CN115290630A - 一种基于聚多巴胺修饰氧化钴猝灭磷掺杂石墨氮化碳电化学发光的免疫传感器的制备方法 - Google Patents

一种基于聚多巴胺修饰氧化钴猝灭磷掺杂石墨氮化碳电化学发光的免疫传感器的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于聚多巴胺修饰氧化钴猝灭磷掺杂石墨氮化碳的电化学发光的免疫传感器的制备方法。本发明通过磷酸与石墨氮化碳的前驱体三聚氰胺共聚，准确的将三嗪环结构中的部分氮原子替换成磷原子，改善了石墨氮化碳网络结构的电子环境。氧化钴具有规则的十二面体结构，表面粗糙多孔，比表面积大，生物相容性好，使用聚多巴胺修饰氧化钴，在氧化钴表面形成一层聚多巴胺薄膜以连接二抗。磷掺杂石墨氮化碳的电化学发光发射光谱和聚多巴胺修饰氧化钴的紫外吸收光谱重叠，二者之间可以发生共振能量转移，磷掺杂石墨氮化碳的电化学发光可以被聚多巴胺修饰氧化钴有效猝灭。使用磷掺杂的石墨氮化碳与神经元特异性烯醇化酶一抗结合形成一抗标记物，以聚多巴胺修饰氧化钴纳米复合材料与神经元特异性烯醇化酶二抗结合形成二抗标记物，构建了夹心猝灭型电化学免疫传感器，实现了对神经元特异性烯醇化酶的超灵敏检测，检测限为17.25 fg/mL。

Description

一种基于聚多巴胺修饰氧化钴猝灭磷掺杂石墨氮化碳电化学 发光的免疫传感器的制备方法
技术领域
本发明涉及一种基于聚多巴胺修饰氧化钴猝灭磷掺杂石墨氮化碳电化学发光的免疫传感器的制备方法，具体是以磷酸掺杂的类石墨氮化碳与神经元特异性烯醇化酶一抗结合形成一抗标记物，聚多巴胺修饰氧化钴纳米复合材料作为二抗标记物标记神经元特异性烯醇化酶识别抗体的二抗，制备了一种检测神经元特异性烯醇化酶的夹心猝灭型电化学免疫传感器，属于新型功能材料与生物传感检测技术领域。
背景技术
肺癌是目前已知的最致命的癌症之一，主要分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌。小细胞肺癌以其早期转移迅速和快速倍增时间而闻名，由于其最初对化疗的高敏感性和耐药性而难以治疗。研究报道，神经元特异性烯醇化酶是早期诊断小细胞肺癌的可靠、特异、敏感的血清生物标志物，可评估患者的康复进展。因此，神经元特异性烯醇化酶水平的测定对于临床诊断中监测小细胞肺癌的进展和治疗效果具有重要意义。电化学发光作为电化学和发光两种技术结合的新兴产物，具有背景低、动态范围宽、仪器设备简便和检测灵敏等优点，在生物分析、食品安全分析和环境污染监测等领域受到广泛的关注。
石墨氮化碳具有独特的电子和能带结构，生物相容性好，因其制备简单、化学稳定性好和易于调控的性能常用作于催化剂或良好载体。近年来，研究者开始聚焦于石墨氮化碳的电化学发光性能，将其应用于电化学免疫传感器领域，然而原始的石墨氮化碳因其电化学发光较弱且发光信号不稳定，大大限制了其在免疫传感器领域中的应用。本发明采用磷掺杂石墨氮化碳的电化学发光性能，通过引入不同量的磷酸与三聚氰胺共聚，改变石墨氮化碳网络结构的电子排布，准确的将三嗪环结构中的部分氮原子替换成磷原子，赋予了其优异的电化学发光行为，大大扩展了类石墨氮化碳的应用前景。
金属有机骨架材料由于其具有高孔隙率、可调功能的晶体结构、较大的表面积和多孔结构，在各个领域得到广泛应用。金属有机骨架材料是合成各种多孔活性材料（如碳材料和金属氧化物）的理想牺牲模板。ZIF-67是一种包含由2-甲基咪唑配体连接的钴离子的金属有机骨架材料，可以用作制备氧化钴多面体的前体。通过ZIF-67的热分解合成了多孔空心十二面体氧化钴。中空十二面体氧化钴独特的3D纳米结构为电子和离子的快速传输提供了有效途径，同时作为一种p型半导体，具有高比表面积、丰富的活性中心、高效的传质和低密度等独特特性，因而引起了广泛关注。
电化学免疫传感器是基于物质的电光信号转换特性来确定待测物浓度的一类检测装置。常见的构建过程需要层层修饰，过程复杂且影响免疫分子的生物活性。本发明基于聚多巴胺修饰氧化钴猝灭磷掺杂石墨氮化碳电化学发光构建了一种新型的电化学免疫传感器，用于神经元特异性烯醇化酶的检测。利用磷掺杂的石墨氮化碳作为基底发光材料，其生物相容性好、信号稳定且抗干扰能力强，使其先与神经元特异性烯醇化酶的一抗结合形成一抗标记物。另外，使用聚多巴胺修饰氧化钴纳米复合材料作为猝灭材料，可实现很好的发光信号猝灭效果。这是因为聚多巴胺修饰氧化钴纳米复合材料的紫外吸收光谱与磷掺杂石墨氮化碳的电化学发光发射光谱有很大重叠，所以基于共振能量转移原理可以实现高效猝灭。将聚多巴胺修饰氧化钴纳米复合材料用于标记神经元特异性烯醇化酶的二抗作为二抗标记物，实现了对神经元特异性烯醇化酶的超灵敏检测，检测限为17.25 fg/mL。
本发明所构建的电化学免疫传感器与常规传感器相比构建层数减少，构建传感器过程简单易行。基于材料的优异性能和精简的检测方法，本发明的电化学免疫传感器灵敏度高，检出限低，稳定性好。基于上述发现，发明人完成了本发明。
发明内容
本发明的目的之一是采用磷酸精确调控的石墨氮化碳作为基底发光材料，准确的将三嗪环结构中的氮原子替换成磷原子，赋予了其优异的电化学发光行为，良好的生物相容性、稳定的电化学信号和优异的抗干扰能力，可以使其与神经元特异性烯醇化酶的一抗相连形成稳定的一抗标记物，精简了传感器的构建过程。
本发明的目的之二是使用聚多巴胺修饰氧化钴纳米复合材料作为猝灭材料，因其紫外吸收光谱与磷掺杂石墨氮化碳的电化学发光发射光谱有很大重叠，所以基于共振能量转移能够实现高效猝灭，为构建电化学免疫传感器提供了新的共振能量转移供体-受体对。
本发明的目的之三是提供一种新型基于共振能量转移的夹心猝灭型电化学免疫传感器的制备方法，该方法将基底发光材料和猝灭材料分别标记待测物的一抗和二抗，使传感器的制备更加简单方便，且稳定性好、灵敏度高和重现性好。
本发明的目的之四是实现了所述电化学免疫传感器的构建并且对神经元特异性烯醇化酶进行了灵敏的检测，检测限为17.25 fg/mL，达到了所述电化学发光传感器在检测神经元特异性烯醇化酶上的用途。
本发明的技术方案
1. 一种基于聚多巴胺修饰氧化钴猝灭磷掺杂石墨氮化碳电化学发光的免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）磷掺杂石墨氮化碳的制备
将1 ~ 3 g三聚氰胺溶解在40 ~ 120 mL水中，然后加热到80 ℃，搅拌三十分钟后加入300 ~ 900 μL磷酸，接着转移到50 mL聚四氟乙烯高温反应釜中，在180 ℃下反应10h，待反应釜冷却至室温后，将所得到的产物离心，放入真空干燥箱中，在60 ℃下干燥一夜。之后，将得到的白色固体研磨，放入用锡箔纸包裹的瓷舟，在管式炉中氮气气氛下加热到550 ℃煅烧4 h，加热速率为2.5 ℃/min。最后将得到的固体用超纯水离心洗涤至中性，60℃真空干燥一夜，磷掺杂石墨氮化碳制备完成；
（2）磷掺杂石墨氮化碳结合神经元特异性烯醇化酶识别抗体的一抗标记物的制备
将5 ~ 20 µL、10 µg/mL神经元特异性烯醇化酶的一抗在4 ℃下使用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺进行活化4 h，然后与磷掺杂石墨氮化碳在4 ℃下共同孵化6 h，得到磷掺杂石墨氮化碳结合神经元特异性烯醇化酶识别抗体的一抗标记物；
（3）聚多巴胺修饰氧化钴的制备
将3 ~ 9 g 2-甲基咪唑和2 ~ 8 g六水硝酸钴分别溶解于100 ~ 300 mL甲醇/乙醇（体积比为1：1）二元混合溶液中，然后将制备好的2-甲基咪唑溶液倒入六水硝酸钴溶液中，剧烈搅拌两分钟得到紫色混合溶液，室温孵育12 h 。将得到的悬浮液离心，用乙醇洗涤数次，60 ℃真空干燥一夜得到紫色粉末。然后将粉末研磨后倒入瓷舟中，在管式炉氩气气氛下350 ℃煅烧1 h以保持其十二面体骨架，接着关闭氩气，再在空气气氛下350 ℃煅烧1h得到黑色的氧化钴粉末；
（4）聚多巴胺修饰氧化钴纳米复合材料的制备
将6 ~ 12 mg黑色氧化钴粉末分散在10 mL 10 mM的pH 8.5的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐-盐酸溶液中，形成均一的悬浮液，然后加入5 ~ 15 mg盐酸多巴胺，室温搅拌24 h，离心，用超纯水洗涤三次，60 ℃真空干燥；
（5）PBS缓冲溶液的配置
取11.94 g十二水合磷酸氢二钠定容于500 mL的容量瓶中配置成浓度为1/15 M的水溶液，作为甲液；取4.54 g磷酸二氢钾定容于500 mL的容量瓶中配置成浓度为1/15 M的水溶液，作为乙液；将甲液和乙液按比例混合，配置成一系列pH在6.0 ~ 8.0的PBS缓冲溶液；
（6）聚多巴胺修饰氧化钴并结合神经元特异性烯醇化酶识别抗体的二抗标记物的制备
将20 ~ 100 μL、10 μg/mL的神经元特异性烯醇化酶二抗加入到1 mL、1 ~ 3 mg/mL的聚多巴胺修饰氧化钴纳米复合材料水溶液中，并在4 ℃下震荡孵化12 h，离心后将得到的产物分散在1 mL PBS中，即得聚多巴胺修饰氧化钴并结合神经元特异性烯醇化酶识别抗体的二抗标记物溶液；
（7）电化学免疫传感器的制备
1）用三氧化二铝抛光粉打磨直径为4 mm的玻碳电极，超纯水清洗干净，将6 µL、0.5 ~ 2.5 mg/mL的磷掺杂石墨氮化碳结合神经元特异性烯醇化酶识别抗体的一抗标记物溶液滴加到电极表面，室温下晾干；
2）继续滴加3 µL、质量分数为0.1 %的牛血清蛋白溶液到电极表面，用超纯水清洗，室温下晾干；
3）继续滴加6 µL、0.00005 ~ 100 ng/mL的一系列不同浓度的神经元特异性烯醇化酶抗原到电极表面，孵化2 h，超纯水清洗，室温下晾干；
4）最后滴加6 µL聚多巴胺修饰氧化钴并结合神经元特异性烯醇化酶识别抗体的二抗标记物溶液，超纯水清洗，室温下晾干，制得一种检测神经元特异性烯醇化酶的电化学免疫传感器。
2. 电化学免疫传感器的检测方法如下：
（1）将Ag/AgCl作为参比电极，铂丝作为对电极，所制备的电化学发光传感器作为工作电极正确连接在化学发光检测仪的暗盒中，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起，光电倍增管的高压设置为500 ~ 800 V，在含有20 ~ 100 mM过硫酸钾的的PBS缓冲溶液中进行测试；
（2）用电化学发光法对神经元特异性烯醇化酶标准溶液进行检测，其电压测试范围为-1.6 ~ 0 V；
（3）观察神经元特异性烯醇化酶加入前后传感器的电化学发光强度，然后记录电化学发光强度值与神经元特异性烯醇化酶浓度的线性关系，绘制工作曲线；
（4）将待测的神经元特异性烯醇化酶抗原样品溶液代替神经元特异性烯醇化酶抗原标准溶液进行检测；
本传感器对神经元特异性烯醇化酶抗原的检测线性范围为0.00005 ~ 100 ng/mL，检测限为17.25 fg/mL；
合成材料所需要的化学试剂均为当地试剂店购得，没有经过再处理。
本发明的有益成果
（1）本发明采用磷掺杂石墨氮化碳作为基底发光材料，准确地将石墨氮化碳三嗪环结构中的部分氮原子替换成磷原子，赋予了其优异的电化学发光行为，使材料整体的电子分布得到很大改善，解决了原始石墨氮化碳电化学发光信号弱且发光信号不稳定的弊端，对于石墨氮化碳的扩展应用具有重要意义。
（2）本发明提供了一种新型共振能量转移的供体-受体对，使用磷掺杂石墨氮化碳作为基底发光材料，使用聚多巴胺修饰氧化钴作为猝灭材料，构建了一个夹心猝灭型的电化学发光免疫传感器。
（3）本发明提供一种新的构建电化学免疫传感器的方法。该方法将基底发光材料和猝灭材料分别标记待测物的一抗和二抗，再识别待测抗原，使传感器的制备更加简单方便，且制备的传感器稳定性好、灵敏度高和重现性好。
（4）本发明制备的电化学免疫传感器对神经元特异性烯醇化酶进行了灵敏的检测，检测范围为0.00005 ~ 100 ng/mL，检测限为17.25 fg/mL，可以实现简便快捷、高灵敏、高特异性和高稳定性的检测。
具体实施方式
实施例1电化学免疫传感器的制备
（1）磷掺杂石墨氮化碳的制备
将1 g三聚氰胺溶解在40 mL水中，然后加热到80 ℃，搅拌三十分钟后加入300 μL磷酸，接着转移到50 mL聚四氟乙烯高温反应釜中，在180 ℃下反应10 h ，待反应釜冷却至室温后，将所得到的产物离心，放入真空干燥箱中，在60 ℃下干燥一夜，之后，将得到的白色固体研磨，放入用锡箔纸包裹的瓷舟，在管式炉中氮气气氛下加热到550 ℃煅烧4 h，加热速率为2.5 ℃/min，最后将得到的固体用超纯水离心洗涤至中性，60 ℃真空干燥一夜，磷掺杂石墨氮化碳制备完成；
（2）磷掺杂石墨氮化碳结合神经元特异性烯醇化酶识别抗体的一抗标记物的制备
将5 µL、10 µg/mL的神经元特异性烯醇化酶的一抗在4 ℃下使用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺进行活化4 h，然后与磷掺杂石墨氮化碳在4 ℃下共同孵化6 h，得到磷掺杂石墨氮化碳结合神经元特异性烯醇化酶识别抗体的一抗标记物；
（3）聚多巴胺修饰氧化钴的制备
将3 g 2-甲基咪唑和2 g六水硝酸钴分别溶解于100 mL甲醇/乙醇（体积比为1：1）二元混合溶液中，然后将制备好的2-甲基咪唑溶液倒入六水硝酸钴溶液中，剧烈搅拌两分钟得到紫色混合溶液，室温孵育12 h，将得到的悬浮液离心，用乙醇洗涤数次，60 ℃真空干燥一夜得到紫色粉末，然后将粉末研磨后倒入瓷舟中，在管式炉氩气气氛下350 ℃煅烧1 h以保持其十二面体骨架，接着关闭氩气，再在空气气氛下350 ℃煅烧1 h得到黑色的氧化钴粉末，
（4）聚多巴胺修饰氧化钴纳米复合材料的制备
将6 mg黑色氧化钴粉末分散在10 mL 10 mM的pH 8.5的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐-盐酸溶液中，形成均一的悬浮液，然后加入5 mg盐酸多巴胺，室温搅拌24 h，离心，用超纯水洗涤三次，60 ℃真空干燥；
（5）PBS缓冲溶液的配置
取11.94 g十二水合磷酸氢二钠定容于500 mL的容量瓶中配置成浓度为1/15 M的水溶液，作为甲液；取4.54 g磷酸二氢钾定容于500 mL的容量瓶中配置成浓度为1/15 M的水溶液，作为乙液；将甲液和乙液按比例混合，配置成一系列pH在6.0 ~ 8.0的PBS缓冲溶液；
（6）聚多巴胺修饰氧化钴并结合神经元特异性烯醇化酶识别抗体的二抗标记物的制备
将20 μL 10 μg/mL神经元特异性烯醇化酶二抗加入到1 mL 1 mg/mL聚多巴胺修饰氧化钴纳米复合材料水溶液中，并在4 ℃下震荡孵化12 h，离心后将得到的产物分散在1mL PBS中，即得聚多巴胺修饰氧化钴并结合神经元特异性烯醇化酶识别抗体的二抗标记物溶液；
（7）电化学免疫传感器的制备
1）用三氧化二铝抛光粉打磨直径为4 mm的玻碳电极，超纯水清洗干净，将6 µL、0.5 mg/mL的磷掺杂石墨氮化碳结合神经元特异性烯醇化酶识别抗体的一抗标记物溶液滴加到电极表面，室温下晾干；
2）继续滴加3 µL、质量分数为0.1 %的牛血清蛋白溶液到电极表面，用超纯水洗净，室温下晾干；
3）继续滴加6 µL、0.00005 ~ 100 ng/mL的一系列不同浓度的神经元特异性烯醇化酶抗原到电极表面，孵化2 h，超纯水冲洗，室温下晾干；
4）最后滴加6 µL的聚多巴胺修饰氧化钴并结合神经元特异性烯醇化酶识别抗体的二抗标记物溶液，超纯水冲洗，室温下晾干，制得一种检测神经元特异性烯醇化酶的电化学免疫传感器。
实施例2电化学免疫传感器的制备
（1）磷掺杂石墨氮化碳的制备
将2 g三聚氰胺溶解在80 mL水中，然后加热到80 ℃，搅拌三十分钟后加入600 μL磷酸，接着转移到50 mL聚四氟乙烯高温反应釜中，在180 ℃下反应10 h，待反应釜冷却至室温后，将所得到的产物离心，放入真空干燥箱中，在60 ℃下干燥一夜，之后，将得到的白色固体研磨，放入用锡箔纸包裹的瓷舟，在管式炉中氮气气氛下加热到550 ℃煅烧4 h，加热速率为2.5 ℃/min，最后将得到的固体用超纯水离心洗涤至中性，60 ℃真空干燥一夜，磷掺杂石墨氮化碳制备完成；
（2）磷掺杂石墨氮化碳结合神经元特异性烯醇化酶识别抗体的一抗标记物的制备
将10 µL、10 µg/mL的神经元特异性烯醇化酶的一抗在4 ℃下使用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺进行活化4 h，然后与磷掺杂石墨氮化碳在4 ℃下共同孵化6 h，得到磷掺杂石墨氮化碳结合神经元特异性烯醇化酶识别抗体的一抗标记物；
（3）聚多巴胺修饰氧化钴的制备
将6 g 2-甲基咪唑和5 g六水硝酸钴分别溶解于200 mL甲醇/乙醇（体积比为1：1）二元混合溶液中，然后将制备好的2-甲基咪唑溶液倒入六水硝酸钴溶液中，剧烈搅拌两分钟得到紫色混合溶液，室温孵育12 h，将得到的悬浮液离心，用乙醇洗涤数次，60 ℃真空干燥一夜得到紫色粉末，然后将粉末研磨后倒入瓷舟中，在管式炉氩气气氛下350 ℃煅烧1 h以保持其十二面体骨架，接着关闭氩气，再在空气气氛下350 ℃煅烧1 h得到黑色的氧化钴粉末；
（4）聚多巴胺修饰氧化钴纳米复合材料的制备
将8 mg黑色氧化钴粉末分散在10 mL 10 mM的pH 8.5的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐-盐酸溶液中，形成均一的悬浮液，然后加入10 mg盐酸多巴胺，室温搅拌24 h，离心，用超纯水洗涤三次，60 ℃真空干燥；
（5）PBS缓冲溶液的配置
取11.94 g十二水合磷酸氢二钠定容于500 mL的容量瓶中配置成浓度为1/15 M的水溶液，作为甲液；取4.54 g磷酸二氢钾定容于500 mL的容量瓶中配置成浓度为1/15 M的水溶液，作为乙液；将甲液和乙液按比例混合，配置成一系列pH在6.0 ~ 8.0的PBS缓冲溶液；
（6）聚多巴胺修饰氧化钴并结合神经元特异性烯醇化酶识别抗体的二抗标记物的制备
将60 μL、10 μg/mL的神经元特异性烯醇化酶二抗加入到1 mL、2 mg/mL的聚多巴胺修饰氧化钴纳米复合材料水溶液中，并在4 ℃下震荡孵化12 h，离心后将得到的产物分散在1 mL PBS中，即得聚多巴胺修饰氧化钴并结合神经元特异性烯醇化酶识别抗体的二抗标记物溶液；
（7）电化学免疫传感器的制备
1）用三氧化二铝抛光粉打磨直径为4 mm的玻碳电极，超纯水清洗干净，将6 µL、1.5 mg/mL的磷掺杂石墨氮化碳结合神经元特异性烯醇化酶识别抗体的一抗标记物溶液滴加到电极表面，室温下晾干；
2）继续滴加3 µL、质量分数为0.1 %的牛血清蛋白溶液到电极表面，用超纯水洗净，室温下晾干；
3）继续滴加6 µL、0.00005 ~ 100 ng/mL的一系列不同浓度的神经元特异性烯醇化酶抗原到电极表面，孵化2 h，超纯水冲洗，室温下晾干；
4）最后滴加6 µL聚多巴胺修饰氧化钴并结合神经元特异性烯醇化酶识别抗体的二抗标记物溶液，超纯水冲洗，室温下晾干，制得一种检测神经元特异性烯醇化酶的电化学免疫传感器。
实施例3电化学免疫传感器的制备
（1）磷掺杂石墨氮化碳的制备
将3 g三聚氰胺溶解在120 mL水中，然后加热到80 ℃，搅拌三十分钟后加入900 μL磷酸，接着转移到50 mL聚四氟乙烯高温反应釜中，在180 ℃下反应10 h ，待反应釜冷却至室温后，将所得到的产物离心，放入真空干燥箱中，在60 ℃下干燥一夜，之后，将得到的白色固体研磨，放入用锡箔纸包裹的瓷舟，在管式炉中氮气气氛下加热到550 ℃煅烧4 h，加热速率为2.5 ℃/min，最后将得到的固体用超纯水离心洗涤至中性，60 ℃真空干燥一夜，磷掺杂石墨氮化碳制备完成；
（2）磷掺杂石墨氮化碳结合神经元特异性烯醇化酶识别抗体的一抗标记物的制备
将20 µL、10 µg/mL的神经元特异性烯醇化酶的一抗在4 ℃下使用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺进行活化4 h，然后与磷掺杂石墨氮化碳在4 ℃下共同孵化6 h，得到磷掺杂石墨氮化碳结合神经元特异性烯醇化酶识别抗体的一抗标记物；
（3）聚多巴胺修饰氧化钴的制备
将9 g的2-甲基咪唑和8 g六水硝酸钴分别溶解于300 mL甲醇/乙醇（体积比为1：1）二元混合溶液中，然后将制备好的2-甲基咪唑溶液倒入六水硝酸钴溶液中，剧烈搅拌两分钟得到紫色混合溶液，室温孵育12 h，将得到的悬浮液离心，用乙醇洗涤数次，60 ℃真空干燥一夜得到紫色粉末，然后将粉末研磨后倒入瓷舟中，在管式炉氩气气氛下350 ℃煅烧1h 以保持其十二面体骨架，接着关闭氩气，再在空气气氛下350 ℃煅烧1 h得到黑色的氧化钴粉末；
（4）聚多巴胺修饰氧化钴纳米复合材料的制备
将12 mg黑色氧化钴粉末分散在10 mL 10 mM的pH 8.5的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐-盐酸溶液中，形成均一的悬浮液，然后加入15 mg盐酸多巴胺，室温搅拌24 h，离心，用超纯水洗涤三次，60 ℃真空干燥；
（5）PBS缓冲溶液的配置
取11.94 g十二水合磷酸氢二钠定容于500 mL的容量瓶中配置成浓度为1/15 M的水溶液，作为甲液；取4.54 g磷酸二氢钾定容于500 mL的容量瓶中配置成浓度为1/15 M的水溶液，作为乙液；将甲液和乙液按比例混合，配置成一系列pH在6.0 ~ 8.0的PBS缓冲溶液；
（6）聚多巴胺修饰氧化钴并结合神经元特异性烯醇化酶识别抗体的二抗标记物的制备
将100 μL、10 μg/mL的神经元特异性烯醇化酶二抗加入到1 mL、3 mg/mL的聚多巴胺修饰氧化钴纳米复合材料水溶液中，并在4 ℃下震荡孵化12 h，离心后将得到的产物分散在1 mL PBS中，即得聚多巴胺修饰氧化钴并结合神经元特异性烯醇化酶识别抗体的二抗标记物溶液；
（7）电化学免疫传感器的制备
1）用三氧化二铝抛光粉打磨直径为4 mm的玻碳电极，超纯水清洗干净，将6 µL、2.5 mg/mL磷掺杂石墨氮化碳结合神经元特异性烯醇化酶识别抗体的一抗标记物溶液滴加到电极表面，室温下晾干；
2）继续滴加3 µL、质量分数为0.1 %的牛血清蛋白溶液到电极表面，用超纯水洗净，室温下晾干；
3）继续滴加6 µL、0.00005 ~ 100 ng/mL的一系列不同浓度的神经元特异性烯醇化酶抗原到电极表面，孵化2 h，超纯水冲洗，室温下晾干；
4）最后滴加6 µL聚多巴胺修饰氧化钴并结合神经元特异性烯醇化酶识别抗体的二抗标记物溶液，超纯水冲洗，室温下晾干，制得一种检测神经元特异性烯醇化酶的电化学免疫传感器。
实施例4 神经元特异性烯醇化酶的检测
（1）将Ag/AgCl作为参比电极，铂丝作为对电极，所制备的电化学发光传感器作为工作电极正确连接在化学发光检测仪的暗盒中，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起，光电倍增管的高压设置为500 V，在含有20 mM过硫酸钾的PBS缓冲溶液中进行测试；
（2）用电化学发光法对神经元特异性烯醇化酶标准溶液进行检测，其电压测试范围为-1.6 ~ 0 V；
（3）观察神经元特异性烯醇化酶加入前后传感器的电化学发光强度，然后记录电化学发光强度值与神经元特异性烯醇化酶浓度的线性关系，绘制工作曲线。
实施例5 神经元特异性烯醇化酶的检测
（1）将Ag/AgCl作为参比电极，铂丝作为对电极，所制备的电化学发光传感器作为工作电极正确连接在化学发光检测仪的暗盒中，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起，光电倍增管的高压设置为600 V，在含有50 mM过硫酸钾的PBS缓冲溶液中进行测试；
（2）用电化学发光法对神经元特异性烯醇化酶标准溶液进行检测，其电压测试范围为-1.5 ~ 0 V；
（3）观察神经元特异性烯醇化酶加入前后传感器的电化学发光强度，然后记录电化学发光强度值与神经元特异性烯醇化酶浓度的线性关系，绘制工作曲线。
实施例6 神经元特异性烯醇化酶的检测
（1）将Ag/AgCl作为参比电极，铂丝作为对电极，所制备的电化学发光传感器作为工作电极正确连接在化学发光检测仪的暗盒中，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起，光电倍增管的高压设置为700 V，在含有80 mM过硫酸钾的PBS缓冲溶液中进行测试；
（2）用电化学发光法对神经元特异性烯醇化酶标准溶液进行检测，其电压测试范围为-1.4 ~ 0 V；
（3）观察神经元特异性烯醇化酶加入前后传感器的电化学发光强度，然后记录电化学发光强度值与神经元特异性烯醇化酶浓度的线性关系，绘制工作曲线。
实施例7 神经元特异性烯醇化酶的检测
（1）将Ag/AgCl作为参比电极，铂丝作为对电极，所制备的电化学发光传感器作为工作电极正确连接在化学发光检测仪的暗盒中，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起，光电倍增管的高压设置为800 V，在含有100 mM过硫酸钾的PBS缓冲溶液中进行测试；
（2）用电化学发光法对神经元特异性烯醇化酶标准溶液进行检测，其电压测试范围为-1.3 ~ 0 V；
（3）观察神经元特异性烯醇化酶加入前后传感器的电化学发光强度，然后记录电化学发光强度值与神经元特异性烯醇化酶浓度的线性关系，绘制工作曲线。

Claims (1)

1.一种基于聚多巴胺修饰氧化钴猝灭磷掺杂石墨氮化碳电化学发光的免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）磷掺杂石墨氮化碳的制备
将1 ~ 3 g三聚氰胺溶解在40 ~ 120 mL水中，然后加热到80 ℃，搅拌30 min后加入300 ~ 900 μL磷酸，接着转移到50 mL聚四氟乙烯高温反应釜中，在180 ℃下反应10 h，待反应釜冷却至室温后，将所得到的产物离心，放入真空干燥箱中，在60 ℃下干燥一夜，之后，将得到的白色固体研磨，放入用锡箔纸包裹的瓷舟，在管式炉中氮气气氛下加热到550℃煅烧4 h，加热速率为2.5 ℃/min；最后将得到的固体用超纯水离心洗涤至中性，60 ℃真空干燥一夜，磷掺杂石墨氮化碳制备完成；
（2）磷掺杂石墨氮化碳结合神经元特异性烯醇化酶识别抗体的一抗标记物的制备
将5 ~ 20 µL、10 μg/mL的神经元特异性烯醇化酶的一抗在4 ℃下使用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺进行活化4 h，然后与磷掺杂石墨氮化碳在4 ℃下共同孵化6 h，得到磷掺杂石墨氮化碳结合神经元特异性烯醇化酶识别抗体的一抗标记物；
（3）聚多巴胺修饰氧化钴的制备
将3 ~ 9 g的2-甲基咪唑和2 ~ 8 g六水硝酸钴分别溶解于100 ~ 300 mL甲醇/乙醇（体积比为1：1）二元混合溶液中，然后将制备好的2-甲基咪唑溶液倒入六水硝酸钴溶液中，剧烈搅拌两分钟得到紫色混合溶液，室温孵育12 h；将得到的悬浮液离心，用乙醇洗涤数次，60 ℃真空干燥一夜得到紫色粉末；然后将粉末研磨后倒入瓷舟中，在管式炉氩气气氛下350 ℃煅烧1 h以保持其十二面体骨架，接着关闭氩气，再在空气气氛下350 ℃煅烧1 h得到黑色的氧化钴粉末；
（4）聚多巴胺修饰氧化钴纳米复合材料的制备
将6 ~ 12 mg黑色氧化钴粉末分散在10 mL 10 mM的pH 8.5的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐-盐酸溶液中，形成均一的悬浮液，然后加入5 ~ 15 mg盐酸多巴胺，室温搅拌24 h，离心，用超纯水洗涤三次，60℃真空干燥；
（5）PBS缓冲溶液的配置
取11.94 g十二水合磷酸氢二钠定容于500 mL的容量瓶中配置成浓度为1/15 M的水溶液，作为甲液；取4.54 g磷酸二氢钾定容于500 mL的容量瓶中配置成浓度为1/15 M的水溶液，作为乙液；将甲液和乙液按比例混合，配置成一系列pH在6.0 ~ 8.0的PBS缓冲溶液；
（6）聚多巴胺修饰氧化钴并结合神经元特异性烯醇化酶识别抗体的二抗标记物的制备
将20 ~ 100 μL、10 μg/mL神经元特异性烯醇化酶二抗加入到1 mL、1 ~ 3 mg/mL聚多巴胺修饰氧化钴纳米复合材料水溶液中，并在4 ℃下震荡孵化12 h，离心后将得到的产物分散在1 mL PBS中，即得聚多巴胺修饰氧化钴并结合神经元特异性烯醇化酶识别抗体的二抗标记物溶液；
（7）电化学免疫传感器的制备
1）用三氧化二铝抛光粉打磨直径为4 mm的玻碳电极，超纯水清洗干净，将6 µL、0.5 ~2.5 mg/mL的磷掺杂石墨氮化碳结合神经元特异性烯醇化酶识别抗体的一抗标记物溶液滴加到电极表面，室温下晾干；
2）继续滴加3 µL、质量分数为0.1 %的牛血清蛋白溶液到电极表面，用超纯水清洗，室温下晾干；
3）继续滴加6 µL、0.00005 ~ 100 ng/mL的一系列不同浓度的神经元特异性烯醇化酶抗原到电极表面，孵化2 h，超纯水清洗，室温下晾干；
4）最后滴加6 µL的聚多巴胺修饰氧化钴并结合神经元特异性烯醇化酶识别抗体的二抗标记物溶液，超纯水清洗，室温下晾干，制得一种基于聚多巴胺修饰氧化钴猝灭磷掺杂石墨氮化碳电化学发光的免疫传感器。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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