CN103983774A - 特异性识别双酚a核酸适配体探针及其试纸条检测应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种特异性识别双酚A核酸适配体探针及其试纸条检测应用。该探针具有SEQIDNO.1所示序列，并可应用于制备双酚A免疫层析金标试纸条等，该试纸条可包括衬板，衬板上至少依次粘贴有样品膜、核酸适配体探针-金标结合垫、具有检测线和参考线的包被膜和吸水膜四种粘贴物，其中，所述核酸适配体探针-金标结合垫包含所述核酸适配体探针与金纳米粒子的复合物。而藉由该试纸条可以通过直接观察实现双酚A的快速定性、定量检测，无需其他辅助仪器设备，检测工作可快速完成并得到准确检测结果，具有特异性高，稳定性好，成本低廉，易于使用等特点，可应用于医院、家庭、以及食品安全与检验检疫的海关、机场、口岸等需要现场快速检测的机构。
Description
技术领域
本发明特别涉及一种特异性识别双酚A核酸适配体探针及在检测双酚A中的应用，例如，基于该核酸适配体探针的双酚A免疫层析金标试纸条、其制备方法与应用。
技术背景
随着科技的发展和对生活便利性快捷性提高的要求，塑料制品已广泛用于生活中的各个方面。双酚A是合成聚碳酸酯和环氧树脂等制作塑料制品材料的重要成分，这些材料应用于制作塑料（奶）瓶、幼儿用的吸口杯、食品和饮料（奶粉）罐内侧涂层。据研究表明双酚A能够导致内分泌失调，导致诱发性早熟，威胁着胎儿与儿童的健康，同时癌症和新陈代谢紊乱导致的肥胖也被认为与此有关。这些不断增长的新兴产品及其使用材料对检验检疫提出新的挑战。依靠传统仪器检测虽然具有检测灵敏度高，检测结果稳定性好等优点，但是大型仪器通常价格较为昂贵，并且需要具备相关知识的专业操作人员，同时存在检测成本高昂等缺点，限制了大型仪器的大规模检测和现场快速检测。基于免疫分析的酶联免疫吸附法可以解决大型仪器的检测成本高和不能够用于现场检测的缺点，但由于酶联免疫吸附法在检测过程中需要多步的反复洗涤和分离的过程，以及需要具有一定专业知识的人进行操作，一定程度上也限制了该方法的广泛推广使用。
发明内容
鉴于现有技术中的不足，本发明的一个目的在于提供一种特异性识别双酚A核酸适配体探针。
本发明的另一目的在于提供前述核酸适配体探针在制备双酚A检测试剂中的应用。
本发明的又一目的在于提供一种基于该核酸适配体探针的双酚A免疫层析金标试纸条。
本发明的再一目的在于提供前述双酚A免疫层析金标试纸条的制备方法。
是实现前述发明目的，本发明采用了如下技术方案：
一种特异性识别双酚A核酸适配体探针，其包含具有SEQ ID NO. 1所述序列的寡核苷酸链。
如前所述核酸适配体探针在制备双酚A检测试剂中的应用。
一种双酚A免疫层析金标试纸条，包含前述核酸适配体探针。
进一步的，所述双酚A免疫层析金标试纸条，包括衬板，所述衬板上至少依次粘贴有样品膜、核酸适配体探针-金标结合垫、具有检测线和参考线的包被膜和吸水膜四种粘贴物，其中，所述核酸适配体探针-金标结合垫包含所述核酸适配体探针与金纳米粒子的复合物。
一种双酚A免疫层析金标试纸条的制备方法，包括：
取胶体金与所述核酸适配体探针于溶液中反应，形成核酸适配体探针-金纳米粒子复合物，而后将所述核酸适配体探针-金纳米粒子复合物施加至结合垫基体上，形成核酸适配体探针-金标结合垫；
并且，分别将双酚A-牛血清蛋白偶联物溶液和能与所述核酸适配体探针互补配对的核苷酸链溶液施加至包被膜基体上形成彼此独立的检测线与参考线，获得包被膜；
以及，至少将样品膜、核酸适配体探针-金标结合垫、包被膜和吸水膜四种粘贴物依次粘接至衬板上，并使相邻粘结物的相应端部相重叠，制得所述试纸条。
与现有技术相比，本发明的有益技术效果包括：
（1）提供了可特异识别双酚A的核酸适配体探针，并且，通过将该探针与金纳米粒子非特异性结合获得核酸适配体—金纳米粒子复合物探针，利用金纳米粒子比表面积大这一显著特点应用于金标试纸条的建立和相应的检测方法，建立了可用于现场快速超灵敏检测的胶体金标记试纸条和相关的检测方法，通过肉眼直接观察实现双酚A的快速定性检测和通过检测条带上显色程度的升高对双酚A进行定量检测，无需其他辅助仪器设备，检测工作可在10-15min内完成并得到检测结果；
（2）本发明提供了一种通用型检测方法，例如，只需要将与金纳米粒子非特异性结合的核酸适配体探针的序列进行相应的改变和替换，即可实现其他目标物的快速、现场检测；
（3）本发明具有特异性高，稳定性好，应用范围广，成本低廉，操作使用方法简单易于推广应用。可应用于医院、家庭、以及食品安全与检验检疫的海关、机场、口岸等需要现场快速检测的机构。
附图说明
图1是本发明实施例1中一种双酚A免疫层析金标试纸条的结构示意图；
图2a-图2d是本发明实施例1中一种双酚A免疫层析金标试纸条的检测结果示意图。
具体实施方式
本发明是针对现有技术中，大型仪器检测方法不能够实现现场、高通量、快速检测的缺点而提出的。
进一步的讲，本发明的一个方面提供了一种特异性识别双酚A核酸适配体探针，其包含具有SEQ ID NO. 1所述序列的寡核苷酸链。
本发明的一个方面还提供了所述核酸适配体探针在制备双酚A检测试剂中的应用。
例如，通过将核酸适配体探针与金纳米粒子复合，形成核酸适配体探针-金纳米粒子复合探针，并将其应用于食品包装材料以及水资源污染中双酚A的快速、现场、超灵敏检测。
本发明的一个方面还提供了一种一种双酚A免疫层析金标试纸条，其包含所述的核酸适配体探针。
进一步的，所述的双酚A免疫层析金标试纸条，其特征在于包括衬板，所述衬板上至少依次粘贴有样品膜、核酸适配体探针-金标结合垫、具有检测线和参考线的包被膜和吸水膜四种粘贴物，其中，所述核酸适配体探针-金标结合垫包含所述核酸适配体探针与金纳米粒子的复合物。
优选的，相邻粘贴物之间重叠部分的长度在2 mm以上，优选为2mm。
优选的，所述金纳米粒子的粒径为25~40nm。
本发明一个方面还提供了一种双酚A免疫层析金标试纸条的制备方法，其包括：
取胶体金与所述核酸适配体探针于溶液中反应，形成核酸适配体探针-金纳米粒子复合物，而后将所述核酸适配体探针-金纳米粒子复合物施加至结合垫基体上，形成核酸适配体探针-金标结合垫；
并且，分别将双酚A-牛血清蛋白偶联物溶液和能与所述核酸适配体探针互补配对的核苷酸链溶液施加至包被膜基体上形成彼此独立的检测线与参考线，获得包被膜；
以及，至少将样品膜、核酸适配体探针-金标结合垫、包被膜和吸水膜四种粘贴物依次粘接至衬板上，并使相邻粘结物的相应端部相重叠，制得所述试纸条。
作为较为优选的实施方案之一，该制备方法可以包括如下步骤：
（1）选取粒径为25~40nm的胶体金溶液与所述核酸适配体探针的溶液混合，室温下反应1h以上，获得核酸适配体探针-金纳米粒子复合物溶液；
（2）将所述核酸适配体探针-金纳米粒子复合物溶液喷涂到结合垫基体上，形成核酸适配体探针-金标结合垫；
（3）具有检测线和参照线的硝酸纤维膜的制备
分别将双酚A-牛血清蛋白偶联物溶液和能与所述核酸适配体探针互补配对的核苷酸链溶液施加至包被膜基体上，形成相互平行的检测线和参照线；
（4）将样品膜、核酸适配体探针-金标结合垫、包被膜和吸水膜四种粘贴物依次粘接至衬板上，并使相邻粘结物的相应端部相重叠，制得所述试纸条。
作为较为典型的实施案例之一，该方法可以包括如下步骤：
（1）选取胶体金溶液与含所述核酸适配体探针、醋酸和TCEP的溶液混合，并在室温下震荡30 min以上，而后依次加入dATP和NaCl，室温反应30min以上，再冷却、离心重悬，获得核酸适配体探针-金纳米粒子复合物溶液；
（2）将所述核酸适配体探针-金纳米粒子复合物溶液喷涂到结合垫基体上，形成核酸适配体探针-金标结合垫；
（3）分别将浓度为1mg/mL的双酚A-牛血清蛋白偶联物溶液和浓度为1mg/mL的能与所述核酸适配体探针互补配对的核苷酸链溶液施加至包被膜基体上，形成相互平行的检测线和参照线；
（4）将样品膜、核酸适配体探针-金标结合垫、包被膜和吸水膜四种粘贴物依次粘接至衬板上，并使相邻粘结物的相应端部相重叠，其中重叠部分的长度在2 mm以上，制得所述试纸条。
进一步的，所述样品膜或吸水膜基体可选用玻璃纤维膜，所述结合垫基体或包被膜基体可选用硝酸纤维膜，但均不限于此。
以下结合具体实施案例对本发明的技术方案作进一步的说明。
如下实施例中所用原料核酸适配体探针为上海生物工程有限公司合成，双酚A（BPA）标准品购自美国Sigma公司，金纳米粒子溶液（胶体金溶液）为采用业界已知的方式合成。
实施例1
本实施例涉及的一种基于核酸适配体探针的双酚A免疫层析金标试纸条的制备方法具体操作步骤如下：
（1）选取25~40nm的胶体金溶液，在9500r/min的离心转速离心7分钟，弃去上清液得到浓缩10倍的浓缩胶体金溶液A；
将9 μL 1 μM/L 核酸适配体探针（如下简写为ssDNA）加入到1 μL醋酸缓冲溶液和1.5 μL 1 Μm/L TCEP中避光下放置1 h，得到混合溶液B；
将100 μL 10倍浓缩的胶体金溶液A（浓度约100mM）加入上述混合液B中，室温下震荡30 min；将85 μL 100 μM /L dATP加入上述溶液中，室温下震荡15 min；震荡完成后加入20 μL 0.1 M/L NaCl溶液，室温放置30 min后放入冰箱中6 h；取出9400倍重力下离心7分钟，去除上清未结合的核酸适配体探针，用重悬液重悬至100uL，得到核酸适配体探针-金纳米粒子复合物溶液；
（2）将核酸适配体探针-金纳米粒子复合物溶液喷涂到玻璃纤维膜上，得到核酸适配体探针-金纳米粒子复合物金标垫，亦可称为核酸适配体探针-金标结合垫；
（3）具有检测线和参照线的硝酸纤维膜（包被膜）的制备
在一块硝酸纤维膜上用浓度为1mg/mL的双酚A-牛血清蛋白偶联物溶液和浓度为1mg/mL与所述核酸适配体探针互补配对的核苷酸链溶液分别画两条线平行的线，双酚A-牛血清蛋白偶联物的溶液的划线作为检测线，与所述核酸适配体探针互补配对的核苷酸链溶液的划线为参照线；
（4）将样品玻璃纤维膜、免疫核酸适配体探针金标垫，具有检测线和参照线的硝酸纤维膜和吸水玻璃纤维膜四种粘贴物分别依次粘贴到塑料衬板上；相邻粘贴物之间的重叠部分的长度为2 mm，得到双酚A免疫层析金标试纸条（亦可命名为信号增强型超灵敏检测金标试纸条），干燥封装，温度4℃～常温条件下保存。
参阅图1所示系本实施例所获试纸条的结构示意图，其中，1为样品玻璃纤维膜，长度为18 mm；2为金标免疫识别探针垫，长度为4 mm；3为金标信号扩增探针垫，长度为4 mm； 4为硝酸纤维膜，长度为20 mm；5为吸水垫，长度为18 mm；6为塑料支撑底板，长度为60 mm；7为检测线，宽度为1 mm；8为参照线，宽度为1 mm。图中箭头表示液体毛细作用方向。
该试纸条在使用时，只需将样品玻璃纤维膜端插入到待检测的溶液中，等待10 min后取出用肉眼观察检测结果。如果包被膜上的检测条带（检测线T）和对照条带（参考线C）同时显色表明检测结果是有效的；与空白对照组的检测条带相比较，如果检测组的检测条带颜色变浅表明待检测溶液中含有目标物兔抗双酚A，显色越浅检测溶液中兔抗双酚A浓度越高，为阳性结果；如只有检测条带显色而对照条带不显色，表明检测结果无效。
更为直观的，当利用所述试纸条进行目标物检测过程中，具体检测结果判断依据如下所示：
参阅图2 a为所述试纸条的阴性检测结果示意图，
参阅图2b中为所述试纸条的阳性检测结果示意图，
参阅图2c为所述试纸条的无效检测结果示意图，
参阅图2d为所述试纸条的无效检测结果示意图。
该试纸条的检测准确度可通过如下方式检测：
配置多个批量的双酚A标准品溶液，每一批量的双酚A标准品溶液包含一系列不同浓度的双酚A标准品溶液和一组空白对照溶液，依照前述方式，以所述试纸条分别检测该一系列双酚A标准品溶液和空白对照溶液，并记录测试结果（包括检测线、参考线显色与否，以及检测线的显色深浅程度等）。
检测结果表明，所述试纸条能准确快速的检测双酚A的浓度。另外，采用此方法，还可探知该试纸条对于双酚A的检测限为0.1ppb。
应当理解，上述实施例只为说明本发明的技术构思和特点，其目的在于让熟悉此项技术的人能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围以内。
<110> 合肥工业大学
<120> 特异性识别双酚A核酸适配体探针及其试纸条检测应用
<160> 1
<210> 1
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
CCGGTGGGTGGTCAGGTGGGATAGCGTTCCGCGTATGGCCCAGCGCATCACGGGT
1 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55
TCGCA CCA
60
Claims (10)
1.一种特异性识别双酚A核酸适配体探针，其特征在于所述探针包含具有SEQ ID NO. 1所述序列的寡核苷酸链。
2.权利要求1所述核酸适配体探针在制备双酚A检测试剂中的应用。
3.一种双酚A免疫层析金标试纸条，其特征在于包含权利要求1所述的核酸适配体探针。
4.根据权利要求3所述的双酚A免疫层析金标试纸条，其特征在于包括衬板，所述衬板上至少依次粘贴有样品膜、核酸适配体探针-金标结合垫、具有检测线和参考线的包被膜和吸水膜四种粘贴物，其中，所述核酸适配体探针-金标结合垫包含所述核酸适配体探针与金纳米粒子的复合物。
5.根据权利要求4所述的双酚A免疫层析金标试纸条，其特征在于相邻粘贴物之间重叠部分的长度为2 mm。
6.根据权利要求4所述的双酚A免疫层析金标试纸条，其特征在于所述金纳米粒子的粒径为25~40nm。
7.一种双酚A免疫层析金标试纸条的制备方法，其特征在于包括：
取胶体金与权利要求1所述核酸适配体探针于溶液中反应，形成核酸适配体探针-金纳米粒子复合物，而后将所述核酸适配体探针-金纳米粒子复合物施加至结合垫基体上，形成核酸适配体探针-金标结合垫；
并且，分别将双酚A-牛血清蛋白偶联物溶液和能与所述核酸适配体探针互补配对的核苷酸链溶液施加至包被膜基体上形成彼此独立的检测线与参考线，获得包被膜；
以及，至少将样品膜、核酸适配体探针-金标结合垫、包被膜和吸水膜四种粘贴物依次粘接至衬板上，并使相邻粘结物的相应端部相重叠，制得所述试纸条。
8.根据权利要求7所述的双酚A免疫层析金标试纸条的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）选取粒径为25~40nm的胶体金溶液与所述核酸适配体探针的溶液混合，室温下反应1h以上，获核酸适配体探针-金纳米粒子复合物溶液；
（2）将所述核酸适配体探针-金纳米粒子复合物溶液喷涂到结合垫基体上，形成核酸适配体探针-金标结合垫；
（3）具有检测线和参照线的硝酸纤维膜的制备
分别将双酚A-牛血清蛋白偶联物溶液和能与所述核酸适配体探针互补配对的核苷酸链溶液施加至包被膜基体上，形成相互平行的检测线和参照线；
（4）将样品膜、核酸适配体探针-金标结合垫、包被膜和吸水膜四种粘贴物依次粘接至衬板上，并使相邻粘结物的相应端部相重叠，制得所述试纸条。
9.根据权利要求 8所述的双酚A免疫层析金标试纸条的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）选取胶体金溶液与含所述核酸适配体探针、醋酸和TCEP的溶液混合，并在室温下震荡30 min以上，而后依次加入dATP和NaCl，室温反应30min以上，再冷却、离心重悬，获得核酸适配体探针-金纳米粒子复合物溶液；
（2）将所述核酸适配体探针-金纳米粒子复合物溶液喷涂到结合垫基体上，形成核酸适配体探针-金标结合垫；
（3）分别将浓度为1mg/mL的双酚A-牛血清蛋白偶联物溶液和浓度为1mg/mL的能与所述核酸适配体探针互补配对的核苷酸链溶液施加至包被膜基体上，形成相互平行的检测线和参照线；
（4）将样品膜、核酸适配体探针-金标结合垫、包被膜和吸水膜四种粘贴物依次粘接至衬板上，并使相邻粘结物的相应端部相重叠，其中重叠部分的长度在2 mm以上，制得所述试纸条。
10.根据权利要求7-9中任一项所述的双酚A免疫层析金标试纸条的制备方法，其特征在于所述样品膜或吸水膜基体包括玻璃纤维膜，所述结合垫基体或包被膜基体包括硝酸纤维膜。
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| PB01 | Publication | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
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