KR100487441B1 - 신규 면역조절 분비 단백질인 ｌ259 단백질 - Google Patents

신규 면역조절 분비 단백질인 ｌ259 단백질 Download PDF

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Abstract

본 발명은 1) 신규 면역조절 분비 단백질을 탐색하기 위해 이용되는 cDNA 라이브러리 및 이의 제작방법, 2) 상기 cDNA 라이브러리를 이용한 유전자 탐색방법, 3) 상기 탐색방법을 이용하여 동정한 신규 면역조절 분비 단백질인 L259 단백질 및 이를 이용하여 면역세포를 조절하는 방법 및 4) 상기 L259 단백질을 암호화하는 면역세포 조절 유전자인 L259 유전자에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 본 발명은 B세포 유도인자를 분비하는 세포의 cDNA 라이브러리로부터 면역세포 성장을 촉진하는 신규 면역조절 분비 단백질인 L259 단백질을 찾아내는 방법이며, 상기 L259 단백질은 면역 결핍성 질환의 예방 또는 치료제로서 사용될 수 있다.

Description

신규 면역조절 분비 단백질인 Ｌ259 단백질{A new L259 protein which is an immune regulating secreted protein}
본 발명은 1) 신규 면역조절 분비 단백질을 탐색하기 위해 이용되는 cDNA 라이브러리 및 이의 제작방법, 2) 상기 cDNA 라이브러리를 이용한 유전자 탐색방법, 3) 상기 탐색방법을 이용하여 동정한 신규 면역조절 분비 단백질인 L259 단백질 및 이를 이용하여 면역세포를 조절하는 방법 및 4) 상기 L259 단백질을 암호화하는 면역세포 조절 유전자인 L259 유전자에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 신호서열 트랩(Signal Sequence Trap, 이하 'SST'라고 함) 방법을 응용하여 B세포 유도인자를 분비하는 세포의 cDNA 라이브러리로부터 면역세포 성장을 촉진하는 신규 면역조절 분비 단백질인 L259 단백질을 탐색하는 방법, 상기 탐색에 이용되는 cDNA 라이브러리, 상기 cDNA 라이브러리의 제작방법, 상기 탐색방법을 이용하여 동정한 신규 면역조절 분비 단백질인 L259 단백질, 상기 L259 단백질을 이용하여 면역세포를 조절하는 방법 및 상기 L259 단백질을 암호화하는 면역세포 조절 유전자인 L259 유전자에 관한 것이다.
어떤 세포가 어떻게 살고, 증식하고, 이동하고, 분화하고 다른 세포와 기능적인 접촉을 하고, 주어진 화합물을 분비하고 또, 기관 형성에 참여하는가를 결정하는 것은 세포가 이웃으로부터 받는 정보 및 인접 환경에 의해 지배를 받게된다. 이런 정보는 자주 분비 단백질들에 의해 전달된다. 싸이토카인(cytokine), 펩타이드 호르몬(peptide hormone), 신경전달물질(neurotransmitter) 등과 같은 분비 단백질들은 세포 밖으로 분비되어 세포간(intercellular) 신호전달에 관여하거나, 표적세포(target cell)로 하여금 이들의 신호를 받아들이도록 하여 세포내(intracellular) 신호전달을 유도한다.
분비 단백질이 세포 밖이나 표면으로 표적화 되기 위해서는 신호 펩타이드(signal peptide)라고 불리는 짧은 아미노 말단 소수성 펩타이드(short amino-terminal hydrophobic peptide)인 신호서열(signal sequence)이 필요하며 신호서열은 신호 펩티다아제(signal peptidase)인 특이적인 막 단백분해효소(protease)에 의해 개열되어 성숙한 단백질이 유리된다. 이들 신호서열만을 선택적으로 탐색하는 방법이 신호서열 트랩(Signal Sequence Trap, 이하 'SST'라 함)이다(J. Mol. Biol., 184, 99-105, 1985). SST 방법은 타시로 등(Tashiro K. et al., Signal sequence trap: a cloning strategy for secreted proteins and type I membrane proteins, Science, 261, 600-603, 1993)에 의해 처음으로 시도되었는데, 신호서열 결핍 CD25 유전자 앞에 cDNA 라이브러리 절편을 삽입하여 제작한 발현벡터를 형질전환시킨 후, 항 CD25 항체로 염색하여 신호서열을 가진 클론들을 선별하는 방법이다. 하지만, 항체 염색을 이용한 선별 방법은 민감도가 낮고 시간이 오래 걸리는 단점이 있어왔다. 그 후, 클레인 등(Klein R.D. et al, Selection for genes encoding secreted proteins and receptors, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 7108-7113, 1996)에 의해 변성 효모(mutant yeast)의 생존율을 이용한 개선된 방법이 시도되었다. 클레인 등의 방법은 타시로 등의 방법보다는 효율적인 탐색 시스템이지만, 모든 포유동물 신호 펩타이드가 효모 안에서 제대로 인식되지는 않는다는 단점이 있다. 최근에 콜지마 등(Kojima, T. et al, A signal sequence trap based on a constitutively active cytokine receptor, Nature Biotechnol., 17, 487-490, 1999)은 YT455 효모 시스템의 단점을 보완하기 위해 포유동물 시스템을 개발한 바 있다.
한편, 생체는 자기 항상성을 지키기 위해서 생체 내에 침입하는 이물질을 섭취하여 자기와 비자기를 식별해서 비자기를 생체 밖으로 배제하는 기구를 가지고 있다. 생체가 배제해야 하는 것은 세균이나 바이러스 등의 외래에서 들어온 이물질 뿐만 아니라 노폐조직이나 암화된 세포 등 자기 성분도 포함된다. 생체에는 피부, 점막 등의 장벽이나 식세포에 의한 식작용 등 비특이적인 방어기구가 있으며 이를 자연면역이라 한다. 반면에 침입한 이물질을 비자기물질로 식별하여 새롭게 획득한 이물질 배제를 위한 특이적인 방어 기구를 획득 면역이라 한다. 획득 면역은 항체를 생산하여 면역 반응을 일으키는 체액성 면역과 임파구가 직접적으로 항원과 면역 반응을 일으키는 세포성 면역으로 나누어지며 면역반응은 항원 인식에 의해 조절된다. 체액성 면역은 헬퍼 T세포가 마크로파지(macrophage) 등의 항원제시 세포의 표면에 있는 클래스 II MHC-항원 복합체를 인식하여 헬퍼 T세포가 림포카인을 분비하며, 분비된 림포카인이 B세포에 작용하여 B세포가 형질세포로 분화, 증식하여 항체를 만들게 되는 것이다. 한편, 세포성 면역은 상기와 같이 헬퍼 T세포로부터 분비된 림포카인이 킬러 T세포를 활성화시키고 활성화된 킬러 T세포가 바이러스에 감염된 세포의 클래스 Ⅰ MHC-항원 복합체와 결합하여 세포를 상해하게 되는 것이다.
면역 기능이 저하된 면역 질환으로는 류마티스 관절염, 재발성 호흡기 감염, 아토피성 피부염, 후천성 면역결핍 증후군(AIDS), 단순포진 감염, 백혈구 감소증, 홍반성 낭창, 중증 근무력증, 위축성 위염, 궤양성 결장염, 만성활동성 간염, 자가면역성 용혈성빈혈 등이 대표적이다.
면역 질환의 치료제로 국내에서 시판되는 것으로는 송아지 흉선에서 추출하여 정제한 흉선 호르몬의 일종이며 비단백성 폴리펩타이드인 티모모듈린(thymomodulin), 흉선 상피세포에서 분비되는 흉선 호르몬의 일종이며 티모포이에틴(thymopoietin)의 활성 펜타펩타이드(pentapeptide)인 티모펜틴(thymopentin), 칸디다 유틸리스(Candida utilis) 균주를 발효하여 세포벽으로부터 추출한 글리코만난 다당류(glycomannan polysaccharide)를 인산칼슘 황산염에 흡착시킨 글리코포스포펩티칼(glycophosphopeptical) 및 펠리누스 린테우스(Phellinus linteus)의 추출물에서 얻은 다당류인 상황균 사체 엑스 등이 있다. 그러나, 티모모듈린은 알레르기 반응을, 티모펜틴은 중추신경계에 작용하여 수면과잉을, 글리코포스포펩티칼은 위장관에 작용하여 소화불량을, 상황균 사체 엑스는 구역, 구토, 식욕부진, 설사 등을 부작용으로 유발할 수 있다.
그러므로, 본 발명은 SST 방법을 응용하여 각종 면역 결핍성 질환의 예방 또는 치료에 사용될 수 있는 면역조절 분비 단백질을 탐색한 결과, B세포 유도인자를 분비하는 세포의 cDNA 라이브러리로부터 면역세포 성장을 촉진하는 신규 면역조절 분비 단백질인 L259 단백질을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 1) 신규 면역조절 분비 단백질을 탐색하기 위해 이용되는 cDNA 라이브러리 및 이의 제작방법, 2) 상기 cDNA 라이브러리를 이용한 유전자 탐색방법, 3) 상기 탐색방법을 이용하여 동정한 신규 면역조절 분비 단백질인 L259 단백질 및 이를 이용하여 면역세포를 조절하는 방법 및 4) 상기 L259 단백질을 암호화하는 면역세포 조절 유전자인 L259 유전자를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 신규 면역조절 분비 단백질을 탐색하기 위해 이용되는 cDNA 라이브러리 및 이의 제작방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 cDNA 라이브러리를 이용한 유전자 탐색방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 탐색방법을 이용하여 동정한 신규 면역조절 분비 단백질인 L259 단백질 및 이를 이용하여 면역세포를 조절하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 L259 단백질을 암호화하는 면역세포 조절 유전자인 L259 유전자을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 면역조절 분비 단백질을 탐색하기 위해 이용되는 cDNA 라이브러리 및 이의 제작방법을 제공한다.
특정한 조직이나 세포로부터 mRNA를 단리하고 이를 주형으로 하여 역전사효소에 의해 cDNA를 효소적으로 합성할 수 있고, 이들을 클론화하여 cDNA 클론을 얻을 수 있다. 이러한 클론 집단은 주형으로 사용한 RNA의 순도를 반영한 다양한 cDNA를 함유하고 있으므로 이를 cDNA 라이브러리라 한다.
본 발명의 cDNA 라이브러리는 1) 대상으로 하는 세포에서 단리한 mRNA를 시발체(primer) 및 올리고 dT를 이용하여 cDNA 단편을 합성하는 단계, 2) 합성된 cDNA 단편에 상이한 특정 제한 효소 부위를 포함하는 어댑터(adapter)를 연결하고 단편 크기로 분획하는 단계, 3) 분획된 cDNA 단편을 레트로바이러스 벡터에 삽입한 단계 및 4) 대장균에 형질전환시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된다. 상기 대상으로 하는 세포는 면역조절과 관련있는 세포이며, 상기 어댑터는 BstXI 또는 EcoRI인 것이 바람직하다.
본 발명은 상기 cDNA 라이브러리를 이용한 유전자 탐색방법을 제공한다.
본 발명의 유전자 탐색방법은 1) cDNA 라이브러리를 형질감염(transfection)시켜 얻어진 바이러스 입자를 세포주에 감염시킨 후 인자 결핍 배지에서 배양하는 단계, 2) 상기 배양에서 살아남은 클론에서 게놈 DNA를 추출하고 PCR을 수행한 후 DNA 단편을 분리하는 단계 및 3) 분리된 DNA 단편을 막혼성화 방법에 의해 특이적으로 발현되는 클론을 탐색하는 단계를 포함한다. 상기 세포주는 IL-3 의존성 세포주이며, 상기 인자 결핍 배지는 IL-3 결핍배지가 바람직하다.
본 발명은 상기 탐색방법을 이용하여 동정한 신규 면역조절 분비 단백질인 L259 단백질 및 이를 이용하여 면역세포를 조절하는 방법을 제공한다.
본 발명의 유전자 탐색방법을 이용하여 신규 면역조절 분비 단백질인 L259 단백질을 동정한다. 신규 L259 단백질은 서열번호 2로 표시되는 단백질 아미노산 서열로 이루어지며, 세포 밖으로 분비되는 단백질로서, 폐에서 가장 강한 발현을 나타내는 면역조절 분비 단백질이다. 따라서, 본 발명의 신규 L259 유전자는 면역 결핍성 질환의 예방 또는 치료제로 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 상기 L259 단백질을 이용하여 면역세포를 조절하는 방법은 1) 비장세포를 분리하여 분주하는 단계, 2) L259 단백질 발현 배양액을 분주된 비장세포에 섞는 단계, 3) 세포 배양 마지막에 세포를 방사능으로 표지하는 단계 및 4) DNA를 수거하여 방사능을 측정하는 단계를 포함한다.
본 발명은 상기 L259 단백질을 암호화하는 면역세포 조절 유전자인 L259 유전자을 제공한다. 면역세포 조절 유전자인 L259 유전자는 서열번호 1로 표시되는 cDNA 염기서열로 이루어진다.
이하에서는 참고예 및 실시예를 들어 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 이들은 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
<참조예 1. pMX-SST-library의 제작>
올리고(dT)-아가로스 비드(agarose bead)를 이용한 페스트트랙 2.0 키트(FastTrack 2.0 Kit, InVitrogen)로 단리한 mRNA는 랜덤 헥사머(random hexamer)와 올리고(dT)를 이용한 수퍼스크립트 초이스 시스템(SuperScript Choice System, Gibco-BRL, Rockville, MD)으로 cDNA 단편을 합성하고, BstXI 어댑터(InVitrogen)와 EcoRI 어댑터(Gibco-BRL, Rockville, MD)를 붙였다. 세파크릴 S-500 컬럼(Sephacryl S-500 column)으로 크기별로 분획하여 500bp 이상의 cDNA를 모아 레트로바이러스 벡터인 pMX-SST에 삽입하고, 일렉트로포레이션(electroporation) 방법으로 DH10B (GIBCO-BRL)에 형질전환(transformation) 한 후 재조합 플라스미드(recombinant plasmid)를 분리,정제 (Qiagen Maxi column) 하였다.
<참조예 2. 레트로바이러스 제조 및 감염>
300 μg의 라이브러리 DNA를 5 x 106 페오닉-에코(Pheonix-Eco) 세포주에 칼슘-인산 동반침강(calcium-phosphate coprecipitation) 방법(CloneTech)으로 형질감염시키고, 이틀 뒤 바이러스 입자가 분비된 배지를 모았다. 생쥐의(murine) IL-3-의존성 프로 B세포(pro-B cell)인 Ba/F3는 10 ng/ml murine IL-3 (R&D Systems, Mineapolis, MN)가 포함된 RPMI1640 (with 10% FBS)에서 배양하다가, 3 x 106 의 BaF3에 레트로바이러스를 감염시키고 24시간 뒤에 IL-3를 제거한 상태에서 12개의 96-웰 플레이트(96-well plate)로 나누어(1 x 104 cells/well) 7일간 배양하여 생존한 클론들을 얻었다.
<참조예 3. 선택된 클론으로부터 대상유전자 동정>
인자 의존성(Factor-independent) Ba/F3에서 게놈 DNA를 추출하고 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 벡터 시발체를 이용한 PCR을 수행하여 삽입된(inserted) DNA 단편을 얻었다. PCR조건은 98℃ 20초, 68℃ 2분으로 30회 반복하는 과정으로 진행하였다. EtBr이 함유된 1% 아가로스겔에 PCR 결과물을 넣고 1 x TAE 버퍼에서 전기영동하여 DNA를 크기별로 분리하고 UV를 이용해 원하는 PCR 단편을 잘라내었다. Qiagen의 겔 용출 키트(gel elution kit)를 이용하여 겔 조각으로부터 DNA만을 정제해 냈다.
<참조예 4. 덧-블롯 배열막(dot-blot array membrane)의 제작>
LK-1 세포주에 특이적으로 존재하거나 분열촉진물질(mitogen)에 의해 발현이 증가되는 클론들을 얻기 위해, PCR로 얻어진 삽입된 DNA 단편을 덧-블롯 키트(dot-blot kit)를 이용하여 나일론 막(nylon membrane)에 부착시켜 배열막(array membrane)을 제작하였다. 우선, PCR 생산물을 1/50 희석하여 96 웰 프레이트에 100 μL씩 넣었다. 여기에 변성 용액(0.5N NaOH/1.5 M NaCl) 100μL를 각 웰에 넣고 잘 섞고, 95 μL씩 나일론 막에 멀티채널 피펫(multi-channel pipet)으로 로딩(loading)하였다. 아스피레이터로 용액을 뽑아내어 막에 DNA가 붙게 하고 중화용액(0.5 M Tris-HCl (pH 8.0)/1.5 M NaCl) 200 μL로 중화시키고 다시 2 x SSC 200 μL로 씻어 주었다. 준비된 막을 UV-교차결합(cross-linking) 후 70℃에서 30분간 베이킹(baking)하였다.
<참조예 5. LK-1 세포주 및 LPS/PMA 특이적 발현클론의 탐색>
B세포 유도 인자를 분비하는 마우스 적혈구 세포주 LK-1과 분비하지 않는 동종의 세포주 MEL세포에서 페스트트랙 2.0 키트(Invitrogen)를 이용해 mRNA를 정제하여 농도를 측정하였다. 같은 방법으로 수컷 Balb/c (25 g)에서 분리한 비장세포(splenocytes)를 1μg/mL LPS와 50 nM PMA로 6시간동안 처리한 그룹과 처리하지 않은 그룹도 mRNA를 준비하였다. 2 μg mRNA를 1 μg의 올리고 dT와 섞어 70℃에 10분간 두었다가 아이스(ice)에서 식히고, 방사성 동위원소 존재 하에서 역전사 반응을 시켰다. 반응용액 조성은 5 μL 의 5 x first-strand buffer (GIBCO-BRL), 2.5 μL의 0.1 M DTT, 1.25 μL의 16 mM dNTP-dCTP, 1.25 μL의 0.1 mM dCTP, 5 μL의 α-32P-dCTP, 1.25 μL의 수퍼스크립트 RT(Superscript RT, 250 U)이며, 42℃에서 1 시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝나면 잔류 RNA를 가수분해 용액 (1 μL의 1% SDS, 1 μL의 0.5 M EDTA, 3 μL의 2N NaOH)을 첨가해 65℃에서 30분간 파쇄시켰다. 여기에 1M Tris(pH 7.6) 10 μL과 2N HCl 3 μL를 첨가해 중화시키고, 세파덱스(Sephadex) G-50 컬럼으로 방사능 표지된 cDNA만 정제하여 사용하였다. 앞에서 준비한 덧-블롯 막(dot-blot membrane)은 혼성화 용액(hybridization solution, CloneTech)으로 42℃에서 3시간 전혼성화(pre-hybridization) 처리 후 방사능 표지된 cDNA를 첨가해 16시간 동안 혼성화시킨 후, 세척 과정을 통해 비특이적인 결합을 없애고 X선 필름에 현상시켰다.
<참조예 6. 염기서열 분석>
앞에서 설명한 과정을 통해 선택되어진 후보 DNA 클론들은 상거 방법(Sanger method)로 서열화하여 DNA 염기서열을 알아내고, NCBI의 모세포 탐색(blast search)과 TIGR에서 유전자의 기능과 구조를 분석하고, 잘 알려지지 않은 클론들은 공통 모티브 탐색(common motif search) 등을 수행해 유전자의 기능을 유추하였다.
<참조예 7. 5'-RACE와 3'-RACE를 통한 전 길이 cDNA 탐색>
클로닝된 유전자의 전 길이 cDNA를 찾기 위해, 5'-RACE와 3'-RACE (SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit Clontech)를 실시하였다. 얻어진 전 길이 cDNA는 신호서열이 있는지, 막통과 영역(transmembrane region)이 있는지의 여부를 알아보았다. 또한, 얻어진 cDNA가 발현하는 단백질의 아미노산 서열을 알아보고 인간에게서 발현되는 유사 단백질을 찾아보았다.
<참조예 8. 노던 블롯을 통한 유전자 발현분석>
Balb/c 마우스의 각 장기별 발현정도를 알아보았다. 마우스에서 위, 뇌, 지방조직, 눈, 폐, 비장 등을 비롯한 각 장기를 떼어내, 조직 파쇄기 (tissue homogenizer)로 RNAzol B (Tel-Test, Friendswood, TX) 용액 안에서 분쇄시키고 RNA를 정제하였다. 30 ㎍의 RNA를 2.2 M 포름알데히드를 함유한 1% 아가로스 겔에서 전기영동하고, 나일론 막(GeneScreenPLUS, NEN Life Science Products, Boston, MA)에 부착시켰다. 이 나일론 막은 32P-표지된 cDNA를 첨가한 ExpressHyb solution (Clontech) 속에서 65oC, 16시간동안 반응시키고, 세 번 이상 세척하여 비특이적으로 부착된 탐침(probe)을 제거하고 자가 방사선상(autoradiogram)을 만들었다.
<참조예 9. 동소부합결합( In situ hybridization)을 이용한 발현분석>
폐암환자와 정상환자에게서 조직을 떼어내, Taq4A-L259 벡터로부터 만든 방사능 표지된 센스(sense) 및 안티센스(anti-sense) 탐침으로 유전자 발현을 분석하였다.
<참조예 10. 재조합 플라스미드 제조>
C 말단에 FLAG를 부착한 L259를 발현시키기 위해, Taq2B 플라스미드에 pfu효소를 이용한 RT-PCR로 얻어진 전 길이 cDNA를 정지 코돈(stop codon)을 제거하고 EcoRI/XhoI 위치에 삽입시켰다(Taq2B-mL259). 또한, FLAG를 부착시키지 않고 L259 자체만 발현하는 플라스미드를 제작하기 위해 정지 코돈을 포함한 cDNA를 같은 방법으로 제작해 Taq2B 플라스미드에 삽입하여 Taq2B-mL259-stop을 제작하였다. cDNA 제작에는 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 PCR 시발체를 사용하였다.
RT-PCR 반응 혼합물은 4 ㎕의 5 x 반응 완충용액, 8 ㎕의 dNTP(dATP, dCTP, dGTP, TTP 각 5μM), 1 ㎕의 랜덤 프라이머(0.5 ㎍/㎕), X ㎕의 총 세포 RNA (X ㎕/3 ㎍), (6-X) ㎕의 증류수, 1 ㎕의 역전사 효소(200U)으로 총 20㎕이다.
먼저 증류수, RNA 및 랜덤 시발체를 섞어 70℃에서 5분간 열처리하고, 나머지를 모두 넣은 후, 이 혼합물을 37℃에서 60분간 반응시킨 후 90℃에서 5분간 반응을 정지시켰다. 이렇게 얻은 반응물 5 ㎕에 3 ㎕의 PCR 10 x 완충용액, 1 ㎕의 5' 시발체(10 pmole), 1 ㎕의 3' 시발체(10 pmole), 19 ㎕의 증류수, 1 ㎕의 pfu 중합효소(2.5U)를 포함하여 30 ㎕를 섞어 중합효소 연쇄반응을 수행하였다.
위의 반응물을 95℃에서 5분간 방치하여 어떤 다른 효소활성을 저해시킨 후에 95℃에서 1분, 60℃에서 1분, 72℃에서 2분 동안 반복하는 사이클을 30회 수행하고 마지막으로 72℃에서 20분간 반응을 수행하였다. 이렇게 얻은 반응물 중에서 10 ㎕을 취하여 1% 아가로스 겔에서 30분간 100V에서 전기영동하였다.
<참조예 11. L259발현 및 면역 세포 증식실험>
대장균을 이용하여 mL259 단백질을 다량으로 발현 분리하기 위해, 말토오스 결합 단백질(maltose-binding protein, MBP)와 결합된 형태의 mL259 단백질을 발현시키는 시스템을 이용하였다. pfu 효소를 이용한 RT-PCR로부터 얻어진 정지 코돈을 포함한 전 길이 cDNA를 pMAL-c2 벡터(New England BioLabs, inc.)의 EcoRI/XhoI 위치에 삽입시켰다. 이 재조합 플라스미드로 형질전환된 대장균 BL21 균주를 0.2% 포도당을 포함한 LB 배지에서 키우고 IPTG로 단백질 발현을 유도하였다. 수거한 세포들을 초음파 분쇄법으로 깨어 세포 추출액을 얻은 후, 아밀로스 친화성 컬럼(amylose affinity column)을 이용하여 이 세포 추출액으로부터 MBP와 결합된 형태의 재조합 mL259 단백질을 정제하였다. 분리정제한 단백질을 12% SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동으로 확인한 결과, 약 65kDa의 MBP-mL259 단백질을 확인하였다.
또한 293 세포에서의 발현은, 100 mm dish에서 배양한 293세포에 칼슘-인산(calcium-phosphate) 방법으로 플라스미드를 도입시키고, 12시간 후 새 배양액으로 교환해 48시간 후에 배양을 수거하여 면역세포 증식실험을 수행하였다. 우선, Balb/c 마우스에서 비장을 떼어내 비장세포를 분리한 후 5 x 105/mL 농도로 200 ㎕ 씩 96 웰 플레이트에 나누고, 앞에서 준비한 L259 발현 배양액을 2%, 10%, 50%로 섞어주어 RPMI-완전 배지에서 72시간동안 배양한다. 이때, 1 μCi 의 [3H]-thymidine을 세포배양 마지막 16시간동안 넣어주어 세포를 방사능으로 표지시키고, 세포 수확기(cell harvester)로 유리 섬유 필터(glass fiber filter)에 DNA를 수거해 방사능을 측정하였다(LSC, liquid scintillation counting). 같은 방법으로, CD40 항체를 첨가하면서 L259 발현배양액을 10% 처리해 세포증식 실험을 수행하였다.
<실시예 1. LK-1 세포주로부터 라이브러리 확립>
108의 LK-1 세포주에서 페스트트랙 2.0 키트로 mRNA를 정제하고, 이중 5 ㎍으로 cDNA를 합성하고(SuperScript Choice System; Gibco-BRL, Rockville, MD), pMX-SST 레트로바이러스 벡터에 삽입하였다. 이때, 사용된 랜덤 시발체와 BstXI 어댑터를 사용한 L-라이브러리, 랜덤/올리고(dT) 시발체 혼합과 EcoRI 어댑터를 사용한 K-라이브러리 등 두 가지 라이브러리를 사용하였다. 라이브러리 질(quality)은 5 x 106 이상의 콜로니들로 이루어졌다.
<실시예 2. 레트로바이러스의 제조 및 BaF3 세포주로의 감염>
제작된 SST/레트로바이러스 DNA 라이브러리는 페오닉-에코(Pheonix-Eco)라는 293-유래 패키징(packaging) 세포주에 칼슘-인산 공동 침강(calcium-phosphate coprecipitation) 방법(CloneTech)으로 도입되고, 여기서 생산된 바이러스 입자들은 IL-3-의존성 세포주인 Ba/F3에 감염시켜, 96-웰 플레이트 20장에 분주되어 일주일 후부터 성장하는 IL-3-비의존성 세포주 클론들을 모으기 시작하였다. 신호서열을 갖고 있는 DNA가 염색체에 삽입되어 선별된 클론은 K-라이브러리에서 491개, L-라이브러리에서 266개, 총 757개의 클론들이 최종적으로 얻어졌다.
<실시예 3. L259 동정>
상기 방법으로 얻은 클론들에서 게놈 DNA를 추출하고 LA-Taq(TaKaRa) 폴리머라제(polymerase)로 게놈 PCR을 수행하여 200bp-1,500bp의 DNA 단편을 얻었다. B세포 유도 인자(B-cell stimulating factor)가 분비된다고 밝혀진 LK-1 세포주와 같은 계열이지만 상기 인자가 분비되지 않는 것으로 밝혀진 MEL 세포주와 비교/분석하여 LK-1 세포주에서 특이적으로 다량 발현되는 클론들을 골라내기 위하여, 얻어진 757개의 PCR 생산물을 96웰 덧-블롯 막에 부착시켜 8장의 배열 블롯(array blot)을 동일하게 두 장씩 제작하였다. 여기에 두 세포주들에서 추출된(FastTrack 2.0 Kit) mRNA를 방사선 동위원소가 포함된 역전사 반응을 통해 cDNA를 제작하고, 각 세포에 특이적으로 발현되는 클론들을 탐색하는 과정을 거쳤다. 이 과정을 통해 총 53개의 클론이 LK-1에 특이적으로 발현되고 이었으며, 이중 53%인 28개가 알려져 있지 않은 클론(unknown clones)이었다. 또한, 기존의 결과들에 의하면 싸이토카인들은 분열촉진물질(mitogen)이나 신호 활성화제(signal activator)들에 의해 발현이 증가되는 것이 일반적인 경향이었으므로, 본 연구취지에 맞는 새로운 B세포 싸이토카인(B-cell cytokine)의 탐색을 위해, 박테리아 다당류(LPS)와 포르볼-12-미리스테이트-13-아세테이트(phorbol-12-myristate-13-acetate, PMA)를 6시간 동안 처리한 Balb/c 비장세포들과 처리하지 않은 비장세포들에서 역시 같은 방법으로 mRNA를 정제하여 덧-블롯 하이브리드 형성을 수행하였다. 그 결과, 19개 클론이 LPS/PMA에 의해 발현증가를 보였고, 이중 8개 클론인 42%가 알려져 있지 않은 클론으로 밝혀졌다. LK-1세포주와 LPS/PMA 시 공통으로 존재하는 클론을 6개 얻어, 이들의 염기서열을 여러 가지 프로그램으로 분석한 결과, L259 클론이 유력한 후보유전자로 밝혀졌고, 이에 대한 전체 염기서열을 5'-RACE 및 3'-RACE 방법으로 하여 서열번호 2에 표시되는 염기서열을 알아내었다.
<실시예 4. L259 유전자 특성분석>
L259 유전자는 진뱅크(GenBank)에 등록되지 않은 새로운 유전자로 밝혀졌으며, 아미노산 염기서열을 분석한 결과 인간에게 발현되는 유사한 유전자를 진뱅크에서 알아낼 수 있었으며, 마우스 유전자와 인간의 유전자는 단백질 아미노산 서열이 39% 유사성을 지님을 알아내었다(도 1 A). 또한, 마우스 L259 클론의 아미노산 서열로 신호 펩타이드 존재여부를 분석한 결과 16번째와 17번째 아미노산 사이에 잘려지는 위치가 있음이 밝혀졌고, 1-16 아미노산이 신호서열로 추정되었다(도 1 B). 막통과 영역(transmembrane region)이 있는가에 대한 아미노산 염기서열 분석결과, 세포막에 걸려있는 부위는 없는 것으로 밝혀졌다. 이 결과들을 토대로 L259는 148개의 아미노산으로 구성된 세포밖으로 분비되는 단백질임을 알 수 있었다.
<실시예 5. L259 유전자 조직별 발현분석>
L259의 발현분포를 알아보기 위해 수행한 마우스 장기별 RNA 분석 실험결과, 폐에서 가장 강한 발현을 나타내었고, 심장, 비장, 골수 및 고환에서 약간이 발현되었고, 나머지 장기에서는 거의 발현되지 않음을 알 수 있었다(도 2 A). 폐에서 가장 강한 발현을 관찰한 것이 실험상 오류이었는지를 검증하기 위해 다른 Balb/C 마우스에서 심장, 폐, 흉선, 신장 및 비장을 떼어내 재분석한 결과에서도, 폐에서 가장 강한 발현을 보임을 재확인 할 수 있었다(도 2 B). 또한, 폐암에 걸린 환자에게서 떼어낸 조직과 정상인의 폐조직에서의 L259발현을 동소부합결합(in situ hybridization) 방법으로 조사한 결과, 정상과 암세포 모두 강한 발현을 관찰할 수 있었으며, 특히 폐점막, 분비샘과 외피세포에서 많은 양이 발현되고 있음을 알 수 있었고, 특히 폐 대식세포에서도 강한 발현이 관찰되었다(도 3).
<실시예 6. L259 유전자 발현 및 기능분석>
L259 단백질이 면역세포 증식에 영향을 주는가를 알아보기 위해, L259 단백질을 대장균(도 4)과 인간 배아 신장세포 293세포에서 발현하였다. 발현시킨 배양액으로 비장세포의 증식 유도 능력을 알아본 실험결과, 293 배양액을 10% 및 50% 첨가한 실험군에서 대조군에 비해 유효성 있게 증식을 촉진시킴을 알 수 있었다(도 5 A). 또한, CD40 항체를 첨가시에도, L259가 대조군보다 세포증식을 증가시킴을 알 수 있었다(도 5 B)
상기에서 살펴본 바와 같이, SST(Signal Sequence Trap) 방법을 응용하여 본 발명의 신규 면역조절 분비 단백질인 L259 단백질을 동정하고 상기 L259 단백질은 면역 결핍성 질환의 예방 또는 치료제로서 사용될 수 있다.
도 1은 L259 유전자 구조를 나타낸 것으로, A는 단백질 아미노산 서열로 인간 유사 유전자의 단백질 아미노산 서열과 비교한 것이고, B는 신호단백질 존재 여부를 컴퓨터로 분석해 유추한 결과이고,
도 2는 Balb/C 마우스의 각 장기별로 L259 발현정도를 노던 블롯(Northern blot)을 통해 살펴본 것이고(A, B),
도 3은 정상 폐조직과 암화된 폐조직에서 L259 유전자의 발현양상을 동소부합결합(in situ hybridization) 방법으로 본 것이고, 폐포에서 L259 발현 분포를 동소부합결합 방법으로 본 것이고[A.정상 폐조직 (100 x); B. 폐암 조직 (40 x); C. 정상 폐포 (400 x); D. 폐암 폐포 (200 x)],
도 4는 L259 단백질을 대장균에서 발현한 것으로, A는 MBP만을 발현한 것이며 B는 MBP-mL259를 발현한 것이고[레인 1, 대조군 대장균; 레인 2, IPTG를 처리한 대장균; 레인 3, 아밀로스-친화성 컬럼(Amylose-affinity column)을 통해 정제한 MBP-mL259 단백질],
도 5는 L259 단백질이 면역세포 증식에 주는 영향을 본 것이고(A), 항 CD40 항체 첨가시 L259 단백질이 면역세포 증식에 주는 영향을 본 것이다(B).
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> A new L259 protein which is an immune regulating secreted protein <130> 2p-03-22 <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 444 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequence1 <400> 1 auggaugucc ucuuuauagc ccuccuuguu gcaccacuca uccugggaca ggaauacgac 60 caugaagagc agcuggaaga gggugauuac uaucaagugg cauauuauua uuacacagug 120 accccuaauu augaugacuu caguguaaac uucacuguug auuacuccgu guuugaguca 180 gaggauaggu ugaacagguu gaauaaggag guaacaacaa uagaagcggu agagacuaca 240 gccucuucau acagucuuca uacagaacuu auggacccuc agaauccugu aaccacgaaa 300 ccagugacca cagaaccagu gaccacagaa ccagugacca cagaaccaca gaguccaaau 360 cagaaugaug ccauguccac gcugcagagu ccuguguccu gcuuucuguu auggacccuc 420 cuucaaggag ggguacauuu uaug 444 <210> 2 <211> 148 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Met Asp Val Leu Phe Ile Ala Leu Leu Val Ala Pro Leu Ile Leu Gly 1 5 10 15 Gln Glu Tyr Asp His Glu Glu Gln Leu Glu Glu Gly Asp Tyr Tyr Gln 20 25 30 Val Ala Tyr Tyr Tyr Tyr Thr Val Thr Pro Asn Tyr Asp Asp Phe Ser 35 40 45 Val Asn Phe Thr Val Asp Tyr Ser Val Phe Glu Ser Glu Asp Arg Leu 50 55 60 Asn Arg Leu Asn Lys Glu Val Thr Thr Ile Glu Ala Val Glu Thr Thr 65 70 75 80 Ala Ser Ser Tyr Ser Leu His Thr Glu Leu Met Asp Pro Gln Asn Pro 85 90 95 Val Thr Thr Lys Pro Val Thr Thr Glu Pro Val Thr Thr Glu Pro Val 100 105 110 Thr Thr Glu Pro Gln Ser Pro Asn Gln Asn Asp Ala Met Ser Thr Leu 115 120 125 Gln Ser Pro Val Ser Cys Phe Leu Leu Trp Thr Leu Leu Gln Gly Gly 130 135 140 Val His Phe Met 145 <210> 3 <211> 131 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Asp Val Leu Phe Val Ala Ile Phe Ala Val Pro Leu Ile Leu Gly 1 5 10 15 Gln Glu Tyr Glu Asp Glu Glu Arg Leu Gly Glu Asp Glu Tyr Tyr Gln 20 25 30 Val Val Tyr Tyr Tyr Thr Val Thr Pro Ser Tyr Asp Asp Phe Ser Ala 35 40 45 Asp Phe Thr Ile Asp Tyr Ser Ile Phe Glu Ser Glu Asp Arg Leu Asn 50 55 60 Arg Leu Asp Lys Asp Ile Thr Glu Ala Ile Glu Thr Thr Ile Ser Leu 65 70 75 80 Glu Thr Ala Arg Ala Asp His Pro Lys Pro Val Thr Val Lys Pro Val 85 90 95 Thr Thr Glu Pro Ser Pro Asp Leu Asn Asp Ala Val Ser Ser Leu Arg 100 105 110 Ser Pro Ile Pro Leu Leu Leu Ser Arg Ala Phe Val Gln Val Gly Met 115 120 125 Tyr Phe Met 130 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' primer <400> 4 cggaattcat ggatgtcctc tttatagcc 29 <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' primer (for Taq2B-mL259) <400> 5 cgctcgagca taaaatgtac ccctccttg 29 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' primer (for Taq2B-mL259-stop) <400> 6 cgctcgagct acataaaatg tacccctcc 29 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' primer <400> 7 gggggtggac catcctcta 19 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' primer <400> 8 cgcgcagctg taaacggtag 20

Claims (11)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 1) 대상으로 하는 세포에서 단리한 mRNA로부터 시발체 및 올리고 dT를 이용하여 cDNA 단편을 합성하고, 합성된 cDNA 단편에 BstXI 또는 EcoRI 중에서 선택된 어댑터를 연결한 후 단편 크기로 분획하는 단계,
    2) 분획된 cDNA 단편을 레트로바이러스 벡터에 삽입하고, 대장균에 형질전환시켜서 cDNA 라이브러리를 제작하는 단계,
    3) 제작된 cDNA 라이브러리를 형질감염시켜 얻어진 바이러스 입자를 IL-3 의존성 세포주에 감염시킨 후 IL-3 결핍배지에서 배양하는 단계,
    4) 상기 배양에서 살아남은 클론에서 게놈 DNA를 추출하고 PCR을 수행한 후 DNA 단편을 분리하는 단계 및
    5) 분리된 DNA 단편을 막혼성화 하여 특이적으로 발현되는 클론을 탐색하는 단계를 포함하는 면역세포 조절 유전자 탐색방법.
  5. 삭제
  6. 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 면역조절 분비 단백질인 L259 단백질.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 면역조절 분비 단백질은 세포 밖으로 분비되는 단백질로서, 폐에서 가장 강한 발현을 나타내는 것을 특징으로 하는 면역조절 분비 단백질인 L259 단백질.
  8. 1) 비장세포를 분리하여 분주하는 단계, 2) L259 단백질 발현 배양액을 분주된 비장세포에 섞는 단계, 3) 세포 배양 마지막에 세포를 방사능으로 표지하는 단계 및 4) DNA를 수거하여 방사능을 측정하는 단계를 포함하는 제 6항 또는 제 7항의 L259 단백질을 이용하여 면역세포의 증식을 측정하는 방법.
  9. 삭제
  10. 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 L259 단백질을 암호화하는 면역세포 조절 유전자인 L259 유전자.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 1로 표시되는 cDNA 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 면역세포 조절 유전자인 L259 유전자.
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