CN105647930A - 一种基于唾液中的孕酮的核酸适配体及检测用金标试纸条 - Google Patents

一种基于唾液中的孕酮的核酸适配体及检测用金标试纸条 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于唾液中的孕酮的核酸适配体及检测用金标试纸条，其中孕酮的核酸适配体序列5’端经过巯基修饰，互补探针A序列5’端经过生物素修饰，互补探针B序列5’端经过生物素修饰。本发明的检测孕酮的金标试纸条是在塑料衬板上依次搭接样品玻璃纤维膜、核酸探针金标垫、硝酸纤维膜和吸水玻璃纤维膜，并且硝酸纤维膜上划有检测线和参照线，参照线靠近吸水玻璃纤维膜一端；其中核酸探针金标垫上附着表面经核酸适配体修饰的胶体金，检测线由核酸适配体A溶液划成，参照线由核酸适配体B溶液划成。本发明无需其他辅助仪器设备，10～15分钟内即可完成检测，结果准确可靠；灵敏度和特异性高，稳定性好，成本低廉，应用范围广。

Description

一种基于唾液中的孕酮的核酸适配体及检测用金标试纸条
技术领域
本发明涉及激素检测技术领域，具体涉及一种基于唾液中的孕酮的核酸适配体及检测用金标试纸条。
背景技术
孕酮(progesterone)亦称黄体酮，是天然的孕激素，由卵巢和胎盘产生，分子量为314.46，它与雌激素共同维持女性生殖周期及女性生理特征。动态监测血清中的孕酮含量，有助于判定排卵期，了解黄体功能，研究各种类固醇避孕药及抗早孕药的作用机理。此外，近年来研究表明，孕酮的作用已远超出生殖功能的范畴，它不仅可在神经系统中合成分泌，还能影响神经系统的结构和功能。
孕酮与人体的内分泌调整密切相关，孕酮在女性的不同生理周期阶段起着关键的调节作用，孕酮的失调会直接影响人体健康。所以检测人体孕酮浓度是女性健康诊断的重要指标。在现有的孕酮检测方法中一般都是基于尿液或者血液来检测，在取样的过程中给用户带来了不便或痛苦。
由于孕酮对人身心健康的重大影响，医学、生物、环境及食品安全等各领域对该物质进行了深入研究，并建立了多种测定方法。目前孕酮的检测方法大致可以分为两类：色谱法和免疫分析法。色谱法作为检测血清中孕酮的标准方法，在准确性、选择性、重现性、灵敏度等方面具有无可比拟的优势，但同时也存在一些局限性：如仪器昂贵，操作技术要求高，需要复杂的样品前处理等。因此，在临床检测中，色谱法不能满足快速、简便、低成本、高通量的要求。而免疫分析方法具有特异性好、简便、低成本等优点，是目前临床检测孕酮的主要方法。放射免疫分析(radioimmunoassay，RIA)、酶联免疫分析(enzymelinkedimmunoadsorbentassay，ELISA)、荧光免疫分析(fluoroimmunoassay，FIA)、时间分辨荧光免疫分析(timeresolvedfluoroimmunoassay，TRFIA)和化学发光免疫分析(chemiluminescenceimmunoassay，CLIA)用于人血清中孕酮的检测都有报道。RIA使用放射性核素，污染环境，有效期短，测量时间长，这些缺点限制了其进一步的应用。ELISA和FIA的灵敏度较低，不利于血清中低浓度孕酮的测定。TRFIA和CLIA克服了以上方法的缺点，国外已经实现了分析技术完全自动化，但这些进口的诊断试剂往往需要专门配套的仪器，试剂、仪器价格昂贵；此外，其专利保护也限制了这些技术在我国国内的研发。
中国专利申请公布号CN102095866A(公开日2011.06.15)公开了一种孕酮化学发光定量检测试剂盒，包括孕酮检测反应板，反应板包被有孕酮抗体，还包括酶结合物、发光底物、校准品、质控品和浓缩洗涤液。其适用的检测样本仍然为血清或血浆。
传统的各种检测方法，过程复杂，耗时长，成本高，并且不能保证批间的稳定性。
发明内容
为了解决现有检测技术中的上述问题，本发明基于胶体金标记适配体识别孕酮特异性抗原的技术原理，提供了一种孕酮的核酸适配体，其相应的互补探针，以及由其组成的金标试纸条。
本发明提供的一种孕酮的核酸适配体，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，其中序列5’端经过巯基修饰。该核酸适配体能够特异性识别孕酮并与其结合。
SEQIDNO:15’-SH-GGCACGGCAAAGGGGTACAGCCTACCGAACCGTGGCTGTAAGGGTGGTTGTGGTGTG-3’。
本发明提供的一种互补探针A，与上述孕酮的核酸适配体互补配对，其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示，其中序列5’端经过生物素修饰。互补探针A能够与孕酮竞争性结合上述核酸适配体。
SEQIDNO:25’-biotin-CACACCACAACCACC-3’。
本发明提供的一种互补探针B，与上述孕酮的核酸适配体互补配对，其核苷酸序列如SEQIDNO:3所示，其中序列5’端经过生物素修饰。互补探针B能够与上述核酸适配体的另外一部分结合，该部分不同于与孕酮结合的序列段，也就是说，互补探针B与孕酮之间没有竞争关系。
SEQIDNO:35’-biotin-CACACCACAACCACCCTTACAGCCACGGTT-3’。
本发明公开的一种检测孕酮的金标试纸条，是在塑料衬板上依次搭接样品玻璃纤维膜、核酸探针金标垫、硝酸纤维膜和吸水玻璃纤维膜，并且硝酸纤维膜上划有检测线和参照线，参照线靠近吸水玻璃纤维膜一端；其中核酸探针金标垫上附着表面经修饰的胶体金，检测线由核酸适配体A溶液划成，参照线由核酸适配体B溶液划成；
所述胶体金的表面经过活化了巯基的孕酮的核酸适配体修饰；
核酸适配体A溶液包括结合了链霉亲和素的互补探针A；
核酸适配体B溶液包括结合了链霉亲和素的互补探针B。
以上金标试纸条，特别适合于唾液中孕酮的检测。通过适配体检测唾液中的孕酮浓度，利用唾液中微量的孕酮浓度与血液中的孕酮浓度存在显著相关性，从而推算出人体的孕酮水平，为一种非侵入式检测方案，可用于监测女性的生理周期及健康状态。
本发明的金标试纸条，检测线中的互补探针A与孕酮竞争性结合核酸适配体。检测时，将唾液样品浸润或滴加到样品玻璃纤维膜，由于毛细现象，唾液向样品玻璃纤维膜的对向端渗透，渗透的过程中孕酮会与核酸探针金标垫的核酸适配体结合并继续一起移动，核酸适配体一端有连接着胶体金颗粒，核酸适配体与胶体金颗粒的结合体将吸附在检测线和参照线上，最终显色的深浅通过与标准色(梯度浓度标准品在金标试纸条上的显色情况)对比就能得到孕酮的浓度。当唾液中含有高浓度的孕酮时，孕酮与互补探针A竞争性结合核酸适配体，从而检测线颜色就会变弱。阴性对照(空白对照)是有两条线都显色，因为当唾液中不含有孕酮，两条互补探针都会截留孕酮的核酸适配体。
优选地，上述金标试纸条，所述胶体金溶液的制备方法如下：
将醋酸缓冲液和TCEP溶液混合，再向其中加入孕酮的核酸适配体，进行巯基活化反应，反应结束后向其中加入金纳米粒子溶液，震荡；再加入dATP，25℃震荡反应后静置30分钟，再在4℃下静置6小时；然后离心，沉淀用磷酸缓冲液溶解既得。
优选地，上述金标试纸条，所述醋酸缓冲液浓度为0.5M，pH值6.5，用量1μL；所述TCEP溶液的浓度为10mM，用量1.5μL；所述dATP浓度10μM，用量85μL；所述金纳米粒子粒径30～40nm，用量100μL；所述磷酸缓冲液浓度0.01M，pH值7.4，用量520μL。
优选地，上述金标试纸条，所述互补探针A溶液制备方法为：将40～80μL1～10OD值的生物素修饰的互补探针A溶液和200～300μL1～5mg/mL链霉亲和素溶液混合后在25℃下静置1小时，在向其中加入500～600μL0.001～1.000MpH值6.0～8.0的磷酸盐缓冲溶液。
优选地，上述金标试纸条，所述互补探针B溶液的制备方法为：将40～80μL1～10OD值的生物素修饰的互补探针B溶液和200～300μL1～5mg/mL链霉亲和素溶液混合后在25℃下静置1小时，在向其中加入500～600μL0.001～1.000MpH值6.0～8.0的磷酸盐缓冲溶液得到结合了链霉亲和素的生物素修饰的互补探针B溶液。
本发明还提供了以上任一所述的金标试纸条的制备方法，是将样品玻璃纤维膜、核酸探针金标垫、硝酸纤维膜和吸水玻璃纤维膜依次粘贴到塑料衬板上，相邻两粘贴物之间的重叠部分长度为2mm，干燥封装，在4℃～25℃条件下保存。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明将纳米粒子比表面积大这一显著特点应用于传统的金标试纸条的建立和相应的检测方法，建立了可用于现场快速超灵敏检测的基于核酸探针的胶体金标记试纸条和相关的检测方法，通过肉眼直接观察实现目标检测物的快速定性检测和通过检测条带上显色程度的降低对目标检测物进行定量检测。无需其他辅助仪器设备，检测工作可在10～15分钟内完成并得到检测结果。
2、本发明为通用型基于胶体金标记适配体的胶体金标记试纸条，只需将试纸条中适配体进行相应替换，即可实现其他目标物的检测。
4、本发明还具有特异性高，稳定性好，应用范围广，成本低廉，操作使用方法简单易于推广应用。可应用于医院、家庭、以及食品安全与检验检疫的海关、机场等口岸等需要现场快速检测机构。
5、本发明中的检测方法不需要穿刺取血或取尿液，只需要取唾液，取样简单，属于非侵入式检测，检测方法简单，成本低廉。
6、本方法检测的灵敏度和高，监测浓度可以达到pmol级别。
附图说明
图1为基于胶体金标记抗体的金标试纸条的侧面结构示意图，图中序号：1样品玻璃纤维膜、2核酸探针金标垫、3硝酸纤维膜、4检测线、5参照线、6吸水玻璃纤维膜、7塑料衬板；
图2为基于胶体金标记抗体的金标试纸条的正面检测结果判断示意图；
图3为金标试纸条对阴性、弱阳性、阳性和无效样品检测结果图；
图4为含不同浓度孕酮的唾液和尿液样品检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1一种基于孕酮核酸探针的金标试纸条的制备
(1)胶体金溶液的制备
将1μL0.5MpH为5.9的醋酸缓冲液和1.5μL10mM的TCEP(三(2-羧乙基)膦)溶液混合后再向其中加入9μL100μM核酸适配体溶液，混合均匀后在25℃下反应1小时，得到活化了巯基的核酸适配体溶液。
向活化了巯基的核酸适配体溶液中加入100μL30～40nm的金纳米粒子溶液，在25℃下震荡30分钟，得到核酸适配体修饰的胶体金中间溶液1。
向核酸适配体修饰的胶体金中间溶液1中加入85μL10μMdATP溶液，在25℃下震荡反应15分钟后静置30分钟，再在4℃下静置6小时，得到核酸适配体修饰的胶体金中间溶液2。
将核酸适配体修饰的胶体金中间溶液2在10000转/分钟条件下离心8分钟，弃去上清液。用100μL0.01MpH为7.4的磷酸缓冲液溶解离心得到的沉淀物，得到核酸适配体修饰的胶体金溶液。
(2)目标检测物核酸探针金标垫的制备
将核酸适配体修饰的胶体金溶液喷涂到玻璃纤维膜上，得到目标检测物核酸探针金标垫；
(3)具有检测线和参照线的硝酸纤维膜的制备
将50μL10OD的生物素修饰的核酸适配体A溶液和270μL2mg/mL链霉亲和素溶液混合后在25℃下静置1小时，在向其中加入520μL0.01MpH为7.4的磷酸盐缓冲溶液得到结合了链霉亲和素的生物素修饰的核酸适配体A溶液。
将50μL10OD的生物素修饰的核酸适配体B溶液和270μL2mg/mL链霉亲和素溶液混合后在25℃下静置1小时，在向其中加入520μL0.01MpH为7.4的磷酸盐缓冲溶液得到结合了链霉亲和素的生物素修饰的核酸适配体B溶液。
在一块硝酸纤维膜上用浓度为2.5mg/mL的结合了链霉亲和素的生物素修饰的核酸适配体A溶液和浓度为2.5mg/mL的结合了链霉亲和素的生物素修饰的核酸适配体B溶液分别划两条线平行的线，结合了链霉亲和素的生物素修饰的核酸适配体A溶液划线作为检测线(T线)，结合了链霉亲和素的生物素修饰的核酸适配体B溶液划线为参照线(C线)；
(4)金标试纸条的制备
如图1所示，将样品玻璃纤维膜1、目标检测物的核酸探针金标垫2、划有检测线4和参照线5的硝酸纤维膜3和吸水玻璃纤维膜6五种粘贴物分别依次粘贴到塑料衬板7上；相邻粘贴物之间的重叠部分的长度为2mm，得到基于核酸探针的金标试纸条，干燥封装，温度4℃～25℃条件下保存。
使用时，将金标试纸条的样品玻璃纤维膜1端插入到待检测的唾液或尿液等样品中，同时设置一空白对照组，等待10min后取出用肉眼观察检测结果。如果膜上的检测线4和参照线5同时显色表明检测结果是有效的；与空白对照组的检测线相比较，如果检测组的检测线颜色变浅表明待检测样品中含有目标物孕酮特异性抗原，显色越浅表明待检测样品中孕酮特异性抗原浓度越高，为阳性结果；如果只有检测线显色而参照线不显色，表明检测结果无效。
实施例2
参见图2，其中序号1为样品玻璃纤维膜，长度为18mm；序号2为核酸探针金标垫，长度为4mm；序号3为硝酸纤维膜，长度为20mm；序号6为吸水玻璃纤维膜，长度为18mm，序号4为检测线，宽度为1mm，序号5为参照线，宽度为1mm。图中箭头表示液体毛细作用方向。
图2为利用本发明的金标试纸条进行唾液中孕酮检测过程中，检测结果的判断依据示意图。如何通过基于核酸探针的金标试纸条的检测结果对检测样品中目标物的含量进行判断，是检测方法的重要组成部分。具体检测结果判断依据如下所示：
图2中左一为基于核酸探针的金标试纸条的阴性检测结果示意图，
图2中左二为基于核酸探针的金标试纸条的弱阳性检测结果示意图，
图2中右一为基于核酸探针的金标试纸条的阳性检测结果示意图，
图2中右二为无效的基于核酸探针的金标试纸条检测结果示意图。
实物结果照片参见图3，从左到右依次对应图2中的阴性、弱阳性、阳性和无效。多次重复实验的结果一致，表明本发明的试纸条检测结果准确可靠。
分别取含有0nM、0.01nM、0.1nM、1nM和5nM的唾液样品和尿液样品，采用本发明的金标试纸条进行检测，检测结果如图4所示，左侧为唾液样品检测结果图，右侧为尿液样品检测结果图，显示两种样品检测结果一样准确。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
SEQUENCELISTING
<110>武汉慧禹信息科技有限公司
<120>一种基于唾液中的孕酮的核酸适配体及检测用金标试纸条
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Claims (9)

1.一种孕酮的核酸适配体，其特征在于，核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，其中序列5’端经过巯基修饰。
2.一种互补探针A，与权利要求1所述的孕酮的核酸适配体互补配对，其特征在于，核苷酸序列如SEQIDNO:2所示，其中序列5’端经过生物素修饰。
3.一种互补探针B，与权利要求1所述的孕酮的核酸适配体互补配对，其特征在于，核苷酸序列如SEQIDNO:3所示，其中序列5’端经过生物素修饰。
4.一种检测孕酮的金标试纸条，其特征在于，在塑料衬板上依次搭接样品玻璃纤维膜、核酸探针金标垫、硝酸纤维膜和吸水玻璃纤维膜，并且硝酸纤维膜上划有检测线和参照线，参照线靠近吸水玻璃纤维膜一端；其中核酸探针金标垫上附着表面经修饰的胶体金，检测线由核酸适配体A溶液划成，参照线由核酸适配体B溶液划成；
所述胶体金的表面经过活化了巯基的权利要求1所述的孕酮的核酸适配体修饰；
核酸适配体A溶液包括结合了链霉亲和素的权利要求2所述的互补探针A；
核酸适配体B溶液包括结合了链霉亲和素的权利要求3所述的互补探针B。
5.根据权利要求4所述的金标试纸条，其特征在于，所述胶体金溶液的制备方法如下：
将醋酸缓冲液和TCEP溶液混合，再向其中加入孕酮的核酸适配体，进行巯基活化反应，反应结束后向其中加入金纳米粒子溶液，震荡；再加入dATP，25℃震荡反应后静置30分钟，再在4℃下静置6小时；然后离心，沉淀用磷酸缓冲液溶解既得。
6.根据权利要求5所述的金标试纸条，其特征在于，所述醋酸缓冲液浓度为0.5M，pH值6.5，用量1μL；所述TCEP溶液的浓度为10mM，用量1.5μL；所述dATP浓度10μM，用量85μL；所述金纳米粒子粒径30～40nm，用量100μL；所述磷酸缓冲液浓度0.01M，pH值7.4，用量520μL。
7.根据权利要求4所述的金标试纸条，其特征在于，所述互补探针A溶液制备方法为：将40～80μL1～10OD值的生物素修饰的互补探针A溶液和200～300μL1～5mg/mL链霉亲和素溶液混合后在25℃下静置1小时，在向其中加入500～600μL0.001～1.000MpH值6.0～8.0的磷酸盐缓冲溶液。
8.根据权利要求4所述的金标试纸条，其特征在于，所述互补探针B溶液制备方法为：将40～80μL1～10OD值的生物素修饰的互补探针B溶液和200～300μL1～5mg/mL链霉亲和素溶液混合后在25℃下静置1小时，在向其中加入500～600μL0.001～1.000MpH值6.0～8.0的磷酸盐缓冲溶液得到结合了链霉亲和素的生物素修饰的互补探针B溶液。
9.权利要求4～8任一所述的金标试纸条的制备方法，其特征在于，将样品玻璃纤维膜、核酸探针金标垫、硝酸纤维膜和吸水玻璃纤维膜依次粘贴到塑料衬板上，相邻两粘贴物之间的重叠部分长度为2mm，干燥封装，在4℃～25℃条件下保存。
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