CN104964664B - 一种包覆有配体的纳米颗粒表面配体层厚度的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种包覆有配体的纳米颗粒表面配体层厚度的测定方法，所述方法包括如下步骤：(1)在梯度溶液中，采用CPS离心粒度仪测定未包覆配体的纳米裸颗粒的粒径d_c；(2)在相同的梯度溶液中，采用CPS离心粒度仪测定包覆了配体的纳米颗粒的粒径d；(3)根据式(I)计算配体层的厚度：其中，d是包覆了配体的纳米颗粒的粒径；d_c是未包覆配体的纳米裸颗粒的粒径；Δl是配体层的厚度；ρ_s是纳米裸颗粒的材质密度；ρ_p为梯度溶液的平均密度。本发明首次测定了包覆有配体的纳米颗粒表面配体层的厚度，为研究配体厚度对纳米颗粒在生物系统中的效应的影响做了准备；测试方法简单，重复性好，重现性好，偏差小。

Description

一种包覆有配体的纳米颗粒表面配体层厚度的测定方法

技术领域

本发明涉及纳米颗粒检测领域，尤其涉及一种包覆有配体的纳米颗粒表面配体层厚度的测定方法。

背景技术

CPS离心粒度仪为圆盘离心式纳米粒度分析仪，采用的是差示沉淀法进行颗粒粒度的测量和分析。CPS离心粒度仪在高速旋转的离心转盘中建立起梯度溶液，常用的梯度液是蔗糖的水溶液，测试步骤具体为：

(1)配制梯度溶液：准备两种不同浓度的梯度液，并按照不同比例混合两种浓度的溶液从而配制梯度溶液；

(2)建立梯度：先向旋转的转盘中注入高浓度溶液，并依次逐步降低注入溶液浓度，最后注入最低浓度梯度液；在转盘中外侧溶液浓度高、内侧溶液浓度低，由于高速旋转，不同浓度溶液短时间(可维持8小时)内可保持梯度而不会混合；

(3)上样测试：待梯度液稳定后用进样注射器将样品从转盘中间进样口加入，颗粒由中心向周围沉降；由于大颗粒沉降较快，小颗粒沉降较慢，通过检测沉降速度，得到样品的粒度分布信息。

根据斯多克斯定律(Stokes Law)，如果颗粒在液体内的一个重力场中沉淀，沉淀速度与颗粒粒度直径的平方成正比，粒度相差百分之几的颗粒之间都会有非常显著的沉淀速度差。

CPS离心粒度仪测试系统在一般情况下可以分辨粒度差别小于5％的颗粒，最小可分辨的粒度差为2％，这比同类其他分析方法的精度都要高很多。CPS标定颗粒的大小是通过直接物理测量方法校正过的，而且标定颗粒都与美国标准和技术研究院NIST的其它标准进行过交叉对比，确保均值、峰值宽度或者半峰宽度等方面的误差在±2％之内。

尺寸在1～100nm范围内的纳米颗粒在生物成像、药物输送、癌症治疗等重要领域都有很重要的应用前景。由于纳米颗粒具有极高的比表面积，也具有非常活跃的表面化学性。故当纳米颗粒进入到生物体液中就很容易被覆盖一层复杂的生物分子(如蛋白质，天然有机高分子，表面活性剂，酶等)，形成生物分子包覆层，即表面配体。具有表面配体的纳米颗粒在尺寸上发生变化，进而改变纳米颗粒的表面性质，从而控制纳米颗粒和细胞之间的相互作用，决定着纳米颗粒进入生物环境中后续的细胞/组织反应。因此，表面配体厚度对纳米颗粒在生物系统中的效应有着至关重要的作用。

由于在纳米颗粒表面包覆配体层厚纳米颗粒仍可以稳定分散在溶剂中。目前多数方法将样品做成干态再测试粒径，例如扫描电镜和透射电镜。而干态纳米颗粒配体层与其在溶剂中稳定分散时的状态有很大差别。故在干态下检测得到的配体层厚度是不准确的，所以单纯将包覆了配体层的粒径与纳米裸颗粒的粒径相减，无法获得配体层的厚度。

因此，现有技术中还无法精确测量出纳米颗粒表面包覆的配体层的厚度，而本领域急需要开发一种能够测量纳米颗粒配体层厚度的方法。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种能够测量纳米颗粒配体层厚度的方法。所述方法能够准确测量出纳米颗粒表面的配体厚度。

本发明通过如下具体方案实现：

一种包覆有配体的纳米颗粒表面配体层厚度的测定方法，包括如下步骤：

(1)在梯度溶液中，采用CPS离心粒度仪测定未包覆配体的纳米裸颗粒的粒径d_c；

(2)在相同的梯度溶液中，采用CPS离心粒度仪测定包覆了配体的纳米颗粒的粒径d；

(3)根据式(I)计算配体层的厚度：

其中，d是包覆了配体的纳米颗粒的粒径；d_c是未包覆配体的纳米裸颗粒的粒径；Δl是配体层的厚度；ρ_s是纳米裸颗粒的材质密度；ρ_p为梯度溶液的平均密度。

其中，所述ρ_p≤0.25ρ_s，例如0.01ρ_s、0.08ρ_s、0.1ρ_s、0.13ρ_s、0.16ρ_s、0.19ρ_s、0.21ρ_s、0.24ρ_s等，优选ρ_p≤0.1ρ_s。

本发明步骤(1)和步骤(2)所述离心粒度仪的转速为10000～20000转/min，例如10200转/min、10900转/min、11500转/min、14600转/min、16000转/min、18500转/min、19000转/min等。

本发明步骤(1)和步骤(2)所述离心粒度仪的离心时间为5～10min，例如6min、7min、8min、9min等。

本发明步骤(1)离心粒度仪测定未包覆配体的纳米裸颗粒的粒径d_c过程中，未包覆配体的纳米裸颗粒以溶液形式上样，上样量为90～110μL，优选100μL；

所述上样的未包覆配体的纳米裸颗粒的溶液浓度为9×10¹⁰个纳米颗粒/mL。

本发明步骤(2)离心粒度仪测定包覆了配体的纳米颗粒的粒径d过程中，包覆了配体的纳米颗粒以溶液形式上样，上样量为90～110μL，优选100μL；

所述上样的包覆了配体的纳米颗粒的溶液浓度为9×10¹⁰个纳米颗粒/mL。

本发明步骤(1)和步骤(2)梯度溶液的梯度个数为6～12，例如7、8、9、10、11等，优选9。

本发明所述包覆了配体的纳米颗粒通过如下方法制备：

(1’)以体积比1:1混合纳米裸颗粒溶液和配体溶液，37℃下在100转/min条件下，震荡孵育0.5h，得到包覆了配体的纳米颗粒。

作为优选技术方案，本发明所述包覆有配体的纳米颗粒表面配体层厚度的测定方法包括如下步骤：

(1)利用离心粒度仪，在具有9个梯度的梯度溶液中，上样未包覆配体的纳米裸颗粒的溶液，上样量为90～110μL，测定未包覆配体的纳米裸颗粒的粒径d_c；

(2)以体积比1:1混合纳米裸颗粒溶液和配体溶液，37℃下在100转/min条件下，震荡孵育0.5h，得到包覆了配体的纳米颗粒；

(3)利用离心粒度仪，在具有9个梯度的梯度溶液中，上样包覆了配体的纳米颗粒的溶液，上样量为90～110μL，测定包覆了配体的纳米颗粒d；

(3)根据式(I)计算配体层的厚度：

其中，d是包覆了配体的纳米颗粒的粒径；d_c是未包覆配体的纳米裸颗粒的粒径；Δl是配体层的厚度；ρ_s是纳米裸颗粒的材质密度；ρ_p为梯度溶液的平均密度。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)首次测定了包覆有配体的纳米颗粒表面配体层的厚度，为研究配体厚度对纳米颗粒在生物系统中的效应的影响做了准备；

(2)测试方法简单，重复性好，偏差小。

附图说明

图1是实施例1～8提供的配体浓度与配体层厚度的关系图。

具体实施方式

为便于理解本发明，本发明列举实施例如下。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

实施例1

一种包覆有胎牛血清蛋白(BSA)配体的金纳米颗粒(GNP)表面配体层厚度的测定方法，所述方法包括如下步骤：

(1)配制梯度溶液，并建立梯度：

配制16wt％的蔗糖水溶液，密度为1.06g/cm³；之后以该浓度为中间值配制9个梯度的梯度溶液，浓度分别为8％、10％、12％、14％、16％、18％、20％、22％、24％；

开启CPS的转盘旋转，由高到低依次注入梯度溶液，从而建立梯度；

(2)制备纳米金颗粒的水分散液：

取500μL的GNP，再加500μL超纯水稀释，并超声分散；

(3)上样测定纳米金颗粒的粒径：

待步骤(1)的梯度液稳定后，用进样注射器从转盘中间注入100μL的纳米金颗粒的水分散液进行上样，纳米金颗粒由中心向周围沉降，读取CPS测得的纳米金裸颗粒粒径d_c为36nm,重复测试偏差约0.5％；

(4)纳米金颗粒表面包覆配体：

以体积比1:1混合步骤(2)的纳米金颗粒的水分散液和浓度为10^-12mol/L的胎牛血清蛋白水溶液，37℃下在100转/min条件下，震荡孵育0.5h，得到GNP@BSA(包覆了胎牛血清蛋白配体的纳米金颗粒)的分散液；

(5)上样测定GNP@BSA的粒径：

用进样注射器从转盘中间注入100μL的GNP@BSA分散液进行上样，GNP@BSA由中心向周围沉降，读取CPS测得的粒径d为31.75nm,重复测试偏差约0.5％；

(6)计算，带入公式计算得配体层厚度Δl为2.6nm。

实施例2～8提供了与实施例1类似的包覆有胎牛血清蛋白(BSA)配体的金纳米颗粒(GNP)表面配体层厚度的测定方法，所述方法与实施例1的区别仅在于步骤(4)胎牛血清蛋白水溶液浓度依次分别为10^-12、10^-11、10^-10、10^-9、10^-8、10^-7、10^-6、10^-5；

经测定，配体层厚度依次为2.6nm、2.6nm、2.7nm、2.9nm、3.2nm、3.8nm、3.8nm、4.2nm。

图1是实施例1～8提供的配体浓度与配体层厚度的关系图。

本领域公知，随着配体溶液浓度的增加，配体层厚度会随着增加，由实施例1～8的测试结果可以看出配体层的测试厚度也是随着溶液浓度增加在增加的，因此可以看出本发明提供的配体层厚度的测试方法是可行的。

实施例9

一种包覆有铁传质蛋白配体的金纳米颗粒(GNP)表面配体层厚度的测定方法，所述方法包括如下步骤：

(1)配制梯度溶液，并建立梯度：

配制16wt％的蔗糖水溶液，密度为1.06g/cm³；之后以该浓度为中间值配制9个梯度的梯度溶液，浓度分别为4％、7％、10％、13％、16％、19％、21％、24％、27％；

开启CPS的转盘旋转，由高到低依次注入梯度溶液，从而建立梯度；

(2)制备纳米金颗粒的水分散液：

取500μL的GNP，再加500μL超纯水稀释，并超声分散；

(3)上样测定纳米金颗粒的粒径：

待步骤(1)的梯度液稳定后，用进样注射器从转盘中间注入100μL的纳米金颗粒的水分散液进行上样，纳米金颗粒由中心向周围沉降，读取CPS测得的纳米金裸颗粒粒径d_c为36nm，重复测试偏差约0.5％；

(4)纳米金颗粒表面包覆配体：

以体积比1:1混合步骤(2)的纳米金颗粒的水分散液和浓度为10^-5mol/L的铁传质蛋白水溶液，37℃下在100转/min条件下，震荡孵育0.5h，得到GNP@铁传质蛋白(包覆了铁传质蛋白配体的纳米金颗粒)的分散液；

(5)上样测定GNP@铁传质蛋白的粒径：

用进样注射器从转盘中间注入100μL的GNP@铁传质蛋白分散液进行上样，GNP@铁传质蛋白由中心向周围沉降，读取CPS测得的粒径d为33.68nm,重复测试偏差约0.5％；

(6)计算，带入公式计算得配体层厚度Δl为1.5nm。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺设备和工艺流程，但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程，即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺设备和工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (13)

1.一种包覆有配体的纳米颗粒表面配体层厚度的测定方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)在梯度溶液中，采用CPS离心粒度仪测定未包覆配体的纳米裸颗粒的粒径d_c；

(2)在相同的梯度溶液中，采用CPS离心粒度仪测定包覆了配体的纳米颗粒的粒径d；

(3)根据式(I)计算配体层的厚度：

$d^{1.5}=\frac{d_c^3+6\[d_c^2\mathrm{\Δ}l+2d_c{\mathrm{\Δl}}^2+\frac{4}{3}{\mathrm{\Δl}}^3\]\frac{{\mathrm{\ρ}}_s}{{\mathrm{\ρ}}_p}}{{(d_c+2\mathrm{\Δ}l)}^{1.5}}---\left(I\right)$

其中，d是包覆了配体的纳米颗粒的粒径；d_c是未包覆配体的纳米裸颗粒的粒径；Δl是配体层的厚度；ρ_s是纳米裸颗粒的材质密度；ρ_p为梯度溶液的平均密度。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述ρ_p≤0.25ρ_s。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述ρ_p≤0.1ρ_s。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(2)所述离心粒度仪的转速为10000～20000转/min。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(2)所述离心粒度仪的离心时间为5～10min。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)离心粒度仪测定未包覆配体的纳米裸颗粒的粒径d_c过程中，未包覆配体的纳米裸颗粒以溶液形式上样，上样量为90～110μL；所述上样的未包覆配体的纳米裸颗粒的溶液浓度为9×10¹⁰个纳米颗粒/mL。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述上样量为100μL。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)离心粒度仪测定包覆了配体的纳米颗粒的粒径d过程中，包覆了配体的纳米颗粒以溶液形式上样，上样量为90～110μL；所述上样的包覆了配体的纳米颗粒的溶液浓度为9×10¹⁰个纳米颗粒/mL。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述上样量为100μL。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(2)梯度溶液的梯度个数为6～12。

11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(2)梯度溶液的梯度个数为9。

12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述包覆了配体的纳米颗粒通过如下方法制备：

(1’)以体积比1:1混合纳米裸颗粒溶液和配体溶液，37℃下在100转/min条件下，震荡孵育0.5h，得到包覆了配体的纳米颗粒。

13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)利用离心粒度仪，在具有9个梯度的梯度溶液中，上样未包覆配体的纳米裸颗粒的溶液，上样量为90～110μL，测定未包覆配体的纳米裸颗粒的粒径d_c；

(1’)以体积比1:1混合纳米裸颗粒溶液和配体溶液，37℃下在100转/min条件下，震荡孵育0.5h，得到包覆了配体的纳米颗粒；

(2)利用离心粒度仪，在具有9个梯度的梯度溶液中，上样包覆了配体的纳米颗粒的溶液，上样量为90～110μL，测定包覆了配体的纳米颗粒d；

(3)根据式(I)计算配体层的厚度：

$d^{1.5}=\frac{d_c^3+6\[d_c^2\mathrm{\Δ}l+2d_c{\mathrm{\Δl}}^2+\frac{4}{3}{\mathrm{\Δl}}^3\]\frac{{\mathrm{\ρ}}_s}{{\mathrm{\ρ}}_p}}{{(d_c+2\mathrm{\Δ}l)}^{1.5}}---\left(I\right)$

其中，d是包覆了配体的纳米颗粒的粒径；d_c是未包覆配体的纳米裸颗粒的粒径；Δl是配体层的厚度；ρ_s是纳米裸颗粒的材质密度；ρ_p为梯度溶液的平均密度。