CN105784990A - 一种利用适配体检测黄曲霉毒素b1或m1的试纸条 - Google Patents

一种利用适配体检测黄曲霉毒素b1或m1的试纸条 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用适配体检测黄曲霉毒素B1或M1的试纸条。本发明提供了所提供的检测黄曲霉毒素B1或M1的试纸，包括样品吸收垫、标记物垫、反应膜和吸水垫；所述标记物垫包被检测探针，所述检测探针为荧光素标记的黄曲霉毒素B1适配体；所述黄曲霉毒素B1适配体的核苷酸序列为序列1；所述反应膜包括检测区和质控区；所述检测区包被黄曲霉毒素B1半抗原与载体蛋白形成的偶联物；所述质控区包被质控探针，所述质控探针由亲和素偶联生物素标记的黄曲霉毒素B1适配体互补单链DNA分子形成的偶联物。本发明的检测黄曲霉毒素B1或M1的试纸具有灵敏度高、精确定量、特异性强、简单方便和检测时间短的优点。

Description

一种利用适配体检测黄曲霉毒素B1或M1的试纸条
技术领域
本发明涉及检测技术领域，尤其涉及一种利用适配体检测黄曲霉毒素B1或M1的试纸条。
背景技术
近年来，我国部分地区频繁出现饲料、牛奶、花生油、粮食等中黄曲霉毒素超标现象，对人体健康构成严重威胁，引起社会各界的高度关注。黄曲霉毒素是来自于黄曲霉和寄生曲霉等所产生的一种次生代谢物，具有急慢性毒性、致突变性、致癌性和致畸性。黄曲霉毒素对家畜和家禽影响很大，特别猪的敏感性最大，主要表现为肝脏肿大受损或癌变、肠道出血、免疫力下降、生长发育不良等危害，我国国家法规对于饲料中黄曲霉毒素含量不得超过20ppb。黄曲霉毒素由约20种相似的化学物质组成，主要包括黄曲霉毒素B1、B2、M1、M2、G1、G2，其中黄曲霉素毒素B1(AFB1)是黄曲霉毒素家族中毒性和致癌性最强的一种，其毒性比氰化钾强10倍，其致癌性比二甲基亚硝胺强75倍。人的原发性肝癌也很可能与黄曲霉毒素有关，被世界卫生组织(WHO)列为一级致癌物，世界各国对黄曲霉毒素B1(AFB1)都作了严格的限量标准。黄曲霉毒素M1(AFM1)是黄曲霉毒素B1的代谢物，其基本结构为一个二呋喃环的氧杂萘邻酮，与黄曲霉毒素B1的致癌性基本相似，但毒性低于黄曲霉毒素B1，然而与氰化钾和砒霜相比，仍属特别剧毒物质，为强致癌剂。
目前，黄曲霉毒素B1或M1的检测方法主要包括薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、酶联免疫吸附法(ELISA)。TLC法虽然具有设备简单的优点，但其灵敏度低。高效液相色谱法具有灵敏度高、分离能力强、特异性好和测定结果可靠等特点，但如果样品成分复杂，在进行液相色谱分离前，需对样品作彻底有效的净化处理，不适合于大批量样品的检测，并且设备仪器昂贵，不易普及。酶联免疫吸附法是目前常使用的一种检测方法，它具有快速、灵敏、可定量、对样品纯度要求不高，特别适用于大批量样品的检测，但由于需要酶标仪和操作熟练的人员以及检测时间相对较长，所以不适合现场快速检测。因此急需开发新的快速简单灵敏的黄曲霉毒素B1或M1的快速检测方法。
核酸适配体作为一种新型识别分子，是通过SELEX技术从1014-1018文库中筛选出来的，具有极高的亲和力和特异性，与抗体相比，具有易于合成制备，性能稳定，便于修饰等优点，已被用于多种物质的检测。目前利用筛选到的AFB1的适配体(也可以检测AFM1)建立了多种检测方法，如胶体金比色法、荧光染料PicoGreen法等，但这些方法容易受到多种基质干扰，灵敏度较低，不适合现场应用。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种检测黄曲霉毒素B1或M1的试纸。
本发明所提供的检测黄曲霉毒素B1或M1的试纸，包括样品吸收垫、标记物垫、反应膜和吸水垫；
所述标记物垫包被检测探针，所述检测探针为荧光素标记的黄曲霉毒素B1适配体；所述黄曲霉毒素B1适配体的核苷酸序列为序列1；
所述反应膜包括检测区和质控区；
所述检测区包被黄曲霉毒素B1半抗原与载体蛋白形成的偶联物；偶联物AFB1-BSA的结构式如图1。
所述黄曲霉毒素B1半抗原能与所述黄曲霉毒素B1适配体结合；
所述质控区包被质控探针，所述质控探针的核苷酸序列为所述黄曲霉毒素B1适配体的互补序列，具体为序列2。
黄曲霉毒素B1半抗原与载体蛋白形成的偶联物为黄曲霉毒素B1半抗原的羧基和载体蛋白BSA的氨基形成肽键。
所述质控探针的5’末端标记生物素，且通过链酶亲和素与其上的生物素偶联形成共价键包被在反应膜上。
所述载体蛋白为但不限于卵清白蛋白或牛血清白蛋白。
上述试纸条中，所述荧光素为但不限于Cy5、AlexaFluor647、量子点、胶体金等。
上述试纸条还包括底板，且所述样品吸收垫、标记物垫、反应膜和吸水垫固定在所述底板上。
上述的试纸条在检测黄曲霉毒素B1或M1中的应用也是本发明保护的范围。
上述的试纸条在制备检测黄曲霉毒素B1或M1产品中的应用也是本发明保护的范围。
上述的试纸条在待测样品中检测黄曲霉毒素B1或M1含量中的应用也是本发明保护的范围。
上述的试纸条在制备待测样品中检测黄曲霉毒素B1或M1含量产品中的应用也是本发明保护的范围。
本发明的另一个目的是提供一种检测待测样品中黄曲霉毒素B1或M1含量的方法。
本发明所提供的检测待测样品中黄曲霉毒素B1或M1含量的方法，包括如下步骤：
(1)用上述的试纸条检测黄曲霉毒素B1或M1标准品，得到标准品在所述试纸的检测区和质控区的荧光信号比值，制作黄曲霉毒素B1或M1标准品的浓度对应荧光信号比值的一元线性回归曲线，计算回归方程；
(2)将所述黄曲霉毒素标准品替换为待测样品，用所述试纸检测待测样品，得到待测样品在所述试纸的检测区和质控区的荧光信号比值，根据步骤(1)的回归方程，得到所述待测样品中黄曲霉毒素的含量。
用上述的试纸条检测黄曲霉毒素B1或M1标准品或待测样品，得到标准品在所述试纸的检测区和质控区的荧光信号比值包括如下步骤：取黄曲霉毒素B1或M1标准品或待测样品滴加到试纸的样品吸收垫上，5分钟后，将试纸条放入试纸条检测仪器ESEQuant-LR3中，进行检测，分别测定检测区和质控区的荧光信号强度；将检测区的荧光信号强度(A)比上质控区的荧光信号强度(B)，得到A/B值，为检测区和质控区的荧光信号比值。
所述步骤(2)中所述检测待测样品之前，还包括将待测样品进行前处理步骤；当所述待测样品为花生粕时，所述待测样品前处理的方法为：称取2g样品于50mL离心管中，加入8mL正己烷和10mL70％的甲醇水溶液，振荡5min，室温4000转/分离心10min；去除上层液体，取0.5mL下层液体加入0.5mL去离子水，混匀，再取混匀液体0.5mL加入0.5mL35％的甲醇水溶液，振荡30s；取100μL进行分析(样品稀释倍数为20倍)。
上核酸适配体(序列1)在检测黄曲霉毒素B1或M1中的应用也是本发明保护的范围。
本发明试纸的检测原理为：在样品吸收垫上滴加样品，如果样品中有黄曲霉毒素B1或M1，则黄曲霉毒素B1或M1经层析作用移动到标记物垫的时候就会和荧光素标记的黄曲霉毒素B1适配体结合形成复合物，并带动荧光素标记的适配体一起在层析作用下上行。当移动到检测区时，未被样品中黄曲霉毒素B1或M1结合的游离的荧光素标记的适配体就会和检测区上的偶联在载体蛋白上的黄曲霉毒素B1结合，而有荧光信号。样品中黄曲霉毒素B1或M1越多，剩余游离的荧光素标记的适配体就会越少，检测区处的荧光信号越低，依此来检测样品中的黄曲霉毒素B1或M1的含量。
本发明的检测黄曲霉毒素B1或M1的试纸具有灵敏度高、精确定量、特异性强、简单方便和检测时间短的优点。由于以荧光素代替了胶体金作为标记物，很少的荧光信号即可以通过仪器检测出来，因此大大提高了检测的灵敏度，检测黄曲霉毒素B1灵敏度可达0.5ng/ml。通过设置质控带(点)作为数据归一化方法，降低了不同纸条间不同操作人员乃至不同仪器扫描的实验误差，将不同纸条测得的样品值代入标准曲线，即可以达到精确定量的效果。由于采用了适配体-样品-半抗原反应的原理，通过选择特异性强的适配体，与其他霉菌毒素基本没有交叉，因此避免了其他霉菌毒素的干扰。采用本方法，只需把试纸条插入样品，20分钟内即可获得实验结果，可以大大提高检测的效率。
附图说明
图1为偶联BSA的AFB1半抗原的结构式。
图2为检测AFB1的荧光试纸条原理示意图。
图3为荧光试纸条检测AFB1的灵敏度及线性范围结果。
图4为荧光试纸条检测AFB1的标准曲线图。
图5为荧光试纸条检测AFM1的标准曲线图。
图6为荧光试纸条检测AFB1和AFM1的特异性研究。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、检测黄曲霉毒素试纸条的制备
一、检测黄曲霉毒素试纸条的制备
1、检测探针和质控探针的合成
分别设计合成荧光素标记的检测探针和生物素标记的质控探针。
其中检测探针为荧光素标记的黄曲霉毒素B1适配体，荧光素为但不限于Cy5。
黄曲霉毒素B1适配体可以和检测区的黄曲霉毒素B1半抗原结合，黄曲霉毒素B1适配体的核苷酸序列如下：
5'-Cy5-GTT-GGG-CAC-GTG-TTG-TCT-CTC-TGT-GTC-TCG-TGC-CCT-TCG-CTA-GGC-CCA-CA-3′(序列1)
质控序列为生物素标记的黄曲霉毒素B1适配体的互补单链DNA分子，可以与检测探针通过碱基互补结合。
质控序列的核苷酸序列为：
5'-biotin-TGT-GGG-CCT-AGC-GAA-GGG-CAC-GAG-ACA-CAG-AGA-GAC-AAC-ACG-TGC-CCA-AC-3'(序列2)
2、AFB1半抗原和载体蛋白BSA的偶联物AFB1-BSA制备
偶联物AFB1-BSA的结构式如图1，黄曲霉毒素B1半抗原的羧基和载体蛋白BSA的氨基形成肽键。
上述偶联物的制备方法：首先经过肟化反应制备AFB1肟(AFB1-O)；然后用碳二亚胺法制备AFB1人工抗原；最后根据AFB1与修饰过的牛血清蛋白(C-BSA)的反应得到偶联产物，即偶联物AFB1-BSA。
3、制备试纸条
1)、标记物垫制备
将检测探针包被在标记物垫(上海杰一生物技术有限公司，JY-BX101)上(包被浓度为0.1μM)，得到包被检测探针的标记物垫；
2)、反应膜制备
反应膜包括检测区和质控区。
将偶联物AFB1-BSA按照包被浓度为1μM包被在反应膜形成检测区；
质控探针为标记生物素的适配体互补序列，其通过链酶亲和素与其上的生物素偶联形成共价键包被在反应膜上形成质控区，包被浓度为1μM。
3)、制备试纸条
试纸条由样品吸收垫(上海杰一生物技术有限公司，JY-BX111)、上述1)制备的包被检测探针的标记物垫、上述2)制备的反应膜、吸水垫依次按照顺序黏贴在底板上，且反应膜的检测区与标记物垫相邻，反应膜的检质控区与吸水垫相邻，如图2第一个图所示。
二、试纸条检测原理
如图2中图所示，当不含黄曲霉毒素B1的样品加入样品吸收垫上时，样品在毛细作用下流动到标记物垫，并带着荧光标记的探针混合物一起继续向前流动。当流动到检测区时，检测探针会与检测区处固定的半抗原结合，经试纸条检测仪器ESEQuant-LR3检测出高荧光强度；当流动到质控区时，剩余的检测探针会与质控探针结合，质控区也出现高荧光强度。
如图2下图所示，当含有黄曲霉毒素B1的样品加入样品吸收垫上时，样品在毛细作用下流动到标记物垫，黄曲霉毒素B1与检测探针(适配体)结合，并在毛细作用下一起向前流动。当流动到检测区时，未与黄曲霉毒素B1结合的检测探针会与半抗原结合；当样品中的AFB1越多，结合的检测探针也就越来越多，剩余的游离检测探针就会越来越少，和检测区半抗原结合的检测探针也就越少，荧光轻度越低。反之，样品中的黄曲霉毒素B1越来越少，剩余的游离检测探针就会越来越多，和检测区处半抗原结合也就越多，荧光强度越强，从而可以根据荧光强度的变化判断样品中黄曲霉毒素B1的浓度。
三、试纸条检测方法
1)取黄曲霉毒素B1或M1标准品滴加到试纸的样品吸收垫上，5分钟后，将试纸条放入试纸条检测仪器ESEQuant-LR3中，进行检测，分别测定检测区和质控区的荧光信号强度；将检测区的荧光信号强度(A)比上质控区的荧光信号强度(B)，得到A/B值，将得到的A/B值制作黄曲霉毒素B1或M1标准品的浓度对应荧光信号比值的一元线性回归曲线，计算回归方程；
2)将黄曲霉毒素标准品B1或M1替换为待测样品，用上述试纸检测待测样品，
记录在所述试纸的检测区和质控区的荧光信号比值，根据步骤(1)的回归方程，得到待测样品中黄曲霉毒素的浓度。
实施例2、试纸条检测黄曲霉毒素B1或M1灵敏度、线性范围、特异性研究
1、检测黄曲霉毒素B1灵敏度与线性范围研究
配制图3所示的不同浓度AFB1(FermentekLtd,AF028)水溶液，分别用实施例1制备的试纸条进行测定。
用试纸条检测仪器ESEQuant-LR3分别测定检测区和质控区处的荧光强度。结果如图3所示，可以看出，随着AFB1浓度增加，检测区处荧光强度逐渐变小。利用检测区荧光强度与质控区荧光强度比值(表1)，绘制检测黄曲霉毒素B1的标准曲线如图4所示，结果表明，试纸条的灵敏度0.5ng/mL；线性范围为0.5ng/mL-50μg/mL。
表1黄曲霉毒素B1标准品的检测结果
2、检测黄曲霉毒素M1灵敏度与线性范围研究
按照上述方法，配制不同浓度AFM1(百灵威科技有限公司，6795-23-9)水溶液，分别用实施例1制备的试纸条进行测定。
用试纸条检测仪器ESEQuant-LR3分别测定检测区和质控区处的荧光强度，利用检测区荧光强度与质控区荧光强度比值(表2)，绘制检测黄曲霉毒素M1的标准曲线如图5所示，结果表明，试纸条的灵敏度为10ng/mL；线性范围为10-1000ng/mL。
表2黄曲霉毒素M1标准品的检测结果
3、特异性研究
配制浓度为100ng/mL的AFB1溶液、100ng/mL的AFM1溶液、浓度为100ng/mL的黄曲霉毒素G1(百灵威科技有限公司，1165-39-5)、浓度为100ng/mL的黄曲霉毒素B2(百灵威科技有限公司，7220-81-7)、浓度为100ng/mL的赭曲酶毒素OchratoxinA(OTA，FermentekLtd,OC030a)溶液、浓度为100ng/mL的玉米赤酶烯酮Zearalenone(ZEN，百灵威科技有限公司，17924-92-4)溶液，浓度为100ng/mL的呕吐毒素Vomitoxin(DON，百灵威科技有限公司，51481-10-8)溶液和空白样品分别用试纸条进行测定。
用试纸条检测仪器ESEQuant-LR3分别测定检测区和质控区处的荧光强度，结果如图6所示，显示AFG1、AFB2、OTA、ZEN、DON以及空白样品等均不能引起检测区处荧光变化，这也说明本方法对黄曲霉毒素B1或M1具有很好的特异性。
实施例3、试纸条在花生粕中黄曲霉毒素B1检测中的应用
1、标准曲线绘制
同实施例1中检测黄曲霉毒素B1灵敏度与线性范围研究中的标准曲线方法，得到的回归方程为：y＝-0.2076x+0.9881，R2＝0.99，为黄曲霉毒素B1标准曲线一元回归方程。
2、样品提取
选择一份经国标方法(LC-MSMS)测定过的花生粕黄曲霉毒素B1样品(含量143.47ng/mL)，用本试纸条进行测定。首先称取2g花生粕于50mL离心管中，加入8mL正己烷和10mL70％的甲醇水溶液，振荡5min，室温4000转/分离心10min；去除上层液体，取0.5mL下层液体加入0.5mL去离子水，混匀，再取混匀液体0.5mL加入0.5mL35％的甲醇水溶液，振荡30s；取100μL进行分析(样品稀释倍数为20倍)。
3、样品测定
取上述制备好的待测样品100μL滴加到所述试纸的样品吸收垫上，观察样品层析沿着硝酸纤维素膜流动，直到被上面的吸水垫吸附；5分钟后，将试纸条放入试纸条检测仪器ESEQuant-LR3中，进行检测，分别测定检测区和质控区的荧光信号强度；将检测区的荧光信号强度(A)比上质控区的荧光信号强度(B)，将得到的计算值代入上述步骤1的回归方程，计算得到待测样品中黄曲霉毒素B1的浓度。
3、检测结果：
检测区的荧光强度(A)为962.06，质控区的荧光强度(B)为1210.75，A/B为0.7946，计算得到的待测样品中黄曲霉毒素B1的浓度为171.05ng/mL。与国标方法测定值误差低于10％，说明本方法具有很好的准确度。
实施例4、试纸条在花生粕中黄曲霉毒素M1检测中的应用
1、标准曲线绘制
同实施例1中检测黄曲霉毒素M1灵敏度与线性范围研究中的标准曲线方法，得到的回归方程为：y＝-0.321x+1.1987R2＝0.9973
2、样品提取
选择一份经国标方法(LC-MSMS)测定过的花生粕黄曲霉毒素M1样品(含量261.54ng/mL)，用本试纸条进行测定。首先称取2g花生粕于50mL离心管中，加入8mL正己烷和10mL70％的甲醇水溶液，振荡5min，室温4000转/分离心10min；去除上层液体，取0.5mL下层液体加入0.5mL去离子水，混匀，再取混匀液体0.5mL加入0.5mL35％的甲醇水溶液，振荡30s；取100μL进行分析(样品稀释倍数为20倍)。
3、样品测定
取上述制备好的待测样品100μL滴加到所述试纸的样品吸收垫上，观察样品层析沿着硝酸纤维素膜流动，直到被上面的吸水垫吸附；5分钟后，将试纸条放入试纸条检测仪器ESEQuant-LR3中，进行检测，分别测定检测区和质控区的荧光信号强度；将检测区的荧光信号强度(A)比上质控区的荧光信号强度(B)，将得到的计算值代入上述步骤1的回归方程，计算得到待测样品中黄曲霉毒素M1的浓度。
4、检测结果：
检测区的荧光强度(A)为1006.77，质控区的荧光强度(B)为1234.65，A/B为0.815432，计算得到的待测样品中黄曲霉毒素M1的浓度为312.61ng/mL。与国标方法测定值误差低于20％，说明本方法具有较好的准确度。

Claims (10)

1.一种检测黄曲霉毒素B1或M1的试纸，包括样品吸收垫、标记物垫、反应膜和吸水垫；
所述标记物垫包被检测探针，所述检测探针为荧光素标记的黄曲霉毒素B1适配体；所述黄曲霉毒素B1适配体的核苷酸序列为序列1；
所述反应膜包括检测区和质控区；
所述检测区包被黄曲霉毒素B1半抗原与载体蛋白形成的偶联物；
所述质控区包被质控探针，所述质控探针的核苷酸序列为所述适配体的互补序列。
2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于：所述黄曲霉毒素B1半抗原能与所述黄曲霉毒素B1适配体结合；
所述质控探针的5’末端标记生物素。
3.根据权利要求1或2所述的试纸条，其特征在于：所述载体蛋白为卵清白蛋白或牛血清白蛋白；
所述荧光素为Cy5、AlexaFluor647、量子点或胶体金。
4.根据权利要求1-3中任一所述的试纸条，其特征在于：
所述试纸中还包括底板，且所述样品吸收垫、所述标记物垫、所述反应膜和所述吸水垫顺次固定在所述底板上。
5.权利要求1-4任一所述的试纸条在检测黄曲霉毒素B1或M1中的应用。
6.权利要求1-4任一所述的试纸条在制备检测黄曲霉毒素B1或M1产品中的应用。
7.权利要求1-4任一所述的试纸条在待测样品中检测黄曲霉毒素B1或M1含量中的应用。
8.权利要求1-4任一所述的试纸条在制备待测样品中检测黄曲霉毒素B1或M1含量产品中的应用。
9.一种检测待测样品中黄曲霉毒素B1或M1含量的方法，包括如下步骤：
(1)用权利要求1-4任一所述的试纸条检测黄曲霉毒素B1或M1标准品，得到标准品在所述试纸的检测区和质控区的荧光信号比值，制作黄曲霉毒素B1或M1标准品的浓度对应荧光信号比值的一元线性回归曲线，计算回归方程；
(2)将所述黄曲霉毒素标准品替换为待测样品，用所述试纸检测待测样品，得到待测样品在所述试纸的检测区和质控区的荧光信号比值，根据步骤(1)的回归方程，得到所述待测样品中黄曲霉毒素的含量。
10.权利要求1-4任一所述的试纸条中的核酸适配体在检测黄曲霉毒素B1或M1中的应用。
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