ES2713479T3

ES2713479T3 - Células y procedimiento para la producción de ramnolípidos

Info

Publication number: ES2713479T3
Application number: ES11734101T
Authority: ES
Inventors: Steffen Schaffer; Mirja Wessel; Anja Thiessenhusen; Nadine Stein
Original assignee: Evonik Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2010-07-28
Filing date: 2011-07-20
Publication date: 2019-05-22
Anticipated expiration: 2031-07-20
Also published as: US9005928B2; EP3418388B1; US20130130319A1; ES2837485T3; US20150247151A1; HUE053232T2; EP2598646A1; JP6461078B2; RU2619877C2; CN103038357A; CA2806430A1; US9580720B2; JP2017060523A; DE102010032484A1; CN108587995A; EP3418388A1; BR112013002124A2; JP2013537411A; BR112013002124B1; HUE042573T2

Abstract

Célula, seleccionadas a partir de microorganismos, que puede formar al menos un ramnolípido de la Fórmula general (I),**Fórmula** siendo m = 2, 1 o 0, en especial 1 o 0, n = 1 o 0, en especial 1, R1 y R2 = independientemente entre sí, restos orgánicos iguales o diferentes independientemente entre sí, con 2 a 24 átomos de carbono, en especial resto alquilo, en caso dado ramificado, en caso dado sustituido, en especial hidroxisustituido, en caso dado insaturado, en especial, en caso dado, mono-, di- o triinsaturado, caracterizada por que se modificó mediante técnica génica de modo que, en comparación con su tipo salvaje, presenta una actividad acrecentada de al menos una de las enzimas E1, E2 y E3, pudiendo catalizar la enzima E1 la reacción de 3-hidroxialcanoil-ACP a través de ácido-3-hidroxialcanoil-3-hidroxialcanoico-ACP para dar ácido hidroxialcanoil-3-hidroxialcanoico, la enzima E2 es una ramnosiltransferasa I, y puede catalizar la reacción de dTDPramnosa y 3-hidroxialcanoato de 3-hidroxialcanoilo para dar 3-hidroxialcanoato de α-L-ramnosilpiranosil-3- hidroxialcanoilo, y la enzima E3 es una ramnosiltransferasa II, y puede catalizar la reacción de dTPD-ramnosa y 3- hidroxialcanoato de α-L-ramnopiranosil-3-hidroxialcanoilo para dar 3-hidroxialcanoato de α-L-ramnopiranosil-(1-2)-α- L-ramnopiranosil-3-hidroxialcanoilo, y presenta, en comparación con su tipo salvaje, una actividad acrecentada, como se especifica a continuación respectivamente, de al menos una de las enzimas seleccionadas a partir del grupo constituido por una enzima E4, una dTTP: α-D-glucosa-1-fosfato timidililtransferasa, EC 2.7.7.24, en especial una con la secuencia de polipéptidos Seq ID Nr. 10 o con la secuencia de polipéptidos en la que hasta un 25 % de los restos aminoácido se han modificado frente a la secuencia de referencia Seq ID Nr. 10 mediante deleción, inserción, sustitución, o una combinación de los mismos, y que posee al menos un 10 % de la actividad enzimática de la enzima con la secuencia de referencia Seq ID Nr. 10, una enzima E5, una dTTP-glucosa-4,6-hidroliasa, EC 4.2.1.46, en especial una con secuencia de polipéptidos Seq ID Nr. 12 o con una secuencia de polipéptidos en la que hasta un 25 % de los restos aminoácido se han modificado respecto a la secuencia de referencia Seq ID Nr. 12 mediante deleción, inserción, sustitución, o una combinación de las mismas, y que aún posee al menos un 10 % de la actividad enzimática de la enzima con la secuencia de referencia Seq ID Nr. 12, una enzima E6, una dTDP-4-dehidrorramnosa-3,5-epimerasa, EC 5.1.3.13, en especial una con secuencia de polipéptidos Seq ID Nr. 14 o con una secuencia de polipéptidos en la que hasta un 25 % de los restos aminoácido se han modificado respecto a la secuencia de referencia Seq ID Nr. 14 mediante deleción, inserción, sustitución, o una combinación de las mismas, y que aún posee al menos un 10 % de la actividad enzimática de la enzima con la secuencia de referencia Seq ID Nr. 14, y una enzima E7, una dTDP-4-dehidrorramnosa-reductasa, EC 1.1.1.133, en especial una con secuencia de polipéptidos Seq ID Nr. 16 o con una secuencia de polipéptidos en la que hasta un 25 % de los restos aminoácido se han modificado respecto a la secuencia de referencia Seq ID Nr. 16 mediante deleción, inserción, sustitución o una combinación de las mismas, y que aún presenta al menos un 10 % de la actividad enzimática de la enzima con la secuencia de referencia Seq ID Nr. 16.

Description

DESCRIPCION

Celulas y procedimiento para la produccion de ramnolipidos

Campo de la invencion

Son objeto de la invencion celulas y procedimientos para la produccion de ramnolipidos.

Estado de la tecnica

Actualmente se producen agentes tensioactivos esencialmente en base a materias primas petroquimicas. La utilizacion de agentes tensioactivos a base de materias primas regenerativas es una alternativa correspondiente debido a la escasez previsible de materias primas petroquimicas y a la demanda creciente de productos que se basan en materias primas regenerativas, o bien son biodegradables.

Los ramnolipidos estan constituidos por uno (monoramnolipidos) o dos restos ramnosa (dirramnolipidos), y uno o dos restos acido 3-hidroxigraso (vease Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology, 2010, paginas 3037-51). Estos poseen propiedades tensioactivas, que se requieren para el empleo como agente tensioactivo en las mas diversas aplicaciones (vease Leitermann etal., 2009).

Actualmente se producen estos lipidos con productos aislados de tipo salvaje de diversas bacterias patogenas humanas y animales, en especial representantes de las especies Pseudomonas y Burkholderia (vease Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology, 2010, paginas 3037-51). El hecho de que estos organismos de produccion pueden desencadenar enfermedades reduce considerablemente la aceptacion del consumidor para ramnolipidos producidos convencionalmente. Ademas, los elevados requisitos de seguridad debidos a un volumen de inversion incrementado, y en caso dado pasos de elaboracion adicionales, influyen tambien los costes de produccion.

Aunque con ayuda de estos organismos de produccion se pueden obtener en parte titulos de producto elevados, asi como rendimientos espacio-tiempo, o bien de carbono, esto presupone el empleo de aceites vegetales como sustrato unico o cosustrato (vease Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology, 2010, paginas 3037-51). No obstante, en comparacion con otras fuentes de carbono, como por ejemplo glucosa, sacarosa, o polisacaridos, como por ejemlo almidon, celulosa y hemicelulosa, glicerina, CO, CO2 o CH4, los aceites vegetales son materias primas relativamente caras. Ademas, debido a su caracter tensioactivo, los ramnolipidos se distinguen por que tienden a un fuerte espumado en procesos de fermentacion. Este es el caso en especial si se emplean sustratos lipofilos. Esta problematica se reduce claramente en el caso de empleo de sustratos hidrosolubles, como por ejemplo glucosa, sacarosa, polisacaridos (almidon, celulosa, hemicelulosa) o glicerina.

Finalmente, se puede influir sobre las propiedades de los ramnolipidos producidos a partir de los productos aislados de tipo salvaje solo de manera limitada. Hasta la fecha, esto tiene lugar exclusivamente a traves de la optimizacion del control de proceso (valor de pH, abastecimiento de oxigeno, composicion del medio, estrategias de alimentacion, abastecimiento de nitrogeno, temperatura, seleccion de sustrato, etc.). No obstante, seria deseable una influencia muy selectiva de determinadas propiedades del producto, como por ejemplo la proporcion de diferentes especies de ramnolipidos (numero de restos ramnosa y acido 3-hidroxigraso), o longitud de cadena y grado de saturacion de los restos acido 3-hidroxigraso, para poder modular las propiedades de producto relevantes para la aplicacion.

Si se emplean en gran medida como agentes tensioactivos en aplicaciones domesticas, de limpieza, cosmeticas, de procesado de productos alimenticios, farmaceuticas, fitosanitarias y otras, los ramnolipidos competiran con los agentes tensioactivos empleados actualmente. Estos son productos quimicos de gran volumen, que se pueden producir con costes muy reducidos, sin riesgos sanitarios evidentes para los consumidores y con especificaciones de producto definidas muy claramente y modulables. Por lo tanto, tambien los ramnolipidos se pueden producir con costes lo mas reducidos posible sin riesgos sanitarios para los consumidores, y con propiedades lo mas definidas posible.

Si bien los ramnolipidos se han producido ya en organismos GRAS (generally regarded as save) basados en fuentes de carbono convenientes, como por ejemplo glucosa o glicerina, en este caso se trata exclusivamente de monoramnolipidos (Ochsner et al. Appl. Environ. Microbiol. 1995. 61(9):3503-3506).

Por otra parte, Cha et al. Describen en Bioresour Technol. 2008. 99(7):2192-9 la produccion de monoramnolipidos a partir de aceite de soja en P. putida mediante introduccion de los genes rhlA y rhlB de Pseudomonas aeruginosa. El documento WO2004050882 da a conocer un procedimiento para la fitorremediacion de un entorno, que esta contaminado con al menos un metal pesado o hidrocarburos oleaginosos, comprendiendo el procedimiento: (a) puesta a disposicion de una planta transgenica, exprimiendo la planta al menos un acido nucleico heterologo que codifica una enzima con actividad de ramnosiltransferasa, (b) siembra o localizacion de plantas transgenicas en el entorno.

El documento US2007020624 se refiere a acidos nucleicos y polipeptidos aislados, que son derivados de Pseudomonas aeruginosa, que son utiles para el diagnostico, la profilaxis y el tratamiento de estado patologicos, asi como materiales y procedimientos para el diagnostico, la prevencion y la mitigacion de estados patologicos que resultan de infecciones bacterianas.

El documento WO2004083385 da a conocer un procedimiento para la identificacion de un modulador de la autoinduccion-senalizacion en bacterias, comprendiendo el procedimiento: puesta a disposicion de una celula que comprende un gen controlado por autoinduccion, respondiendo la celula a una molecula senal de autoinduccion, de modo que se genera una senal detectable: puesta en contacto de la celula con una molecula senal de autoinduccion en presencia y ausencia de un compuesto de ensayo; y deteccion de una modificacion en la senal detectable, para identificar de este modo el compuesto de ensayo como un modulador de la senalizacion de autoinduccion en bacterias.

Ochsner et al. "Production of Pseudomonas aeruginosa rhamnolipid biosurfactants in heterologous hosts", Applied and Environmental Micorbiology, vol. 61, n° 9, pagina 3503, da a conocer la cepa Pseudomonas aeruginosa PG201 con actividad de ramnosiltransferasa elevada.

El informe de proyecto final Bio-Engineering High Performance Microbial Strains for MEOR by Directed Protein Evolution Technology", 2008, Oil & Natural Gas Technology Projects, da a conocer cepas de Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens y E. coli que contienen los genes de ramnosiltransferasa rhlAB y presenta tasas de produccion de ramnolipidos elevadas.

"Pseudomonas aeruginosa rhamnosyl transferase genes and regulatory protein gene, complete cds.", EMBL, Database accession no. L28170, da a conocer las secuencias de acidos nucleicos y aminoacidos de proteinas de Pseudomonas aeruginosa indicadas como ramnosiltransferasas.

Por lo tanto, existe una demanda creciente de la produccion economica, y segura desde el punto de vista sanitario, de mono- y diramnolipidos con propiedades definidas, asi como modulables. Esta modulacion se puede efectuar, a modo de ejemplo, mediante una puesta a disposicion equilibrada de las actividades enzimaticas individuales, que reduce la concentracion de monoramnolipidos. No obstante, esta modulacion se puede efectuar, a modo de ejemplo, mediante el empleo de enzimas con determinadas propiedades, por ejemplo respecto a especificidad de sustrato y, por consiguiente, eventualmente la longitud de cadena de acidos hidroxigrasos incorporados en los ramnolipidos. Por lo tanto, la presente invencion tomaba como base la tarea de poner a disposicion una posibilidad de producir ramnolipidos con huespedes de produccion seguros a partir de fuentes de carbono convenientemente accesibles. Descripcion de la invencion

Sorprendentemente se descubrio que las celulas descritas a continuacion, asi como los procedimientos en los que se emplean estas celulas, contribuyen a solucionar la tarea planteada por la invencion.

Por lo tanto, son objeto de la presente invencion celulas que pueden formar ramnolipidos y, en comparacion con su tipo salvaje, presentan al menos una actividad acrecentada de un producto genico de homologos de los productos genicos rhlA, rhlB yrhlC, asi como otros, como se describe en la reivindicacion 1. Otro objeto de la invencion es un procedimiento para la produccion de ramnolipidos bajo empleo de las celulas citadas anteriormente como biocatalizador y fuentes de carbono simples.

Una ventaja de la presente invencion consiste en que se pueden emplear organismos que no son patogenos y son faciles de cultivar. Otra ventaja consiste en que no es necesario el empleo de aceites como sustrato unico o cosustrato. Tambien es una ventaja que se puedan producir ramnolipidos con propiedades definidas, asi como modulables, con ayuda de la invencion. Otra ventaja de la presente invencion consiste en que se pueden sintetizar diramnolipidos. Una ventaja ulterior consiste en que se pueden producir ramnolipidos con rendimientos espaciotiempo y carbono mas elevados que con celulas sin intensificacion de estas actividades.

Contribuye a la solucion de la tarea citada inicialmente una celula seleccionada a partir de microorganismos, preferentemente una celula aislada, que puede formar al menos un ramnolipido de la formula general (I) o su sal,

siendo

m = 2, 1 o 0, en especial 1 o 0,

n = 1 o 0, en especial 1,

R1 y R2 = independientemente entre si, restos organicos iguales o diferentes independientemente entre si, con 2 a 24, preferentemente 5 a 13 atomos de carbono, en especial resto alquilo, en caso dado ramificado, en caso dado sustituido, en especial hidroxisustituido, en caso dado insaturado, en especial, en caso dado, mono-, di- o triinsaturado, preferentemente aquellos seleccionados a partir del grupo constituido por pentenilo, heptenilo, nonenilo, undecenilo y tridecenilo, y (CH2)o-CH3 con o = 1 a 23, preferentemente 4 a 12, caracterizada por que se modifico mediante tecnica genica de modo que, en comparacion con su tipo salvaje, presenta una actividad acrecentada de al menos una de las enzimas E1, E2 y E3, pudiendo catalizar la enzima E1 la reaccion de 3-hidroxialcanoil-ACP a traves de acido-3-hidroxialcanoil-3-hidroxialcanoico-ACP para dar acido hidroxialcanoil-3-hidroxialcanoico, la enzima E2 es una ramnosiltransferasa I, y puede catalizar la reaccion de dTDP-ramnosa y 3-hidroxialcanoato de 3-hidroxialcanoilo para dar 3-hidroxialcanoato de a-L-ramnosilpiranosil-3-hidroxialcanoilo, y la enzima E3 es una ramnosiltransferasa II, y puede catalizar la reaccion de dTPD-ramnosa y 3-hidroxialcanoato de a-L-ramnopiranosil-3-hidroxialcanoilo para dar 3-hidroxialcanoato de a-L-ramnopiranosil-(1-2)-a-L-ramnopiranosil-3-hidroxialcanoilo, y presenta, en comparacion con su tipo salvaje, una actividad acrecentada, como se especifica a continuacion respectivamente, de al menos una de las enzimas seleccionadas a partir del grupo constituido por

una enzima E4, una dTTP: a-D-glucosa-1-fosfato timidililtransferasa, EC 2.7.7.24, en especial una con la secuencia de polipeptidos Seq ID Nr. 10 o con la secuencia de polipeptidos en la que hasta un 25 %, preferentemente hasta un 20 %, de modo especialmente preferente hasta un 15 %, en especial hasta un 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % de los restos aminoacido se han modificado frente a la secuencia de referencia Seq ID Nr. 10 mediante delecion, insercion, sustitucion, o una combinacion de los mismos, y que posee al menos un 10 %, preferentemente un 50 %, de modo especialmente preferente un 80 %, en especial mas de un 90 % de la actividad enzimatica de la enzima con la secuencia de referencia Seq ID Nr. 10, entendiendose por actividad enzimatica para una enzima E4 la capacidad de transformar a-D-glucosa-1 -fosfato y dTTP en dTDP-glucosa,

una enzima E5, una dTTP-glucosa-4,6-hidroliasa, EC 4.2.1.46, en especial una con secuencia de polipeptidos Seq ID Nr. 12 o con una secuencia de polipeptidos en la que hasta un 25 %, preferentemente hasta un 20 %, de modo especialmente preferente hasta un 15 % en peso, en especial hasta un 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % de los restos aminoacido se han modificado respecto a la secuencia de referencia Seq ID Nr. 12 mediante delecion, insercion, sustitucion, o una combinacion de las mismas, y que aun posee al menos un 10 %, preferentemente un 50 %, de modo especialmente preferente un 80 %, en especial mas de un 90 % de la actividad enzimatica de la enzima con la secuencia de referencia Seq ID Nr. 12, entendiendose por actividad enzimatica para una enzima E5 la capacidad de transformar dTDP-glucosa en dTDP-4-dehidro-6-deoxi-D-glucosa,

una enzima Eg, una dTDP-4-dehidrorramnosa-3,5-epimerasa, EC 5.1.3.13, en especial una con secuencia de polipeptidos Seq ID Nr. 14 o con una secuencia de polipeptidos en la que hasta un 25 %, preferentemente hasta un 20 %, de modo especialmente preferente hasta un 15 % en peso, en especial hasta un 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % de los restos aminoacido se han modificado respecto a la secuencia de referencia Seq ID Nr. 14 mediante delecion, insercion, sustitucion, o una combinacion de las mismas, y que aun posee al menos un 10 %, preferentemente un 50 %, de modo especialmente preferente un 80 %, en especial mas de un 90 % de la actividad enzimatica de la enzima con la secuencia de referencia Seq ID Nr. 14, entendiendose por actividad enzimatica para una enzima E6 la capacidad de transformar dTDP-4-dehidro-6-deoxi-D-glucosa en dTDP-4-dehidro-6-deoxi-L-manosa, y

una enzima E7, una dTDP-4-dehidrorramnosa-reductasa, EC 1.1.1.133, en especial una con secuencia de polipeptidos Seq ID Nr. 16 o con una secuencia de polipeptidos en la que hasta un 25 %, preferentemente hasta un 20 %, de modo especialmente preferente hasta un 15 % en peso, en especial hasta un 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % de los restos aminoacido se han modificado respecto a la secuencia de referencia Seq ID Nr. 16 mediante delecion, insercion, sustitucion o una combinacion de las mismas, y que aun presenta al menos un 10 %, preferentemente un 50 %, de modo especialmente preferente un 80 %, en especial mas de un 90 % de la actividad enzimatica de la enzima con la secuencia de referencia Seq ID Nr. 16, entendiendose por actividad enzimatica para una enzima E7 la capacidad de transformar dTDP-4-dehidro-6-deoxi-L-manosa en dTDP-6-Deoxy-L-manosa,

seleccionandose estas enzimas E1, E2 y E3 preferentemente a partir del grupo constituido por

una enzima E1 seleccionada a partir de una enzima E1a con la secuencia de polipeptidos Seq ID Nr. 2 o con una secuencia de polipeptidos en la que hasta un 25 %, preferentemente hasta un 20 %, de modo especialmente preferente hasta un 15 % en peso, en especial hasta un 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % de los restos aminoacido se han modificado respecto a la secuencia de referencia Seq ID Nr. 2 mediante delecion, insercion, sustitucion, o una combinacion de las mismas, y que aun posee al menos un 10 %, preferentemente un 50 %, de modo especialmente preferente un 80 %, en especial mas de un 90 % de la actividad enzimatica de la enzima con la secuencia de referencia Seq ID Nr. 2, entendiendose por actividad enzimatica para una enzima E1a la capacidad de transformar bevorzugt 3-hidroxidecanoil-ACP a traves de acido 3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico-ACP en acido hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico,

una enzima E1b con la secuencia de polipeptidos Seq ID Nr. 18 o con una secuencia de polipeptidos en la que hasta un 25 %, preferentemente hasta un 20 %, de modo especialmente preferente hasta un 15 % en peso, en especial hasta un 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % de los restos aminoacido se han modificado respecto a la secuencia de referencia Seq ID Nr. 18 mediante delecion, insercion, sustitucion, o una combinacion de las mismas, y que aun posee al menos un 10 %, preferentemente un 50 %, de modo especialmente preferente un 80 %, en especial mas de un 90 % de la actividad enzimatica de la enzima con la secuencia de referencia Seq ID Nr. 18, entendiendose por actividad enzimatica para una enzima E1b la capacidad de transformar preferentemente 3-hidroxitetradecanoil-ACP a traves de acido 3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico-ACP en acido hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico,

una enzima E1c con la secuencia de polipeptidos Seq ID Nr. 78 o con una secuencia de polipeptidos en la que hasta un 25 %, preferentemente hasta un 20 %, de modo especialmente preferente hasta un 15 % en peso, en especial hasta un 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % de los restos aminoacido se han modificado respecto a la secuencia de referencia Seq ID Nr. 78 mediante delecion, insercion, sustitucion, o una combinacion de las mismas, y que aun posee al menos un 10 %, preferentemente un 50 %, de modo especialmente preferente un 80 %, en especial mas de un 90 % de la actividad enzimatica de la enzima con la secuencia de referencia Seq ID Nr. 78, entendiendose por actividad enzimatica para una enzima E1c la capacidad de transformar preferentemente 3-hidroxitetradecanoil-ACP a traves de acido 3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico-ACP en acido hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico,

una enzima E1d con la secuencia de polipeptidos Seq ID Nr. 80 o con una secuencia de polipeptidos en la que hasta un 25 %, preferentemente hasta un 20 %, de modo especialmente preferente hasta un 15 % en peso, en especial hasta un 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % de los restos aminoacido se han modificado respecto a la secuencia de referencia Seq ID Nr. 80 mediante delecion, insercion, sustitucion, o una combinacion de las mismas, y que aun posee al menos un 10 %, preferentemente un 50 %, de modo especialmente preferente un 80 %, en especial mas de un 90 % de la actividad enzimatica de la enzima con la secuencia de referencia Seq ID Nr. 80, entendiendose por actividad enzimatica para una enzima E1d la capacidad de transformar preferentemente 3-hidroxitetradecanoil-ACP a traves de acido 3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico-ACP en acido hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico, y

una enzima Eie con la secuencia de polipeptidos Seq ID Nr. 82 o con una secuencia de polipeptidos en la que hasta un 25 %, preferentemente hasta un 20 %, de modo especialmente preferente hasta un 15 % en peso, en especial hasta un 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % de los restos aminoacido se han modificado respecto a la secuencia de referencia Seq ID Nr. 82 mediante delecion, insercion, sustitucion, o una combinacion de las mismas, y que aun posee al menos un 10 %, preferentemente un 50 %, de modo especialmente preferente un 80 %, en especial mas de un 90 % de la actividad enzimatica de la enzima con la secuencia de referencia Seq ID Nr. 82, entendiendose por actividad enzimatica para una enzima E1e la capacidad de transformar preferentemente 3-hidroxitetradecanoil-ACP a traves de acido 3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico-ACP en acido hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico,

una enzima E2 con la secuencia de polipeptidos seleccionada a partir de una enzima E2a con la secuencia de polipeptidos Seq ID Nr. 4 o con una secuencia de polipeptidos en la que hasta un 25 %, preferentemente hasta un 20 %, de modo especialmente preferente hasta un 15 % en peso, en especial hasta un 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % de los restos aminoacido se han modificado respecto a la secuencia de referencia Seq ID Nr. 4 mediante delecion, insercion, sustitucion, o una combinacion de las mismas, y que aun posee al menos un 10 %, preferentemente un 50 %, de modo especialmente preferente un 80 %, en especial mas de un 90 % de la actividad enzimatica de la enzima con la secuencia de referencia Seq ID Nr. 4, entendiendose por actividad enzimatica para una enzima E2a la capacidad de transformar bevorzugt dTDP-ramnosa y acido 3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico en acido a-L-ramnopiranosil-acido 3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico,

una enzima E2b con la secuencia de polipeptidos Seq ID Nr. 20 o con una secuencia de polipeptidos en la que hasta un 25 %, preferentemente hasta un 20 %, de modo especialmente preferente hasta un 15 % en peso, en especial hasta un 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % de los restos aminoacido se han modificado respecto a la secuencia de referencia Seq ID Nr. 20 mediante delecion, insercion, sustitucion, o una combinacion de las mismas, y que aun posee al menos un 10 %, preferentemente un 50 %, de modo especialmente preferente un 80 %, en especial mas de un 90 % de la actividad enzimatica de la enzima con la secuencia de referencia Seq ID Nr. 20, entendiendose por actividad enzimatica para una enzima E2b la capacidad de transformar preferentemente dTDP-ramnosa y acido 3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico en acido a-L-ramnosil-3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico,

una enzima E2c con la secuencia de polipeptidos Seq ID Nr. 84 o con una secuencia de polipeptidos en la que hasta un 25 %, preferentemente hasta un 20 %, de modo especialmente preferente hasta un 15 % en peso, en especial hasta un 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % de los restos aminoacido se han modificado respecto a la secuencia de referencia Seq ID Nr. 84 mediante delecion, insercion, sustitucion, o una combinacion de las mismas, y que aun posee al menos un 10 %, preferentemente un 50 %, de modo especialmente preferente un 80 %, en especial mas de un 90 % de la actividad enzimatica de la enzima con la secuencia de referencia Seq ID Nr. 84, entendiendose por actividad enzimatica para una enzima E2c la capacidad de transformar preferentemente dTDP-ramnosa y acido 3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico en acido a-L-ramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico,

una enzima E2d con la secuencia de polipeptidos Seq ID Nr. 86 o con una secuencia de polipeptidos en la que hasta un 25 %, preferentemente hasta un 20 %, de modo especialmente preferente hasta un 15 % en peso, en especial hasta un 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % de los restos aminoacido se han modificado respecto a la secuencia de referencia Seq ID Nr. 86 mediante delecion, insercion, sustitucion, o una combinacion de las mismas, y que aun posee al menos un 10 %, preferentemente un 50 %, de modo especialmente preferente un 80 %, en especial mas de un 90 % de la actividad enzimatica de la enzima con la secuencia de referencia Seq ID Nr. 86, entendiendose por actividad enzimatica para una enzima E2d la capacidad de transformar preferentemente dTDP-ramnosa y acido 3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico en acido a-L-ramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico, y

una enzima E2e con la secuencia de polipeptidos Seq ID Nr. 88 o con una secuencia de polipeptidos en la que hasta un 25 %, preferentemente hasta un 20 %, de modo especialmente preferente hasta un 15 % en peso, en especial hasta un 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % de los restos aminoacido se han modificado respecto a la secuencia de referencia Seq ID Nr. 88 mediante delecion, insercion, sustitucion, o una combinacion de las mismas, y que aun posee al menos un 10 %, preferentemente un 50 %, de modo especialmente preferente un 80 %, en especial mas de un 90 % de la actividad enzimatica de la enzima con la secuencia de referencia Seq ID Nr. 88, entendiendose por actividad enzimatica para una enzima E2e la capacidad de transformar preferentemente dTDP-ramnosa y acido 3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico en acido a-L-ramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico, y

una enzima E3 seleccionada a partir de una enzima E3a con la secuencia de polipeptidos Seq ID Nr. 6 o con una secuencia de polipeptidos en la que hasta un 25 %, preferentemente hasta un 20 %, de modo especialmente preferente hasta un 15 % en peso, en especial hasta un 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % de los restos aminoacido se han modificado respecto a la secuencia de referencia Seq ID Nr. 6 mediante delecion, insercion, sustitucion, o una combinacion de las mismas, y que aun posee al menos un 10 %, preferentemente un 50 %, de modo especialmente preferente un 80 %, en especial mas de un 90 % de la actividad enzimatica de la enzima con la secuencia de referencia Seq ID Nr. 6, entendiendose por actividad enzimatica para una enzima E3a la capacidad de transformar preferentemente dTDP-ramnosa y acido a-L-ramnopiranosil-3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico en acido a-L-ramnopiranosil-(1-2)-a-L-ramnopiranosil-3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico,

una enzima E3b con la secuencia de polipeptidos Seq ID Nr. 22 o con una secuencia de polipeptidos en la que hasta un 25 %, preferentemente hasta un 20 %, de modo especialmente preferente hasta un 15 % en peso, en especial hasta un 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % de los restos aminoacido se han modificado respecto a la secuencia de referencia Seq ID Nr. 22 mediante delecion, insercion, sustitucion, o una combinacion de las mismas, y que aun posee al menos un 10 %, preferentemente un 50 %, de modo especialmente preferente un 80 %, en especial mas de un 90 % de la actividad enzimatica de la enzima con la secuencia de referencia Seq ID Nr. 22, entendiendose por actividad enzimatica para una enzima E3b la capacidad de transformar preferentemente dTDP-ramnosa y a-L-ramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico en acido a-L-ramnopiranosil-(1 -2)-a-L-ramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico,

una enzima E3c con la secuencia de polipeptidos Seq ID Nr. 90 o con una secuencia de polipeptidos en la que hasta un 25 %, preferentemente hasta un 20 %, de modo especialmente preferente hasta un 15 % en peso, en especial hasta un 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % de los restos aminoacido se han modificado respecto a la secuencia de referencia Seq ID Nr. 90 mediante delecion, insercion, sustitucion, o una combinacion de las mismas, y que aun posee al menos un 10 %, preferentemente un 50 %, de modo especialmente preferente un 80 %, en especial mas de un 90 % de la actividad enzimatica de la enzima con la secuencia de referencia Seq ID Nr. 90, entendiendose por actividad enzimatica para una enzima E3c la capacidad de transformar preferentemente dTDP-ramnosa y a-L-ramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico en acido a-L-ramnopiranosil-(1 -2)-a-L-ramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico, y

una enzima E3d con la secuencia de polipeptidos Seq ID Nr. 92 o con una secuencia de polipeptidos en la que hasta un 25 %, preferentemente hasta un 20 %, de modo especialmente preferente hasta un 15 % en peso, en especial hasta un 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % de los restos aminoacido se han modificado respecto a la secuencia de referencia Seq ID Nr. 92 mediante delecion, insercion, sustitucion, o una combinacion de las mismas, y presenta aun al menos un 10 %, preferentemente un 50 %, de modo especialmente preferente un 80 %, en especial mas de un 92 % de actividad enzimatica de la enzima con la secuencia de referencia Seq ID Nr. 92, entendiendose por actividad enzimatica para una enzima E3d la capacidad de transformar preferentemente dTDP-ramnosa y acido a-L-ramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico en acido a-L-ramnopiranosil-(1 -2)-a-L-ramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico.

Para una vision general vease la Figura 1.

Se denomina “tipo salvaje“ de una celula preferentemente una celula cuyo genoma se presenta en un estado como se ha producido naturalmente debido a la evolucion. El concepto se emplea tanto para la celula total, como tambien para algunos genes. Por lo tanto, no corresponden al concepto “tipo salvaje“ en especial aquellas celulas, o bien aquellos genes cuyas secuencias genicas se han modificado al menos parcialmente por el hombre mediante procedimientos recombinantes. En relacion con la presente invencion, bajo el concepto “ramnolipido“ se entiende un compuesto de la Formula general (I) o su sal. Es evidente que las actividades indicadas concretamente para las enzimas E1a a E3b representan solo una seleccion ejemplar de un espectro de actividades mas amplio de las enzimas citadas anteriormente; la actividad citada en cada caso es aquella que esta presente en una enzima dada para un procedimiento de medicion fiable. De este modo, es obvio que una enzima que transforma un sustrato con un resto C10-alquilo no ramificado, saturado, transformara igualmente - si bien, en caso dado, con actividad reducida - aquellos sustratos que presentan un resto C6- o C16-alquilo, que tambien puede estar ramificado o saturado en caso dado.

El concepto "actividad acrecentada de una enzima" se debe entender preferentemente como actividad intracelular acrecentada. Las siguientes explicaciones sobre el aumento de la actividad enzimatica en celulas se consideran tanto para el aumento de actividad de la enzima E1 a E3 como tambien para todas enzimas citadas a continuacion, cuya actividad se puede aumentar en caso dado. En principio se puede obtener un aumento de la actividad enzimatica aumentandose el numero de copias de la secuencia genica, o bien de las secuencias genicas que codifican para la enzima, empleandose un promotor fuerte o un punto de union de ribosomas mejorado, debilitandose una regulacion negativa de la expresion genica, a modo de ejemplo mediante reguladores de transcripcion, o intensificandose una regulacion positiva de la expresion genica, a modo de ejemplo mediante reguladores de transcripcion, modificandose la utilizacion de codon del gen, aumentandose la vida media de mARN o de la enzima de diferentes maneras, modificandose la regulacion de la expresion del gen o utilizandose un gen o alelo que codifica para una enzima correspondiente con una actividad elevada, y combina estas medidas en caso dado. Se generan celulas modificadas mediante tecnica genica segun la invencion, a modo de ejemplo, mediante transformacion, transduccion, conjugacion, o una combinacion de estos metodos, con un vector que contiene el gen deseado, un alelo de este gen o partes del mismo, y en caso dado un promotor que posibilita la expresion del gen.

La expresion heterologa se obtiene en especial mediante integracion del gen o de los alelos en el cromosoma de la celula o un vector replicante de modo extracromosomico. Ofrece una vision de conjunto sobre las posibilidades para el aumento de la actividad enzimatica en celulas en el ejmplo de piruvato-carboxilasa, el documento DE-A-100 31 999, que se introduce como referencia en el presente documento, y cuyo contenido divulgativo respecto a las posibilidades para el aumento de la actividad enzimatica forma una parte de la divulgacion de la presente invencion.

La expresion de enzimas, o bien genes citados anteriormente y a continuacion en su totalidad es identificable con ayuda de separacion en gel proteico 1- y 2-dimensional, y subsiguiente identificacion optica de la concentracion de proteinas con correspondiente software de valoracion en el gel. Si el aumento de una actividad enzimatica se basa exclusivamente en un aumento de la expresion del correspondiente gen, la cuantificacion del aumento de la actividad enzimatica se puede determinar facilmente mediante una comparacion de las separaciones de proteinas 1-y 2-dimensionales entre tipo salvaje y celulas modificadas mediante tecnica genica.

Un metodo comun para la preparacion de geles proteicos en bacterias corineformes y para la identificacion de proteinas es el procedimiento descrito por Hermann et al. (Electrophoresis, 22: 1712.23 (2001)). La concentracion de proteinas se puede analizar igualmente mediante hibridacion Western-Blot con un anticuerpo especifico para la proteina a identificar (Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. USA, 1989) y subsiguiente valoracion optica con correspondiente software para la determinacion de la concentracion (Lohaus y Meyer (1989) Biospektrum, 5: 32-39; Lottspeich (1999) Angewandte Chemie 111: 2630-2647). La actividad de proteinas que enlazan ADN se puede medir mediante ensayos de desplazamiento de banda de ADN (tambien denominado retardo de gel) (Wilson et al. (2001) Journal of Bacteriology, 183: 2151-2155).

La accion de proteinas que enlazan ADN sobre la expresion de otros genes se puede identificar mediante diferentes metodos convenientemente descritos del ensayo de gen reportero (Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. USA, 1989). Las actividades enzimaticas intracelulares se pueden determinar segun diversos metodos descritos (Donahue et al. (2000) Journal of Bacteriology 182 (19): 5624-5627; Ray et al. (2000) Journal of Bacteriology 182 (8): 2277-2284; Freedberg et al. (1973) Journal of Bacteriology 115 (3): 816-823).

En tanto en las siguientes explicaciones no se indiquen metodos concretos para la determinacion de la actividad de una enzima dada, la determinacion del aumento de la actividad enzimatica, y tambien la determinacion de la reduccion de una actividad enzimatica, se efectuan preferentemente por medio de metodos descritos en Hermann et al., Electophoresis, 22: 1712-23 (2001), Lohaus et al., Biospektrum 532-39 (1998), Lottspeich, Angewandte Chemie 111: 2630-2647 (1999) y Wilson et al., Journal of Bacteriology 183: 2151 -2155 (2001).

Si el aumento de la actividad enzimatica se realiza mediante mutacion del gen endogeno, tales mutaciones se pueden generar de manera no selectiva segun metodos clasicos, como por ejemplo mediante radiacion UV o mediante productos quimicos mutagenos, o selectivamente por medio de metodos de tecnologia genica, como delecion(es), insercion(es) y/o intercambio(s) de nucleotidos. Mediante estas mutaciones se obtienen celulas modificadas. En especial son mutantes de enzimas especialmente preferentes tambien aquellas enzimas que ya no inhibibles en retroalimentacion, producto o sustrato, o lo son al menos de manera reducida en comparacion con la enzima de tipo salvaje.

Si el aumento de la actividad enzimatica se realiza mediante aumento de la sintesis de una enzima, a modo de ejemplo se aumenta el numero de copias de los correspondientes genes, o se mita la region de promotor y regulacion, o el punto de enlace ribosomico, que se encuentra en linea de entrada del gen estructural. Del mismo modo actuan cassettes de expresion que se incorporan en linea de entrada del gen estructural. Mediante promotores inducibles es posible adicionalmente aumentar la expresion en cualquier momento arbitrario. No obstante, por lo demas, al gen enzimatico se pueden asignar tambien los denominados “potenciadores“ como secuencias reguladoras, que ocasionan igualmente una expresion genica aumentada a traves de una interaccion mejorada entre ARN-polimerasa y ADN. Mediante medidas para la prolongacion de la vida util de mARN se mejora igualmente la expresion. Ademas, mediante inhibicion de la degradacion de la proteina enzimatica se intensifica asimismo la actividad enzimatica. Los genes o construcciones geneticas se presentan en este caso en plasmidos con diferente numero de copias, o estan integrados y amplificados en el cromosoma. Alternativamente se puede obtener ademas una sobreexpresion de los genes respectivos mediante modificacion de la composicion del medio y el control de cultivo. El especialista encuentra explicaciones a tal efecto, entre otros, en Martin et al. (Bio/Technology 5, 137-146 (1987)), en Guerrero et al. (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya y Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988)), en Eikmanns et al. (Gene 102, 93-98 (1991)), en el documento EP-A-0 472 869, en el documento US 4,601,893, en Schwarzer y Puhler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991), en Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)), en LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)), en el documento WO-A-96/15246, en Malumbres et al. (Gene 134, 15-24 (1993)), en JP-A-10-229891, en Jensen y Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998)) y en libros de texto conocidos de genetica y biologia molecular. Las medidas descritas anteriormente conducen a celulas modificadas mediante tecnica genica, al igual que las mutaciones.

Para el aumento de la expresion de los respectivos genes se emplean, por ejemplo, plasmidos episomales. En principio entran en consideracion como plasmidos, o bien vectores, todas las formas de realizacion disponibles para el especialista con este fin. Tales plasmidos y vectores se pueden extraer, por ejemplo, de las publicaciones de las firmas Novagen, Promega, New England Biolabs, Clontech o Gibco BRL. Otros plasmidos y vectores preferentes se pueden encontrar en: Glover, D. M. (1985) DNA cloning: a practical approach, Vol. I-III, IRL Press Ltd., Oxford; Rodriguez, R.L. y Denhardt, D. T (eds) (1988) Vectors : a survey of molecular cloning vectors and their uses, 179 204, Butterworth, Stoneham; Goeddel, D. V. (1990) Systems for heterologous gene expression, Methods Enzymol.

185, 3-7; Sambrook, J.; Fritsch, E. F. y Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York.

El vector plasmido, que contiene el gen a amplificar, se transforma a continuacion en la cepa deseada mediante conjugacion o transformacion. El metodo de conjugacion se describe, a modo de ejemplo, en Schafer et al., Applied and Environmental Microbiology 60: 756-759 (1994). Se describen metodos para la transformacion, a modo de ejemplo, en Thierbach et al., Applied Microbiology and Biotechnology 29: 356-362 (1988), Dunican y Shivnan, Bio/Technology 7: 1067-1070 (1989) y Tauch et al., FEMS Microbiology Let-ters 123: 343-347 (1994). Tras recombinacion homologa por medio de un resultado "cross-over", la cepa resultante contiene al menos dos copias del gen afectado.

Bajo la formulacion empleada anteriormente y en las siguientes explicaciones "una actividad de una enzima Ex acrecentada en comparacion con su tipo salvaje“, siempre se debe entender preferentemente una actividad de la respectiva enzima Ex acrecentada al menos en el factor 2, de modo especialmente preferente de al menos 10, ademas preferentemente de al menos 100, ademas, de modo aun mas preferente de al menos 1000, y del modo mas preferente de al menos 10000. Ademas, la celula segun la invencion, que presenta "una actividad de una enzima Ex acrecentada en comparacion con su tipo salvaje“, tambien comprende en especial una celula cuyo tipo salvaje no presenta una actividad enzimatica, al menos identificable, de esta enzima Ex, y que muestra una actividad identificable de esta enzima Ex solo tras aumento de la actividad enzimatica, a modo de ejemplo mediante sobrexpresion. En este contexto, el concepto "superexpresion" o la formulacion "aumento de la expresion" empleada en las siguientes explicaciones, comprende tambien el caso de que una celula de partida, a modo de ejemplo una celula de tipo salvaje, no presente una expresion, o al menos identificable, y se induzca una sintesis identificable de la enzima Ex solo mediante procedimientos recombinantes.

El especialista conoce modificaciones de los restos aminoacido de una secuencia de polipeptidos dada, que no conducen a modificaciones esenciales de las propiedades y la funcion del polipeptido dado. A modo de ejemplo, los denominados aminoacidos conservados se pueden intercambiar entre si; son ejemplos de tales sustituciones de aminoacido apropiadas: Ala por Ser; Arg por Lys; Asn por Gln o His; Asp por Glu; Cys por Ser; Gln por Asn; Glu por Asp; Gly por Pro; His por Asn o Gln; Ile por Leu o Val; Leu por Met o Val; Lys por Arg o Gln o Glu; Met por Leu o Ile; Phe por Met o Leu o Tyr; Ser por Thr; Thr por Ser; Trp por Tyr; Tyr por Trp o Phe; Val por Ile o Leu. Asimismo es sabido que las modificaciones, especialmente en el extremo N o C de un polipeptido en forma de inserciones o deleciones de aminoacidos, no ejercen frecuentemente una influencia esencial en la funcion del polipeptido.

La actividad de una enzima se puede determinar disgregandose celulas que contienen esta actividad de modo conocido por el especialista, a modo de ejemplo con ayuda de un molino de bolas, una prensa francesa o un desintegrador ultrasonico, y separandose a continuacion celulas intactas, fragmentos celulares y adyuvantes de disgregacion, como por ejemplo bolas de vidrio, mediante centrifugacion de 10 minutos a 13000 rpm y 4°C. Con el extracto crudo exento de celulas resultante se pueden llevar a cabo entonces el ensayo enzimatico con subsiguiente deteccion de los productos por LC-ESI-MS. Alternativamente, la enzima se puede concentrar, o tambien purificar hasta homogeneidad de modo conocido por el especialista, mediante metodos cromatograficos (como cromatografia de afinidad de niquel-acido nitrilotriacetico, cromatografia de afinidad de estreptavidina, cromatografia de filtracion en gel o cromatografia de intercambio ionico).

La actividad de la enzima E1 se determina entonces con las muestras obtenidas como se describe anteriormente de la siguiente manera: un ensayo estandar contiene 100 pM E. coli ACP, 1 mM p-mercaptoetanol, 200 pM malonilcoenzima A, 40 pM octanoil-coenzima A (para E1a) o dodecanoil-coenzima A (para E1b), 100 pM NADPH, 2 pg E. coli FabD, 2 pg de Mycobacterium tuberculosis FabH, 1 pg de E. coli FabG, 0,1 M tampon fosfato sodico, pH 7,0, y 5 pg de enzima E1 en un volumen final de 120 pL. ACP, p-mercaptoetanol y tampon fosfato sodico se incuban previamente 30 minutos a 37°C para reducir completamente la ACP. La reaccion se inicia mediante adicion de enzima E1. Las reacciones se detienen con 2 ml de agua, que se ha acidificado con HCl a pH 2,0, y a continuacion se extrae dos veces con 2 ml de cloroformo/metanol (2:1 (v:v)). Se efectua separacion de fases mediante centrifugado (16.100 g, 5 min, TA). La fase organica inferior se retira, se evapora completamente en la centrifuga de vacio, y el sedimento se absorbe en 50 pl de metanol. Los componentes no disueltos se sedimentan mediante centrifugado (16.100 g, 5 min, TA), y la muestra se analiza por medio de LC-ESI-MS. La identificacion de los productos se efectua mediante analisis de las correspondientes trazas masicas y espectros de MS2.

La actividad de la enzima E2 se determina entonces con las muestras obtenidas como se describe anteriormente de la siguiente manera: un ensayo estandar puede estar constituido por 185 pl de 10 mM tris-HCl (pH 7,5), 10 pl de 125 mM dTDP-ramnosa, y 50 gl de extracto de proteina (aproximadamente 1 mg de proteina total), o proteina purificada en disolucion (5 gg de proteina purificada). La reaccion se inicia mediante la adicion de 10 gl de disolucion etanolica 10 mM de acido 3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico (para E2a) o acido 3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico (para E2b), y se incuba 1 h a 30°C bajo agitacion (600 rpm). A continuacion se mezcla la reaccion con 1 ml de acetona. Los componentes insolubles se sedimentan mediante centrifugado (16.100 g, 5 min, TA), y la muestra se analiza por medio de LC-ESI-MS. La identificacion de los productos se efectua mediante analisis de las correspondientes trazas masicas y espectros de MS2.

La actividad de la enzima E3 se determina entonces con las muestras obtenidas como se describe anteriormente de la siguiente manera: un ensayo estandar puede estar constituido por 185 gl de 10 mM tris-HCl (pH 7,5), 10 gl de 125 mM dTDP-ramnosa y 50 gl de extracto crudo de proteina (aproximadamente 1 mg de proteina total), o proteina purificada en disolucion (5 gg de proteina purificada). La reaccion se inicia mediante la adicion de 10 gl de disolucion etanolica 10 mM de acido a-L-ramnopiranosil-3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico (para E3a) o acido a-L-ramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico (para E3b), y se incuba 1 h a 30°C bajo agitacion (600 rpm). A continuacion se mezcla la reaccion con 1 ml de acetona. Los componentes insolubles se sedimentan mediante centrifugado (16.100 g, 5 min, TA), y la muestra se analiza por medio de LC-ESI-MS. La identificacion de los productos se efectua mediante analisis de las correspondientes trazas masicas y espectros de MS2.

Segun la invencion son preferentes celulas que presentan actividades acrecentadas de las siguientes combinaciones de enzimas:

E1, E2, E3, E1E2, E1E3, E2E3 y E1E2E3,

de las que es especialmente preferente la combinacion

E2, E2E3 y E1E2E3, en especial E1E2E3.

En una forma configuracion preferente de la celula segun la invencion, que presenta una actividad acrecentada de la combinacion enzimatica E1E2E3, n es preferentemente =1.

Las celulas segun la invencion son microorganismos, como levaduras, hongos o bacterias, siendo especialmente preferentes los microorganismos, y siendo preferentes en la mayor parte de los casos las bacterias y las levaduras. Como bacterias, levaduras u hongos son apropiadas en especial aquellas bacterias, levaduras u hongos que se depositan en la Deutschen Sammlung von Mikroorganismen y Zellkulturen GmbH (DSMZ), Braunschweig, Alemania, como cepas de bacterias, levaduras u hongos. Las bacterias apropiadas segun la invencion pertenecen a las especies que se enumeran en

http://www.dsmz.de/species/bacteria.htm,

las levaduras apropiadas segun la invencion pertenecen a aquellas especies que se enumeran en http://www.dsmz.de/species/yeasts.htm,

y los hongos apropiados segun la invencion son aquellos que se enumeran en ttp://www.dsmz.de/species/fungi.htm.

Celulas preferentes segun la invencion son aquellas de las especies Aspergillus, Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus, Acinetobacter, Alcaligenes, Lactobacillus, Paracoccus, Lactococcus, Candida, Pichia, Hansenula, Kluyveromyces, Saccharomyces, Escherichia, Zymomonas, Yarrowia, Methylobacterium, Ralstonia, Pseudomonas, Rhodospirillum, Rhodobacter, Burkholderia, Clostridium y Cupriavidus, siendo especialmente preferentes Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Alcaligenes latus, Bacillus megaterium, Bacillus subtilis, Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum, Burkholderia andropogonis, B. brasilensis, B. caledonica, B. caribensis, B. caryophylli, B. fungorum, B. gladioli, B. glathei, B. glumae, B. graminis, B. hospita, B. kururiensis, B. phenazinium, B. phymatum, B. phytofirmans, B. plantarii, B. sacchari, B. singaporensis, B. sordidicola, B. terricola, B. tropica, B. tuberum, B. ubonensis, B. unamae, B. xenovorans, B. anthina, B. pyrrocinia, B. thailandensis, Candida blankii, Candida rugosa, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium efficiens, Escherichia coli, Hansenula polymorpha, Kluveromyces lactis, Methylobacterium extorquens, Paracoccus versutus, Pseudomonas argentinensis, P. borbori, P. citronellolis, P. flavescens, P. mendocina, P. nitroreducens, P. oleovorans, P. pseudoalcaligenes, P. resinovorans, P. straminea, P. aurantiaca, P. aureofaciens, P. chlororaphis, P. fragi, P. lundensis, P. taetrolens, P. antarctica, P. azotoformans, 'P. blatchfordae', P. brassicacearum, P. brenneri, P. cedrina, P. corrugata, P. fluorescens, P. gessardii, P. libanensis, P. mandelii, P. marginalis, P. mediterranea, P. meridiana, P. migulae, P. mucidolens, P. orientalis, P. panacis, P. proteolytica, P. rhodesiae, P. synxantha, P. thivervalensis, P. tolaasii, P. veronii, P.

denitrificans, P. pertucinogena, P. cremoricolorata, P. fulva, P. monteilii, P. mosselii, P. parafulva, P. putida, P. balearica, P. stutzeri, P. amygdali, P. avellanae, P. caricapapayae, P. cichorii, P. coronafaciens, P. ficuserectae, 'P. helianthi', P. meliae, P. savastanoi, P. syringae, P. tomato, P. viridiflava, P. abietaniphila, P. acidophila, P. agarici, P. alcaliphila, P. alkanolytica, P. amyloderamosa, P. asplenii, P. azotifigens, P. cannabina, P. coenobios, P. congelans, P. costantinii, P. cruciviae, P. delhiensis, P. excibis, P. extremorientalis, P. frederiksbergensis, P. fuscovaginae, P. gelidicola, P. grimontii, P. indica, P. jessenii, P. jinjuensis, P. kilonensis, P. knackmussii, P. koreensis, P. lini, P. lutea, P. moraviensis, P. otitidis, P. pachastrellae, P. palleroniana, P. papaveris, P. peli, P. perolens, P. poae, P. pohangensis, P. psychrophila, P. psychrotolerans, P. rathonis, P. reptilivora, P. resiniphila, P. rhizosphaerae, P. rubescens, P. salomonii, P. segitis, P. septica, P. simiae, P. suis, P. thermotolerans, P. aeruginosa, P. tremae, P. trivialis, P. turbinellae, P. tuticorinensis, P. umsongensis, P. vancouverensis, P. vranovensis, P. xanthomarina, Ralstonia eutropha, Rhodospirillum rubrum, Rhodobacter sphaeroides, Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica y Zymomonas mobilis, en especial Pseudomonas putida, Escherichia coli y Burkholderia thailandensis.

Las celulas preferentes segun la invencion como tipo salvaje no pueden formar cantidades, o cantidades identificables de ramnolfpidos, y ademas no presentan preferentemente una actividad, o una actividad identificable de las enzimas E1,E2 y E3.

Segun la invencion es ventajoso que la celula segun la invencion sea una celula que puede formar como tipo salvaje polihidroxialcanoatos con longitudes de cadena de monoalcanoato de C6 a C16. Tales celulas son, a modo de ejemplo, Burkholderia sp., Burkholderia thailandensis, Pseudomonas sp., Pseudomonas putida, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas oleovorans, Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas citronellolis, Pseudomonas resinovorans, Comamonas testosteroni, Aeromonas hydrophila, Cupriavidus necator, Alcaligenes latus y Ralstonia eutropha. En este contexto, las celulas preferentes segun la invencion estan modificadas mediante tecnica genica, de modo que pueden formar menos polihidroxialcanoatos en comparacion con su tipo salvaje. Tales celulas se describen, a modo de ejemplo, en De Eugenio et al., Environ Microbiol. 2010.

12(1 ):207-21 y Rehm et al., Appl Environ Microbiol. 2001.67(7):3102-9.

Tal celula, que puede formar menos polihidroxialcanoatos en comparacion con su tipo salvaje, esta caracterizada especialmente por que, en comparacion con su tipo salvaje, presenta una actividad reducida de una enzima E9 o E10, representando E9 una polihidroxialcanoato-sintasa, EC:2.3.1.-, en especial con la secuencia de polipeptidos Seq ID Nr. 30 o Seq ID Nr. 32, o con una secuencia de polipeptidos en la que hasta un 25 %, preferentemente hasta un 20 %, de modo especialmente preferente hasta un 15 % en peso, en especial hasta un 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % de los restos aminoacidos estan modificados frente a la respectiva secuencia de referencia Seq ID Nr. 30 o Seq ID Nr. 32 mediante delecion, insercion, sustitucion, o una combinacion de las mismas, y que aun posee al menos un 10 %, preferentemente un 50 %, de modo especialmente preferente un 80 %, en especial mas de un 90 % de la actividad enzimatica de la enzima con la respectiva secuencia de referencia Seq ID Nr. 30 o Seq ID Nr. 32, entendiendose por actividad enzimatica de una enzima E9 la capacidad de transformar 3-hidroxialcanoil-coenzima A en acido poli-3-hidroxialcanoico, en especial 3-hidroxitetradecanoil-coenzima A en acido poli-3-hidroxitetradecanoico, y

E10 una 3-hidroxialcanoil-ACP:coenzima A-transferasa, en especial con la secuencia de polipeptidos Seq ID Nr. 34 o Seq ID Nr. 36, o con una secuencia de polipeptidos en la que hasta un 25 %, preferentemente hasta un 20 %, de modo especialmente preferente hasta un 15 % en peso, en especial hasta un 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % de los restos aminoacido estan transformados frente a la respectiva secuencia de referencia Seq ID Nr. 34 o Seq ID Nr. 36 mediante delecion, insercion, sustitucion, o una combinacion de las mismas, y que aun posee al menos un 10 %, preferentemente un 50 %, de modo especialmente preferente un 80 %, en especial mas de un 90 % de la actividad enzimatica de la enzima con la respectiva secuencia objetivo Seq ID Nr. 34 o Seq ID Nr. 36, entendiendose por actividad enzimatica para una enzima E10 la capacidad de transformar 3-hidroxialcanoil-ACP en 3-hidroxialcanoilcoenzima A, en especial 3-hidroxialcanoil-ACP en 3-hidroxitetradecanoil-coenzima A.

Para una vision general vease la Figura 1.

La actividad de la enzima E9 se determina entonces con las muestras obtenidas como se describe anteriormente para las enzimas E1 a E3, mezclandose en primer lugar 560 gl de 100 mM Tris/HCl, pH 7,5, 20 gl de 35 mM DTNB en DMSO y 20 gl de 41 mM 3-hidroxidecanoil-coenzima A. A continuacion se anaden 5 gg de enzima purificada E9 en 100 gl de tris/HCl, pH 7,5, y a continuacion se registra continuamente durante 1 minuto el descenso de extincion a 412 nm en el espectrofotometro (provocado por adicion de 5,5‘-ditiobis(2-hitrobenzoato) (DTNB) en grupos SH libres) a lo largo del tiempo (AE/min).

La actividad de la enzima E10 se determina entonces con las muestras obtenidas como se describe anteriormente para las enzimas E1 a E3. El ensayo estandar contiene 3 mM MgCl2, 40 gM hidroxidecanoil-coenzima A y 20 gM E. coli ACP en 50 mM tris-HCl, pH 7,5, en un volumen total de 200 gl. La reaccion se inicia mediante adicion de 5 gg de enzima E10 purificada en 50 gl de Tris/HCl, pH 7,5 y se incuba durante 1 h a 30°C. La reaccion se detiene mediante adicion de 50% (w/v) de acido tricloroacetico y 10 mg/ml BSA (30 gl). La coenzima A liberada se determina mediante espectrofotometria, registrandose la extincion a 412 nm, ocasionada mediante adicion de 5,5‘-ditiobis(2-nitrobenzoato) (DTNB) en grupos SH libres a lo largo del tiempo.

Por consiguiente, bajo la formulacion empleada "actividad reducida de una enzima Ex" se entiende preferentemente una actividad reducida preferentemente en un factor de al menos 0,5, de modo especialmente preferente de al menos 0,1 , ademas preferentemente de al menos 0,01, ademas de modo aun mas preferente de al menos 0,001, y del modo mas preferente de al menos 0,0001. La formulacion "actividad reducida" incluye tambien ninguna actividad detectable ("actividad cero"). La reduccion de la actividad de una enzima determinada se puede efectuar, a modo de ejemplo, mediante mutacion selectiva u otras medidas para la reduccion de la actividad de una enzima determinada conocidas por el especialista. El especialista conoce procedimientos para la reduccion de actividades enzimaticas en microorganismos.

En este caso se ofrecen en especial tecnicas de biologia molecular. El especialista encuentra una guia para la modificacion y reduccion de la expresion de proteinas y, acompanando a esta, una reduccion de la actividad enzimatica, especialmente para Pseudomonas y Burkholderia, en especial para la interrupcion de genes especiales, a modo de ejemplo, en Dubeau et al. 2009. BMC Microbiology 9:263; Singh & Rohm. Microbiology. 2008. 154:797 809 o Lee et al. FEMS Microbiol Lett. 2009. 297(1 ):38-48.

Las celulas preferentes segun la invencion estan caracterizadas por que la reduccion de la actividad enzimatica se consigue mediante una modificacion de un gen que comprene una de las citadas secuencias de acido nucleico, seleccionandose la modificacion a partir del grupo constituido preferentemente por insercion de ADN ajeno en el gen, delecion de al menos partes del gen, mutaciones por puntos en la secuencia genica, interferencia de ARN (siRNA), ARN antisentido o modificacion (insercion, delecion o mutaciones por puntos) de secuencias reguladoras, como por ejemplo promotores y terminadores, o de puntos de enlace de ribosomas que flanquean el gen.

En este contexto, se entiende por ADN ajeno cualquier secuencia de ADN que es “ajena“ al gen (y no al organismo), es decir, tambien secuencias de ADN endogenas pueden actuar como “ADN ajeno“ en este contexto.

En este contexto es especialmente preferente que el gen se interrumpa mediante insercion de un gen marcador de seleccion, por lo que el ADN ajeno es un gen marcador de seleccion, efectuandose preferentemente la insercion mediante recombinacion homologa en el locus genetico.

En una forma preferente de realizacion de la celula segun la invencion, en el caso de la celula se trata de celulas de Pseudomonas putida, que presentan una sintesis de polihidroxialcanoato reducida en comparacion con su tipo salvaje. Tales celulas se describen, a modo de ejemplo, en Ren et al., Journal Applied Microbiology and Biotechnology 1998 Jun, 49(6):743-50 como GPp121, GPp122, GPp123 y GPp124, en Huisman et al., J Biol Chem.

1991 Feb 5;266(4):2191 -8 como GPp104, asi como en De Eugenio et al., Environ Microbiol. 2010. 12(1 ):207-21 como KT42C1 y en Ouyang et al. Macromol Biosci. 2007. 7(2):227-33 como KTOY01 y KTOY02.

Para el caso de que la celula segun la invencion pueda formar un ramnolipido con m=1, es preferente que el resto determinado a traves de R1 y R2

se derive de acido 3-hidroxioctanoil-3-hidroxioctanoico, acido 3-hidroxioctanoil-3-hidroxidecanoico, acido 3-hidroxidecanoil-3-hidroxioctanoico, acido 3-hidroxioctanoil-3-hidroxidecenoico, acido 3-hidroxidecenoil-3-hidroxioctanoico, acido 3-hidroxioctanoil-3-hidroxidodecanoico, acido 3-hidroxidodecanoil-3-hidroxioctanoico, acido 3-hidroxioctanoil-3-hidroxidodecenoico, acido 3-hidroxidodecenoil-3-hidroxioctanoico, acido 3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico, acido 3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecenoico, acido 3-hidroxidecenoil-3-hidroxidecanoico, acido 3-hidroxidecenoil-3-hidroxidecenoico, acido 3-hidroxidecanoil-3-hidroxidodecanoico, acido 3-hidroxidodecanoil-3-hidroxidecanoico, acido 3-hidroxidecanoil-3-hidroxidodecenoico, acido 3-hidroxidecanoil-3-hidroxitetradecenoico, acido 3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxidecenoico, acido 3-hidroxidodecenoil-3-hidroxidecanoico, acido 3-hidroxidecanoil-3-hidroxitetradecanoico, acido 3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxidecanoico, acido 3-hidroxidecanoil-3-hidroxitetradecenoico, acido 3-hidroxitetradecenoil-3-hidroxidecanoico, acido 3-hidroxidodecanoil-3-hidroxidodecanoico, acido 3-hidroxidodecenoil-3-hidroxidodecanoico, acido 3-hidroxidodecanoil-3-hidroxidodecenoico, acido 3-hidroxidodecanoil-3-hidroxitetradecanoico, acido 3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxidodecanoico, acido 3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico, acido 3-hidroxihexadecanoil-3-hidroxitetradecanoico, acido 3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxihexadecanoico o 3-hidroxihexadecanoil-3-hidroxihexadecanoico.

Para el especialista es obvio que una celula segun la invencion tambien puede formar mezclas de diferentes ramnolipidos de la Formula general (I). En este contexto es preferente que las celulas segun la invencion puedan formar mezclas de ramnolipidos de la Formula general (I), que estan caracterizadas por que en mas de un 80 % en peso, preferentemente mas de un 90 % en peso, de modo especialmente preferente mas de un 95 % en peso de los ramnolipidos formados n es = 1, y el resto determinado a traves de R1 y R2 se deriva en menos de un 10 % en peso, preferentemente menos de un 5 % en peso, de modo especialmente preferente menos de un 2 % en peso de los ramnolipidos formados de acido 3-hidroxidecanoil-3-hidroxioctanoico o acido 3-hidroxioctanoil-3-hidroxidecanoico, refiriendose los % en peso indicados a la suma de todos los ramnolipidos de la Formula general (I) formados.

La actividad de la enzima E4 se determina con las muestras obtenidas como se describe anteriormente para las enzimas E1 a E3, incubandose a-D-glucosa-1-fosfato (1,3 mM) con dTTP (5 mM) y 5 gg de enzima purificada E4 en 50 gl de tampon fosfato sodico, pH 8,5, y deteniendose la reaccion tras 5, 10 y 20 minutos de incubacion a 30°C mediante adicion de 20 gl de cloroformo. La mezcla se agita a continuacion y se centrifuga 5 minutos a 16.000 g y temperatura ambiente. La fase acuosa se traslada a un nuevo recipiente de reaccion y la fase organica se extrae de nuevo con 80 gl de agua. Ambas fases acuosas se reunen y se analizan por medio de HPLC. En este caso se emplea una columna Phenosphere-ODS2 (250 x 4,6 mm; Phenomenex, Torrance, USA) o una columna Spheresorb-ODS2(250 x 4,6 mm; Waters, Milford, USA). La elucion de los analitos se efectua con una tasa de flujo de 1 ml min-1 con 0,5 M KH2PO4 (eluyente A) durante 15 minutos, seguido de un gradiente lineal hasta un 80 % de eluyente A y un 20 % de metanol durante un intervalo de tiempo de 14 minutos con una tasa de flujo de 0,7 ml min-1. Los analitos que se eluyen de la columna ODS2 se inyectan entonces en una columna de intercambio ionico Phenosphere-SAX (250 x 4,6 mm; Phenomenex, Torrance, USA) y los analitos se eluyen con una tasa de flujo de 1 ml min-1 y un gradiente lineal de formiato amonico (2 a 600 mM durante 25 min). La cuantificacion de dTDP glucosa se efectua entonces a traves de su absorcion UV con un detector de ensayo de fotodiodos (DAD). El maximo de absorcion de timidina se situa en 267 nm. El calibrado se efectua por medio de azucar de nucleotido autentico (Sigma-Aldrich, Munchen, USA).

La actividad de la enzima E5 se determina con las muestras obtenidas como se describe anteriormente para las enzimas E1 bis E3, incubandose dTDP-a-D-glucosa (1,3 mM) con 5 gg de enzima purificada E5 en 50 gl de tampon fosfato sodico, pH 8,5, y deteniendose la reaccion tras 5, 10 y 20 minutos de incubacion a 30°C mediante adicion de 20 gl de cloroformo. La mezcla se agita a continuacion y se centrifuga 5 minutos a 16.000 g y temperatura ambiente. La fase acuosa se traslada a un nuevo recipiente de reaccion y la fase organica se extrae de nuevo con 80 gl de agua. Ambas fases acuosas se reunen y se analizan por medio de HPLC. En este caso se emplea una columna Phenosphere-ODS2 (250 x 4,6 mm; Phenomenex, Torrance, USA) o una columna Spheresorb-ODS2(250 x 4,6 mm; Waters, Milford, USA). La elucion de los analitos se efectua con una tasa de flujo de 1 ml min-1 con 0,5 M KH2PO4 (eluyente A) durante 15 minutos, seguido de un gradiente lineal hasta un 80 % de eluyente A y un 20 % de metanol durante un intervalo de tiempo de 14 minutos con una tasa de flujo de 0,7 ml min-1. Los analitos que se eluyen de la columna ODS2 se inyectan entonces en una columna de intercambio ionico Phenosphere-SAX (250 x 4,6 mm; Phenomenex, Torrance, USA) y los analitos se eluyen con una tasa de flujo de 1 ml min-1 y un gradiente lineal de formiato amonico (2 a 600 mM durante 25 min). La cuantificacion de dTDP-glucosa y dTDP-4-dehidro-6-deoxi-D-glucosa se efectua entonces a traves de su absorcion UV con un detector de ensayo de fotodiodos (DAD). El maximo de absorcion de timidina se situa en 267 nm. El calibrado se efectua por medio de azucar de nucleotido autentico (Sigma-Aldrich, Munchen, USA).

La actividad de la enzima E6 se determina con las muestras obtenidas como se describe anteriormente para las enzimas E1 bis E3, incubandose en primer lugar dTDP-a-D- glucosa (1,3 mM) con 5 gg de enzima purificada E5 en 50 gl de tampon fosfato sodico, pH 8,5, durante 10 minutos a 30°C. A continuacion se anaden 0,5 gg de enzima purificada E6, y se detiene la reaccion tras 5, 10 y 20 minutos de incubacion a 30°C mediante adicion de 20 gl de cloroformo. La mezcla se agita a continuacion y se centrifuga 5 minutos a 16.000 g y temperatura ambiente. La fase acuosa se traslada a un nuevo recipiente de reaccion y la fase organica se extrae de nuevo con 80 gl de agua. Ambas fases acuosas se reunen y se analizan por medio de HPLC. En este caso se emplea una columna Phenosphere-ODS2 (250 x 4,6 mm; Phenomenex, Torrance, USA) o una columna Spheresorb-ODS2(250 x 4,6 mm; Waters, Milford, USA). La elucion de los analitos se efectua con una tasa de flujo de 1 ml min-1 con 0,5 M KH2PO4 (eluyente A) durante 15 minutos, seguido de un gradiente lineal hasta un 80 % de eluyente A y un 20 % de metanol durante un intervalo de tiempo de 14 minutos con una tasa de flujo de 0,7 ml min-1. Los analitos que se eluyen de la columna ODS2 se inyectan entonces en una columna de intercambio ionico Phenosphere-SAX (250 x 4,6 mm; Phenomenex, Torrance, USA) y los analitos se eluyen con una tasa de flujo de 1 ml min-1 y un gradiente lineal de formiato amonico (2 a 600 mM durante 25 min). La cuantificacion de dTDP-glucosa, dTDP-4-dehidro-6-deoxi-D-glucosa y dTDP-6-deoxi-L-manosa se efectua entonces a traves de su absorcion UV con un detector de ensayo de fotodiodos (DAD). El maximo de absorcion de timidina se situa en 267 nm. El calibrado se efectua por medio de azucar de nucleotido autentico (Sigma-Aldrich, Munchen, USA).

La actividad de la enzima E7 se determina con las muestras obtenidas como se describe anteriormente para las enzimas Ei bis E3, incubandose en primer lugar dTDP-a-D-glucosa (1,3 mM) con 5 gg de enzima purificada E5 en 50 gl de tampon fosfato sodico, pH 8,5, durante 10 minutos a 30°C. A continuacion se anaden 5 gg de enzima purificada E6 y un 0,5 gg de enzima purificada E7, asi como NADPH (10 mM), y se detiene la reaccion tras 5, 10 y 20 minutos de incubacion a 30°C mediante adicion de 20 gl de cloroformo. La mezcla se agita a continuacion y se centrifuga 5 minutos a 16.000 g y temperatura ambiente. La fase acuosa se traslada a un nuevo recipiente de reaccion y la fase organica se extrae de nuevo con 80 gl de agua. Ambas fases acuosas se reunen y se analizan por medio de HPLC. En este caso se emplea una columna Phenosphere-ODS2 (250 x 4,6 mm; Phenomenex, Torrance, USA) o una columna Spheresorb-ODS2(250 x 4,6 mm; Waters, Milford, USA). La elucion de los analitos se efectua con una tasa de flujo de 1 ml min-1 con 0,5 M KH2PO4 (eluyente A) durante 15 minutos, seguido de un gradiente lineal hasta un 80 % de eluyente A y un 20 % de metanol durante un intervalo de tiempo de 14 minutos a una tasa de flujo de 0,7 ml min-1. Los analitos que se eluyen de la columna ODS2 se inyectan entonces en una columna de intercambio ionico Phenosphere-SAX (250 x 4,6 mm; Phenomenex, Torrance, USA) y los analitos se eluyen con una tasa de flujo de 1 ml min-1 y un gradiente lineal de formiato amonico (2 a 600 mM durante 25 min). La cuantificacion de dTDP-glucosa, dTDP-4-dehidro-6-deoxi-D-glucosa, dTDP-6-deoxi-L-manosa y dTDP-4-dehidro-6-deoxi-L-manosa se efectua entonces mediante su absorcion UV con un detector de ensayo de fotodiodos (DAD). El maximo de absorcion de timidina se situa en 267 nm. El calibrado se efectua por medio de azucar de nucleotido autentico (Sigma-Aldrich, Munchen, USA).

E4E5, E4E6, E4E7, E5E6, E5E7, E6E7, E4E5E6, E4E5E7, E5E6E7, E4E6E7, E4E5E6E7,

siendo especialmente preferente la combinacion

E4E5E6E7.

Segun la invencion puede ser ventajoso que la celula segun la invencion se modifique mediante tecnica genica en la biosintesis de acidos grasos, de modo que se intensifiquen las reacciones enzimaticas que conducen a la transformacion de acil-ACP y malonil-coenzima A en 3-cetoacil-ACP y/o a la transformacion de 3-cetoacil-ACP en (R)-3-hidroxialcanoil-ACP. De manera adicional o alternativa, puede ser ventajoso que la celula segun la invencion se modifique mediante tecnica genica en la biosintesis de acidos grasos, de modo que se debiliten las reacciones enzimaticas que conducen a la transformacion de (R)-3-hidroxialcanoil-ACP en trans-2-enoil-ACP y/o a transformacion de trans-2-enoil-ACP en acil-ACP.

Igualmente puede ser ventajoso que la celula segun la invencion se modifique mediante tecnica genica en la poxidacion de acidos grasos, de modo que se intensifiquen las reacciones enzimaticas que conducen a la transformacion de acil-coenzima A en trans-2-enoil-coenzima A y/o a la transformacion de trans-2-enoil-coenzima A en (S)-3-hidroxialcanoil-coenzima A. De manera alternativa o adicional, segun la invencion puede ser ventajoso que la celula segun la invencion se modifique mediante tecnica genica en la p-oxidacion de acidos grasos, de modo que se debiliten las reacciones enzimaticas que conducen a la transformacion de (S)-3-hidroxialcanoil-coenzima A en 3-cetoacil-coenzima A y/o a la transformacion de 3-cetoacil-coenzima A en acil-coenzima A y acetil-coenzima A.

Para una vision de conjunto vease la Figura 1.

Ya que las celulas segun la invencion se pueden emplear ventajosamente para la produccion de ramnolipidos, y ya que estos lipidos se purifican a continuacion en caso dado, es ventajoso que las celulas segun la invencion presenten una actividad de al menos una enzima E8 aumentada frente a su tipo salvaje, que cataliza la exportacion de un ramnolipido de la Formula general (I) de la celula al medio circundante.

En este contexto se seleccionan preferentemente proteinas E8 a partir del grupo constituido por una enzima E8 con la secuencia de polipeptidos Seq ID Nr. 8, Seq ID Nr. 24, Seq iD Nr. 26 o Seq ID Nr. 28, o con una secuencia de polipeptidos en la que hasta un 25 %, preferentemente hasta un 20 %, de modo especialmente preferente hasta un 15 % en peso, en especial hasta un 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % de los restos aminoacido se han modificado frente a la respectiva secuencia de referencia Seq ID Nr. 8, Seq ID Nr. 24, Seq ID Nr. 26 o Seq ID Nr. 28 mediante delecion, insercion, sustitucion, o una combinacion de las mismas, y que posee aun al menos un 50 %, preferentemente un 65 %, de modo especialmente preferente un 80 %, en especial mas de un 90 % de la actividad enzimatica de la enzima con la respectiva secuencia de referenda Seq ID Nr. 8, Seq ID Nr. 24, Seq ID Nr. 26 o Seq ID Nr. 28, entendiendose por actividad enzimatica para una enzima E8 la capacidad de exportar un ramnolipido de la Formula general (I) de la celula al medio circundante.

forma preferente de realizacion de celulas segun la invencion esta caracterizada por que presenta al menos uno de los acidos nucleicos o vectores segun la invencion citados mas abajo.

Las celulas segun la invencion se pueden emplear ventajosamente para la produccion de ramnolipidos.

Por consiguiente, se da a conocer el empleo de celulas segun la invencion para la produccion de compuestos de la Formula general (I).

Otro objeto de la presente invencion es un procedimiento para la produccion de ramnolipidos de la formula general (I),

siendo

m = 2, 1 o 0, en especial 1 o 0,

n = 1 o 0, en especial 1 ,

R1 y R2 = independientemente entre si, restos organicos iguales o diferentes independientemente entre si, con 2 a 24, preferentemente 5 a 13 atomos de carbono, en especial resto alquilo, en caso dado ramificado, en caso dado sustituido, en especial hidroxisustituido, en caso dado insaturado, en especial, en caso dado, mono-, di- o triinsaturado, preferentemente aquellos seleccionados a partir del grupo constituido por pentenilo, heptenilo, nonenilo, undecenilo y tridecenilo, y (CH2)o-CH3 con o = 1 a 23, preferentemente 4 a 12, que comprende los pasos de procedimiento

I) puesta en contacto de la celula segun la invencion con un medio que contiene una fuente de carbono,

II) cultivo de la celula bajo condiciones que posibilitan a la celula formar el ramnolipido a partir de la fuente de carbono, y

III) en caso dado aislamiento de los ramnolipidos formados.

Las celulas modificadas mediante tecnica genica segun la invencion se pueden poner en contacto y, por consiguiente, cultivar con el medio nutriente continua o discontinuamente en procedimiento por cargas (cultivo discontinuo) o en procedimiento de cargas de alimentacion (procedimiento de alimentacion), o procedimiento de carga de alimentacion reiterada (procedimiento de alimentacion repetitiva) para la produccion de los productos citados anteriormente. Tambien es concebible un procedimiento semicontinuo, como se describe en el GB-A-1009370. Se describe una sinopsis sobre metodos de cultivo conocidos en el manual de Chmiel ("Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik" (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) o en el manual de Storhas ("Bioreaktoren und periphere Einrichtungen", editorial Vieweg, Braunschweig/Wiesbaden, 1994).

El medio de cultivo a emplear debe cumplir los requisitos de las respectivas cepas de modo apropiado. Se incluyen descripciones de medios de cultivo de diversas cepas de levadura, a modo de ejemplo, en "Nonconventional yeast in biotechnology" (Ed. Klaus Wolf, editorial Springer Berlin, 1996).

Como fuente de carbono se pueden emplear hidratos de carbono, como por ejemplo glucosa, sacarosa, arabinosa, xilosa, lactosa, fructosa, maltosa, melasa, almidon, celulosa y hemicelulosa, aceites y grasas vegetales y animales, como por ejemplo aceite de soja, aceite de cardo, aceite de cacahuete, aceite de canamo, aceite de jatropa, grasa de coco, aceite de semillas de calabaza, aceite de linaza, aceite de maiz, aceite de amapola, aceite de onagra, aceite de oliva, aceite de semillas de palmiste, aceite de palma, aceite de colza, aceite de sesamo, aceite de girasol, aceite de semillas de uva, aceite de nuez, aceite de germen de trigo y aceite de coco, acidos grasos, como por ejemplo acido caprilico, acido caprinico, acido laurico, acido miristico, acido palmitico, acido palmitoleico, acido estearico, acido araquidonico, acido behenico, acido oleico, acido linoleico, acido linolenico, acido gamma-linolenico, y sus esteres metilicos o etilicos, asi como mezclas de acidos grasos, mono-, di- y trigliceridos con los acidos grasos que se acaban de mencionar, alcoholes, como por ejemplo glicerina, etanol y metanol, hidrocarburos, como metano, gases que contienen carbono y mezclas de gases, como CO, CO2, gas de sintesis o de humo, aminoacidos, como L-glutamato o L-valina, o acidos organicos, como por ejemplo acido acetico. Estas sustancias se pueden emplear por separado o como mezcla. Es especialmente preferente el empleo de hidratos de carbono, en especial de monosacaridos, oligosacaridos o polisacaridos, como fuente de carbono, tal como se describe en los documentos US 6,01,494 y US 6,136,576, asi como de hidrocarburos, en especial de alcanos, alquenos y alquinos, asi como los acidos monocarboxilicos derivados de los mismos, y los mono-, di- y trigliceridos derivados de estos acidos monocarboxilicos, asi como de glicerina y acetato. Son muy especialmente preferentes mono-, di- y trigliceridos que contienen los productos de esterificacion de glicerina con acido caprilico, acido caprinico, acido laurico, acido miristico, acido palmitico, acido palmitoleico, acido estearico, acido araquidonico, acido behenico, acido oleico, acido linoleico, acido linolenico y/o acido gamma-linolenico.

Una gran ventaja de la presente invencion consiste en que las celulas segun la invencion pueden formar ramnolipidos de las mas simples fuentes de carbono, como por ejemplo glucosa, sacarosa o glicerina, de modo que no es necesaria una puesta a disposicion de fuentes de C de cadena mas larga en el medio durante el procedimiento segun la invencion. Por consiguiente, en el caso de disponibilidad escasa es ventajoso que el medio no contenga, o no contenga cantidades identificables de acidos carboxilicos con una longitud de cadena de mas de seis atomos de carbono, o esteres o gliceridos derivables de estos, en el paso I) del procedimiento segun la invencion.

Como fuente de nitrogeno se pueden emplear compuestos organicos nitrogenados, como peptonas, extracto de levadura, extracto de pescado, extracto de malta, agua de remojo de maiz, harina de habas de soja y urea, o compuestos inorganicos, como sulfato amonico, cloruro amonico, fosfato amonico, carbonato amonico y nitrato amonico. Las fuentes de nitrogeno se pueden emplear por separado o como mezcla.

Como fuente de fosforo pueden estar contenidos acido fosforico, dihidrogenofosfato potasico o hidrogenofosfato dipotasico, o las correspondientes sales que contienen sodio, en el medio nutriente. El medio de cultivo debe contener ademas sales de metales, como por ejemplo sulfato de magnesio o sulfato de hierro, que son necesarios para el crecimiento. Finalmente se pueden emplear substancias de crecimiento esenciales, como aminoacidos y vitaminas, adicionalmente a las substancias citadas anteriormente. Ademas se pueden anadir precursores apropiados al medio de cultivo. Las citadas substancias de empleo se pueden anadir al cultivo en forma de una unica carga, o alimentar de modo apropiado durante el cultivo.

Para el control de pH del cultivo se emplean compuestos basicos, como hidroxido sodico, hidroxido potasico, amoniaco, o bien agua amoniacal, o compuestos acidos, como acido fosforico o acido sulfurico, de modo apropiado. Para el control del espumado se pueden emplear agentes antiespumantes, como por ejemplo poliglicolesteres de acidos grasos. Para el mantenimiento de la estabilidad de plasmidos se pueden anadir al medio substancias de accion selectiva apropiadas, como por ejemplo antibioticos. Para mantener condiciones aerobias se introducen en el cultivo oxigeno o mezclas de gases que contienen oxigeno, como por ejemplo aire.

La temperatura del cultivo se situa normalmente en mas de 20°C, preferentemente en mas de 25°C, esta puede ascender tambien a mas de 40°C, no sobrepasandose ventajosamente una temperatura de cultivo de 95°C, de modo especialmente preferente 90°C, y del modo mas preferente 80°C.

En el paso III) del procedimiento segun la invencion, los ramnolipidos formados por las celulas se pueden aislar de las celulas y/o del medio nutriente en caso dado, entrando en consideracion para el aislamiento todos los metodos conocidos por el especialista para el aislamiento de sustancias de bajo peso molecular a partir de composiciones complejas, como por ejemplo filtracion, extraccion, adsorcion (cromatografia) o cristalizacion.

Ademas, la fase de producto contiene restos de biomasa y diferentes impurezas, como aceites, acidos grasos y otros componentes de medios nutrientes. La separacion de impurezas se efectua preferentemente en un proceso exento de disolvente. De este modo, por ejemplo, se puede diluir la fase de producto con agua para facilitar el ajuste del valor de pH. A continuacion se pueden homogeneizar la fase de producto y la fase acuosa transformandose los ramnolipidos en una forma hidrosoluble mediante reduccion o aumento del valor de pH mediante acidos o bases. Potencialmente se puede apoyar la solubilizacion de ramnolipidos en la fase acuosa mediante incubacion a temperaturas elevadas, por ejemplo a 60 hasta 90°C, y mezclado constante. Mediante aumento o reduccion subsiguiente del valor de pH mediante bases o acidos se pueden transformar los ramnolipidos de nuevo en una forma hidrosoluble, de modo que se pueden separar facilmente de la fase acuosa. La fase de producto se puede lavar entonces una o varias veces con agua para eliminar impurezas hidrosolubles.

Los restos de aceite se pueden separar, a modo de ejemplo, mediante extraccion por medio de disolventes apropiados, ventajosamente por medio de disolventes organicos. Como disolvente se emplea preferentemente un alcano, como por ejemplo n-hexano. La separacion del producto de la fase acuosa se puede efectuar, alternativamente al proceso exento de disolvente descrito con anterioridad, con un disolvente apropiado, por ejemplo un ester, como por ejemplo acetato de etilo o acetato de butilo. Los citados pasos de extraccion se pueden llevar a cabo en cualquier orden.

En este caso se emplean preferentemente disolventes, en especial disolventes organicos. Como disolvente es preferente n-pentanol. Para la eliminacion del disolvente se efectua, a modo de ejemplo, una destilacion. A continuacion se puede purificar ulteriormente el producto liofilizado, a modo de ejemplo por medio de metodos cromatograficos. En este punto citese a modo de ejemplo la precipitacion por medio de disolventes apropiados, la extraccion por medio de disolventes apropiados, la complejacion, a modo de ejemplo por medio de ciclodextrinas o derivados de ciclodextrina, la cristalizacion, o bien aislamiento por medio de metodos cromatograficas, o la transformacion de ramnolipidos en derivados facilmente separables.

Se dan a conocer los ramnolipidos que se pueden producir con el procedimiento segun la invencion, en especial tambien las mezclas de ramnolipidos descritas anteriormente, que se pueden producir con el procedimiento segun la invencion.

Los ramnolipidos y las mezclas que se pueden producir con el procedimiento segun la invencion se pueden emplear ventajosamente en agentes de limpieza, en formulaciones cosmeticas o farmaceuticas, asi como en formulaciones fitosanitarias.

Por consiguiente se da a conocer el empleo de los ramnolipidos obtenidos con el procedimiento segun la invencion para la produccion de formulaciones cosmeticas, dermatologicas o farmaceuticas, de formulaciones fitosanitarias, asi como de agentes de tratamiento y limpieza y concentrados de agentes tensioactivos.

En este caso, bajo el concepto "agente de tratamiento" se entiende una formulacion que cumpla el fin de obtener un objeto en su forma original, reducir o evitar los efectos de influencias externas (por ejemplo tiempo, luz, temperatura, presion, contaminacion, reaccion quimica con otros compuestos reactivos que entran en contacto con el objeto), como por ejemplo envejecimiento, contaminacion, fatiga de materiales, decoloracion, o incluso mejorar las propiedades positivas del objeto deseadas. Como ultimo punto citese, por ejemplo, una brillo dle cabello mejorado o una mayor elasticidad del objeto considerado.

Se entiende por “formulacion fitosanitaria“ aquellas formulaciones que se emplean obviamente para la proteccion fitosanitaria segun su tipo de preparacion; este es el caso en especial si en la formulacion esta contenido al menos un compuesto de las clases de herbicidas, fungicidas, insecticidas, acaricidas, nematicidas, protectores contra picadura de pajaros, nutrientes vegetales y rectificadores de la estructura del suelo.

Los ramnolipidos producidos con el procedimiento segun la invencion se pueden emplear en agentes de tratamiento y limpieza para el sector domestico, industria, en especial para superficies duras, cuero o materiales textiles.

Contribuye a la solucion de la tarea una celula segun la invencion que contiene un acido nucleico aislado, que presenta al menos, en cada caso, una secuencia seleccionada a partir de los tres grupos [A1 a G1], [A2 a G2] y [A3 a G3], estando constituido el grupo [A1 a G1] por las siguientes secuencias:

A1a) una secuencia segun Seq ID Nr. 1, codificando esta secuencia para una proteina que puede transformar 3-hidroxidecanoil-ACP a traves de 3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoil-ACP en acido 3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico,

B1a) una secuencia exenta de intron, que es derivada de una secuencia segun A1a) y codifica la misma proteina o el mismo peptido que la secuencia segun Seq ID Nr. 1,

C1 a) una secuencia que codifica una proteina o un peptido que comprende la secuencia de aminoacidos segun Seq ID Nr. 2, y que puede transformar preferentemente 3-hidroxidecanoil-ACP a traves de 3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoil-ACP en acido 3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico,

D1a) una secuencia que es identica a una secuencia segun uno de los grupos A1a) a C1a), de modo especialmente preferente segun el grupo A1a), en al menos un 70 %, de modo especialmente preferente en al menos un 90 %, ademas preferentemente en al menos un 95 %, y del modo mas preferente en al menos un 99 %, codificando esta secuencia preferentemente para una proteina o un peptido que puede transformar 3-hidroxidecanoil-ACP a traves de 3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoil-ACP en acido 3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico,

E1a) una secuencia que hibrida con la contrahebra de una secuencia segun uno de los grupos A1a) a D1a), de modo especialmente preferente segun el grupo A1a), o hibridaria bajo consideracion de la degeneracion del codigo genetico, pudiendo codificar esta secuencia para una proteina o un peptido que puede transformar 3-hidroxidecanoil-ACP a traves de 3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoil-ACP en acido 3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico,

F1a) un derivado, obtenido mediante sustitucion, adicion, inversion y/o delecion de al menos una base, preferentemente de al menos 2 bases, ademas preferentemente de al menos 5 bases, y del modo mas preferente al menos 10 bases, pero no mas de 100 bases, de modo especialmente preferente no mas de 50 bases, y del modo mas preferente no mas de 25 bases, de una secuencia segun uno de los grupos A1a) a E1a), de modo especialmente preferente segun el grupo A1a), codificando este derivado preferentemente para una proteina o peptido, que puede transformar 3-hidroxidecanoil-ACP a traves de 3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoil-ACP en acido 3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico,

G1a) una secuencia complementaria a una secuencia segun uno de los grupos A1 a) a F1 a), de modo especialmente preferente segun el grupo A1a),

A1b) una secuencia segun Seq ID Nr. 17, codificando esta secuencia para una proteina que puede transformar 3-hidroxitetradecanoil-ACP a traves de 3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoil-ACP en acido 3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico,

B1b) una secuencia exenta de intron, que es derivada de una secuencia segun A1b) y codifica la misma proteina o el mismo peptido que la secuencia segun Seq ID Nr. 17,

C1b) una secuencia que codifica una proteina o un peptido que comprende la secuencia de aminoacidos segun Seq ID Nr. 18, y que puede transformar preferentemente 3-hidroxitetradecanoil-ACP a traves de 3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoil-ACP en acido 3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico,

D1b) una secuencia que es identica a una secuencia segun uno de los grupos A1b) a C1b), de modo especialmente preferente segun el grupo A1b), en al menos un 70 %, de modo especialmente preferente en al menos un 90 %, ademas preferentemente en al menos un 95 %, y del modo mas preferente en al menos un 99 %, codificando esta secuencia preferentemente para una proteina o un peptido que puede transformar 3-hidroxitetradecanoil-ACP a traves de 3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoil-ACP en acido 3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico,

E1b) una secuencia que hibrida con la contrahebra de una secuencia segun uno de los grupos A1b) a D1b), de modo especialmente preferente segun el grupo A1b), o hibridaria bajo consideracion de la degeneracion del codigo genetico, pudiendo codificar esta secuencia para una proteina o un peptido que puede transformar 3-hidroxitetradecanoil-ACP a traves de 3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoil-ACP en acido 3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico,

F1b) un derivado, obtenido mediante sustitucion, adicion, inversion y/o delecion de al menos una base, preferentemente de al menos 2 bases, ademas preferentemente de al menos 5 bases, y del modo mas preferente al menos 10 bases, pero no mas de 100 bases, de modo especialmente preferente no mas de 50 bases, y del modo mas preferente no mas de 25 bases, de una secuencia segun uno de los grupos A1b) a E1b), de modo especialmente preferente segun el grupo A1b), codificando este derivado preferentemente para una proteina o peptido, que puede transformar 3-hidroxitetradecanoil-ACP a traves de 3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoil-ACP en acido 3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico, y

G1b) una secuencia complementaria a una secuencia segun uno de los grupos A1 b) a F1 b), de modo especialmente preferente segun el grupo A1b), y

estando constituido el grupo [A2 a G2] por las siguientes secuencias:

A2a) una secuencia segun Seq ID Nr. 3, codificando esta secuencia para una proteina que puede transformar dTDP-ramnosa y acido 3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico en acido a-L-ramnopiranosil-3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico,

B2a) una secuencia exenta de intron, que es derivada de una secuencia segun A2a) y codifica la misma proteina o el mismo peptido que la secuencia segun Seq ID Nr. 3,

C2a) una secuencia que codifica una proteina o un peptido que comprende la secuencia de aminoacidos segun Seq ID Nr. 4, y que puede transformar preferentemente dTDP-ramnosa y acido 3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico en acido a-L-ramnopiranosil-3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico,

D2a) una secuencia que es identica a una secuencia segun uno de los grupos A2a) a C2a), de modo especialmente preferente segun el grupo A2a), en al menos un 80 %, de modo especialmente preferente en al menos un 90 %, ademas preferentemente en al menos un 95 %, y del modo mas preferente en al menos un 99 %, codificando esta secuencia preferentemente para una proteina o un peptido que puede transformar dTDP-ramnosa y acido 3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico en acido a-L-ramnopiranosil-3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico,

E2a) una secuencia que hibrida con la contrahebra de una secuencia segun uno de los grupos A2a) a D2a), de modo especialmente preferente segun el grupo A2a), o hibridaria bajo consideracion de la degeneracion del codigo genetico, pudiendo codificar esta secuencia para una proteina o un peptido que puede transformar dTDP-ramnosa y acido 3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico en acido a-L-ramnopiranosil-3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico,

F2a) un derivado, obtenido mediante sustitucion, adicion, inversion y/o delecion de al menos una base, preferentemente de al menos 2 bases, ademas preferentemente de al menos 5 bases, y del modo mas preferente al menos 10 bases, pero no mas de 100 bases, de modo especialmente preferente no mas de 50 bases, y del modo mas preferente no mas de 25 bases, de una secuencia segun uno de los grupos A2a) a E2a), de modo especialmente preferente segun el grupo A2a), codificando este derivado preferentemente para una proteina o peptido, que puede transformar dTDP-ramnosa y acido 3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico en acido a-L-ramnopiranosil-3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico,

G2a) una secuencia complementaria a una secuencia segun uno de los grupos A2a) a F2a), de modo especialmente preferente segun el grupo A2a),

A2b) una secuencia segun Seq ID Nr. 19, codificando esta secuencia para una proteina que puede transformar dTDP-ramnosa y acido 3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico en acido a-L-ramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico,

B2b) una secuencia exenta de intron, que es derivada de una secuencia segun A2b) y codifica la misma proteina o el mismo peptido que la secuencia segun Seq ID Nr. 19,

C2b) una secuencia que codifica una proteina o un peptido que comprende la secuencia de aminoacidos segun Seq ID Nr. 20, y que puede transformar preferentemente dTDP-ramnosa y acido 3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico en acido a-L-ramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico,

D2b) una secuencia que es identica a una secuencia segun uno de los grupos A2b) a C2b), de modo especialmente preferente segun el grupo A2b), en al menos un 70 %, de modo especialmente preferente en al menos un 90 %, ademas preferentemente en al menos un 95 %, y del modo mas preferente en al menos un 99 %, codificando esta secuencia preferentemente para una proteina o un peptido que puede transformar dTDP-ramnosa y acido 3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico en acido a-L-ramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico,

E2b) una secuencia que hibrida con la contrahebra de una secuencia segun uno de los grupos A2b) a D2b), de modo especialmente preferente segun el grupo A2b), o hibridaria bajo consideracion de la degeneracion del codigo genetico, pudiendo codificar esta secuencia para una proteina o un peptido que puede transformar dTDP-ramnosa y acido 3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico en acido a-L-ramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico,

F2b) un derivado, obtenido mediante sustitucion, adicion, inversion y/o delecion de al menos una base, preferentemente de al menos 2 bases, ademas preferentemente de al menos 5 bases, y del modo mas preferente al menos 10 bases, pero no mas de 100 bases, de modo especialmente preferente no mas de 50 bases, y del modo mas preferente no mas de 25 bases, de una secuencia segun uno de los grupos A2b) a E2b), de modo especialmente preferente segun el grupo A2b), codificando este derivado preferentemente para una proteina o peptido, que puede transformar dTDP-ramnosa y acido 3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico en acido a-L-ramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico, y

G2b) una secuencia complementaria a una secuencia segun uno de los grupos A2b) a F2b), de modo especialmente preferente segun el grupo A2b),

y estando constituido el grupo [A3 a G3] por las siguientes secuencias:

A3a) una secuencia segun Seq ID Nr. 5, codificando esta secuencia para una proteina que puede transformar dTDP-ramnosa y acido a-L-ramnopiranosil-3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico en acido a-L-ramnopiranosil-(1-2)-a-L-ramnopiranosil-3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico,

B3a) una secuencia exenta de intron, que es derivada de una secuencia segun A3a) y codifica la misma proteina o el mismo peptido que la secuencia segun Seq ID Nr. 5,

C3a) una secuencia que codifica una proteina o un peptido que comprende la secuencia de aminoacidos segun Seq ID Nr. 6, y que puede transformar preferentemente dTDP-ramnosa y acido-a-L-ramnopiranosil-3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico en acido a-L-ramnopiranosil-(1-2)-a-L-ramnopiranosil-3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico,

D3a) una secuencia que es identica a una secuencia segun uno de los grupos A3a) a C3a), de modo especialmente preferente segun el grupo A3a), en al menos un 80 %, de modo especialmente preferente en al menos un 90 %, ademas preferentemente en al menos un 95 %, y del modo mas preferente en al menos un 99 %, codificando esta secuencia preferentemente para una proteina o un peptido que puede transformar dTDP-ramnosa y acido-a-L-ramnopiranosil-3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico en acido a-L-ramnopiranosil-(1-2)-a-L-ramnopiranosil-3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico,

E3a) una secuencia que hibrida con la contrahebra de una secuencia segun uno de los grupos A3a) a D3a), de modo especialmente preferente segun el grupo A3a), o hibridaria bajo consideracion de la degeneracion del codigo genetico, pudiendo codificar esta secuencia para una proteina o un peptido que puede transformar dTDP-ramnosa y acido a-L-ramnopiranosil-3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico en acido a-L-ramnopiranosil-(1-2)-a-L-ramnopiranosil-3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico,

F3a) un derivado, obtenido mediante sustitucion, adicion, inversion y/o delecion de al menos una base, preferentemente de al menos 2 bases, ademas preferentemente de al menos 5 bases, y del modo mas preferente al menos 10 bases, pero no mas de 100 bases, de modo especialmente preferente no mas de 50 bases, y del modo mas preferente no mas de 25 bases, de una secuencia segun uno de los grupos A3a) a E3a), de modo especialmente preferente segun el grupo A3a), codificando este derivado preferentemente para una proteina o peptido que puede transformar dTDP-ramnosa y acido a-L-ramnopiranosil-3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico en acido a-L-ramnopiranosil-(1-2)-a-L-ramnopiranosil-3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico,

G3a) una secuencia complementaria a una secuencia segun uno de los grupos A3a) a F3a), de modo especialmente preferente segun el grupo A3a),

A3b) una secuencia segun Seq ID Nr. 21, codificando esta secuencia para una proteina que puede transformar dTDP-ramnosa y acido a-L-ramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico en acido a-L-ramnopiranosil-(1-2)-a-L-ramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico,

B3b) una secuencia exenta de intron, que es derivada de una secuencia segun A3b) y codifica la misma proteina o el mismo peptido que la secuencia segun Seq ID Nr. 21,

C3b) una secuencia que codifica una proteina o un peptido que comprende la secuencia de aminoacidos segun Seq ID Nr. 22, y que puede transformar preferentemente dTDP-ramnosa y acido a-L-ramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico en acido a-L-ramnopiranosil-(1-2)-a-L-ramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico,

D3b) una secuencia que es identica a una secuencia segun uno de los grupos A3b) a C3b), de modo especialmente preferente segun el grupo A3b), en al menos un 60 %, de modo especialmente preferente en al menos un 90 %, ademas preferentemente en al menos un 95 %, y del modo mas preferente en al menos un 99 %, codificando esta secuencia preferentemente para una proteina o un peptido que puede transformar dTDP-ramnosa y acido a-L-ramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico en acido a-L-ramnopiranosil-(1-2)-a-L-ramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico,

E3b) una secuencia que hibrida con la contrahebra de una secuencia segun uno de los grupos A3b) a D3b), de modo especialmente preferente segun el grupo A3b), o hibridaria bajo consideracion de la degeneracion del codigo genetico, pudiendo codificar esta secuencia para una proteina o un peptido que puede transformar dTDP-ramnosa y acido a-L-ramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico en acido a-L-ramnopiranosil-(1-2)-a-L-ramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico,

F3b) un derivado, obtenido mediante sustitucion, adicion, inversion y/o delecion de al menos una base, preferentemente de al menos 2 bases, ademas preferentemente de al menos 5 bases, y del modo mas preferente al menos 10 bases, pero no mas de 100 bases, de modo especialmente preferente no mas de 50 bases, y del modo mas preferente no mas de 25 bases, de una secuencia segun uno de los grupos A3b) a E3b), de modo especialmente preferente segun el grupo A3b), codificando este derivado preferentemente para una proteina o peptido que puede transformar dTDP-ramnosa y acido a-L-ramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico en acido a-L-ramnopiranosil-(1 -2)-a-L-ramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico, y

G3b) una secuencia complementaria a una secuencia segun uno de los grupos A3b) a F3b), de modo especialmente preferente segun el grupo A3b).

La "identidad de nucleotido" o la "identidad de aminoacido" se determina con ayuda de procedimientos conocidos en este caso. En general se emplean programas informaticos especiales con algoritmos, bajo consideracion de requisitos especiales.

Los procedimientos preferentes para la determinacion de la identidad generan en primer lugar la mayor coincidencia entre las secuencias a comparar. Los programas informaticos para la determinacion de la identidad comprenden el paquete de programas GCG, incluyendo GAP, pero no estan limitados al mismo (Deveroy, J. et al., Nucleic Acid Research 12 (1984), pagina 387, Genetics Computer Group University of Wisconsin, Medicine (Wi), y BLASTP, BLASTN y Fa StA (Altschul, S. et al., Journal of Molecular Biology 215 (1990), paginas 403-410. El programa BLAST se puede conseguir en el National Center For Biotechnology Information (NCBI) y a partir de otras fuentes (BLAST Handbuch, Altschul S. et al., NCBI NLM NIH Bethesda ND 22894; Altschul S. et al., vease mas arriba).

El conocido algoritmo de Smith-Waterman se puede emplear igualmente para la determinacion de la identidad de nucleotido.

En el caso de empleo del programa BLASTN (Altschul, S. et al., Journal of Molecular Biology 215 (1990), paginas 403-410, los parametros preferentes para la determinacion de la "identidad de nucleotido" son:

Umbral esperado: 10

Tamano de palabra: 28

Resultado de coincidencia: 1

Resultado de divergencia: -2

Costes de diferencia: Linear

Los anteriores parametros son los parametros estandar en comparacion con la secuencia de nucleotidos. El programa GAP es igualmente apropiado para empleo con los anteriores parametros.

En el caso de empleo del programa BLASTN (Altschul, S. et al., Journal of Molecular Biology 215 (1990), paginas 403-410, los parametros preferentes para la determinacion de la "identidad de aminoacido" son:

Umbral esperado: 10

Tamano de palabra: 3

Matriz: BLOSUM62

Costes de diferencia: Existence: 11; Extension: 1

Ajustes en la composicion: Ajuste de matriz de resultado condicional composicional

Los anteriores parametros son los parametros estandar en comparacion con la secuencia de aminoacidos. El programa GAP es igualmente apropiado para empleo con los anteriores parametros.

Una identidad de un 60 % segun el anterior algoritmo significa un 60 % de identidad en el contexto de la presente invencion. Se considera lo mismo para identidades superiores.

La caracteristica "secuencia que hibrida con la contrahebra de una secuencia, o hibridaria bajo consideracion de la degeneracion del codigo genetico" indica una secuencia que hibrida, bajo condiciones preferentemente restrictivas, con la contrahebra de una secuencia de referencia, o hibridaria bajo consideracion de la degeneracion del codigo genetico. A modo de ejemplo, las hibridaciones se pueden llevar a cabo a 68°C en 2 x SSC o segun el protocolo del kit de marcaje de digoxigenina de la firma Boehringer (Mannheim). Las condiciones de hibridacion preferentes son, por ejemplo, incubacion a 65°C durante la noche en 7% de SDS, 1 % de BSA, 1 mM EDTA, 250 mM tampon fosfato sodico (pH 7,2) y subsiguiente lavado a 65°C con 2 x SSC; 0,1 % SDS.

A los derivados de ADN aislado segun la invencion, que se pueden obtener segun alternativas F1), F2) o F3) mediante sustitucion, adicion, inversion y/o delecion de una o varias bases de una secuencia segun uno de los grupos A1) a E1), A2) a E2) y A3) a E3), pertenecen en especial aquellas secuencias que conducen a intercambios de aminoacido conservadores, como por ejemplo el intercambio de glicina por alanina o de acido aspartico por acido glutamico en la proteina que codifican. Tales mutaciones neutras en funcion se denominan mutaciones sin cambio de sentido (sense mutations), y no conducen a una modificacion basica de la actividad del polipeptido. Ademas es sabido que la presente invencion comprende modificaciones en el extremo N y/o C de un polipeptido no influyen esencialmente en su funcion, o incluso pueden estabilizar esta, de modo que tambien se anaden correspondientemente secuencias de ADN en las que se anaden bases en el extremo 3‘ o en el extremo 5‘ de la secuencia con los acidos nucleicos segun la invencion. El especialista encuentra datos a tal efecto, entre otros, en Ben-Bassat et al. (Journal of Bacteriology 169:751-757 (1987)), en O'Regan et al. (Gene 77:237-251 (1989)), en Sahin-Toth et al. (Protein Sciences 3:240-247 (1994)), en Hochuli et al. (Bio/Technology 6:1321-1325 (1988)) y en libros de texto de genetica y biologia molecular conocidos.

El acido nucleico contenido segun la invencion es preferentemente un vector, en especial un vector de expresion o un cassette de sobreexpresion genica. Como vectores entran en consideracion todos los vectores conocidos por el especialista, que se emplean habitualmente para la inclusion de ADN en una celula huesped. Estos vectores se pueden replicar tanto de manera autonoma, ya que poseen origenes de replicacion, como por ejemplo los del plasmido 2g o ARS (secuencias replicativas de manera autonoma), o se integran en los cromosomas (plasmidos no replicativos). Tambien se entiende por vectores fragmentos de ADN lineales que no poseen ningun tipo de origenes de replicacion, como por ejemplo cassettes de insercion genica o de sobreexpresion genica.

Los cassettes de sobreexpresion genica estan constituidos habitualmente por un marcador, los genes a sobreexprimir, asi como zonas reguladoras relevantes para la expresion de los genes, como por ejemplo promotores y terminadores. Los vectores preferentes se seleccionan a partir del grupo que comprende plasmidos y cassettes, como por ejemplo plasmidos transportadores de levadura de E. Coli, siendo especialmente preferentes vectores de expresion, cassettes de insercion genica o sobreexpresion genica, en especial los vectores descritos mas abajo Seq ID Nr. 38, Seq ID Nr. 40, Seq ID Nr. 42, Seq ID Nr. 45 y Seq ID Nr. 47.

Segun una forma preferente de realizacion del vector contenido segun la invencion, las secuencias de los grupos [A1 a G1], [A2 a G2] y [A3 a G3] estan bajo el control de al menos un promotor constitutivo o regulable, que es apropiado para la expresion del polipeptido codificado por estas secuencias de ADN en la celula de un microorganismo, preferentemente una celula bacteriana, de levadura o fungica, siendo especialmente preferentes Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Alcaligenes latus, Bacillus megaterium, Bacillus subtilis, Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum, Burkholderia andropogonis, B. brasilensis, B. caledonica, B. caribensis, B. caryophylli, B. fungorum, B. gladioli, B. glathei, B. glumae, B. graminis, B. hospita, B. kururiensis, B. phenazinium, B. phymatum, B. phytofirmans, B. plantarii, B. sacchari, B. singaporensis, B. sordidicola, B. terricola, B. tropica, B. tuberum, B. ubonensis, B. unamae, B. xenovorans, B. anthina, B. pyrrocinia, B. thailandensis, Candida blankii, Candida rugosa, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium efficiens, Escherichia coli, Hansenula polymorpha, Kluveromyces lactis, Methylobacterium extorquens, Paracoccus versutus, Pseudomonas argentinensis, P. borbori, P. citronellolis, P. flavescens, P. mendocina, P. nitroreducens, P. oleovorans, P. pseudoalcaligenes, P. resinovorans, P. straminea, P. aurantiaca, P. aureofaciens, P. chlororaphis, P. fragi, P. lundensis, P. taetrolens, P. antarctica, P. azotoformans, 'P. blatchfordae', P. brassicacearum, P. brenneri, P. cedrina, P. corrugata, P. fluorescens, P. gessardii, P. libanensis, P. mandelii, P. marginalis, P. mediterranea, P. meridiana, P. migulae, P. mucidolens, P. orientalis, P. panacis, P. proteolytica, P. rhodesiae, P. synxantha, P. thivervalensis, P. tolaasii, P. veronii, P. denitrificans, P. pertucinogena, P. cremoricolorata, P. fulva, P. monteilii, P. mosselii, P. parafulva, P. putida, P. balearica, P. stutzeri, P. amygdali, P. avellanae, P. caricapapayae, P. cichorii, P. coronafaciens, P. ficuserectae, 'P. helianthi', P. meliae, P. savastanoi, P. syringae, P. tomato, P. viridiflava, P. abietaniphila, P. acidophila, P. agarici, P. alcaliphila, P. alkanolytica, P. amyloderamosa, P. asplenii, P. azotifigens, P. cannabina, P. coenobios, P. congelans, P. costantinii, P. cruciviae, P. delhiensis, P. excibis, P. extremorientalis, P. frederiksbergensis, P. fuscovaginae, P. gelidicola, P. grimontii, P. indica, P. jessenii, P. jinjuensis, P. kilonensis, P. knackmussii, P. koreensis, P. lini, P. lutea, P. moraviensis, P. otitidis, P. pachastrellae, P. palleroniana, P. papaveris, P. peli, P. perolens, P. poae, P. pohangensis, P. psychrophila, P. psychrotolerans, P. rathonis, P. reptilivora, P. resiniphila, P. rhizosphaerae, P. rubescens, P. salomonii, P. segitis, P. septica, P. simiae, P. suis, P. thermotolerans, P. aeruginosa, P. tremae, P. trivialis, P. turbinellae, P. tuticorinensis, P. umsongensis, P. vancouverensis, P. vranovensis, P. xanthomarina, Ralstonia eutropha, Rhodospirillum rubrum, Rhodobacter sphaeroides, Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica, Zymomonas mobilis, en especial Pseudomonas putida, Escherichia coli y Burkholderia thailandensis. Son ejemplos de promotores constitutivos lac, lacUV5, tac, trc (respectivamente en ausencia del represor LacI en las celulas segun la invencion), Ltet-O1 (en ausencia del represor TetR en las celulas segun la invencion), T5 y gap.

Son ejemplos de promotores inducibles lac, lacUV5, tac, trc (respectivamente en presencia del represor Lacl en las celulas segun la invencion) Ltet-O1 (en presencia del represor TetR en las celulas segun la invencion), T5 (en combinacion con un operador lac y en presencia del represor Lacl en las celulas segun la invencion), SP6 y T7 (en presencia del gen que codifica la ARN-polimerasa cognada, cuya expresion es regulable por su parte). El vector contenido segun la invencion debia comprender preferentemente un punto de enlace ribosomico, asi como un terminador, ademas de un promotor. En este caso es especialmente preferente que el acido nucleico contenido segun la invencion este incorporado en un cassette de expresion del vector que comprende el promotor, el punto de enlace ribosomico y el terminador. Por lo demas, ademas de los elementos estructurales citados anteriormente, el vector puede comprender genes de seleccion conocidos por el especialista.

Si no se indica lo contrario, todos los porcentajes indicados (%) son porcentaje en masa. En los ejemplos enumerados a continuacion se describe la presente invencion de manera ejemplar, sin que la invencion, cuyo espectro de aplicacion resulta de la descripcion total y las reivindicaciones, se deba limitar a las formas de realizacion citadas en los ejemplos.

Breve descripcion de las figuras:

Figura 1: biosintesis de acidos grasos, p-oxidacion de acidos grasos y enlace de estas vias metabolicas con la biosintesis de ramnolipidos (enzimas E1, E2 y E3) y polihidroxialcanoatos (enzimas Eg y E10). Se representan flujos de carbono en biosintesis de acidos grasos, p-oxidacion de acidos grasos, biosintesis de ramnolipidos y biosintesis de polihidroxialcanoato. No se muestran consumo y formacion de coenzimas, equivalentes redox, asi como nucleotidos.

Figura 2: formacion de dirramnolipidos (mg/l/OD 600 nm) de las cepas recombinantes P. putida KT2440 pBBR1 MCS-2 y pBBR1 MCS-2::ABC, asi como GPp104 pBBR1 MCS-2 y pBBR1 MCS-2::ABC tras 48 h, 72 h y 96 h de cultivo en medio CMP. El analisis de la concentracion de ramnolipidos se efectuo por medio de HPLC.

Figura 3: formacion de monorramnolipidos (superficie de pico/OD 600 nm) de las cepas recombinantes P. putida KT2440 pBBR1 MCS-2, pBBR1 MCS-2::AB y pBBR1 MCS-2::ABM, asi como GPp104 pBBR1 MCS-2, pBBR1 MCS-2::AB y pBBR1MCS-2::ABM tras 48 h, 72 h y 96 h de cultivo en medio CMP. El analisis de la concentracion de ramnolipidos se efectuo por medio de HPLC.

Ejemplos

1. Construccion de un vectorpBBR1MCS-2::AB para la expresion heterologa de genes de Pseudomonas aeruginosa 1707 rhlA y rhlB en Pseudomonas putida

Para la expresion heterologa de genes de Pseudomonas aeruginosa DSM1707 rhlA y rhlB se construyo el plasmido pBBR1MCS-2::AB (Seq ID Nr. 38). A tal efecto se sintetizo el operon sintetico rhlAB (Seq ID Nr. 37) de la firma GeneArt AG (Regensburg) y se interclono en el vector comercial pMA (GeneArt AG). La base para la sintesis era la secuencia genomica ya conocida de Pseudomonas aeruginosa DSM1707. Partiendo del vector pMA::AB se corto el operon sintetico por medio de BglII y Xbal a partir del vector, y a continuacion se unio al vector de expresion, cortado con BamHI y XbaI, pBBR1MCS-2 (Seq ID Nr. 49) (descrito en Kovach et al., 1995: Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene, 166:175-176). El plasmido resultante pBBR1MCS-2::AB (Seq ID Nr. 38) tiene un tamano de 7422 pares de bases. La union, asi como la transformacion de celulas de E. coli DH5a quimicamente competentes (Gibco-BRL, Karlsruhe) se efectuo de modo conocido por el especialista. La autenticidad del inserto se verifico mediante analisis secuencial de ADN. La transformacion de Pseudomonas putida KT2440 y GPp104 con los vectores pBBR1MCS-2 (Seq ID Nr. 49) y pBBR1MCS-2::AB se efectuo como se describe anteriormente (Iwasaki et al. Biosci. Biotech. Biochem. 1994.

58(5):851-854). Se aislo y analizo el ADN plasmidico de 10 clones. Las cepas obtenidas, portadoras de plasmido, se llamaron P. putida KT2440 pBBR1 MCS-2, P. putida GPp104 pBBR1 MCS-2, P. putida KT2440 pBBR1 MCS-2::AB, o bien P. putida GPp104 pBBR1 MCS-2::AB.

2. Construccion de un vector pBBR1MCS-2::ABC para la expresion heterologa de genes de genes de Pseudomonas aeruginosa DSM1707 rhlA, rhlB y rhlC en Pseudomonas putida

Para la expresion heterologa de genes de Pseudomonas aeruginosa DSM1707 rhlA, rhlB y rhlC se construyo el plasmido pBBR1MCS-2::ABC (Seq ID Nr. 40). A tal efecto se sintetizo el operon sintetico rhlABC (Seq ID Nr. 39) de la firma GeneArt AG (Regensburg) y se interclono en el vector comercial pMA (GeneArt AG). La base para la sintesis era la secuencia genomica ya conocida de Pseudomonas aeruginosa DSM1707. Partiendo del vector pMA::ABC se corto el operon sintetico por medio de BglII y XbaI a partir del vector, y a continuacion se unio al vector de expresion, cortado con BamHI y XbaI, pBBR1 MCS-2 (Seq ID Nr. 49) (Kovach et al., 1995: Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBRIMCS carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene, 166:175 176). El plasmido resultante pBBR1MCS-2::ABC (Seq ID Nr. 40) tiene un tamano de 8409 pares de bases. La union, asi como la transformacion de celulas de E. coli DH5a competentes quimicamente (Gibco-BRL, Karlsruhe) se efectuo de modo conocido por el especialista. La autenticidad del inserto se verifico mediante analisis secuencial de ADN.

La transformacion de Pseudomonas putida KT2440 y GPp104 con el vector pBBR1 MCS-2::ABC se efectuo como se describe anteriormente (Iwasaki et al. Biosci. Biotech. Biochem. 1994. 58(5):851-854). Se aislo y se analizo el ADN plasmidico de 10 clones respectivamente. Las cepas obtenidas, portadoras de plasmido, se llamaron P. putida KT2440 pBBR1 MCS-2::ABC, o bien P. putida GPp104 pBBR1 MCS-2::ABC.

3. Construccion de un vector pBBR1MCS-2::ABM para la expresion heterologa de genes de Pseudomonas aeruginosa DSM1707 rhlA, rhlB y pa1131 en Pseudomonas putida

Para la expresion heterologa de genes de Pseudomonas aeruginosa DSM1707 rhlA, rhlB y pa1131 se construyo el plasmido pBBR1MCS-2::ABM (Seq ID Nr. 42). A tal efecto se sintetizo el operon sintetico rhlAB-pa1131 (Seq iD Nr.

41) de la firma GeneArt AG (Regensburg) y se interclono en el vector comercial pMA (GeneArt AG). La base para la sintesis era la ya conocida secuencia genomica de Pseudomonas aeruginosa DSM1707. Partiendo del vector pMA::ABM se corto el operon sintetico Bg/II y Xbala partir del vector, y a continuacion se unio al vector de expresion, cortado con BamHI y XbaI, pBBR1MCS-2 (Seq ID Nr. 49) (Kovach et al., 1995: Four new derivatives of the broadhost-range cloning vector pBBR1MCS carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene, 166:175-176). El plasmido resultante pBBR1MCS-2::ABM (Seq ID Nr. 42) tiene un tamano de 8702 pares de bases. La union, asi como la transformacion de celulas de E. coli DH5a competentes quimicamente (Gibco-BRL, Karlsruhe) se efectuo de modo conocido por el especialista. La autenticidad del inserto se verifico mediante analisis secuencial de ADN.

La transformacion de Pseudomonas putida KT2440 y GPp104 con el vector pBBR1 MCS-2::ABM se efectuo como se ha descrito anteriormente (Iwasaki et al. Biosci. Biotech. Biochem. 1994. 58(5):851-854). Se aislo y se analizo el ADN plasmidico de 10 clones respectivamente. Las cepas obtenidas, portadoras de plasmido, se llamaron P. putida KT2440 pBBR1 MCS-2::ABM, o bien P. putida GPp104 pBBR1 MCS-2::ABM.

4. Cuantificacion de la produccion de ramnolfpidos mediante cepas recombinantes de P. Putida

Se cultivaron las cepas recombinantes P. putida KT2440 pBBR1MCS-2; P. putida KT2440 pBBRIMCS-2::AB; P. putida KT2440 pBBR1 MCS-2::ABC; P. putida KT2440 pBBR1 MCS-2::ABM; P. putida GPp104 pBBR1MCS-2; P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::AB, P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::ABC y P. putida GPp104 pBBR1 MCS-2::ABM sobre placas de LB-agar-canamicina (50 gg/ml).

Para la produccion de ramnolfpidos se empleo el medio denominado medio CMP a continuacion. Este esta constituido por un 2 % (p/v) de glucosa, un 0,007 % (p/v) de KH2PO4, 0,11 % de Na2HPO4 x 2 H2O, un 0,2% (p/v) de NaNO3, un 0,04% (p/v) de MgSO4 x H2O, un 0,01 % (p/v) de CaCl2 x 2 H2O y un 0,2 % (v/v) de una disolucion de oligoelementos. Esta esta constituida por un 0,2 % (p/v) de FeSO4 x 7 H2O, un 0,15 % (p/v) de MnSO4 x H2O y un 0,06 % (p/v) de (NH4)MO7O24 x 4 H2O. Se ajusto el valor de pH del medio a 6,7 con NaOH, y se esterilizo el medio por medio de autoclave de modo subsiguiente (121 °C, 20 min). No era necesario un ajuste del valor de pH durante el cultivo.

Para la investigacion de la produccion de ramnolfpidos en el matraz de agitacion se elaboro un cultivo previo en primer lugar. A tal efecto se empleo un asa bacteriologica de una cepa recien extendida sobre placas de LB-agar, y se inocularon 10 ml de medio LB en un matraz Erlenmeyer de 100 ml. Todas las cepas de P. putida recombinantes se cultivaron en medio LB, al que se anadieron 50 gg/ml de canamicina. El cultivo de las cepas se efectuo a 30°C y 200 rpm durante la noche.

Los cultivos previos se emplearon para inocular 50 ml de medio CMP en matraces Erlenmeyer de 250 ml (OD600 inicial 0,1). Los cultivos se cultivaron a 200 rpm y 30°C durante un maximo de 120 h. A intervalos de 24 h se extrajo una muestra de 1 ml de caldo del matraz de cultivo. La preparacion de muestras para los siguientes analisis cromatograficos se efectuo de la siguiente manera:

con una pipeta de expulsion (Combitip) se dispuso 1 ml de acetona en un recipiente de reaccion de 2 ml, y se cerro inmediatamente el recipiente de reaccion para minimizar la evaporacion. Siguio la adicion de 1 ml de caldo. Tras agitacion de la mezcla de caldo/acetona se centrifugo esta durante 3 minutos a 13000 rpm, y se trasladaron 800 gl del sobrenadante a un recipiente de HPLC.

Para la identificacion y para la cuantificacion de ramnolfpidos se utilizo un Evaporative Light Scattering Detektor (Sedex LT-ELSD Model 85LT). La verdadera medida se llevo a cabo por medio de Agilent Technologies 1200 Series (Santa Clara, California) y de la columna Zorbax SB-C8 Rapid Resolution (4,6 x 150 mm, 3,5 pm, Agilent). El volumen de inyeccion ascendia a 5 pl, y la duracion del metodo se situaba en 20 minutos. Como fase movil se empleo TFA acuoso al 0,1 % (acido trifluoracetico, disolucion A), y metanol (disolucion B). La temperatura de la columna ascendia a 40°C. Como detectores sirvieron el ELSD (temperatura de detector 60 °C) y el DAD (ensayo de diodos, 210 nm). El gradiente empleado en el metodo era:

t [min] Disolucion B % en vol. Flujos [ml/min]

0,00 70% 1,00

15,00 100% 1,00

15,01 70% 1,00

20,00 70% 1,00

Mientras que P. putida KT2440 pBBR1MCS-2 y GPp104 pBBR1MCS-2 no produjeron ramnolipidos, en las cepas recombinantes P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::AB, P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABC, P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABM, P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::AB, P. putida Gpp104 pBBR1MCS-2::ABC y P. putida GPp104 pBBR1 MCS-2::ABM era identificable la formacion de diversas especies de ramnolipidos (Fig. 2 y 3).

Mediante la introduccion de pBBR1MCS-2::AB, o bien pBBR1MCS-2::ABM en P. putida se pudieron generar monorramnolipidos (Fig. 3). Ya que no estaba presente ningun material de referencia para monorramnolipidos, la identificacion de los productos se efectuo mediante analisis de las correspondientes trazas masicas y los espectros de MS2 en LC-MS.

Si adicionalmente se introdujo rhlC (pBBR1MCS-2::ABC) en las cepas, se produjeron mono- y dirramnolipidos (Fig. 2).

La comparacion directa de la formacion de la formacion de ramnolipidos a traves de P. putida pBBR1 MCS-2::AB, o bien P. putida pBBR1MCS-2::ABM, muestra que la coexpresion de P. aeruginosa p3111 con P. aeruginosa rhlAB conduce a una mejora de la biosintesis de ramnolipidos (Fig. 3). Mientras que las cepas P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::AB y P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::AB habian producido aproximadamente 39 (P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::AB), o bien 23 superficie de pico de ramnolipidos/OD 600 nm (P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::AB) despues de 120 h, las cepas P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABM y P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::ABM formaban aproximadamente 50 (P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABM), o bien 62 superficies de pico de ramnolipidos/OD 600 nm (P. putida GPp104 pBBR1 MCS-2::ABM) despues de 120 h.

Si se compararon la sintesis de monorramnolipidos de las cepas P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABM y P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::ABM, en los mutantes PHA-negativos P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::ABM se pudieron detectar 62 superficies de pico/OD 600 nm (cultivo de 120 h), y con P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABM 50 area/OD 600 nm de monorramnolipidos (Fig. 3).

Un analisis comparativo de la formacion de dirramnolipidos (mg/l/OD 600 nm) en las cepas P. putida KT2440 y GPp104 mostraba igualmente una mayor formacion de dirramnolipidos en el fondo de cepa PHA negativo de P. putida GPp104. P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::ABC formaba un promedio de 113 mg/l/OD 600 nm de dirramnolipidos (96 h), mientras que con P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABC se pudieron identificar solo 55 mg/l/OD 600 nm de dirramnolipidos despues de 96 h (Figur 2).

Por consiguiente, se pudo mostrar que el empleo de un fondo de cepa debilitado respecto a la sintesis de PHA conducia a una mejora de la biosintesis de ramnolipidos.

5. Construccion de un vector pBBR1MCS-2::ABMC para la expresion heterologa de genes de Pseudomonas aeruginosa DSM1707 rhlA, rhlB, pa1131 y rhlC en Pseudomonas putida

Para la expresion heterologa de genes de Pseudomonas aeruginosa DSM1707 rhlA, rhlB, pa1131 y rhlC se construyo el plasmido pBBR1MCS-2::ABMC (Seq ID Nr. 51). A tal efecto se sintetizo el operon sintetico rhlAB-pa1131-rhlC (Seq ID Nr. 50) de la firma GeneArt AG (Regensburg) y se interclono en el vector comercial pMA (GeneArt AG). La base para la sintesis era la ya conocida secuencia genomica de Pseudomonas aeruginosa DSM1707. Partiendo del vector pMA::ABMC se corto el operon sintetico Bg/II y Xbal a partir del vector, y a continuacion se unio al vector de expresion, cortado con BamHI y XbaI pBBR1 MCS-2 (Seq ID Nr. 49) (Kovach et al., 1995: Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1 MCS carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene, 166:175-176). El plasmido resultante pBBR1MCS-2::ABMC (Seq ID Nr. 51) tiene un tamano de 9663 pares de bases. La union, asi como la transformacion de celulas de E. coli DH5a competentes quimicamente (Gibco-BRL, Karlsruhe) se efectuo de modo conocido por el especialista. La autenticidad del inserto se verified mediante analisis secuencial de ADN.

La transformacion de Pseudomonas putida KT2440 y GPp104 con el vector pBBRI MCS-2::ABMC se efectuo como se ha descrito anteriormente (Iwasaki et al. Biosci. Biotech. Biochem. 1994. 58(5):851-854). Se aislo y se analizo el ADN plasmidico de 10 clones respectivamente. Las cepas obtenidas, portadoras de plasmido, se llamaron P. putida KT2440 pBBR1 MCS-2::ABMC, o bien P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::ABMC.

6. Comparacion cualitativa de la produccion de ramnolfpidos mediante cepas recombinantes de P. Putida y P. aeruginosa

Se cultivaron las cepas recombinantes P. putida GPp104 pBBR1MCS-2 y P. putida GPp104 pBBR1 MCS-2::ABMC, asi como P. aeruginosa DSM 19880, en placas de LB-agar-canamicina (50 pg/ml; P. putida)-, o bien LB-agar (P. aeruginosa).

Para la produccion de ramnolfpidos se empleo el medio denominado medio CMP a continuacion. Este esta constituido por un 2 % (p/v) de glucosa, un 0,007 % de KH2PO4, un 0,11 % de Na2HPO4 x 2 H2O, un 0,2 % (p/v) de NaNO3, un 0,04% (p/v) de MgSO4 x H2O, 0,01 % (p/v) de CaCl2 x 2 H2O y un 0,2% (v/v) de una disolucion de oligoelementos. Esta esta constituida por un 0,2% (p/v) de FeSO4 x 7 H2O, un 0,15% (p/v) de MnSO4 x H2O y un 0,06% (w/v) de (NH4)MO7O24 x 4 H2O. Se ajusto el valor de pH del medio a 6,7 con NaOH, y se esterilizo el medio por medio de autoclave (121 °C, 20 min) de modo subsiguiente. No era necesario un ajuste del valor de pH durante el cultivo.

Para la investigacion de la produccion de ramnolfpidos en el matraz de agitacion se elaboro un cultivo previo en primer lugar. A tal efecto se empleo un asa bacteriologica de una cepa recien extendida sobre placas de LB-agar, y se inocularon 10 ml de medio LB en un matraz Erlenmeyer de 100 ml. Las cepas de P. putida recombinantes se cultivaron en medio LB, al que se anadieron 50 pg/ml de canamicina. Se cultivo P. aeruginosa en el medio de cultivo LB. El cultivo de las cepas se efectuo a 30°C y 200 rpm durante la noche.

Los cultivos previos se emplearon para inocular 50 ml de medio CMP en matraces Erlenmeyer de 250 ml (OD600 inicial 0,1). Los cultivos se cultivaron a 200 rpm y 30°C durante un maximo de 120 h. A intervalos de 24 h se extrajo una muestra de 1 ml de caldo del matraz de cultivo.

La preparacion de muestras para los siguientes analisis cromatograficos se efectuo de la siguiente manera: con una pipeta de expulsion (Combitip) se dispuso 1 ml de acetona en un recipiente de reaccion de 2 ml, y se cerro inmediatamente el recipiente de reaccion para minimizar la evaporacion. Siguio la adicion de 1 ml de caldo. Tras agitacion de la mezcla de caldo/acetona se centrifugo esta durante 3 minutos a 13000 rpm, y se trasladaron 800 pl del sobrenadante a un recipiente de HPLC.

Para la identificacion de productos formados se inyectaron 5 pl en una instalacion UPLC Accela (Thermo Scientific, Dreieich). Las sustancias a investigar se analizaron con una columna semi UPLC "PursuitXRs ULTRA (C8, 2,8 pm, 2,1 x 100 mm) (Varian, Darmstadt). La separacion se efectuo en el intervalo de 25 minutos por medio de un gradiente constituido por la fase movil A1 (H2O, 0,1 % (v/v) TFA) y la fase movil B1 (metanol, 0,1 % (v/v) TFA) con una tasa de flujo de 0,3 ml/minutos a 40 °C. El desarrollo temporal del gradiente era el siguiente:

Tiempo [min] Fase movil A1 [%] Fase movil B1 [%]

0 30 70

15 0 100

25 0 100

25,01 30 70

32 30 70

La deteccion se efectuo por medio del detector DAD en el intervalo de longitud de onda de 200 - 600 nm, asi como selectivamente respecto a la masa con un espectrometro de masas FT-ICR LTQ-FT (Thermo Scientific, Dreieich) en el intervalo de escaneo m/z 100 - 1000. La ionizacion se efectuo por medio de ESI (electrospray ionization). Se determinaron masas exactas y formulas moleculares quimicas con ayuda del analizador masico FT-ICR, con una resolucion de R = 100000 y una precision masica de < 2 ppm. La identificacion de los productos se efectuo mediante analisis de las correspondientes trazas masicas y los espectros de MS2. Para poder comparar las cepas se confrontaron las superficies de pico de las correspondientes sustancias.

Como se representa en la Figura 4, la cepa P. putida GPp104 pBBRI MCS-2 no formaba ningun tipo de ramnolipido. P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::ABMC, asi como P. aeruginosa DSM 19880, formaban ramnolipidos, situandose la proporcion entre di- y monorramnolipidos formados en el caso de P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::ABMC aproximadamente en 4:1, en el caso de P. aeruginosa DSM 19880 aproximadamente en 2:1. Ademas, la cepa P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::ABMC, en contrapartida a P. aeruginosa DSM 19880, no formaba, o formaba muy poco ramnolipidos con un resto determinado a traves de R1 y R2, derivado de acido 3-hidroxioctanoil-3-hidroxidecanoico o acido 3-hidroxidecanoil-3-hidroxioctanoico.

7. Construccion de un vector pBBR1MCS-2::rfbBDAC y pBBR1MCS-2::ABC_rfbBDAC para la expresion heterologa en Pseudomonas putida

En la firma Firma Trenzyme GmbH (Konstanz), partiendo de ADN cromosomico de Pseudomonas putida KT2440 se amplifico el operon de biosintesis de ramnosa rfbBDAC. A tal efecto se empleo el siguiente cebador:

RL1: 5'-TATATATAGAATTCGCGTCATCTGTCTACGACAACAC-3' (Seq ID Nr. 48)

RL2: 5'-TATATATAGAATTCGGCTGCGCTACCGCAGCCCTTC-3' (Seq ID Nr. 43)

El producto de PCR obtenido se interclono en el sistema Trenzyme's Alligator Cloning y se transformo en E. coli DH5a (New England Biolabs; Frankfurt). Se analizaron y se secuenciaron vectores de diferentes candidatos. Una vez efectuada una secuenciacion de ADN exitosa y exenta de errores se corto el vector por medio de EcoRI y se aislo el fragmento objetivo rfbBDAC. Para una interclonacion ulterior se corto el vector pBBR1 MCS-2 (Kovach et al., 1995: Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1 MCS carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene, 166:175-176) del mismo modo. El fragmento objetivo cortado (rfbBDAC) y el vector cortado (pBBR1MCS-2) se reunieron mediante union convencional. El vector producido pBBR1MCS-2::rfbBDAC (Seq ID Nr.

45) se transformo igualmente en E. coli DH5a (New England Biolabs; Frankfurt). Se analizaron algunos candidatos de transformandos respecto a la absorcion exitosa de plasmido.

El vector pBBR1 MCS-2::rfbBDAC sirvio como matriz para una PCR. Se emplearon los siguientes oligonucleotidos:

RL_XbaI-fw: 5'-T AT AT AT ATCT AGAATT AATGCAGCTGGCACGAC-3' (Seq ID Nr. 44)

RL_Xba_rev: 5'-GGCCGCTCTAGAACTAGTGGA-3' (Seq ID Nr. 46)

La PCR se llevo a cabo con la Phusion™ High-Fidelity Master Mix de New England Biolabs (Frankfurt) polimerasa. Esta se efectuo de modo conocido por el especialista. La secuencia objetivo (/ac-promotor y rfbBDAC) se interclono en el sistema Trenzyme Alligator Cloning System. Se seleccionaron transformandos de E. coli DH5a (New England Biolabs; Frankfurt) y se aislo y secuencio el ADN plasmidico de diversos candidatos. Despues de haber verificado la secuencia y analizado la exactitud de la misma, se corto el vector con XbaI. El fragmento objetivo se unio al pBBR1MCS-2::ABC, igualmente cortado con XbaI (vease mas arriba) por medio de metodos de union convencionales. El vector objetivo obtenido pBBR1MCS-2::ABC_rfbBDAC (Seq ID Nr. 47) tiene un tamano de 12249 pares de bases. Se secuencio el inserto del vector. La puesta en practica de la PCR, la verificacion de la amplificacion exitosa de PCR por medio de electroforesis en egel de agarosa, el tenido con bromuro de etidio de ADN, la determinacion del tamano de fragmento por PCR, la purificacion de los productos de PCR y determinacion de la concentracion de ADN se efectuaron de modo conocido por el especialista.

La transformacion de Pseudomonas putida KT2440 y GPp104 con el vector pBBR1 MCS-2::ABC_rfbBDAC se efectuo como se ha descrito anteriormente (Iwasaki et al. Biosci. Biotech. Biochem. 1994. 58(5):851-854). Se aislo y se analizo el ADN plasmidico de 10 clones respectivamente. Las cepas obtenidas, portadoras de plasmido, se llaman P. putida KT2440 pBBR1 MCS-2::ABC_rfbBDAC y P. putida GPp104 pBBR1 MCS-2::ABC_rfbBDAC.

8. Cuantificacion de la produccion de ramnolipidos mediante cepas recombinantes de P. Putida con y sin sobreexpresion del operon rfbBDAC

Las cepas recombinantes P. putida KT2440 pBBR1MCS-2; P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABC, P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABC_rfbBDAC, P. putida GPp104 pBBR1MCS-2, P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::ABC y P. putida GPp104 pBBR1 MCS-2::ABC_rfbBDAC se cultivan en placas de LB-agar-canamicina (50 pg/ml).

Para la produccion de ramnolipidos se emplea el medio denominado medio CMP a continuacion. Este esta constituido por un 2% (p/v) de glucosa, 0,007% (p/v) de KH2PO4, 0,11 % Na2HPO4 x 2 H2O, 0,2% (p/v) de NaNO3, 0,04% (p/v) de MgSO4 x H2O, 0,01 % (p/v) de CaCl2 x 2 H2O y un 0,2% (v/v) de una disolucion de oligoelementos. Esta esta constituida por un 0,2% (p/v) de FeSO4 x 7 H2O, 0,15% (p/v) de MnSO4 x H2O y un 0,06% (p/v) de (NH4)MO7O24 x 4 H2O. El valor de pH del medio se ajusta a 6,7 con NaOH, y a continuacion se esteriliza el medio por medio de autoclave (121 °C, 20 min). No es necesario un ajuste del valor de pH durante el cultivo.

Para la investigacion de la produccion de ramnolipidos en el matraz de agitacion se elabora un cultivo previo en primer lugar. A tal efecto se emplea un asa bacteriologica de una cepa recien extendida sobre placas de LB-agar, y se inoculan 10 ml de medio LB en un matraz Erlenmeyer de 100 ml. Todas las cepas recombinantes de P. putida recombinantes se cultivan en medio LB, al que se anadien 50 pg/ml de canamicina. El cultivo de las cepas de P. putida se efectua a 30°C y 200 rpm durante la noche.

Los cultivos previos se emplean para inocular 50 ml de medio CMP en el matraz Erlenmeyer de 250 ml (Start-OD600 0,1). Los cultivos se cultivan a 200 rpm y 30°C durante un maximo de 120 h. A intervalos de 24 h se extrae una muestra de 1 ml de caldo del matraz de cultivo.

La preparacion de muestras para los subsiguientes analisis cromatograficos se efectua de la siguiente manera: con una pipeta de expulsion (Combitip) se dispone 1 ml de acetona en un recipiente de reaccion de 2 ml, y se cierra el recipiente de reaccion inmediatamente para minimizar la evaporacion. Sigue la adicion de 1 ml de caldo. Tras agitacion de la mezcla de caldo/acetona se centrifuga la misma durante 3 minutos a 13000 rpm, y se trasladan 800 pl del sobrenadante a un recipiente de HPLC.

Para la identificacion y para la cuantificacion de ramnolipidos se utiliza un Evaporative Light Scattering Detektor (Sedex LT-ELSD Model 85LT). La verdadera medida se lleva a cabo por medio de Agilent Technologies 1200 Series (Santa Clara, California) y la columna Zorbax SB-C8 Rapid Resolution (4,6 x 150 mm, 3,5 pm, Agilent). El volumen de inyeccion asciende a 5 pl y la duracion del metodo es 20 minutos. Como fase movil se emplea TFA acuoso al 0,1 % (acido trifluoracetico, disolucion A) y metanol (disolucion B). La temperatura de columna asciende a 40 °C. Como detectores sirven el ELSD (temperatura de detector 60°C) y el DAD (ensayo de diodos, 210 nm). El gradiente empleado en el metodo es:

t [min] % en vol. de disolucion B Flujo [ml/min]

0,00 70% 1,00

15,00 100% 1,00

15,01 70% 1,00

20,00 70% 1,00

Mientras que P. putida KT2440 pBBR1MCS-2 y GPp104 pBBR1MCS-2 no producen ramnolipidos, la formacion de ramnolipidos es verificable en las cepas recombinantes P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABC, P. putida KT2440 pBBR1 MCS-2::ABC_rfbBDAC; P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::ABC y P. putida GPp104 pBBR1 MCS-2::ABC_rfbBDAC.

P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABC_rfbBDAC en comparacion con P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABC y P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::ABC_rfbBDAC en comparacion con P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::ABC muestra una formacion intensificada de di- y monorramnolipidos. Esto muestra claramente la influencia positiva de la intensificacion de la expresion de rfbBDAC sobre la formacion de mono- y dirramnolipidos.

Si se compara la biosintesis de mono- y dirramnolipidos de las cepas P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABC_rfbBDAC y P. putida GPp104 pBBR1 MCS-2::ABC_rfbBDAC, en el mutante PHA-negativo P. putida GPp104 pBBR1 MCS-2::ABC_rfbBDAC se detecta una sintesis de mono- y dirramnolipidos intensificada.

Como ya se ha descrito anteriormente, en el caso de empleo de un fondo de cepa desactivado en la sintesis de PHA se intensifica la biosintesis de ramnolipidos.

9. Generacion de E. coli W3110 pBBR1MCS-2::ABC y E. coli W3110 pBBR1MCS-2::ABC_rfbBDAC recombinante

La transformacion de E. coli W3110 se efectuo como se ha descrito anteriormente (Miller JH. A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria. Plainview, NY: Cold Spring Harbor Lab. Press; 1992) por medio de electroporacion. Se aislo y se analizo el ADN plasmidico de 10 clones respectivamente. Las cepas obtenidas, portadoras de plasmido, se llamaron E. coli W3110 pBBR1MCS-2::ABC_rfbBDAC y E. coliW3110 pBBR1 MCS-2::ABC_rfbBDAC.

10. Cuantificacion de la produccion de ramnolipidos mediante cepas de E. coli recombinantes con y sin sobreexpresion del operon rfbBDAC

Las cepas recombinantes E. coli W3110 pBBR1MCS-2; E. coli W3110 pBBR1MCS-2::ABC y E. coli W3110 pBBR1MCS-2::ABC_rfbBDAC se cultivan en placas de LB-agar-canamicina (50 pg/ml).

Para la produccion de ramnolipidos se emplea el medio denominado medio CMP a continuacion. Este esta constituido por un 2 % (p/v) de glucosa, 0,007 % (p/v) de KH2PO4, 0,11 % Na2HPO4 x 2 H2O, 0,2 % (p/v) de NaNO3, 0,04 % (w/v) de MgSO4 x H2O, 0,01 % (p/v) de CaCl2 x 2 H2O y un 0,2 % (v/v) de una disolucion de oligoelementos. Esta esta constituida por un 0,2 % (p/v) de FeSO4 x 7 H2O, 0,15 % (p/v) de MnSO4 x H2O y un 0,06 % (p/v) de (NH4)MO7O24 x 4 H2O. El valor de pH del medio se ajusta a 6,7 con NaOH, y a continuacion se esteriliza el medio por medio de autoclave (121 °C, 20 min). No es necesario un ajuste del valor de pH durante el cultivo.

Para la investigacion de la produccion de ramnolipidos en el matraz de agitacion se elaboro un cultivo previo en primer lugar. A tal efecto se emplea un asa bacteriologica de una cepa recien extendida sobre placas de LB-agar, y se inoculan 10 ml de medio LB en un matraz Erlenmeyer de 100 ml. Todas las cepas recombinantes de E. coli se cultivan en medio LB, al que se anaden 50 pg/ml de canamicina. El cultivo de las cepas de E. coli se efectua a 37 °C y 200 rpm durante la noche. Los cultivos previos se emplean para inocular 50 ml de medio CMP en el matraz Erlenmeyer de 250 ml (Start-OD6oo 0,1). Los cultivos se cultivan a 200 rpm y 30°C durante un maximo de 120 h. A intervalos de 24 h se extrae una muestra de 1 ml de caldo del matraz de cultivo. La preparacion de muestras para los subsiguientes analisis cromatograficos se efectua de la siguiente manera: con una pipeta de expulsion (Combitip) se dispone 1 ml de acetona en un recipiente de reaccion de 2 ml, y se cierra el recipiente de reaccion inmediatamente para minimizar la evaporacion. Sigue la adicion de 1 ml de caldo. Tras agitacion de la mezcla de caldo/acetona se centrifuga la misma durante 3 minutos a 13000 rpm, y se trasladan 800 pl del sobrenadante a un recipiente de HPLC.

t [min] % en vol. de disolucion B Flujo [ml/min]

0,00 70% 1,00

15,00 100% 1,00

15,01 70% 1,00

20,00 70% 1,00

Mientras que E. coli W3110 pBBR1 MCS-2 no produce ramnolipidos, la formacion de ramnolipidos es verificable en las cepas recombinantes E. coli W3110 pBBR1MCS-2::ABC y E. coli W3110 pBBR1MCS-2::ABC_rfbBDAC, formando E. coli W3110 pBBR1MCS-2::ABC_rfbBDAC significativamente mas mono- y dirramnolipidos que E. coli W3110 pBBR1MCS-2::ABC. Esto muestra que la expresion heterologa de rhlABC de Pseudomonas aeruginosa DSM1707 conduce a la formacion de mono- y dirramnolipidos en E. coli. Esto muestra ademas la influencia positiva de la intensificacion de la expresion de rfbBDAC sobre la formacion de mono- y dirramnolipidos.

11. Construccion de un vector pBBR1MCS-2::ABC-BTH_II1077- II1080-II1081 para la expresion heterologa de genes de Pseudomonas aeruginosa DSM1707 rhlA, rhlB y rhlC, asi como de genes de Burkholderia thailandensis E264 BTH_II1077, BT_II1080 y BT_II1081 en Pseudomonas putida

Para la expresion heterologa de genes de Pseudomonas aeruginosa DSM1707 rhlA, rhlB y rhlC, asi como de genes de B. thailandensis E264 BTH_II1077, BT_II1080 y BT_II1081 en Pseudomonas putida, se construye el plasmido pBBR1MCS-2::ABC-BTH_II1077- II1080-II1081 (Seq ID Nr. 69). A tal efecto se sintetiza el operon sintetico BTH_II1077, BT_II1080 y BT_II1081 (Seq ID Nr. 70) de la firma DNA 2.0 (Menlo Park, CA, USA) y se interclona en el vector comercial pJ294 (DNA 2.0; Menlo Park, CA, USA). La base para la sintesis es la secuencia genomica de la cepa B. thailandensis E264. Partiendo del vector pJ294-BTH_II1077- II080-II081 se corta el operon sintetico por medio de Xbal a partir de este vector y a continuacion se une al el vector, igualmente cortado con XbaI, pBBR1 MCS-2::ABC (Seq ID Nr. 40). El vector objetivo obtenido pBBR1MCS-2::ABC-BTH_II1077-II1080-II1081 (Seq ID Nr. 69) tiene un tamano de 13768 pares de bases. Se secuencia el inserto del vector. La puesta en practica de la PCR, la verificacion de la amplificacion exitosa de la PCR por medio de electroforesis en gel de agarosa, el tenido con bromuro de etidio de ADN, la determinacion del tamano de fragmento por PCR, la purificacion de los productos de PCR y la determinacion de la concentracion de ADN se efectuan de modo conocido por el especialista.

La transformacion de Pseudomonas putida KT2440 y GPp104 con el vector pBBR1MCS-2::ABC-BTH_II1077-II1080-II1081 (Seq ID Nr. 69) se efectua como se describe anteriormente (Iwasaki et al. Biosci. Biotech. Biochem.

1994. 58(5):851-854). Se aisla y se analiza el ADN plasmidico de 10 clones respectivamente . Las cepas obtenidas, portadoras de plasmidos, se llaman P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABC-BTH_II1077- II1080-II1081, o bien P. putida GPp104 pBBR1 MCS-2::ABC-BTH_II1077- II1080-II1081.

12. Cuantificacion de la produccion de ramnolfpidos mediante cepas de P. putida recombinantes con y sin sobreexpresion de los genes B. thailandensis E264 BTH_111077, BT_II1080 y BT_II1081

Las cepas de P. putida recombinantes generadas en los Ejemplos 1,2 y 11 P. putida KT2440 pBBR1 MCS-2::AB, P. putida KT2440 pBBR1 MCS-2::AB-BTH_II1077- II1080-II1081, P. putida GPp104 pBBR1 MCS-2::AB, P. putida GPp104 pBBR1 MCS-2::AB-BTH_II1077- II1080-II1081, P. putida KT2440 pBBR1 MCS-2::ABC, P. putida KT2440 pBBR1 MCS-2::ABC-BTH_II1077- II1080-II1081 P. putida GPp104 pBBR1 MCS-2::ABC y P. putida GPp104pBBR1MCS-2::ABC-BTH_II1077- II1080-II1081 se cultivan en placas de LB-agar-canamicina (50 pg/ml).

Para la produccion de ramnolfpidos se emplea el medio denominado medio M9 a continuacion. Este medio esta constituido por un 2 % (w/v) de glucosa, un 0,3 % (p/v) de KH2PO4, un 0,679 % Na2HPO4, un 0,05 % (p/v) de NaCl, Un 0,2 % (p/v) NH4Cl, un 0,049 % (p/v) de MgSO4 x 7 H2O y un 0,1 % (v/v) de una disolucion de oligoelementos. Esta esta constituida por un 1,78 % (p/v) de FeSO4 x 7 H2O, un 0,191 % (p/v) de MnCl2 x 7 H2O, un 3,65 % (p/v) de HCl, un 0,187 % (p/v) de ZnSO4 x 7 H2O, un 0,084 % (v/v) de Na-EDTA x 2 H2O, un 0,03 % (v/v) de H3BO3, un 0,025 % (p/v) de Na2MoO4 x 2 H2O y un 0,47 % (p/v) de CaCl2 x 2 H2O. El valor de pH del medio se ajusta a 7,4 con NH4OH auf 7,4 y el medio se esterizila a continuacion por medio de autoclave (121 °C, 20 minutos). No es necesario un ajuste del valor de pH durante el cultivo.

Para la investigacion de la produccion de ramnolfpidos en el matraz de agitacion se elaboro un cultivo previo en primer lugar. A tal efecto se emplea un asa bacteriologica de una cepa recien extendida sobre placas de LB-agar, y se inoculan 10 ml de medio LB en un matraz Erlenmeyer de 100 ml. Todas las cepas recombinantes de P. putida se cultivan en medio LB, la que se anadieron 50 pg/ml. El cultivo de las cepas de P. putida se efectua a 37 °C y 200 rpm durante la noche.

Los cultivos previos se emplean para inocular 50 ml de medio M9 (+ 50 pg/ml de canamicina) en el matraz Erlenmeyer de 250 ml (OD600 inicial 0,1). Los cultivos se cultivan a 200 rpm y 30°C. A intervalos de 24 h se extrae una muestra de 1 ml de caldo del matraz de cultivo. La preparacion de muestras para los subsiguientes analisis cromatograficos en si mismos se efectuan como se describe en el Ejemplo 4.

Se muestra que las cepas recombinantes P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::AB-BTH_II1077- II1080-II1081 y P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::AB-BTH_II1077- II1080-II1081 forman sensiblemente mas monorramnolipidos que las cepas P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::AB y P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::AB. Esto demuestra que la intensificacion de BTH_II1077-II1080-II1081 de B. thailandensis E264 intensifica la formacion de monorramnolipidos en cepas de P. Putida con los genes de Pseudomonas aeruginosa DSM1707 rhlAB.

Ademas se muestra que las cepas recombinantes P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABC-BTH_II1077- II1080-II1081 y P. putida GPp104 pBBR1 MCS-2::ABC-BTH_II1077-II1080-II1081 forman sensiblemente mas mono- y dirramnolipidos que las cepas P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABC y P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::ABC. Esto demuestra que la intensificacion de BTH_II1077- II1080-II1081 de B. thailandensis E264 intensifica la formacion de mono- y dirramnolipidos en cepas de P. Putida con los genes de Pseudomonas aeruginosa DSM1707 rhlABC.

Finalmente se muestra que el debilitamiento de la formacion de polihidroxibutirato en el fondo de cepa P. putida GPp104 conduce a una formacion de ramnolfpidos acrecentada frente a la cepa P. putida KT2440, ya que las cepas P. putida KT2440 pBBR1 MCS-2::AB, P. putida KT2440 pBBR1 MCS-2::ABC, P. putida KT2440 pBBR1 MCS-2::AB-BTH_111077- II1080-II1081 y P. putida KT2440 pBBR1 MCS-2::ABC-BTH_II1077- II1080-II1081 pueden formar sensiblemente menos mono- (), o bien sensiblemente menos mono- (), o bien mono- y dirramnolipidos que las correspondientes cepas de control P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::AB, P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::ABC, P. putida GPp104 pBBR1 MCS-2::AB-BTH-II1077- II1080-II1081 y P. putida GPp104 pBBR1 MCS-2::ABC-BTH_II1077-II1080-II1081.

13. Construccion de un vector pBBR1MCS-2::ABCM para la expresion heterologa de genes de Pseudomonas aeruginosa DSM1707 rhlA, rhlB, pa1131 y rhlC en Pseudomonas putida

Para la expresion heterologa de genes de Pseudomonas aeruginosa DSM1707 rhlA, rhlB, pa1131 y rhlC se construyo el plasmido pBBR1MCS-2::ABCM (Seq ID Nr. 58). A tal efecto se amplifico el gen pa1131 (Seq ID Nr. 59), partiendo de ADN genomico de la cepa Pseudomonas aeruginosa PAO1 (DSM 1707), con los oligonucleotidos

MFS2.0_xbaI_fw: 5'-AGGAAATCTAGATGAGAGGCCGGCAAGGATAC-3' (Seq ID Nr. 60) MFS2.0_XbaI_rev:5'-CCAGGTTCTAGACGCCAGGATTGAACAGTACC-3' (Seq ID Nr. 61).

La amplificacion del producto de PCR (1483 pares de bases) se llevo a cabo con la Phusion™ High-Fidelity Master Mix de New England Biolabs (Frankfurt) polimerasa. El producto de PCR se corto con Xbal y se unio al vector, igualmente cortado con Xbal, pBBR1MCs-2::ABC (Seq ID Nr. 40) por medio del Fast Link Ligation Kit (Epicentre Technologies; Madison, Wl, USA). El vector objetivo obtenido pBBRl MCS-2::ABCM (Seq ID Nr. 58) tiene un tamano de 9892 pares de bases. Se secuencio el inserto del vector. El ADN cromosomico se aislo por medio de DNeasy Blood and Tissue Kit (Qiagen; Hilden) segun datos del fabricante. La puesta en practica de la PCR, la verificacion de la amplificacion exitosa de la PCR por medio de electroforesis en gel de agarosa, el tenido con bromuro de etidio de ADN, la determinacion del tamano de fragmento por PCR, la purificacion de los productos de PCR y la determinacion de la concentracion de ADN se efectuaron de modo conocido por el especialista.

La transformacion de Pseudomonas putida KT2440 y GPp104 con el vector pBBR1 MCS-2::ABCM se efectuo como se ha descrito anteriormente (Iwasaki et al. Biosci. Biotech. Biochem. 1994. 58(5):851-854). Se aislo y se analizo el ADN plasmidico de 10 clones respectivamente. Las cepas obtenidas, portadoras de plasmido, se llamaron P. putida KT2440 pBBR1 MCS-2::ABCM, o bien P. putida GPp104 pBBR1 MCS-2::ABCM.

14. Cuantificacion de la produccion de ramnolfpidos mediante cepas recombinantes de P. putida con y sin sobreexpresion del gen de Pseudomonas aeruginosa DSM1707 pa1131

Las cepas recombinantes generadas en los Ejemplos 2 y 13 P. putida P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABC, P. putida KT2440 pBBR1 MCS-2::ABCM, P. putida KT2440 pBBR1 MCS-2::ABC y P. putida GPp104 pBBR1 MCS-2::ABCM se cultivaron en placas de LB-agar-canamicina (50 gg/ml). El subsiguiente cultivo para la produccion de los ramnolfpidos se efectuo como se describe en el Ejemplo 12.

La preparacion de muestras para los subsiguientes analisis cromatograficos y los analisis cromatograficos en si mismos se efectuaron como se describe en el Ejemplo 4. Los resultados se representan en la siguiente tabla.

Formacion de di- y monorramnolipidos mediante cepas de P. putida con y sin sobreexpresion del gen de P. aeruginosa pa1131 tras 48 h de incubacion

Cepas de P. putida Dirramnolipidos [mg/l] Monorramnolipidos [superficie de pico]

KT2440 pBBR1 MCS-2::ABC 310 19

KT2440 pBBR1 MCS-2::ABCM 1053 314

GPp104 pBBR1 MCS-2::ABC 689 127

GPp104 pBBR1 MCS-2::ABCM 960 1090

Los resultados muestran que la sobreexpresion del gen de P. aeruginosa pa1131 en ambos fondos de cepa (KT2440: tipo salvaje, o bien GPp104 con formacion de polihidroxibutirato desactivada), conduce a una formacion elevada de di- y monorramnolipidos. Los resultados muestran ademas que el debilitamiento de la formacion de polihidroxibutirato en GPp104 conduce generalmente a una formacion intensificada de ramnolfpidos.

15. Construccion de un vector pEC-XT99A::AB para la expresion heterologa de los genes rhlA y rhlB de Pseudomonas aeruginosa DSM1707 en Corynebacterium glutamicum

Para la expresion heterologa de los genes rhlA y rhlB de Pseudomonas aeruginosa DSM1707 en Corynebacterium glutamicum se construye el plasmido pEC-XT99A::AB (Seq ID Nr. 52). A tal efecto se sintetizo el operon sintetico rhlAB (Seq ID Nr. 37) de la firma GeneArt AG (Regensburg) y se interclono en el vector comercial pMA (GeneArt AG) zwischenkloniert. La base para la sintesis era la ya conocida secuencia genomica de Pseudomonas aeruginosa DSM1707. Partiendo del vector pMA::AB se corta el operon sintetico por medio de BglII y XbaI a partir del vector, y a continuacion se une al vector de expresion, cortado con BamHI y XbaI, pEC-XT99A (Patente US 7118904). El plasmido resultante pEC-XT99A::AB (Seq ID Nr. 52) tiene un tamano de 9793 pares de bases. La union, asi como la transformacion de celulas de E. coli DH5a competentes quimicamente (Gibco-BRL, Karlsruhe) se efectua de modo conocido por el especialista. La autenticidad del inserto se verifica mediante analisis secuencial de ADN.

La transformacion de C. glutamicum ATCC13032 con el vector pEC-XT99A::AB se efectua como se describe anteriormente (Liebl et al., FEMS Microbiol. Lett. 53:299-303 (1989)). La seleccion de los transformandos se efectua en placas de LBHIS-agar (18,5 g/l de infusion de cerebro-corazon Boullion, sorbitol 0,5 M, 5 g/l de bacto-triptona, 2,5 g/l de extracto de bacto-levadura, 5 g/l de NaCl y 18 g/l de bacto-agar, complementado con 5 mg/l de tetraciclina).

Las placas se incubaron dos dias a 332C. La cepa obtenida, portadora de plasmido, se llama C. glutamicum pEC-XT99A::AB.

16. Construccion de un vector pEC-XT99A::ABC para la expresion heterologa de los genes rhlA, rhlB y rhlC de Pseudomonas aeruginosa DSM1707 en Corynebacterium glutamicum

Para la expresion heterologa de los genes rhlA, rhlB y rhlC de Pseudomonas aeruginosa DSM1707 en Corynebacterium glutamicum se construye el plasmido pEC-XT99A::ABC (Seq ID Nr. 53). A tal efecto se sintetizo el operon sintetico rhlABC (Seq ID Nr. 39) de la firma GeneArt AG (Regensburg) y se interclono en el vector comercial pMA (GeneArt AG). La base para la sintesis era la ya conocida secuencia genomica de Pseudomonas aeruginosa DSM1707. Partiendo del vector pMA::ABC se corta el operon sintetico por medio de Bg/II y Xbal a partir del vector, y a continuacion se une al vector de expresion, cortado con BamHI y XbaI, pEC-XT99A (Patente US 7118904). El plasmido resultante pEC-XT99A::ABC (Seq ID Nr. 53) tiene un tamano de 10780 pares de bases. La union, asi como la transformacion de celulas de E. coli DH5a competentes quimicamente (Gibco-BRL, Karlsruhe), se efectua de modo conocido por el especialista. La autenticidad del inserto se verifica mediante analisis secuencial de ADN.

La transformacion de C. glutamicum ATCC13032 con el vector pEC-XT99A::ABC se efectua como se describe anteriormente (Liebl et al., FEMS Microbiol. Lett. 53:299-303 (1989)). La seleccion de los transformandos se efectua en placas de LBHIS-agar (18,5 g/l de infusion de cerebro-corazon Boullion, sorbitol 0,5 M, 5 g/l de bacto-triptona, 2,5 g/l de extracto de bacto-levadura, 5 g/l de NaCl y 18 g/l de bacto-agar, complementado con 5 g/l de tetraciclina). Las placas se incubaron dos dias a 33°C. La cepa obtenida, portadora de plasmido, se llama C. glutamicum pEC-XT99A::ABC.

17. Construccion de un vector pEC-XT99A::ABM para la expresion heterologa de los genes rhlA, rhlB y pa1131 de Pseudomonas aeruginosa DSM1707 en Corynebacterium glutamicum

Para la expresion heterologa de los genes rhlA, rhlB y pa1131 de Pseudomonas aeruginosa DSM1707 en Corynebacterium glutamicum se construye el plasmido pEC-XT99A::ABM (Seq ID Nr. 54). A tal efecto se sintetizo el operon sintetico rhlABM (Seq ID Nr. 41) de la firma GeneArt AG (Regensburg) y se interclono en el vector comercial pMA (GeneArt AG). La base para la sintesis era la ya conocida secuencia genomica de Pseudomonas aeruginosa DSM1707. Partiendo del vector pMA::ABM se corta el operon sintetico por medio de Bg/II y XbaI a partir del vector, y a continuacion se une al vector de expresion, cortado con BamHI y XbaI, pEC-XT99A (Patente US 7118904). El plasmido resultante pEC-XT99A::ABM (Seq ID Nr. 54) tiene un tamano de 11073 pares de bases. La union, asi como la transformacion de celulas de E. coli DH5a competentes quimicamente (Gibco-BRL, Karlsruhe), se efectua de modo conocido por el especialista. La autenticidad del inserto se verifica mediante analisis secuencial de ADN.

La transformacion de C. glutamicum ATCC13032 con el vector pEC-XT99A::ABM se efectua como se describe anteriormente (Liebl et al., FEMS Microbiol. Lett. 53:299-303 (1989)). La seleccion de los transformandos se efectua en placas de LBHIS-agar (18,5 g/l de infusion de cerebro-corazon Boullion, sorbitol 0,5 M, 5 g/l de bacto-triptona, 2,5 g/l de extracto de bacto-levadura, 5 g/l de NaCl y 18 g/l de bacto-agar, complementado con 5 mg/l de tetraciclina). Las placas se incubaron dos dias a 33°C. La cepa obtenida, portadora de plasmido, se llama C. glutamicum pEC-XT99A::ABM.

18. Construccion de un vector pEC-XT99A::ABCM para la expresion heterologa de los genes rhlA, rhlB, pa1131 y rhlC de Pseudomonas aeruginosa DSM1707 en Corynebacterium glutamicum

Para la expresion heterologa de los genes rhlA, rhlB, pa1131 y rhlC de Pseudomonas aeruginosa DSM1707 en Corynebacterium glutamicum se construye el plasmido pEC-XT99A::ABCM (Seq ID Nr. 55). A tal efecto se amplifico el gen pa1131 (Seq ID Nr. 59) partiendo del ADN genomico de la cepa Pseudomonas aeruginosa PAO1 (DSM 1707) con los oligonucleotidos

MFS2.0_xbaI_fw: 5'-AGGAAATCTAGATGAGAGGCCGGCAAGGATAC-3' (Seq ID Nr. 60)

MFS2.0_XbaI_rev:5'-CCAGGTTCTAGACGCCAGGATTGAACAGTACC-3' (Seq ID Nr. 61).

La amplificacion del producto de PCR (1483 pares de bases) se llevo a cabo con la Phusion™ High-Fidelity Master Mix de New England Biolabs (Frankfurt) polimerasa. El producto de PCR se corto con XbaI y se unio al vector, igualmente cortado con XbaI, pBBR1MCS-2::ABC (Seq ID Nr. 40) por medio del Fast Link Ligation Kit (Epicentre Technologies; Madison, WI, USA). El vector objetivo obtenido pEC-XT99A::ABCM (Seq ID Nr. 55) tiene un tamano de 12263 pares de bases. Se secuencio el inserto del vector. El ADN cromosomico se aislo por medio del DNeasy Blood and Tissue Kit (Qiagen; Hilden) segun datos del fabricante. La puesta en practica de la PCR, la verificacion de la amplificacion exitosa de la PCR por medio de electroforesis en gel de agarosa, el tenido con bromuro de etidio de ADN, la determinacion del tamano de fragmento por PCR, la purificacion de los productos de PCR y la determinacion de la concentracion de ADN se efectuaron de modo conocido por el especialista. La transformacion de C. glutamicum ATCC13032 con el vector pEC-XT99A::ABCM se efectua como se describe anteriormente (Liebl et al., FEMS Microbiol. Lett. 53:299-303 (1989)). La seleccion de los transformandos se efectua en placas de LBHIS-agar (18,5 g/l de infusion de cerebro-corazon Boullion, sorbitol 0,5 M, 5 g/l de bacto-triptona, 2,5 g/l de extracto de bacto-levadura, 5 g/l de NaCl y 18 g/l de bacto-agar, complementado con 5 mg/l de tetraciclina). Las placas se incubaron dos dias a 33°C. La cepa obtenida, portadora de plasmido, se llama C. glutamicum pEC-XT99A::ABCM.

19. Construccion de un vectorpVWEX1::rfbBDAC para la expresion heterologa en C. glutamicum

Para la expresion heterologa de los genes rfbBDAC de P. putida bajo control del promotor de lac en C. glutamicum se construye el vector pVWEX1 ::rfbBDAC (Seq ID Nr. 57). A tal efecto se digiere el vector pBBR1MCS-2::rfbBDAC (Seq ID Nr. 45) con Xbal y se unen el fragmento que contiene los genes rfbBDAC de P. putida KT2440 y el promotor de lac (3840 bp) en el vector digerido con Xbal pVwEX1 (Seq ID Nr. 56). El plasmido resultante pVWEX1 ::rfbBDAC (Seq ID Nr. 57) tiene un tamano de 12311 pares de bases. La union, asi como la transformacion de celulas de E. coli DH5a competentes quimicamente (Gibco-BRL, Karlsruhe) se efectua de modo conocido por el especialista. La autenticidad del inserto se verifica mediante analisis secuencial de ADN. La transformacion de C. glutamicum ATCC13032 pEC-XT99A, ATCC13032 pEC-XT99A::AB, ATCC13032 pEC-XT99A::ABM, ATCC13032 pEC-XT99A::ABC y ATCC13032 pEC-XT99A::ABCM con el vector pVWEX1::rfbBDAC se efectua como se describe anteriormente (Liebl et al., FEMS Microbiol. Lett. 53:299-303 (1989)). La seleccion de los transformandos se efectua en placas de LBHIS-agar (18,5 g/l de infusion de cerebro-corazon Boullion, sorbitol 0,5 M, 5 g/l de bacto-triptona, 2,5 g/l de extracto de bacto-levadura, 5 g/l de NaCl y 18 g/l de bacto-agar, complementado con 5 mg/l de tetraciclina y 25 mg/l de canamicina). Las placas se incubaron dos dias a 33°C. Las cepas obtenidas, portadoras de plasmidos, se llaman C. glutamicum pEC-XT99A pVWEX1::rfbBDAC, C. glutamicum pEC-XT99A::AB pVWEX1::rfbBDAC, C. glutamicum pEC-XT99A::ABM pVWEX1::rfbBDAC, C. glutamicum pEC-XT99A::ABC pVWEX1::rfbBDAC y C. glutamicum pEC-XT99A::ABCM pVWEX1 ::rfbBDAC.

20. Cuantificacion de la produccion de ramnolfpidos mediante cepas recombinantes de C. glutamicum

Las cepas recombinantes de C. glutamicum generadas en los Ejemplos 15 a 19 C. glutamicum pEC-XT99A, C. glutamicum pEC-XT99A::AB, C. glutamicum pEC-XT99A::ABC, C. glutamicum pEC-XT99A::ABM, C. glutamicum pEC-XT99A::ABCM, C. glutamicum pEC-XT99A pVWEX1::rfbBDAC, C. glutamicum pEC-XT99A::AB pVWEX1::rfbBDAC, C. glutamicum pEC-XT99A::ABM pVWEX1::rfbBDAC, C. glutamicum pEC-XT99A::ABC pVWEX1::rfbBDAC y C. glutamicum pEC-XT99A::ABCM pVWEX1::rfbBDAC se cultivan en placas de LBHIS-agar con 5 mg/l de tetraciclina, o bien 5 mg/l de tetraciclina y 25 mg/l de canamicina. Para la investigacion de la produccion de ramnolfpidos en el matraz de agitacion se elaboran cultivos previos en primer lugar. A tal efecto se emplea un asa bacteriologica de una cepa recien extendida sobre placas de LBHIS-agar, y se inoculan 10 ml de medio LBHIS en un matraz Erlenmeyer de 100 ml (18,5 g/l de infusion de cerebro-corazon Boullion, sorbitol 0,5 M, 5 g/l de bacto-triptona, 2,5 g/l de extracto de bacto-levadura y 5 g/l de NaCl, complementado con 5 mg/l de tetraciclina, o bien 5 mg/l de tetraciclina y 25 mg/l de canamicina). El cultivo de las cepas se efectua a 33 °C y 200 rpm durante la noche. A la manana siguiente se inoculan 50 ml de medio CGXII (con 5 mg/l de tetraciclina, o bien 5 mg/l de tetraciclina y 25 mg/l de canamicina) en un matraz Erlenmeyer de 500 ml con deflectores con 1 ml de cultivo previo (OD600 inicial 0,1).

Medio CGXII:

• 20 g/l de (NH4)2SO4 (Merck)

• 5 g/l de urea (Merck)

• 1 g/l de KH2PO4 (Merck)

• 1 g/l de K2HPO4 (Merck)

• 0,25 g/l de MgSO4 • 7H2O (Merck)

• 10 mg/l de CaCl2 (Merck)

• 42 g/l de MOPS (Roth)

• 0,2 mg/l de biotina (Merck)

• 1 ml/l de disolucion salina en trazas

• ajuste de pH 7 con NaOH

• tras el tratamiento en autoclave se anaden 1 ml/l de acido protocatequico (30 g/l disueltos en NaOH diluido, filtrado en medio esteril) y 40 g/l de glucosa (Merck)

Disolucion salina en trazas:

• 10 g/l de FeSO4 • 7H2O (Merck)

• 10 g/l de MnSO4 • H2O (Merck)

• 1 g/l de ZnSO4 • 7H2O (Merck)

• 0,2 g/l de CuSO4 • 5 H2O (Merck)

• 20 mg/l de NiCh • 6 H2O (Merck)

• para disolucion se acidifica a pH 1 con HCl

Los cultivos se cultivan a 200 rpm y 33°C hasta una densidad optica (600 nm) de 0,4 - 0,6. Los cultivos se inducen a esta densidad optica mediante la adicion de IPTG (isopropil-p-D-tiogalactopiranosido; concentracion final 1 mM). La expresion subsiguiente se efectua igualmente a 33°C y 200 rpm durante 72 h. A intervalos de 24 h se extrae una muestra de 1 ml de caldo del matraz de cultivo. La preparacion de muestras para los subsiguientes analisis cromatograficos en si mismos se efectuan como se describe en el Ejemplo 4.

Mientras que C. glutamicum pEC-XT99A no produce ramnolipidos, la formacion de ramnolipidos es identificable en las cepas recombinantes C. glutamicum pEC-XT99A::AB, C. glutamicum pEC-XT99A::ABC, C. glutamicum pEC-XT99A::ABM y C. glutamicum pEC-XT99A::ABCM. Por medio de materiales de referencia se muestra que C. glutamicum pEC-XT99A::AB y C. glutamicum pEC-XT99A::ABM forman unicamente monorramnolipidos, mientras que C. glutamicum pEC-XT99A::ABC, C. glutamicum pEC-XT99A::ABM y C. glutamicum pEC-XT99A::ABCM pueden formar dirramnolipidos y monorramnolipidos. Ademas se muestra que C. glutamicum pEC-XT99A::ABM y C. glutamicum pEC-XT99A::ABCM pueden formar mas monorramnolipidos, o bien dirramnolipidos y monorramnolipidos que las respectivas cepas de referencia C. glutamicum pEC-XT99A::AB y C. glutamicum pEC-XT99A::ABC sin intensificacion del gen pa1131 de Pseudomonas aeruginosa.

Ademas se muestra que las cepas C. glutamicum pEC-XT99A::AB pVWEX1::rfbBDAC, C. glutamicum pEC-XT99A::ABM pVWEX1::rfbBDAC, C. glutamicum pEC-XT99A::ABC pVwEX1::rfbBDAC y C. glutamicum pEC-XT99A::ABCM pVWEX1::rfbBDAC forman sensiblemente mas mono- (C. glutamicum pEC-XT99A::AB pVWEX1::rfbBDAC y C. glutamicum pEC-XT99A::ABM pVWEX1::rfbBDAC), o bien mono- y dirramnolipidos (C. glutamicum pEC-XT99A::ABC pVWEX1 ::rfbBDAC y C. glutamicum pEC-XT99A::ABCM pVWEX1 ::rfbBDAC) que las cepas C. glutamicum pEC-XT99A::ABM, C. glutamicum pEC-XT99A::ABC y C. glutamicum pEC-XT99A::ABCM sin intensificacion de los genes rfbBDA de P. putida.

21. Construccion de cepas de Pseudomonas que portan los plasmidos pBBR1MCS-2, pBBR1MCS-2::AB, pBBR1 MCS-2::ABC, pBBR 1 MCS-2::ABMy pBBR 1 MCS-2::ABCM

Los plasmidos pBBR1 MCS-2, pBBR1 MCS-2::AB, pBBR1 MCS-2::ABC, pBBR1 MCS-2::ABM y pBBR1 MCS-2::ABCM se introducen en Pseudomonas fluorescens DSM 50090, Pseudomonas fluorescens DSM 9958, Pseudomonas putida DSM 6899, Pseudomonas putida DSM 50204, Pseudomonas putida 50194, P. brassicacearum DSM 13227, P. stutzeri DSM 10701, Pseudomonas stutzeri DSM 4166 y Pseudomonas fulva DSM 17717 por electroporacion. La transformacion de cepas de Pseudomonas se efectua como se describe anteriormente (Iwasaki et al. Biosci. Biotech. Biochem. 1994. 58(5):851-854). La seleccion de los transformandos se efectua sobre placas de nutrienteagar (5 g/l de peptona; 3 g/l de extracto de carne; 15 g/l de agar; pH 7; complementado con 50 mg/l de canamicina). Las placas se incuban dos dias a 30°C, o bien 28°C. Las cepas obtenidas, portadoras de plasmidos, se llaman Pseudomonas fluorescens DSM 50090 pBBR1MCS-2, Pseudomonas fluorescens DSM 9958 pBBR1MCS-2, Pseudomonas putida DSM 6899 pBBR1MCS-2, Pseudomonas putida DSM 50204 pBBR1MCS-2, Pseudomonas putida 50194 pBBR1MCS-2, P. brassicacearum DSM 13227 pBBR1MCS-2, P. stutzeri DSM 10701 pBBR1MCS-2, Pseudomonas stutzeri DSM 4166 pBBR1MCS-2, Pseudomonas fulva DSM 17717 pBBR1MCS-2, Pseudomonas fluorescens DSM 50090 pBBR1MCS-2::AB, Pseudomonas fluorescens DSM 9958 pBBR1MCS-2::AB, Pseudomonas putida DSM 6899 pBBR1MCS-2::AB, Pseudomonas putida DSM 50204 pBBR1MCS-2::AB, Pseudomonas putida 50194 pBBR1 MCS-2::AB, P. brassicacearum DSM 13227 pBBR1 MCS-2::AB, P. stutzeri DSM 10701 pBBR1 MCS-2::AB, Pseudomonas stutzeri DSM 4166 pBBR1MCS-2::AB, Pseudomonas fulva DSM 17717 pBBR1MCS-2::AB, Pseudomonas fluorescens DSM 50090 pBBR1MCS-2::ABC, Pseudomonas fluorescens DSM 9958 pBBR1MCS-2::ABC, Pseudomonas putida DSM 6899 pBBR1MCS-2::ABC, Pseudomonas putida DSM 50204 pBBR1MCS-2::ABC, Pseudomonas putida 50194 pBBR1MCS-2::ABC, P. brassicacearum DSM 13227 pBBR1MCS-2::ABC, P. stutzeri DSM 10701 pBBR1MCS-2::ABC, Pseudomonas stutzeri DSM 4166 pBBR1MCS-2::ABC, Pseudomonas fulva DSM 17717 pBBR1MCS-2::ABC, Pseudomonas fluorescens DSM 50090 pBBR1MCS-2::ABCM, Pseudomonas fluorescens DSM 9958 pBBR1MCS-2::ABCM, Pseudomonas putida DSM 6899 pBBR1MCS-2::ABCM, Pseudomonas putida DSM 50204 pBBR1MCS-2::ABCM, Pseudomonas putida 50194 pBBR1MCS-2::ABCM, P. brassicacearum DSM 13227 pBBR1MCS-2::ABCM, P. stutzeri DSM 10701 pBBR1MCS-2::ABCM, Pseudomonas stutzeri DSM 4166 pBBR1MCS-2::ABCM, Pseudomonas fulva DSM 17717 pBBR1MCS-2::ABCM, Pseudomonas fluorescens DSM 50090 pBBR1MCS-2::ABM, Pseudomonas fluorescens DSM 9958 pBBR1MCS-2::ABM, Pseudomonas putida DSM 6899 pBBR1MCS-2::ABM, Pseudomonas putida DSM 50204 pBBR1MCS-2::ABM, Pseudomonas putida 50194 pBBR1MCS-2::ABM, P. brassicacearum DSM 13227 pBBR1MCS-2::ABM, P. stutzeri DSM 10701 pBBR1MCS-2::ABM, Pseudomonas stutzeri DSM 4166 pBBR1MCS-2::ABM y Pseudomonas fulva DSM 17717 pBBR1 MCS-2::ABM.

22. Cuantificacion de la production de ramnolfpidos mediante cepas recombinantes de Pseudomonas

Las cepas recombinantes de Pseudomonas generadas en el Ejemplo 21 Pseudomonas fluorescens DSM 50090, Pseudomonas fluorescens DSM 9958 pBBR1MCS-2, Pseudomonas putida DSM 6899 pBBR1MCS-2, Pseudomonas putida DSM 50204 pBBR1MCS-2, Pseudomonas putida 50194 pBBR1MCS-2, P. brassicacearum DSM 13227 pBBR1MCS-2, P. stutzeri DSM 10701 pBBR1MCS-2, Pseudomonas stutzeri DSM 4166 pBBR1MCS-2, Pseudomonas fulva DSM 17717 pBBR1MCS-2, Pseudomonas fluorescens DSM 50090 pBBR1MCS-2::AB, Pseudomonas fluorescens DSM 9958 pBBR1MCS-2::AB, Pseudomonas putida DSM 6899 pBBR1MCS-2::AB, Pseudomonas putida DSM 50204 pBBR1MCS-2::AB, Pseudomonas putida 50194 pBBR1MCS-2::AB, P. brassicacearum DSM 13227 pBBR1MCS-2::AB, P. stutzeri DSM 10701 pBBR1MCS-2::AB, Pseudomonas stutzeri DSM 4166 pBBR1MCS-2::AB, Pseudomonas fulva DSM 17717 pBBR1MCS-2::AB, Pseudomonas fluorescens DSM 50090 pBBR1MCS-2::ABC, Pseudomonas fluorescens DSM 9958 pBBR1MCS-2::ABC, Pseudomonas putida DSM 6899 pBBR1MCS-2::ABC, Pseudomonas putida DSM 50204 pBBR1MCS-2::ABC, Pseudomonas putida 50194 pBBR1MCS-2::ABC, P. brassicacearum DSM 13227 pBBR1MCS-2::ABC, P. stutzeri DSM 10701 pBBR1MCS-2::ABC, Pseudomonas stutzeri DSM 4166 pBBR1MCS-2::ABC, Pseudomonas fulva DSM 17717 pBBR1MCS-2::ABC, Pseudomonas fluorescens DSM 50090 pBBR1MCS-2::ABCM, Pseudomonas fluorescens DSM 9958 pBBR1MCS-2::ABCM, Pseudomonas putida DSM 6899 pBBR1MCS-2::ABCM, Pseudomonas putida DSM 50204 pBBR1MCS-2::ABCM, Pseudomonas putida 50194 pBBR1MCS-2::ABCM, P. brassicacearum DSM 13227 pBBR1MCS-2::ABCM, P. stutzeri DSM 10701 pBBR1MCS-2::ABCM, Pseudomonas stutzeri DSM 4166 pBBR1MCS-2::ABCM, Pseudomonas fulva DSM 17717 pBBR1MCS-2::ABCM, Pseudomonas fluorescens DSM 50090 pBBR1MCS-2::ABM, Pseudomonas fluorescens DSM 9958 pBBR1MCS-2::ABM, Pseudomonas putida DSM 6899 pBBR1MCS-2::ABM, Pseudomonas putida DSM 50204 pBBR1MCS-2::ABM, Pseudomonas putida 50194 pBBR1 MCS-2::ABM, P. brassicacearum DSM 13227 pBBR1 MCS-2::ABM, P. stutzeri DSM 10701 pBBR1 MCS-2::ABM, Pseudomonas stutzeri DSM 4166 pBBR1MCS-2::ABM y Pseudomonas fulva DSM 17717 pBBR1MCS-2::ABM se cultivan en placas de LB-agar-canamicina (50 pg/ml). El subsiguiente cultivo para la produccion de ramnolfpidos se efectua como se describe en el Ejemplo 12. La preparacion de muestras para los subsiguientes analisis cromatograficos en si mismos se efectuan como se describe en el Ejemplo 4.

Mientras que las cepas de Pseudomonas Pseudomonas fluorescens DSM 50090, Pseudomonas fluorescens DSM 9958 pBBR1 MCS-2, Pseudomonas putida DSM 6899 pBBR1 MCS-2, Pseudomonas putida DSM 50204 pBBR1 MCS-2, Pseudomonas putida 50194 pBBR1MCS-2, P. brassicacearum DSM 13227 pBBR1MCS-2, P. stutzeri DSM 10701 pBBR1MCS-2, Pseudomonas stutzeri DSM 4166 pBBR1MCS-2, Pseudomonas fulva DSM 17717 pBBR1MCS-2 no producen ramnolfpidos, la formacion de monorramnolipidos es verificable en las cepas recombinantes Pseudomonas fluorescens DSM 50090 pBBR1MCS-2::AB, Pseudomonas fluorescens DSM 9958 pBBR1MCS-2::AB, Pseudomonas putida DSM 6899 pBBR1MCS-2::AB, Pseudomonas putida DSM 50204 pBBR1McS-2::AB, Pseudomonas putida 50194 pBBR1 MCS-2::AB, P. brassicacearum DSM 13227 pBBR1 MCS-2::AB, P. stutzeri DSM 10701 pBBR1 MCS-2::AB, Pseudomonas stutzeri DSM 4166 pBBR1MCS-2::AB, Pseudomonas fulva DSM 17717 pBBR1MCS-2::AB, Pseudomonas fluorescens DSM 50090 pBBR1MCS-2::ABM, Pseudomonas fluorescens DSM 9958 pBBR1MCS-2::ABM, Pseudomonas putida DSM 6899 pBBR1MCS-2::ABM, Pseudomonas putida DSM 50204 pBBR1MCS-2::ABM, Pseudomonas putida 50194 pBBR1MCS-2::ABM, P. brassicacearum DSM 13227 pBBR1McS-2::ABM, P. stutzeri DSM 10701 pBBR1MCS-2::ABM, Pseudomonas stutzeri DSM 4166 pBBR1MCS-2::ABM y Pseudomonas fulva DSM 17717 pBBR1MCS-2::ABM, y la formacion de mono- y dirramnolipidos es determinable en las cepas Pseudomonas fluorescens DSM 50090 pBBR1MCS-2::ABC, Pseudomonas fluorescens DSM 9958 pBBR1MCS-2::ABC, Pseudomonas putida DSM 6899 pBBR1MCS-2::ABC, Pseudomonas putida DSM 50204 pBBR1MCS-2::ABC, Pseudomonas putida 50194 pBBR1MCS-2::ABC, P. brassicacearum DSM 13227 pBBR1McS-2::ABC, P. stutzeri DSM 10701 pBBR1MCS-2::ABC, Pseudomonas stutzeri DSM 4166 pBBR1MCS-2::ABc, Pseudomonas fulva DSM 17717 pBBR1MCS-2::ABC, Pseudomonas fluorescens DSM 50090 pBBR1MCS-2::ABcM, Pseudomonas fluorescens DSM 9958 pBBR1MCS-2::ABCM, Pseudomonas putida DSM 6899 pBBR1MCS-2::ABCM, Pseudomonas putida DSM 50204 pBBR1MCS-2::ABCM, Pseudomonas putida 50194 pBBR1MCS-2::ABCM, P. brassicacearum DSM 13227 pBBR1MCS-2::ABCM, P. stutzeri DSM 10701 pBBR1MCS-2::ABCM, Pseudomonas stutzeri DSM 4166 pBBR1McS-2::ABCM y Pseudomonas fulva DSM 17717 pBBR1MCS-2::ABCM.

Ademas, mediante las cepas recombinantes de Pseudomonas Pseudomonas fluorescens DSM 50090 pBBR1MCS-2::ABM, Pseudomonas fluorescens DSM 9958 pBBR1MCS-2::ABM, Pseudomonas putida DSM 6899 pBBR1MCS-2::ABM, Pseudomonas putida DSM 50204 pBBR1MCS-2::ABM, Pseudomonas putida 50194 pBBR1MCS-2::ABM, P. brassicacearum DSM 13227 pBBR1MCS-2::ABM, P. stutzeri DSM 10701 pBBR1MCS-2::ABM, Pseudomonas stutzeri DSM 4166 pBBR1McS-2::ABM Pseudomonas fulva DSM 17717 pBBR1MCS-2::ABM, se forman menos monorramnolipidos, o bien mediante las cepas recombinantes de Pseudomonas Pseudomonas fluorescens DSM 50090 pBBR1MCS-2::ABCM, Pseudomonas fluorescens DSM 9958 pBBR1MCS-2::ABCM, Pseudomonas putida DSM 6899 pBBR1MCS-2::ABcM, Pseudomonas putida DSM 50204 pBBR1MCS-2::ABCM, Pseudomonas putida 50194 pBBR1 MCS-2::ABCM, P. brassicacearum DSM 13227 pBBR1 MCS-2::ABCM, P. stutzeri DSM 10701 pBBR1McS-2::ABCM, Pseudomonas stutzeri DSM 4166 pBBR1MCS-2::ABCM y Pseudomonas fulva DSM 17717 pBBR1MCS-2::ABCM se forman menos mono- y dirramnolipidos que mediante las respectivas cepas de referencia sin el gen de P. aeruginosa pa1131 Pseudomonas fluorescens DSM 50090 pBBR1MCS-2::AB, Pseudomonas fluorescens DSM 9958 pBBR1 Mc S-2::AB, Pseudomonas putida DSM 6899 pBBR1 MCS-2::AB, Pseudomonas putida DSM 50204 pBBR1MCS-2::AB, Pseudomonas putida 50194 pBBR1MCS-2::AB, P. brassicacearum DSM 13227 pBBR1MCS-2::AB, P. stutzeri DSM 10701 pBBR1MCS-2::AB, Pseudomonas stutzeri DSM 4166 pBBR1MCS-2::AB y Pseudomonas fulva DSM 17717 pBBR1MCS-2::AB, o bien Pseudomonas fluorescens DSM 50090 pBBR1MCS-2::ABC, Pseudomonas fluorescens DSM 9958 pBBR1MCS-2::ABC, Pseudomonas putida DSM 6899 pBBR1MCS-2::ABC, Pseudomonas putida DSM 50204 pBBR1MCS-2::ABC, Pseudomonas putida 50194 pBBR1MCS-2::ABC, P. brassicacearum DSM 13227 pBBR1MCS-2::ABC, P. stutzeri ^dS^m10701 pBBR1MCS-2::ABC, Pseudomonas stutzeri DSM 4166 pBBR1MCS-2::ABC y Pseudomonas fulva DSM 17717 pBBR1MCS-2::ABC sin intensificacion del gen pa1131 de Pseudomonas aeruginosa.

23. Construccion de los vectores pBBR1MCS-2::ABPAO1-C1 y pBBR1MCS-2::ABPA7-CE264 para la expresion heterologa de genes alternativos rhlA, rhlB y rhlC de Pseudomonas aeruginosa PAO1, Pseudomonas aeruginosa PA7, Pseudomonas aeruginosa 1 y Burkholderia thailandensis E264 en P. putida

Para la expresion heterologa de los genes rhlA, rhlB y rhlC de Pseudomonas aeruginosa PAO1, o bien Pseudomonas aeruginosa PA7, en primer lugar se construyen los plasmidos pBBR1MCS-2::ABPAO1 (Seq ID Nr.

62) y pBBR1MCS-2::ABPA7 (Seq iD Nr. 63). A tal efecto se sintetizan los operones sinteticos rhlABPAO1 (Seq ID Nr.64) y rhlABPA7 (Seq ID Nr. 65) de la firma DNA 2.0 (Menlo Park, CA, U.S.A) y se interclonan en el vector comercial pJ294 (DNA 2.0). La base para la sintesis es la ya conocida secuencia genomica de las cepas Pseudomonas aeruginosa PAO1 y Pseudomonas aeruginosa PA7. Partiendo de los vectores pJ294::ABPAO1 y pJ294::ABPA7 se cortan los operones sinteticos por medio de Kpnl y Xbal a partir de los vectores, y a continuacion se unen al vector de expresion, cortado con Kpnl y Xbal, pBBR1MCS-2 (Seq ID Nr. 49) (Kovach et al., 1995: Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene, 166:175-176). Los plasmidos resultantes pBBR1MCS-2::ABPAO1 (Seq ID Nr. 62) y pBBR1MCS-2::ABPA7 (Seq ID Nr. 63) tienen un tamano de 7332, o bien 7354 pares de bases. La union, asi como la transformacion de celulas de E. coli DH5a competentes quimicamente (Gibco-BRL, Karlsruhe) se efectua de modo conocido por el especialista. La autenticidad del inserto se verifica mediante analisis secuencial de ADN. En el segundo paso se generan los plasmidos pBBR1MCS-2::ABPAO1-C1 (Seq ID Nr. 66) y pBBR1MCS-2::ABPA7-CE264 (Seq ID Nr. 67). A tal efecto se sintetizan los genes rhlC de Pseudomonas aeruginosa 1 (Seq ID Nr. 68) y Burkholderia thailandensis E264 (Seq ID Nr. 76) de la firma DNA 2.0 (Menlo Park, CA, U.S.A) y se interclonan en el vector comercial pJ294 (DNA 2.0). La base para la sintesis es la ya conocida secuencia genomica de las cepas Pseudomonas aeruginosa 1 y Burkholderia thailandensis E264. Partiendo de los vectores pJ294::C1 y pJ294::CE264 se cortan los genes rhlC por medio de Xba y SacI a partir de los vectores, y a continuacion se unen a los vectores, igualmente cortados con Xba y Sacl, pBBR1MCS-2::ABPAO1 (Seq ID Nr. 62), o bien pBBR1MCS-2::ABPA7 (Seq ID Nr. 63). Los plasmidos resultantes pBBR1MCS-2::ABPAO1-C1 (Seq ID Nr. 66) y pBBR1MCS-2::ABPA7-CE264 (Seq ID Nr. 67) tienen un tamano de 8325, o bien 8335 pares de bases. La union, asi como la transformacion de celulas de E. coli DH5a competentes quimicamente (Gibco-BRL, Karlsruhe) se efectua de modo conocido por el especialista. La autenticidad del inserto se verifica mediante analisis secuencial de ADN.

La transformacion de Pseudomonas putida KT2440 y GPp104 con los vectores pBBR1MCS-2, pBBR1MCS-2::ABPAO1-C1 y pBBR1MCS-2::ABPA7-CE264 se efectua como se describe anteriormente (Iwasaki et al. Biosci. Biotech. Biochem. 1994. 58(5):851-854). Se aisla y se analiza el ADN plasmidico de 10 clones respectivamente. Las cepas obtenidas, portadoras de plasmidos, se llaman P. putida KT2440 pBBR1MCS-2, P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABPAO1-C1, P. putida KT2440 pBBR1 MCS-2::ABPA7-CE264, P. putida GPp104 pBBR1 MCS-2, P. putida GPp104 pBBR1 MCS-2::ABPAO1-C1 y P. putida GPp104 pBBR1 MCS-2::ABPA7-CE264.

24. Cuantificacion de la produccion de ramnolipidos mediante cepas recombinantes de P. putida con genes alternativos rhlA, rhlB y rhlC de Pseudomonas aeruginosa PAO1, Pseudomonas aeruginosa PA7, Pseudomonas aeruginosa 1 y Burkholderia thailandensis E264

Las cepas recombinantes generadas en el Ejemplo 23 P. Putida se cultivan en placas de LB-agar-canamicina (50 pg/ml). El subsiguiente cultivo para la produccion de ramnolipidos se efectua como se describe en el Ejemplo 12. La preparacion de muestras para los subsiguientes analisis cromatograficos en si mismos se efectuan como se describe en el Ejemplo 4.

Mientras las cepas P. putida KT2440 pBBR1MCS-2 y P. putida GPp104 pBBR1MCS-2 no pueden formar mono- y dirramnolipidos, las cepas P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABPAO1-C1, P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABPA7-CE264, P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::ABPAO1-C1 y P. putida GPp104 pBBR1 MCS-2::ABPA7-CE264 forman tanto mono- como tambien dirramnolipidos. Se muestra que las cepas con debilitamiento de la formacion de polihidroxibutirato (P. putida GPp104 pBBR1MCS-2::ABPAO1-C1 y P. putida GPp104 pBBR1 MCS-2::ABPA7-CE264) pueden producir mas mono- o dirramnolipidos que las cepas sin debilitamiento de la formacion de polihidroxibutirato (P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABPAO1-C1 y P. putida KT2440 pBBR1 MCS-2::ABPA7-CE264).

25. Construction de los vectores pBBR1MCS-2::AB_rfbBDAC, pBBR1MCS-2::ABM_rfbBDAC y pBBRIMCS-2::ABMC_rfbBDAC para la sobreexpresion del operon de P. putida rfbBDAC en P. putida y E. coli

Para la construccion de los vectores pBBR1MCS-2::AB_rfbBDAC, pBBR1MCS-2::ABM_rfbBDAC y pBBRIMCS-2::ABMC_rfbBDAC para la sobreexpresion del operon de P. putida rfbBDAC en P. putida y E. coli, en primer lugar se amplifico el operon de P. putida rfbBDAC por pCR. El vector pBBR1MCS-2::rfbBDAC (Seq ID Nr. 45) sirvio como matriz para una PCR. Se emplearon los siguientes oligonucleotidos:

RL_Agel-fw: 5'-TAT AT AT AACCGGTATT AATGCAGCTGGCACGAC-3' (Seq ID Nr. 71)

RL_Agel_rev: 5'-GGCCGACCGGTACTAGTGGA-3' (Seq ID Nr. 72)

La PCR se llevo a cabo con la Phusion™ High-Fidelity Master Mix de New England Biolabs (Frankfurt) polimerasa. Esta se efectuo de modo conocido por el especialista. La secuencia objetivo (promotor de lac y rfbBDAC) se interclono en el sistema Trenzyme Alligator Cloning System. Se seleccionaron transformandos de E. coli DH5a (New England Biolabs; Frankfurt) y se aislo y se secuencio el ADN plasmidico de diversos candidatos. Despues de haber verificado la secuencia y analizado la exactitud de la misma, se corto el vector con Agel. El fragmento objetivo se unio a los vectores, igualmente cortados con Agel, pBBR1MCS-2::AB (Seq ID Nr. 38), pBBR1MCS-2::ABM (Seq ID Nr. 42) y pBBR1MCS-2::ABMC (Seq ID Nr. 51) por medio de metodos de union convencionales. Los vectores resultantes pBBR1MCS-2::AB_rfbBDAC (Seq ID Nr. 73), pBBR1MCS-2::ABM_rfbBDAC (Seq ID Nr. 74) y pBBR1MCS-2::ABMC_rfbBDAC (Seq ID Nr. 75) tienen tamanos de 11960, 13289, o bien 14250 pares de bases. Se secuenciaron los insertos de los vectores. La puesta en practica de la PCR, la verificacion de la amplificacion exitosa de la PCR por medio de electroforesis en gel de agarosa, el tenido con bromuro de etidio de ADN, la determinacion del tamano de fragmento por PCR, la purificacion de los productos de PCR y la determinacion de la concentracion de ADN se efectuaron de modo conocido por el especialista.

La transformacion de Pseudomonas putida KT2440 con los vectores pBBR1MCS-2::AB_rfbBDAC, pBBR1MCS-2::ABM_rfbBDAC y pBBR1MCS-2::ABMC_rfbBDAC se efectuo como se ha descrito anteriormente (Iwasaki et al. Biosci. Biotech. Biochem. 1994. 58(5):851-854). Se aislo y se analizo el ADN plasmidico de 10 clones respectivamente. Las cepas obtenidas, portadoras de plasmidos, se llaman P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::AB_rfbBDAC, P. putida KT2440 pBBR1 MCS-2::ABM_rfbBDAC y P. putida KT2440 pBBR1 MCS-2::ABMC_rfbBDAC.

26. Cuantificacion de la production de ramnolipidos mediante P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::AB_rfbBDAC, P. putida KT2440 pBBR 1 MCS-2::ABM_rfbBDAC, P. putida KT2440 pBBR 1 MCS-2::ABC_rfbBDAC, P. putida KT2440 pBBR 1 MCS-2::-ABMC_rfbBDAC, P. putida KT2440 pBBR 1 MCS-2::AB, P. putida KT2440 pBBR 1 MCS-2::ABM, P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABC y P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABMC recombinante

Las cepas recombinantes de P. putida generadas en los Ejemplos 2, 7 y 25 se cultivan en placas de LB-agarcanamicina (50 pg/ml). El subsiguiente cultivo para la produccion de ramnolipidos se efectua como se describe en el Ejemplo 12. La preparacion de muestras para los subsiguientes analisis cromatograficos en si mismos se efectuan como se describe en el Ejemplo 4.

Se muestra que P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::AB_rfbBDAC, P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABM_rfbBDAC, P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::AB y P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABM pueden formar monorramnolipidos, mientras que P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABMC_rfbBDAC, P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABC_rfbBDAC, P. putida kT2440 pBBR1MCS-2::ABC y P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABMC pueden formar mono- y dirramnolipidos.

Ademas se muestra que P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABM_rfbBDAC, P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABM, KT2440 pBBR1MCS-2::ABMC_rfbBDAC y KT2440 pBBR1MCS-2::ABMC pueden formar mas mono- y dirramnolipidos que las correspondientes cepas de control P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::AB_rfbBDAC, P. putida KT2440 pBBR1 MCS-2::AB, KT2440 pBBR1 MCS-2::ABC_rfbBDAC y KT2440 pBBR1 MCS-2::ABC sin intensificacion del gen de Pseudomonas aeruginosa pa1131.

Finalmente se muestra que P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::AB_rfbBDAC, P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABM_rfbBDAC, P. putida KT2440 pBBR1 MCS-2::ABC_rfbBDAC, P. putida KT2440 pBBR1 MCS-2::ABMC_rfbBDAC pueden formar mas mono- (P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::AB_rfbBDAC y P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABM_rfbBDAC), o bien mono- y dirramnolipidos (P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABC_rfbBDAC y P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABMC_rfbBDAC) que las respectivas cepas de control P. putida KT2440 pBBR1 MCS-2::AB, P. putida KT2440 pBBR1 MCS-2::ABM, P. putida KT2440 pBBR1 MCS-2::ABC, P. putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABMC sin intensificacion de los genes de P. putida rfbBDAC.

27. Generation de E. coli W3110 pBBR1MCS-2::AB, E. coli W3110 pBBR1MCS-2::ABM, E. coli W3110 pBBRIMCS-2::ABC, E. coli W3110 pBBR1MCS-2::ABCM, E. coli W3110 pBBR 1 MCS-2::AB_rfbBDAC, E. coli W3110 pBBR 1 MCS-2::ABM_rfbBDAC, E. coli W3110 pBBR 1 MCS-2::ABC_rfbBDAC y E. coli W3110 pBBR1MCS-2::ABCM_rfbBDAC recombinante

La transformacion de E. coli W3110 se efectuo como se ha descrito anteriormente (Miller JH. A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria. Plainview, NY: Cold Spring Harbor Lab. Press; 1992) por medio de electroporacion. Se aislo y se analizo el ADN plasmidico de 10 clones respectivamente. Las cepas obtenidas, portadoras de plasmido, se llamaron E. coli W3110 pBBR1MCS-2::AB, E. coli W3110 pBBR1MCS-2::ABM, E. coli W3110 pBBR1 MCS-2::ABC, E. coli W3110 pBBR1 MCS-2::ABCM, E. coli W3110 pBBR1 MCS-2::AB_rfbBDAC, E. coli W3110 pBBR1 MCS-2::ABM_rfbBDAC, E. coli W3110 pBBR1 MCS-2::ABC_rfbBDAC y E. coli W3110 pBBR1 MCS-2::ABCM_rfbBDAC.

28. Cuantificacion de la production de ramnolfpidos mediante E. coli W3110 pBBR1MCS-2::AB, E. coli W3110 pBBR 1 MCS-2::ABM, E. coli W3110 pBBR 1 MCS-2::ABC, E. coli W3110 pBBR 1 MCS-2::ABCM, E. coli W3110 pBBR 1 MCS-2::AB_rfbBDAC, E. coli W3110 pBBR 1 MCS-2::ABM_rfbBDAC, E. coli W3110 pBBR1MCS-2::ABC_rfbBDAC y E. coli W3110 pBBR1MCS-2::ABCM_rfbBDAC recombinante

Las cepas recombinantes de E. coli generadas en el ejemplo 27 se cultivan en placas de LB-agar-canamicina (50 gg/ml). El siguiente cultivo para la produccion de ramnolfpidos se efectua como se describe en el Ejemplo 10. La preparacion de muestras para los subsiguientes analisis cromatograficos en si mismos se efectuan como se describe en el Ejemplo 4.

Se muestra que E. coli W3110 pBBR1 MCS-2::AB, E. coli W3110 pBBR1 MCS-2::ABM, E. coli W3110 pBBR1 MCS-2::AB_rfbBDAC y E. coli W3110 pBBR1MCS-2::ABM_rfbBDAC pueden formar monorramnolipidos, mientras que E. coli W3110 pBBR1 MCS-2::ABC, E. coli W3110 pBBR1 MCS-2::ABCM, E. coli W3110 pBBR1 MCS-2::ABC_rfbBDAC y E. coli W3110 pBBR1 MCS-2::ABCM_rfbBDAC pueden formar mono- y dirramnolipidos. Ademas se muestra que E. coli W3110 pBBR1 MCS-2::ABM y E. coli W3110 pBBR1 MCS-2::ABM_rfbBDAC forman mas monorramnolipidos que E. coli W3110 pBBR1MCS-2::AB y E. coli w 3110 pBBR1MCS-2::AB_rfbBDAC sin intensificacion del gen de Pseudomonas aeruginosa pa1131.

Ademas se muestra que E. coli W3110 pBBR1MCS-2::ABCM y E. coli W3110 pBBR1MCS-2::ABCM_rfbBDAC forman mas mono- y dirramnolipidos que E. coli W3110 pBBR1MCS-2::ABC y E. coli W3110 pBBR1MCS-2::ABC_rfbBDAC sin intensificacion del gen de Pseudomonas aeruginosa pa1131. Ademas se muestra que E. coli W3110 pBBR1MCS-2::ABM y E. coli W3110 pBBR1MCS-2::ABM_rfbBDAC forman mas monorramnolipidos que E. coli W3110 pBBR1MCS-2::AB y E. coli W3110 pBBR1MCS-2::AB_rfbBDAC sin intensificacion del gen de Pseudomonas aeruginosa pa1131. Finalmente se muestra que E. coli W3110 pBBR1MCS-2::AB_rfbBDAC, E. coli W3110 pBBR1 MCS-2::ABM_rfbBDAC, E. coli W3110 pBBR1 MCS-2::ABC_rfbBDAC y E. coli W3110 pBBR1 MCS-2::ABCM_rfbBDAC pueden formar mas mono- (E. coli W3110 pBBR1MCS-2::AB_rfbBDAC, E. coli W3110 pBBR1MCS-2::ABM_rfbBDAC), o bien mono- y dirramnolipidos (E. coli W3110 pBBR1MCS-2::ABC_rfbBDAC y E. coli W3110 pBBR1MCS-2::ABCM_rfbBDAC) que las respectivas cepas de control E. coli W3110 pBBR1MCS-2::AB, E. coli W3110 pBBR1 MCS-2::ABM, E. coli W3110 pBBR1MCS-2::ABC y E. coli W3110 pBBR1 MCS-2::ABCM sin intensificacion de los genes de P. putida rfbBDAC.

Claims

REIVINDICACIONES

1.- Celula, seleccionadas a partir de microorganismos, que puede formar al menos un ramnolipido de la Formula general (I),

siendo

m = 2, 1 o 0, en especial 1 o 0,

n = 1 o 0, en especial 1,

R1 y R2 = independientemente entre si, restos organicos iguales o diferentes independientemente entre si, con 2 a 24 atomos de carbono, en especial resto alquilo, en caso dado ramificado, en caso dado sustituido, en especial hidroxisustituido, en caso dado insaturado, en especial, en caso dado, mono-, di- o triinsaturado,

caracterizada por que se modifico mediante tecnica genica de modo que, en comparacion con su tipo salvaje, presenta una actividad acrecentada de al menos una de las enzimas E1, E2 y E3, pudiendo catalizar la enzima E1 la reaccion de 3-hidroxialcanoil-ACP a traves de acido-3-hidroxialcanoil-3-hidroxialcanoico-ACP para dar acido hidroxialcanoil-3-hidroxialcanoico, la enzima E2 es una ramnosiltransferasa I, y puede catalizar la reaccion de dTDP-ramnosa y 3-hidroxialcanoato de 3-hidroxialcanoilo para dar 3-hidroxialcanoato de a-L-ramnosilpiranosil-3-hidroxialcanoilo, y la enzima E3 es una ramnosiltransferasa II, y puede catalizar la reaccion de dTPD-ramnosa y 3-hidroxialcanoato de a-L-ramnopiranosil-3-hidroxialcanoilo para dar 3-hidroxialcanoato de a-L-ramnopiranosil-(1-2)-a-L-ramnopiranosil-3-hidroxialcanoilo, y presenta, en comparacion con su tipo salvaje, una actividad acrecentada, como se especifica a continuacion respectivamente, de al menos una de las enzimas seleccionadas a partir del grupo constituido por

una enzima E4, una dTTP: a-D-glucosa-1-fosfato timidililtransferasa, EC 2.7.7.24, en especial una con la secuencia de polipeptidos Seq ID Nr. 10 o con la secuencia de polipeptidos en la que hasta un 25 % de los restos aminoacido se han modificado frente a la secuencia de referencia Seq ID Nr. 10 mediante delecion, insercion, sustitucion, o una combinacion de los mismos, y que posee al menos un 10 % de la actividad enzimatica de la enzima con la secuencia de referencia Seq ID Nr. 10,

una enzima E5, una dTTP-glucosa-4,6-hidroliasa, EC 4.2.1.46, en especial una con secuencia de polipeptidos Seq ID Nr. 12 o con una secuencia de polipeptidos en la que hasta un 25 % de los restos aminoacido se han modificado respecto a la secuencia de referencia Seq ID Nr. 12 mediante delecion, insercion, sustitucion, o una combinacion de las mismas, y que aun posee al menos un 10 % de la actividad enzimatica de la enzima con la secuencia de referencia Seq ID Nr. 12,

una enzima E6, una dTDP-4-dehidrorramnosa-3,5-epimerasa, EC 5.1.3.13, en especial una con secuencia de polipeptidos Seq ID Nr. 14 o con una secuencia de polipeptidos en la que hasta un 25 % de los restos aminoacido se han modificado respecto a la secuencia de referencia Seq ID Nr. 14 mediante delecion, insercion, sustitucion, o una combinacion de las mismas, y que aun posee al menos un 10 % de la actividad enzimatica de la enzima con la secuencia de referencia Seq ID Nr. 14, y

una enzima E7, una dTDP-4-dehidrorramnosa-reductasa, EC 1.1.1.133, en especial una con secuencia de polipeptidos Seq ID Nr. 16 o con una secuencia de polipeptidos en la que hasta un 25 % de los restos aminoacido se han modificado respecto a la secuencia de referencia Seq ID Nr. 16 mediante delecion, insercion, sustitucion o una combinacion de las mismas, y que aun presenta al menos un 10 % de la actividad enzimatica de la enzima con la secuencia de referencia Seq ID Nr. 16.

2.- Celula segun la reivindicacion 1, caracterizada por que las enzimas E1, E2 y E3 se seleccionan a partir del grupo constituido por

una enzima E1 seleccionada a partir de

una enzima E1a con la secuencia de polipeptidos Seq ID Nr. 2 o con una secuencia de polipeptidos en la que hasta un 25 % de los restos aminoacido se han modificado respecto a la secuencia de referencia Seq ID Nr. 2 mediante delecion, insercion, sustitucion, o una combinacion de las mismas, y que aun posee al menos un 10 % de la actividad enzimatica de la enzima con la secuencia de referencia Seq ID Nr. 2,

una enzima E1b con la secuencia de polipeptidos Seq ID Nr. 18 o con una secuencia de polipeptidos en la que hasta un 25 % de los restos aminoacido se han modificado respecto a la secuencia de referencia Seq ID Nr. 18 mediante delecion, insercion, sustitucion, o una combinacion de las mismas, y que aun posee al menos un 10 % de la actividad enzimatica de la enzima con la secuencia de referencia Seq ID Nr. 18,

una enzima E1c con la secuencia de polipeptidos Seq ID Nr. 78 o con una secuencia de polipeptidos en la que hasta un 25 % de los restos aminoacido se han modificado respecto a la secuencia de referencia Seq ID Nr. 78 mediante delecion, insercion, sustitucion, o una combinacion de las mismas, y que aun posee al menos un 10 % de la actividad enzimatica de la enzima con la secuencia de referencia Seq ID Nr. 78,

una enzima E1d con la secuencia de polipeptidos Seq ID Nr. 80 o con una secuencia de polipeptidos en la que hasta un 25 % de los restos aminoacido se han modificado respecto a la secuencia de referencia Seq ID Nr. 80 mediante delecion, insercion, sustitucion, o una combinacion de las mismas, y que aun posee al menos un 10 % de la actividad enzimatica de la enzima con la secuencia de referencia Seq ID Nr. 80, y

una enzima E1e con la secuencia de polipeptidos Seq ID Nr. 82 o con una secuencia de polipeptidos en la que hasta un 25 % de los restos aminoacido se han modificado respecto a la secuencia de referencia Seq ID Nr. 82 mediante delecion, insercion, sustitucion, o una combinacion de las mismas, y que aun posee al menos un 10 % de la actividad enzimatica de la enzima con la secuencia de referencia Seq ID Nr. 82,

una enzima E2 seleccionada a partir de

una enzima E2a con la secuencia de polipeptidos Seq ID Nr. 4 o con una secuencia de polipeptidos en la que hasta un 25 % de los restos aminoacido se han modificado respecto a la secuencia de referencia Seq ID Nr. 4 mediante delecion, insercion, sustitucion, o una combinacion de las mismas, y que aun posee al menos un 10 % de la actividad enzimatica de la enzima con la secuencia de referencia Seq ID Nr.4,

una enzima E2b con la secuencia de polipeptidos Seq ID Nr. 20 o con una secuencia de polipeptidos en la que hasta un 25 % de los restos aminoacido se han modificado respecto a la secuencia de referencia Seq ID Nr. 20 mediante delecion, insercion, sustitucion, o una combinacion de las mismas, y que aun posee al menos un 10 % de la actividad enzimatica de la enzima con la secuencia de referencia Seq ID Nr. 20,

una enzima E2c con la secuencia de polipeptidos Seq ID Nr. 84 o con una secuencia de polipeptidos en la que hasta un 25 % de los restos aminoacido se han modificado respecto a la secuencia de referencia Seq ID Nr. 84 mediante delecion, insercion, sustitucion, o una combinacion de las mismas, y que aun posee al menos un 10 % de la actividad enzimatica de la enzima con la secuencia de referencia Seq ID Nr. 84,

una enzima E2d con la secuencia de polipeptidos Seq ID Nr. 86 o con una secuencia de polipeptidos en la que hasta un 25 % de los restos aminoacido se han modificado respecto a la secuencia de referencia Seq ID Nr. 86 mediante delecion, insercion, sustitucion, o una combinacion de las mismas, y que aun posee al menos un 10 % de la actividad enzimatica de la enzima con la secuencia de referencia Seq ID Nr. 86, y

una enzima E2e con la secuencia de polipeptidos Seq ID Nr. 88 o con una secuencia de polipeptidos en la que hasta un 25 % de los restos aminoacido se han modificado respecto a la secuencia de referencia Seq ID Nr. 88 mediante delecion, insercion, sustitucion, o una combinacion de las mismas, y que aun posee al menos un 10 % de la actividad enzimatica de la enzima con la secuencia de referencia Seq ID Nr. 88, y

una enzima E3 seleccionada a partir de

una enzima E3a con la secuencia de polipeptidos Seq ID Nr. 6 o con una secuencia de polipeptidos en la que hasta un 25 % de los restos aminoacido se han modificado respecto a la secuencia de referencia Seq ID Nr. 6 mediante delecion, insercion, sustitucion, o una combinacion de las mismas, y que aun posee al menos un 10 % de la actividad enzimatica de la enzima con la secuencia de referencia Seq ID Nr. 6,

una enzima E3b con la secuencia de polipeptidos Seq ID Nr. 22 o con una secuencia de polipeptidos en la que hasta un 25 % de los restos aminoacido se han modificado respecto a la secuencia de referencia Seq ID Nr. 22 mediante delecion, insercion, sustitucion, o una combinacion de las mismas, y que aun posee al menos un 10 % de la actividad enzimatica de la enzima con la secuencia de referencia Seq ID Nr. 22,

una enzima E3c con la secuencia de polipeptidos Seq ID Nr. 90 o con una secuencia de polipeptidos en la que hasta un 25 % de los restos aminoacido se han modificado respecto a la secuencia de referencia Seq ID Nr. 90 mediante delecion, insercion, sustitucion, o una combinacion de las mismas, y que aun posee al menos un 10 % de la actividad enzimatica de la enzima con la secuencia de referencia Seq ID Nr. 90, y

una enzima E3d con la secuencia de polipeptidos Seq ID Nr. 92 o con una secuencia de polipeptidos en la que hasta un 25 % de los restos aminoacido se han modificado respecto a la secuencia de referencia Seq ID Nr. 92 mediante delecion, insercion, sustitucion, o una combinacion de las mismas, y que aun posee al menos un 10 %, de la actividad enzimatica de la enzima con la secuencia de referencia Seq ID Nr. 92.

3. - Celula segun al menos una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada por que presenta una actividad acrecentada de la combinacion de enzimas E1E2E3 y n es = 1.

4. - Celula segun al menos una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada por que se selecciona a partir de una especie del grupo constituido por Aspergillus, Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus, Acinetobacter, Alcaligenes, Lactobacillus, Paracoccus, Lactococcus, Candida, Pichia, Hansenula, Kluyveromyces, Saccharomyces, Escherichia, Zymomonas, Yarrowia, Methylobacterium, Ralstonia, Pseudomonas, Rhodospirillum, Rhodobacter, Burkholderia, Clostridium y Cupriavidus.

5. - Celula segun al menos una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada por que, como tipo salvaje, puede formar polihidroxialcanoatos con longitudes de cadena de C6 a C16, en especial aquella se modifico mediante tecnica genica de modo que puede formar menos polihidroxialcanoatos en comparacion con su tipo salvaje.

6. - Celula segun la reivindicacion 5, caracterizada por que la celula, en comparacion con su tipo salvaje, presenta una actividad reducida de al menos una enzima Eg o E1o,

representando E9 una polihidroxialcanoato-sintasa, EC:2.3.1.- con la capacidad de transformar 3-hidroxialcanoilcoenzima A en acido poli-3-hidroxialcanoico, en especial con la secuencia de polipeptidos Seq ID Nr. 30 o Seq ID Nr. 32, o con una secuencia de polipeptidos en la que hasta un 25 % de los restos aminoacido estan transformados frente a la respectiva secuencia de referencia Seq ID Nr. 30 o Seq ID Nr. 32 mediante delecion, insercion, sustitucion, o una combinacion de las mismas, y que aun posee al menos un 10 % de la actividad enzimatica de la enzima con la respectiva secuencia objetivo Seq ID Nr. 30 o Seq ID Nr. 32, y

E10 una 3-hidroxialcanoil-ACP:coenzima A-transferasa con la capacidad de transformar 3-hidroxialcanoil-ACP en 3-hidroxialcanoil-coenzima A, en especial con la secuencia de polipeptidos Seq ID Nr. 34 o Seq ID Nr. 36, o con una secuencia de polipeptidos en la que hasta un 25 % de los restos aminoacido estan transformados frente a la respectiva secuencia de referencia Seq ID Nr. 34 o Seq ID Nr. 36 mediante delecion, insercion, sustitucion, o una combinacion de las mismas, y que aun posee al menos un 10 % de la actividad enzimatica de la enzima con la respectiva secuencia objetivo Seq ID Nr. 34 o Seq ID Nr. 36.

7. - Celula segun una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada por que, en comparacion con su tipo salvaje, presenta una actividad acrecentada de al menos una enzima E8, que cataliza la exportacion de un ramnolipido de la Formula general (I) de la celula al medio circundante, preferentemente con la secuencia de polipeptidos Seq ID Nr. 8, Seq ID Nr. 24, Seq ID Nr. 26 o Seq ID Nr. 28, o con una secuencia de polipeptidos en la que hasta un 25 % de los restos aminoacido se han modificado frente a la respectiva secuencia de referencia Seq ID Nr. 8, Seq ID Nr. 24, Seq ID Nr. 26 o Seq ID Nr. 28 mediante delecion, insercion, sustitucion, o una combinacion de las mismas, y que posee aun al menos un 10 % de la actividad enzimatica de la enzima con la respectiva secuencia de referencia Seq ID Nr. 8, Seq ID Nr. 24, Seq ID Nr. 26 o Seq ID Nr. 28.

8. - Celula segun una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada por que presenta al menos un acido nucleico aislado, que presenta al menos, en cada caso, una secuencia seleccionada a partir de los tres grupos [A1 a G1], [A2 a G2] y [A3 a G3],

estando constituido el grupo [A1 a G1] por las siguientes secuencias:

C1a) una secuencia que codifica una proteina o un peptido que comprende la secuencia de aminoacidos segun Seq ID Nr. 2,

D1 a) una secuencia que es identica a una secuencia segun uno de los grupos A1 a) a C1 a) en al menos un 70 %, E1a) una secuencia que hibrida con la contrahebra de una secuencia segun uno de los grupos A1a) a D1a), o hibridaria bajo consideracion de la degeneracion del codigo genetico, pudiendo codificar esta secuencia para una proteina o un peptido que puede transformar 3-hidroxidecanoil-ACP a traves de 3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoil-ACP en acido 3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico, y las condiciones de hibridacion son incubacion a 65°C durante la noche en 7 % de SDS, 1 % de BSA, EDTA 1 mM, tampon fosfato sodico 250 mM (pH 7,2), y

lavado subsiguiente a 65°C con 2 x SSC; 0,1 % de SDS,

F1a) un derivado, obtenido mediante sustitucion, adicion, inversion y/o delecion de al menos una base, pero no mas de 100 bases, de una secuencia segun uno de los grupos A1a) a E1a),

G1a) una secuencia complementaria a una secuencia segun uno de los grupos A1 a) a F1 a),

C1b) una secuencia que codifica una proteina o un peptido que comprende la secuencia de aminoacidos segun Seq ID Nr. 18,

D1 b) una secuencia que es identica a una secuencia segun uno de los grupos A1 b) a C1 b) en al menos un 70 %, E1b) una secuencia que hibrida con la contrahebra de una secuencia segun uno de los grupos A1b) a D1b), o hibridaria bajo consideracion de la degeneracion del codigo genetico, pudiendo codificar esta secuencia para una proteina o un peptido que puede transformar 3-hidroxitetradecanoil-ACP a traves de 3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoil-ACP en acido 3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico,

y las condiciones de hibridacion son incubacion a 65°C durante la noche en 7 % de SDS, 1 % de BSA, EDTA 1 mM, tampon fosfato sodico 250 mM (pH 7,2), y lavado subsiguiente a 65°C con 2 x SSC; 0,1 % de SDS,

F1b) un derivado, obtenido mediante sustitucion, adicion, inversion y/o delecion de al menos una base, pero no mas de 100 bases, de una secuencia segun uno de los grupos A1b) a E1b), y

G1b) una secuencia complementaria a una secuencia segun uno de los grupos A1b) a F1b), y

estando constituido el grupo [A2 a G2] por las siguientes secuencias:

C2a) una secuencia que codifica una proteina o un peptido que comprende la secuencia de aminoacidos segun Seq ID Nr. 4,

D2a) una secuencia que es identica a una secuencia segun uno de los grupos A2a) a C2a) en al menos un 80 %,

E2a) una secuencia que hibrida con la contrahebra de una secuencia segun uno de los grupos A2a) a D2a), o hibridaria bajo consideracion de la degeneracion del codigo genetico, pudiendo codificar esta secuencia para una proteina o un peptido que puede transformar dTDP-ramnosa y acido 3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico en acido a-L-ramnopiranosil-3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico, y las condiciones de hibridacion son incubacion a 65°C durante la noche en 7 % de SDS, 1 % de BSA, EDTA 1 mM, tampon fosfato sodico 250 mM (pH 7,2), y lavado subsiguiente a 65°C con 2 x SSC; 0,1 % de SDS,

F2a) un derivado, obtenido mediante sustitucion, adicion, inversion y/o delecion de al menos una base, pero no mas de 100 bases, de una secuencia segun uno de los grupos A2a) a E2a),

G2a) una secuencia complementaria a una secuencia segun uno de los grupos A2a) a F2a),

C2b) una secuencia que codifica una proteina o un peptido que comprende la secuencia de aminoacidos segun Seq ID Nr. 20,

D2b) una secuencia que es identica a una secuencia segun uno de los grupos A2b) a C2b) en al menos un 70 %,

E2b) una secuencia que hibrida con la contrahebra de una secuencia segun uno de los grupos A2b) a D2b), o hibridaria bajo consideracion de la degeneracion del codigo genetico, pudiendo codificar esta secuencia para una proteina o un peptido que puede transformar dTDP-ramnosa y acido 3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico en acido a-L-ramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico, y las condiciones de hibridacion son incubacion a 65°C durante la noche en 7 % de SDS, 1 % de BSA, EDTA 1 mM, tampon fosfato sodico 250 mM (pH 7,2), y lavado subsiguiente a 65°C con 2 x SSC; 0,1 % de SDS,

F2b) un derivado, obtenido mediante sustitucion, adicion, inversion y/o delecion de al menos una base, pero no mas de 100 bases de una secuencia segun uno de los grupos A2b) a E2b), y

G2b) una secuencia complementaria a una secuencia segun uno de los grupos A2b) a F2b), y

estando constituido el grupo [A3 a G3] por las siguientes secuencias:

C3a) una secuencia que codifica una proteina o un peptido que comprende la secuencia de aminoacidos segun Seq ID Nr. 6,

D3a) una secuencia que es identica a una secuencia segun uno de los grupos A3a) a C3a) en al menos un 80 %,

E3a) una secuencia que hibrida con la contrahebra de una secuencia segun uno de los grupos A3a) a D3a), o hibridaria bajo consideracion de la degeneracion del codigo genetico, pudiendo codificar esta secuencia para una proteina o un peptido que puede transformar dTDP-ramnosa y acido a-L-ramnopiranosil-3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico en acido a-L-ramnopiranosil-(1-2)-a-L-ramnopiranosil-3-hidroxidecanoil-3-hidroxidecanoico, y las condiciones de hibridacion son incubacion a 65°C durante la noche en 7 % de SDS, 1 % de BSA, ED^tA 1 mM, tampon fosfato sodico 250 mM (pH 7,2), y lavado subsiguiente a 65°C con 2 x SSC; 0,1 % de SDS,

F3a) un derivado, obtenido mediante sustitucion, adicion, inversion y/o delecion de al menos una base, pero no mas de 100 bases, de una secuencia segun uno de los grupos A3a) a E3a),

G3a) una secuencia complementaria a una secuencia segun uno de los grupos A3a) a F3a),

C3b) una secuencia que codifica una proteina o un peptido que comprende la secuencia de aminoacidos segun Seq ID Nr. 22,

D3b) una secuencia que es identica a una secuencia segun uno de los grupos A3b) a C3b) en al menos un 60 %,

E3b) una secuencia que hibrida con la contrahebra de una secuencia segun uno de los grupos A3b) a D3b), o hibridaria bajo consideracion de la degeneracion del codigo genetico, pudiendo codificar esta secuencia para una proteina o un peptido que puede transformar dTDP-ramnosa y acido a-L-ramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico en acido a-L-ramnopiranosil-(1-2)-a-L-ramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoil-3-hidroxitetradecanoico, y las condiciones de reaccion son incubacion a 65°C durante la noche en 7 % de SDS, 1 % de BSA, EDTA 1 mM, tampon fosfato sodico 250 mM (pH 7,2), y lavado subsiguiente a 65°C con 2 x SSC; 0,1 % de SDS,

F3b) un derivado, obtenido mediante sustitucion, adicion, inversion y/o delecion de al menos una base, pero no mas de 100 bases, de una secuencia segun uno de los grupos A3b) a E3b), y

G3b) una secuencia complementaria a una secuencia segun uno de los grupos A3b) a F3b),

o al menos un vector, en especial un vector de expresion o un cassette de sobreexpresion genica, que comprende al menos una secuencia de acidos nucleicos seleccionada a partir de Seq ID Nr. 38, Seq ID Nr. 40, Seq ID Nr. 42, Seq ID Nr. 45, Seq ID Nr. 47 y acidos nucleicos seleccionados a partir de los tres grupos citados anteriormente [A1 a G1], [A2 a G2] y [A3 a G3].

9.- Procedimiento para la produccion de ramnolipidos de la formula general (I), que comprende los pasos de procedimiento

I) puesta en contacto de una celula segun una de las reivindicaciones 1 a 8 con un medio que contiene una fuente de carbono,

III) en caso dado aislamiento de los ramnolipidos formados.