重组杆状病毒的溶液或具有“编码G因子β亚基βi2的cDNA”的表达试验用重组杆状病毒的溶液分别用无血清PSFM-J1培养基稀释105、106、107、108倍，并将这些溶液分别各1ml添加到Sf9细胞中，在室温下轻轻地振荡了1小时。然后，除去培养皿上清液(病毒液)，注入含有0.5％SeaKemGTG agarose(BMA公司制造)的无血清PSFM-J1培养基4ml，并在28℃下静置培养了7天。在7天后的板中添加0.03％中性溶液并静置3小时进行了染色。计数空斑(成为透明的部位)数，计算出滴度值。
所获得的结果如下。
具有编码G因子α亚基A的cDNA的重组杆状病毒：2.1×108pfu/mL
具有编码G因子β亚基βi2的cDNA的重组杆状病毒i2：1.4×108pfu/mL
6-3.重组G因子α亚基与β亚基的共表达
用已去除BG的无血清培养基PSFM-J1(pH5.5～6.2)将昆虫细胞expresS F+TM(Protein Science公司制造)稀释成1.5×106cells/ml，在12个125ml三角烧瓶中准备了各50ml。
向这些三角烧瓶中从上述6-1中所制备的表达试验用重组杆状病毒溶液以VOI＝1/400的比例加入一种G因子α亚基表达用杆状病毒且以VOI＝1/100的比例加入一种G因子β亚基表达用杆状病毒，进行旋转培养，并在130rpm、27℃下振荡培养了2天。培养后，将培养液以3,000×g、4℃离心30分钟，分离成上清液和沉淀。将上清液冷冻保存(VOI＝volume ofinfection(感染量))。
利用上述“5.已去除BG的无血清PSFM-J1培养基的制作”的方法来获得了上述中所使用的“已去除BG的无血清培养基PSFM-J1”。
另外，在此使用的G因子α亚基表达用杆状病毒所具有的DNA在C末端侧未连结有PA标签序列及6×His标签序列。
当以上述VOI感染时，若以感染复数(multiplicity of infection，以下称为MOI。)换算，则大致成为具有编码G因子α亚基的cDNA的表达用杆状病毒:具有编码G因子β亚基的cDNA的表达用杆状病毒＝0.4:0.9的比率。
在此使用的具有编码G因子α亚基的cDNA的表达用杆状病毒具有编码G因子α亚基A或B的cDNA(序列号41或序列号42)。
并且，具有编码G因子β亚基的cDNA的表达用杆状病毒具有编码G因子β亚基βi2、βi3、β2、β5、βC1或βC2的cDNA(序列号43、44、45、46、47或48)。
＜7.重组G因子α亚基和β亚基的表达确认(蛋白质印迹法(Western bl otting))＞
混合上述6-2中所获得的表达试验用重组杆状病毒溶液(G因子α亚基A表达试验用重组杆状病毒溶液或G因子β亚基βi2表达试验用重组杆状病毒溶液)90μL和试样用缓冲液(含有3-巯基-1,2-丙二醇)(×4)(FUJIFILM Wak o Pure Chemical Corporation制造)30μL，并热处理了5分钟。将热处理的试样15μL施用于固定在简易分离器中的Super SepTMAce、10-20％凝胶(FUJIFI LM Wako Pure Chemical Corporation制造)。
用SDS-PAGE缓冲液(pH8.5)(FUJIFILM Wako Pure Chemical Corpora tion制造)填满简易分离器(FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation制造)，并以250CV通电了60分钟。电泳后，将进行了SDS-PAGE的凝胶载置于用甲醇亲水化的Clear TransTM SP PVDF膜(疏水性，0.2μm)(FUJIFILMWako Pure Chemical Corporation制造)上，用在Aqua BlotTM1×高效转膜缓冲液中浸泡的滤纸从上下夹住。以1mA/cm2 CA通电了60分钟。
通电后，当使用G因子α亚基A表达试验用重组杆状病毒溶液时，以3％脱脂牛奶(60分钟)(FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation制造)、抗G因子α亚基抗体(60分钟)、抗小鼠IgG抗体(HRP结合)(60分钟)(FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation制造)的顺序进行了振荡。反应后，用ImmunoStarTMZeta使其发光并利用AI-600QC进行了检测。
并且，当使用G因子β亚基βi2表达试验用重组杆状病毒溶液时，通电后，以3％脱脂牛奶(60分钟)(FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation制造)、抗6xHis标签抗体(HRP结合)(FUJIFILM Wako Pure Chemical Cor poration制造)的顺序进行了振荡。反应后，用ImmunoStarTMZeta使其发光并利用AI-600QC进行了检测。
其结果，rG因子α亚基在约75kDa附近的位置确认到条带，rG因子β亚基在约40kDa附近的位置确认到条带。
由以上确认到G因子α亚基及本发明的G因子β亚基的表达。
实施例2.本发明的异源二聚体的葡聚糖依赖性蛋白酶活性确认试验
将包含实施例1的6-3中所获得的本发明的G因子α亚基与G因子β亚基的共表达物的上清液用作试样，利用以下方法进行了所获得的共表达物的葡聚糖依赖性蛋白酶活性的评价。
即，制备下述表12中所记载的组成的反应溶液，将其依次添加到反应用管中。接着，在37℃下进行200分钟反应，使用ELx808(BioTek制造)测定了405nm(测定波长)和492nm(次波长)下的吸光度。将LNT添加与未添加(空白)时的吸光度差示于表13。
并且，作为比较，制备具有编码源自美洲鲎的G因子α亚基的氨基酸序列(BAJ10550.1(protein_id)、序列号50)的Genbank Accession No.AB547712的碱基序列(序列号49)的cDNA，并使用该cDNA，除此以外，利用与实施例1相同的方法共表达源自美洲鲎的G因子α亚基和本发明的G因子β亚基，获得了源自美洲鲎的G因子α亚基(AB547712)与本发明的G因子β亚基的异源二聚体。使用该异源二聚体，除此以外，同样地进行了葡聚糖依赖性蛋白酶活性确认试验。将结果一并示于表13。
此外，利用专利文献2中所记载的方法，使源自中华鲎、美洲鲎的G因子α亚基和G因子β亚基共表达而获得了异源二聚体。使用该异源二聚体，除此以外，同样地进行了葡聚糖依赖性蛋白酶活性确认试验。将结果示于表14。
[表12]
Figure BDA0003687919030000501
另外，在此使用的LNT使用了将用于静脉注射的香菇多糖1mg“Ajinomoto”溶解在1N NaOH中而制备的LNT。
[表13]
Figure BDA0003687919030000511
将LNT添加与LNT未添加时的吸光度的d差设为“空白差”。
在表13中，
◎表示空白差＞0.1的情况，
〇表示0.1≧空白差＞0.01的情况，
△表示0.01≧空白差＞0的情况，
×表示空白差＝0的情况。
[表14]
Figure BDA0003687919030000512
由表13明确可知，本发明的异源二聚体确认到在BG存在下具有蛋白酶活性。
另一方面，由表13明确可知，作为公知的序列的AB547712和本发明的G因子β亚基的异源二聚体无法测定蛋白酶活性。由以上确认到，关于作为公知的序列的AB547712，难以制作具有BG依赖性的G因子。
并且，由表14明确可知，代替本发明的异源二聚体而使用源自中华鲎属的G因子αβ进行了相同的测定的结果，无法测定蛋白酶活性。
由以上暗示着，本发明的G因子α亚基与本发明的G因子β亚基的异源二聚体能够用于BG的定量测定或真菌病的诊断。
实施例3.使用本发明的异源二聚体的BG的测定
将包含实施例1的6-3中所获得的、本发明的G因子α亚基A与G因子β亚基βi2的共表达物的上清液或包含本发明的G因子α亚基B与G因子β亚基β2的共表达物的上清液用作试样，利用以下方法测定了已知的BG量。
即，制备下述表15中所记载的组成的反应溶液，将其依次添加到反应用管中。在表15中，将在1N NaOH中以LNT浓度成为0.35pg/mL、3.5pg/mL及35pg/mL的方式溶解有用于静脉注射的香菇多糖1mg(“Ajinomoto”)的溶液用作LNT溶液。
并且，将注射用蒸馏水用作LNT未添加的空白。
[表15]
Figure BDA0003687919030000521
接着，在37℃下进行200分钟反应，使用ELx808(BioTek制造)测定了405nm(测定波长)和492nm(次波长)下的吸光度。将LNT添加与未添加(空白)时的吸光度差设为各LTN浓度下的吸光度。
接着，制作出标绘有相对于试样中的香菇多糖浓度(换算值，pg/mL，x轴)的吸光度的校准曲线。
将使用包含本发明的G因子α亚基A与G因子β亚基βi2的共表达物的上清液的测定中所获得的校准曲线示于图3。
并且，由测定值通过最小二乘法求出的线性回归方程式和相关系数如下所述。
y＝0.2819×0.296
R2＝1
将使用包含本发明的G因子α亚基B与G因子β亚基β2的共表达物的上清液的测定中所获得的校准曲线示于图4。
并且，由测定值通过最小二乘法求出的线性回归方程式和相关系数如下所述。
y＝0.1601×0.2356
R2＝0.9938
由图3及图4明确可知，当使用本发明的异源二聚体进行BG的测定时，获得了与试样中的BG浓度(以香菇多糖浓度换算值为0～350pg/mL)成正比的良好的校准曲线。据此可知，能够将本发明的异源二聚体用于BG的定量。尤其，能够确认到能够将香菇多糖浓度的下限非偶然地检测至0.35pg/mL。另外，在临床检査领域中测定BG时的BG的截止值为11pg/mL以下。
实施例4.本发明的异源二聚体的获取-2
(1)表达载体的构建
1)G因子α亚基A表达载体的构建
将具有序列号41(包含以表9中所记载的昆虫细胞用最优化的碱基序列、信号序列)表示的碱基序列的cDNA插入到质粒载体pIEx-Bac-1载体(Novage n公司)的NcoI-NotI位点，构建了G因子α亚基A表达载体(α(TYPE A)/pIEx-Bac-1)。
2)G因子β亚基i2表达载体的构建
设计出从5'末端侧以信号序列、Hat标签、SUMO标签、G因子β亚基βi2(氨基酸序列：序列号6)的顺序配置的氨基酸序列(序列号67)，编码该氨基酸序列，且设计出以昆虫细胞用最优化的碱基序列(序列号68)。编码该碱基序列的G因子β亚基βi2的碱基序列由序列号69表示。
委托GENEWIZ公司合成了具有该碱基序列的cDNA。将该cDNA插入到质粒载体pIEx-Bac-1载体(Novagen公司)的NcoI-NotI位点，构建了G因子β亚基βi2表达载体(βi2/pIEx-Bac-1)。
(2)使用表达载体的共表达
将昆虫细胞expresSF+(注册商标；Protein Science公司制造)以成为1.0×106cells的方式接种在含有已去除BG的无血清培养基PSFM-J1(pH5.5～6.2)的6孔板(wellplate)中。
混合上述中所构建的表达载体α(TYPE A)/pIEx-Bac-1及βi2/pIEx-Bac-1(分别为1μg的量)及转染试剂ScreenFectA plus(FUJIFILM Wako Pure Che mical Corporation制造)2μL、PSFM-J1培养基(FUJIFILM Wako Pure Chemi cal Corporation制造)100μL，在室温下温育20分钟之后，将溶液添加到接种有expresSF+的6孔板中。
然后，在27℃下培养了3天。培养后，将培养液以12,000×g、4℃离心2分钟，分离成上清液和沉淀。将上清液冷冻保存。
(3)葡聚糖依赖性蛋白酶活性确认试验
将所获得的上清液(含有本发明的G因子α亚基A与G因子β亚基βi2的共表达物)用作试样，除此以外，利用与实施例2相同的方法进行了所获得的共表达物的葡聚糖依赖性蛋白酶活性的评价。另外，以测定时的浓度成为35pg/mL、3.5pg/mL或0.35pg/mL的方式加入了35pg/mL的LNT溶液。
将结果示于图5。
由图5能够明确确认到，当使用本发明的异源二聚体进行BG的测定时，即使试样中的BG浓度以香菇多糖浓度换算值为0.35pg/mL，也能够充分检测。
序 列 表
<110> 富士胶片株式会社
<120> 源自鲎的重组G因子及使用该重组G因子的β-葡聚糖的测定方法
<130> 2144
<150> 2019-223604
<151> 2019-12-11
<160> 69
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1944
<212> DNA
<213> 美洲鲎（Limulus polyphemus）
<400> 1
gaaccaaaat ggaagctcgt ctggtcggat gaatttacca atggaatcag ttcagattgg 60
gaattcgaaa cgggcaatgg ccccaacggt tggggcaata acgaactgca atattatcgt 120
cgtgaaaata cccgagttga gggcgggaaa ttaataatta cagctaaaga agaagattat 180
gagggtttca ggtacacttc tgccaagctg aaaacccagt tcaataaacc ttggaaagat 240
ggtaaaattg aagccagaat gtcgattcca tcatttcggg gggtctgggt ggcgttctgg 300
atgttaggag acatcaccga tactgatagc tggccctctt ccggtgaaat tgactttgag 360
gaacacataa ataccaacaa tgaagttaga ggaactattc actggtctac ttctgatgac 420
gctgatacac ttcatggcag aggaaccaat actgactatc acatttattc tgtagagtgg 480
aattcttccg ttattagatg gtttgttgat ggaaatcagt actttgaggt gaatattcag 540
agaggagcaa ctggaacaaa cgcatttcat aataacgttt tcgttatttt aaacatggct 600
attggtggaa actggccagg attcaatgtt gctgatgagg ctttccctgc taacatgtat 660
gtagattatg tccgtgtata tcaggatgcc aatacacctt ctcctgttga cgttactcat 720
ttatctggtt actattttct tcaaaatagg cacagtgaac tgtatcttga tgtcagtggt 780
tccagtaacg aagatggagc atttctacaa caatggcctt atagcggtaa tgctaaccaa 840
cagtttgatt ttgtacatct cggaaataag gtttataaaa ttatcaataa aaatagtgga 900
aaatctctgg atgtttacga gttagggact gataatggtg tcagaatcca acagtggtcg 960
tatggagggg gctacaatca gcagtttatt gtacaagatg ttggagatgg ttattataag 1020
atatttgcac gcagcactgg aaagttagtg gaagtagcag atttgaataa agacccagga 1080
ggaaagatac aacaatggtc tgatgatggc caattatccg gacagtggaa acttattcga 1140
aataaagcta attctaaatt gattcaggca gaaagttatt ttgctagttc aaaagtacaa 1200
ttggaagata cctcggatgt aggaggcggg aagaatgtca agtgtgataa tgaaggagcc 1260
tggatggctt acaaggatat caatttccca agttcaggta cttatcaagt agagtacaga 1320
gtggcaagtg aacgtgcagg aggaatgttg tctctggatt tgaatgcagg ttctatagtg 1380
cttggcatgc tgaatgttcc ttcaactgga ggattgcaga agtggaccac catttcccac 1440
acagtgaatg taagttcagg tacgtacaac ttggggatca gtgttcaacg acccgggtgg 1500
aatatcaact ggattaatat tacaaaagta tccagtcagt tgaaatctat tccaagtact 1560
aattctagag taattcaggc agaaagttat ttcgatagtt caaaagtaca attggaagac 1620
acctcggatg ttggaggcgg gaagaatgtt aagtgtgata ctaaaggagc ctggatggcc 1680
tacaaggata tcaattttcc cagttcaggt agttatcaaa tagagtacag agtggcaagt 1740
gaacgtgcag gaggaaagtt gtctctcgat ttgaatgcag gttctatagt gcttggaatg 1800
ctggatgttc cttcaactgg gggatggcag aagtggacca ccatttccca tacagtaaag 1860
gtggattcag gtacttataa cttggggatc tacgttcaac aacccgggtg gaatatcaac 1920
tggattaaga ttacaaaggt ttag 1944
<210> 2
<211> 647
<212> PRT
<213> 美洲鲎（Limulus polyphemus）
<400> 2
Glu Pro Lys Trp Lys Leu Val Trp Ser Asp Glu Phe Thr Asn Gly Ile
1 5 10 15
Ser Ser Asp Trp Glu Phe Glu Thr Gly Asn Gly Pro Asn Gly Trp Gly
20 25 30
Asn Asn Glu Leu Gln Tyr Tyr Arg Arg Glu Asn Thr Arg Val Glu Gly
35 40 45
Gly Lys Leu Ile Ile Thr Ala Lys Glu Glu Asp Tyr Glu Gly Phe Arg
50 55 60
Tyr Thr Ser Ala Lys Leu Lys Thr Gln Phe Asn Lys Pro Trp Lys Asp
65 70 75 80
Gly Lys Ile Glu Ala Arg Met Ser Ile Pro Ser Phe Arg Gly Val Trp
85 90 95
Val Ala Phe Trp Met Leu Gly Asp Ile Thr Asp Thr Asp Ser Trp Pro
100 105 110
Ser Ser Gly Glu Ile Asp Phe Glu Glu His Ile Asn Thr Asn Asn Glu
115 120 125
Val Arg Gly Thr Ile His Trp Ser Thr Ser Asp Asp Ala Asp Thr Leu
130 135 140
His Gly Arg Gly Thr Asn Thr Asp Tyr His Ile Tyr Ser Val Glu Trp
145 150 155 160
Asn Ser Ser Val Ile Arg Trp Phe Val Asp Gly Asn Gln Tyr Phe Glu
165 170 175
Val Asn Ile Gln Arg Gly Ala Thr Gly Thr Asn Ala Phe His Asn Asn
180 185 190
Val Phe Val Ile Leu Asn Met Ala Ile Gly Gly Asn Trp Pro Gly Phe
195 200 205
Asn Val Ala Asp Glu Ala Phe Pro Ala Asn Met Tyr Val Asp Tyr Val
210 215 220
Arg Val Tyr Gln Asp Ala Asn Thr Pro Ser Pro Val Asp Val Thr His
225 230 235 240
Leu Ser Gly Tyr Tyr Phe Leu Gln Asn Arg His Ser Glu Leu Tyr Leu
245 250 255
Asp Val Ser Gly Ser Ser Asn Glu Asp Gly Ala Phe Leu Gln Gln Trp
260 265 270
Pro Tyr Ser Gly Asn Ala Asn Gln Gln Phe Asp Phe Val His Leu Gly
275 280 285
Asn Lys Val Tyr Lys Ile Ile Asn Lys Asn Ser Gly Lys Ser Leu Asp
290 295 300
Val Tyr Glu Leu Gly Thr Asp Asn Gly Val Arg Ile Gln Gln Trp Ser
305 310 315 320
Tyr Gly Gly Gly Tyr Asn Gln Gln Phe Ile Val Gln Asp Val Gly Asp
325 330 335
Gly Tyr Tyr Lys Ile Phe Ala Arg Ser Thr Gly Lys Leu Val Glu Val
340 345 350
Ala Asp Leu Asn Lys Asp Pro Gly Gly Lys Ile Gln Gln Trp Ser Asp
355 360 365
Asp Gly Gln Leu Ser Gly Gln Trp Lys Leu Ile Arg Asn Lys Ala Asn
370 375 380
Ser Lys Leu Ile Gln Ala Glu Ser Tyr Phe Ala Ser Ser Lys Val Gln
385 390 395 400
Leu Glu Asp Thr Ser Asp Val Gly Gly Gly Lys Asn Val Lys Cys Asp
405 410 415
Asn Glu Gly Ala Trp Met Ala Tyr Lys Asp Ile Asn Phe Pro Ser Ser
420 425 430
Gly Thr Tyr Gln Val Glu Tyr Arg Val Ala Ser Glu Arg Ala Gly Gly
435 440 445
Met Leu Ser Leu Asp Leu Asn Ala Gly Ser Ile Val Leu Gly Met Leu
450 455 460
Asn Val Pro Ser Thr Gly Gly Leu Gln Lys Trp Thr Thr Ile Ser His
465 470 475 480
Thr Val Asn Val Ser Ser Gly Thr Tyr Asn Leu Gly Ile Ser Val Gln
485 490 495
Arg Pro Gly Trp Asn Ile Asn Trp Ile Asn Ile Thr Lys Val Ser Ser
500 505 510
Gln Leu Lys Ser Ile Pro Ser Thr Asn Ser Arg Val Ile Gln Ala Glu
515 520 525
Ser Tyr Phe Asp Ser Ser Lys Val Gln Leu Glu Asp Thr Ser Asp Val
530 535 540
Gly Gly Gly Lys Asn Val Lys Cys Asp Thr Lys Gly Ala Trp Met Ala
545 550 555 560
Tyr Lys Asp Ile Asn Phe Pro Ser Ser Gly Ser Tyr Gln Ile Glu Tyr
565 570 575
Arg Val Ala Ser Glu Arg Ala Gly Gly Lys Leu Ser Leu Asp Leu Asn
580 585 590
Ala Gly Ser Ile Val Leu Gly Met Leu Asp Val Pro Ser Thr Gly Gly
595 600 605
Trp Gln Lys Trp Thr Thr Ile Ser His Thr Val Lys Val Asp Ser Gly
610 615 620
Thr Tyr Asn Leu Gly Ile Tyr Val Gln Gln Pro Gly Trp Asn Ile Asn
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Trp Ile Lys Ile Thr Lys Val
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<211> 1953
<212> DNA
<213> 美洲鲎（Limulus polyphemus）
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ttactctcga aaccaatcga atacaactac aaagtacggc ctgtctgtat tcctgagttg 420
aacaagttga acgtgaactt aaacaataag gaggtcgttg ttattggttg gggtgttact 480
gaaagaggta gtgagaaata taatgttcta cgtgaactgg agttgcccgt agttacaaac 540
gaactgtgca acaagtctta tcaaaccata tcattctccg gcctcaaccg aggaatcact 600
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<212> DNA
<213> 美洲鲎（Limulus polyphemus）
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aagattattg ttcaccagga ctacaaatac cgttcacaat actacgatat tggtttgatt 360
ttactctcga aaccaatcga atacaactac aaagtacggc ctgtctgtat tcctgagttg 420
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<213> 美洲鲎（Limulus polyphemus）
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<220>
<221> 信号
<222> (1)..(19)
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Asp Ser Gly Thr Tyr Asn Leu Gly Ile Tyr Val Gln Gln Pro Gly Trp
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Asn Ile Asn Trp Ile Lys Ile Thr Lys Val
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<221> 信号肽
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<213> 美洲鲎（Limulus polyphemus）
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attaataaag tctccgttgt cactgccgcc cattgtcttg tgacacagtc tggaaacaga 300
cagaattctt ccattgtcgt aagagttgga gctcatgaca tagacaattc gggcatcgac 360
tatcatgtag ataagattat tgttcaccag gactacaaat accgttcaca atactacgat 420
attggtttga ttttactctc gaaacgaatc gaatataact acaaagtacg gcctgtctgt 480
attcctgagt tgaacaagtt gaacgtgaac ttaaacaata aggaggtcgt tgttattggt 540
tggggtgtta ctgaaagagg tagtgagaaa tataatgttc tacgtgaact ggagttgccc 600
gtagttacaa acgaactgtg caacaagtct tatcaaacca tatcattctc cggcctcaac 660
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cgcctctcga gctacggtaa ctggttccag aaagtcacct ttggatattt actcgctact 900
ttattcgaag ttgtgccagt attttaa 927
<210> 30
<211> 308
<212> PRT
<213> 美洲鲎（Limulus polyphemus）
<220>
<221> 信号
<222> (1)..(24)
<400> 30
Met Lys Thr Thr Leu Trp Thr Phe Phe Ala Leu Ala Met Ala Leu Phe
1 5 10 15
Ser Ile Asn Val Thr Ala Ser Glu Met Ser Val Thr Ser Arg Val Arg
20 25 30
Arg Glu Ile Asn Glu Glu His Cys Gly Ile Arg Pro Thr Ala Pro Arg
35 40 45
Ile Ile Lys Gly Arg Ile Ser Ile Pro His Ser Trp Pro Trp Met Val
50 55 60
Gly Ile Phe Gln Val Asp Pro Leu Leu Phe Ile Cys Gly Gly Thr Ile
65 70 75 80
Ile Asn Lys Val Ser Val Val Thr Ala Ala His Cys Leu Val Thr Gln
85 90 95
Ser Gly Asn Arg Gln Asn Ser Ser Ile Val Val Arg Val Gly Ala His
100 105 110
Asp Ile Asp Asn Ser Gly Ile Asp Tyr His Val Asp Lys Ile Ile Val
115 120 125
His Gln Asp Tyr Lys Tyr Arg Ser Gln Tyr Tyr Asp Ile Gly Leu Ile
130 135 140
Leu Leu Ser Lys Arg Ile Glu Tyr Asn Tyr Lys Val Arg Pro Val Cys
145 150 155 160
Ile Pro Glu Leu Asn Lys Leu Asn Val Asn Leu Asn Asn Lys Glu Val
165 170 175
Val Val Ile Gly Trp Gly Val Thr Glu Arg Gly Ser Glu Lys Tyr Asn
180 185 190
Val Leu Arg Glu Leu Glu Leu Pro Val Val Thr Asn Glu Leu Cys Asn
195 200 205
Lys Ser Tyr Gln Thr Ile Ser Phe Ser Gly Leu Asn Arg Gly Ile Thr
210 215 220
Asp Asp Met Ile Cys Ala Gly Tyr Gln Glu Gly Gly Arg Asp Ser Cys
225 230 235 240
Glu Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Met Tyr His Asp Pro Thr Thr Gly
245 250 255
Arg Val Glu Leu Val Gly Val Val Ser Phe Gly Phe Gly Cys Ala Arg
260 265 270
Pro Asn Phe Pro Gly Val Tyr Thr Arg Leu Ser Ser Tyr Gly Asn Trp
275 280 285
Phe Gln Lys Val Thr Phe Gly Tyr Leu Leu Ala Thr Leu Phe Glu Val
290 295 300
Val Pro Val Phe
305
<210> 31
<211> 927
<212> DNA
<213> 美洲鲎（Limulus polyphemus）
<220>
<221> 信号肽
<222> (1)..(72)
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tatcatgtag ataagattat tgttcaccag gactacaaat accgttcaca atactacgat 420
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<210> 32
<211> 308
<212> PRT
<213> 美洲鲎（Limulus polyphemus）
<220>
<221> 信号
<222> (1)..(24)
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Val Val Ile Gly Trp Gly Val Thr Glu Arg Gly Ser Glu Lys His Asn
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<211> 1944
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 33
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tggatcaaga tcaccaaggt gtaa 1944
<210> 34
<211> 1953
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 34
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<210> 35
<211> 855
<212> DNA
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<220>
<223> 合成的多肽
<400> 35
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gtgcccgtgt tctaa 855
<210> 36
<211> 855
<212> DNA
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<220>
<223> 合成的多肽
<400> 36
atgtccgtga ccagccgcgt gcgtcgtgag atcaacgagg agcattgtgg catccgcccc 60
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成的多肽
<400> 37
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<212> DNA
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<212> DNA
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<220>
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gacgacatga tctgcgctgg ttaccaggag ggtggccgcg actcctgtga gggtgactcc 660
ggtggccccc tgatgtacca cgaccccacc accggtcgtg tggagctggt gggtgtggtg 720
tccttcggct tcggttgcgc tcgccccaac ttccctggcg tgtacacccg cctgtcctcc 780
tacggcaact ggttccagaa ggtgaccttc ggctacctgc tggctaccct gttcgaggtg 840
gtgcccgtgt tcggcgtggc tatgcccggt gctgaggacg acgtggtgca tcaccaccat 900
caccactaa 909
<210> 41
<211> 2007
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<220>
<221> 信号肽
<222> (1)..(63)
<400> 41
atggcaatgt tcctgtgcta cgtggtgctg tacgtgggcg tggctggcat ctactgctcc 60
caggagccca agtggaagct ggtgtggtcc gacgagttca ccaacggcat ctcctccgac 120
tgggagttcg agaccggtaa cggtcccaac ggctggggca acaacgagct gcagtactac 180
cgccgcgaga acacccgcgt ggagggcggc aagctgatca tcaccgctaa ggaggaggac 240
tacgagggct tccgctacac ctccgctaag ctgaagaccc agttcaacaa gccctggaag 300
gacggcaaga tcgaggctcg catgtccatc ccctccttcc gcggtgtgtg ggtggctttc 360
tggatgctgg gcgacatcac cgacaccgac tcctggcctt cctccggtga gatcgacttc 420
gaggagcaca tcaacaccaa caacgaggtg cgcggcacca tccactggtc cacctccgac 480
gacgctgaca ccctgcacgg ccgcggcacc aacaccgact accacatcta ctccgtggag 540
tggaactcct ccgtgatccg ctggttcgtg gacggcaacc agtacttcga ggtgaacatc 600
cagcgcggcg ctaccggtac caacgctttc cacaacaacg tgttcgtgat cctgaacatg 660
gctatcggcg gtaactggcc cggcttcaac gtggctgacg aggctttccc cgctaacatg 720
tacgtggact acgtgcgcgt gtaccaggac gctaacaccc cctcccccgt ggacgtcacc 780
cacctcagcg gctactactt cctccagaac cgccacagcg agctgtacct cgacgtgtcc 840
ggcagctcca acgaggacgg tgctttcctg cagcagtggc cctactccgg taatgccaat 900
cagcagttcg acttcgtgca cctgggcaac aaggtgtaca agatcatcaa caagaactcc 960
ggtaagagcc tggacgtgta cgaactgggc accgacaacg gcgtgcgcat ccagcaatgg 1020
tcctacggtg gcggctacaa ccaacagttc attgtccagg acgtgggtga cggctactac 1080
aagatcttcg ctcgcagcac tggcaagctg gtggaggtgg ccgacctcaa caaggacccc 1140
ggtggcaaga tccagcagtg gagcgacgac ggccaactct ccggccagtg gaaactgatc 1200
cgcaacaagg ccaacagcaa gctgatccag gccgagagct acttcgcctc ctccaaagtg 1260
cagctggagg acacttccga cgtgggcggt ggcaagaatg tgaagtgcga caacgagggc 1320
gcctggatgg cctacaagga catcaacttc ccctccagcg gtacctacca ggtggagtac 1380
cgcgtggcta gcgagcgcgc tggtggtatg ctgtccctgg acctgaacgc tggctccatc 1440
gtgctgggta tgctcaacgt gccctccacc ggtggtctgc agaagtggac caccatctcc 1500
cacaccgtca acgtgtcctc cggcacctac aatctgggta tcagcgtgca gcgccccggc 1560
tggaacatca actggatcaa catcactaaa gtcagctccc agctgaagtc cattccttcc 1620
accaactccc gcgtgatcca agctgagtcc tacttcgact cctccaaggt gcaactggag 1680
gatacctccg atgtgggtgg cggcaagaac gtcaagtgcg acactaaggg cgcctggatg 1740
gcttacaagg acatcaactt cccctcctcc ggttcctacc agatcgagta ccgcgtggct 1800
tccgagcgtg ctggtggcaa gctgtccctg gacctgaacg ctggctccat cgtgctgggt 1860
atgctggacg tgccttccac cggcggttgg cagaagtgga ccaccatctc ccacaccgtg 1920
aaggtggact ccggcaccta caacctgggc atctacgtgc agcagcccgg ctggaacatc 1980
aactggatca agatcaccaa ggtgtaa 2007
<210> 42
<211> 2019
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<220>
<221> 信号肽
<222> (1)..(66)
<400> 42
atggcaatgt tcctgtgcta cgtggtgctg gtggtgggcg tgaccggcat ctgctgctcc 60
caggagacca actggaagct ggtgtggtcc gacgagttca ccaacggcat ctcctccgac 120
tgggagttcg agaccggtaa cggtcccaac ggctggggca acaacgagct gcagtactac 180
cgccgcgaga acgctcgcgt ggagggcggc aagctgatca tcaccgctaa gaaggaggac 240
tacgagggct tccgctacac ctccgctaag ctgaagaccc agttcaacaa gccctggaag 300
gacggcaaga tcgaggctcg catgtccatc ccctccttcc gcggtgtgtg ggtggctttc 360
tggatgctgg gcgacatcac cgacaccgac tcctggcctt cctccggtga gatcgacttc 420
aaggagcaca tcaacaccaa caacgaggtg cgcggcacca tccactggtc cacctccgac 480
ggcgctcaca cccaccacgg ccgcggcacc aacaccgact accacatcta ctccgtggag 540
tggaactcct ccgtgatccg ctggttcgtg gacggcaacc agtacttcga ggtgaacatc 600
cagcgcggcg ctaccggtac caacgctttc cacaacaagg tgttcgtgat cctgaacatg 660
gctatcggcg gtaactggcc cggcttcaac gtggctgacg aggctttccc cgctaacatg 720
tacgtggact acgtgcgcgt gtaccaggac gctaacaccc cctcccccgt ggacgtcgat 780
gtgactgacc tgagcggcta ctacttcctc cagaaccgcc actccgagct gtacctggac 840
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cagatgccct atcgcggcag ctacaaccaa caattcatcg tgcaggacgt cggtgacggc 1080
tactacaaga tcttcgcccg taacagccgc aaactggtgg aggtcgccga tttcaacaag 1140
gaccccggcg gcaagatcca gcagtggagc gatgacggtc agattagcgg tcagtggaag 1200
ctgatccgca acaaagtcaa ctccaaagtg atccaggctg aaagctactt cgcttccctc 1260
ggcgtccagc tggaagatac cagcgatgtg ggcggcggca agaacgtgaa gtgcgatacc 1320
gagggcgctt ggatggccta caaggacatc aacttccctt cctccggttc ctaccaggtg 1380
gagtaccgtg tcgcttccga acgcgctggc ggtaagctgt ccctggacct gaacgctggc 1440
tccatcgtgc tgggcatgct gaacgtgcct tccactggcg gctggcagaa gtggaccacc 1500
atcagccaca ccgtcaaggt ggatagcggc acctacaacc tgggtatcta cgtccagcgt 1560
cctcgttgga acatcaactg gatcaagatc accgaggccc ccggtcagag caagcccatc 1620
cagcgtagcg acaccgacag caaggtgatc caggccgaga gctatttcgc ctcctccaag 1680
gtgcaactcg aagacacctc cgacgtgggc ggcggtaaga acgtcaagtg cgataacgag 1740
ggcgcctgga tggcttacaa ggacatcaac ttcccctcct ccggttccta ccagatcgag 1800
taccgcgtgg cttccgagcg tgctggtggc aagctgtccc tggacctgaa cgctggctcc 1860
atcgtgctgg gtatgctgga cgtgccttcc accggcggtt ggcagaagtg gaccaccatc 1920
tcccacaccg tgaacgtgtc ctccggcacc tacaacctgg gtatctacgt gcagcgcgcc 1980
gcctggaaca tcaactggat caagatcacc aaggtgtaa 2019
<210> 43
<211> 933
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<220>
<221> 信号肽
<222> (1)..(78)
<400> 43
atggcaatga agaccaccct gtggaccttc ttcgccctgg ctatggccct gttctccatt 60
aacgtgaccg ccagcgagat gtccgtgact agccgcgtgc gccgcgagat caacgaggag 120
cactgcggta tccgccccac tgctcctcgc atcatcaagg gccgcatctc catccctcac 180
tcctggcctt ggatggtggg catcttccag gtggaccccc tgctgttcat ctgcggcggc 240
accatcatca acaaggtgtc cgtcgtgacc gctgctcact gcctggtgac tcagtccggt 300
aaccgccaga actcctccat tgtcgtccgc gtgggtgccc acgacatcga taacagcggt 360
atcgactacc acgtggacaa gatcatcgtc caccaggatt acaagtaccg ctcccaatac 420
tacgacatcg gtctgatcct gctctccaag cgcatcgaat acaactacaa ggtgcgcccc 480
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atcggctggg gtgtgaccga acgtggtagc gagaagcaca acgtgctgcg cgagctggag 600
ctccctgtgg tgaccaacga gctctgcaac aagtcctacc agaccatcag cttcagcggc 660
ctcaaccgcg gcatcaccga tgacatgatc tgcgctggct accaggaggg cggtcgcgat 720
agctgcgagg gtgactccgg tggtcccctg atgtaccacg accctaccac cggtcgtgtc 780
gagctggtcg gtgtggtgtc cttcggcttc ggctgtgctc gccccaactt ccctggcgtg 840
tacactcgtc tgtcctccta cggcaactgg ttccaaaagg tgaccttcgg ctacctgctg 900
gctactctgt tcgaggtcgt gcccgtgttc taa 933
<210> 44
<211> 933
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<220>
<221> 信号肽
<222> (1)..(78)
<400> 44
atggcaatga agactaccct gtggaccttc ttcgctctgg ctatggctct gttctccatt 60
aacgtgaccg ctagcgagat gtccgtgacc agccgcgtgc gtcgtgagat caacgaggag 120
cattgtggca tccgccccac tgccccccgt atcatcaagg gtcgcatctc catcccccac 180
agctggccct ggatggtggg tattttccag gtcgaccctc tgctgttcat ctgcggcggt 240
accatcatca acaaagtgtc cgtggtgacc gccgctcact gtctggtgac tcagtccggc 300
aaccgccaga actcctccat cgtggtgcgt gtgggtgctc acgacatcga caacagcggc 360
atcgactacc acgtcgacaa gatcatcgtg caccaggact acaaataccg cagccagtac 420
tacgacatcg gtctcatcct gctgagcaag cccatcgaat acaactacaa ggtccgcccc 480
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atcggctggg gtgtgactga gcgcggttcc gagaagtaca acgtgctgcg cgaactggag 600
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tcctgtgagg gtgacagcgg tggtcctctg atgtaccacg accccactac cggccgtgtc 780
gaactggtcg gcgtggtctc cttcggtttc ggctgcgctc gtcccaactt ccctggcgtg 840
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gctaccctgt tcgaggtggt gcccgtgttc taa 933
<210> 45
<211> 933
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<220>
<221> 信号肽
<222> (1)..(78)
<400> 45
atggcaatga agaccaccct gtggaccttc ttcgctctgg ctatggctct gttctccatc 60
aacgtgaccg cttccgagat gtccgtgacc tcccgtgtgc gccgcgagat caacgaggag 120
cactgcggta tccgtcctac cgctccccgc atcatcaagg gtcgcatctc catcccccac 180
tcctggccct ggatggtggg catcttccag gtggaccccc tgctgttcat ctgcggcggc 240
accatcatca acaaggtgtc cgtggtgacc gctgctcact gcctggtgac ccagtccggc 300
aaccgccaga actactccat cgtggtgcgc gtgggcgctc acgacatcga caactccggc 360
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ctgcccgtgg tgaccaacga gctgtgcaac aagtcctacc agaccatctc cttctccggc 660
ctgaaccgcg gcatcaccga cgacatgatc tgcgctggct accaggaggg tggtcgcgac 720
tcctgcgaag gtgactccgg tggccccctg atgtaccacg accccaccac cggcggtgtg 780
gagctggtgg gcgtggtgtc cttcggcttc ggttgcgctc gccccaactt ccccggtgtg 840
tacacccgcc tgtcctccta cggcaactgg ttccagaagg tgaccttcgg ctacctgctg 900
gctaccctgt tcgaggtggt gcccgtgttc taa 933
<210> 46
<211> 933
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<220>
<221> 信号肽
<222> (1)..(78)
<400> 46
atggcaatga agaccaccct gtggaccttc ttcgctctgg ctatggctct gttctccatc 60
aacgtgaccg cttccgagat gtccgtgacc tcccgtgtgc gccgcgagat caacgaggag 120
cactgcggta tccgtcctac cgctccccgc atcatcaagg gtcgcatctc catcccccac 180
tcctggccct ggatggtggg catcttccag gtggaccccc tgctgttcat ctgcggcggc 240
accatcatca acaaggtgtc cgtggtgacc gctgctcact gcctggtgac ccagtccggc 300
aaccgccaga actactccat cgtggtgcgc gtgggcgctc acgacatcga caactccggc 360
atcgactacc acgtggacaa gatcatcgtg caccaggact acaagtaccg ctcccagtac 420
tacgacatcg gcctgatcct gctgtccaag cctatcgagt acaactacaa ggtgcgcccc 480
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atcggttggg gcgtgaccga gcgtggttcc gagaagtaca acgtgctgcg cgaactggag 600
ctgcccgtgg tgaccaacga gctgtgcaac aagtcctacc agaccatctc cttctccggc 660
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tcctgcgaag gtgactccgg tggccccctg atgtaccacg accccaccac cggccgtgtg 780
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gctaccctgt tcgaggtggt gcccgtgttc taa 933
<210> 47
<211> 933
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<220>
<221> 信号肽
<222> (1)..(78)
<400> 47
atggcaatga agaccaccct gtggaccttc ttcgctctgg ctatggctct gttctccatc 60
aacgtgaccg cttccgagat gtccgtgacc tcccgtgtgc gccgcgagat caacgaggag 120
cactgcggta tccgtcctac cgctccccgc atcatcaagg gtcgcatctc catcccccac 180
tcctggccct ggatggtggg catcttccag gtggaccccc tgctgttcat ctgcggcggc 240
accatcatca acaaggtgtc cgtggtgacc gctgctcact gcctggtgac ccagtccggc 300
aaccgccaga actcctccat cgtggtgcgc gtgggcgctc acgacatcga caactccggc 360
atcgactacc acgtggacaa gatcatcgtg caccaggact acaagtaccg ctcccagtac 420
tacgacatcg gcctgatcct gctgtccaag cgtatcgagt acaactacaa ggtgcgcccc 480
gtgtgcatcc ccgagctgaa caagctgaac gtgaacctga acaacaagga ggtggtggtg 540
atcggttggg gcgtgaccga gcgtggttcc gagaagtaca acgtgctgcg cgaactggag 600
ctgcccgtgg tgaccaacga gctgtgcaac aagtcctacc agaccatctc cttctccggc 660
ctgaaccgcg gcatcaccga cgacatgatc tgcgctggct accaggaggg tggtcgcgac 720
tcctgcgaag gtgactccgg tggccccctg atgtaccacg accccaccac cggccgtgtg 780
gagctggtgg gcgtggtgtc cttcggcttc ggttgcgctc gccccaactt ccccggtgtg 840
tacacccgcc tgtcctccta cggcaactgg ttccagaagg tgaccttcgg ctacctgctg 900
gctaccctgt tcgaggtggt gcccgtgttc taa 933
<210> 48
<211> 933
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<220>
<221> 信号肽
<222> (1)..(78)
<400> 48
atggcaatga agaccaccct gtggaccttc ttcgctctgg ctatggctct gttctccatc 60
aacgtgaccg cttccgagat gtccgtgacc tcccgtgtgc gccgcgagat caacgaggag 120
cactgcggta tccgtcctac cgctccccgc atcatcaagg gtcgcatctc catcccccac 180
tcctggccct ggatggtggg catcttccag gtggatcccc tgctgttcat ctgcggcggc 240
accatcatca acaaggtgtc cgtggtgacc gctgctcact gcctggtgac ccagtccggc 300
aaccgccaga actactccat cgtggtgcgc gtgggcgctc acgacatcga caactccggc 360
atcgactacc acgtggacaa gatcatcgtg caccaggact acaagtaccg ctcccagtac 420
tacgacatcg gcctgatcct gctgtccaag cctatcgagt acaactacaa ggtgcgcccc 480
gtgtgcatcc ccgagctgaa caagctgaac gtgaacctga acaacaagga ggtggtggtg 540
atcggctggg gcgtgaccga acgtggttcc gagaagcaca acgtgctgcg cgaactggag 600
ctgcccgtgg tgaccaacga gctgtgcaac aagtcctacc agaccatctc cttctccggc 660
ctgaaccgcg gcatcaccga cgacatgatc tgcgctggtt accaggaggg tggccgcgac 720
tcctgtgagg gtgactccgg tggccccctg atgtaccacg accccaccac cggtcgtgtg 780
gagctggtgg gtgtggtgtc cttcggcttc ggttgcgctc gccccaactt ccctggcgtg 840
tacacccgcc tgtcctccta cggcaactgg ttccagaagg tgaccttcgg ctacctgctg 900
gctaccctgt tcgaggtggt gcccgtgttc taa 933
<210> 49
<211> 2007
<212> DNA
<213> 美洲鲎（Limulus polyphemus）
<400> 49
atgttggtgt tgctgtgttg tgttgttttg catgttggtg ttgcaagaat ttgctgtagc 60
caggaaccaa aatggaagct cgtctggtcg gatgaattta ccaatggaat cagttcagat 120
tgggaattcg aaacgggcaa tggccccaac ggttggggca ataacgaact gcaatattat 180
cgtcgtgaaa atacccgagt tgagggcggg aaattaataa ttacagctaa agaagaagat 240
tatgagggtt tcaggtacac ttctgccaag ctgaaaaccc agttcaataa accttggaaa 300
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tggatgttag gagacatcac cgatactgat agctggccct cttccggtga aattgacttt 420
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gctattggtg gaaactggcc aggattcaat gttgctgatg aggctttccc tgctaacatg 720
tatgtagatt atgtccgtgt atatcaggat gccaatacac cttctcctgt tgacgttact 780
catttatctg gttactattt tcttcaaaat aggcacagtg aactgtatct tgatgtcagt 840
ggttccagta acgaagatgg agcatttcta caacaatggc cttatagcgg taatgctaac 900
caacagtttg attttgtaca tctcggaaat aaggtttata aaattatcaa taaaaatagt 960
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tcgtatggag ggggctacaa tcagcagttt attgtacaag atgttggaga tggttattat 1080
aagatatttg cacgcagcac tggaaagtta gtggaagtag cagatttgaa taaagaccca 1140
ggaggaaaga tacaacaatg gtctgatgat ggccaattat ccggacagtg gaaacttatt 1200
cgaaataaag ctaattctaa attgattcag gcagaaagtt attttgctag ttcaaaagta 1260
caattggaag atacctcgga tgtaggaggc gggaagaatg tcaagtgtga taatgaagga 1320
gcctggatgg cttacaagga tatcaatttc ccaagttcag gtacttatca agtagagtac 1380
agagtggcaa gtgaacgtgc aggaggaatg ttgtctctgg atttgaatgc aggttctata 1440
gtgcttggca tgctgaatgt tccttcaact ggaggattgc agaagtggac caccatttcc 1500
cacacagtga atgtaagttc aggtacgtac aacttgggga tcagtgttca acgacccggg 1560
tggaatatca actggattaa tattacaaaa gtatccagtc agttgaaatc tattccaagt 1620
actaattcta gagtaattca ggcagaaagt tatttcgata gttcaaaagt acaattggaa 1680
gacacctcgg atgttggagg cgggaagaat gttaagtgtg atactaaagg agcctggatg 1740
gcctacaagg atatcaattt tcccagttca ggtagttatc aaatagagta cagagtggca 1800
agtgaacgtg caggaggaaa gttgtctctc gatttgaatg caggttctat agtgcttgga 1860
atgctggatg ttccttcaac tgggggatgg cagaagtgga ccaccatttc ccatacagta 1920
aaggtggatt caggtactta taacttgggg atctacgttc aacaacccgg gtggaatatc 1980
aactggatta agattacaaa ggtttag 2007
<210> 50
<211> 668
<212> PRT
<213> 美洲鲎（Limulus polyphemus）
<400> 50
Met Leu Val Leu Leu Cys Cys Val Val Leu His Val Gly Val Ala Arg
1 5 10 15
Ile Cys Cys Ser Gln Glu Pro Lys Trp Lys Leu Val Trp Ser Asp Glu
20 25 30
Phe Thr Asn Gly Ile Ser Ser Asp Trp Glu Phe Glu Thr Gly Asn Gly
35 40 45
Pro Asn Gly Trp Gly Asn Asn Glu Leu Gln Tyr Tyr Arg Arg Glu Asn
50 55 60
Thr Arg Val Glu Gly Gly Lys Leu Ile Ile Thr Ala Lys Glu Glu Asp
65 70 75 80
Tyr Glu Gly Phe Arg Tyr Thr Ser Ala Lys Leu Lys Thr Gln Phe Asn
85 90 95
Lys Pro Trp Lys Asp Gly Lys Ile Glu Ala Arg Met Ser Ile Pro Ser
100 105 110
Phe Arg Gly Val Trp Val Ala Phe Trp Met Leu Gly Asp Ile Thr Asp
115 120 125
Thr Asp Ser Trp Pro Ser Ser Gly Glu Ile Asp Phe Glu Glu His Ile
130 135 140
Asn Thr Asn Asn Glu Val Arg Gly Thr Ile His Trp Ser Thr Ser Asp
145 150 155 160
Asp Ala Asp Thr Leu His Gly Arg Gly Thr Asn Thr Asp Tyr His Ile
165 170 175
Tyr Ser Val Glu Trp Asn Ser Ser Val Ile Arg Trp Phe Val Asp Gly
180 185 190
Asn Gln Tyr Phe Asp Val Asn Ile Gln Arg Gly Ala Thr Gly Thr Asn
195 200 205
Ala Phe His Asn Asn Val Phe Val Ile Leu Asn Met Ala Ile Gly Gly
210 215 220
Asn Trp Pro Gly Phe Asn Val Ala Asp Glu Ala Phe Pro Ala Asn Met
225 230 235 240
Tyr Val Asp Tyr Val Arg Val Tyr Gln Asp Ala Asn Thr Pro Ser Pro
245 250 255
Val Asp Val Thr His Leu Ser Gly Tyr Tyr Phe Leu Gln Asn Arg His
260 265 270
Ser Glu Leu Tyr Leu Asp Val Ser Gly Ser Ser Asn Glu Asp Gly Ala
275 280 285
Phe Leu Gln Gln Trp Pro Tyr Ser Gly Asn Ala Asn Gln Gln Phe Asp
290 295 300
Phe Val His Leu Gly Asn Lys Val Tyr Lys Ile Ile Asn Lys Asn Ser
305 310 315 320
Gly Lys Ser Leu Asp Val Tyr Glu Leu Gly Thr Asp Asn Gly Val Arg
325 330 335
Ile Gln Gln Trp Ser Tyr Gly Gly Gly Tyr Asn Gln Gln Phe Ile Val
340 345 350
Gln Asp Val Gly Asp Gly Tyr Tyr Lys Ile Phe Ala Arg Ser Thr Gly
355 360 365
Lys Leu Val Glu Val Ala Asp Leu Asn Lys Asp Pro Gly Gly Lys Ile
370 375 380
Gln Gln Trp Ser Asp Asp Gly Gln Leu Ser Gly Gln Trp Lys Leu Ile
385 390 395 400
Arg Asn Lys Ala Asn Ser Lys Leu Ile Gln Ala Glu Ser Tyr Phe Ala
405 410 415
Ser Ser Lys Val Gln Leu Glu Asp Thr Ser Asp Val Gly Gly Gly Lys
420 425 430
Asn Val Lys Cys Asp Asn Glu Gly Ala Trp Met Ala Tyr Lys Asp Ile
435 440 445
Asn Phe Pro Ser Ser Gly Thr Tyr Gln Val Glu Tyr Arg Val Ala Ser
450 455 460
Glu Arg Ala Gly Gly Met Leu Ser Leu Asp Leu Asn Ala Gly Ser Ile
465 470 475 480
Val Leu Gly Met Leu Asn Val Pro Ser Thr Gly Gly Leu Gln Lys Trp
485 490 495
Thr Thr Ile Ser His Thr Val Asn Val Ser Ser Gly Thr Tyr Asn Leu
500 505 510
Gly Ile Ser Val Gln Arg Pro Gly Trp Asn Ile Asn Trp Ile Asn Ile
515 520 525
Thr Lys Val Ser Ser Gln Leu Lys Ser Ile Pro Ser Thr Asn Ser Arg
530 535 540
Val Ile Gln Ala Glu Ser Tyr Phe Asp Ser Ser Lys Val Gln Leu Glu
545 550 555 560
Asp Thr Ser Asp Val Gly Gly Gly Lys Asn Val Lys Cys Asp Thr Lys
565 570 575
Gly Ala Trp Met Ala Tyr Lys Asp Ile Asn Phe Pro Ser Ser Gly Ser
580 585 590
Tyr Gln Ile Glu Tyr Arg Val Ala Ser Glu Arg Ala Gly Gly Lys Leu
595 600 605
Ser Leu Asp Leu Asn Ala Gly Ser Ile Val Leu Gly Met Leu Asp Val
610 615 620
Pro Ser Thr Gly Gly Trp Gln Lys Trp Thr Thr Ile Ser His Thr Val
625 630 635 640
Lys Val Asp Ser Gly Thr Tyr Asn Leu Gly Ile Tyr Val Gln Gln Pro
645 650 655
Gly Trp Asn Ile Asn Trp Ile Lys Ile Thr Lys Val
660 665
<210> 51
<211> 2022
<212> DNA
<213> 中华鲎（Tachypleus tridentatus）
<400> 51
atgttggtgt tgctgtgttg tgttgttttg catgttggtg ttgcaagaat ttgctgtagc 60
cacgaaccaa agtggcagct cgtctggtcg gatgaattta ccaatggaat aagttctgat 120
tgggaatttg aaatgggcaa tggcctcaat ggttggggta ataacgaact gcaatattat 180
cgtcgtgaaa atgcccaagt tgagggaggg aaactggtaa ttactgctaa aagagaagac 240
tatgatggct tcaaatacac ttctgctagg ctgaaaaccc agtttgataa atcttggaag 300
tatggtaaaa ttgaagccaa aatggcgatt ccatcatttc ggggagtctg ggtgatgttc 360
tggatgtcag gagacaacac taattatgtt agatggccat cttctggtga aattgacttt 420
attgaacata gaaacactaa caatgaaaaa gtcagaggaa ctattcactg gtccactcct 480
gacggtgctc atgcgcatca taacagagaa agtaatacaa atgggattga ttatcacatt 540
tattctgtag agtggaattc ttccattgtt aaatggtttg ttaatggaaa tcaatacttt 600
gaagtgaaaa ttcagggagg agtaaatggg aaaagtgcat ttcgtaacaa agttttcgtt 660
attttaaaca tggcgattgg tggaaactgg ccaggattcg atgttgctga cgaggctttc 720
cctgctaaaa tgtacattga ttatgtccgt gtataccagg atgccagtac atcttctcct 780
gttggggata cctctttaga tggttactat tttgtccaaa acaggcacag tgaattgtat 840
cttgatgtca ctgatgccag taacgaagat ggagcatttc tgcaacaatg gtcttatagt 900
ggtaatgaga accaacagtt tgattttgag catctcgaaa ataatgttta taaaattact 960
aataaaaaaa gtggaaaatc tttggatgtt tataattttg ggactgagaa tggtgttaga 1020
atccaacagt ggtcatatgg aggggctcgc aatcagcagt ttactgtaca aagtgttggt 1080
gatggttatt ataagattat tccacgcggc agtggaaagt tagtggaagt agcagatttt 1140
agtaaagatg caggagggaa gatacaacaa tggtctgata acaaccaatt atctggacag 1200
tggaaactta ttaaaagtaa aagttattct aaattaattc aggcagaaag ttattttgat 1260
tcctcaaaag tacaattgga agatacctca gatgtaggag gtgggaagaa tgttaaatgt 1320
gataatgaag gagcctggat ggcttataag gatattgatt tccccagttc aggtaattat 1380
cgaatagaat acagagtagc aagtgaacgt gcaggaggaa agctgtctct ggatttgaat 1440
gcaggctcta tagttcttgg catgctggat gttccttcaa caggaggatg gcagaagtgg 1500
accaccattt cccatacagt gaatgtggat tcaggtacat ataacttggg gatctatgtt 1560
caacgagcca gctggaatat caactggata aagattacaa aaatacctga acagtcaaat 1620
ttgaatcaag ggcgtcgtaa ttctaaatta attcaggcag aaagttattt tagttactca 1680
gaagtacaac tggaagatac cttagatgta ggaggtggaa agaatgttaa atgtgataaa 1740
gaaggggcct ggatggctta caaggatatt gatttcccca gttcaggaag ttatcgagta 1800
gaatacagag tggcaagtga acgtgcagga ggaaagctgt ccctagattt gaatgcaggc 1860
tctatagtgc ttggcatgct ggatattcct tcaacaggag gattgcagaa gtggaccacc 1920
atttctcata tagtgaatgt ggatttaggt acatataact tgggaattta tgttcaaaaa 1980
gccagttgga atatcaattg gattagaatt acaaaagtgt ag 2022
<210> 52
<211> 673
<212> PRT
<213> 中华鲎（Tachypleus tridentatus）
<400> 52
Met Leu Val Leu Leu Cys Cys Val Val Leu His Val Gly Val Ala Arg
1 5 10 15
Ile Cys Cys Ser His Glu Pro Lys Trp Gln Leu Val Trp Ser Asp Glu
20 25 30
Phe Thr Asn Gly Ile Ser Ser Asp Trp Glu Phe Glu Met Gly Asn Gly
35 40 45
Leu Asn Gly Trp Gly Asn Asn Glu Leu Gln Tyr Tyr Arg Arg Glu Asn
50 55 60
Ala Gln Val Glu Gly Gly Lys Leu Val Ile Thr Ala Lys Arg Glu Asp
65 70 75 80
Tyr Asp Gly Phe Lys Tyr Thr Ser Ala Arg Leu Lys Thr Gln Phe Asp
85 90 95
Lys Ser Trp Lys Tyr Gly Lys Ile Glu Ala Lys Met Ala Ile Pro Ser
100 105 110
Phe Arg Gly Val Trp Val Met Phe Trp Met Ser Gly Asp Asn Thr Asn
115 120 125
Tyr Val Arg Trp Pro Ser Ser Gly Glu Ile Asp Phe Ile Glu His Arg
130 135 140
Asn Thr Asn Asn Glu Lys Val Arg Gly Thr Ile His Trp Ser Thr Pro
145 150 155 160
Asp Gly Ala His Ala His His Asn Arg Glu Ser Asn Thr Asn Gly Ile
165 170 175
Asp Tyr His Ile Tyr Ser Val Glu Trp Asn Ser Ser Ile Val Lys Trp
180 185 190
Phe Val Asn Gly Asn Gln Tyr Phe Glu Val Lys Ile Gln Gly Gly Val
195 200 205
Asn Gly Lys Ser Ala Phe Arg Asn Lys Val Phe Val Ile Leu Asn Met
210 215 220
Ala Ile Gly Gly Asn Trp Pro Gly Phe Asp Val Ala Asp Glu Ala Phe
225 230 235 240
Pro Ala Lys Met Tyr Ile Asp Tyr Val Arg Val Tyr Gln Asp Ala Ser
245 250 255
Thr Ser Ser Pro Val Gly Asp Thr Ser Leu Asp Gly Tyr Tyr Phe Val
260 265 270
Gln Asn Arg His Ser Glu Leu Tyr Leu Asp Val Thr Asp Ala Ser Asn
275 280 285
Glu Asp Gly Ala Phe Leu Gln Gln Trp Ser Tyr Ser Gly Asn Glu Asn
290 295 300
Gln Gln Phe Asp Phe Glu His Leu Glu Asn Asn Val Tyr Lys Ile Thr
305 310 315 320
Asn Lys Lys Ser Gly Lys Ser Leu Asp Val Tyr Asn Phe Gly Thr Glu
325 330 335
Asn Gly Val Arg Ile Gln Gln Trp Ser Tyr Gly Gly Ala Arg Asn Gln
340 345 350
Gln Phe Thr Val Gln Ser Val Gly Asp Gly Tyr Tyr Lys Ile Ile Pro
355 360 365
Arg Gly Ser Gly Lys Leu Val Glu Val Ala Asp Phe Ser Lys Asp Ala
370 375 380
Gly Gly Lys Ile Gln Gln Trp Ser Asp Asn Asn Gln Leu Ser Gly Gln
385 390 395 400
Trp Lys Leu Ile Lys Ser Lys Ser Tyr Ser Lys Leu Ile Gln Ala Glu
405 410 415
Ser Tyr Phe Asp Ser Ser Lys Val Gln Leu Glu Asp Thr Ser Asp Val
420 425 430
Gly Gly Gly Lys Asn Val Lys Cys Asp Asn Glu Gly Ala Trp Met Ala
435 440 445
Tyr Lys Asp Ile Asp Phe Pro Ser Ser Gly Asn Tyr Arg Ile Glu Tyr
450 455 460
Arg Val Ala Ser Glu Arg Ala Gly Gly Lys Leu Ser Leu Asp Leu Asn
465 470 475 480
Ala Gly Ser Ile Val Leu Gly Met Leu Asp Val Pro Ser Thr Gly Gly
485 490 495
Trp Gln Lys Trp Thr Thr Ile Ser His Thr Val Asn Val Asp Ser Gly
500 505 510
Thr Tyr Asn Leu Gly Ile Tyr Val Gln Arg Ala Ser Trp Asn Ile Asn
515 520 525
Trp Ile Lys Ile Thr Lys Ile Pro Glu Gln Ser Asn Leu Asn Gln Gly
530 535 540
Arg Arg Asn Ser Lys Leu Ile Gln Ala Glu Ser Tyr Phe Ser Tyr Ser
545 550 555 560
Glu Val Gln Leu Glu Asp Thr Leu Asp Val Gly Gly Gly Lys Asn Val
565 570 575
Lys Cys Asp Lys Glu Gly Ala Trp Met Ala Tyr Lys Asp Ile Asp Phe
580 585 590
Pro Ser Ser Gly Ser Tyr Arg Val Glu Tyr Arg Val Ala Ser Glu Arg
595 600 605
Ala Gly Gly Lys Leu Ser Leu Asp Leu Asn Ala Gly Ser Ile Val Leu
610 615 620
Gly Met Leu Asp Ile Pro Ser Thr Gly Gly Leu Gln Lys Trp Thr Thr
625 630 635 640
Ile Ser His Ile Val Asn Val Asp Leu Gly Thr Tyr Asn Leu Gly Ile
645 650 655
Tyr Val Gln Lys Ala Ser Trp Asn Ile Asn Trp Ile Arg Ile Thr Lys
660 665 670
Val
<210> 53
<211> 1465
<212> DNA
<213> 美洲鲎（Limulus polyphemus）
<400> 53
ctggaatgag gctatacata tagaatttgc acggctgtct cgccaacgtc acacgcatgc 60
ctactacccg gatgaaattt ggacaggaat gagatttcat agcacagcgg catggtacag 120
agttcggtga agaaggcaaa taaattcact gtataatctc ctaaattgaa atgtttctgt 180
gttatgttgt tttgtatgtt ggtgtcgcag gaatctactg tagccaggaa ccaaaatgga 240
agctcgtctg gtcggatgaa tttaccaatg gaatcagttc agattgggaa ttcgaaacgg 300
gcaatggccc caacggttgg ggcaataacg aactgcaata ttatcgtcgt gaaaataccc 360
gagttgaggg cgggaaatta ataattacag ctaaaaaaga agattatgag ggtttcaggt 420
acacttctgc caagctgaaa acccagttca ataaaccttg gaaagatggt aaaattgaag 480
ccagaatgtc gattccatca tttcgggggg tctgggtggc gttctggatg ttaggagaca 540
tcaccgatac tgatagctgg ccctcttccg gtgaaattga ctttaaggaa catataaata 600
ccaacaatga agttagagga actattcact ggtctacttc tgatgacgct gatacacttc 660
atggcagagg aaccaatact gactatcaca tttattctgt agagtggaat tcttccgtta 720
ttagatggtt tgttgatgga aatcagtact ttgaggtgaa tattcagaga ggagcaactg 780
gaacaaacgc atttcataac aaagttttcg ttattttaaa catggctatt ggtggaaact 840
ggccaggatt caatgttgct gatgaggctt tccctgctaa catgtatgta gattatgtcc 900
gtgtatatca ggatgccaat acaccttctc ctgttgacgt tgacgttact gatttatctg 960
gttactattt tcttcaaaat aggcacagtg aactgtatct tgatgtcagt ttctccagta 1020
acaaagatgg agcatttcta caacaatggc cttataacgg taatgctaac caacagtttg 1080
attttgtaca tctcggaaat aatatatata aaattaccaa taaaaatagt ggaaaatctc 1140
tggatgtcta caatgtaggg actgaaaatg gtgtcagaat tcaacagatg ccgtatagag 1200
ggagctacaa tcagcagttt attgtacaag atgttggaga tggttattat aagatatttg 1260
cacgcaacag cagaaagtta gtggaagtag cagatttcaa taaagaccca ggaggaaaaa 1320
tacaacaatg gtctgatgat ggccaattat ccggacagtg gaaacttatt cgaaataaag 1380
ctaattctaa agtaattcag gcagaaagtt attttgctag ttcaaaagta caattggaag 1440
atacctcgga tgtaggaggc gggaa 1465
<210> 54
<211> 1459
<212> DNA
<213> 美洲鲎（Limulus polyphemus）
<400> 54
ctggaatgag gctatacata tagaatttgc acggctgtct cgccaacgtc acacgcatgc 60
ctactacccg gatgaaattt ggacaggaat gagatttcat agcacagcgg catggtacag 120
agttcggtga agaaggcaaa taaattcact gtataatctc ctaaattgaa atgtttctgt 180
gttatgttgt tttgtatgtt ggtgtcgcag gaatctactg tagccaggaa ccaaaatgga 240
agctcgtctg gtcggatgaa tttaccaatg gaatcagttc agattgggaa ttcgaaacgg 300
gcaatggccc caacggttgg ggcaataacg aactgcaata ttatcgtcgt gaaaataccc 360
gagttgaggg cgggaaatta ataattacag ctaaaaaaga agattatgag ggtttcaggt 420
acacttctgc caagctgaaa acccagttca ataaaccttg gaaagatggt aaaattgaag 480
ccagaatgtc gattccatca tttcgggggg tctgggtggc gttctggatg ttaggagaca 540
tcaccgatac tgatagctgg ccctcttccg gtgaaattga ctttaaggaa catataaata 600
ccaacaatga agttagagga actattcact ggtctacttc tgatgacgct gatacacttc 660
atggcagagg aaccaatact gactatcaca tttattctgt agagtggaat tcttccgtta 720
ttagatggtt tgttgatgga aatcagtact ttgaggtgaa tattcagaga ggagcaactg 780
gaacaaacgc atttcataat aacgttttcg ttattttaaa catggctatt ggtggaaact 840
ggccaggatt caatgttgct gatgaggctt tccctgctaa catgtatgta gattatgtcc 900
gtgtatatca ggatgccaat acaccttctc ctgttgacgt tactcattta tctggttact 960
attttcttca aaataggcac agtgaactgt atcttgatgt cagtggttcc agtaacgaag 1020
atggagcatt tctacaacaa tggccttata acggtaatgc taaccaacag tttgattttg 1080
tacatctcgg aaataaggtt tataaaatta tcaataaaaa tagtggaaaa tctctggatg 1140
tttacgagtt agggactgat aatggtgtca gaatccaaca gtggtcgtat ggagggggct 1200
acaatcagca gtttattgta caagatgttg gagatggtta ttataagata tttgcacgca 1260
gcactggaaa gttagtggaa gtagcagatt tgaataaaga cccaggagga aagatacaac 1320
aatggtctga tgatggccaa ttatccggac agtggaaact tattcgaaat aaagctaatt 1380
ctaaattgat tcaggcagaa agttattttg ctagttcaaa agtacaattg gaagatacct 1440
cggatgtagg aggcgggaa 1459
<210> 55
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引物
<400> 55
gattacgcca agcttgccag aatgtcgatt ccatc 35
<210> 56
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引物
<400> 56
gtaaaacgac ggccagt 17
<210> 57
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引物
<400> 57
caggaaacag ctatgac 17
<210> 58
<211> 2013
<212> DNA
<213> 美洲鲎（Limulus polyphemus）
<400> 58
gggggggttc tgggtggcgt tctggatgtt aggagacatc accgatactg atagctggcc 60
ctcttccggt gaaattgact ttaaggaaca tataaatacc aacaatgaag ttagaggaac 120
tattcactgg tctacttctg atggtgctca tacgcatcat ggcagaggaa ccaatactga 180
ctatcacatt tattctgtag agtggaattc ttccgttatt agatggtttg ttgatggaaa 240
tcagtacttt gaggtgaata ttcagagagg agcaactgga acaaacgcat ttcataacaa 300
agttttcgtt attttaaaca tggctattgg tggaaactgg ccaggattca atgttgctga 360
tgaggctttc cctgctaaca tgtatgtaga ttatgtccgt gtatatcagg atgccaatac 420
accttctcct gttgacgttg acgttactga tttatctggt tactattttc ttcaaaatag 480
gcacagtgaa ctgtatcttg atgtcagttt ctccagtaac aaagatggag catttctaca 540
acaatggcct tataacggta atgctaacca acagtttgat tttgtacatc tcggaaataa 600
tatatataaa attaccaata aaaatagtgg aaaatctctg gatgtctaca atgtagggac 660
tgaaaatggt gtcagaattc aacagatgcc gtatagaggg agctacaatc agcagtttat 720
tgtacaagat gttggagatg gttattataa gatatttgca cgcaacagca gaaagttagt 780
ggaagtagca gatttcaata aagacccagg aggaaagata caacaatggt ctgatgatgg 840
ccaaatatcc ggacagtgga aacttattcg aaataaagtt aattctaaag taattcaggc 900
agaaagttat tttgctagtt taggagtaca attggaagac acctcggatg taggaggcgg 960
gaagaatgtt aagtgtgata ctgaaggagc ctggatggct tacaaggata tcaatttccc 1020
cagttcaggt agttatcaag tagagtacag agtggcaagc gaacgtgcag gaggaaagtt 1080
gtctctggat ttgaatgcag gttctatagt gcttggaatg ctgaatgttc cttcaacagg 1140
aggatggcag aagtggacca ccatttccca tacagtaaag gtggattcag gtacttataa 1200
cttggggatc tacgttcaac gacccaggtg gaatatcaac tggattaaga ttacagaagc 1260
acccggacag tcaaaaccta ttcaaagaag tgataccgat tctaaagtaa ttcaggcaga 1320
aagttatttt gctagttcaa aagtacaatt ggaagatacc tcggatgttg gaggcgggaa 1380
gaatgttaag tgtgataatg aaggagcctg gatggcctac aaggatatta attttcccag 1440
ttcaggtagt tatcaaatag agtacagagt ggcaagtgaa cgtgcaggag gaaagttgtc 1500
tctcgatttg aatgcaggtt ctatagtgct tggaatgctg gatgttcctt caactggggg 1560
atggcagaag tggaccccca tttcccacac agtgaatgtg agttcgggta catataactt 1620
ggggatctac gttcaacgag ctgcgtggaa tatcaactgg attaagatta caaaggttta 1680
gaatacaaga gtaaattaat tttatttttt tgaagaaaca acagatcttt gatcatctgg 1740
agtttatcta actactacag aatccactat cacctttcta gatgtattca ttgctgatga 1800
tagtgatgta taactaatga atgagaagat tatcaacaga accactgatg tattgttata 1860
tcttatggag ggtacataat cgttaaaaag ctacatttgt aataaatatg cctttaagaa 1920
gtgtggtttt ttttacaata aatatatttt aattttacaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1980
aaaaaaaagt actctgcgtt gataccactg ctg 2013
<210> 59
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引物
<400> 59
cgcgttggtt ttagagggca 20
<210> 60
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引物
<400> 60
acgtcgccaa ctcccattgt 20
<210> 61
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引物
<400> 61
aaccaagtga ccatgaaaac cactctatgg acttt 35
<210> 62
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引物
<400> 62
gatggtggtg ctcgagttaa aatactggca caacttc 37
<210> 63
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引物
<400> 63
aaccaagtga ccatgaaaac cactctatgg acttt 35
<210> 64
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引物
<400> 64
gatggtggtg ctcgagttaa aatactggca caacttc 37
<210> 65
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PA标签肽
<400> 65
Gly Val Ala Met Pro Gly Ala Glu Asp Asp Val Val
1 5 10
<210> 66
<211> 2073
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<220>
<221> 信号肽
<222> (1)..(60)
<220>
<221> misc_feature
<222> (2017)..(2052)
<223> PA标签
<220>
<221> misc_feature
<222> (2053)..(2070)
<223> 6 x His标签
<400> 66
atggcaatgt tcctgtgcta cgtggtgctg gtggtgggcg tgaccggcat ctgctgctcc 60
caggagacca actggaagct ggtgtggtcc gacgagttca ccaacggcat ctcctccgac 120
tgggagttcg agaccggtaa cggtcccaac ggctggggca acaacgagct gcagtactac 180
cgccgcgaga acgctcgcgt ggagggcggc aagctgatca tcaccgctaa gaaggaggac 240
tacgagggct tccgctacac ctccgctaag ctgaagaccc agttcaacaa gccctggaag 300
gacggcaaga tcgaggctcg catgtccatc ccctccttcc gcggtgtgtg ggtggctttc 360
tggatgctgg gcgacatcac cgacaccgac tcctggcctt cctccggtga gatcgacttc 420
aaggagcaca tcaacaccaa caacgaggtg cgcggcacca tccactggtc cacctccgac 480
ggcgctcaca cccaccacgg ccgcggcacc aacaccgact accacatcta ctccgtggag 540
tggaactcct ccgtgatccg ctggttcgtg gacggcaacc agtacttcga ggtgaacatc 600
cagcgcggcg ctaccggtac caacgctttc cacaacaagg tgttcgtgat cctgaacatg 660
gctatcggcg gtaactggcc cggcttcaac gtggctgacg aggctttccc cgctaacatg 720
tacgtggact acgtgcgcgt gtaccaggac gctaacaccc cctcccccgt ggacgtcgac 780
gtgaccgacc tgtccggtta ctacttcctg cagaaccgcc actccgagct gtatctcgac 840
gtcagcttca gctccaacaa ggatggcgct ttcctccagc agtggcctta caacggcaat 900
gccaaccagc aattcgactt cgtccatctc ggcaacaaca tctacaagat caccaataag 960
aactccggta agtccctgga cgtctacaac gtcggtaccg aaaacggcgt gcgcattcag 1020
cagatgccct accgcggctc ctacaaccaa cagttcatcg tccaggacgt cggcgacggc 1080
tactacaaga tcttcgcccg taattcccgc aagctcgtgg aagtggctga cttcaacaag 1140
gaccctggcg gcaagatcca acagtggagc gacgacggcc agatctccgg ccagtggaag 1200
ctcatccgca acaaggtcaa tagcaaggtc atccaggccg agagctattt cgctagcctg 1260
ggtgtccaac tggaggacac cagcgacgtg ggtggcggta aaaacgtgaa atgcgacacc 1320
gagggcgctt ggatggccta caaggacatc aatttcccct cctccggctc ctaccaggtg 1380
gagtaccgcg tcgcttccga acgtgctggc ggcaagctgt ccctggacct gaacgccggt 1440
agcatcgtgc tgggcatgct gaacgtcccc tccaccggtg gctggcagaa gtggaccacc 1500
atcagccaca ctgtgaaggt ggactccggc acctataacc tgggtatcta cgtgcagcgc 1560
ccccgctgga acatcaactg gatcaagatc accgaggccc ccggccaatc caaacccatc 1620
cagcgcagcg acaccgactc caaggtgatc caagccgagt cctactttgc tagcagcaag 1680
gtgcagctgg aggataccag cgacgtcggt ggtggcaaga acgtgaagtg cgacaacgag 1740
ggcgcctgga tggcttacaa ggacatcaac ttcccctcct ccggttccta ccagatcgag 1800
taccgcgtgg cttccgagcg tgctggtggc aagctgtccc tggacctgaa cgctggctcc 1860
atcgtgctgg gtatgctgga cgtgccttcc accggcggtt ggcagaagtg gaccaccatc 1920
tcccacaccg tgaacgtgtc ctccggcacc tacaacctgg gcatctacgt gcagcgtgcc 1980
gcctggaaca tcaactggat caagatcacc aaggtgggcg tggctatgcc cggtgctgag 2040
gacgacgtgg tgcatcacca ccatcaccac taa 2073
<210> 67
<211> 421
<212> PRT
<213> 合成的多肽
<220>
<221> 信号
<222> (1)..(24)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (25)..(41)
<223> HAT标签
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (42)..(137)
<223> SUMO标签
<400> 67
Met Lys Thr Thr Leu Trp Thr Phe Phe Ala Leu Ala Met Ala Leu Phe
1 5 10 15
Ser Ile Asn Val Thr Ala Ser Glu Lys Asp His Leu Ile His Asn Val
20 25 30
His Lys Glu Glu His Ala His Asn Lys Asp Ser Glu Val Asn Gln Glu
35 40 45
Ala Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu Thr His Ile Asn
50 55 60
Leu Lys Val Ser Asp Gly Ser Ser Glu Ile Phe Phe Lys Ile Lys Lys
65 70 75 80
Thr Thr Pro Leu Arg Arg Leu Met Glu Ala Phe Ala Lys Arg Gln Gly
85 90 95
Lys Glu Met Asp Ser Leu Thr Phe Leu Tyr Asp Gly Ile Glu Ile Gln
100 105 110
Ala Asp Gln Thr Pro Glu Asp Leu Asp Met Glu Asp Asn Asp Ile Ile
115 120 125
Glu Ala His Arg Glu Gln Ile Gly Gly Met Ser Val Thr Ser Arg Val
130 135 140
Arg Arg Glu Ile Asn Glu Glu His Cys Gly Ile Arg Pro Thr Ala Pro
145 150 155 160
Arg Ile Ile Lys Gly Arg Ile Ser Ile Pro His Ser Trp Pro Trp Met
165 170 175
Val Gly Ile Phe Gln Val Asp Pro Leu Leu Phe Ile Cys Gly Gly Thr
180 185 190
Ile Ile Asn Lys Val Ser Val Val Thr Ala Ala His Cys Leu Val Thr
195 200 205
Gln Ser Gly Asn Arg Gln Asn Ser Ser Ile Val Val Arg Val Gly Ala
210 215 220
His Asp Ile Asp Asn Ser Gly Ile Asp Tyr His Val Asp Lys Ile Ile
225 230 235 240
Val His Gln Asp Tyr Lys Tyr Arg Ser Gln Tyr Tyr Asp Ile Gly Leu
245 250 255
Ile Leu Leu Ser Lys Arg Ile Glu Tyr Asn Tyr Lys Val Arg Pro Val
260 265 270
Cys Ile Pro Glu Leu Asn Lys Leu Asn Val Asn Leu Asn Asn Lys Glu
275 280 285
Val Val Val Ile Gly Trp Gly Val Thr Glu Arg Gly Ser Glu Lys His
290 295 300
Asn Val Leu Arg Glu Leu Glu Leu Pro Val Val Thr Asn Glu Leu Cys
305 310 315 320
Asn Lys Ser Tyr Gln Thr Ile Ser Phe Ser Gly Leu Asn Arg Gly Ile
325 330 335
Thr Asp Asp Met Ile Cys Ala Gly Tyr Gln Glu Gly Gly Arg Asp Ser
340 345 350
Cys Glu Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Met Tyr His Asp Pro Thr Thr
355 360 365
Gly Arg Val Glu Leu Val Gly Val Val Ser Phe Gly Phe Gly Cys Ala
370 375 380
Arg Pro Asn Phe Pro Gly Val Tyr Thr Arg Leu Ser Ser Tyr Gly Asn
385 390 395 400
Trp Phe Gln Lys Val Thr Phe Gly Tyr Leu Leu Ala Thr Leu Phe Glu
405 410 415
Val Val Pro Val Phe
420
<210> 68
<211> 1266
<212> DNA
<213> 合成的多肽
<220>
<221> 信号肽
<222> (1)..(72)
<220>
<221> misc_feature
<222> (73)..(123)
<220>
<221> misc_feature
<222> (124)..(411)
<223> SUMO标签
<400> 68
atgaaaacca ctctgtggac tttcttcgct ctggctatgg ccctcttttc catcaacgtg 60
accgcctccg agaaggacca tctcatccac aacgtccaca aggaggagca cgcccacaac 120
aaggactccg aggtgaacca agaggctaag cccgaggtga agcccgaggt gaagcccgag 180
acccacatca atctgaaggt gagcgacggc tcctccgaga tcttcttcaa gatcaagaag 240
actacccccc tccgccgcct catggaagcc tttgctaagc gccaaggtaa ggagatggac 300
tctctgactt ttctgtacga cggcatcgaa atccaagctg accaaacccc cgaggatctg 360
gacatggagg acaacgacat catcgaggcc caccgtgaac agatcggcgg tatgtccgtg 420
accagccgtg tgcgtcgtga aatcaacgag gaacactgcg gcatccgtcc taccgcccct 480
cgcatcatta agggccgtat cagcatcccc cacagctggc cttggatggt gggcatcttc 540
caagtggacc ctctgctgtt catctgcggc ggcaccatca tcaacaaagt gagcgtcgtg 600
accgccgctc attgtctggt cactcaatcc ggtaaccgcc agaactcctc catcgtggtc 660
cgtgtgggtg cccacgacat cgacaacagc ggcatcgact accacgtcga caaaatcatc 720
gtgcaccaag actacaagta ccgcagccag tactacgaca tcggtctgat tctgctcagc 780
aaacgtatcg agtataacta caaggtgcgc cccgtgtgca tccccgagct caacaagctc 840
aacgtgaatc tcaacaacaa agaggtggtg gtgatcggtt ggggtgtgac cgaacgtggc 900
agcgaaaagc ataacgtgct gcgcgagctg gagctgcccg tggtgaccaa cgagctctgc 960
aacaagtcct accagaccat cagcttcagc ggcctcaacc gcggcatcac cgatgacatg 1020
atctgcgctg gctatcaaga gggtggccgt gatagctgcg agggtgactc cggtggtcct 1080
ctgatgtacc acgaccccac taccggccgt gtggaactcg tgggcgtggt gtccttcggt 1140
ttcggctgcg cccgtcccaa cttccccggt gtgtacaccc gtctgtcctc ctacggcaac 1200
tggttccaga aggtgacctt cggttatctg ctggctactc tgttcgaggt ggtgcccgtg 1260
ttctaa 1266
<210> 69
<211> 855
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 69
atgtccgtga ccagccgtgt gcgtcgtgaa atcaacgagg aacactgcgg catccgtcct 60
accgcccctc gcatcattaa gggccgtatc agcatccccc acagctggcc ttggatggtg 120
ggcatcttcc aagtggaccc tctgctgttc atctgcggcg gcaccatcat caacaaagtg 180
agcgtcgtga ccgccgctca ttgtctggtc actcaatccg gtaaccgcca gaactcctcc 240
atcgtggtcc gtgtgggtgc ccacgacatc gacaacagcg gcatcgacta ccacgtcgac 300
aaaatcatcg tgcaccaaga ctacaagtac cgcagccagt actacgacat cggtctgatt 360
ctgctcagca aacgtatcga gtataactac aaggtgcgcc ccgtgtgcat ccccgagctc 420
aacaagctca acgtgaatct caacaacaaa gaggtggtgg tgatcggttg gggtgtgacc 480
gaacgtggca gcgaaaagca taacgtgctg cgcgagctgg agctgcccgt ggtgaccaac 540
gagctctgca acaagtccta ccagaccatc agcttcagcg gcctcaaccg cggcatcacc 600
gatgacatga tctgcgctgg ctatcaagag ggtggccgtg atagctgcga gggtgactcc 660
ggtggtcctc tgatgtacca cgaccccact accggccgtg tggaactcgt gggcgtggtg 720
tccttcggtt tcggctgcgc ccgtcccaac ttccccggtg tgtacacccg tctgtcctcc 780
tacggcaact ggttccagaa ggtgaccttc ggttatctgc tggctactct gttcgaggtg 840
gtgcccgtgt tctaa 855

Claims (7)

1.一种异源二聚体，其为含有与序列号2或序列号4表示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的G因子α亚基和含有与序列号6、8、10、12、14或16中的任一个表示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的G因子β亚基的组合。
2.根据权利要求1所述的异源二聚体，其选自下述异源二聚体：
(1)含有序列号2表示的氨基酸序列的G因子α亚基和含有序列号6表示的氨基酸序列的G因子β亚基的组合的异源二聚体；
(2)含有序列号2表示的氨基酸序列的G因子α亚基和含有序列号8表示的氨基酸序列的G因子β亚基的组合的异源二聚体；
(3)含有序列号2表示的氨基酸序列的G因子α亚基和含有序列号12表示的氨基酸序列的G因子β亚基的组合的异源二聚体；
(4)含有序列号2表示的氨基酸序列的G因子α亚基和含有序列号14表示的氨基酸序列的G因子β亚基的组合的异源二聚体；
(5)含有序列号4表示的氨基酸序列的G因子α亚基和含有序列号10表示的氨基酸序列的G因子β亚基的组合的异源二聚体；
(6)含有序列号4表示的氨基酸序列的G因子α亚基和含有序列号16表示的氨基酸序列的G因子β亚基的异源二聚体。
3.根据权利要求2所述的异源二聚体，其选自(1)、(2)或(5)。
4.一种β-葡聚糖的测定方法，其使用试样以及含有序列号2或序列号4表示的氨基酸序列的G因子α亚基和含有与序列号6、8、10、12、14或16中的任一个表示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的G因子β亚基的组合的异源二聚体。
5.一种G因子α亚基，其含有序列号2或序列号4表示的氨基酸序列。
6.一种G因子β亚基，其含有与序列号6、8、10、12、14或16中的任一个表示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列。
7.一种β-葡聚糖测定用试剂盒，其包含异源二聚体，所述异源二聚体为含有与序列号2或序列号4表示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的G因子α亚基和含有与序列号6、8、10、12、14或16中的任一个表示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的G因子β亚基的组合。
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