CN104407113B - 食品中致病菌检测的微型化磁通门生物传感器 - Google Patents
食品中致病菌检测的微型化磁通门生物传感器 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种食品中致病菌检测的微型化磁通门生物传感器。该生物传感器由位于玻璃基片上的微型化磁通门传感器芯片、致病菌捕获芯片、赫姆霍兹线圈、信号采集系统组成。微型化磁通门传感器芯片是在玻璃基片上采用MEMS技术制备的,致病菌捕获芯片由玻璃基片上的Au膜、生物敏感膜、致病菌单克隆抗体构成。致病菌单克隆抗体捕获被检测的带有磁性标签的致病菌,采用磁分离技术对致病菌进行富集和分离。利用微型化磁通门传感器检测磁性标签,实现对致病菌的检测。
Description
技术领域
本发明涉及生物传感器,具体地,涉及一种食品中致病菌检测的微型化磁通门生物传感器,属于食品中致病菌检测领域。
背景技术
微生物的快速检测对临床检验、食品安全以及环境监测都是至关重要的。据WHO估计,全世界每年发生食源性疾病数十亿人,每年约有二百万儿童死于腹泻.其中66%以上是由致病菌所致。食品中致病菌一般包括沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、空肠弯曲菌、肠出血性大肠杆菌O157:H7、副溶血性弧菌、霍乱弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌等,其中以沙门氏菌、大肠杆菌0157:H7、李斯特氏菌、副溶血弧菌等引起的食源性疾病尤为突出。因此,建立对食品中不同致病菌的快速、准确、特异性强、简便的检测方法,对保障食品安全十分必要。
目前食品卫生中常规的微生物检测方法是增菌培养、平板计数法,由于其检测周期长、工作量大、容易造成误差、漏检率高、程序复杂等缺点已远远不能满足现代检测要求。随着现代科学技术的不断发展和分子细菌学研究的开展,特别是免疫学、生物化学、分子生物学的不断发展,出现了一些较为先进的、快速的检测方法,如聚合酶链反应(PCR)、多重PCR、荧光PCR、免疫学检测、质谱测定、DNA探针法等检测方法,但是大都普遍存在仪器成本昂贵、操作复杂等缺点,不易在实际应用中普及和现场快速检测和诊断。
生物传感器是近几十年来发展起来的一种新的传感器技术,它是利用生物活性材料(酶、蛋白质、DNA、抗体、抗原、生物膜等)与物理化学换能器(电化学、光学、机械、热、电、磁等)有机结合构成的一种生物信息检测分析工具。生物传感器由于其独特的优势,如能在浑浊溶液中操作、选择性好、灵敏度高等。其所测的信号通常是电信号的变化,可以直接测量,便于仪器自动化、小型化和智能化。然而传统的生物传感器的分析操作步骤太多、分析周期长、价格昂贵、体积大、昂贵的光学检测设备及需要训练有素的专业人员才能完成等,限制了生物传感器的大规模应用。近年来,由于免疫磁珠技术的不断进展和微传感器技术的发展,科学家们提出了将微纳磁传感器并结合磁性标签研制用于生物学、医学、遗传学、毒物学等生物信息探测的新型生物传感器。利用磁传感器并结合磁性标签用于探测生物分子的理念最早是由美国海军实验室的Baselt等[Baselt D.R.,Lee G.U.,Natesan M.,Metzger S.W.,Sheehan P.E.,Colton R.,A biosensor based on magnetoresistance technology,Biosens.Bioelectr.17(1998)731.]于1998年提出的,由此开启了磁生物传感器研究的热潮。
经对现有技术的文献检索发现,Dieckhoff等(Diechhoff J.,Schilling M.,LudwigF.)在《Appl.Phys.Lett.》(美国应用物理快报)《Vol.99,pp.112501,2011》提出使用磁通门传感器来探测磁性纳米粒子,证明了磁通门传感器在生物医学检测领域的可行性,但该研究工作只是得到了磁通门传感器对Fe3O4磁性纳米粒子的响应,没有实现对生物标志物的检测。
随着微机电系统(MEMS)技术的发展,利用MEMS技术制备的微流控芯片已应用于生物与医学检测领域,而MEMS技术同样可用来制造微型化、集成化的磁通门传感器。将生物信息的固定与微型化磁通门传感器相结合构建新型食品中致病菌检测系统,利用磁性标签对食品中致病菌进行检测,具有重要的研究意义和临床价值。通过文献和专利检索,没有发现关于将微型化磁通门传感器用于食品中致病菌检测的相关研究成果。
中国专利申请号为201210397978.7,公开号102937649A,该专利公开了一种血清肿瘤标志物检测的微型化磁通门生物传感器,该生物传感器由位于玻璃基片上的微型化磁通门传感器、生物芯片、信号采集系统组成。生物芯片由玻璃基片上的Au膜、生物敏感膜、磁性标签构成。Au膜为溅射的Cr/Au薄膜,生物敏感膜为纳米级厚度的自组装膜,生物敏感膜可以连接各种单克隆抗体。但是该发明只是针对血清肿瘤标志物进行检测,无法实现对致病菌的检测。
发明内容
针对现有技术中的缺陷,本发明的目的是提供一种食品中致病菌检测的微型化磁通门生物传感器。该生物传感器与致病菌捕获芯片配套使用,与配套的检测电路一起可实现整个系统的小型化,对致病菌的检测,具有检测芯片面积大,检测灵敏度高,不需要对生物样本进行增菌培养和PCR扩增,可以直接检测液体食品中的致病菌,其检测灵敏度为10-100CFU/ml。
为了实现上述目的,本发明所述食品中致病菌检测的微型化磁通门生物传感器包括微型化磁通门传感器芯片、致病菌捕获芯片、施加轴向磁场的赫姆霍兹线圈、以及与微型化磁通门传感器芯片连接的信号采集系统,其中:所述致病菌捕获芯片位于微型化磁通门传感器芯片的敏感轴上,所述致病菌捕获芯片由玻璃基片上的Au膜、Au膜上修饰了一层生物敏感膜、生物敏感膜固定了致病菌单克隆抗体,致病菌单克隆抗体捕获带有磁性标签的致病菌,致病菌与生物素修饰的致病菌单克隆抗体结合,致病菌通过生物素与亲和素作用与磁性标签相连,磁性标签为链酶亲和素修饰的磁性纳米粒子或由其构成的磁珠,采用磁分离技术对带有磁性标签的致病菌进行富集和分离。
优选的,所述施加轴向磁场的赫姆霍兹线圈,该赫姆霍兹线圈为一绕制在PVC上的赫姆霍兹线圈,通过外接的直流电源产生轴向均匀磁场,以满足对微型化磁通门传感器芯片的磁芯材料的均匀磁化;微型化磁通门传感器芯片的敏感轴放置在赫姆霍兹线圈的轴向位置上,致病菌捕获芯片与微型化磁通门传感器芯片的敏感轴位于同一平面且紧密相连,以保证磁性标签产生的磁场作用到微型化磁通门传感器芯片的磁芯材料上。
所述的信号采集系统由信号发生器、功率放大器、锁相放大器、滤波器、显示器构成,信号发生器、功率放大器能够实现在激励线圈中施加一使磁芯处于饱和状态的交流电流,滤波器对微型化磁通门传感器芯片中的接收线圈的输出信号进行滤波,锁相放大器对滤波后的信号进行锁相放大后得到二次谐波信号并显示。二次谐波信号大小与外部磁场成正比,因此可测量磁性标签产生的信号大小与检测致病菌之间的关系。
磁分离技术是以纳米或微粒级的磁性颗粒为载体,利用结合于磁性颗粒表面修饰的蛋白质所提供的蛋白-蛋白之间的特异亲和特性,在施加磁场的装置控制下,通过免疫亲和吸附、清洗、解吸操作,从复杂的生物样本中分离得到目标生物分子,具有磁性分离简单方便、亲和吸附高特异性及高敏感性等众多优点。本发明采用磁分离技术利用磁性标签对致病菌进行富集和分离,具体操作过程参见实施例。
与现有技术相比,本发明具有如下的有益效果:
(1)本发明采用微型化磁通门传感器检测致病菌,芯片采用MEMS技术制作,具有较大的传感器芯片面积,传感器具有高的磁场检测灵敏度;
(2)致病菌捕获芯片采用MEMS技术设计制作,致病菌捕获芯片表面上的Au膜修饰了生物敏感膜,生物敏感膜固定了致病菌单克隆抗体,致病菌单克隆抗体可以捕获致病菌;采用磁分离技术对致病菌进行富集和分离,不需要对生物样品进行增菌培养和PCR扩增,致病菌与生物素修饰的致病菌单克隆抗体结合,致病菌通过生物素与亲和素作用与磁性标签相连,磁性标签为链酶亲和素修饰的磁性纳米粒子或由其构成的磁珠。采用磁分离技术将带有磁性标签的致病菌从生物样本中分离出来,大大缩短了检测时间;本发明中的致病菌捕获芯片结合对致病菌的磁分离技术是中国专利申请号为201210397978.7的专利技术所不能实现的效果;
(3)生物样品本身不带磁性,能提供一个很低噪声的磁测量环境,相对于荧光分子、放射性同位元素、酶等标签,磁性标签非常稳定;
(4)本发明中的食品中致病菌检测系统具有检测速度快、可重复使用、无特殊环境和存放要求、体积小、灵敏度高等优点,缺点是不能对固体样品中的致病菌直接进行检测;本发明的微型化磁通门传感器不需要依赖于操作人员的生物学医学经验以及庞杂、昂贵的荧光检测设备,就可实现特定的生化分析或致病菌检测,这将有利于实现便携式、成本低廉、快速诊断的致病菌检测系统,必将产生巨大的经济效益和社会价值。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述,本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显:
图1为本发明的结构示意图。
图2为沿图1所示A-A剖面图。
图3为沿图1所示B-B剖面图。
图4为本发明的致病菌捕获芯片原理图。
图中:1为玻璃基片,2为激励线圈,3为接收线圈,4为磁芯,5为引脚,6为聚酰亚胺绝缘材料,7为激励线圈的底层线圈,8为激励线圈的连接导体,9为激励线圈的顶层线圈,10为接收线圈的底层线圈,11为接收线圈的连接导体,12为接收线圈的顶层线圈,13为玻璃基片,14为Au膜,15生物敏感膜,16为单克隆抗体,17为致病菌,18为单克隆抗体或多克隆抗体,19为生物素,20为链酶亲和素,21为磁珠。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明,但不以任何形式限制本发明。应当指出的是,对本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
本实施例提供一种食品中致病菌检测的微型化磁通门生物传感器。该生物传感器包括微型化磁通门传感器芯片、致病菌捕获芯片、施加轴向磁场的赫姆霍兹线圈、以及与微型化磁通门传感器芯片连接的信号采集系统。其中:所述致病菌捕获芯片位于微型化磁通门传感器芯片的敏感轴上,由位于玻璃基片上的Au膜、Au膜上的生物敏感膜、生物敏感膜上的致病菌单克隆抗体组成,致病菌单克隆抗体可以捕获被检测的带有磁性标签的致病菌,致病菌能够结合生物素修饰的致病菌单克隆抗体或多克隆抗体,生物素修饰的致病菌单克隆抗体或多克隆抗体能够与磁性标签相结合,磁性标签为链霉亲和素修饰的磁性纳米粒子或由磁性纳米粒子构成的磁珠,采用磁分离技术对致病菌进行富集和分离。
所述微型化磁通门传感器芯片位于玻璃基片上,可以采用现有技术实现,比如专利申请号为200910046099.8的中国专利中记载的传感器,当然也可以采用其他能实现本发明功能的微型化磁通门传感器。以下申请号为200910046099.8记载的传感器结构来说明本发明的实施例。
如图1-3所示,本实施例中,微型化磁通门传感器包括玻璃基片1、激励线圈2、接收线圈3、磁芯4、引脚5、聚酰亚胺绝缘材料6,闭合的矩形磁芯4上对称绕制两组相连的三维螺线管激励线圈2,与激励线圈2垂直绕制一组三维螺线管接收线圈3;激励线圈2位于玻璃基片1上,由底层线圈7、顶层线圈9通过连接导体8连接形成,激励线圈2的两端连接引脚;接收线圈3位于玻璃基片1上,由底层线圈10、顶层线圈12通过连接导体11连接形成,接收线圈3的两端连接引脚5,激励线圈2和接收线圈3均通过聚酰亚胺绝缘材料6与磁芯4绝缘隔离。磁芯4、激励线圈2和接收线圈3均由聚酰亚胺绝缘、支撑并完全包覆固定为一个整体,与空气隔离,传感器表面仅露出引脚5。磁芯4可以为NiFe薄膜或非晶软磁带材或纳米晶软磁带材,并采用MEMS工艺进行加工。
工作时,在激励线圈2中通一交流电流使磁芯4处于饱和状态,没有外部磁场时,接收线圈3没有任何信号输出;当有外部磁场存在时,接收线圈3会有输出信号,信号为偶次谐波,经滤波锁相放大后可得到二次谐波信号。二次谐波信号大小与外部磁场成正比,因此可测量外部磁场大小和方向。
如图3所示,本实施例中,致病菌捕获芯片由玻璃基片13上的Au膜14、位于Au膜14上的生物敏感膜15、致病菌单克隆抗体16组成。致病菌单克隆抗体16可以捕获带有磁性标签的致病菌17。致病菌17与生物素19修饰的致病菌单克隆抗体18结合,通过生物素19与亲和素20作用与磁性标签相连,磁性标签为链酶亲和素20修饰的磁性纳米粒子或由其构成的磁珠21,采用磁分离技术对带有磁性标签的致病菌进行富集和分离。
本实施例中,Au膜14的上的生物敏感膜15为一层纳米级厚度的自组装膜,然后经EDC+NHS活化形成的,自组装膜为巯基类化合物如巯基丙酸、11-巯基十一烷酸等,生物敏感膜15可以连接各种致病菌单克隆抗体16,致病菌单克隆抗体16可以捕获被检测的致病菌17。
本实施例中,磁性标签为链酶亲和素20修饰的磁性纳米粒子或由磁性纳米粒子构成的磁珠21,可以和经生物素19修饰的致病菌单克隆抗体或多克隆抗体18相结合,生物素19修饰的致病菌单克隆抗体或多克隆抗体18可以和被检测的致病菌17结合。
本实施例中,施加轴向磁场的赫姆霍兹线圈为一绕制在PVC上的小型化赫姆霍兹线圈,线圈直径为25cm及线圈间距为10cm,通过外接的直流电源可以产生0-20Oe的轴向均匀磁场;微型化磁通门传感器芯片的敏感轴放置在赫姆霍兹线圈的轴向位置上,致病菌捕获芯片与微型化磁通门传感器芯片的敏感轴位于同一平面且紧密靠近。
本实施例中,信号采集系统包含信号发生器、功率放大器、滤波器、锁相放大器、显示器等,信号发生器、功率放大器能够实现在激励线圈中施加一使磁芯处于饱和状态的交流电流,滤波器对微型化磁通门传感器芯片中的接收线圈的输出信号进行滤波,锁相放大器对滤波后的信号进行锁相放大后得到二次谐波信号并显示。二次谐波信号大小与外部磁场成正比,因此可测量磁性标签产生的信号大小与检测致病菌之间的关系。
本实施例上述的生物传感器制作方法如下:
(1)制作微型化磁通门传感器芯片:详细方法可以采用现有技术实现,比如已有专利号为200910046101.1的发明专利。
(2)致病菌捕获芯片的制作方法如下:
●在玻璃基片上溅射Cr/Au薄膜,甩光刻胶、烘干、曝光、显影、刻蚀Cr/Au膜、去胶,使Au膜暴露在外面。
●Au膜上生物敏感膜的制备。生物敏感膜为一层纳米级厚度的自组装膜,自组装膜为11巯基十一烷酸,然后经EDC+NHS活化形成的。
●致病菌单克隆抗体的固定。将适当浓度的致病菌单克隆抗体溶液滴入Au膜上的生物敏感膜上,在蒸汽浴37℃下培育40分钟;然后用PBS溶液清洗、BSA溶液封闭,最后用PBS溶液清洗、室温干燥。
●磁性标签与生物素化的致病菌抗体连接。将适当浓度的生物素化的致病菌抗体与适当浓度的磁性标签(亲和素的磁珠)混合,37℃培育40分钟;然后进行磁分离,去除多余的抗体,称为带有致病菌抗体的磁性标签。
●致病菌捕获。将致病菌溶液1ml中加入带有致病菌抗体的磁性标签,混合摇匀,37℃培育40分钟,然后进行磁分离,去除大量的液体,只保留30μl带有致病菌的磁性标签。
●致病菌点样。将分离的带有致病菌的磁性标签滴入固定致病菌抗体的Au膜上,室温固定20min,用PBS清洗,室温干燥。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是,本发明并不局限于上述特定实施方式,本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改,这并不影响本发明的实质内容。
Claims (4)
1.一种食品中致病菌检测的微型化磁通门生物传感器,其特征在于包括位于玻璃基片上的微型化磁通门传感器芯片、致病菌捕获芯片、施加轴向磁场的赫姆霍兹线圈以及与微型化磁通门传感器芯片连接的信号采集系统;其中:所述致病菌捕获芯片位于微型化磁通门传感器芯片的敏感轴上,由位于玻璃基片上的Au膜、Au膜上的生物敏感膜、生物敏感膜上的致病菌单克隆抗体组成,致病菌单克隆抗体可以捕获被检测的带有磁性标签的致病菌,致病菌能够结合生物素修饰的致病菌单克隆抗体或多克隆抗体,生物素修饰的致病菌单克隆抗体或多克隆抗体能够与磁性标签相结合,磁性标签为链霉亲和素修饰的磁性纳米粒子或由磁性纳米粒子构成的磁珠,采用磁分离技术对致病菌进行富集和分离。
2.根据权利要求1所述的食品中致病菌检测的微型化磁通门生物传感器,其特征在于,所述的施加轴向磁场的赫姆霍兹线圈为一绕制在PVC上的小型化赫姆霍兹线圈,通过外接的直流电源产生轴向均匀磁场;微型化磁通门传感器芯片的敏感轴放置在赫姆霍兹线圈的轴向位置上,致病菌捕获芯片与微型化磁通门传感器芯片的敏感轴位于同一平面且紧密靠近。
3.根据权利要求1所述的食品中致病菌检测的微型化磁通门传感器,其特征在于,所述微型化磁通门传感器芯片,其磁芯材料为NiFe薄膜或非晶软磁带材或纳米晶软磁带材,并采用MEMS工艺制作微型化磁通门传感器芯片。
4.根据权利要求1所述的食品中致病菌检测的微型化磁通门传感器,其特征在于,所述的信号采集系统由信号发生器、功率放大器、锁相放大器、滤波器、显示器构成,信号发生器、功率放大器能够实现在微型化磁通门传感器芯片中的激励线圈中施加一使磁芯处于饱和状态的交流电流,滤波器对微型化磁通门传感器芯片中的接收线圈的输出信号进行滤波,锁相放大器对滤波后的信号进行锁相放大后得到二次谐波信号并显示,二次谐波信号大小与外部磁场成正比,因此测量磁性标签产生的信号大小与检测致病菌之间的关系。
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