JP2019531750A - 減少したグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するラムノリピド産生細胞 - Google Patents

Abstract

本発明は、ラムノリピドを産生し、かつその野生型と比較してグルコースデヒドロゲナーゼの減少した活性を有するように遺伝子改変された細胞、および本発明による細胞を用いたラムノリピドの製造方法に関する。

Description

発明の分野
本発明は、ラムノリピドを産生し、かつその野生型と比較してグルコースデヒドロゲナーゼの減少した活性を有するように遺伝子改変された細胞、および本発明による細胞を用いたラムノリピドの製造方法に関する。

従来技術
独国特許出願公開第１０２０１２２０１３６０号明細書（ＤＥ １０２０１２２０１３６０）には、ラムノリピドを産生し、かつその野生型と比較して特定の酵素および酵素の組合せの減少または増大した活性を有するように遺伝子改変された細胞（これは、該細胞が有利にラムノリピドを産生することを意味する）、および該発明による細胞を用いたラムノリピドの製造方法が記載されている。

本発明の目的は、使用される炭素源に基づいてラムノリピドの増大した収率を有する細胞を提供することである。

発明の説明
驚くべきことに、以下に記載する細胞が前述の目的を達成できることが判明した。

本発明は、ラムノリピドを産生し、かつその野生型と比較してグルコースデヒドロゲナーゼの減少した活性を有するように遺伝子改変された細胞を提供する。本発明はさらに、上記細胞を生体触媒として使用するラムノリピドの製造方法を提供する。

本発明の利点の１つに、病原性ではなく、培養しやすい生物を使用できるという点がある。

本発明のもう１つの利点は、広範な炭素源の選択肢を利用できるという点にある。

さらなる利点は、いかなる場合にも単独の基質としてまたは補助基質としての油を使用しなくてもよいことである。

もう１つの利点は、本発明を用いることで、所定のおよび調整可能な特性を有するラムノリピドを製造できるという点にある。

さらなる利点は、ラムノリピドを、その活性が変更されていない細胞を用いた場合よりも高い空時収率および高い炭素収率で製造できるという点にある。

したがって本発明は、少なくとも１つのラムノリピドを産生できる細胞、有利には単離細胞であって、該細胞は、その野生型と比較して、Ｄ−グルコースおよびキノンからＤ−グルコノ−１，５−ラクトンおよびキノールへの転化を触媒する少なくとも１つの酵素Ｅ_１の減少した活性を有するように遺伝子改変されていることを特徴とする細胞を提供する。

本明細書において、細胞の「野生型」という用語は、そのゲノムが進化により自然に生じた状態で存在する細胞を意味する。この用語は、細胞全体と個々の遺伝子の双方に使用される。したがって「野生型」という用語には、その遺伝子配列がヒトにより組換え技法を用いて少なくとも部分的に改変された細胞または遺伝子は特に含まれない。「野生型」という用語は、特に生物の自然個体群の数で最も頻繁に生じる表現型、遺伝子型または遺伝子を意味する。

本発明において、「ラムノリピド」という用語は、一般式（Ｉ）

［式中、
ｍは、２、１または０、特に１または０であり、
ｎは、１または０、特に１であり、
Ｒ^１は、２〜２４個、有利には５〜１３個の炭素原子を有し、特に場合により分岐状の、場合により置換された、特にヒドロキシで置換された、場合により不飽和の有機基、特に場合により一不飽和、二不飽和または三不飽和のアルキル基であり、有利にはペンテニル、ヘプテニル、ノネニル、ウンデセニルおよびトリデセニルおよび（ＣＨ_２）_ｏ−ＣＨ_３（ここで、ｏは、１〜２３、有利には４〜１２である）からなる群から選択されるものであり、かつ
Ｒ^２は、互いに独立して、２〜２４個、有利には５〜１３個の炭素原子を有する同一のまたは異なる有機基、特に場合により分岐状の、場合により置換された、特にヒドロキシで置換された、場合により不飽和の、特に場合により一不飽和、二不飽和または三不飽和のアルキル基であり、有利にはペンテニル、ヘプテニル、ノネニル、ウンデセニルおよびトリデセニルおよび（ＣＨ_２）_ｏ−ＣＨ_３（ここで、ｏは、１〜２３、有利には４〜１２である）からなる群から選択されるものである］の化合物またはその塩を意味すると解釈される。

本発明による細胞が、ｍ＝１のラムノリピドを産生できる場合には、Ｒ^１およびＲ^２により決定される基

は、３−ヒドロキシオクタノイル−３−ヒドロキシオクタン酸、３−ヒドロキシオクタノイル−３−ヒドロキシデカン酸、３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシオクタン酸、３−ヒドロキシオクタノイル−３−ヒドロキシデセン酸、３−ヒドロキシデセノイル−３−ヒドロキシオクタン酸、３−ヒドロキシオクタノイル−３−ヒドロキシドデカン酸、３−ヒドロキシドデカノイル−３−ヒドロキシオクタン酸、３−ヒドロキシオクタノイル−３−ヒドロキシドデセン酸、３−ヒドロキシドデセノイル−３−ヒドロキシオクタン酸、３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸、３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデセン酸、３−ヒドロキシデセノイル−３−ヒドロキシデカン酸、３−ヒドロキシデセノイル−３−ヒドロキシデセン酸、３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシドデカン酸、３−ヒドロキシドデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸、３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシドデセン酸、３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシテトラデセン酸、３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシデセン酸、３−ヒドロキシドデセノイル−３−ヒドロキシデカン酸、３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸、３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸、３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシテトラデセン酸、３−ヒドロキシテトラデセノイル−３−ヒドロキシデカン酸、３−ヒドロキシドデカノイル−３−ヒドロキシドデカン酸、３−ヒドロキシドデセノイル−３−ヒドロキシドデカン酸、３−ヒドロキシドデカノイル−３−ヒドロキシドデセン酸、３−ヒドロキシドデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸、３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシドデカン酸、３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸、３−ヒドロキシヘキサデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸、３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシヘキサデカン酸または３−ヒドロキシヘキサデカノイル−３−ヒドロキシヘキサデカン酸から誘導されることが有利である。

本発明による細胞が一般式（Ｉ）の種々のラムノリピドの混合物も産生し得ることは、当業者には自明である。

これに関連して、本発明による細胞は、産生されたラムノリピドの８０重量％超、有利には９０重量％超、特に有利には９５重量％超がｎ＝１であり、かつＲ^１およびＲ^２により決定される基に関して、産生されたラムノリピドの２０重量％未満、有利には１５重量％未満が３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシオクタン酸または３−ヒドロキシオクタノイル−３−ヒドロキシデカン酸に由来することを特徴とする一般式（Ｉ）のラムノリピドの混合物を産生できることが有利であり、ここで、表示された重量％は、産生された一般式（Ｉ）の全ラムノリピドの合計を基準とする。

本発明において列挙されたアクセッション番号は、２０１６年１月２６日付のＮＣＢＩのタンパク質構造データベースのエントリに相応し、総じてこの場合には、エントリのバージョン番号は、例えば「．１」のように「．数」により特定される。

別段の記載がない限り、所与のパーセンテージ（％）はいずれも、重量パーセントである。

したがって、使用される「酵素Ｅ_ｘの減少した活性」という表現は、有利には少なくとも０．５倍、特に有利には少なくとも０．１倍、さらに有利には少なくとも０．０１倍、なおもさらに有利には０．００１倍、最も有利には少なくとも０．０００１倍に減少した活性を意味すると解釈される。「減少した活性」という表現には、検出不可能な活性も含まれる（「活性０」）。

微生物において酵素活性を減少させる方法は、当業者に公知である。ここでは、分子生物学的技法が特に有効である。例えば特定の酵素の活性を、標的突然変異により、または特定の酵素の活性を減少させる当業者に公知の他の方法により減少させることができる。特にシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）およびバークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）についての、特に特定の遺伝子を阻害するための、タンパク質発現を変更および減少させかつそれに付随して酵素活性を減少させる指示は、当業者により例えばＤｕｂｅａｕ ｅｔ ａｌ． ２００９． ＢＭＣ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ９：２６３；Ｓｉｎｇｈ ＆ Ｒｏｅｈｍ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ． ２００８． １５４：７９７−８０９またはＬｅｅ ｅｔ ａｌ． ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ． ２００９． ２９７（１）：３８−４８において見ることができる。以下に記載する酵素Ｅ_１の酵素活性を減少させるための有利な方法を、本発明においてさらなる酵素活性を減少させるために同様に有利に使用することができる。

本発明による有利な細胞は、酵素Ｅ_１をコードする遺伝子の遺伝子改変によって酵素活性の減少が達成されることを特徴とし、ここで、この改変は、遺伝子への外来ＤＮＡの挿入、遺伝子の少なくとも一部の欠失、遺伝子配列における点突然変異、特に例えばプロモーターやターミネーターといった制御配列中のもしくは該配列の遺伝子配列における点突然変異、またはリボソーム結合部位の遺伝子配列における点突然変異を含み、有利にはこれらからなる群から選択される。

これに関連して、外来ＤＮＡとは、（生物にとってではなく）遺伝子にとって「外来」である任意のＤＮＡ配列を意味すると解釈され、すなわちこれに関連して、内因性ＤＮＡ配列も「外来ＤＮＡ」として機能し得る。これに関連して、選択マーカー遺伝子の挿入により、遺伝子は特に有利に中断される。したがって、外来ＤＮＡは選択マーカー遺伝子であり、挿入は有利には遺伝子座への相同組換えにより行われている。

あるいは本発明による有利な細胞は、酵素Ｅ_１をコードする遺伝子の目的の転写または転写後遺伝子サイレンシングにより、特に酵素Ｅ_１をコードする遺伝子のプロモーターへの少なくとも１つのリプレッサー結合を用いて、ナンセンスコドン介在的ｍＲＮＡ分解（ＮＭＤ）およびＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を用いて酵素活性の減少が達成されることを特徴とし、その際、ＲＮＡｉでは、有利にはマイクロＲＮＡ方法論（ｍｉＲＮＡ）または低分子干渉ＲＮＡ法（ｓｉＲＮＡ）が利用され、これによって、酵素Ｅ_１のｍＲＮＡが分解される。

本発明によれば、Ｅ_１がＥＣ１．１．５．２のグルコース１−デヒドロゲナーゼであることが有利である。特に有利な酵素Ｅ_１は、
ｇｃｄ遺伝子によりコードされる酵素、および
ｇｃｄ遺伝子によりコードされる酵素に対してアミノ酸残基の２５％まで、有利には２０％まで、特に有利には１５％まで、とりわけ１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％までが欠失、挿入、置換もしくはそれらの組合せにより改変されているポリペプチド配列を有し、かつｇｃｄ遺伝子によりコードされる酵素の参照配列を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％、有利には５０％、特に有利には８０％、特に９０％超をなおも有する酵素
から選択される。

特に、酵素Ｅ_１は、
ポリペプチド配列ＡＡＮ６７０６６．１を有するか、または
ＡＡＮ６７０６６．１に対してアミノ酸残基の２５％まで、有利には２０％まで、特に有利には１５％まで、とりわけ１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％までが欠失、挿入、置換もしくはそれらの組合せにより改変されているポリペプチド配列を有し、かつ参照配列ＡＡＮ６７０６６．１を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％、有利には５０％、特に有利には８０％、とりわけ９０％超をなおも有する
酵素Ｅ_１から選択される。

本発明による細胞は、原核生物であっても真核生物であってもよい。これらは、哺乳類細胞（例えばヒトの細胞）、植物細胞または微生物、例えば酵母、真菌または細菌であることができ、微生物は特に有利であり、細菌および酵母が最も有利である。

さらに、本発明によれば、本発明による細胞が、野生型としてＣ_６〜Ｃ_１６のモノアルカノエートの鎖長を有するポリヒドロキシアルカノエートを産生し得る細胞である場合に有利である。このような細胞は、例えばバークホルデリア種（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ．）、バークホルデリア・タイランデンシス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｔｈａｉｌａｎｄｅｎｓｉｓ）、シュードモナス種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・エルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・オレオボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）、シュードモナス・クロロラフィス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ）、シュードモナス・スタッツェリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・シトロネロリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｉｔｒｏｎｅｌｌｏｌｉｓ）、シュードモナス・レシノボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｓｉｎｏｖｏｒａｎｓ）、コマモナス・テストステローニ（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）、エロモナス・ハイドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）、カプリアビダス・ネカトール（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ）、アルカリゲネス・レータス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｌａｔｕｓ）およびラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）である。これに関連して、有利な本発明の細胞は、該細胞がその野生型と比較してより少ないポリヒドロキシアルカノエートしか産生できないように遺伝子改変されている。

細菌の群のなかでは、特にシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、大腸菌およびバークホルデリア・タイランデンシス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｔｈａｉｌａｎｄｅｎｓｉｓ）が特に有利である。

本発明による細胞の出発株は、天然のラムノリピド産生体であることができ、野生型として既にラムノリピドを産生する細胞であってもよいし、単に遺伝子工学によってラムノリピド産生が可能になったにすぎない細胞であってもよい。

どちらの場合にも、本発明による有利な細胞は、該細胞がその野生型と比較してＥ_２、Ｅ_３およびＥ_４の群から選択される少なくとも１つの酵素の増大した活性を有するように遺伝子改変されているということから有益性を得ており、ここで、酵素Ｅ_２は、３−ヒドロキシアルカノイル−ＡＣＰから３−ヒドロキシアルカノイル−３−ヒドロキシアルカン酸−ＡＣＰを経由してヒドロキシアルカノイル−３−ヒドロキシアルカン酸への転化を触媒することができ、酵素Ｅ_３は、ラムノシルトランスフェラーゼＩであり、かつｄＴＤＰ−ラムノースおよび３−ヒドロキシアルカノイル−３−ヒドロキシアルカノエートからα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシアルカノイル−３−ヒドロキシアルカノエートへの転化を触媒することができ、かつ酵素Ｅ_４は、ラムノシルトランスフェラーゼＩＩであり、かつｄＴＤＰ−ラムノースおよびα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシアルカノイル−３−ヒドロキシアルカノエートからα−Ｌ−ラムノピラノシル−（１−２）−α−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシアルカノイル−３−ヒドロキシアルカノエートへの転化を触媒することができる。

酵素Ｅ_２は、有利には、
ｒｈｌＡ遺伝子によりコードされる酵素、ならびに
ｒｈｌＡ遺伝子によりコードされる酵素に対してアミノ酸残基の２５％まで、有利には２０％まで、特に有利には１５％まで、とりわけ１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％までが欠失、挿入、置換もしくはそれらの組合せにより改変されているポリペプチド配列を有し、かつｒｈｌＡ遺伝子によりコードされる酵素の参照配列を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％、有利には５０％、特に有利には８０％、特に９０％超をなおも有する酵素
から選択される。

酵素Ｅ_３は、有利には、
ｒｈｌＢ遺伝子によりコードされる酵素、ならびに
ｒｈｌＢ遺伝子によりコードされる酵素に対してアミノ酸残基の２５％まで、有利には２０％まで、特に有利には１５％まで、とりわけ１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％までが欠失、挿入、置換もしくはそれらの組合せにより改変されているポリペプチド配列を有し、かつｒｈｌＢ遺伝子によりコードされる酵素の参照配列を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％、有利には５０％、特に有利には８０％、特に９０％超をなおも有する酵素
から選択される。

酵素Ｅ_４は、有利には、
ｒｈｌＣ遺伝子によりコードされる酵素、ならびに
ｒｈｌＣ遺伝子によりコードされる酵素に対してアミノ酸残基の２５％まで、有利には２０％まで、特に有利には１５％まで、とりわけ１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％までが欠失、挿入、置換もしくはそれらの組合せにより改変されているポリペプチド配列を有し、かつｒｈｌＣ遺伝子によりコードされる酵素の参照配列を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％、有利には５０％、特に有利には８０％、特に９０％超をなおも有する酵素
から選択される。

Ｅ_２、Ｅ_３およびＥ_４に特に有利なもの：
酵素Ｅ_２は、次のものからなる群から選択される：
少なくとも１つの酵素Ｅ_２ａであって、
ポリペプチド配列ＡＤＰ０６３８７．１を有するか、または
参照配列ＡＤＰ０６３８７．１に対してアミノ酸残基の２５％まで、有利には２０％まで、特に有利には１５％まで、とりわけ１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％までが欠失、挿入、置換もしくはそれらの組合せにより改変されているポリペプチド配列を有し、かつ参照配列ＡＤＰ０６３８７．１を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％、有利には５０％、特に有利には８０％、特に９０％超をなおも有する
酵素Ｅ_２ａであり、ここで、酵素Ｅ_２ａの酵素活性とは、３−ヒドロキシデカノイル−ＡＣＰから３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸−ＡＣＰを経由してヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸へと転化させる能力を意味すると解釈される；
少なくとも１つの酵素Ｅ_２ｂであって、
ポリペプチド配列ＡＩＰ２９４７１．１、ＣＢＩ７１０２１．１、ＮＰ＿２５２１６９．１、ＡＢＲ８１１０６．１、ＹＰ＿４３９２７２．１、ＹＰ＿１１１３６２．１、ＹＰ＿１１０５５７．１、ＹＰ＿１０５２３１．１、ＺＰ＿０２４６１６８８．１、ＺＰ＿０２３５８９４９．１、ＺＰ＿０１７６９１９２．１、ＺＰ＿０４８９３１６５．１、ＺＰ＿０２２６５３８７．２、ＺＰ＿０２５１１７８１．１、ＺＰ＿０３４５６８３５．１、ＺＰ＿０３７９４６３３．１、ＹＰ＿９９０３２９．１、ＺＰ＿０２４０８７２７．１、ＹＰ＿００２９０８２４３．１、ＺＰ＿０４８８４０５６．１、ＹＰ＿００４３４８７０３．１、ＺＰ＿０４９０５３３４．１、ＺＰ＿０２３７６５４０．１、ＥＧＣ９９８７５．１、ＺＰ＿０２９０７６２１．１、ＹＰ＿００１８１１６９６．１、ＺＰ＿０２４６６６７８．１、ＺＰ＿０２８９１４７５．１、ＹＰ＿７７６３９３．１、ＹＰ＿００２２３４９３９．１、ＹＰ＿００１７７８８０４．１、ＹＰ＿３７１３１４．１、ＺＰ＿０４９４３３０５．１、ＹＰ＿６２３１３９．１、ＺＰ＿０２４１７２３５．１もしくはＺＰ＿０４８９２０５９．１を有するか、または
特定の前記アクセッション番号に対してアミノ酸残基の２５％まで、有利には２０％まで、特に有利には１５％まで、とりわけ１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％までが欠失、挿入、置換もしくはそれらの組合せにより改変されているポリペプチド配列を有し、かつ特定の前記アクセッション番号を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％、有利には５０％、特に有利には８０％、特に９０％超をなおも有する
酵素Ｅ_２ｂであり、ここで、酵素Ｅ_２ｂの酵素活性とは、３−ヒドロキシテトラデカノイル−ＡＣＰを３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸−ＡＣＰを経由してヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸へと転化させる能力を意味すると解釈される。

酵素Ｅ_３は、次のものからなる群から選択される：
少なくとも１つの酵素Ｅ_３ａであって、
ポリペプチド配列ＡＤＰ０６３８８．１、ＹＰ＿００１３４７０３２．１、ＣＢＩ７１０２９．１、ＹＰ＿００２４３９１３８．１、ＣＢＩ７１０３１．１、ＮＰ＿２５２１６８．１、ＣＢＩ７１０３４．１、ＣＢＩ７１０２８．１、ＡＡＡ６２１２９．１もしくはＺＰ＿０４９２９７５０．１を有するか、または
特定の前記アクセッション番号に対してアミノ酸残基の２５％まで、有利には２０％まで、特に有利には１５％まで、とりわけ１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％までが欠失、挿入、置換もしくはそれらの組合せにより改変されているポリペプチド配列を有し、かつ特定の前記アクセッション番号を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％、有利には５０％、特に有利には８０％、特に９０％超をなおも有する
酵素Ｅ_３ａであり、ここで、酵素Ｅ_３ａの酵素活性とは、ｄＴＤＰ−ラムノースおよび３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸をα−Ｌ−ラムノピラノシル−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸へと転化させる能力を意味すると解釈される；
少なくとも１つの酵素Ｅ_３ｂであって、
ポリペプチド配列ＡＪＹ０１５９０．１、ＡＢＲ８４８８１．１、ＮＰ＿２５２１６８．１、ＦＮ６０１３６４．１、ＹＰ＿４４００７４．１、ＺＰ＿０５５９０６５７．１、ＺＰ＿０４５２０３７４．１、ＺＰ＿００４３８３６０．２、ＺＰ＿００４３８２０９．２、ＹＰ＿００１０７４７６１．１、ＺＰ＿０４８１１０８４．１、ＹＰ＿１１０５５８．１、ＹＰ＿１１１３６１．１、ＺＰ＿０２４９２８５７．１、ＹＰ＿３３７２４６．１、ＹＰ＿００１０６１８１１．１、ＹＰ＿１０５６０７．１、ＺＰ＿０２３７１５０３．１、ＺＰ＿０２５０３９６２．１、ＺＰ＿０３４５６８３９．１、ＺＰ＿０２４６１６９０．１、ＺＰ＿０３７９４６３４．１、ＺＰ＿０１７６９７３６．１、ＺＰ＿０１７６９３０８．１、ＺＰ＿０２３５８９４８．１、ＺＰ＿０２４８７７３６．１、ＺＰ＿０２４０８７５８．１、ＹＰ＿００２２３４９３７．１、ＺＰ＿０２８９１４７７．１、ＹＰ＿００１７７８８０６．１、ＹＰ＿６２３１４１．１、ＹＰ＿８３８７２１．１、ＺＰ＿０４９４３３０７．１、ＹＰ＿７７６３９１．１、ＹＰ＿００４３４８７０４．１、ＺＰ＿０２９０７６１９．１、ＹＰ＿３７１３１６．１、ＺＰ＿０２３８９９４８．１、ＹＰ＿００１８１１６９４．１、ＹＰ＿００２９０８２４４．１、ＺＰ＿０２５１１８０８．１、ＺＰ＿０２３７６５４２．１、ＥＧＣ９９８７７．１、ＺＰ＿０２４５１７６０．１もしくはＺＰ＿０２４１４４１４．１を有するか、または
特定の前記アクセッション番号に対してアミノ酸残基の２５％まで、有利には２０％まで、特に有利には１５％まで、とりわけ１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％までが欠失、挿入、置換もしくはそれらの組合せにより改変されているポリペプチド配列を有し、かつ特定の前記アクセッション番号を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％、有利には５０％、特に有利には８０％、特に９０％超をなおも有する
酵素Ｅ_３ｂであり、ここで、酵素Ｅ_３ｂの酵素活性とは、ｄＴＤＰ−ラムノースおよび３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸をα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸へと転化させる能力を意味すると解釈される。

酵素Ｅ_４は、次のものからなる群から選択される：
少なくとも１つの酵素Ｅ_４ａであって、
ポリペプチド配列ＮＰ＿２４９８２１．１を有するか、または
参照配列ＮＰ＿２４９８２１．１に対してアミノ酸残基の２５％まで、有利には２０％まで、特に有利には１５％まで、とりわけ１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％までが欠失、挿入、置換もしくはそれらの組合せにより改変されているポリペプチド配列を有し、かつ参照配列ＮＰ＿２４９８２１．１を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％、有利には５０％、特に有利には８０％、特に９０％超をなおも有する
酵素Ｅ_４ａであり、ここで、酵素Ｅ_４ａの酵素活性とは、ｄＴＤＰ−ラムノースおよびα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸をα−Ｌ−ラムノピラノシル−（１−２）−α−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸に転化させる能力を意味すると解釈される；
１つの酵素Ｅ_４ｂであって、
ポリペプチド配列ＡＪＹ０２９８１．１、ＦＮ６０１３８７．１、ＦＮ６０１３９１．１、ＹＰ＿４４００７１．１、ＺＰ＿０２３７５８９９．１、ＺＰ＿０２４６６６７６．１、ＹＰ＿００１０７５８６３．１、ＺＰ＿０２４０８７９６．１、ＹＰ＿３３５５３０．１、ＺＰ＿０１７６９１７６．１、ＹＰ＿１０５６０９．１、ＺＰ＿０１７７０８６７．１、ＺＰ＿０４５２０８７３．１、ＹＰ＿１１０５６０．１、ＹＰ＿００１０２４０１４．１、ＺＰ＿０３４５０１２５．１、ＹＰ＿００１０６１８１３．１、ＹＰ＿１１１３５９．１、ＺＰ＿００４４０９９４．２、ＺＰ＿０３４５６９２６．１、ＺＰ＿０２３５８９４６．１、ＺＰ＿００４３８００１．２、ＺＰ＿０２４６１４７８．１、ＺＰ＿０２５０３９２９．１、ＺＰ＿０２５１１８３２．１、ＹＰ＿００４３４８７０６．１、ＺＰ＿０４８９８７４２．１、ＹＰ＿００２９０８２４６．１、ＺＰ＿０２３８２８４４．１、ＥＧＤ０５１６７．１、ＹＰ＿００１７７８８０８．１、ＹＰ＿００１８１１６９２．１、ＹＰ＿００２２３４９３５．１、ＹＰ＿３７１３１８．１、ＹＰ＿６２３１４３．１、ＹＰ＿７７６３８９．１、ＺＰ＿０２８９１４７９．１、ＺＰ＿０２９０７６１７．１、ＺＰ＿０２４１７４２４．１もしくはＺＰ＿０４８９８７４３．１を有するか、または
特定の前記アクセッション番号に対してアミノ酸残基の２５％まで、有利には２０％まで、特に有利には１５％まで、とりわけ１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％までが欠失、挿入、置換もしくはそれらの組合せにより改変されているポリペプチド配列を有し、かつ特定の前記アクセッション番号を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％、有利には５０％、特に有利には８０％、特に９０％超をなおも有する
酵素Ｅ_４ｂであり、ここで、酵素Ｅ_４ｂの酵素活性とは、ｄＴＤＰ−ラムノースおよびα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸をα−Ｌ−ラムノピラノシル−（１−２）−α−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸に転化させる能力を意味すると解釈される。

酵素Ｅ_２ａ〜Ｅ_４ｂに関して具体的に挙げた活性が、上記酵素の広範な様々な活性の特定の例示的な選択肢にすぎないことは明らかであり、それぞれ挙げた活性は、所与の酵素について該活性に関して信頼性のある測定法が利用可能な活性である。したがって、非分岐状の飽和Ｃ_１０−アルキル基を有する基質を転化させる酵素が、減少した活性を有する可能性があるにもかかわらず、Ｃ_６−またはＣ_１６−アルキル基（これらも分岐状または不飽和である可能性がある）を有する基質も同様に転化させることは明らかである。

本発明による有利な細胞は、野生型としては、ラムノリピドを産生することができないかまたは検出可能な量では産生することができず、さらに有利には野生型としては、酵素Ｅ_２、Ｅ_３およびＥ_４の活性を有しないかまたは検出可能な活性を有しない。

本発明によれば、以下の酵素の組合せ：
Ｅ_２、Ｅ_３、Ｅ_４、Ｅ_２Ｅ_３、Ｅ_２Ｅ_４、Ｅ_３Ｅ_４およびＥ_２Ｅ_３Ｅ_４
の増大した活性を有する細胞が好ましく、これらのうち、
Ｅ_３、Ｅ_３Ｅ_４およびＥ_２Ｅ_３Ｅ_４、特にＥ_２Ｅ_３Ｅ_４
の組合せが特に有利である。

酵素の組合せＥ_２Ｅ_３Ｅ_４の増大した活性を有する本発明による細胞の有利な実施態様では、ｎは有利には＝１である。

本発明において、「酵素の増大した活性」という用語は、有利には増大した細胞内活性を意味すると解釈されるべきである。

原則として、酵素をコードする遺伝子配列のコピー数を増大することにより、強力なプロモーターもしくは改善されたリボソーム結合部位を使用することにより、遺伝子発現の負の制御の減衰を例えば転写レギュレーターを使用して行うことにより、または遺伝子発現の正の制御の促進を例えば転写レギュレーターを使用して行うことにより、遺伝子のコドン使用頻度を変更することにより、様々な方法でｍＲＮＡもしくは酵素の半減期を増大することにより、遺伝子の発現の制御を変更することにより、または増大した活性を有する相応の酵素をコードする遺伝子もしくは対立遺伝子を使用することにより、およびこれらの方法を適切に組み合わせることにより、酵素活性の増大を達成することができる。活性の増大は有利には、本発明によれば、野生型と比較して酵素をコードする遺伝子配列のコピー数を増大することにより増大される。以前は野生型では存在しなかった遺伝子配列のコピーの取り込みは、自明ながら０から１のコピー数における増大に相応する。

本発明により遺伝子改変された細胞は、例えば形質転換、トランスダクション、コンジュゲーションまたはこれらの方法の組合せによって、所望の遺伝子と、該遺伝子の対立遺伝子またはその一部と、場合により遺伝子の発現を可能にするプロモーターとを含むベクターを用いて生成される。異種発現は、特に遺伝子もしくは対立遺伝子を細胞の染色体に組み込むか、または染色体外でベクターを複製することにより達成される。

細胞における酵素活性の増大に関する選択肢の概要は、一例として独国特許出願公開第１００３１９９９号明細書（ＤＥ−Ａ−１００３１９９９）にピルベートカルボキシラーゼに関して挙げられており、該刊行物の内容を本明細書において援用するものとし、その開示内容は、細胞における酵素活性の増大に関する選択肢に関して本発明の開示の一部を形成する。

上記の酵素または遺伝子および下記のすべての酵素または遺伝子の発現は、１次元および２次元タンパク質ゲル分離およびその後の適切な評価ソフトウェアを用いたゲル中でのタンパク質濃度の光学的同定を用いて検出可能である。酵素活性の増大が、相応する遺伝子の発現の増大のみに基づいている場合には、野生型と遺伝子改変細胞の間で１次元または２次元タンパク質分離を比較することにより前記酵素活性の増大を容易に定量化できる。コリネ型細菌の場合にタンパク質ゲルを製造して該タンパク質を同定する通常の方法は、Ｈｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．により記載されている手法である（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ， ２２：１７１２．２３（２００１））。タンパク質濃度は、検出すべきタンパク質に特異的な抗体を使用したウエスタンブロットハイブリダイゼーション（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ Ｅｄ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ． ＵＳＡ， １９８９）およびその後の濃度測定のための適切なソフトウェアを使用した光学的評価（Ｌｏｈａｕｓ ａｎｄ Ｍｅｙｅｒ（１９８９）Ｂｉｏｓｐｅｋｔｒｕｍ， ５：３２−３９；Ｌｏｔｔｓｐｅｉｃｈ（１９９９）Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ １１１：２６３０−２６４７）により同様に分析可能である。ＤＮＡ結合タンパク質の活性は、ＤＮＡバンドシフトアッセイを用いることにより測定可能である（ゲルリターデーションとも称される）（Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ， １８３：２１５１−２１５５）。その他の遺伝子の発現におけるＤＮＡ結合タンパク質の作用は、様々に十分に記載されているレポーター遺伝子アッセイ法により検出可能である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ Ｅｄ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ． ＵＳＡ， １９８９）。細胞内酵素活性は、様々に記載されている方法により測定可能である（Ｄｏｎａｈｕｅ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １８２（１９）：５６２４−５６２７；Ｒａｙ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １８２（８）：２２７７−２２８４；Ｆｒｅｅｄｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（１９７３）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １１５（３）：８１６−８２３）。特定の酵素の活性を測定するための具体的な方法が以下の説明に記載されていない場合には、酵素活性の増大および酵素活性の減少は、好ましくは、Ｈｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．、Ｅｌｅｃｔｏｐｈｏｒｅｓｉｓ， ２２：１７１２−２３（２００１）、Ｌｏｈａｕｓ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｓｐｅｋｔｒｕｍ ５ ３２−３９（１９９８）、Ｌｏｔｔｓｐｅｉｃｈ， Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ １１１：２６３０−２６４７（１９９９）およびＷｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １８３：２１５１−２１５５（２００１）に記載の方法を用いて測定される。

酵素活性の増大が内部遺伝子の突然変異により達成される場合には、このような突然変異を、伝統的な方法により間接的に、例えばＵＶ照射または突然変異を引き起こす化学物質によって生じさせてもよいし、特に欠失、挿入および／またはヌクレオチド置換のような遺伝子工学法より生じさせてもよい。改変された細胞は、これらの突然変異により得られる。酵素の特に有利な突然変異体は、もはやフィードバック阻害、生産物阻害もしくは基質阻害下にはないか、または少なくとも野生型酵素と比較してそうしたものが少ない酵素である。

酵素活性の増大が酵素の合成の増大により達成される場合には、例えば関連遺伝子のコピー数が増大するか、またはプロモーターおよび制御領域もしくは構造遺伝子の上流に位置するリボソーム結合部位が突然変異される。構造遺伝子の上流に組み込まれた発現カセットは、類似の効果を示す。さらに、誘導性プロモーターにより、所望のどの時点でも発現を増大させることができる。しかしさらに、いわゆる「エンハンサー」を制御配列として酵素遺伝子に与えることもでき、これも同様に、ＲＮＡポリメラーゼとＤＮＡとの間での相互作用の改善によって増大した遺伝子発現を引き起こす。発現は、ｍＲＮＡの寿命を延長する措置によっても改善される。さらに、酵素活性は、酵素タンパク質の分解を阻害することによっても強化される。ここで、遺伝子または遺伝子構築物は、種々のコピー数のプラスミド中に存在するかまたは染色体に組み込まれて増幅される。あるいはさらに、関連遺伝子の過剰発現は、培地組成物および培養の変更により達成できる。これに関する指示は、当業者により特にＭａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５， １３７−１４６（１９８７））、Ｇｕｅｒｒｅｒｏ ｅｔ ａｌ．（Ｇｅｎｅ １３８， ３５−４１（１９９４））、Ｔｓｕｃｈｉｙａ ａｎｄ Ｍｏｒｉｎａｇａ（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６， ４２８−４３０（１９８８））、Ｅｉｋｍａｎｎｓ ｅｔ ａｌ．（Ｇｅｎｅ １０２， ９３−９８（１９９１））、欧州特許出願公開第０４７２８６９号明細書（ＥＰ−Ａ−０４７２８６９）、米国特許第４，６０１，８９３号明細書（ＵＳ ４，６０１，８９３）、Ｓｃｈｗａｒｚｅｒ ａｎｄ Ｐｕｅｈｌｅｒ（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９， ８４−８７（１９９１））、Ｒｅｉｎｓｃｈｅｉｄ ｅｔ ａｌ．（Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ６０， １２６−１３２（１９９４））、ＬａＢａｒｒｅ ｅｔ ａｌ．（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７５， １００１−１００７（１９９３））、国際公開第９６／１５２４６号（ＷＯ−Ａ−９６／１５２４６）、Ｍａｌｕｍｂｒｅｓ ｅｔ ａｌ．（Ｇｅｎｅ １３４， １５−２４（１９９３））、特開平１０−２２９８９１号公報（ＪＰ−Ａ−１０−２２９８９１）、Ｊｅｎｓｅｎ ａｎｄ Ｈａｍｍｅｒ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ５８， １９１−１９５（１９９８））、ならびに公知の遺伝子学および分子生物学的教書に見出すことができる。突然変異のような上記の手法によって、遺伝子改変された細胞が得られる。

特定の遺伝子の発現を増大するために、例えばエピソーマルプラスミドが使用される。原則として、プラスミドまたはベクターとして、このために当業者に入手可能なすべての実施態様が可能である。このようなプラスミドおよびベクターは、例えばＮｏｖａｇｅｎ， Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｃｌｏｎｔｅｃｈ ｏｒ Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬのパンフレットから推論できる。さらに有利なプラスミドおよびベクターは、以下：Ｇｌｏｖｅｒ， Ｄ． Ｍ．（１９８５）ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｖｏｌ． Ｉ−ＩＩＩ， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｔｄ．， Ｏｘｆｏｒｄ；Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ， Ｒ．Ｌ． ａｎｄ Ｄｅｎｈａｒｄｔ， Ｄ． Ｔ（ｅｄｓ）（１９８８）Ｖｅｃｔｏｒｓ：ａ ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｓｅｓ， １７９−２０４， Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ， Ｓｔｏｎｅｈａｍ；Ｇｏｅｄｄｅｌ， Ｄ． Ｖ．（１９９０）Ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８５， ３−７；Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．；Ｆｒｉｔｓｃｈ， Ｅ． Ｆ． ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｔ．（１９８９）， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに見出すことができる。

次いで、増幅すべき遺伝子を含むプラスミドベクターは、コンジュゲーションまたは形質転換により所望の株に移される。コンジュゲーションの方法は、例えばＳｃｈａｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ６０：７５６−７５９（１９９４）に記載されている。形質転換の方法は，例えばＴｈｉｅｒｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２９：３５６−３６２（１９８８）， Ｄｕｎｉｃａｎ ａｎｄ Ｓｈｉｖｎａｎ， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：１０６７−１０７０（１９８９）およびＴａｕｃｈ ｅｔ ａｌ．， ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ １２３：３４３−３４７（１９９４）に記載されている。「交叉」事象による相同組換えの後に、得られた株は、該当する遺伝子の少なくとも２つのコピーを含む。

本発明において、酵素の活性の増大は、特に有利には、考慮する酵素をコードする領域のコピー数を、特に強力なプロモーターと共役して野生型細胞と比較して増加させることによって達成され、野生型において既に存在する酵素の場合には、野生型遺伝子中に存在するものと比較して、より強力なプロモーターを使用することによって達成される。

上記および以下の説明に使用される「酵素Ｅ_ｘの、その野生型と比較して増大した活性」という表現は、特定の酵素Ｅ_ｘの活性が有利には少なくとも２倍、特に有利には少なくとも１０倍、さらに有利には少なくとも１００倍、さらになお有利には少なくとも１０００倍および最も有利には少なくとも１００００倍増大することを意味すると常に解釈すべきである。さらに、「酵素Ｅ_ｘの、その野生型と比較して増大した活性」を有する本発明による細胞には、特に、その野生型がこの酵素Ｅ_ｘの活性を有しないかまたは少なくとも検出可能な活性を有しておらず、かつ例えば過剰発現により酵素活性が増大した後にのみ、この酵素Ｅ_ｘの検出可能な酵素活性を示す細胞も含まれる。これに関連して、以下の説明で使用される「過剰発現」という用語または「発現を増大する」という表現には、出発細胞、例えば「野生型細胞」が発現を示さないかまたは少なくとも検出可能な発現を示さず、かつ組換え法によってのみ酵素Ｅ_ｘの検出可能な合成が誘導される場合も含まれる。

所与のポリペプチドの特性および機能の著しい変化を導かない所与のポリペプチド配列のアミノ酸残基の変更は、当業者に周知である。したがって、例えば保存されたアミノ酸を交換することができる。このような適切なアミノ酸置換の例は、以下のものである：アラニンとセリン；アルギニンとリジン；アスパラギンとグルタミンまたはヒスチジン；アスパラギン酸とグルタミン酸；システインとセリン；グルタミンとアスパラギン；グルタミン酸とアスパラギン酸；グリシンとプロリン；ヒスチジンとアスパラギンまたはグルタミン；イソロイシンとロイシンまたはバリン；ロイシンとメチオニンまたはバリン；リジンとアルギニンまたはグルタミンまたはグルタミン酸；メチオニンとロイシンまたはイソロイシン；フェニルアラニンとメチオニンまたはロイシンまたはチロシン；セリンとトレオニン；トレオニンとセリン；トリプトファンとチロシン；チロシンとトリプトファンまたはフェニルアラニン；バリンとイソロイシンまたはロイシン。特にポリペプチドのＮまたはＣ末端における例えばアミノ酸の挿入または欠失の形での変更は、ポリペプチドの機能に著しい影響を及ぼさないことが多いことも公知である。

本発明において使用される酵素と関連する「アミノ酸同一性」は、公知の方法を用いて決定される。一般的に、規定要求事項を考慮したアルゴリズムを用いた特別なコンピュータプログラムが利用される。

同一性を決定するための有利な方法では、最初に、比較すべき配列の間での最大のアライメントが生成される。同一性を決定するためのコンピュータプログラムには、次のものを含むＧＣＧプログラムパッケージが含まれるが、これらに限定されるわけではない：
ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｏｙ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２（１９８４），３８７頁）， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ， Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｗｉ）、ならびにＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ． ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２１５（１９９０）， ４０３−４１０頁）。ＢＬＡＳＴプログラムは、国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）およびその他の供給元から得ることができる（ＢＬＡＳＴ Ｈａｎｄｂｏｏｋ， Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ． ｅｔ ａｌ．， ＮＣＢＩ ＮＬＭ ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＮＤ ２２８９４；上記Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ． ｅｔ ａｌ．）。

公知のＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムも同様に、同一性の決定に使用することができる。

「アミノ酸同一性」を決定するための有利なパラメーターは、ＢＬＡＳＴＰプログラムを使用する場合は以下の通りである（Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ． ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２１５（１９９０）， ４０３−４１０頁）：
期待閾値： １０
ワードサイズ： ３
マトリックス： ＢＬＯＳＵＭ６２
ギャップコスト： 存在：１１；伸長：１
構成調整： 条件付きスコアマトリックス構成調整
上記のパラメーターは、アミノ酸配列比較用のデフォルトパラメーターである。ＧＡＰプログラムも同様に、上記パラメーターを用いた使用に適切である。本発明において、上記アルゴリズムによる６０％の同一性は、６０％同一性を意味する。より高い同一性についても、同一のことが該当する。

酵素の活性は、前記活性を含む細胞を、当業者に公知の方法で、例えばビーズミル、フレンチプレスまたは超音波粉砕機を使用して破砕し、次に無傷細胞、細胞破壊片および破砕助剤、例えばガラスビーズを１１０００×ｇおよび４℃で１０分間遠心分離して除去することにより測定可能である。次に、得られた細胞不含の粗抽出物を使用して酵素アッセイを行い、次いで産生物のＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ検出を実施することができる。また、酵素を富化させるか、または当業者に公知の方法でクロマトグラフ法（例えばニッケル−ニトリロ三酢酸アフィニティークロマトグラフィー、ストレプトアビジンアフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィー）により精製して均質にすることができる。

些細なことであり万全を期すために述べるにすぎないが、細胞の野生型と比較して増大または減少した活性を測定するために、測定すべき試料と同一の条件に曝された野生型の参照培養物が使用される。

酵素Ｅ_１の活性は、Ａｂｃａｍ社製Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ Ｇｌｕｃｏｓｅ Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（品番ａｂ１０２５３２）を用いて、製造者の要求にしたがって細胞不含抽出物を使用して測定される。

上記のように得られた細胞不含の粗抽出物を使用して、酵素Ｅ_２の活性を以下のように決定する：標準のアッセイは、１００μＭの大腸菌ＡＣＰ、１ｍＭのβ−メルカプトエタノール、２００μＭのマロニル−コエンザイムＡ、４０μＭのオクタノイル−コエンザイムＡ（Ｅ_２ａの場合）またはドデカノイル−コエンザイムＡ（Ｅ_２ｂの場合）、１００μＭのＮＡＤＰＨ、２μｇの大腸菌ＦａｂＤ、２μｇの結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）ＦａｂＨ、１μｇの大腸菌ＦａｂＧ、０．１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）および５μｇの酵素Ｅ_５を、最終体積１２０μＬで含有する。ＡＣＰ、β−メルカプトエタノールおよびリン酸ナトリウム緩衝剤を３７℃で３０分間プレインキュベートして、ＡＣＰを完全に減少させる。酵素Ｅ_２の添加により反応を開始させる。ＨＣｌを使用してｐＨ２．０に酸性化しておいた２ｍｌの水を使用して反応を停止させ、かつ次に２ｍｌのクロロホルム／メタノール（２：１（ｖ：ｖ））を使用して２回抽出する。相分離を遠心分離（１６１００ｇ、５分、室温）により行う。下方の有機相を除去し、真空遠心分離で完全に蒸発させ、沈殿物を５０μｌのメタノール中にとる。不溶成分を遠心分離（１６１００ｇ、５分、ＲＴ）により沈殿させ、試料をＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳにより分析する。相応する質量トレースおよびＭＳ^２スペクトルの分析により生成物を同定する。

次に、上記のようにして得られた細胞不含の粗抽出物を使用して、酵素Ｅ_３の活性を以下のように決定する：標準的なアッセイは、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）１８５μｌ、１２５ｍＭのｄＴＤＰ−ラムノース１０μｌ、および溶解した粗タンパク質抽出物（全タンパク質約１ｍｇ）または精製タンパク質（精製タンパク質５μｇ）５０μｌからなることができる。３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸（Ｅ_３ａの場合）または３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸（Ｅ_３ｂの場合）の１０ｍＭエタノール溶液１０μｌの添加により反応を開始し、かつ振盪（６００ｒｐｍ）しながら３０℃で１時間インキュベートする。次に、この反応物をアセトン１ｍｌと混合する。不溶成分を遠心分離（１６１００ｇ、５分、室温）により沈殿させ、ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳにより試料を分析する。相応する質量トレースおよびＭＳ^２スペクトルの分析により、生成物を同定する。

次に、上記のようにして得られた細胞不含の粗抽出物を使用して、酵素Ｅ_４の活性を以下のように決定する：標準的なアッセイは、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）１８５μｌ、１２５ｍＭのｄＴＤＰ−ラムノース１０μｌ、および溶解した粗タンパク質抽出物（全タンパク質約１ｍｇ）または精製タンパク質（精製タンパク質５μｇ）５０μｌからなることができる。α−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸（Ｅ_４ａの場合）またはα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸（Ｅ_４ｂの場合）の１０ｍＭエタノール溶液１０μｌの添加により反応を開始し、かつ振盪（６００ｒｐｍ）しながら３０℃で１時間インキュベートする。次に、この反応物をアセトン１ｍｌと混合する。不溶成分を遠心分離（１６１００ｇ、５分、室温）により沈殿させ、ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳにより試料を分析する。相応する質量トレースおよびＭＳ^２スペクトルの分析により、生成物を同定する。

さらにＥ_１に関して、本発明による細胞が、その野生型と比較して、以下のものからなる群から選択される少なくとも１つの酵素の、以下に詳説するような増大した活性を有するように遺伝子改変されている場合に有利である：
少なくとも１つの酵素Ｅ_５である、ＥＣ２．７．７．２４のｄＴＴＰ：α−Ｄ−グルコース−１−ホスフェートチミジリルトランスフェラーゼであって、特に
ｒｍｌＡもしくはｒｆｂＡ遺伝子によりコードされるか、または
ｒｍｌＡもしくはｒｆｂＡ遺伝子によりコードされる酵素のアミノ酸残基の２５％まで、有利には２０％まで、特に有利には１５％まで、とりわけ１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％までが欠失、挿入、置換もしくはそれらの組合せにより改変されているポリペプチド配列を有し、かつｒｍｌＡもしくはｒｆｂＡ遺伝子によりコードされる酵素の酵素活性の少なくとも１０％、有利には５０％、特に有利には８０％、とりわけ９０％超をなおも有する
酵素から選択されるもの、ここで、酵素Ｅ_５の酵素活性とは、α−Ｄ−グルコース１−ホスフェートおよびｄＴＴＰをｄＴＤＰ−グルコースに転化させる能力を意味すると解釈される；
少なくとも１つの酵素Ｅ_６である、ＥＣ４．２．１．４６のｄＴＤＰ−グルコース４，６−ヒドロリアーゼであって、特に
ｒｍｌＢもしくはｒｆｂＢ遺伝子によりコードされるか、または
ｒｍｌＢもしくはｒｆｂＢ遺伝子によりコードされる酵素のアミノ酸残基の２５％まで、有利には２０％まで、特に有利には１５％まで、とりわけ１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％までが欠失、挿入、置換もしくはそれらの組合せにより改変されているポリペプチド配列を有し、かつｒｍｌＢもしくはｒｆｂＢ遺伝子によりコードされる酵素の酵素活性の少なくとも１０％、有利には５０％、特に有利には８０％、とりわけ９０％超をなおも有する
酵素から選択されるもの、ここで、酵素Ｅ_６の酵素活性とは、ｄＴＤＰ−グルコースをｄＴＤＰ−４−デヒドロ−６−デオキシ−Ｄ−グルコースに転化させる能力を意味すると解釈される；
少なくとも１つの酵素Ｅ_７である、ＥＣ５．１．３．１３のｄＴＤＰ−４−デヒドロラムノース３，５−エピメラーゼであって、特に
ｒｍｌＣもしくはｒｆｂＣ遺伝子によりコードされるか、または
ｒｍｌＣもしくはｒｆｂＣ遺伝子によりコードされる酵素のアミノ酸残基の２５％まで、有利には２０％まで、特に有利には１５％まで、とりわけ１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％までが欠失、挿入、置換もしくはそれらの組合せにより改変されているポリペプチド配列を有し、かつｒｍｌＣもしくはｒｆｂＣ遺伝子によりコードされる酵素の酵素活性の少なくとも１０％、有利には５０％、特に有利には８０％、とりわけ９０％超をなおも有する
酵素から選択されるもの、ここで、酵素Ｅ_７の酵素活性とは、ｄＴＤＰ−４−デヒドロ−６−デオキシ−Ｄ−グルコースをｄＴＤＰ−４−デヒドロ−６−デオキシ−Ｌ−マンノースに転化させる能力を意味すると解釈される；および
少なくとも１つの酵素Ｅ_８である、ＥＣ１．１．１．１３３のｄＴＤＰ−４−デヒドロラムノースレダクターゼであって、特に
ｒｍｌＤもしくはｒｆｂＤ遺伝子によりコードされるか、または
ｒｍｌＤもしくはｒｆｂＤ遺伝子によりコードされる酵素のアミノ酸残基の２５％まで、有利には２０％まで、特に有利には１５％まで、とりわけ１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％までが欠失、挿入、置換もしくはそれらの組合せにより改変されているポリペプチド配列を有し、かつｒｍｌＤもしくはｒｆｂＤ遺伝子によりコードされる酵素の酵素活性の少なくとも１０％、有利には５０％、特に有利には８０％、とりわけ９０％超をなおも有する
酵素から選択されるもの、ここで、酵素Ｅ_８の酵素活性とは、ｄＴＤＰ−４−デヒドロ−６−デオキシ−Ｌ−マンノースをｄＴＤＰ−６−デオキシ−Ｌ−マンノースに転化させる能力を意味すると解釈される。

酵素Ｅ_５の活性は、酵素Ｅ_２〜Ｅ_４に関して上記で説明した通りに得られた試料を使用して、α−Ｄ−グルコース１−ホスフェート（１．３ｍＭ）およびｄＴＴＰ（５ｍＭ）および５μｇの精製酵素Ｅ_５を５０μｌのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ８．５）中でインキュベートし、３０℃で５、１０および２０分間インキュベートした後にクロロホルム２０μｌの添加により反応を停止することにより決定される。次に、この混合物をボルテックス処理し、１６０００ｇで室温で５分間遠心分離する。水相を新たな反応管に移し、水８０μｌを使用して有機相を再び抽出する。双方の水相を合してＨＰＬＣにより分析する。これには、Ｐｈｅｎｏｓｐｈｅｒｅ ＯＤＳ２カラム（２５０×４．６ｍｍ；Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、トランス、米国）またはＳｐｈｅｒｅｓｏｒｂ ＯＤＳ２カラム（２５０×４．６ｍｍ；Ｗａｔｅｒｓ、ミルフォード、米国）の使用を要する。０．５ＭのＫＨ_２ＰＯ_４（溶離液Ａ）を１ｍｌ／ｍｉｎの流量で１５分間使用して分析物を溶離し、続いて０．７ｍｌ／ｍｉｎの流量で１４分間にわたり溶離液Ａ８０％およびメタノール２０％までの直線的勾配とする。次に、ＯＤＳ２カラムから溶離した分析物をＰｈｅｎｏｓｐｈｅｒｅ ＳＡＸイオン交換カラム（２５０×４．６ｍｍ；Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、トランス、米国）に注入し、この分析物を、１ｍｌ／ｍｉｎの流量でギ酸アンモニウムの直線的勾配（２〜６００ｍＭで２５分間）で溶離する。次に、フォトダイオードアレイ検出器（ＤＡＤ）を使用してｄＴＤＰ−グルコースをそのＵＶ吸収により定量化する。チミジンの吸収最大は、２６７ｎｍである。認証された糖ヌクレオチド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、米国）を使用して校正を行う。

その後、酵素Ｅ_２〜Ｅ_４に関して上記で説明した通りに得られた試料を使用して、ｄＴＤＰ−α−Ｄ−グルコース（１．３ｍＭ）および５μｇの精製酵素Ｅ_６を５０μｌのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ８．５）中でインキュベートし、３０℃で５、１０および２０分間インキュベートした後にクロロホルム２０μｌの添加により反応を停止することにより酵素Ｅ_６の活性が決定される。次に、この混合物をボルテックス処理し、１６０００ｇで室温で５分間遠心分離する。水相を新たな反応管に移し、水８０μｌを使用して有機相を再び抽出する。双方の水相を合してＨＰＬＣにより分析する。これには、Ｐｈｅｎｏｓｐｈｅｒｅ ＯＤＳ２カラム（２５０×４．６ｍｍ；Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、トランス、米国）またはＳｐｈｅｒｅｓｏｒｂ ＯＤＳ２カラム（２５０×４．６ｍｍ；Ｗａｔｅｒｓ、ミルフォード、米国）の使用を要する。０．５ＭのＫＨ_２ＰＯ_４（溶離液Ａ）を１ｍｌ／ｍｉｎの流量で１５分間使用して分析物を溶離し、続いて０．７ｍｌ／ｍｉｎの流量で１４分間にわたり溶離液Ａ８０％およびメタノール２０％までの直線的勾配とする。次に、ＯＤＳ２カラムから溶離した分析物をＰｈｅｎｏｓｐｈｅｒｅ ＳＡＸイオン交換カラム（２５０×４．６ｍｍ；Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、トランス、米国）に注入し、この分析物を、１ｍｌ／ｍｉｎの流量でギ酸アンモニウムの直線的勾配（２〜６００ｍＭで２５分間）で溶離する。次に、フォトダイオードアレイ検出器（ＤＡＤ）を使用してｄＴＤＰ−グルコースおよびｄＴＤＰ−４−デヒドロ−６−デオキシ−Ｄ−グルコースをそのＵＶ吸収により定量化する。チミジンの吸収最大は、２６７ｎｍである。認証された糖ヌクレオチド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、米国）を使用して校正を行う。

その後、酵素Ｅ_２〜Ｅ_４に関して上記で説明した通りに得られた試料を使用して、まずｄＴＤＰ−α−Ｄ−グルコース（１．３ｍＭ）および５μｇの精製酵素Ｅ_６を５０μｌのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ８．５）中で３０℃で１０分間インキュベートすることにより酵素Ｅ_７の活性が決定される。その後に、０．５μｇの精製酵素Ｅ_７を添加し、３０℃で５、１０および２０分間インキュベートした後に、クロロホルム２０μｌの添加により反応を停止させる。次に、この混合物をボルテックス処理し、１６０００ｇで室温で５分間遠心分離する。水相を新たな反応管に移し、水８０μｌを使用して有機相を再び抽出する。双方の水相を合してＨＰＬＣにより分析する。これには、Ｐｈｅｎｏｓｐｈｅｒｅ ＯＤＳ２カラム（２５０×４．６ｍｍ；Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、トランス、米国）またはＳｐｈｅｒｅｓｏｒｂ ＯＤＳ２カラム（２５０×４．６ｍｍ；Ｗａｔｅｒｓ、ミルフォード、米国）の使用を要する。０．５ＭのＫＨ_２ＰＯ_４（溶離液Ａ）を１ｍｌ／ｍｉｎの流量で１５分間使用して分析物を溶離し、続いて０．７ｍｌ／ｍｉｎの流量で１４分間にわたり溶離液Ａ８０％およびメタノール２０％までの直線的勾配とする。次に、ＯＤＳ２カラムから溶離した分析物をＰｈｅｎｏｓｐｈｅｒｅ ＳＡＸイオン交換カラム（２５０×４．６ｍｍ；Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、トランス、米国）に注入し、この分析物を、１ｍｌ／ｍｉｎの流量でギ酸アンモニウムの直線的勾配（２〜６００ｍＭで２５分間）で溶離する。次に、フォトダイオードアレイ検出器（ＤＡＤ）を使用して、ｄＴＤＰ−グルコース、ｄＴＤＰ−４−デヒドロ−６−デオキシ−Ｄ−グルコースおよびｄＴＤＰ−６−デオキシ−Ｌ−マンノースをそのＵＶ吸収により定量化する。チミジンの吸収最大は、２６７ｎｍである。認証された糖ヌクレオチド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、米国）を使用して校正を行う。

その後、酵素Ｅ_２〜Ｅ_４に関して上記で説明した通りに得られた試料を使用して、まずｄＴＤＰ−α−Ｄ−グルコース（１．３ｍＭ）および５μｇの精製酵素Ｅ_６を５０μｌのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ８．５）中で３０℃で１０分間インキュベートすることにより酵素Ｅ_８の活性が決定される。その後に、０．５μｇの精製酵素Ｅ_７および０．５μｇの精製酵素Ｅ_８、さらにＮＡＤＰＨ（１０ｍＭ）を添加し、３０℃で５、１０および２０分間インキュベートした後に、クロロホルム２０μｌの添加により反応を停止させる。次に、この混合物をボルテックス処理し、１６０００ｇで室温で５分間遠心分離する。水相を新たな反応管に移し、水８０μｌを使用して有機相を再び抽出する。双方の水相を合してＨＰＬＣにより分析する。これには、Ｐｈｅｎｏｓｐｈｅｒｅ ＯＤＳ２カラム（２５０×４．６ｍｍ；Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、トランス、米国）またはＳｐｈｅｒｅｓｏｒｂ ＯＤＳ２カラム（２５０×４．６ｍｍ；Ｗａｔｅｒｓ、ミルフォード、米国）の使用を要する。０．５ＭのＫＨ_２ＰＯ_４（溶離液Ａ）を１ｍｌ／ｍｉｎの流量で１５分間使用して分析物を溶離し、続いて０．７ｍｌ／ｍｉｎの流量で１４分間にわたり溶離液Ａ８０％およびメタノール２０％までの直線的勾配とする。次に、ＯＤＳ２カラムから溶離した分析物をＰｈｅｎｏｓｐｈｅｒｅ ＳＡＸイオン交換カラム（２５０×４．６ｍｍ；Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、トランス、米国）に注入し、この分析物を、１ｍｌ／ｍｉｎの流量でギ酸アンモニウムの直線的勾配（２〜６００ｍＭで２５分間）で溶離する。次に、フォトダイオードアレイ検出器（ＤＡＤ）を使用して、ｄＴＤＰ−グルコース、ｄＴＤＰ−４−デヒドロ−６−デオキシ−Ｄ−グルコース、ｄＴＤＰ−６−デオキシ−Ｌ−マンノースおよびｄＴＤＰ−４−デヒドロ−６−デオキシ−Ｌ−マンノースを、そのＵＶ吸収により定量化する。チミジンの吸収最大は、２６７ｎｍである。認証された糖ヌクレオチド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、米国）を使用して校正を行う。

本発明によれば、以下の酵素の組合せ：
Ｅ_５Ｅ_６、Ｅ_５Ｅ_７、Ｅ_５Ｅ_８、Ｅ_６Ｅ_７、Ｅ_６Ｅ_８、Ｅ_７Ｅ_８、Ｅ_５Ｅ_６Ｅ_７、Ｅ_５Ｅ_６Ｅ_８、Ｅ_６Ｅ_７Ｅ_８、Ｅ_５Ｅ_７Ｅ_８、Ｅ_５Ｅ_６Ｅ_７Ｅ_８の増大した活性を有する細胞が有利であり、このうち、
Ｅ_５Ｅ_６Ｅ_７Ｅ_８の組合せが特に有利である。

特に有利には、前記の酵素の組合せの増大した活性を上記の酵素Ｅ_２〜Ｅ_４のものと組み合わせることができ、その際、Ｅ_２Ｅ_３Ｅ_４Ｅ_５Ｅ_６Ｅ_７Ｅ_８の組合せが特に有利である。

さらにＥ_１に関して、本発明による細胞が、その野生型と比較して、グルコーストランスポーターである少なくとも１つの酵素Ｅ_９の増大した活性を有するように遺伝子改変されている場合にさらに有利であり、したがって好ましい。ここでは特に有利には、本発明による細胞にとって外来であり、したがって野生型ゲノム中には存在しないグルコーストランスポーターが使用される。有利な酵素Ｅ_９は、特に、
ｇａｌＰ、ｇｌｆ、ｉｏｌＴ１、ｇｌｃＰ、ｇｌｕＰ、ＳｅｍｉＳＷＥＥＴもしくはｇｌｃＵ遺伝子によりコードされる酵素、およびＰＴＳ系（これは、成分酵素Ｉ、ＨＰｒ、酵素ＩＩＡ、酵素ＩＩＢおよび酵素ＩＩＣからなり、ここで、酵素ＩＩＡ、ＩＩＢおよびＩＩＣは、融合タンパク質として存在できるものする）、または
ｇａｌＰ、ｇｌｆ、ｉｏｌＴ１、ｇｌｃＰ、ｇｌｕＰ、ＳｅｍｉＳＷＥＥＴもしくはｇｌｃＵ遺伝子がコードする酵素およびＰＴＳ系のアミノ酸残基の２５％まで、有利には２０％まで、特に有利には１５％まで、とりわけ１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％までが欠失、挿入、置換もしくはそれらの組合せにより改変されているポリペプチド配列を有し、かつｇａｌＰ、ｇｌｆ、ｉｏｌＴ１、ｇｌｃＰ、ｇｌｕＰ、ＳｅｍｉＳＷＥＥＴもしくはｇｌｃＵ遺伝子がコードする酵素およびＰＴＳ系の酵素活性の少なくとも１０％、有利には５０％、特に有利には８０％、とりわけ９０％超をなおも有する酵素
から選択され、ここで、酵素Ｅ_９の酵素活性とは、２−（Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ）−２−デオキシグルコース（２−ＮＢＤＧ）を細胞内に取り込む能力を意味すると解釈される。

上記ポリペプチド配列に関して、ｉｏｌＴ１遺伝子は特に、Ｃ．グルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）由来のものであり、ｇｌｃＰ遺伝子は特に、Ｍ．スメグマチス（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）、Ｓ．フリジディマリナ（Ｓ．ｆｒｉｇｉｄｉｍａｒｉｎａ）またはＳ．アマゾネンシス（Ｓ．ａｍａｚｏｎｅｎｓｉｓ）由来のものであり、ｇｌｕＰ遺伝子は特に、Ｂ．アボルツス（Ｂ．ａｂｏｒｔｕｓ）由来のものであり、ＳｅｍｉＳＷＥＥＴ遺伝子は、Ｌ．ビフレクサ（Ｌ．ｂｉｆｌｅｘａ）由来のものであり、かつｇｌｕＵ遺伝子は特に、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）またはＳ．キシローサス（Ｓ．ｘｙｌｏｓｕｓ）由来のものである。

酵素Ｅ_９の活性は、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製Ｇｌｕｃｏｓｅ Ｕｐｔａｋｅ Ｃｅｌｌ Ｂａｓｅ Ａｓｓａｙ ｋｉｔ（品番６００４７０）を用いて、具体的には２０１５年１０月９日付けの製造者の指示書にしたがって測定可能である。

少なくとも１つの酵素Ｅ_９の増大した活性と併せて、本発明による細胞が、野生型として、酵素Ｅ_１０、つまりＡＢＣグルコーストランスポーターを有し、かつその野生型と比較して酵素Ｅ_１０の減少した活性を有するように遺伝子改変されていることを特徴とする場合に本発明によれば有利であり、よって好ましい可能性がある。ここで、酵素Ｅ_１０は、２−（Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ）−２−デオキシグルコース（２−ＮＢＤＧ）を細胞内に取り込む。酵素Ｅ_１０の活性は、Ｅ_９に関して上記で説明した通りに決定できる。このために、Ｅ_１０の活性が減少するように直接的に仕向けられた遺伝子改変の点でのみ異なっている細胞を互いに直接比較して、活性において相違があるか否かを調べることは、通常の当業者にとって自明である。

特に有利には、上記の酵素の変更された活性は、以下の組合せ：
Ｅ_２Ｅ_３Ｅ_４Ｅ_９Ｅ_１０、Ｅ_５Ｅ_６Ｅ_７Ｅ_８Ｅ_９Ｅ_１０およびＥ_２Ｅ_３Ｅ_４Ｅ_５Ｅ_６Ｅ_７Ｅ_８Ｅ_９Ｅ_１０であり、その際、Ｅ_２Ｅ_３Ｅ_４Ｅ_５Ｅ_６Ｅ_７Ｅ_８Ｅ_９Ｅ_１０が特に有利である。

さらに、本発明によれば、本発明による細胞が、野生型としてＣ_６〜Ｃ_１６のモノアルカノエートの鎖長を有するポリヒドロキシアルカノエートを産生し得る細胞である場合に有利である。このような細胞は、例えばバークホルデリア種（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ．）、バークホルデリア・タイランデンシス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｔｈａｉｌａｎｄｅｎｓｉｓ）、シュードモナス種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・エルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・オレオボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）、シュードモナス・スタッツェリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・シトロネロリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｉｔｒｏｎｅｌｌｏｌｉｓ）、シュードモナス・レシノボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｓｉｎｏｖｏｒａｎｓ）、コマモナス・テストステローニ（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）、エロモナス・ハイドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）、カプリアビダス・ネカトール（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ）、アルカリゲネス・レータス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｌａｔｕｓ）およびラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）である。これに関連して、有利な本発明の細胞は、該細胞がその野生型と比較してより少ないポリヒドロキシアルカノエートしか産生できないように遺伝子改変されている。

このような細胞は、例えばＲｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９９８ Ｊｕｎ， ４９（６）：７４３−５０に、ＧＰｐ１２１、ＧＰｐ１２２、ＧＰｐ１２３およびＧＰｐ１２４として、Ｈｕｉｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． １９９１ Ｆｅｂ ５；２６６（４）：２１９１−８にはＧＰｐ１０４として、Ｄｅ Ｅｕｇｅｎｉｏ ｅｔ ａｌ．， Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２０１０． １２（１）：２０７−２１にはＫＴ４２Ｃ１として、またＯｕｙａｎｇ ｅｔ ａｌ． Ｍａｃｒｏｍｏｌ Ｂｉｏｓｃｉ． ２００７． ７（２）：２２７−３３にはＫＴＯＹ０１およびＫＴＯＹ０２として記載されている。

このような細胞は、その野生型と比較してより少ないポリヒドロキシアルカノエートしか産生することができず、特に、その野生型と比較して少なくとも１つの酵素Ｅ_１１の減少した活性を有することを特徴とする。

Ｅ_１１は、ＥＣ：２．３．１．−のポリヒドロキシアルカノエートシンターゼであり、有利には
ｐｈａＣ遺伝子、特にｐｈＡｃ１もしくはｐｈａＣ２遺伝子によりコードされるか、または
ｐｈａＣ遺伝子、特にｐｈＡｃ１もしくはｐｈａＣ２遺伝子によりコードされる酵素のアミノ酸残基の２５％まで、有利には２０％まで、特に有利には１５％まで、とりわけ１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％までが欠失、挿入、置換もしくはそれらの組合せにより改変されているポリペプチド配列を有し、かつｐｈａＣ遺伝子、特にｐｈＡｃ１もしくはｐｈａＣ２遺伝子によりコードされる酵素の酵素活性の少なくとも１０％、有利には５０％、特に有利には８０％、とりわけ９０％超をなおも有し、ここで、酵素Ｅ_１１の酵素活性とは、３−ヒドロキシアルカノイル−コエンザイムＡをポリ−３−ヒドロキシアルカン酸に、特に３−ヒドロキシデカノイル−コエンザイムＡをポリ−３−ヒドロキシデカン酸に転化させる能力を意味すると解釈される。

特に有利な酵素Ｅ_１１は、
ポリペプチド配列ＡＡＭ６３４０７．１もしくはＡＡＭ６３４０９．１を有するか、または
上記の特定のアクセッション番号に対してアミノ酸残基の２５％まで、有利には２０％まで、特に有利には１５％まで、とりわけ１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％までが欠失、挿入、置換もしくはそれらの組合せにより改変されているポリペプチド配列を有し、かつ上記の特定のアクセッション番号を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％、有利には５０％、特に有利には８０％、とりわけ９０％超をなおも有する
酵素から選択される。

酵素Ｅ_１１の活性は、分光測光法により決定できる。すべての成分を添加した後に、このアッセイ混合物は、１０８ｍＭのリン酸カリウム緩衝剤（２５℃でｐＨ６．０）、３３ｍＭのグルコン酸ナトリウム、０．２２ｍＭの２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ナトリウム塩）、１．３ｍＭのフェナジンメトスルフェートおよび０．００５％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミンを含有する。６００ｎｍでの吸収が一定になるまで、このアッセイ混合物を２５℃で平衡化する。次に、測定すべき活性を含む細胞不含の抽出物の添加により反応を開始し、吸収の減少を６００ｎｍで２５℃で約５分間記録する。２，６−ジクロロフェノールインドフェノールの濃度を分光測光法により測定し、６００ｎｍでのモル吸収係数を１０ｍＭ^−１ｃｍ^−１と仮定する。酵素活性１単位とは、２５℃、ｐＨ６．０で１分間あたり１．０μｍｏｌの２，６−ジクロロフェノールインドフェノールの減少を導く酵素の量として定義付けられる。

さらにＥ_１に関して、本発明による細胞がその野生型と比較して、ＥＣ１．１．１．２１５のグルコネート２−デヒドロゲナーゼである少なくとも１つの酵素Ｅ_１２の減少した活性を有するように遺伝子改変される場合にさらに有利であり、したがって好ましい。

有利な酵素Ｅ_１２は、特に
ｇａｄ遺伝子によりコードされるか、または
ｇａｄ遺伝子によりコードされる酵素のアミノ酸残基の２５％まで、有利には２０％まで、特に有利には１５％まで、とりわけ１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％までが欠失、挿入、置換もしくはそれらの組合せにより改変されているポリペプチド配列を有し、かつｇａｄ遺伝子によりコードされる酵素の酵素活性の少なくとも１０％、有利には５０％、特に有利には８０％、とりわけ９０％超をなおも有する
酵素から選択され、その際、酵素Ｅ_１２の酵素活性とは、グルコネートを２−デヒドログルコネートに転化させる能力を意味すると解釈される。

酵素Ｅ_１２の活性は、３−ヒドロキシデカノイル−コエンザイムＡの重合において遊離されるコエンザイムＡ（ＣｏＡ）の定量化により決定できる。アッセイ混合物は、２ｍＭの３−ヒドロキシデカノイル−ＣｏＡ、４０ｍＭのリン酸カリウム緩衝剤（ｐＨ７．５）、１０ｍＭの５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）および１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを含有する。測定すべき活性を含む細胞不含の抽出物の添加により反応を開始し、吸収を４１２ｎｍで３０℃で記録する。ＣｏＡの濃度を分光測光法により測定し、４１２ｎｍでのモル吸収係数を１３６００Ｍ^−１ｃｍ^−１と仮定する。酵素活性１単位とは、３０℃、ｐＨ７．５で１分間あたり１．０μｍｏｌのＣｏＡの遊離を導く酵素の量として定義付けられる。

さらにＥ_１に関して、本発明による細胞がその野生型と比較して、該細胞から周辺の培地への一般式（Ｉ）のラムノリピドの排出を触媒する少なくとも１つの酵素Ｅ_１３の増大した活性を有するように遺伝子改変されている場合にさらに有利であり、したがって好ましい。

本発明による有利な細胞の場合には、Ｅ_１３は、
次のポリペプチド配列：ＡＡＧ０４５２０．１、ＡＪＹ０２９９６．１、ＺＰ＿０５５９０６６１．１、ＹＰ＿４３９２７８．１、ＹＰ＿４４００６９．１、ＺＰ＿０４９６９３０１．１、ＺＰ＿０４５２０２３４．１、ＹＰ＿３３５５２８．１、ＹＰ＿００１０７５８５９．１、ＹＰ＿００１０６１８１７．１、ＺＰ＿０２４８７４９９．１、ＹＰ＿３３７２５１．１、ＺＰ＿０４８９７７１２．１、ＺＰ＿０４８１０１９０．１、ＹＰ＿９９０３２２．１、ＺＰ＿０２４７６９２４．１、ＺＰ＿０４８９９７３５．１、ＺＰ＿０４８９３８７３．１、ＺＰ＿０２３６５９８２．１、ＹＰ＿００１０６２９０９．１、ＹＰ＿１０５６１１．１、ＺＰ＿０３７９４０６１．１、ＺＰ＿０３４５７０１１．１、ＺＰ＿０２３８５４０１．１、ＺＰ＿０２３７０５５２．１、ＹＰ＿１０５２３６．１、ＺＰ＿０４９０５０９７．１、ＹＰ＿７７６３８７．１、ＹＰ＿００１８１１６９０．１、ＹＰ＿００４３４８７３０．１、ＹＰ＿００４３４８７０８．１、ＹＰ＿３７１３２０．１、ＹＰ＿６２３１４５．１、ＹＰ＿００１７７８８１０．１、ＹＰ＿００２２３４９３３．１、ＣＣＥ５２９０９．１、ＹＰ＿００２９０８２４８．１、ＺＰ＿０４９５４５５７．１、ＺＰ＿０４９５６０３８．１、ＺＰ＿０２４０８９５０．１、ＺＰ＿０２３７５８９７．１、ＺＰ＿０２３８９９０８．１、ＹＰ＿４３９２７４．１、ＹＰ＿００１０７４７６２．１、ＹＰ＿３３７２４７．１、ＹＰ＿１１０５５９．１、ＺＰ＿０２４９５９２７．１、ＹＰ＿１１１３６０．１、ＹＰ＿１０５６０８．１、ＺＰ＿０２４８７８２６．１、ＺＰ＿０２３５８９４７．１、ＹＰ＿００１０７８６０５．１、ＺＰ＿００４３８０００．１、ＺＰ＿００４４０９９３．１、ＺＰ＿０２４７７２６０．１、ＹＰ＿３７１３１７．１、ＹＰ＿００１７７８８０７．１、ＺＰ＿０２３８２８４３．１、ＹＰ＿００２２３４９３６．１、ＹＰ＿６２３１４２．１、ＺＰ＿０２９０７６１８．１、ＺＰ＿０２８９１４７８．１、ＹＰ＿７７６３９０．１、ＺＰ＿０４９４３３０８．１、ＹＰ＿００１８１１６９３．１、ＺＰ＿０２５０３９８５．１、ＹＰ＿００４３６２７４０．１、ＹＰ＿００２９０８２４５．１、ＹＰ＿００４３４８７０５．１、ＺＰ＿０２４０８７９８．１、ＺＰ＿０２４１７２５０．１、ＥＧＤ０５１６６．１、ＺＰ＿０２４５８６７７．１、ＺＰ＿０２４６５７９３．１、ＹＰ＿００１５７８２４０．１、ＺＰ＿０４９４４３４４．１、ＹＰ＿７７１９３２．１、ＺＰ＿０２８８９１６６．１、ＹＰ＿００２２３２６１４．１、ＺＰ＿０３５７４８０８．１、ＺＰ＿０２９０６１０５．１、ＹＰ＿００１８０６７６４．１、ＹＰ＿６１９９１２．１、ＹＰ＿００１１１７９１３．１、ＹＰ＿１０６６４７．１、ＹＰ＿００１７６３３６８．１、ＺＰ＿０２４７９５３５．１、ＺＰ＿０２４６１７４３．１、ＹＰ＿５６０９９８．１、ＹＰ＿３３１６５１．１、ＺＰ＿０４８９３０７０．１、ＹＰ＿００３６０６７１４．１、ＺＰ＿０２５０３９９５．１、ＺＰ＿０６８４０４２８．１、ＹＰ＿１０４２８８．１、ＺＰ＿０２４８７８４９．１、ＺＰ＿０２３５３８４８．１、ＹＰ＿３６７４７５．１、ＺＰ＿０２３７７３９９．１、ＺＰ＿０２３７２１４３．１、ＹＰ＿００１８９７５６２．１、ＺＰ＿０２３６１０６６．１、ＹＰ＿４４０５８２．１、ＺＰ＿０３２６８４５３．１、ＡＥＴ９０５４４．１、ＹＰ＿００３９０８７３８．１、ＹＰ＿００４２３００４９．１、ＺＰ＿０２８８５４１８．１、ＣＤＨ７２３１６．１、ＷＰ＿００１２９７０１３．１、ＷＰ＿０１０９５５７７５．１、ＷＰ＿０１０９５５６７１．１、ＷＰ＿０１０９５５６７２．１、ＷＰ＿０１０９５５６７３．１、ＷＰ＿０１０９５２４０１．１、ＷＰ＿０１０９５２４０２．１、ＷＰ＿０１０９５２４０３．１、ＷＰ＿０１０９５２８５５．１、ＷＰ＿０１０９５４５７３．１、ＷＰ＿０１０９５４６３１．１、ＷＰ＿０１０９５４６３２．１、ＷＰ＿０１０９５４４０４．１、ＷＰ＿００４５７５３１０．１もしくはＺＰ＿０２５１１８３１．１を有するか、または
特定の上記のアクセッション番号に対してアミノ酸残基の２５％まで、有利には２０％まで、特に有利には１５％まで、とりわけ１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％までが欠失、挿入、置換もしくはそれらの組合せにより改変されているポリペプチド配列を有し、かつ特に上記アクセッション番号を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％、有利には５０％、特に有利には８０％、特に９０％超をなおも有する
酵素Ｅ_１３からなる群から選択され、ここで、酵素Ｅ_１３の酵素活性とは、一般式（Ｉ）のラムノリピドを細胞から周辺培地に排出する能力を意味すると解釈される。

次いで、上記のように得られた細胞不含の粗抽出物を使用して、産生された酵素Ｅ_１３の量を測定することにより、酵素Ｅ_１３の活性を決定することができる。これは、バイオマス１単位当たりに、より多くの酵素Ｅ_１３によって、一般式（Ｉ）のより多くのラムノリピドが細胞から周辺培地に排出され得るという仮定に基づいている。このような定量化は、酵素Ｅ_１３に特異的な抗体を用いた免疫学的検出により（Ｋｕｒｉｅｎ， Ｔ． Ｂ．， Ｓｃｏｆｉｅｌｄ， Ｒ． Ｈ （Ｅｄｓ．）． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ５３６． １ｓｔ Ｅｄ．， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ． Ｎ．Ｙ． ＵＳＡ， ２００９参照）またはマススペクトロメトリー法により（Ｓｃｈｍｉｄｔ， Ａ．， Ｋｅｌｌｅｒｍａｎｎ， Ｊ． ＆ Ｌｏｔｔｓｐｅｉｃｈ， Ｆ． Ａ ｎｏｖｅｌ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｏｒｎｉｃｓ ｕｓｉｎｇ ｉｓｏｔｏｐｅ−ｃｏｄｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌａｂｅｌｓ． Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ５， ４−１５（２００５）参照）実施することができる。

あるいは酵素Ｅ_１３の活性は、放射線によりラベルしたラムノリピドおよび本発明による細胞から産生された反転小胞を使用して取込みアッセイを実施することによっても決定できる。一般的な方法は、例えばＮｉｅｓ ＤＨ， Ｔｈｅ ｃｏｂａｌｔ， ｚｉｎｃ， ａｎｄ ｃａｄｍｉｕｍ ｅｆｆｌｕｘ ｓｙｓｔｅｍ ＣｚｃＡＢＣ ｆｒｏｍ Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｓ ａ ｃａｔｉｏｎ−ｐｒｏｔｏｎ ａｎｔｉｐｏｒｔｅｒ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １９９５． １７７（１０）：２７０７−１２、またはＬｅｗｉｎｓｏｎ Ｏ， Ａｄｌｅｒ Ｊ， Ｐｏｅｌａｒｅｎｄｓ ＧＪ， Ｍａｚｕｒｋｉｅｗｉｃｚ Ｐ， Ｄｒｉｅｓｓｅｎ ＡＪ， Ｂｉｂｉ Ｅ． Ｔｈｅ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ＭｄｆＡ ｃａｔａｌｙｚｅｓ ｂｏｔｈ ｅｌｅｃｔｒｏｇｅｎｉｃ ａｎｄ ｅｌｅｃｔｒｏｎｅｕｔｒａｌ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． ２００３ Ｆｅｂ １８；１００（４）：１６６７−７２に記載されている。

特に有利には、上記の酵素の改変された活性は、次の組合せ
Ｅ_２Ｅ_３Ｅ_４Ｅ_１３、Ｅ_２Ｅ_３Ｅ_４Ｅ_９Ｅ_１０Ｅ_１３、Ｅ_５Ｅ_６Ｅ_７Ｅ_８Ｅ_９Ｅ_１０Ｅ_１３およびＥ_２Ｅ_３Ｅ_４Ｅ_５Ｅ_６Ｅ_７Ｅ_８Ｅ_９Ｅ_１０Ｅ_１３であり、その際、Ｅ_２Ｅ_３Ｅ_４Ｅ_５Ｅ_６Ｅ_７Ｅ_８Ｅ_９Ｅ_１０Ｅ_１３が特に有利である。

本発明による細胞は、ラムノリピドの製造に有利に使用することができる。

したがって本発明は、一般式（Ｉ）の化合物を製造するための本発明による細胞の使用をさらに提供する。

本発明はさらに、ラムノリピド、特に一般式（Ｉ）
［式中、
ｍは、２、１または０、特に１または０であり、
ｎは、１または０、特に１であり、
Ｒ^１およびＲ^２は、２〜２４個、有利には５〜１３個の炭素原子を有する同一のまたは異なる有機基、特に場合により分岐状の、場合により置換された、特にヒドロキシで置換された、場合により不飽和の、特に場合により一不飽和、二不飽和または三不飽和のアルキル基であり、有利にはペンテニル、ヘプテニル、ノネニル、ウンデセニルおよびトリデセニルおよび（ＣＨ_２）_ｏ−ＣＨ_３（ここで、ｏは、１〜２３、有利には４〜１２である）からなる群から選択されるものである］のラムノリピドの製造方法であって、以下の方法工程：
Ｉ）本発明による細胞を、炭素源を含有する培地と接触させる工程、
ＩＩ）前記細胞が前記炭素源からラムノリピドを産生できるような条件下に前記細胞を培養する工程、および
ＩＩＩ）必要に応じて、産生されたラムノリピドを単離する工程
を含む方法を提供する。

本発明による遺伝子改変された細胞を培養培地と接触させて、上記産生物を産生する目的で連続的または非連続的に回分法または流加法でまたは流加法を繰り返すことにより培養することができる。

また、英国特許出願公開第１００９３７０号明細書（ＧＢ−Ａ−１００９３７０）に記載されているような半連続的方法も考え得る。公知の培養法の概要は、Ｃｈｍｉｅｌによる教書（“Ｂｉｏｐｒｏｚｅｓｓｔｅｃｈｎｉｋ １． Ｅｉｎｆｕｅｈｒｕｎｇ ｉｎ ｄｉｅ Ｂｉｏｖｅｒｆａｈｒｅｎｓｔｅｃｈｎｉｋ”［Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １． Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ］（Ｇｕｓｔａｖ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｖｅｒｌａｇ， Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ， １９９１））またはＳｔｏｒｈａｓによる教書（“Ｂｉｏｒｅａｋｔｏｒｅｎ ｕｎｄ ｐｅｒｉｐｈｅｒｅ Ｅｉｎｒｉｃｈｔｕｎｇｅｎ”［Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｄｅｖｉｃｅｓ］（Ｖｉｅｗｅｇ Ｖｅｒｌａｇ， Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ／Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ， １９９４））にて得ることができる。

使用すべき培養培地は、特定の株の要求を適切に満たさねばならない。様々な酵母株の培養培地の説明は、例えば“Ｎｏｎｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ｙｅａｓｔ ｉｎ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”（Ｅｄ． Ｋｌａｕｓ Ｗｏｌｆ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ Ｂｅｒｌｉｎ， １９９６）に含まれる。

使用される炭素源は、炭水化物、例えばグルコース、スクロース、アラビノース、キシロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、デンプン、セルロースおよびヘミセルロース、植物油および動物油ならびに脂肪、例えば大豆油、紅花油、落花生油、麻実油、ジャトロファ油、ココナッツ脂肪、パンプキンシード油、アマニ油、コーン油、ケシの実油、月見草油、オリーブ油、パーム核油、パーム油、菜種油、ゴマ油、ヒマワリ油、グレープシード油、クルミ油、小麦胚芽油およびココナッツ脂肪、脂肪酸、例えばカプリル酸、カプリン酸、ラウリル酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、パルミトール酸、ステアリン酸、アラキドン酸、ベヘン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、γ−リノレン酸およびそれらのメチルもしくはエチルエステルならびに脂肪酸混合物、前述の脂肪酸を含有するモノ−、ジ−およびトリグリセリド、アルコール、例えばグリセロール、エタノールおよびメタノール、炭化水素、例えばメタン、炭素質ガスおよびガス混合物、例えばＣＯ、ＣＯ_２、合成ガスまたは燃焼排ガス、アミノ酸、例えばＬ−グルタメートまたはＬ−バリンまたは有機酸、例えば酢酸であってよい。これらの物質を、個別に使用してもよいし混合物として使用してもよい。特に有利であるのは、米国特許第６，０１，４９４号明細書（ＵＳ ６，０１，４９４）および米国特許第６，１３６，５７６号明細書（ＵＳ ６，１３６，５７６）に記載の炭素源としての、炭水化物、特に単糖類、オリゴ糖類または多糖類、ならびに炭化水素、特にアルカン、アルケンおよびアルキンおよびそれらから誘導されるモノカルボン酸および前記モノカルボン酸から誘導されるモノ−、ジ−およびトリグリセリドおよびグリセロールおよびアセテートの使用である。極めて特に有利であるのは、グリセロールと、カプリル酸、カプリン酸、ラウリル酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、パルミトール酸、ステアリン酸、アラキドン酸、ベヘン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸および／またはγ−リノレン酸とのエステル化生成物を含有するモノ−、ジ−およびトリグリセリドである。

本発明の主な利点は、本発明による細胞が、例えばグルコース、スクロースまたはグリセロールといった非常に単純な炭素源からラムノリピドを産生できることであり、このことは、本発明による方法の間に培地中に長鎖炭素源を提供しなくてもよいことを意味する。したがって、入手可能性が不十分である場合には、本発明による方法の工程Ｉ）での培地が、炭素原子６個よりも長い鎖長を有するカルボン酸またはそれらから誘導可能なエステルもしくはグリセリドを含有しないかまたは検出可能な量を含有しないことが有利である。

使用される窒素源は、含窒素有機化合物、例えばペプトン、酵母抽出物、肉抽出物、麦芽抽出物、コーンスティープリカー、大豆粉末および尿素または無機化合物、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムおよび硝酸アンモニウム、アンモニア、水酸化アンモニウムまたはアンモニア水であってもよい。窒素源を、個別に使用してもよいし混合物として使用してもよい。

使用されるリン源は、リン酸、リン酸二水素カリウムまたはリン酸水素二カリウムまたは相応するナトリウム含有塩であってもよい。さらに、培養培地は、増殖に必要な金属の塩、例えば硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄を含有すべきである。最後に、上記の物質に加えてアミノ酸およびビタミンのような必須増殖物質を使用してもよい。さらに、適切な前駆物質を培養培地に添加してもよい。上記の出発材料を、１回バッチの形で培養物に添加してもよいし、培養の間に適切に供給してもよい。培養物のｐＨを調整するために、塩基性化合物、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアもしくはアンモニア水、または酸性化合物、例えばリン酸もしくは硫酸が適切に使用される。発泡を調整するために、消泡剤、例えば脂肪酸ポリグリコールエステルを使用することができる。プラスミドの安定性を保持するために、培地に適切な選択物質、例えば抗生物質を添加することができる。好気条件を保持するために、酸素または酸素性ガス混合物、例えば空気が培養物に導入される。

培養物の温度は、通常は２０℃よりも高く、有利には２５℃よりも高く、また４０℃よりも高いこともでき、９５℃の培養温度、とりわけ有利には９０℃および最も有利には８０℃を有利には超えない。

本発明による方法の工程ＩＩＩ）では、細胞により産生されるラムノリピドを、場合により細胞および／または培養培地から単離することができ、その際、単離の目的に使用するために、低分子量物質を複合的組成物から単離するための当業者に公知のあらゆる方法、例えばろ過、抽出、吸着（クロマトグラフィー）または結晶化を使用することができる。

さらに、生成物相は、バイオマスの残留物および様々な不純物、例えば油、脂肪酸およびその他の培養培地成分を含有する。不純物は、有利には無溶媒の方法で除去される。例えば生成物相は、水で希釈してｐＨ調節を容易に行うことができる。次に、酸またはアルカリを用いてｐＨを低下または上昇させてラムノリピドを水溶性の形態に移行させることにより、生成物相と水相とを均質化することができる。恐らく、水相へのラムノリピドの可溶化は、比較的に高温での、例えば６０〜９０℃でのインキュベーションおよび一定の混合により支持することができる。引き続きアルカリまたは酸を用いてｐＨを上昇または低下させることにより、ラムノリピドを再び水に不溶性の形態に移行させることができ、このようにして、これらを容易に水相から分離することができる。次に、生成物相はさらに水で１回以上洗浄して、水溶性の不純物を除去することができる。

油残留物は、例えば適切な溶媒を用いて、有利には有機溶媒を用いる抽出により除去できる。アルカン、例えばｎ−ヘキサンが溶媒として有利である。

上記の無溶媒の方法に代わるものとして、適切な溶媒、例えばエステル、例えば酢酸エチルまたは酢酸ブチルを使用して水相から生成物を除去することができる。記載された抽出工程は、所望の順番で実施することができる。ここでは、溶媒、特に有機溶媒が有利に使用される。有利な溶媒は、ｎ−ペンタノールである。溶媒は、例えば蒸留により除去される。その後、凍結乾燥生成物を例えばクロマトグラフ法によりさらに精製することができる。この点で挙げることができる例には、適切な溶媒を用いた沈殿、適切な溶媒を用いた抽出、例えばシクロデキストリンもしくはシクロデキストリン誘導体による錯体形成、結晶化、クロマトグラフ法による精製もしくは単離、またはラムノリピドを容易に除去可能な誘導体へと移行させることが含まれる。

方法工程ＩＩＩ）での特に適切なラムノリピド単離手法は、以下の部分工程：
Ａ）ラムノリピドを６未満のｐＨを有する水性培地に移す工程、
Ｂ）前記培地を少なくとも１つの有機溶媒と接触させて多相系を得て、そして水相を除去する工程、
Ｃ）ｐＨを６以上のｐＨに上昇させて、多相有機系を得る工程、
Ｄ）ラムノリピドが富化した有機相を除去する工程、および
Ｅ）場合によりラムノリピドをさらに精製する工程
の方法を含む。

方法工程ＩＩＩ）のこの有利な実施態様の実施方法の詳細な説明は、米国特許出願公開第２０１４０１４８５８８号明細書（ＵＳ ２０１４０１４８５８８）に挙げられている。

本発明は、同様に本発明による方法を用いて得ることができるラムノリピド、特にまた本発明による方法を用いて得ることができる上記ラムノリピド混合物を提供する。

有利にも、本発明による方法を用いて得ることができるラムノリピドおよび混合物を、洗浄剤において、化粧品または医薬製剤において、および作物保護剤において使用することができる。

したがって、本発明はさらに、化粧品、皮膚用製剤または医薬製剤、作物保護剤ならびにケア製品および洗浄剤および界面活性剤濃縮物を製造するための、本発明による方法を用いて得られたラムノリピドの使用を提供する。

以下に提示する例によって本発明を例示により説明するが、本発明は例に明示された実施態様に限定されるものではなく、その適用範囲は、本発明の明細書および特許請求の範囲の全体から明らかである。

以下の図は、例の構成要素である。

図１は、並行する例（実験＃１〜３）における株ＰＰ−１５５およびＰＰ−０９９［Δｇｃｄ］の全収率ならびに平均値の比較を示す。

例：
例１（本発明によらない）：株ＢＳ−ＰＰ−１５５（Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０ Δｕｐｐ＋ｐＡＣＹＣＡＴｈ５−｛ＰｒｈａＳＲ｝［ｒｈａＳＲ＿Ｅｃ］｛ＰｒｈａＢＡＤ｝［ｒｈｌＡＢＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝［ａｒａＣ＿Ｅｃ］｛ＰａｒａＢＡＤ｝［ｒｍｌＢＤＡＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝；クローン１）を使用した。

株ＢＳ−ＰＰ−１５５の構築
遺伝子ｒｈｌＡ、ｒｈｌＢおよびｒｈｌＣならびに遺伝子ｒｍｌＢ、ｒｍｌＤ、ｒｍｌＡおよびｒｍｌＣ（双方ともＰ．エルギノーザ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来）を異種発現するために、プラスミドｐＡＣＹＣＡＴｈ５−｛ＰｒｈａＳＲ｝［ｒｈａＳＲ＿Ｅｃ］｛ＰｒｈａＢＡＤ｝［ｒｈｌＡＢＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝［ａｒａＣ＿Ｅｃ］｛ＰａｒａＢＡＤ｝［ｒｍｌＢＤＡＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝を構築した。プラスミドは、第一に、Ｐ．エルギノーザ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＤＳＭ１１２８（配列番号１）由来の遺伝子ｒｈｌＡおよびｒｈｌＢ（ラムノシルトランスフェラーゼ１をコード）ならびにｒｈｌＣ（ラムノシルトランスフェラーゼ２をコード）からなる合成オペロンを含み、第二に、Ｐ．エルギノーザ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＤＳＭ １９８８０（配列番号２）由来の遺伝子ｒｍｌＢ（ｄＴＤＰ−Ｄ−グルコース４，６−デヒドラターゼをコード）、ｒｍｌＤ（ｄＴＤＰ−４−デヒドロラムノースレダクターゼをコード）、ｒｍｌＡ（グルコース−１−ホスフェートチミジリルトランスフェラーゼをコード）およびｒｍｌＣ（ｄＴＤＰ−４−デヒドロラムノース３，５−エピメラーゼをコード）からなるオペロンを含む。遺伝子ｒｈｌＡＢＣは、ラムノース誘導性Ｐ_Ｒｈａプロモーターの制御下にあり、ｒｍｌＢＤＡＣ遺伝子は、アラビノース誘導性Ｐ_ＢＡＤプロモーターの制御下にある。２つのオペロン構造の下流には、ターミネーター配列（ｒｒｎＢ Ｔ１Ｔ２）が位置している。ｒｍｌＢＤＡＣ遺伝子を、Ｐ．エルギノーザ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＤＳＭ １９８８０由来のゲノムＤＮＡから増幅し、かつ合成ｒｈｌＡＢＣオペロンを遺伝子合成により得た。Ｐ_Ｒｈａプロモーターカセット（配列番号３）およびＰ_ＢＡＤプロモーターカセット（配列番号４）ならびにターミネーター配列（配列番号５）をゲノム大腸菌ＤＮＡから増幅した。それに対して、ジラムノリピドの合成にはｒｈｌＡＢＣ遺伝子が必要であり、活性化されたｄＴＤＰ−Ｌ−ラムノースの提供にはｒｍｌＢＤＡＣ遺伝子が必要である。

ベクターは、プラスミドｐＡＣＹＣ１８４（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，フランクフルト・アム・マイン、ドイツ）をベースとし、かつ大腸菌内で複製するためのｐ１５Ａ複製起点とＰ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）内で複製するためのｐＶＳ１複製起点とを有する。ｐＶＳ１複製起点を、シュードモナスプラスミドｐＶＳ１から増幅させた（Ｉｔｏｈ Ｙ， Ｗａｔｓｏｎ ＪＭ， Ｈａａｓ Ｄ， Ｌｅｉｓｉｎｇｅｒ Ｔ， Ｐｌａｓｍｉｄ １９８４， １１（３）， ２０６−２０）。ベクター部分およびＤＮＡ断片を、市販のイン・ビトロＤＮＡアセンブリキットを（例えばＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを製造者の指示書にしたがって（ＮＥＢ；フランクフルト・アム・マイン、ドイツ））使用してクローニングした。大腸菌１０ ｂｅｔａケミカルコンピテントセル（ＮＥＢ；フランクフルト・アム・マイン、ドイツ）を、当業者に公知の方法で形質転換した。標的遺伝子の正確な挿入を制限分析によりチェックし、導入された相同領域の信頼性をＤＮＡシーケンシングにより確認した。得られたプラスミドｐＡＣＹＣＡＴｈ５−｛ＰｒｈａＳＲ｝［ｒｈａＳＲ＿Ｅｃ］｛ＰｒｈａＢＡＤ｝［ｒｈｌＡＢＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝［ａｒａＣ＿Ｅｃ］｛ＰａｒａＢＡＤ｝［ｒｍｌＢＤＡＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝（配列番号６）のサイズは、１７３３７塩基対である。

その後、このプラスミドを、Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０ Δｕｐｐに導入した。この株を、Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）内でマーカーレス遺伝子欠失を構築するための出発株として使用する（Ｇｒａｆ ＆ Ａｌｔｅｎｂｕｃｈｎｅｒ， ２０１１， Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ ７７， Ｎｏ． １５， ５５４９−５５５２， ＤＯＩ：１０．１１２８／ＡＥＭ．０５０５５−１１）。該方法は、Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）に対するネガティブカウンターセレクション系に基づいており、これは、ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼの活性および代謝拮抗剤５−フルオロウラシルに対するＰ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）の感受性を利用する。ｕｐｐ遺伝子の欠失は、ラムノリピド生合成に影響を与えない。ベクターｐＡＣＹＣＡＴｈ５−｛ＰｒｈａＳＲ｝［ｒｈａＳＲ＿Ｅｃ］｛ＰｒｈａＢＡＤ｝［ｒｈｌＡＢＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝［ａｒａＣ＿Ｅｃ］｛ＰａｒａＢＡＤ｝［ｒｍｌＢＤＡＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝を用いたＰ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０ Δｕｐｐの形質転換を、Ｉｗａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．（Ｉｗａｓａｋｉ Ｋ， Ｕｃｈｉｙａｍａ Ｈ， Ｙａｇｉ Ｏ， Ｋｕｒａｂａｙａｓｈｉ， Ｔ， Ｉｓｈｉｚｕｋａ Ｋ， Ｔａｋａｍｕｒａ Ｙ， Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １９９４． ５８（５）：８５１−８５４）に記載の通りに実施した。１０クローンそれぞれからプラスミドＤＮＡを単離して分析した。このプラスミドを有する株を、Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０ Δｕｐｐ ｐＡＣＹＣＡＴｈ５−｛ＰｒｈａＳＲ｝［ｒｈａＳＲ＿Ｅｃ］｛ＰｒｈａＢＡＤ｝［ｒｈｌＡＢＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝［ａｒａＣ＿Ｅｃ］｛ＰａｒａＢＡＤ｝［ｒｍｌＢＤＡＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝と称した。

バイオテクノロジーによる界面活性剤の製造を、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社製の８重並行発酵系「ＤＡＳＧＩＰ」において実施した。

発酵のために、１Ｌ反応器を使用した。ｐＨプローブを、ｐＨ４．０およびｐＨ７．０の測定溶液を用いた２点校正により校正した。反応器に３００ｍＬの水を充填し、１２１℃で２０分間オートクレーブ処理して、確実に無菌状態となるようにした。翌朝、クリーンベンチ内で水を取り除き、無菌発酵培地と取り換えた（オートクレーブ処理済み：２．２ｇ／Ｌの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、０．０２ｇ／ＬのＮａＣｌ、０．４ｇ／ＬのＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．０４ｇ／ＬのＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ、別個に滅菌済み：２ｇ／ＬのＫＨ_２ＰＯ_４、１５ｇ／Ｌのグルコース、１０ｍＬ／Ｌの微量元素溶液Ｍ１２［滅菌ろ過済み：０．２ｇ／ＬのＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．１ｇ／ＬのＭｎＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏ、１．５ｇ／Ｌのクエン酸三ナトリウム・２Ｈ_２Ｏ、０．１ｇ／ＬのＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ、０．００２ｇ／ＬのＮｉＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ、０．００３ｇ／ＬのＮａ_２ＭｏＯ_４・２Ｈ_２Ｏ、０．０３ｇ／ＬのＨ_３ＢＯ_３、１ｇ／ＬのＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ］）。引き続き、ｐＯ_２プローブを１点校正により校正し（撹拌機：６００ｒｐｍ／通気：１０ｓＬ／ｈ空気）、フィード、校正剤および誘導剤のラインを定置洗浄により洗浄した。このために、チューブを７０％エタノールで洗い流し、次に１ＭのＮａＯＨで、次に滅菌した脱塩水で洗浄し、最後に特定の培地を充填した。

凍結培養物から得た１００μＬを使用し、株（Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０ Δｕｐｐ＋ｐＡＣＹＣＡＴｈ５−｛ＰｒｈａＳＲ｝［ｒｈａＳＲ＿Ｅｃ］｛ＰｒｈａＢＡＤ｝［ｒｈｌＡＢＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝［ａｒａＣ＿Ｅｃ］｛ＰａｒａＢＡＤ｝［ｒｍｌＢＤＡＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝をまず、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンの入った２５０ｍＬバッフル付フラスコ内のＬＢ１培地（１０ｇ／Ｌのカゼイン加水分解物、５ｇ／Ｌの酵母抽出物、１ｇ／ＬのＮａＣｌ）２５ｍＬ中で、一晩３０℃、２００ｒｐｍで約１８時間増殖させた。この培養物の光学密度を測定した後に、５００ｍＬのバッフル付フラスコ内の滅菌シード培地５０ｍＬ（オートクレーブ処理済み：４．４ｇ／ＬのＮａ_２ＨＰＯ_４・２Ｈ_２Ｏ、１．５ｇ／ＬのＫＨ_２ＰＯ_４、１ｇ／ＬのＮＨ_４Ｃｌ、１０ｇ／Ｌの酵母抽出物、別個に滅菌済み：２０ｇ／Ｌのグルコース、０．２ｇ／ＬのＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．００６ｇ／ＬのＦｅＣｌ_３、０．０１５ｇ／ＬのＣａＣｌ_２、１ｍＬ／Ｌの微量元素溶液ＳＬ６［滅菌ろ過済み：０．３ｇ／ＬのＨ_３ＢＯ_３、０．２ｇ／ＬのＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ、０．１ｇ／ＬのＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．０３ｇ／ＬのＭｎＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏ、０．０１ｇ／ＬのＣｕＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ、０．０３ｇ／ＬのＮａ_２ＭｏＯ_４・２Ｈ_２Ｏ、０．０２ｇ／ＬのＮｉＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ］）を、０．２の開始ＯＤ_６００を使用してＬＢ予備培養物から植菌し、３０℃、２００ｒｐｍで約７時間インキュベートした。およそ８の光学密度ＯＤ_６００で、主要な培養物を０．７の開始ＯＤ_６００を使用して植菌した。

０．７の光学密度を使用して反応器に植菌するために、約２６ｍＬを３０ｍＬシリンジ内に充填し、セプタムを通して針により反応器に植菌した。

以下の標準プログラムを使用した：

アンモニア（１２．５％）を使用して、ｐＨを一方的にｐＨ７．０に調節した。培養およびバイオトランスフォーメーションの間に、培養物中の溶存酸素を、撹拌機速度および通気速度により３０％で一定に保持した。発酵をフェドバッチとして実施し、その際、供給開始から、５００ｇ／Ｌのグルコース供給による２．５ｇ／Ｌｈグルコースの供給を、ＤＯピークをトリガとして行った。組換えにより導入された遺伝子の発現を、０．２％（ｗ／ｖ）ラムノースおよび０．２％（ｗ／ｖ）アラビノースの自動的な添加により供給開始の３時間後に誘導した。誘導糖の必要量は、発酵開始体積に基づく。双方の糖に、２２０ｇ／Ｌのストック溶液を使用した。誘導の時点から界面活性剤の生成が始まった。ｐＨ、ＤＯ、ＣＴＲ、ＯＴＲ、また基質、例えばｐＨ調節用のアンモニア溶液の流量および量、グルコース供給または誘導剤の流量といったすべてのオンライン測定データを、ＤＡＳＧＩＰ発酵系により記録した。

発酵分析のために、１０ｍＬシリンジを使用して、２ｍＬを初留分として各容器から引き出し、かつ廃棄した。これに続いて、実際の分析用にもう一度６ｍＬを引き出した。ラムノリピド含有量、グルコール濃度および乾物バイオマスを求めた。発酵を６５時間後に終了させた。

ＨＰＬＣを用いてラムノリピド濃度を求めた。１００μＬの発酵試料をエッペンドルフチューブ内で９００μＬの７０％（ｖ／ｖ）ｎ−プロパノールと混合し、レッチェミル内で３０Ｈｚで１分間振盪させた。その後、この試料を１３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上澄み液を新たなエッペンドルフチューブに移した。さらなる希釈が必要な場合には、これを５５％ｎ−プロパノールを使用して行った。すべてのチューブを即座に閉鎖して、蒸発を回避した。次に、この試料をＨＰＬＣバイアルに移し、測定するまで−２０℃で貯蔵した。

容積式ピペット（Ｃｏｍｂｉｔｉｐ）を使用して２ｍｌ反応チューブに１ｍｌのアセトンを充填し、この反応チューブを即座に閉鎖して蒸発を最小限にした。これに続いて、１ｍｌの培養ブロスを添加した。この培養ブロス／アセトン混合物をボルテックス処理した後に、この混合物を１３０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、８００μｌの上澄み液をＨＰＬＣバイアルに移した。蒸発光散乱検出器（Ｓｅｄｅｘ ＬＴ−ＥＬＳＤ Ｍｏｄｅｌ ８５ＬＴ）をラムノリピドの検出および定量化に使用した。実際の測定は、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ １２００ Ｓｅｒｉｅｓ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ社、カルフォルニア）およびＺｏｒｂａｘ ＳＢ−Ｃ８ Ｒａｐｉｄ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｏｌｕｍｎ（４．６×１５０ｍｍ、３．５μｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ社）を使用して実施した。注入体積は５μｌであり、本方法の実施時間は２０分であった。水性０．１％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸、溶液Ａ）およびメタノール（溶液Ｂ）を移動相として使用した。カラム温度は４０℃であった。ＥＬＳＤ（検出器温度６０℃）およびＤＡＤ（ダイオードアレイ、２１０ｎｍ）を検出器として利用した。本方法で使用した勾配は、次の通りであった：

予め秤量しておいたエッペンドルフチューブにピペットで試料約１ｍｌを入れて初期重量を測定することにより、乾物バイオマスを求めた。その後、この試料を水道水約１ｍｌと合し、混合し、そして１３０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上澄み液を廃棄し、エッペンドルフチューブを粗く拭いた。もう一度水道水１ｍｌを加え、再懸濁をレッチェミル内で３０Ｈｚで１分間実施した。その後、遠心分離を１３０００ｒｐｍで１０分間実施し、上澄み液を廃棄し、次いでエッペンドルフチューブを例えば綿棒で拭いて乾かしたが、それと同時にエッペンドルフチューブからバイオマスを取り出さないようにした。試料を１０５℃で４８時間乾燥させ、冷却後に再び秤量した。各々の場合に二重測定を実施した。

次に、乾物バイオマスの算出をエクセルで実施した：
ＤＢＭ＝（バック重量（Ｂａｃｋ ｗｅｉｇｈｔ）−風袋重量）／（初期重量−風袋重量）×１０００［ｇ／Ｌ］。

発酵試料を遠心分離および滅菌ろ過した後に、製造者の規定通りにＲｏｃｈｅ Ｃｅｄｅｘ Ｂｉｏ ＨＴを用いてグルコース濃度を測定した。

３つの実験を、それぞれ例２と並行して行う。

例２：株ＢＳ−ＰＰ−０９９（Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０ Δｕｐｐ Δｇｃｄ＋ｐＡＣＹＣＡＴｈ５−｛ＰｒｈａＳＲ｝［ｒｈａＳＲ＿Ｅｃ］｛ＰｒｈａＢＡＤ｝［ｒｈｌＡＢＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝［ａｒａＣ＿Ｅｃ］｛ＰａｒａＢＡＤ｝［ｒｍｌＢＤＡＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝）を利用した。

シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ ２４４０ Δｕｐｐにおいてｇｃｄ遺伝子を欠失させるためのベクターの構築
Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ ２４４０ Δｕｐｐから、グルコースデヒドロゲナーゼをコードするｇｃｄ遺伝子を欠失させるためのベクターを、ｇｃｄ遺伝子の約６８０塩基対上流および下流のＰＣＲ増幅により調製した。

以下のプライマーをｇｃｄ遺伝子の相同領域の上流および下流の増幅に使用した：
ＰＣＲ１：ｇｃｄの上流領域
４^＊５４ ５’− ＧＣＣＧＣＴＴＴＧＧＴＣＣＣＧＧＧＴＴＴＣＡＡＧＣＴＣＡＧＣＧＧ −３’（配列番号７）
４^＊５７ ５’− ＡＡＧＧＣＧＣＧＡＴＣＧＣＧＧＧＴＴＡＧＡＡＡＣＴＧＣＴＣＴＧＧ −３’（配列番号８）
ＰＣＲ２：ｇｃｄの下流領域
４^＊５６ ５’−ＣＣＧＣＧＡＴＣＧＣＧＣＣＴＴＧＴＧＴＣＧＣＧＴＴＴＣ−３’（配列番号９）
４^＊５５ ５’−ＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＡＴＧＣＣＧＴＡＧＧＣＴＴＴＧＡＣＣ−３’（配列番号１０）。

以下のパラメーターをＰＣＲに使用した：
変性： ９８℃ ３０秒
変性： ９８℃ １０秒 ３０ｘ
アニーリング： ６２℃ １２秒 ３０ｘ
伸長： ７２℃ ２２秒 ３０ｘ
最終伸長： ７２℃ ５分。

増幅には、ＮＥＢ社（フランクフルト・アム・マイン、ドイツ）製Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを製造者の推奨にしたがって使用した。次に、ＰＣＲ反応物各５０μｌを、１％ＴＡＥアガロースゲル上で溶解させた。ＰＣＲ、アガロースゲル電気泳動、ＤＮＡの臭化エチジウム染色およびＰＣＲ断片サイズの決定を、当業者に公知の方法で実施する。予測されるサイズのＰＣＲ断片（ＰＣＲ１、６７９塩基対（配列番号１１）；ＰＣＲ２、６８２塩基対（配列番号１２））を増幅した。ＰＣＲ産物を、Ｑｉａｇｅｎ社製“ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ”を使用して製造者の規定通りに精製した。ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを製造者（ＮＥＢ；フランクフルト・アム・マイン、ドイツ）の指示書にしたがって使用し、精製したＰＣＲ産物をＢＡＭＨＩ−およびＳｂｆＩ−ｃｕｔ ｐＫＯＰｐベクターにクローニングした（配列番号１３）。大腸菌１０ ｂｅｔａケミカルコンピテントセル（ＮＥＢ、フランクフルト・アム・マイン、ドイツ）を、当業者に公知の方法で形質転換した。標的遺伝子の正確な挿入を制限分析によりチェックし、導入された相同領域の信頼性をＤＮＡシーケンシングにより確認した。得られたノックアウトベクターを、ｐＫＯＰｐ＿ｇｃｄ（配列番号１４）と称した。

株ＢＳ−ＰＰ−０９９の構築
株Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０ Δｕｐｐ Δｇｃｄの構築を、プラスミドｐＫＯＰｐ＿ｇｃｄおよびＧｒａｆ ｅｔ ａｌ．， ２０１１（Ｇｒａｆ Ｎ， Ａｌｔｅｎｂｕｃｈｎｅｒ Ｊ， Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｏｒｂｉｏｌ．， ２０１１ ， ７７（１５）：５５４９；ＤＯＩ：１０．１１２８／ＡＥＭ．０５０５５−１１）に記載の方法を用いて実施した。ｇｃｄ欠失後のＤＮＡ配列は、配列番号１５に記載されている。ベクターｐＡＣＹＣＡＴｈ５−｛ＰｒｈａＳＲ｝［ｒｈａＳＲ＿Ｅｃ］｛ＰｒｈａＢＡＤ｝［ｒｈｌＡＢＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝［ａｒａＣ＿Ｅｃ］｛ＰａｒａＢＡＤ｝［ｒｍｌＢＤＡＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝を用いたＰ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０ Δｕｐｐ Δｇｃｄの形質転換を、Ｉｗａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．（Ｉｗａｓａｋｉ Ｋ， Ｕｃｈｉｙａｍａ Ｈ， Ｙａｇｉ Ｏ， Ｋｕｒａｂａｙａｓｈｉ， Ｔ， Ｉｓｈｉｚｕｋａ Ｋ， Ｔａｋａｍｕｒａ Ｙ， Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １９９４． ５８（５）：８５１−８５４）に記載の通りに実施した。その後に、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を補充したＬＢアガープレートに細胞を播種した。プラスミドｐＡＣＹＣＡＴｈ５−｛ＰｒｈａＳＲ｝［ｒｈａＳＲ＿Ｅｃ］｛ＰｒｈａＢＡＤ｝［ｒｈｌＡＢＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝［ａｒａＣ＿Ｅｃ］｛ＰａｒａＢＡＤ｝［ｒｍｌＢＤＡＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝（配列番号６）は、既に例１に記載されている。１０クローンそれぞれからプラスミドＤＮＡを単離し、制限分析を用いて分析した。このプラスミドを有する株を、Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０ Δｕｐｐ Δｇｃｄ ｐＡＣＹＣＡＴｈ５−｛ＰｒｈａＳＲ｝｛ｒｈａＳＲ＿Ｅｃ｝｛ＰｒｈａＢＡＤ｝［ｒｈｌＡＢＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝［ａｒａＣ＿Ｅｃ］｛ＰａｒａＢＡＤ｝［ｒｍｌＢＤＡＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝と称した。技術的な具現化を、例１に記載の通りに実施した。

３つの実験を、それぞれ例１と並行して行った。

評価したものは全収率であり、これを、バイオマス＋産生されたラムノリピドの合計を使用および消費されたグルコースで除したものとして求めた。

図１から分かるように、ｒｈｌＡ、ｒｈｌＢおよびｒｈｌＣだけでなくグルコースデヒドロゲナーゼの在来遺伝子をも含むＰ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）株は、平均して０．２５８［（ｇ バイオマス＋ｇ ＲＬ）／ｇ グルコース］の全収率を達成する。比較によれば、ｇｃｄ遺伝子が欠失した株は、平均して０．２８３［（ｇ バイオマス＋ｇ ＲＬ）／ｇ グルコース］の全収率を達成する。

例３：株シュードモナス・エルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＰＡＯ１ Δｇｃｄの構築
株Ｐ．エルギノーザ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＰＡＯ１ Δｇｃｄの構築を、Ｃｈｏｉ ＆ Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ （Ｃｈｏｉ ＆ Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ， ＭＢＣ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ２００５ ５：３０， ＤＯＩ：１０．１１８６／１４７１−２１８０−５−３０）に記載の方法を用いて実施した。この方法は、Ｐ．エルギノーザ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）におけるマーカーレス遺伝子欠失の生成を可能にし、かつ相同組換えを用いるネガティブカウンターセレクション系（ｓａｃＢ）および選択マーカーを取り除くためのＦｌｐ−ＦＲＴ組換え系に基づく。ｇｃｄ欠失後のＤＮＡ配列は、配列番号１６に記載されている。すべての培養工程を３７℃で実施すること以外は、例１に記載されている通りに技術的な具現化を実施する。

３つの実験を、それぞれ並行して株Ｐ．エルギノーザ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＰＡＯ１において実施する。評価するものは全収率であり、これを、バイオマス＋産生されたラムノリピドの合計を使用および消費されたグルコースで除したものとして求める。なおもグルコースデヒドロゲナーゼの在来遺伝子を含むＰ．エルギノーザ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）株は、ｇｃｄ遺伝子が欠失した株と比較して、平均してより低い全収率［（ｇ バイオマス＋ｇ ＲＬ）／ｇ グルコース］を達成する。

例４（本発明によらない）：株Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０ Δｕｐｐ＋ｐＡＣＹＣＡＴｈ５−｛ＰｒｈａＳＲ｝［ｒｈａＳＲ＿Ｅｃ］｛ＰｒｈａＢＡＤ｝［ｒｈｌＡＢ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝［ａｒａＣ＿Ｅｃ］｛ＰａｒａＢＡＤ｝［ｒｍｌＢＤＡＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝；クローン１）を利用する。

株の構築：
遺伝子ｒｈｌＡおよびｒｈｌＢならびに遺伝子ｒｍｌＢ、ｒｍｌＤ、ｒｍｌＡおよびｒｍｌＣ（双方ともＰ．エルギノーザ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来）の異種発現のために、プラスミドｐＡＣＹＣＡＴｈ５−｛ＰｒｈａＳＲ｝［ｒｈａＳＲ＿Ｅｃ］｛ＰｒｈａＢＡＤ｝［ｒｈｌＡＢＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝［ａｒａＣ＿Ｅｃ］｛ＰａｒａＢＡＤ｝［ｒｍｌＢＤＡＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝を構築する。このプラスミドは、第一に、Ｐ．エルギノーザ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＤＳＭ １１２８（配列番号１７）由来の遺伝子ｒｈｌＡおよびｒｈｌＢ（ラムノシルトランスフェラーゼ１をコード）からなるオペロンを含み、第二に、Ｐ．エルギノーザ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＤＳＭ １９８８０（配列番号２）由来の遺伝子ｒｍｌＢ（ｄＴＤＰ−Ｄ−グルコース４，６−デヒドラターゼをコード）、ｒｍｌＤ（ｄＴＤＰ−４−デヒドロラムノースレダクターゼをコード）、ｒｍｌＡ（グルコース−１−ホスフェートチミジリルトランスフェラーゼをコード）およびｒｍｌＣ（ｄＴＤＰ−４−デヒドロラムノース３，５−エピメラーゼをコード）からなるオペロンを含む。ｒｈｌＡＢ遺伝子は、ラムノース誘導性Ｐ_Ｒｈａプロモーターの制御下にあり、ｒｍｌＢＤＡＣ遺伝子は、アラビノース誘導性Ｐ_ＢＡＤプロモーターの制御下にある。２つのオペロン構造の下流には、ターミネーター配列（ｒｒｎＢ Ｔ１Ｔ２）が位置している。モノラムノリピドの合成にはｒｈｌＡＢ遺伝子が必要であるのに対して、活性化されたｄＴＤＰ−Ｌ−ラムノースの提供にはｒｍｌＢＤＡＣ遺伝子が必要である。

ベクターは、プラスミドｐＡＣＹＣＡＴｈ５−｛ＰｒｈａＳＲ｝［ｒｈａＳＲ＿Ｅｃ］｛ＰｒｈａＢＡＤ｝［ｒｈｌＡＢＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝［ａｒａＣ＿Ｅｃ］｛ＰａｒａＢＡＤ｝［ｒｍｌＢＤＡＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝（配列番号６）（例１参照）をベースとする。ｒｈｌＣ遺伝子を取り除くために、ベクターをＰａｃＩとＮｓｉＩにより切断した。ｒｈｌＣの他に、ｒｈｌＣ上流および下流の箇所も制限により取り除いた。これらの損失領域をＰＣＲにより増幅する。使用したテンプレートは、プラスミドｐＡＣＹＣＡＴｈ５−｛ＰｒｈａＳＲ｝［ｒｈａＳＲ＿Ｅｃ］｛ＰｒｈａＢＡＤ｝［ｒｈｌＡＢＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝［ａｒａＣ＿Ｅｃ］｛ＰａｒａＢＡＤ｝［ｒｍｌＢＤＡＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝（配列番号６）（例１参照）である。次に、ベクター部分および双方のＰＣＲ断片を、市販のイン・ビトロＤＮＡアセンブリキットを（例えばＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを製造者（ＮＥＢ；フランクフルト・アム・マイン、ドイツ）の指示書にしたがって）使用してクローニングする。大腸菌１０ ｂｅｔａケミカルコンピテントセル（ＮＥＢ、フランクフルト・アム・マイン、ドイツ）を、当業者に公知の方法で形質転換する。標的遺伝子の正確な挿入を制限分析によりチェックし、導入された相同領域の信頼性をＤＮＡシーケンシングにより確認する。得られたプラスミドｐＡＣＹＣＡＴｈ５−｛ＰｒｈａＳＲ｝［ｒｈａＳＲ＿Ｅｃ］｛ＰｒｈａＢＡＤ｝［ｒｈｌＡＢ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝［ａｒａＣ＿Ｅｃ］｛ＰａｒａＢＡＤ｝［ｒｍｌＢＤＡＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝（配列番号１８）のサイズは、１６３５９塩基対である。

その後、プラスミドをＰ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０ Δｕｐｐに導入する。この株を、Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）内でマーカーレス遺伝子欠失を構築するための出発株として使用する（Ｇｒａｆ ＆ Ａｌｔｅｎｂｕｃｈｎｅｒ， ２０１１， Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ ７７， Ｎｏ． １５， ５５４９−５５５２， ＤＯＩ：１０．１１２８／ＡＥＭ．０５０５５−１１）。この方法は、Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）に対するネガティブカウンターセレクション系に基づいており、これは、ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼの活性および代謝拮抗剤５−フルオロウラシルに対するＰ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）の感受性を利用する。ｕｐｐ遺伝子の欠失は、ラムノリピド生合成に影響を与えない。ベクターｐＡＣＹＣＡＴｈ５−｛ＰｒｈａＳＲ｝［ｒｈａＳＲ＿Ｅｃ］｛ＰｒｈａＢＡＤ｝［ｒｈｌＡＢＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝［ａｒａＣ＿Ｅｃ］｛ＰａｒａＢＡＤ｝［ｒｍｌＢＤＡＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝を用いたＰ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０ Δｕｐｐの形質転換を、Ｉｗａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．（Ｉｗａｓａｋｉ Ｋ， Ｕｃｈｉｙａｍａ Ｈ， Ｙａｇｉ Ｏ， Ｋｕｒａｂａｙａｓｈｉ， Ｔ， Ｉｓｈｉｚｕｋａ Ｋ， Ｔａｋａｍｕｒａ Ｙ， Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １９９４． ５８（５）：８５１−８５４）に記載の通りに実施する。１０クローンそれぞれからプラスミドＤＮＡを単離して分析する。このプラスミドを有する株を、Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０ Δｕｐｐ ｐＡＣＹＣＡＴｈ５−｛ＰｒｈａＳＲ｝［ｒｈａＳＲ＿Ｅｃ］｛ＰｒｈａＢＡＤ｝［ｒｈｌＡＢＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝［ａｒａＣ＿Ｅｃ］｛ＰａｒａＢＡＤ｝［ｒｍｌＢＤＡＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝と称する。

例５（本発明による）：株Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０ Δｕｐｐ Δｇｃｄ＋ｐＡＣＹＣＡＴｈ５−｛ＰｒｈａＳＲ｝［ｒｈａＳＲ＿Ｅｃ］｛ＰｒｈａＢＡＤ｝［ｒｈｌＡＢ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝［ａｒａＣ＿Ｅｃ］｛ＰａｒａＢＡＤ｝［ｒｍｌＢＤＡＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝を利用する。

株Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０ Δｕｐｐ Δｇｃｄ＋ｐＡＣＹＣＡＴｈ５−｛ＰｒｈａＳＲ｝［ｒｈａＳＲ＿Ｅｃ］｛ＰｒｈａＢＡＤ｝［ｒｈｌＡＢ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝［ａｒａＣ＿Ｅｃ］｛ＰａｒａＢＡＤ｝［ｒｍｌＢＤＡＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝の構築
株Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０ Δｕｐｐ Δｇｃｄ＋ｐＡＣＹＣＡＴｈ５−｛ＰｒｈａＳＲ｝［ｒｈａＳＲ＿Ｅｃ］｛ＰｒｈａＢＡＤ｝［ｒｈｌＡＢ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝［ａｒａＣ＿Ｅｃ］｛ＰａｒａＢＡＤ｝［ｒｍｌＢＤＡＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝を構築するために、プラスミｐＡＣＹＣＡＴｈ５−｛ＰｒｈａＳＲ｝［ｒｈａＳＲ＿Ｅｃ］｛ＰｒｈａＢＡＤ｝［ｒｈｌＡＢＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝［ａｒａＣ＿Ｅｃ］｛ＰａｒａＢＡＤ｝［ｒｍｌＢＤＡＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝を、Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０ Δｕｐｐ Δｇｃｄに導入する。株の構築は既に例２に記載されており、プラスミドの構築は例４に記載されている。形質転換を、Ｉｗａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．（Ｉｗａｓａｋｉ Ｋ， Ｕｃｈｉｙａｍａ Ｈ， Ｙａｇｉ Ｏ， Ｋｕｒａｂａｙａｓｈｉ， Ｔ， Ｉｓｈｉｚｕｋａ Ｋ， Ｔａｋａｍｕｒａ Ｙ， Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １９９４． ５８（５）：８５１−８５４）に記載の通りに実施する。その後、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を補充したＬＢアガープレートに細胞を播種する。１０クローンそれぞれからプラスミドＤＮＡを単離し、制限分析を用いて分析する。このプラスミドを有する株を、Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０ Δｕｐｐ Δｇｃｄ ｐＡＣＹＣＡＴｈ５−｛ＰｒｈａＳＲ｝［ｒｈａＳＲ＿Ｅｃ］｛ＰｒｈａＢＡＤ｝［ｒｈｌＡＢＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝［ａｒａＣ＿Ｅｃ］｛ＰａｒａＢＡＤ｝［ｒｍｌＢＤＡＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝と称する。技術的な具現化を、例１に記載の通りに実施する。

３つの実験を、それぞれ例４と並行して行う。評価するものは全収率であり、これを、バイオマス＋産生されたラムノリピドの合計を使用および消費されたグルコースで除したものとして求める。

ｒｈｌＡおよびＲｈｌＢの他に、グルコースデヒドロゲナーゼの在来遺伝子をも含むＰ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）株は、ｇｃｄ遺伝子が欠失した株と比較して、平均してより低い全収率［（ｇ バイオマス＋ｇ ＲＬ）／ｇ グルコース］を達成する。

Claims (11)

1. 少なくとも１つのラムノリピドを産生できる細胞において、該細胞は、その野生型と比較して、Ｄ−グルコースおよびキノンからＤ−グルコノ−１，５−ラクトンおよびキノールへの転化を触媒する少なくとも１つの酵素Ｅ_１の減少した活性を有するように遺伝子改変されていることを特徴とする、細胞。
2. ラムノリピドとして、一般式（Ｉ）
   

   

   ［式中、
   ｍ＝１であり、
   ｎ＝１または０であり、
   かつＲ^１およびＲ^２により決定される基
   

   

   は、３−ヒドロキシオクタノイル−３−ヒドロキシオクタン酸、３−ヒドロキシオクタノイル−３−ヒドロキシデカン酸、３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシオクタン酸、３−ヒドロキシオクタノイル−３−ヒドロキシデセン酸、３−ヒドロキシデセノイル−３−ヒドロキシオクタン酸、３−ヒドロキシオクタノイル−３−ヒドロキシドデカン酸、３−ヒドロキシドデカノイル−３−ヒドロキシオクタン酸、３−ヒドロキシオクタノイル−３−ヒドロキシドデセン酸、３−ヒドロキシドデセノイル−３−ヒドロキシオクタン酸、３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸、３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデセン酸、３−ヒドロキシデセノイル−３−ヒドロキシデカン酸、３−ヒドロキシデセノイル−３−ヒドロキシデセン酸、３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシドデカン酸、３−ヒドロキシドデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸、３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシドデセン酸、３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシテトラデセン酸、３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシデセン酸、３−ヒドロキシドデセノイル−３−ヒドロキシデカン酸、３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸、３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸、３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシテトラデセン酸、３−ヒドロキシテトラデセノイル−３−ヒドロキシデカン酸、３−ヒドロキシドデカノイル−３−ヒドロキシドデカン酸、３−ヒドロキシドデセノイル−３−ヒドロキシドデカン酸、３−ヒドロキシドデカノイル−３−ヒドロキシドデセン酸、３−ヒドロキシドデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸、３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシドデカン酸、３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸、３−ヒドロキシヘキサデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸、３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシヘキサデカン酸または３−ヒドロキシヘキサデカノイル−３−ヒドロキシヘキサデカン酸から誘導される］
   の化合物を産生できることを特徴とする、請求項１記載の細胞。
3. Ｅ_１は、ＥＣ１．１．５．２のグルコース１−デヒドロゲナーゼであることを特徴とする、請求項１または２記載の細胞。
4. バークホルデリア種（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ．）、バークホルデリア・タイランデンシス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｔｈａｉｌａｎｄｅｎｓｉｓ）、シュードモナス種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・エルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・オレオボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）、シュードモナス・スタッツェリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ）、シュードモナス・クロロラフィス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・シトロネロリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｉｔｒｏｎｅｌｌｏｌｉｓ）、シュードモナス・レシノボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｓｉｎｏｖｏｒａｎｓ）、コマモナス・テストステローニ（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）、エロモナス・ハイドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）、カプリアビダス・ネカトール（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ）、アルカリゲネス・レータス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｌａｔｕｓ）およびラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１から３までのいずれか１項記載の細胞。
5. 前記細胞は、その野生型と比較して、群Ｅ_２、Ｅ_３およびＥ_４から選択される少なくとも１つの酵素の増大した活性を有するように遺伝子改変されており、ここで、
   前記酵素Ｅ_２は、３−ヒドロキシアルカノイル−ＡＣＰから３−ヒドロキシアルカノイル−３−ヒドロキシアルカン酸−ＡＣＰを経由してヒドロキシアルカノイル−３−ヒドロキシアルカン酸への転化を触媒することができ、
   前記酵素Ｅ_３は、ラムノシルトランスフェラーゼＩであり、かつｄＴＤＰ−ラムノースおよび３−ヒドロキシアルカノイル−３−ヒドロキシアルカノエートからα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシアルカノイル−３−ヒドロキシアルカノエートへの転化を触媒することができ、かつ
   前記酵素Ｅ_４は、ラムノシルトランスフェラーゼＩＩであり、かつｄＴＤＰ−ラムノースおよびα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシアルカノイル−３−ヒドロキシアルカノエートからα−Ｌ−ラムノピラノシル−（１−２）−α−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシアルカノイル−３−ヒドロキシアルカノエートへの転化を触媒することができることを特徴とする、請求項１から４までのいずれか１項記載の細胞。
6. Ｅ_２、Ｅ_３およびＥ_４は、
   それぞれｒｈｌＡ遺伝子、ｒｈｌＢ遺伝子およびｒｈｌＣ遺伝子によりコードされるか、または
   ｒｈｌ遺伝子によりコードされる酵素に対してアミノ酸残基の２５％まで、有利には２０％まで、特に有利には１５％まで、とりわけ１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％までが欠失、挿入、置換もしくはそれらの組合せにより改変されているポリペプチド配列を有し、かつｒｈｌ遺伝子によりコードされる酵素の参照配列を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％、有利には５０％、特に有利には８０％、とりわけ９０％超をなおも有する酵素である
   ことを特徴とする、請求項５記載の細胞。
7. 以下のＥ_３、Ｅ_３Ｅ_４およびＥ_２Ｅ_３Ｅ_４から選択される酵素の組合せの増大した活性を有することを特徴とする、請求項５または６記載の細胞。
8. 前記細胞は、その野生型と比較して、次のもの：
   少なくとも１つの酵素Ｅ_５である、ＥＣ２．７．７．２４のｄＴＴＰ：α−Ｄ−グルコース−１−ホスフェートチミジリルトランスフェラーゼ、
   少なくとも１つの酵素Ｅ_６である、ＥＣ４．２．１．４６のｄＴＤＰ−グルコース４，６−ヒドロリアーゼ、
   少なくとも１つの酵素Ｅ_７である、ＥＣ５．１．３．１３のｄＴＤＰ−４−デヒドロラムノース３，５−エピメラーゼ、
   少なくとも１つの酵素Ｅ_８である、ＥＣ１．１．１．１３３のｄＴＤＰ−４−デヒドロラムノースレダクターゼ
   からなる群から選択される少なくとも１つの酵素の増大した活性を有することを特徴とする、請求項１から７までのいずれか１項記載の細胞。
9. 該細胞は、その野生型と比較して少なくとも１つの酵素Ｅ_１３の増大した活性を有し、ここで、前記酵素Ｅ_１３は、前記細胞から周辺の培地へのラムノリピドの排出を触媒し、かつ
   次のポリペプチド配列：ＡＡＧ０４５２０．１、ＡＪＹ０２９９６．１、ＺＰ＿０５５９０６６１．１、ＹＰ＿４３９２７８．１、ＹＰ＿４４００６９．１、ＺＰ＿０４９６９３０１．１、ＺＰ＿０４５２０２３４．１、ＹＰ＿３３５５２８．１、ＹＰ＿００１０７５８５９．１、ＹＰ＿００１０６１８１７．１、ＺＰ＿０２４８７４９９．１、ＹＰ＿３３７２５１．１、ＺＰ＿０４８９７７１２．１、ＺＰ＿０４８１０１９０．１、ＹＰ＿９９０３２２．１、ＺＰ＿０２４７６９２４．１、ＺＰ＿０４８９９７３５．１、ＺＰ＿０４８９３８７３．１、ＺＰ＿０２３６５９８２．１、ＹＰ＿００１０６２９０９．１、ＹＰ＿１０５６１１．１、ＺＰ＿０３７９４０６１．１、ＺＰ＿０３４５７０１１．１、ＺＰ＿０２３８５４０１．１、ＺＰ＿０２３７０５５２．１、ＹＰ＿１０５２３６．１、ＺＰ＿０４９０５０９７．１、ＹＰ＿７７６３８７．１、ＹＰ＿００１８１１６９０．１、ＹＰ＿００４３４８７３０．１、ＹＰ＿００４３４８７０８．１、ＹＰ＿３７１３２０．１、ＹＰ＿６２３１４５．１、ＹＰ＿００１７７８８１０．１、ＹＰ＿００２２３４９３３．１、ＣＣＥ５２９０９．１、ＹＰ＿００２９０８２４８．１、ＺＰ＿０４９５４５５７．１、ＺＰ＿０４９５６０３８．１、ＺＰ＿０２４０８９５０．１、ＺＰ＿０２３７５８９７．１、ＺＰ＿０２３８９９０８．１、ＹＰ＿４３９２７４．１、ＹＰ＿００１０７４７６２．１、ＹＰ＿３３７２４７．１、ＹＰ＿１１０５５９．１、ＺＰ＿０２４９５９２７．１、ＹＰ＿１１１３６０．１、ＹＰ＿１０５６０８．１、ＺＰ＿０２４８７８２６．１、ＺＰ＿０２３５８９４７．１、ＹＰ＿００１０７８６０５．１、ＺＰ＿００４３８０００．１、ＺＰ＿００４４０９９３．１、ＺＰ＿０２４７７２６０．１、ＹＰ＿３７１３１７．１、ＹＰ＿００１７７８８０７．１、ＺＰ＿０２３８２８４３．１、ＹＰ＿００２２３４９３６．１、ＹＰ＿６２３１４２．１、ＺＰ＿０２９０７６１８．１、ＺＰ＿０２８９１４７８．１、ＹＰ＿７７６３９０．１、ＺＰ＿０４９４３３０８．１、ＹＰ＿００１８１１６９３．１、ＺＰ＿０２５０３９８５．１、ＹＰ＿００４３６２７４０．１、ＹＰ＿００２９０８２４５．１、ＹＰ＿００４３４８７０５．１、ＺＰ＿０２４０８７９８．１、ＺＰ＿０２４１７２５０．１、ＥＧＤ０５１６６．１、ＺＰ＿０２４５８６７７．１、ＺＰ＿０２４６５７９３．１、ＹＰ＿００１５７８２４０．１、ＺＰ＿０４９４４３４４．１、ＹＰ＿７７１９３２．１、ＺＰ＿０２８８９１６６．１、ＹＰ＿００２２３２６１４．１、ＺＰ＿０３５７４８０８．１、ＺＰ＿０２９０６１０５．１、ＹＰ＿００１８０６７６４．１、ＹＰ＿６１９９１２．１、ＹＰ＿００１１１７９１３．１、ＹＰ＿１０６６４７．１、ＹＰ＿００１７６３３６８．１、ＺＰ＿０２４７９５３５．１、ＺＰ＿０２４６１７４３．１、ＹＰ＿５６０９９８．１、ＹＰ＿３３１６５１．１、ＺＰ＿０４８９３０７０．１、ＹＰ＿００３６０６７１４．１、ＺＰ＿０２５０３９９５．１、ＺＰ＿０６８４０４２８．１、ＹＰ＿１０４２８８．１、ＺＰ＿０２４８７８４９．１、ＺＰ＿０２３５３８４８．１、ＹＰ＿３６７４７５．１、ＺＰ＿０２３７７３９９．１、ＺＰ＿０２３７２１４３．１、ＹＰ＿００１８９７５６２．１、ＺＰ＿０２３６１０６６．１、ＹＰ＿４４０５８２．１、ＺＰ＿０３２６８４５３．１、ＡＥＴ９０５４４．１、ＹＰ＿００３９０８７３８．１、ＹＰ＿００４２３００４９．１、ＺＰ＿０２８８５４１８．１もしくはＺＰ＿０２５１１８３１．１を有するか、または
   上記の特定のアクセッション番号に対してアミノ酸残基の２５％までが欠失、挿入、置換もしくはそれらの組合せにより改変されているポリペプチド配列を有し、かつ上記の特定のアクセッション番号を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％をなおも有する
   酵素からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１から８までのいずれか１項記載の細胞。
10. 以下の方法工程：
    Ｉ）請求項１から９までのいずれか１項記載の細胞を、前記手段を適宜組み合わせて、炭素源を含有する培地と接触させる工程、
    ＩＩ）前記細胞が前記炭素源からラムノリピドを産生できるような条件下に前記細胞を培養する工程、および
    ＩＩＩ）必要に応じて、産生されたラムノリピドを単離する工程
    を含む、ラムノリピドの製造方法。
11. 化粧品、皮膚用製剤または医薬製剤、作物保護剤ならびにケア製品および洗浄剤および界面活性剤濃縮物を製造するための、請求項１０記載の方法を用いて得られたラムノリピドの使用。

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