WO2022107622A1 - 逆ナノディスク - Google Patents

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WO2022107622A1
WO2022107622A1 PCT/JP2021/040806 JP2021040806W WO2022107622A1 WO 2022107622 A1 WO2022107622 A1 WO 2022107622A1 JP 2021040806 W JP2021040806 W JP 2021040806W WO 2022107622 A1 WO2022107622 A1 WO 2022107622A1
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reverse
nanodisk
lipophilic
nonionic surfactant
mass
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PCT/JP2021/040806
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恵広 柳澤
忠夫 辻
知弘 井村
敏彰 平
Original Assignee
株式会社カネカ
国立研究開発法人産業技術総合研究所
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Publication date
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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
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    • B82B—NANOSTRUCTURES FORMED BY MANIPULATION OF INDIVIDUAL ATOMS, MOLECULES, OR LIMITED COLLECTIONS OF ATOMS OR MOLECULES AS DISCRETE UNITS; MANUFACTURE OR TREATMENT THEREOF
    • B82B1/00—Nanostructures formed by manipulation of individual atoms or molecules, or limited collections of atoms or molecules as discrete units
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery

Definitions

  • the present invention relates to a reverse nanodisk and a lipophilic dispersion liquid in which the reverse nanodisk is dispersed in a lipophilic solvent.
  • molecular aggregates such as micelles and vesicles may be used as a technique for infiltrating the active ingredient into the skin.
  • a general micelle is formed by aggregating surfactants in a hydrophilic solvent with the hydrophilic portion facing outward and the lipophilic portion facing inward.
  • Vesicles are spherical particles composed of two or more layers of surfactant.
  • vesicles composed of phospholipids and glycolipids are called liposomes.
  • the size of the liposome is relatively large, 0.1 to several hundred ⁇ m, and the hydrophilic dispersion liquid containing the liposome in the hydrophilic solvent is cloudy.
  • nanodisks consisting of a lipid bilayer or fine particles called nanodisks
  • a general nanodisc is a fine particle in which a membrane scaffold protein is bound and immobilized on the side surface of a lipid bilayer, and a hydrophilic dispersion in which fine particles having such a structure are dispersed in a hydrophilic solvent is It is used as an ingredient in pharmaceuticals, non-medicinal products, cosmetics, etc.
  • the present inventors have developed a nanodisk containing a lipid bilayer and a lipopeptide biosurfactant (Patent Document 1).
  • Patent Document 2 discloses a reverse vesicle composed of a sugar-type biosurfactant compound such as mannosylargitol lipid and a self-assembled bilayer membrane.
  • Patent Document 3 discloses a reverse vesicle composition containing a silicone surfactant, water, and an oil agent.
  • Patent Document 4 discloses a reverse vesicle (inverted vesicle) containing a specific fatty acid ester as a nonionic surfactant.
  • Patent Document 5 discloses a reverse vesicle composition containing specific sphingosines, fatty acids, hydrocarbon oils, ester oils, and water.
  • an object of the present invention is to provide a reverse nanodisk and a lipophilic dispersion liquid in which the reverse nanodisk is dispersed in a lipophilic solvent.
  • the present inventors have conducted extensive research to solve the above problems. As a result, they have found that a reverse nanodisk can be produced by using a nonionic surfactant as the lipid constituting the lipid bilayer and using a lipopeptide biosurfactant as the membrane scaffold compound, and completed the present invention. Hereinafter, the present invention will be shown.
  • the nonionic surfactant forms a lipid bilayer with its lipophilic portion on the outside and its hydrophilic portion on the inside.
  • a method for manufacturing reverse nanodisks A step of obtaining a reverse vesicle dispersion by stirring a mixture of an aqueous solvent solution of a nonionic surfactant and a lipophilic solvent, and A method comprising a step of obtaining a reverse nanodisk by adding a polypeptide biosurfactant to the reverse vesicle dispersion.
  • the method according to the above [8] which uses the aqueous solvent solution of 1 part by mass or more and 4 parts by mass or less with respect to 1 part by mass of the nonionic surfactant.
  • the method according to the above [8] or [9] wherein the aqueous solvent solution further contains a monohydric C 4-20 alcohol.
  • the reverse nanodisk contains the hydrophilic compound, a nonionic surfactant, and a lipopeptide biosurfactant.
  • the nonionic surfactant forms a lipid bilayer with its lipophilic portion on the outside and its hydrophilic portion on the inside.
  • the lipopeptide biosurfactant is attached to the side surface of the lipid bilayer.
  • a method for infiltrating a hydrophilic compound into skin tissue Including the step of administering reverse nanodiscs to the skin
  • the reverse nanodisk contains the hydrophilic compound, a nonionic surfactant, and a lipopeptide biosurfactant.
  • the nonionic surfactant forms a lipid bilayer with its lipophilic portion on the outside and its hydrophilic portion on the inside.
  • a method characterized in that the lipopeptide biosurfactant is attached to the side surface of the lipid bilayer in the reverse nanodisk.
  • a reverse nanodisk which is considered to have a very high industrial utility value if it can be put into practical use is provided.
  • FIG. 1 is an enlarged photograph of an inverted vesicle dispersion liquid using a phase-contrast microscope.
  • FIG. 1 (a) is an enlarged photograph under normal conditions
  • FIG. 1 (b) is an enlarged photograph under orthogonal Nicol.
  • FIG. 2A is a photograph of the appearance of the reverse vesicle dispersion
  • FIG. 2B is a photograph of the appearance of the reverse nanodisk dispersion prepared by adding sodium surfactin to the reverse vesicle dispersion.
  • FIG. 3 is a graph showing the particle size distribution of the inverse nanodisk.
  • FIG. 4 is a transmission electron micrograph of a negatively stained reverse nanodisk.
  • FIG. 5 is a schematic diagram of the formation mechanism of the inverted nanodisk according to the present invention.
  • the reverse nanodisk according to the present invention contains a nonionic surfactant and a lipopeptide biosurfactant.
  • the nonionic surfactant is a compound having a hydrophilic part and a lipophilic part having no ionic group and exhibiting surface activity.
  • examples of the nonionic surfactant include sucrose fatty acid ester, sorbitan fatty acid ester, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, polyoxyethylene alkyl ether, polyoxyethylene alkyl phenol ether, fatty acid alkanolamide and the like.
  • Sucrose fatty acid esters are esters of sucrose and long chain fatty acids, such as sucrose lauric acid ester, sucrose myristic acid ester, sucrose palmitate ester, sucrose stearate ester, and sucrose oleic acid ester. Such as sucrose C 12-20 fatty acid ester.
  • the sorbitan fatty acid ester is an ester of sorbitan and a long-chain fatty acid, for example, sorbitan monooleate, sorbitan isostearate, sorbitan monolaurate, sorbitan monopalmitate, sorbitan monostearate, sorbitan sesquioleate, sorbitan triole.
  • sorbitan monooleate for example, sorbitan monooleate, sorbitan isostearate, sorbitan monolaurate, sorbitan monopalmitate, sorbitan monostearate, sorbitan sesquioleate, sorbitan triole.
  • sorbitan C 12-20 fatty acid esters such as ate.
  • the polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester has the general formula R-COO- [sorbitan]-((CH 2 CH 2 O) n -H) m (m indicates an integer of 1 or more and 3 or less, n is 10 or more and 100. It is an ester ether type nonionic surfactant in which ethylene oxide is added to a sorbitan fatty acid ester, which is represented by the following integer.
  • R-COO- [sorbitan]-((CH 2 CH 2 O) n -H) m indicates an integer of 1 or more and 3 or less, n is 10 or more and 100.
  • It is an ester ether type nonionic surfactant in which ethylene oxide is added to a sorbitan fatty acid ester, which is represented by the following integer.
  • POE (20) sorbitan monostearate or POE (20) sorbitan. Tristearate can be mentioned.
  • Polyoxyethylene alkyl ether is represented by the general formula RO- (CH 2 CH 2 O) p -H, also called alcohol ethoxylate, and is an ether-type nonionic surfactant obtained by ethoxylating alcohol with ethylene oxide.
  • the activator include POE-C 12-20 alkyl ethers having an ethylene oxide unit repeating number p of 20 or more and 200 or less.
  • the polyoxyethylene alkyl phenol ether is an ether type represented by the general formula R- (C 6 H 4 ) -O- (CH 2 CH 2 O) q -H (q indicates an integer of 5 or more and 60 or less). It is a nonionic surfactant of, and examples thereof include poly (oxyethylene) octylphenyl ether.
  • the fatty acid alkanolamide is a tertiary amide in which hydrogen of ammonia is replaced with an R-CO- group and two ethanol groups, and is represented by the general formula R-CON (CH 2 CH 2 OH) 2 , for example, lauric acid.
  • nonionic surfactant only one type of nonionic surfactant may be used alone, or two or more types of nonionic surfactant may be used in combination.
  • nonionic surfactant sucrose fatty acid ester is preferable.
  • the lipopeptide biosurfactant has a hydrophobic group and a peptide structure containing a hydrophilic moiety, exhibits a surface-active action, and is produced by a microorganism.
  • examples of the lipopeptide biosurfactant include surfactin, arslovactin, itulin, fendisin, serawettin, leikecin, and biscocin.
  • surfactin represented by the following formula (I) or a salt thereof (hereinafter referred to as “surfactin (I)" is preferable.
  • the carboxymethyl group and the root of the carboxyethyl group represent an optically active point.
  • X represents any one amino acid residue selected from leucine, isoleucine and valine.
  • the amino acid residue as X may be L-form or D-form, but L-form is preferable.
  • R 1 represents a C 9-18 alkyl group.
  • the "C 9-18 alkyl group” refers to a linear or branched monovalent saturated hydrocarbon group having 9 or more carbon atoms and 18 or less carbon atoms.
  • N-tetradecyl n-pentadecylic, n-hexadecyl, n-heptadecyl, n-octadecyl and the like.
  • the above-mentioned surfactin (I) may be used alone or in combination of two or more.
  • the C 9-18 alkyl group of R 1 may contain a plurality of different surfactins (I).
  • Surfactin (I) can be used by culturing a microorganism, for example, a strain belonging to Bacillus subtilis, and separating it from the culture solution according to a known method, and it can be used as a refined product or an unrefined product.
  • the culture solution can be used as it is.
  • those obtained by a chemical synthesis method can also be used in the same manner.
  • a salt of surfactin (I) can also be used.
  • the counter cation constituting the salt is not particularly limited, and examples thereof include alkali metal ions and ammonium ions.
  • the alkali metal ion that can be used for the salt of surfactin (I) is not particularly limited, but represents lithium ion, sodium ion, potassium ion, or the like. Further, the two alkali metal ions may be the same as each other or may be different from each other.
  • Examples of the substituent of the ammonium ion include alkyl groups such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl and t-butyl; aralkyl groups such as benzyl, methylbenzyl and phenylethyl; phenyl, toluyl, xsilyl and the like. Examples thereof include organic groups such as the aryl group of. Examples of the ammonium ion include tetramethylammonium ion, tetraethylammonium ion, pyridinium ion and the like.
  • the two counter cations may be the same or different from each other. Further, it is assumed that one of the carboxy groups may be in the state of -COOH or -COO-.
  • the hydrophobic part of the amphipathic membrane scaffold protein is bound and coated on the side surface of the lipid bilayer, and the hydrophilic part of the lipid faces outward in the lipid bilayer. It is stabilized by a structure in which the oil-based part faces inward.
  • the lipopeptide biosurfactant is bound to the side hydrophobic portion of the lipid bilayer and coated, and the lipophilic portion of the lipid faces outward in the lipid bilayer, and the hydrophilic portion. Is considered to be stable due to the structure facing inward.
  • a cyclic peptide is pierced into a lipid bilayer as an ion channel, or a lipid having a bulky hydrophobic moiety and a surfactant having a bulky hydrophilic moiety form a bilayer. Therefore, even in the reverse nanodisk according to the present invention, it is possible that some lipopeptide biosurfactants form a bilayer together with the nonionic surfactant.
  • the size of the inverted nanodisk according to the present invention may be 2 nm or more and 10 nm or less, a diameter of 5 nm or more and less than 20 nm in a state where the lipid bilayer is a single layer.
  • the thickness is preferably 3 nm or more, more preferably 4 nm or more, preferably 8 nm or less, and more preferably 6 nm or less.
  • the diameter is preferably 6 nm or more, more preferably 7 nm or more, more preferably 15 nm or less, and even more preferably 12 nm or less.
  • the reverse nanodisk according to the present invention may contain components other than the nonionic surfactant and the lipopeptide biosurfactant.
  • monovalent C 4-20 alcohol helps dissolve some nonionic surfactants that are not sufficiently soluble, and due to their amphipathic nature, it constitutes a lipid bilayer mainly composed of nonionic surfactants. It becomes a component and may contribute to the formation and stabilization of the lipid bilayer.
  • Examples of the monohydric C 4-20 alcohol include butanol such as n-butanol, isobutanol, s-butanol, and t-butanol, pentanol, hexanol, heptanol, octanol, nonanol, decanol, undecanol, dodecanol, tridecanol, and tetra.
  • Monohydric C 4-20 alcohols such as decanol, pentadecanol, hexadecanol, heptadecanol, octadecanol, nonadecanol, and icosanol can be used.
  • the number of carbon atoms is 4 or more and 20 or less, it is considered that it can contribute to the formation and stabilization of the lipid bilayer of the nonionic surfactant.
  • the alcohol monohydric C 5-15 alcohol is preferable, and monovalent C 6-10 alcohol is more preferable.
  • the reverse nanodisk according to the present invention may contain an aqueous solvent.
  • the lipid bilayer of the reverse nanodisk according to the present invention has a hydrophilic layer in which the hydrophilic portions of the nonionic surfactant are aggregated, and the aqueous solvent can exist in the hydrophilic layer. Like the C 4-20 alcohol, it is thought to contribute to the formation and stabilization of the lipid bilayer.
  • the aqueous solvent include water and a mixed solvent of a water-miscible organic solvent and water.
  • the water-miscible organic solvent means an organic solvent that can be miscible with water at normal temperature and pressure without limitation, and examples thereof include monohydric C 1-4 alcohols such as methanol, ethanol, n-propanol, and isopropanol, and ethanol and ethanol. / Or isopropanol is preferred.
  • the mixing ratio of water and the water-miscible organic solvent in the water-based mixed solvent may be appropriately adjusted, and for example, the ratio of the water-miscible organic solvent to the water-based mixed solvent can be 50% by mass or less.
  • the ratio is preferably 40% by mass or less or 30% by mass or less, more preferably 20% by mass or less or 10% by mass or less, still more preferably 5% by mass or less, 2% by mass or less or 1% by mass or less.
  • the aqueous solvent may be a buffer solution, and its pH is not particularly limited.
  • the lipid bilayer may contain a lipophilic solvent.
  • the lipophilic solvent is not particularly limited as long as it forms two layers when mixed with water, and is, for example, an aliphatic hydrocarbon solvent, animal and vegetable fats and oils, hydrogenated animal and vegetable fats and oils, fatty acid glyceride, aromatic hydrocarbon solvent and the like. Can be mentioned.
  • aliphatic hydrocarbon solvent examples include C 6-12 aliphatic hydrocarbon solvents such as hexane, heptane, octane, nonan, decane, undecane, and dodecane, as well as mixed aliphatic solvents such as honey wax, candelilla wax, and rice bran wax. Hydrocarbon solvents can be mentioned.
  • Animal and vegetable oils include palm oil, shea oil, monkey oil, iripe oil, pork oil, beef oil, rapeseed oil, rice oil, peanut oil, olive oil, corn oil, soybean oil, perilla oil, cottonseed oil, sunflower oil, and evening primrose oil.
  • Examples include sesame oil, safflower oil, palm oil, cacao butter, palm kernel oil, fish oil, wakame oil, and comb oil.
  • Examples of hydrogenated animal and vegetable fats and oils include palm hardened oil, palm extremely hardened oil, rapeseed hardened oil, rapeseed extremely hardened oil, soybean hardened oil, pork fat hardened oil, fish oil hardened oil and the like.
  • the fatty acid glyceride may be any of tri-, di-, and mono-glycerides, and examples thereof include stearin glyceride, palmitic glyceride, and lauric glyceride.
  • aromatic hydrocarbon solvent examples include benzene, toluene, chlorobenzene, dichlorobenzene and the like.
  • an aliphatic hydrocarbon solvent is preferable, a C 6-12 aliphatic hydrocarbon solvent or a C 8-12 aliphatic hydrocarbon solvent is more preferable, and decane is even more preferable.
  • the lipid bilayer of the reverse nanodisk according to the present invention has a hydrophilic layer in which the hydrophilic portions of the nonionic surfactant are aggregated, and a lipophilic layer in which the lipophilic portions of the nonionic surfactant are aggregated. It has on the outside.
  • the inverse nanodisks according to the invention may contain hydrophilic compounds and / or lipophilic compounds.
  • the hydrophilic compound is not particularly limited as long as it is a compound showing an affinity for water molecules.
  • a hydrophilic compound 1 g or 1 mL is placed in water and strongly every 5 minutes at 20 ⁇ 5 ° C. for 30 seconds.
  • the amount of such water is preferably less than 10 mL, more preferably less than 1 mL.
  • Many of the hydrophilic compounds are water-soluble, and may be contained in the hydrophilic layer of the lipid bilayer, or may be adsorbed on the hydrophilic portion of the reverse nanodisk and stabilized. It may also be possible to stabilize an active ingredient, such as a metal oxide, which is hydrophilic but insoluble in water, by adsorbing it on the hydrophilic portion of the reverse nanodisk.
  • hydrophilic compounds include ultraviolet scattering agents such as titanium oxide particles and zinc oxide particles; inorganic pigments such as red iron oxide, titanium oxide and iron oxide; water-soluble vitamins such as ascorbic acid and its derivatives; locust bean gum and guar gum.
  • ultraviolet scattering agents such as titanium oxide particles and zinc oxide particles
  • inorganic pigments such as red iron oxide, titanium oxide and iron oxide
  • water-soluble vitamins such as ascorbic acid and its derivatives
  • locust bean gum and guar gum examples include thickeners such as derivatives, carrageenan, pectin, xanthan gum, gellan gum, and alginic acid.
  • a lipophilic compound is a compound that has a lipophilic group, is sparingly or insoluble in water, and is soluble in oil.
  • a lipophilic compound is a compound in which, for example, when 1 g or 1 mL is placed in water and shaken vigorously every 5 minutes at 20 ⁇ 5 ° C. for 30 seconds, the amount of water required to dissolve within 30 minutes is 30 mL or more. .. The amount of such water is preferably 100 mL or more, more preferably 1000 mL or more, or 10000 mL or more.
  • the lipophilic compound used in the present invention is not particularly limited as long as it is an active ingredient to be blended in cosmetics, pharmaceutical compositions, etc., but for example, a whitening agent, an antiaging agent, an antioxidant, a moisturizer, a hair restorer, and cell activation.
  • Agents, vitamins, amino acids, etc. may be mentioned. More specifically, fat-soluble vitamins such as tocopherol, coenzyme Q10, reduced coenzyme Q10, and derivatives thereof; oils such as squalane; steroidal anti-inflammatory agents such as hydrocortisone, prednisolone, dexamethasone, betamethasone; acetyl.
  • Non-steroidal anti-inflammatory agents such as salicylic acid, ibuprofen, indomethasone, loxoprofen; antibiotics; antifungal agents; preservatives such as methylparaben; fragrances such as menthol; pigments such as alizanin.
  • albutin and its derivatives L-ascorbic acid and its derivatives; hydroquinone and its derivatives; glutathione and its derivatives; placenta extract; pantothenic acid and its derivatives; tranexamic acid and its derivatives; Derivatives; Plant extracts such as chamomile extract and citrus extract; Carotenoids such as beta-carotene; Astaxanthin and its derivatives; Flavonoids; Catechin and its derivatives; Vitamin A and its derivatives; ⁇ -lipoic acid and its derivatives; Glycyrrhizic acid And its derivatives; thiotaurine and its derivatives; urea and its derivatives; glycerin derivatives; salicylic acid and its derivatives; nicotinic acid and its derivatives; L-amino acids and its derivatives; adenosine and its derivatives; plant female hormone-like components such as isoflavone; Grablydin and its derivatives; Magnolignan and its derivatives
  • the reverse nanodisk according to the present invention is, for example, a step of obtaining a reverse vesicle dispersion by stirring a mixture of an aqueous solvent solution of a nonionic surfactant and a lipophilic solvent, and a polypeptide bio in the reverse vesicle dispersion. It can be manufactured by a method including a step of obtaining a reverse nanodisk by adding a surfactant.
  • the reverse nanodisk according to the present invention may be produced by mixing each component including a component that can be used as a solvent with only gentle stirring or without stirring.
  • the amount of the aqueous solvent used may be appropriately adjusted within a range in which the nonionic surfactant can be dissolved at normal temperature and pressure.
  • the mass ratio of the aqueous solvent to 1 part by mass of the nonionic surfactant is 1 or more and 4 or less. Can be. If the ratio is 1 or more, the nonionic surfactant can be dissolved more reliably, and if the ratio is 4 or less, it is considered that the formation of the reverse vesicle is not inhibited.
  • the ratio is preferably 1.5 or more, preferably 3 or less, and more preferably 2.5 or less.
  • a monohydric C 4-20 alcohol may be added to the mixture of the nonionic surfactant and the aqueous solvent in order to dissolve the nonionic surfactant and to promote the formation of a reverse vesicle.
  • the amount of the monovalent C 4-20 alcohol added may be appropriately adjusted within the range in which the above effects are exhibited.
  • the mass ratio of the monovalent C 4-20 alcohol to 1 part by mass of the nonionic surfactant is 0. It can be 5.5 or more and 2 or less. If the ratio is within the range, the above effect is more reliably discarded.
  • the ratio is preferably 0.8 or more, preferably 1.5 or less, and more preferably 1.2 or less.
  • a lipophilic solvent is added and stirred vigorously to form a reverse vesicle.
  • the amount of the lipophilic solvent may be appropriately adjusted within the range in which the reverse vesicle is formed.
  • the mass ratio of the lipophilic solvent to 1 part by mass of the nonionic surfactant may be 2 or more and 10 or less. can.
  • the ratio is 2 or more, the reverse vesicles are formed more reliably, and when the ratio is 10 or less, it is considered that the formation of the reverse nanodisks in the next step is not hindered.
  • 3 or more or 4 or more is preferable, 5 or more is more preferable, 8 or less is preferable, and 7 or less is more preferable.
  • the mixture of the nonionic surfactant solution and the lipophilic solvent is stirred vigorously to the extent that a reverse vesicle is formed.
  • the stirring intensity may be appropriately adjusted within a range in which a reverse vesicle is formed according to the amount of the mixture or the like.
  • the stirring may be performed at a rotation speed of 200 rpm or more and 10,000 rpm or less for 30 seconds or more and 30 minutes or less.
  • a vortex mixer or the like can be used for a small scale, and a homogenizer or a dissolver provided with a stirring blade or the like can be used for a large scale.
  • a reverse nanodisk is obtained by adding a polypeptide biosurfactant to the reverse vesicle dispersion obtained above.
  • a general vesicle is a spherical particle of about 20 to 400 ⁇ m composed of a lipid bilayer, and the dispersion liquid is cloudy.
  • the reverse vesicle dispersion is cloudy, it tends to appear transparent at least to the naked eye when finer reverse nanodisks are formed by the addition of the polypeptide biosurfactant.
  • a small amount of the polypeptide biosurfactant may be added to the reverse vesicle dispersion and stirred, or the polypeptide biosurfactant may be continuously or intermittently added to the stirred reverse vesicle dispersion.
  • the amount of lipopeptide biosurfactant used may be appropriately adjusted within the range in which reverse nanodisks are formed.
  • the mass ratio of lipopeptide biosurfactant to 1 part by mass of nonionic surfactant can be 0.001 or more and 0.5 or less. If the ratio is 0.001 or more, the reverse nanodisks are formed more reliably, and if the ratio is 0.5 or less, the amount of lipopeptide biosurfactants that are not involved in the formation of the reverse nanodisks is so excessive. Not economical.
  • 0.005 or more is preferable, 0.01 or more is more preferable, 0.5 or less or 0.1 or less is preferable, 0.05 or less is more preferable, and 0.02 or less is further preferable. ..
  • ingredients other than nonionic surfactant, aqueous solvent, monohydric C4-20 alcohol, lipophilic solvent, and lipopeptide biosurfactant may be added in a timely manner.
  • the hydrophilic compound may be added to the aqueous solvent in a timely manner.
  • the lipophilic compound is preferably allowed to coexist with the lipophilic solvent.
  • the amount of the lipophilic compound and the hydrophilic compound is preferably 0.001 part by mass or more and 1 part by mass or less, and 0.005 part by mass or more and 0.5 part by mass or less, respectively, with respect to 1 part by mass of the nonionic surfactant. Is more preferable, and 0.01 parts by mass or more and 0.2 parts by mass or less are even more preferable.
  • the reverse nanodisk may be freeze-dried and then dispersed again in a lipophilic solvent.
  • the reverse nanodisc concentration of the redissolve can be adjusted arbitrarily.
  • the reverse nanodisk according to the present invention can take in a hydrophilic compound or a lipophilic compound therein and disperse it well in a lipophilic solvent, the dispersion liquid is very fine. It looks sufficiently transparent to the eye and is considered to have high permeability to skin tissues and the like. In the cosmetics industry in particular, in general, the state in which the dispersoid cannot be visually confirmed and the dispersion is visually transparent may be referred to as "solubilization". Therefore, it can be said that the reverse nanodisc according to the present invention is very effective as a component of a personal care composition or a pharmaceutical composition such as a cosmetic which is an O / W emulsion preparation.
  • DK ester nonionic surfactant
  • SS manufactured by Daiichi Kogyo Seiyaku Co., Ltd., sucrose fatty acid ester
  • n-decane was added to the nonionic surfactant, and the mixture was stirred for 1 minute using a vortex mixer to obtain a cloudy liquid.
  • a phase-contrast microscope (“BX41” manufactured by OLYMPUS)
  • a donut-shaped molecular aggregate was observed as shown in FIG. 1 (a).
  • the cloudy liquid was observed under orthogonal Nicol, maltase cloth was confirmed as shown in FIG. 1 (b), and it was clarified that the reverse vesicle was formed.
  • fine nanoparticles having a hydrodynamic diameter of 13.7 ⁇ 2.1 nm were measured. Since the minimum particle size of the vesicle structure is about 20 nm, it is considered that nanodisks having an inverted structure are formed instead of vesicles.
  • the solution was negatively stained and observed with a transmission electron microscope (“H-7650” manufactured by Hitachi High-Technologies Corporation). For negative staining, a 1% aqueous sodium phosphotungstate solution was used, the acceleration voltage was set to 100 kV, and a grid reinforced with carbon with 200 mesh was used.
  • the sodium phosphotungstate aqueous solution is prepared by weighing 50 mg of sodium phosphotungstate, adding 5 mL of ultrapure water, stirring for 5 minutes under shading, and adjusting the pH to 6.8 with a 5 M sodium hydroxide aqueous solution. , 0.1 ⁇ m or 0.22 ⁇ m PVDF Syringe filter before use.
  • the results are shown in FIG.
  • Fig. 4 As shown in the transmission electron micrograph in Fig. 4, a large number of uniform nanoparticles were observed, and from the results of image analysis, particles with a diameter of 13.1 ⁇ 1.7 nm, which is almost the same as the dynamic light scattering measurement in Fig. 3. It was found that nanoparticles with an extremely narrow diameter distribution were obtained.

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Abstract

本発明は、逆ナノディスクと、当該逆ナノディスクが親油性溶媒中に分散している親油性分散液を提供することを目的とする。本発明に係る逆ナノディスクは、非イオン界面活性剤、およびリポペプチドバイオサーファクタントを含有し、前記非イオン界面活性剤が、その親油性部分を外側に、その親水性部分を内側にして脂質二重層を形成し、前記リポペプチドバイオサーファクタントが前記脂質二重層の側面に結合していることを特徴とする。

Description

逆ナノディスク
　本発明は、逆ナノディスクと、当該逆ナノディスクが親油性溶媒中に分散している親油性分散液に関するものである。
　化粧料や医薬部外品、医薬品などにおいて有効成分を皮膚に浸透させる技術として、ミセルやベシクル等の分子集合体が用いられることがある。一般的なミセルは、親水性溶媒中で親水性部分が外側を向き、親油性部分が内側を向いて界面活性剤が集合することにより形成される。ベシクルは二層以上の界面活性剤層で構成される球状粒子である。特にリン脂質や糖脂質で構成されたベシクルはリポソームと呼ばれている。一般にリポソームの大きさは０．１～数百μｍと比較的大きく、これを親水性溶媒中に含む親水性分散液は白濁したものである。
　近年、リポソームと同様に脂質二重層からなるナノ粒子またはナノディスクと呼ばれる微細な粒子が開発されている。一般的なナノディスクは、脂質二重層の側面に膜スキャフォールドタンパク質が結合して固定化された微粒子をいい、この様な構造の微粒子が親水性溶媒に分散している親水性分散物は、医薬品、医薬部外品、化粧品などの成分として利用されている。例えば本発明者らは、脂質二重層とリポペプチドバイオサーファクタントを含むナノディスクを開発している（特許文献１）。
　一方、一般的なベシクルとは逆に、親油性溶媒中で最外面が脂質の親油性層からなり、内部に親水性層を有する構造の逆ベシクルも存在するが、その報告事例は少なく、その特性、用途、製法などについても十分研究が進んでいるとは言い難い。例えば特許文献２には、マンノシルアルジトールリピッド等の糖型バイオサーファクタント化合物と自己組織化２分子膜からなる逆ベシクルが開示されている。特許文献３には、シリコーン界面活性剤、水、および油剤を含有する逆ベシクル組成物が開示されている。特許文献４には、非イオン界面活性剤として特定の脂肪酸エステルを含む逆ベシクル（反転ベシクル）が開示されている。特許文献５には、特定のスフィンゴシン類、脂肪酸、炭化水素油、エステル油、および水を含む逆ベシクル組成物が開示されている。
国際公開第２０１８／１８１５３８号パンフレット 特開２０１１－７４０５８号公報 特開２０１４－１２５４７１号公報 特開２００９－６２３８６号公報 特開２００９－６２３６５号公報
　上述したように、逆ベシクルは知られているが、一般的な逆ベシクルやベシクルの粒子径は比較的大きく、その分散液は白濁している。それに対してナノディスクの粒子径は比較的小さく、その分散液は肉眼では透明であるが、逆ベシクル自体の研究が未だ十分ではなく、逆ナノディスクは知られていない。しかし逆ナノディスクが実用化できれば、産業上の利用価値は非常に高いと考えられる。
　そこで本発明は、逆ナノディスクと、当該逆ナノディスクが親油性溶媒中に分散している親油性分散液を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、脂質二重層を構成する脂質として非イオン界面活性剤を用い、且つ膜スキャホールド化合物としてリポペプチドバイオサーファクタントを用いることにより逆ナノディスクを製造できることを見出して、本発明を完成した。
　以下、本発明を示す。
　［１］　非イオン界面活性剤、およびリポペプチドバイオサーファクタントを含有し、
　前記非イオン界面活性剤が、その親油性部分を外側に、その親水性部分を内側にして脂質二重層を形成し、
　前記リポペプチドバイオサーファクタントが前記脂質二重層の側面に結合していることを特徴とする逆ナノディスク。
　［２］　前記脂質二重層が水系溶媒を含む上記［１］に記載の逆ナノディスク。
　［３］　前記脂質二重層が親水性化合物を含む上記［１］または［２］に記載の逆ナノディスク。
　［４］　前記脂質二重層が親油性化合物を含む上記［１］～［３］のいずれかに記載の逆ナノディスク。
　［５］　体積平均粒子径が５ｎｍ以上、２０ｎｍ未満である上記［１］～［４］のいずれかに記載の逆ナノディスク。
　［６］　前記リポペプチドバイオサーファクタントがサーファクチンまたはその塩である上記［１］～［５］のいずれかに記載の逆ナノディスク。
　［７］　親油性溶媒中に上記［１］～［６］のいずれかに記載の逆ナノディスクが分散していることを特徴とする親油性分散液。
　［８］　逆ナノディスクを製造するための方法であって、
　非イオン界面活性剤の水系溶媒溶液と親油性溶媒の混合物を撹拌することにより逆ベシクル分散液を得る工程、および、
　前記逆ベシクル分散液にポリペプチドバイオサーファクタントを添加することにより逆ナノディスクを得る工程を含むことを特徴とする方法。
　［９］　前記非イオン界面活性剤１質量部に対して１質量部以上、４質量部以下の前記水系溶媒溶液を用いる上記［８］に記載の方法。
　［１０］　前記水系溶媒溶液が、更に一価Ｃ4-20アルコールを含む上記［８］または［９］に記載の方法。
　［１１］　前記リポペプチドバイオサーファクタントがサーファクチンまたはその塩である上記［８］～［１０］のいずれかに記載の方法。
　［１２］　前記非イオン界面活性剤１質量部に対して０．００１質量部以上、０．５質量部以下の前記リポペプチドバイオサーファクタントを用いる上記［８］～［１１］のいずれかに記載の方法。
　［１３］　親水性化合物を皮膚組織へ浸透させるための逆ナノディスクの使用であって、
　前記逆ナノディスクが、前記親水性化合物、非イオン界面活性剤、およびリポペプチドバイオサーファクタントを含有し、
　前記逆ナノディスクにおいて、前記非イオン界面活性剤が、その親油性部分を外側に、その親水性部分を内側にして脂質二重層を形成し、
　前記逆ナノディスクにおいて、前記リポペプチドバイオサーファクタントが前記脂質二重層の側面に結合していることを特徴とする使用。
　［１４］　前記脂質二重層が水系溶媒を含む上記［１３］に記載の使用。
　［１５］　前記逆ナノディスクの体積平均粒子径が５ｎｍ以上、２０ｎｍ未満である上記［１３］または［１４］のいずれかに記載の使用。
　［１６］　前記リポペプチドバイオサーファクタントがサーファクチンまたはその塩である上記［１３］～［１５］のいずれかに記載の使用。
　［１７］　前記逆ナノディスクが親油性溶媒中に分散している上記［１３］～［１６］のいずれかに記載の使用。
　［１８］　親水性化合物を皮膚組織へ浸透させるための方法であって、
　逆ナノディスクを皮膚へ投与する工程を含み、
　前記逆ナノディスクが、前記親水性化合物、非イオン界面活性剤、およびリポペプチドバイオサーファクタントを含有し、
　前記逆ナノディスクにおいて、前記非イオン界面活性剤が、その親油性部分を外側に、その親水性部分を内側にして脂質二重層を形成し、
　前記逆ナノディスクにおいて、前記リポペプチドバイオサーファクタントが前記脂質二重層の側面に結合していることを特徴とする方法。
　［１９］　前記逆ナノディスクの親油性溶媒分散液を前記皮膚へ投与する上記［１８］に記載の方法。
　［２０］　前記脂質二重層が水系溶媒を含む上記［１８］または［１９］に記載の方法。
　［２１］　前記逆ナノディスクの体積平均粒子径が５ｎｍ以上、２０ｎｍ未満である上記［１８］～［２０］のいずれかに記載の方法。
　［２２］　前記リポペプチドバイオサーファクタントがサーファクチンまたはその塩である上記［１８］～［２１］のいずれかに記載の方法。
　本発明によれば、実用化できれば産業上の利用価値が非常に高いと考えられる逆ナノディスクが提供される。
図１は、位相差顕微鏡を使った逆ベシクル分散液の拡大写真である。図１（ａ）は通常条件下での拡大写真であり、図１（ｂ）は直交ニコル下での拡大写真である。 図２（ａ）は、逆ベシクル分散液の外観写真であり、図２（ｂ）は、逆ベシクル分散液にサーファクチンナトリウムを添加して調製した逆ナノディスク分散液の外観写真である。 図３は、逆ナノディスクの粒度分布を示すグラフである。 図４は、ネガティブ染色した逆ナノディスクの透過型電子顕微鏡写真である。 図５は、本発明に係る逆ナノディスクの形成機構の模式図である。
　本発明に係る逆ナノディスクは、非イオン界面活性剤とリポペプチドバイオサーファクタントを含有する。
　非イオン界面活性剤とは、イオン性基を有さない親水性部分と親油性部分を有し、界面活性を示す化合物をいう。非イオン界面活性剤としては、例えば、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェノールエーテル、脂肪酸アルカノールアミド等が挙げられる。
　ショ糖脂肪酸エステルは、ショ糖と長鎖脂肪酸とのエステルであり、例えば、ショ糖ラウリン酸エステル、ショ糖ミリスチン酸エステル、ショ糖パルミチン酸エステル、ショ糖ステアリン酸エステル、およびショ糖オレイン酸エステル等のショ糖Ｃ12-20脂肪酸エステルが挙げられる。
　ソルビタン脂肪酸エステルは、ソルビタンと長鎖脂肪酸とのエステルであり、例えば、ソルビタンモノオレエート、ソルビタンイソステアレート、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタンセスキオレエート、ソルビタントリオレエート等のソルビタンＣ12-20脂肪酸エステルが挙げられる。
　ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルは、一般式Ｒ－ＣＯＯ－［ソルビタン］－（（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n－Ｈ）m（ｍは１以上、３以下の整数を示し、ｎは１０以上、１００以下の整数を示す。）で表される、ソルビタン脂肪酸エステルに酸化エチレンを付加したエステル・エーテル型の非イオン界面活性剤であり、例えば、ＰＯＥ（２０）ソルビタンモノステアレートやＰＯＥ（２０）ソルビタントリステアレートが挙げられる。
　ポリオキシエチレンアルキルエーテルは、一般式Ｒ－Ｏ－（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）p－Ｈで表され、アルコールエトキシレートとも呼ばれ、アルコールを酸化エチレンでエトキシ化して得られるエーテル型の非イオン界面活性剤であり、例えば、エチレンオキサイド単位の繰返し数ｐが２０以上、２００以下のＰＯＥ－Ｃ12-20アルキルエーテルが挙げられる。
　ポリオキシエチレンアルキルフェノールエーテルは、一般式Ｒ－（Ｃ6Ｈ4）－Ｏ－（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）q－Ｈ（ｑは５以上、６０以下の整数を示す。）で表されるエーテル型の非イオン界面活性剤であり、例えば、ポリ（オキシエチレン）オクチルフェニルエーテルが挙げられる。
　脂肪酸アルカノールアミドは、アンモニアの水素がＲ－ＣＯ－基と２つのエタノール基で置換された３級アミドであり、一般式Ｒ－ＣＯＮ（ＣＨ2ＣＨ2ＯＨ）2で表され、例えば、ラウリン酸ジエタノールアミド、ラウリン酸ミリスチン酸ジエタノールアミド、ステアリン酸ジエタノールアミド、オレイン酸ジエタノールアミド、Ｃ8-18脂肪酸メチルエタノールアミド、ヤシ油脂肪酸ジエタノールアミド、パーム核油脂肪酸ジエタノールアミド、モディファイドヤシ油脂肪酸ジエタノールアミド、ヤシ油脂肪酸モノエタノールアミド、ステアリン酸モノエタノールアミド、ラウリン酸モノイソプロパノールアミド、ヤシ油脂肪酸Ｎ－メチルエタノールアミドが挙げられる。
　１種のみの非イオン界面活性剤を単独で用いてもよいし、２種以上の非イオン界面活性剤を併用してもよい。非イオン界面活性剤としては、ショ糖脂肪酸エステルが好ましい。
　リポペプチドバイオサーファクタントは、疎水性基と、親水性部分を含むペプチド構造を有し、界面活性作用を示すものであり、微生物が生産するものをいう。リポペプチドバイオサーファクタントとしては、例えば、サーファクチン、アルスロファクチン、イチュリン、フェンジシン、セラウェッチン、ライケシン、ビスコシンを挙げることができる。
　リポペプチドバイオサーファクタントとしては、下記式（Ｉ）で表されるサーファクチンまたはその塩（以下、「サーファクチン（Ｉ）」という）が好ましい。式（Ｉ）中、カルボキシメチル基およびカルボキシエチル基の根元は光学活性点を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　式（Ｉ）中、Ｘは、ロイシン、イソロイシンおよびバリンから選択されるいずれか１種のアミノ酸残基を表す。Ｘとしてのアミノ酸残基は、Ｌ体でもＤ体でもよいが、Ｌ体が好ましい。
　Ｒ1は、Ｃ9-18アルキル基を表す。ここで、「Ｃ9-18アルキル基」は、炭素数が９以上、１８以下の直鎖状または分枝鎖状の一価飽和炭化水素基をいう。例えば、ｎ－ノニル、６－メチルオクチル、７－メチルオクチル、ｎ－デシル、８－メチルノニル、ｎ－ウンデシル、９－メチルデシル、ｎ－ドデシル、１０－メチルウンデシル、ｎ－トリデシル、１１－メチルドデシル、ｎ－テトラデシル、ｎ－ペンタデシル、ｎ－ヘキサデシル、ｎ－ヘプタデシル、ｎ－オクタデシルなどが挙げられる。
　上記サーファクチン（Ｉ）は１種、または２種以上使用してもよい。例えば、Ｒ1のＣ9-18アルキル基が異なる複数のサーファクチン（Ｉ）を含むものであってもよい。
　サーファクチン（Ｉ）は、公知方法に従って、微生物、例えばバチルス・ズブチリスに属する菌株を培養し、その培養液から分離することができ、精製品であっても未精製品であっても使用できる。例えば培養液のまま使用することもできる。また、化学合成法によって得られるものでも同様に使用できる。
　サーファクチン（Ｉ）の塩も用いることができる。当該塩を構成するカウンターカチオンは特に制限されないが、例えばアルカリ金属イオンやアンモニウムイオンが挙げられる。
　サーファクチン（Ｉ）の塩に使用できるアルカリ金属イオンは特に限定されないが、リチウムイオン、ナトリウムイオン、カリウムイオンなどを表す。また、２つのアルカリ金属イオンは、互いに同一であってもよいし、異なっていてもよい。
　アンモニウムイオンの置換基としては、例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、ｔ－ブチル等のアルキル基；ベンジル、メチルベンジル、フェニルエチル等のアラルキル基；フェニル、トルイル、キシリル等のアリール基等の有機基が挙げられる。アンモニウムイオンとしては、例えば、テトラメチルアンモニウムイオン、テトラエチルアンモニウムイオン、ピリジニウムイオン等が挙げられる。
　なお、サーファクチン（Ｉ）の塩中、二つのカウンターカチオンは互いに同一であってもよいし、異なっていてもよいものとする。また、一方のカルボキシ基が－ＣＯＯＨまたは－ＣＯＯ-の状態になっていてもよいものとする。
　一般的なナノディスクは、脂質二重層の側面部に両親媒性である膜スキャフォールドタンパク質の疎水性部分が結合して被覆し、且つ、脂質二重層において脂質の親水性部分が外側を向き、親油性部分が内側を向いている構造で安定化している。それに対して本発明に係る逆ナノディスクは、脂質二重層の側面疎水部にリポペプチドバイオサーファクタントが結合して被覆し、且つ、脂質二重層において脂質の親油性部分が外側を向き、親水性部分が内側を向いている構造で安定化していると考えられる。更に、環状ペプチドがイオンチャネルとして脂質二重層に刺さっていたり、嵩高い疎水性部分を有する脂質と嵩高い親水性部分を有する界面活性剤が二重層を形成している例も知られていることから、本発明に係る逆ナノディスクでも、一部のリポペプチドバイオサーファクタントが非イオン界面活性剤と共に二重層を形成している可能性もあり得る。
　２以上の脂質二重層が互いに積層して多層構造を形成している場合がある。本発明に係る逆ナノディスクの大きさとしては、脂質二重層が単層の状態で、厚さが２ｎｍ以上、１０ｎｍ以下、直径が５ｎｍ以上、２０ｎｍ未満であってよい。当該厚さとしては３ｎｍ以上が好ましく、４ｎｍ以上がより好ましく、また、８ｎｍ以下が好ましく、６ｎｍ以下がより好ましい。当該直径としては、６ｎｍ以上が好ましく、７ｎｍ以上がより好ましく、また、１５ｎｍ以下が好ましく、１２ｎｍ以下がより好ましい。
　本発明に係る逆ナノディスクは、非イオン界面活性剤およびリポペプチドバイオサーファクタント以外の成分を含んでいてもよい。例えば一価Ｃ4-20アルコールは、溶解性が十分でない一部の非イオン界面活性剤の溶解を助け、また、その両親媒性により非イオン界面活性剤を主成分とする脂質二重層の構成成分となり、当該脂質二重層の形成や安定化に寄与する可能性がある。
　一価Ｃ4-20アルコールとしては、例えば、ｎ－ブタノール、イソブタノール、ｓ－ブタノール、ｔ－ブタノール等のブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、ヘプタノール、オクタノール、ノナノール、デカノール、ウンデカノール、ドデカノール、トリデカノール、テトラデカノール、ペンタデカノール、ヘキサデカノール、ヘプタデカノール、オクタデカノール、ノナデカノール、イコサノール等の一価Ｃ4-20アルコールを用いることができる。炭素数が４以上、２０以下であれば、非イオン界面活性剤の脂質二重層の形成や安定化に寄与できると考えられる。アルコールとしては、一価Ｃ5-15アルコールが好ましく、一価Ｃ6-10アルコールがより好ましい。
　本発明に係る逆ナノディスクは、水系溶媒を含んでいてもよい。本発明に係る逆ナノディスクの脂質二重層は、非イオン界面活性剤の親水性部分が集合した親水性層を内部に有し、水系溶媒はかかる親水性層中に存在することができ、一価Ｃ4-20アルコールと同様に、脂質二重層の形成や安定化に寄与すると考えられる。水系溶媒としては、例えば、水、および水混和性有機溶媒と水との混合溶媒が挙げられる。
　水混和性有機溶媒とは、常温常圧で水と無制限に混和可能な有機溶媒をいい、例えば、メタノール、エタノール、ｎ－プロパノール、イソプロパノール等の一価Ｃ1-4アルコールが挙げられ、エタノールおよび／またはイソプロパノールが好ましい。水系混合溶媒における水と水混和性有機溶媒との混合割合は適宜調整すればよいが、例えば、水系混合溶媒に対する水混和性有機溶媒の割合を５０質量％以下とすることができる。当該割合としては、４０質量％以下または３０質量％以下が好ましく、２０質量％以下または１０質量％以下がより好ましく、５質量％以下、２質量％以下または１質量％以下がより更に好ましい。また、水系溶媒は緩衝液であってもよく、そのｐＨは特に制限されない。
　本発明に係る逆ナノディスクの製造時には親油性溶媒を用いることから、脂質二重層には親油性溶媒が含まれる可能性がある。親油性溶媒は、水と混合した場合に二層を形成するものであれば特に制限されないが、例えば、脂肪族炭化水素溶媒、動植物油脂、水素添加動植物油脂、脂肪酸グリセリド、芳香族炭化水素溶媒などが挙げられる。
　脂肪族炭化水素溶媒としては、例えば、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、ノナン、デカン、ウンデカン、ドデカン等のＣ6-12脂肪族炭化水素溶媒の他、ミツロウ、キャンデリラロウ、米ぬかロウ等の混合脂肪族炭化水素溶媒が挙げられる。動植物油脂としては、パーム油、シア脂、サル脂、イリッペ脂、豚脂、牛脂、ナタネ油、米油、落花生油、オリーブ油、コーン油、大豆油、シソ油、綿実油、ヒマワリ油、月見草油、ゴマ油、サフラワー油、ヤシ油、カカオ脂、パーム核油、魚油、ワカメ油、コンブ油などが挙げられる。水素添加動植物油脂としては、パーム硬化油、パーム極度硬化油、ナタネ硬化油、ナタネ極度硬化油、大豆硬化油、豚脂硬化油、魚油硬化油などが挙げられる。脂肪酸グリセリドとしては、トリ－、ジ－、モノ－グリセリドのいずれでもよく、ステアリングリセリド、パルミチングリセリド、ラウリングリセリド等が挙げられる。芳香族炭化水素系溶媒としては、ベンゼン、トルエン、クロロベンゼン、ジクロロベンゼン等が挙げられる。親油性溶媒としては、脂肪族炭化水素溶媒が好ましく、Ｃ6-12脂肪族炭化水素溶媒またはＣ8-12脂肪族炭化水素溶媒がより好ましく、デカンがより更に好ましい。
　本発明に係る逆ナノディスクの脂質二重層は、非イオン界面活性剤の親水性部分が集合した親水性層を内部に有し、非イオン界面活性剤の親油性部分が集合した親油性層をその外側に有する。よって、本発明に係る逆ナノディスクは、親水性化合物および／または親油性化合物を含み得る。
　親水性化合物は、水分子に対して親和性を示す化合物であれば特に制限されないが、例えば、親水性化合物は、１ｇまたは１ｍＬを水中に入れ、２０±５℃で５分ごとに強く３０秒間振り混ぜるとき、３０分以内に溶解させるに要する水の量が３０ｍＬ未満である化合物をいう。かかる水の量としては、１０ｍＬ未満が好ましく、１ｍＬ未満がより好ましい。親水性化合物は水溶性を示すものが多く、脂質二重層の親水性層に含まれていたり、逆ナノディスクの親水性部分に吸着して安定化している可能性がある。また、金属酸化物など、親水性ではあるが水に対して不溶性である有効成分を逆ナノディスクの親水性部分に吸着させることにより安定化させることも可能になり得る。
　親水性化合物としては、例えば、酸化チタン粒子や酸化亜鉛粒子などの紫外線散乱剤；ベンガラ、酸化チタン、酸化鉄などの無機顔料；アスコルビン酸やその誘導体などの水溶性ビタミン類；ローカストビーンガム、グァーガム誘導体、カラギーナン、ペクチン、キサンタンガム、ジェランガム、アルギン酸などの増粘剤を挙げることができる。
　親油性化合物は、親油性基を有し、水に難溶または不溶で且つ油に可溶である化合物をいう。親油性化合物は、例えば、１ｇまたは１ｍＬを水中に入れ、２０±５℃で５分ごとに強く３０秒間振り混ぜるとき、３０分以内に溶解させるに要する水の量が３０ｍＬ以上である化合物をいう。かかる水の量としては、１００ｍＬ以上が好ましく、１０００ｍＬ以上または１００００ｍＬ以上がより好ましい。本発明で用いる親油性化合物は、化粧料や医薬組成物などに配合する有効成分であれば特に制限されないが、例えば、美白剤、抗老化剤、抗酸化剤、保湿剤、育毛剤、細胞賦活剤、ビタミン類、アミノ酸類などが挙げられる。より具体的には、例えば、トコフェロール、コエンザイムＱ１０、還元型コエンザイムＱ１０、およびそれらの誘導体などの脂溶性ビタミン類；スクワランなどのオイル；ヒドロコルチゾン、プレドニゾロン、デキサメタゾン、ベタメタゾンなどのステロイド系抗炎症薬；アセチルサリチル酸、イブプロフェン、インドメタシン、ロキソプロフェンなどの非ステロイド系抗炎症薬；抗生物質；抗真菌剤；メチルパラベンなどの防腐剤；メントールなどの香料；アリザニンなどの色素を挙げることができる。その他、アルブチン及びその誘導体；Ｌ－アスコルビン酸およびその誘導体；ハイドロキノン及びその誘導体；グルタチオン及びその誘導体；胎盤抽出物；パントテン酸およびその誘導体；トラネキサム酸およびその誘導体；コウジ酸およびその誘導体；システイン及びその誘導体；カミツレエキス、カンゾウ抽出物などの植物抽出物；ベータカロチン等のカロテノイド類；アスタキサンチン及びその誘導体；フラボノイド類；カテキン及びその誘導体；ビタミンＡ及びその誘導体；α－リポ酸およびその誘導体；グリチルリチン酸およびその誘導体；チオタウリン及びその誘導体；尿素およびその誘導体；グリセリン誘導体；サリチル酸およびその誘導体；ニコチン酸およびその誘導体；Ｌ－アミノ酸およびその誘導体；アデノシン及びその誘導体；イソフラボン等の植物性女性ホルモン様成分；グラブリジン及びその誘導体；マグノリグナン及びその誘導体；ミノキシジル及びその誘導体；フィナステリド及びその誘導体；フラバノン類；塩化カルプロニウム及びその誘導体；フェルラ酸およびその誘導体；フラーレン及びその誘導体；ラクトフェリン；Ｄ－アミノ酸およびその誘導体；オリゴ糖およびその誘導体；核酸およびその誘導体；Ｄ－グルコサミン及びその誘導体；コンドロイチン硫酸ナトリウム及びその誘導体；ジプロピレングリコール及びその誘導体；セラミド及びその誘導体；ソルビトール及びその誘導体；トレハロース及びその誘導体；ヒアルロン酸およびその誘導体；プロピレングリコール脂肪酸エステル及びその誘導体；マルチトール及びその誘導体；ラフィノース及びその誘導体；アルギン酸およびその誘導体；カフェイン及びその誘導体；カルボキシビニルポリマー及びその誘導体；キサンタンガム及びその誘導体；ヒドロキシエチルセルロース及びその誘導体；ポリビニルピロリドン及びその誘導体；ケラチン分解物およびその誘導体；シルクタンパク質分解物およびその誘導体；γ－アミノ酪酸およびその誘導体；アラントイン及びその誘導体；γ－オリザノール及びその誘導体；Ｌ－カルニチン及びその誘導体；β－１，３－グルカン及びその誘導体；ビオチン及びその誘導体などが挙げられる。
　本発明に係る逆ナノディスクは、例えば、非イオン界面活性剤の水系溶媒溶液と親油性溶媒の混合物を撹拌することにより逆ベシクル分散液を得る工程、および、前記逆ベシクル分散液にポリペプチドバイオサーファクタントを添加することにより逆ナノディスクを得る工程を含む方法により製造することができる。なお、本発明に係る逆ナノディスクは、溶媒として用い得る成分を含む各成分を混合し、穏やかな撹拌のみで或いは撹拌することなく製造できる可能性もある。
　水系溶媒の使用量は、常温常圧で非イオン界面活性剤を溶解できる範囲で適宜調整すればよいが、例えば、非イオン界面活性剤１質量部に対する水系溶媒の質量比を１以上、４以下とすることができる。当該比が１以上であれば、非イオン界面活性剤をより確実に溶解することができ、当該比が４以下であれば、逆ベシクルの形成を阻害しないと考えられる。上記比としては、１．５以上が好ましく、また、３以下が好ましく、２．５以下がより好ましい。
　非イオン界面活性剤と水系溶媒との混合物には、非イオン界面活性剤の溶解のためや、逆ベシクルの形成を促進するために、一価Ｃ4-20アルコールを添加してもよい。一価Ｃ4-20アルコールの添加量は、上記効果が発揮される範囲で適宜調整すればよいが、例えば、非イオン界面活性剤１質量部に対する一価Ｃ4-20アルコールの質量比を０．５以上、２以下とすることができる。当該比が当該範囲内であれば、上記効果がより確実に廃棄される。上記比としては、０．８以上が好ましく、また、１．５以下が好ましく、１．２以下がより好ましい。
　非イオン界面活性剤と水系溶媒、更に好適には一価Ｃ4-20アルコールを含む混合物を混合し、非イオン界面活性剤を溶解させる。次に、親油性溶媒を加え、逆ベシクルが形成されるよう激しく撹拌する。親油性溶媒の使用量は、逆ベシクルが形成される範囲で適宜調整すればよいが、例えば、非イオン界面活性剤１質量部に対する親油性溶媒の質量比を２以上、１０以下とすることができる。当該比が２以上であれば、逆ベシクルがより確実に形成され、当該比が１０以下であれば、次工程における逆ナノディスクの形成が阻害されないと考えられる。上記比としては、３以上または４以上が好ましく、５以上がより好ましく、また、８以下が好ましく、７以下がより好ましい。
　非イオン界面活性剤溶液と親油性溶媒の混合物は、逆ベシクルが形成される程度に激しく撹拌することが好ましい。撹拌強度は、混合物の量などに応じて逆ベシクルが形成される範囲で適宜調整すればよいが、例えば、２００ｒｐｍ以上、１００００ｒｐｍ以下の回転数で、３０秒間以上、３０分間以下撹拌すればよい。撹拌手段としては、小規模であればボルテックスミキサー等を用いることができ、大規模であれば、撹拌翼などを備えたホモジナイザーやディゾルバー等を用いることができる。
　次に、上記で得られた逆ベシクル分散液にポリペプチドバイオサーファクタントを添加することにより逆ナノディスクを得る。一般的なベシクルは脂質二重層で構成される２０～４００μｍ程度の球状粒子であり、その分散液は白濁している。本発明においても上記逆ベシクル分散液が白濁している場合であっても、ポリペプチドバイオサーファクタントの添加によってより微細な逆ナノディスクが形成されると、少なくとも肉眼では透明に見える傾向がある。
　具体的には、逆ベシクル分散液にポリペプチドバイオサーファクタントを少量加えて撹拌するか、或いは撹拌した逆ベシクル分散液にポリペプチドバイオサーファクタントを連続的または断続的に加えていってもよい。
　リポペプチドバイオサーファクタントの使用量は、逆ナノディスクが形成される範囲で適宜調整すればよい。例えば、非イオン界面活性剤１質量部に対するリポペプチドバイオサーファクタントの質量比を０．００１以上、０．５以下とすることができる。当該比が０．００１以上であれば、逆ナノディスクがより確実に形成され、当該比が０．５以下であれば、逆ナノディスクの形成に関与しないリポペプチドバイオサーファクタントの量がそれほど過剰にならず、経済的である。上記比としては、０．００５以上が好ましく、０．０１以上がより好ましく、また、０．５以下または０．１以下が好ましく、０．０５以下がより好ましく、０．０２以下がより更に好ましい。
　非イオン界面活性剤、水系溶媒、一価Ｃ4-20アルコール、親油性溶媒、およびリポペプチドバイオサーファクタント以外の成分は、適時添加すればよい。例えば親水性化合物は、水系溶媒に適時添加すればよい。親油性化合物は、親油性溶媒と共存させることが好ましい。親油性化合物および親水性化合物の量は、それぞれ非イオン界面活性剤１質量部に対して０．００１質量部以上、１質量部以下が好ましく、０．００５質量部以上、０．５質量部以下がより好ましく、０．０１質量部以上、０．２質量部以下がより更に好ましい。
　逆ナノディスクは、凍結乾燥した後、再び親油性溶媒に分散させてもよい。再溶解液の逆ナノディスク濃度は、任意に調整することができる。
　本発明に係る逆ナノディスクは、特に親水性化合物や親油性化合物をその内部に取り込み、親油性溶媒中に良好に分散させることができる上に、非常に微細であることから、その分散液は目視上十分に透明に見え、また、皮膚組織などへの浸透性も高いと考えられる。なお、特に化粧品業界においては、一般的に、分散質が目視で確認できなくなり、分散液が目視上透明になった状態を「可溶化」という場合がある。よって本発明に係る逆ナノディスクは、例えばＯ／Ｗエマルション製剤である化粧料などのパーソナルケア組成物や医薬組成物の成分として、非常に有効であるといえる。
　本願は、２０２０年１１月２０日に出願された日本国特許出願第２０２０－１９３２９７号に基づく優先権の利益を主張するものである。２０２０年１１月２０日に出願された日本国特許出願第２０２０－１９３２９７号の明細書の全内容が、本願に参考のため援用される。
　以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
　実施例１
　（１）逆ベシクル分散液の調製
　水と１－ヘキサノールを水：１－ヘキサノール＝２０：１０の質量比で試験管に量り取り、１－ヘキサノールと同量の非イオン界面活性剤（「ＤＫエステルＳＳ」第一工業製薬社製，ショ糖脂肪酸エステル）を加えて溶液を得た。更に、非イオン界面活性剤に対して６質量倍のｎ－デカンを加え、ボルテックスミキサーを使って１分間撹拌することで、白濁液を得た。当該白濁液中の各成分の質量比は、ｎ－デカン：水：非イオン界面活性剤：１－ヘキサノール＝６０：２０：１０：１０である。
　得られた白濁液を位相差顕微鏡（「ＢＸ４１」ＯＬＹＭＰＵＳ社製）で観察したところ、図１（ａ）に示す通り、ドーナツ状の分子集合体が観察された。
　また、同白濁液を直交ニコル下で観察したところ、図１（ｂ）に示す通りマルターゼクロスが確認されたことから、逆ベシクルが形成されていることが明らかとなった。
　（２）逆ナノディスク分散液の調製
　上記（１）で得られた逆ベシクル分散液（５ｍＬ）にサーファクチンナトリウム（ＳＦＮａ）を徐々に添加していったところ、１０．８ｍｇ添加したところで図２に示す通り透明になった。この際の非イオン界面活性剤の濃度は１４０ｍＭ、サーファクチンナトリウムの濃度は２ｍＭであった。
　動的光散乱装置（「ＤＬＳ－７０００」大塚電子社製）を用い、得られた透明溶液に含まれている粒子の粒度分布を測定した。その際、光源にはλ＝４８８ｎｍのＡｒレーザーを用い、散乱角度は９０度に設定した。その結果、図３に示すように、流体力学的直径が１３．７±２．１ｎｍの微細なナノ粒子が計測された。ベシクル構造体の最小粒子径はおよそ２０ｎｍとされていることから、ベシクルではなく、逆構造のナノディスクが形成したものと考えられる。
　また、同溶液をネガティブ染色し、透過型電子顕微鏡（「Ｈ－７６５０」日立ハイテクノロジーズ社製）で観察した。ネガティブ染色には、１％リンタングステン酸ナトリウム水溶液を用い、加速電圧は１００ｋＶに設定し、２００メッシュでカーボン補強処理したグリッドを用いた。リンタングステン酸ナトリウム水溶液は、リンタングステン酸ナトリウムを５０ｍｇ秤量し、超純水を５ｍＬ加え、遮光下で５分間撹拌した上で、ｐＨを５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液により６．８に調整して調製し、０．１μｍまたは０．２２μｍＰＶＤＦシリンジフィルターにより濾過してから使用した。結果を図４に示す。
　図４の透過型電子顕微鏡写真の通り、多数の均一なナノ粒子が観測され、画像解析の結果から、図３の動的光散乱測定とほぼ同程度の、１３．１±１．７ｎｍの粒子径分布が極めて狭いナノ粒子が得られていることが判明した。
　以上の結果より、いったん形成された逆ベシクルを構成する逆脂質二重層の側面にリポペプチドバイオサーファクタントであるサーファクチンナトリウムが結合して微細な逆ナノディスクが形成されたと考えられる。かかる機構を、図５に模式的に示す。

Claims (12)

  1. 　非イオン界面活性剤、およびリポペプチドバイオサーファクタントを含有し、
    　前記非イオン界面活性剤が、その親油性部分を外側に、その親水性部分を内側にして脂質二重層を形成し、
    　前記リポペプチドバイオサーファクタントが前記脂質二重層の側面に結合していることを特徴とする逆ナノディスク。
  2. 　前記脂質二重層が水系溶媒を含む請求項１に記載の逆ナノディスク。
  3. 　前記脂質二重層が親水性化合物を含む請求項１または２に記載の逆ナノディスク。
  4. 　前記脂質二重層が親油性化合物を含む請求項１～３のいずれかに記載の逆ナノディスク。
  5. 　体積平均粒子径が５ｎｍ以上、２０ｎｍ未満である請求項１～４のいずれかに記載の逆ナノディスク。
  6. 　前記リポペプチドバイオサーファクタントがサーファクチンまたはその塩である請求項１～５のいずれかに記載の逆ナノディスク。
  7. 　親油性溶媒中に請求項１～６のいずれかに記載の逆ナノディスクが分散していることを特徴とする親油性分散液。
  8. 　逆ナノディスクを製造するための方法であって、
    　非イオン界面活性剤の水系溶媒溶液と親油性溶媒の混合物を撹拌することにより逆ベシクル分散液を得る工程、および、
    　前記逆ベシクル分散液にポリペプチドバイオサーファクタントを添加することにより逆ナノディスクを得る工程を含むことを特徴とする方法。
  9. 　前記非イオン界面活性剤１質量部に対して１質量部以上、４質量部以下の前記水系溶媒溶液を用いる請求項８に記載の方法。
  10. 　前記水系溶媒溶液が、更に一価Ｃ4-20アルコールを含む請求項８または９に記載の方法。
  11. 　前記リポペプチドバイオサーファクタントがサーファクチンまたはその塩である請求項８～１０のいずれかに記載の方法。
  12. 　前記非イオン界面活性剤１質量部に対して０．００１質量部以上、０．５質量部以下の前記リポペプチドバイオサーファクタントを用いる請求項８～１１のいずれかに記載の方法。
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