BR112016027290B1

BR112016027290B1 - Métodos e sistemas para a detecção de microrganismos

Info

Publication number: BR112016027290B1
Application number: BR112016027290-0A
Authority: BR
Inventors: Oliver Thum; Philip ENGEL; Christian Gehring; Steffen Schaffer; Mirja Wessel
Original assignee: Evonik Operations Gmbh
Priority date: 2014-05-26
Filing date: 2015-04-27
Publication date: 2022-07-12
Also published as: JP6742918B2; CN106414758A; BR112016027290A2; EP3148335A1; CA2948696C; US10174353B2; JP2017516478A; RU2694392C2; RU2016149604A3; EP3148335B1; RU2016149604A; US20170096695A1; CA2948696A1; CN106414758B; WO2015180907A1; EP2949214A1; RU2694392C9

Abstract

MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE RAMNOLIPÍDEOS. A presente invenção diz respeito a um método para a preparação de pelo menos um ramnolipídeo, o qual compreende: - fazer contactar uma célula recombinante com um meio que contém uma fonte de carbono e - desenvolver em cultura a célula sob condições adequadas para a preparação do ramnolipídeo a partir da fonte de carbono pela célula, em que a célula recombinante foi geneticamente modificada de um modo tal que, em comparação com o tipo selvagem da célula, a célula tem uma atividade aumentada de pelo menos uma das enzimas E1, E2 e E3, em que a enzima E1 é uma a/ß hidrolase, a enzima E2 é uma ramnosil-transferase I e a enzima E3 é uma ramnosil-transferase II e em que a fonte de carbono é uma molécula C4.

Description

[001] CAMPO DA INVENÇÃO

[002] A presente invenção diz respeito a métodos e a células para a produção de pelo menos um ramnolipídeo a partir de uma fonte de carbono.

[003] ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[004] Existe uma grande procura no mercado por tensoativos biodegradáveis que sejam produzidos a partir de matérias-primas renováveis como alternativa adequada aos tensoativos presentemente disponíveis, os quais são obtidos a partir de matérias-primas petroquímicas. Em particular, esta procura é acentuada com a previsível carência de matérias-primas petroquímicas e com a crescente necessidade de tensoativos. Os ramnolipídeos constituem pelo menos um exemplo de um tal tensoativo. Os ramnolipídeos representam uma classe economicamente interessante uma vez que podem potencialmente substituir os tensoativos convencionais feitos a partir de petróleo ou de seus produtos e, assim, melhorar invariavelmente o desempenho ambiental das formulações resultantes.

[005] Tais ramnolipídeos compreendem pelo menos um lipídeo mono- ramnosilo ou dois radicais ramnose (lipídeos di-ramnosilo) e um ou dois resíduos de ácido gordo 3-hidróxido (Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology, 2010). Possuem propriedades tensoativas que são necessárias em todos os tipos de aplicações para utilização como tensoativo (ver, Leitermann et al., 2009). Em particular, os ramnolipídeos podem ser utilizados em grande escala como tensoativos em aplicações domésticas, de limpeza, cosméticas, de processamento de alimentos, farmacêuticas, proteção de plantas e outras aplicações.

[006] Os métodos presentemente utilizados para produzir tais ramnolipídeos utilizam isolados de tipo selvagem de várias bactérias patogénicas humanas e animais, em particular, membros do género Pseudomonas e Burkholderia (Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology, 2010). O fato destes organismos patogénicos serem capazes de provocar doenças ao consumidor reduz consideravelmente a aceitação por parte do consumidor para estes ramnolipídeos produzidos convencionalmente. Além disso, requisitos mais elevados em termos segurança também aumentam os custos de produção devido a um gasto aumentado de capital e a possíveis passos de produção adicionais. Uma vez que os produtos nos quais estes ramnolipídeos são utilizados são na grande maioria químicos de volume elevado que podem ser produzidos com custos muito reduzidos, os ramnolipídeos também deverão ser capazes de ser produzidos com custos tão baixos quando possível, sem riscos para a saúde do consumidor e com propriedades definidas, tanto quanto possível.

[007] Os métodos presentemente disponíveis para a produção de ramnolipídeos incluem a utilização destes organismos patogénicos e de óleos vegetais por si sós ou como co-substrato (Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology, 2010). No entanto, os óleos vegetais são matérias-primas comparativamente caras em comparação com outras fontes de carbono, tais como, por exemplo, glicose, sacarose ou polissacáridos, tais como, por exemplo, amido, celulose e hemi-celulose, glicerol, CO, CO2 ou CH4. Os ramnolipídeos também são produzidos por organismos não patogénicos utilizando fontes de carbono, tais como, por exemplo, glicose, sacarose ou polissacáridos, tal como descrito no documento WO2012013554A1.

[008] No entanto, existe ainda uma necessidade de produzir ramnolipídeos (em particular, lipídeo mono-ramnosilo e/ou lipídeos di- ramnosilo) eficazmente (isto é, de um modo barato e seguro sob um ponto de vista de saúde) e em quantidades mais do que adequadas utilizando organismos não patogénicos e uma matéria-prima renovável alternativa.

[009] DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[010] De acordo com um aspecto, a presente invenção diz respeito a um método que pode ser capaz de resolver os problemas presentes no estado da técnica. Em particular, a presente invenção diz respeito a um método para a produção de pelo menos um ramnolipídeo por meio de cultura de uma célula recombinante na presença de pelo menos uma fonte de carbono, em que a fonte de carbono é pelo menos uma molécula C4 com exatamente 4 átomos de carbono. A célula recombinante compreende atividade aumentada de pelo menos uma das enzimas, α/β hidrolase, ramnosil-transferase I ou ramnosil- transferase II, comparativamente com o tipo selvagem da célula. Este método pode ser particularmente vantajoso uma vez que pode permitir uma produção bastante seletiva de lipídeos mono-ramnosilo e/ou lipídeos di-ramnosilo com uma redução na quantidade de produtos secundários indesejáveis e de intermediários produzidos. Por exemplo, é possível produzir pelo menos uma quantidade inferior de intermediários, tais como dímeros de ácidos gordos β- hidroxi (dímeros de ácido gordo) formados de acordo com qualquer aspecto da presente invenção, em comparação com os métodos presentemente disponíveis.

[011] Outras vantagens do método de acordo com um qualquer aspecto da presente invenção incluem, mas sem que isso constitua qualquer limitação, ao fato de ser possível utilizar organismos que sejam não patogénicos e simples de desenvolver em cultura. Uma outra vantagem pode incluir o fato de com o método de acordo com um qualquer aspecto da presente invenção, poderá não ser necessário que os óleos e os substratos de hidratos de carbono simples (v.g., glicose, frutose ou sacarose) sejam o único substrato ou co- substrato. De acordo com um qualquer aspecto da presente invenção, uma outra vantagem pode ser o fato d ser possível produzir ramnolipídeos com propriedades definidas e moduláveis. Além disso, especificamente, é possível produzir lipídeos di-ramnosilo. Uma outra vantagem deve-se ao fator dos ramnolipídeos poderem ser produzidos com um intervalo de tempo e rendimentos em carbono mais elevados do que com células sem aumento destas atividades.

[012] De acordo com um aspecto qualquer da presente invenção, os ramnolipídeos e/ou suas misturas que podem ser produzidos utilizando um aspecto qualquer da presente invenção podem igualmente constituir um objeto da presente invenção. Os ramnolipídeos e misturas que podem ser produzidos de acordo com um aspecto qualquer da presente invenção podem ser vantajosamente utilizados pelo menos em agentes de limpeza ou de cuidados, em formulações de cosmética, dermatológicas ou farmacêuticas, bem como em formulações para a proteção de plantas, concentrados de tensoativo e semelhantes.

[013] O termo “agentes de cuidados” pretende aqui designar uma formulação que satisfaz o propósito de manter um artigo na sua forma original, reduzir ou evitar os efeitos de influências externas (v.g., tempo, luz, temperatura, pressão, poluição, reação química com outros compostos reativos que entre em contato com o artigo e semelhantes) e envelhecimento, poluição, fadiga do material e/ou mesmo melhoria de propriedades positivas desejadas do artigo. Um exemplo de propriedades positivas desejadas do artigo pode incluir características, tais como uma melhoria no brilho do cabelo ou uma elasticidade superior do artigo e semelhantes.

[014] As “formulações para a proteção de plantas” pretendem aqui designar aquelas formulações que devido à natureza da sua preparação são utilizadas para a proteção de plantas. Tal constitui, em particular, o caso de pelo menos um composto do conjunto constituído por herbicidas, fungicidas, inseticidas, acaricidas, nematicidas, substâncias protetoras contra danos por pássaros, nutrientes de plantas e agente para a melhoria da estrutura do solo, estar contido na formulação.

[015] Os ramnolipídeos produzidos de acordo com um qualquer aspecto da presente invenção podem ser utilizados como um componente de agentes de cuidado e limpeza que são utilizados em áreas domésticas, indústria, em particular, em superfícies duras, couro e/ou têxteis.

[016] De acordo com um aspecto da presente invenção, esta proporciona pelo menos um método para a preparação de pelo menos um ramnolipídeo, o qual compreende:

[017] - fazer contactar uma célula recombinante com um meio que contém uma fonte de carbono e

[018] - desenvolver em cultura a célula sob condições adequadas para a preparação do ramnolipídeo a partir da fonte de carbono pela célula,

[019] em que a célula recombinante foi geneticamente modificada de uma forma tal que, comparativamente com o tipo selvagem da célula, a célula apresenta uma atividade aumentada de pelo menos uma das enzimas E1, E2 e E3, em que a enzima E1 é uma α/β hidrolase, a enzima E2 é uma ramnosil- transferase I e a enzima E3 é uma ramnosil-transferase II, e em que a fonte de carbono é uma molécula C4.

[020] De acordo com outro aspecto da presente invenção, esta proporciona uma célula que é capaz de formar pelo menos um ramnolipídeo a partir de uma molécula C4, em que a célula foi geneticamente modificada de um modo tal que, em comparação com o tipo selvagem da célula, a célula apresenta uma atividade aumentada da enzima oxido-redutase e de pelo menos uma das enzimas E1, E2 e E3, em que a enzima E1 é α/β hidrolase, a enzima E2 é ramnosil-transferase I e a enzima E3 é ramnosil-transferase II.

[021] Mais particularmente, as células de acordo com um aspecto qualquer da presente invenção podem ser capazes de formar ramnolipídeos e, comparativamente com o seu tipo selvagem, apresentam uma atividade aumentada de pelo menos um produto génico ou homólogos dos produtos de génicos rhlA, rhlB e rhlC. Pelo menos em um exemplo, os genes rhlA, rhlB e rhlC de Pseudomonas aeruginosa podem ser introduzidos em organismos GRAS (normalmente considerados como seguros, em inglês ‘generally regarded as save’) (tal como descrito no documento WO2012013554A1) para produzir ramnolipídeos a partir de moléculas C4. Em um exemplo específico, a célula de acordo com um aspeto qualquer da presente invenção pode ser P. putida da estirpe KT2440.

[022] Em particular, a molécula C4 aqui referida pode ser uma estrutura que compreende C, H e/ou O. Em particular, a molécula C4 pode ser qualquer composto que compreenda exatamente 4 átomos de carbono (isto é, não mais nem menos do que 4 átomos de carbono em cada unidade) na estrutura do composto. A “molécula C4” de acordo com um qualquer aspecto da presente invenção diz respeito a um composto orgânico que compreende exatamente quatro átomos de C e um número variável de átomos de H, dependendo dos outros átomos encontrados na estrutura do composto com 4 átomos de carbono. A molécula C4 também pode compreender átomos de O. Em particular, a molécula C4 de acordo com um qualquer aspecto da presente invenção pode ser butano e os produtos oxidados de butano. Os produtos oxidados de butano incluem pelo menos 1-butanol, 2-butanol, 1-butanal, butanona e ácido butírico. Em particular, a molécula C4 pode ser selecionada entre o conjunto constituído por butano, 1-butanol, 2-butanol, 1-butanal, butanona, ácido butírico (butiratos) e suas combinações. A molécula C4 também pode ser uma tetrose.

[023] Mais particularmente, a molécula C4 utilizada de acordo com um qualquer aspecto da presente invenção pode ser apenas um tipo de molécula C4 (isto é, apenas butano, 1-butanol, 2-butanol, 1-butanal, butanona ou ácido butírico). De acordo com um exemplo, a molécula C4 utilizada pode ser uma combinação de qualquer uma das moléculas C4 selecionadas entre o conjunto constituído por butano, 1-butanol, 2-butanol, 1-butanal, butanona e ácido butírico. Por exemplo, a molécula C4 de acordo com um qualquer aspecto da presente invenção pode ser uma combinação de butano e 1-butanol, butano e 2-butanol, butano e 1-butanal, butano e butanona, butano e ácido butírico e semelhantes. De acordo com um exemplo, podem ser utilizadas pelo menos 3, 4, 5 ou 6 moléculas C4 diferentes como fonte de carbono de acordo com um aspecto qualquer da presente invenção. De acordo com outro exemplo, pode ser utilizada uma combinação de butano, 1-butanol e ácido butírico como molécula C4 de acordo com um qualquer aspecto da presente invenção. De acordo com outro exemplo, é possível utilizar tetrose por si só ou em combinação com butano e produtos de oxidação de butano como fonte de carbono, de acordo com um qualquer aspecto da presente invenção.

[024] O meio utilizado de acordo com um qualquer aspecto da presente invenção compreende pelo menos uma fonte de carbono. A fonte de carbono no meio pode ser pelo menos uma molécula C4. Em particular, a fonte de carbono no meio pode ser constituída essencialmente ou compreender substancialmente uma molécula C4. Em particular, a quantidade total de moléculas C4 é pelo menos ou igual a 20%, 40%, 50%, 60% ou 70% em peso do teor total em carbono no meio de moléculas C4 de fonte de carbono no meio total. Mais particularmente, a quantidade total de molécula C4 é pelo menos ou igual a 50%, 70% ou 80% em peso da fonte de carbono no meio. Ainda mais particularmente, a molécula C4 pode ser pelo menos ou igual a 90% ou cerca de 100% em peso da fonte de carbono no meio.

[025] De acordo com um exemplo, o meio pode compreender uma segunda fonte de carbono. Em particular, a fonte de carbono pode ser hidratos de carbono, tais como, por exemplo, glicose, sacarose, arabinose, xilose, lactose, frutose, maltose, molasses, amido, celulose e hemi-celulose, óleos vegetais e animais e gorduras, tais como, por exemplo, óleo de soja, óleo de cártamo, óleo de amendoim, óleo de cânhamo, óleo de purgueira, gordura de coco, óleo de cuieira, óleo de linhaça, óleo de milho, óleo de semente de papoila, óleo de onagra, azeite, óleo de palmiste, óleo de palma, óleo de colza, óleo de sésamo, óleo de girassol, óleo de sementes de uva, óleo de noz, óleo de gérmen de trigo e óleo de coco, ácidos gordos, tais como, por exemplo, ácido caprílico, ácido cáprico, ácido láurico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido palmitoleico, ácido esteárico, ácido araquidónico, ácido beénico, ácido oleico, ácido linoleico, ácido linolénico, ácido gama-linolénico e seus ésteres metílico e etílico, bem como misturas de ácido gordo, mono-, di- e tri-glicéridos que contêm quaisquer ácidos gordos referidos antes, álcoois, tais como, por exemplo, glicerol, etanol e metanol, hidrocarbonetos, tais como metano, gases que contêm carbono e mistura de gases, tais como CO, CO2, gases de síntese ou gases de exaustão, aminoácidos, tais como L-glutamato ou L-valina, ou ácidos orgânicos, tais como, por exemplo, ácido acético. Estas substâncias podem ser utilizadas individualmente ou como mistura. É possível utilizar hidratos de carbono, em particular, monossacáridos, oligossacáridos ou polissacáridos, como fonte de carbono, tal como descrito nos documentos US 6 01 494 e US 6 136 576, bem como de hidrocarbonetos, em particular, de alcanos, alcenos e alcinos, bem como os ácidos carboxílicos obtidos a partir destes e mono-, di- e tri-glicéridos provenientes destes ácidos carboxílicos, bem como glicerol e acetato. É possível utilizar mono-, di- e tri-glicéridos que contêm os produtos de esterificação de glicerol com ácido caprílico, ácido cáprico, ácido láurico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido palmitoleico, ácido esteárico, ácido araquidónico, ácido beénico, ácido oleico, ácido linoleico, ácido linolénico e/ou ácido gama-linolénico.

[026] De acordo com um aspecto qualquer da presente invenção, constitui uma grande vantagem que as células possam ser capazes de formar ramnolipídeos a partir das fontes de carbono mais simples, tais como butano, de um modo tal que não seja necessária uma provisão de fonte de carbono de cadeia mais longa no meio de acordo com um aspecto qualquer da presente invenção. Tal pode ser particularmente vantajoso no caso de falta de disponibilidade no meio de acordo com um qualquer aspecto da presente invenção de quantidades detectáveis de ácidos carboxílicos que possuem um comprimento de cadeia superior a seis átomos de carbono ou ésteres ou glicéridos que possam ser obtidos a partir destes.

[027] Os compostos básicos, tais como hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, amónia ou água de amónia, ou compostos ácidos, tais como ácido fosfórico ou ácido sulfúrico, podem ser adequadamente utilizados no meio para o controle de pH da cultura. É possível utilizar agentes anti-espuma, tais como, por exemplo, ésteres poliglicólicos de ácido gordo, para o controle do desenvolvimento de espuma. É possível adicionar substâncias com atuação seletiva adequada, tais como, por exemplo, antibióticos, ao meio para manter a estabilidade dos plasmídeos. Para manter as condições aeróbicas, é possível incorporar oxigénio ou misturas gasosas que contêm oxigénio, tais como, por exemplo, ar, na cultura.

[028] A temperatura da cultura é normalmente superior ou igual a 20°C, 25°C, também pode ser superior ou igual a 40°C, em que, vantajosamente, é possível utilizar uma temperatura de cultura de pelo menos ou igual a 95°C, em particular, pelo menos ou igual a 90°C e, mais particularmente, pelo menos ou igual a 80°C.

[029] Será do conhecimento de um especialista na matéria quais condições constituem as condições adequadas para a cultura de células recombinantes de acordo com um qualquer aspecto da presente invenção para produzir ramnolipídeos a partir de pelo menos uma molécula C4. Utilizando métodos básicos conhecidos na especialidade, um especialista na matéria é capaz de variar as condições no meio de forma a adequa-las à célula relevante utilizada de acordo com um qualquer aspecto da presente invenção.

[030] No método de acordo com um qualquer aspecto da presente invenção, os ramnolipídeos formados pelas células podem ser facultativamente isolados a partir das células e/ou do meio. Todos os métodos conhecidos na especialidade para o isolamento de substâncias de peso molecular reduzido a partir de composições complexas podem ser aplicados. Por exemplo, métodos tais como filtração, extração, adsorção (cromatografia), cristalização e semelhantes podem ser utilizados na fase de produto.

[031] O produto isolado na fase de produto também pode compreender outros resíduos indesejados de biomassa e de várias impurezas, tais como óleos, ácidos gordos e outros constituintes do meio nutriente. A separação destas impurezas e semelhantes pode ser efetuada em um processo isento de solvente. Assim, por exemplo, o produto isolado pode, em primeiro lugar, ser diluído com água para facilitar o ajuste do pH. O produto e as fases aquosas podem então ser homogeneizados por conversão dos ramnolipídeos em uma forma solúvel em água diminuindo ou aumentando o pH com ácidos ou alcalinos, respectivamente. A solubilidade dos ramnolipídeos na fase aquosa pode ser assistida por incubação da mistura de reação a temperaturas mais elevadas, v.g., de 60°C até 90°C, e/ou com mistura constante. Aumentando ou diminuindo subsequentemente o pH por meio de alcalinos ou ácidos, os ramnolipídeos podem então ser novamente convertidos para uma forma insolúvel em água, de um modo tal que possam ser facilmente separados da fase aquosa. A fase de produto pode então ser lacada uma vez ou várias vezes com água para remover as impurezas solúveis em água.

[032] Os resíduos oleosos podem ser separados, por exemplo, por extração através de solventes adequados e, vantajosamente, por meio de solventes orgânicos. É possível utilizar um alcano, tal como, por exemplo, n- hexano e semelhantes, como solvente.

[033] A separação do produto da fase aquosa pode ser efetuada, em alternativa ao processo isento de solvente descrito antes, utilizando um solvente adequado, v.g., um éster, tal como, por exemplo, acetato de etilo, acetato de butilo e semelhantes. Estes passos de extração podem ser efetuados em qualquer sequência desejada. Um especialista na matéria conseguirá variar facilmente a sequência de passos e/ou de solventes utilizados de forma a adequá-los à célula e ao ramnolipídeo que se pretende extrair.

[034] De acordo com outro exemplo, é possível utilizar solventes na extração dos ramnolipídeos produzidos de acordo com um qualquer aspecto da presente invenção. Em particular, é possível utilizar solventes orgânicos. Mais particularmente, é possível utilizar n-pentanol como solvente. Uma destilação, por exemplo, pode ser efetuada para a remoção do solvente. Subsequentemente, o produto liofilizado pode ser ainda purificado, por exemplo, por meio de métodos cromatográficos. A título de exemplo, é possível utilizar precipitação por meio de solventes adequados, extração por meio de solventes adequados, complexação, por exemplo, por meio de ciclodextrinas ou derivados de ciclodextrina, cristalização, purificação ou isolamento por meio de métodos cromatográficos ou conversão dos ramnolipídeos em derivados facilmente separáveis.

[035] A célula recombinante utilizada de acordo com um qualquer aspecto da presente invenção, foi geneticamente modificada de um modo tal que, em comparação com o tipo selvagem da célula, a célula apresenta uma atividade aumentada de pelo menos uma das enzimas E1, E2 e E3, em que a enzima E1 é uma α/β hidrolase, a enzima E2 é uma ramnosil-transferase I e a enzima E3 é uma ramnosil-transferase II. A célula recombinante utilizada de acordo com um qualquer aspecto da presente invenção pode ser preparada de acordo com o método descrito no documento WO2012013554A1.

[036] Em particular, na célula de acordo com um qualquer aspecto da presente invenção, a enzima E1 pode ser capaz de catalisar a conversão de 3- hidroxialcanoíl-ACP via ácido 3-hidroxialcanoíl-3-hidroxialcanóico-ACP em ácido hidroxialcanoíl-3-hidroxialcanóico, a enzima E2 pode ser uma ramnosil- transferase I e pode ser capaz de catalisar a conversão de dTDP-ramnose e 3- hidroxialcanoíl-3-hidroxialcanoato em a-L-ramnopiranosil-3-hidroxialcanoíl-3- hidroxialcanoato e a enzima E3 pode ser uma ramnosil-transferase II e pode ser capaz de catalisar a conversão de dTDP-ramnose e a-L-ramnopiranosil-3- hidroxialcanoíl-3-hidroxi-alcanoato em a-L-ramnopiranosil-(1-2)-a-L-ramno- piranosil-3-hidroxialcanoíl-3-hidroxialcanoato, em que estas enzimas E1, E2 e E3 podem ser selecionadas entre o conjunto constituído por:

[037] pelo menos uma enzima E1 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada entre o conjunto constituído por SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 e seus fragmentos;

[038] pelo menos uma enzima E2 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada entre o conjunto constituído por SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 e seus fragmentos e

[039] pelo menos uma enzima E3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada entre o conjunto constituído por SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15 e seus fragmentos. O fragmento no que diz respeito a qualquer uma das enzimas E1, E2 ou E3 pode compreender uma sequência de polipeptídeos em que até 25% dos radicais aminoácidos são modificados por supressão, inserção, substituição ou uma sua combinação em comparação com a sequência da respectiva enzima e o fragmento compreende pelo menos 10% da atividade enzimática da respectiva enzima.

[040] Em particular, a enzima E1 na célula de acordo com um qualquer aspecto da presente invenção, pode ser selecionada entre o conjunto constituído por:

[041] uma enzima E1a que compreende uma sequência de polipeptídeos SEQ ID NO:2 ou que tem uma sequência de polipeptídeos em que até 25%, 20%, 15%, em particular, até 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% dos radicais aminoácidos são modificados em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO:2, por supressão, inserção, substituição ou uma sua combinação e que tem ainda pelo menos 10%, 50%, 80%, em particular, mais de 90% da atividade enzimática da enzima que tem a sequência de referência SEQ ID NO:2, em que a atividade enzimática para uma enzima E1a pode ser entendida como a aptidão para converter 3-hidroxidecanoíl-ACP via ácido 3- hidroxidecanoíl-3-hidroxidecanóico-ACP em ácido hidroxidecanoíl-3- hidroxidecanóico,

[042] uma enzima E1b que compreende uma sequência de polipeptídeos SEQ ID NO:3 ou que tem uma sequência de polipeptídeos em que até 25%, 20%, 15%, em particular, até 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% dos radicais aminoácidos são modificados em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO:2, por supressão, inserção, substituição ou uma sua combinação e que tem ainda pelo menos 10%, 50%, 80%, em particular, mais de 90% da atividade enzimática da enzima que tem a sequência de referência SEQ ID NO:3, em que a atividade enzimática para uma enzima E1b pode ser entendida como a aptidão para converter 3-hidroxidecanoíl-ACP via ácido 3- hidroxidecanoíl-3-hidroxidecanóico-ACP em ácido hidroxidecanoíl-3- hidroxidecanóico,

[043] uma enzima E1c que compreende uma sequência de polipeptídeos SEQ ID NO:4 ou que tem uma sequência de polipeptídeos em que até 25%, 20%, 15%, em particular, até 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% dos radicais aminoácidos são modificados em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO:4, por supressão, inserção, substituição ou uma sua combinação e que tem ainda pelo menos 10%, 50%, 80%, em particular, mais de 90% da atividade enzimática da enzima que tem a sequência de referência SEQ ID NO:4, em que a atividade enzimática para uma enzima E1c pode ser entendida como a aptidão para converter 3-hidroxidecanoíl-ACP via ácido 3- hidroxidecanoíl-3-hidroxidecanóico-ACP em ácido hidroxidecanoíl-3- hidroxidecanóico,

[044] uma enzima E1d que compreende uma sequência de polipeptídeos SEQ ID NO:5 ou que tem uma sequência de polipeptídeos em que até 25%, 20%, 15%, em particular, até 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% dos radicais aminoácidos são modificados em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO:5, por supressão, inserção, substituição ou uma sua combinação e que tem ainda pelo menos 10%, 50%, 80%, em particular, mais de 90% da atividade enzimática da enzima que tem a sequência de referência SEQ ID NO:5, em que a atividade enzimática para uma enzima E1d pode ser entendida como a aptidão para converter 3-hidroxidecanoíl-ACP via ácido 3- hidroxidecanoíl-3-hidroxidecanóico-ACP em ácido hidroxidecanoíl-3- hidroxidecanóico e

[045] uma enzima E1e que compreende uma sequência de polipeptídeos SEQ ID NO:6 ou que tem uma sequência de polipeptídeos em que até 25%, 20%, 15%, em particular, até 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% dos radicais aminoácidos são modificados em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO:6, por supressão, inserção, substituição ou uma sua combinação e que tem ainda pelo menos 10%, 50%, 80%, em particular, mais de 90% da atividade enzimática da enzima que tem a sequência de referência SEQ ID NO:6, em que a atividade enzimática para uma enzima E1e pode ser entendida como a aptidão para converter 3-hidroxidecanoíl-ACP via ácido 3- hidroxidecanoíl-3-hidroxidecanóico-ACP em ácido hidroxidecanoíl-3- hidroxidecanóico.

[046] Em particular, a enzima E2 utilizada na célula de acordo com um qualquer aspecto da presente invenção pode ser selecionada entre o conjunto constituído por:

[047] uma enzima E2a que tem uma sequência de polipeptídeos SEQ ID NO:7 ou que tem uma sequência de polipeptídeos em que até 25%, 20%, 15%, em particular, até 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% dos radicais aminoácidos são modificados em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO:7, por supressão, inserção, substituição ou uma sua combinação e que tem ainda pelo menos 10%, 50%, 80%, em particular, mais de 90% da atividade enzimática da enzima que tem a sequência de referência SEQ ID NO:7, em que a atividade enzimática para uma enzima E2a pode ser entendida como a aptidão para converter, de preferência, dTDP-ramnose e ácido 3- hidroxidecanoíl-3-hidroxidecanóico em ácido a-L-ramnopiranosil-3- hidroxidecanoíl-3-hidroxidecanóico,

[048] uma enzima E2b que tem uma sequência de polipeptídeos SEQ ID NO:8 ou que tem uma sequência de polipeptídeos em que até 25%, 20%, 15%, em particular, até 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% dos radicais aminoácidos são modificados em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO:8, por supressão, inserção, substituição ou uma sua combinação e que tem ainda pelo menos 10%, 50%, 80%, em particular, mais de 90% da atividade enzimática da enzima que tem a sequência de referência SEQ ID NO:8, em que a atividade enzimática para uma enzima E2b pode ser entendida como a aptidão para converter, de preferência, dTDP-ramnose e ácido 3- hidroxidecanoíl-3-hidroxidecanóico em ácido a-L-ramnopiranosil-3- hidroxidecanoíl-3-hidroxidecanóico,

[049] uma enzima E2c que tem uma sequência de polipeptídeos SEQ ID NO:9 ou que tem uma sequência de polipeptídeos em que até 25%, 20%, 15%, em particular, até 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% dos radicais aminoácidos são modificados em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO:9, por supressão, inserção, substituição ou uma sua combinação e que tem ainda pelo menos 10%, 50%, 80%, em particular, mais de 90% da atividade enzimática da enzima que tem a sequência de referência SEQ ID NO:9, em que a atividade enzimática para uma enzima E2c pode ser entendida como a aptidão para converter, de preferência, dTDP-ramnose e ácido 3- hidroxidecanoíl-3-hidroxidecanóico em ácido a-L-ramnopiranosil-3- hidroxidecanoíl-3-hidroxidecanóico,

[050] uma enzima E2d que tem uma sequência de polipeptídeos SEQ ID NO:10 ou que tem uma sequência de polipeptídeos em que até 25%, 20%, 15%, em particular, até 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% dos radicais aminoácidos são modificados em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO:10, por supressão, inserção, substituição ou uma sua combinação e que tem ainda pelo menos 10%, 50%, 80%, em particular, mais de 90% da atividade enzimática da enzima que tem a sequência de referência SEQ ID NO:10, em que a atividade enzimática para uma enzima E2d pode ser entendida como a aptidão para converter, de preferência, dTDP-ramnose e ácido 3-hidroxidecanoíl-3-hidroxidecanóico em ácido a-L-ramnopiranosil-3- hidroxidecanoíl-3-hidroxidecanóico e

[051] uma enzima E2e que tem uma sequência de polipeptídeos SEQ ID NO:11 ou que tem uma sequência de polipeptídeos em que até 25%, 20%, 15%, em particular, até 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% dos radicais aminoácidos são modificados em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO:11, por supressão, inserção, substituição ou uma sua combinação e que tem ainda pelo menos 10%, 50%, 80%, em particular, mais de 90% da atividade enzimática da enzima que tem a sequência de referência SEQ ID NO:11, em que a atividade enzimática para uma enzima E2e pode ser entendida como a aptidão para converter, de preferência, dTDP-ramnose e ácido 3-hidroxidecanoíl-3-hidroxidecanóico em ácido a-L-ramnopiranosil-3- hidroxidecanoíl-3-hidroxidecanóico.

[052] Em particular, a enzima E3 utilizada na célula de acordo com um qualquer aspecto da presente invenção pode ser selecionada entre o conjunto constituído por:

[053] uma enzima E3a que tem uma sequência de polipeptídeos SEQ ID NO:12 ou que tem uma sequência de polipeptídeos em que até 25%, 20%, 15%, em particular, até 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% dos radicais aminoácidos são modificados em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO:12, por supressão, inserção, substituição ou uma sua combinação e que tem ainda pelo menos 10%, 50%, 80%, em particular, mais de 90% da atividade enzimática da enzima que tem a sequência de referência SEQ ID NO:12, em que a atividade enzimática para uma enzima E3a pode ser entendida como a aptidão para converter, de preferência, dTDP-ramnose e ácido a-L-ramnopiranosil-3-hidroxidecanoíl-3-hidroxidecanóico em ácido a-L- ramno-piranosil-(1-2)-a-L-ramnopiranosil-3-hidroxidecanoíl-3-hidroxidecanóico,

[054] uma enzima E3b que tem uma sequência de polipeptídeos SEQ ID NO:13 ou que tem uma sequência de polipeptídeos em que até 25%, 20%, 15%, em particular, até 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% dos radicais aminoácidos são modificados em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO:13, por supressão, inserção, substituição ou uma sua combinação e que tem ainda pelo menos 10%, 50%, 80%, em particular, mais de 90% da atividade enzimática da enzima que tem a sequência de referência SEQ ID NO:13, em que a atividade enzimática para uma enzima E3b pode ser entendida como a aptidão para converter, de preferência, dTDP-ramnose e ácido a-L-ramnopiranosil-3-hidroxidecanoíl-3-hidroxidecanóico em ácido a-L- ramno-piranosil-(1-2)-a-L-ramnopiranosil-3-hidroxidecanoíl-3-hidroxidecanóico,

[055] uma enzima E3c que tem uma sequência de polipeptídeos SEQ ID NO:14 ou que tem uma sequência de polipeptídeos em que até 25%, 20%, 15%, em particular, até 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% dos radicais aminoácidos são modificados em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO:14, por supressão, inserção, substituição ou uma sua combinação e que tem ainda pelo menos 10%, 50%, 80%, em particular, mais de 90% da atividade enzimática da enzima que tem a sequência de referência SEQ ID NO:14, em que a atividade enzimática para uma enzima E3c pode ser entendida como a aptidão para converter, de preferência, dTDP-ramnose e ácido a-L-ramnopiranosil-3-hidroxidecanoíl-3-hidroxidecanóico em ácido a-L- ramno-piranosil-(1-2)-a-L-ramnopiranosil-3-hidroxidecanoíl-3-hidroxidecanóico e

[056] uma enzima E3d que tem uma sequência de polipeptídeos SEQ ID NO:15 ou que tem uma sequência de polipeptídeos em que até 25%, 20%, 15%, em particular, até 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% dos radicais aminoácidos são modificados em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO:15, por supressão, inserção, substituição ou uma sua combinação e que tem ainda pelo menos 10%, 50%, 80%, em particular, mais de 90% da atividade enzimática da enzima que tem a sequência de referência SEQ ID NO:15, em que a atividade enzimática para uma enzima E3d pode ser entendida como a aptidão para converter, de preferência, dTDP-ramnose e ácido a-L-ramnopiranosil-3-hidroxidecanoíl-3-hidroxidecanóico em ácido a-L- ramno-piranosil-(1-2)-a-L-ramnopiranosil-3-hidroxidecanoíl-3-hidroxidecanóico.

[057] Será evidente para um especialista na matéria que as atividades indicadas antes para as enzimas E1a a E3b são apenas escolhas exemplificativas especiais de um espectro mais alargado de atividades destas enzimas; a atividade respectiva mencionada é aquela para a qual se encontram disponível um método de medição de confiança no caso de uma determinada enzima. Assim, é óbvio que uma enzima com um substrato que possui um radical C10 saturado e não ramificado também pode ser capaz de converter esses substratos que contêm um radical alquilo C6 ou C16, os quais podem também ser facultativamente ramificados ou insaturados.

[058] A célula recombinante de acordo com um qualquer aspecto da presente invenção também pode ser geneticamente modificada de um modo tal que, em comparação como tipo selvagem da célula, a células apresente uma atividade aumentada da enzima oxido-redutase. Em particular, a célula pode ser geneticamente modificada de um modo tal que a células apresente uma atividade aumentada de E1, E2 ou E3 ou de suas combinações e de oxido- redutase. Mais particularmente, as células podem apresentar uma atividade aumentada de E1, E2, E3 e de oxido-redutase. De acordo com um exemplo, as células têm atividade aumentada de E1 e E2 e de oxido-redutase ou de E1 e E3 e de oxido-redutase ou de E2 e E3 e de oxido-redutase.

[059] A oxido-redutase pode ser uma oxido-redutase de tipo alqB. Esta classe de oxido-redutases, alqB, são proteínas redox do sistema Pseudomonas putida AlqBGT, dependente de dois polipeptídeos auxiliares, alqG e alqT. AlqT é uma rubredoxina reductase dependente de FAD que transfere elétrons de NADH para alqG. AlqG é uma rubredoxina, uma proteína redox que contém ferro e que funcional como dador diretor de elétrons para alqB. De acordo com um exemplo particular, a oxido-redutase de tipo alqB é uma alqB de Pseudomonas putida Gpo1 (número de adesão: CAB54050.1 (versão 1), SEQ ID NO:1, qualquer número de adesão utilizado no pedido de patente de invenção refere-se à respectiva sequência da base de dados Genbank de NCBI, em que a libertação referida é aquela disponibilizada em linha no dia 4 de Abril de 2014).

[060] A enzima oxido-redutase de tipo alqB tem uma sequência de polipeptídeos SEQ ID NO:1 ou tem uma sequência de polipeptídeos em que até 25%, 20%, 15%, em particular, até 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% dos radicais aminoácidos são modificados em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO:1, por supressão, inserção, substituição ou uma sua combinação e que tem ainda pelo menos 10%, 50%, 80%, em particular, mais de 92% da atividade enzimática da enzima que tem a sequência de referência SEQ ID NO:1, em que a atividade enzimática para uma enzima oxido-redutase de tipo alqB pode ser entendida como a aptidão para converter, de preferência, butano em 1-butanol e/ou 2-butanol, quando o butano é utilizado como fonte de carbono, isto é, quando o butano é utilizado como molécula C4 de acordo com um qualquer aspecto da presente invenção.

[061] A oxido-redutase pode ser uma mono-oxigenase. Em particular, a mono-oxigenase pode ser uma mono-oxigenase de tipo P450, v.g., citocromo P450 de Candida tropicalis ou de Cicer arietiem um. Mais particularmente, uma mono-oxigenase CYP153, v.g., citocromo P450-mono-oxigenase de Alcanivorax borkumensis SK2 (YP_691921). A mono-oxigenase pode ser utilizada na primeira oxidação de butano em álcool.

[062] De acordo com outro exemplo, a oxido-redutase pode ser uma desodrigenase de álcool (ADH) dependente de NAD(P)H. Em particular, a ADH pode ser de Escherichia coli MS 187-1 (ZP_07145023), de Bacillus stearothermophilus (P42328), de Ralstonia eutropha (ACB78191.1), de Lactobacillus brevis (YP_795183.1), de Lactobacillus kefiri (ACF95832.1), de fígado de cavalo, de Paracoccus pantotrophus (ACB78182.1) ou de Sphingobium yanoikuyae (EU427523.1). De acordo com um exemplo, uma ADH pode ser uma ADH dependente de flavina, v.g., de Candida tropicalis (AAS46878.1). A ADH pode ser utilizada quando o butanol é utilizado como fonte de carbono, isto é, quando o butanol é utilizado como molécula C4 de acordo com um qualquer aspecto da presente invenção, diretamente ou produzido in situ a partir de butano.

[063] De acordo com um exemplo, a oxido-redutase pode ser da família de glicose-metanol-colina-oxido-redutase, em particular, de Caulobacter sp. K31 (ABZ74557.1). Esta oxido-redutase particular também pode ser utilizada quando o butanol é utilizado como fonte de carbono, isto é, quando o butanol é utilizado como molécula C4 de acordo com um qualquer aspecto da presente invenção, diretamente ou produzido in situ a partir de butano.

[064] O termo “atividade aumentada de uma enzima” pretende designar atividade intracelular aumentada.

[065] A descrição e as definições seguintes em relação a aumentar a atividade da enzima em células aplica-se tanto ao aumento na atividade das enzimas E1 a E3 e de oxido-redutase como para todas as enzimas mencionadas subsequentemente na presente descrição, cuja atividade possa ser facultativamente aumentada. Em particular, é possível aplicar todos os métodos, tal como descritos ao longo da presente memória descritiva em relação às enzimas E1, E2 e E3, à enzima oxido-redutase que pode estar facultativamente presente na célula recombinante de acordo com um qualquer aspecto da presente invenção.

[066] Em princípio, um aumento na atividade enzimática pode ser alcançado por meio do aumento do número de cópias da sequência de genes ou das sequências de genes que codificam a enzima, utilizando um promotor forte ou um local melhorado de ligação a ribossoma, atenuando a regulação negativa da expressão de gene, por exemplo, por reguladores de transcrição, ou amplificando uma regulação positiva da expressão de gene, modificando a utilização do códon do gene, modificando de várias formas o período de semivida de mRNA ou da enzima, modificando a regulação da expressão do gene ou utilizando um gene ou alelo que codifique uma enzima adequada que possui uma atividade aumentada e, facultativamente, combinando estas medidas. De acordo com um qualquer aspecto da presente invenção, são produzidas células geneticamente modificadas, por exemplo, por transformação, transdução, conjugação ou uma combinação destes métodos, utilizando um vetor que contém o gene desejado, um alelo deste gene ou suas partes, que contém, facultativamente, um promotor que torna possível a expressão do gene. Em particular, a expressão heteróloga é alcançada por integração do gene ou dos alelos no cromossoma da célula ou um vetor de replicação extracromossômico.

[067] No documento DE-A-10031999 são apresentados vários exemplos de formas para aumentar a atividade enzimática em células, tal como exemplificado por piruvato carboxilase. Um especialista na matéria será facilmente capaz de utilizar os métodos descritos no documento DE-A- 10031999 para aumentar a atividade enzimática em células de acordo com um qualquer aspecto da presente invenção.

[068] A expressão das enzimas ou genes anteriores e de todos aqueles subsequentemente mencionados é detectável com o auxílio de separação em gel de proteínas de 1 dimensão e/ou de 2 dimensões e subsequente identificação óptica da concentração de proteína no gel utilizando a aplicação informática analítica adequada. Caso o aumento na atividade enzimática seja baseado exclusivamente em um aumento na expressão do gene correspondente, a quantificação do aumento na atividade enzimática pode ser determinada de um modo simples por comparação das separações de proteína a 1 ou 2 dimensões entre a célula de tipo selvagem e a célula geneticamente modificada. Um método convencional para a preparação dos geles de proteína no caso de corynebacterium e para a identificação de proteínas é o processo descrito por Hermann et al., 2001. A concentração em proteína pode ser analisada por hibridação por Western Blot utilizando um anticorpo específico para a proteína que se pretende detectar (Sambrook et al., 1989) e subsequente análise óptica utilizando a aplicação informática adequada para a determinação da concentração (Lohaus e Meyer, 1989). A atividade de proteínas de ligação a DNA pode ser medida por meio de ensaios de desvio de banda de DNA (também designados por retardamento de gel) (Wilson et al., 2001). A ação das proteínas de ligação a DNA sobre a expressão de outros genes pode ser detectada por vários métodos bem conhecidos de ensaio de gene repórter (Sambrook et al., 1989). As atividades enzimáticas intracelulares também podem ser determinadas de acordo com vários métodos estabelecidos (Donahue et al., 2000; Ray et al., 2000; Freedberg et al., 1973). Caso, nos seguintes exemplos, não sejam indicados métodos específicos para a determinação da atividade de uma enzima precisa, então a determinação do aumento na atividade enzimática ou a determinação da diminuição de uma atividade enzimática pode ser efetuada por meio dos métodos descritos por Hermann et al., 2001, Lohaus et al., 1998, Lottspeich, 1999 e Wilson et al., 2001.

[069] Caso o aumento na atividade enzimática seja conseguido por mutação do gene endógeno, então tais mutações podem ser produzidas aleatoriamente por métodos convencionais, tais como, por exemplo, por irradiação UV ou por químicos mutagênicos, ou seletivamente por meio de métodos de engenharia genética, tais como supressões, inserções e/ou permutas de nucleotídeos. As células modificadas são obtidas por estas mutações. Em particular, os mutantes de enzimas são também aquelas enzimas que já não são capazes de ser inibidas por resposta, produto ou substrato, ou são capazes de ser inibidas mas em um nível reduzido pelo menos em comparação com a enzima de tipo selvagem.

[070] Caso o aumento na atividade enzimática seja conseguido por meio do aumento na síntese de uma enzima, então o número de cópias dos genes correspondentes pode ser aumentado ou o promotor e a região de regulação ou o local de ligação do ribossoma, que está situado a montante do gene estrutural, pode ser mutado. As cassetes de expressão, que são incorporadas a montante do gene estrutural, atuam de um modo idêntico. Também é possível, pelo menos por meio de promotores indutíveis, aumentar a expressão do gene em um momento qualquer desejado no tempo. Os “potenciadores” também podem ser atribuídos ao gene de enzima relevante como sequências regulatórias, que proporcionam igualmente uma expressão de gene aumentada por meio de uma interação melhorada entre polimerase de RNA e DNA. Como resultados das medidas para prolongar o período de vida de mRNA, a expressão é também melhorada. Além disso, através da prevenção da degradação da proteína da enzima, a atividade enzimática também pode ser aumentada. Os genes ou as construções de genes estão aqui presentes em plasmídeos com um número de cópias diferentes ou são integrados e amplificados no cromossoma. De acordo com um outro exemplo, uma sobre- expressão dos genes em causa pode ser alcançada através de modificação da composição do meio e da gestão de cultura. Um especialista na matéria é capaz de encontrar direções para tal, inter alia, em Martin et al., 1987, Guerrero et al., 1994, Tsuchiya e Morinaga, 1988, Eikmanns et al., 1991, EP-A-0472869, US 4 601 893, Schwarzer e Pühler, 1991, Reinscheid et al., 1994, LaBarre et al., 1993, WO 96/15246A, Malumbres et al., 1993, JP 10229891A, Jensen e Hammer, 1998 e em textos conhecidos de genética e de biologia molecular. De igual modo, as medidas descritas antes resultam, tal como as mutações, em células geneticamente modificadas que podem ser utilizadas de acordo com um qualquer aspecto da presente invenção.

[071] Os plasmídeos epissómicos, por exemplo, são utilizados para aumentar a expressão dos genes respectivos. Como plasmídeos ou vetores adequados refere-se, em princípio, todos aqueles disponíveis teoricamente para este propósito para um especialista na matéria. Tais plasmídeos e vetores podem ser obtidos, por exemplo, a partir de folhetos das companhias Novagen, Promega, New England Biolabs, Clontech ou Gibco BRL. Em particular, os plasmídeos e vetores podem ser encontrados em: Glover, D. M., 1985, Rodriguez, R.L. e Denhardt, D. T, 1988, Butterworth, Stoneham; Goeddel, D. V., 1990, Fritsch, E. F. e Maniatis, T., 1989.

[072] O vetor plasmídeo, que compreende o gene que se pretende amplificar, é então convertido para a estirpe desejada por conjugação ou transformação. O método de conjugação encontra-se descrito, por exemplo, em Schãfer et al., 1994. Métodos para transformação encontram-se descritos, por exemplo, pelo menos em Thierbach et al., 1988, Dunican e Shivnan, 1989 e Tauch et al., 1994. Após recombinação homóloga por meio de um evento “cruzado”, a estirpe resultante compreende pelo menos duas cópias do gene em questão. Utilizando este método, pelo menos o número de cópias dos genes pode ser aumentado até um número desejado na estirpe.

[073] Na formulação utilizada antes e nos exemplos seguintes, “uma atividade de uma enzima (Ex) aumentada em comparação com a do seu tipo selvagem” pretende sempre designar uma atividade da respectiva enzima Ex aumentada em um fator de pelo menos 2, em particular, de pelo menos 10, mais particularmente, de pelo menos 100, ainda mais particularmente, pelo menos de 1000 e, muito mais particularmente, pelo menos de 10000. A célula de acordo com um qualquer aspecto da presente invenção, que tem uma “atividade aumentada de uma enzima (Ex) em comparação com a do seu tipo selvagem”, compreende, em particular, uma célula cujo tipo selvagem contém nenhum ou pelo menos nenhuma atividade detectável desta enzima Ex apenas após aumento da atividade da enzima, por exemplo, por sobre-expressão. Neste sentido, o termo “sobre-expressão” ou a formulação utilizada nos exemplos seguintes “que aumenta a expressão” também compreende o caso em que uma célula de partida, por exemplo, uma célula de tipo selvagem, apresenta nenhuma ou pelo menos nenhuma expressão detectável, e uma síntese detectável da enzima Ex é induzida apenas por métodos recombinantes. Ex também pode referir-se a oxido-redutase.

[074] O termo “tipo selvagem” de uma célula designa aqui uma célula cujo genoma está presente em um estado tal como é formado naturalmente por evolução. O termo é utilizando tanto para a célula total como para genes individuais. Assim sendo, o termo “tipo selvagem” não inclui, em particular, aquelas células ou aqueles genes, cuja sequência de genes foi modificada pelo menos parcialmente pelo homem por meio de métodos recombinantes.

[075] Em particular, o aumento na atividade enzimática em relação à célula de tipo selvagem pode ser medido utilizando métodos convencionais conhecidos na especialidade. Por exemplo, o aumento em atividade de E1, E2 e E3 pode ser medido utilizando os métodos descritos por Burger, M. M., 1963 e Burger, M. M., 1966.

[076] As alterações de radicais aminoácidos de uma determinada sequência de polipeptídeos, que dá origem a alterações não significativas nas propriedades e na função do determinado polipeptídeo, são conhecidas pelos especialistas na matéria. Assim, por exemplo, os “aminoácidos conservados” podem ser permutados mutuamente. Como exemplos de tais substituições de aminoácidos adequadas refere-se, mas sem que isso constitua qualquer limitação: Ala por Ser; Arg por Lys; Asn por Gln ou His; Asp por Glu; Cys por Ser; Gln por Asn; Glu por Asp; Gly por Pro; His por Asn ou Gln; Ile por Leu ou Val; Leu por Met ou Val; Lys por Arg ou Gln ou Glu; Met por Leu ou Ile; Phe por Met ou Leu ou Tyr; Ser por Thr; Thr por Ser; Trp por Tyr; Tyr por Trp ou Phe; Val por Ile ou Leu. De igual modo, sabe-se também que alterações, em particular, no terminal N ou C de um polipeptídeo, sob a forma, por exemplo, de inserções ou supressões de aminoácidos exercem frequentemente uma influência não significativa na função do polipeptídeo.

[077] A atividade de uma enzima pode ser determinada por perturbação de células que contêm esta atividade de um modo conhecido pelos especialistas na matéria, por exemplo, com o auxílio de um moinho de esferas, uma prensa francesa ou um desintegrador ultrassónico. Subsequentemente, a separação de células, resíduos de células e auxiliares de perturbação, tais como, por exemplo, esferas de vidro, pode ser efetuada pelo menos por centrifugação durante 10 minutos a 13000 r.p.m. e 4°C.

[078] Utilizando o extrato impuro isento de células resultante, é possível efetuar então os ensaios de enzima com subsequente detecção LC-ESI-MS dos produtos. Em alternativa, a enzima desejada pode ser enriquecida por meios conhecidos pelos especialistas na matéria, por exemplo, por métodos cromatográficos (tais como, cromatografia de afinidade de níquel-ácido nitrilotriacético, cromatografia de afinidade a estreptavidina, cromatografia de filtração em gel ou cromatografia de permuta iónica) ou então pode ser purificada até à homogeneidade.

[079] A atividade da enzima E1 pode ser determinada utilizando as amostras de enzima obtidas da seguinte forma: um ensaio padrão pode conter E. coli ACP 100 μM, β-mercaptoetanol 1 mM, malonil-coenzima A 200 μM, octanoíl-coenzima A (para E1a) ou dodecanoíl-coenzima A (para E1b) 40 μM, NADPH 100 μM, 2 μg de E. coli FabD, 2 μg de Mycobacterium tuberculosis FabH, 1 μg de E. coli FabG, tampão de fosfato de sódio 0,1 M, pH 7,0 e 5 μg de enzima E1, em um volume final de 120 μL. Mantém-se a incubar ACP, β-mercaptoetanol e tampão de fosfato de sódio durante 30 minutos a 37°C para reduzir o ACP completamente. Pode então dar-se início à reação por meio da adição de enzima E1. As reações podem ser interrompidas utilizando 2 mL de água, que foi acidificada com HCl até pH 2,0, e subsequentemente extraídas duas vezes com 2 mL de clorofórmio/metanol (a 2:1 (v:v)). A separação de fases é então efetuada por centrifugação (16100 g, 5 minutos, TA). A fase orgânica inferior pode ser removida, evaporada completamente na centrífuga de vácuo e o sedimento pode ser retomado em 50 μL de metanol. Os constituintes não dissolvidos são removidos como sedimentos por centrifugação (16100 g, 5 minutos, TA) e a amostra é analisada por meio de LC-ESI-MS. A identificação dos produtos é efetuada por análise dos vestígios de maça correspondentes e pelo espectro MS2.

[080] A atividade da enzima E2 pode ser determinada do modo seguinte utilizando as amostras de enzima obtidas tal como descrito antes: um ensaio padrão pode conter 185 μL de tris-HCl 10 mM (pH 7,5), 10 μL de dTDP- ramnose 125 mM e 50 μL de extrato impuro de proteína (cerca de 1 mg da proteína total) ou uma proteína purificada em solução (5 μg de proteína purificada). Dá-se início à reação por meio da adição de 10 μL de uma solução etanólica 10 mM de ácido 3-hidroxidecanoíl-3-hidroxidecanóico (para E2a) ou ácido 3-hidroxi-tetradecanoíl-3-hidroxitetradecanóico (para E2b) e mantém-se a incubar durante 1 hora a 30°C sob agitação (600 r.p.m.). Subsequentemente, a reação pode ser tratada com 1 mL de acetona. Os constituintes não dissolvidos são removidos como sedimentos por centrifugação (16100 g, 5 minutos, TA) e a amostra é analisada por meio de LC-ESI-MS. A identificação dos produtos é efetuada por análise dos vestígios de maça correspondentes e pelo espectro MS2.

[081] A atividade da enzima E3 pode ser determinada tal como a seguir se descreve utilizando as amostras de enzima obtidas tal como descrito antes: um ensaio padrão pode conter 185 μL de tris-HCl 10 mM (pH 7,5), 10 μL de dTDP- ramnose 125 mM e 50 μL de extrato impuro de proteína (cerca de 1 mg da proteína total) ou proteína purificada em solução (5 μg de proteína purificada). Dá-se início à reação por meio da adição de 10 μL de solução etanólica 10 mM de ácido a-L-ramnopiranosil-3-hidroxidecanoíl-3-hidroxidecanóico (para E3a) ou ácido a-L-ramnopiranosil-3-hidroxitetradecanoíl-3-hidroxitetradecanóico (para E3b) e mantém-se a incubar durante 1 hora a 30°C sob agitação (600 r.p.m.). Subsequentemente, trata-se a reação com 1 mL de acetona. Os constituintes não dissolvidos são removidos como sedimentos por centrifugação (16100 g, 5 minutos, TA) e a amostra é analisada por meio de LC-ESI-MS. A identificação dos produtos é efetuada por análise dos vestígios de maça correspondentes e pelo espectro MS2.

[082] As células recombinantes de acordo com um qualquer aspecto da presente invenção podem apresentar atividades aumentadas de pelo menos E1, E2 e/ou E3. Em particular, as células podem apresentar atividade aumentada de E1, E2 ou E3 ou de suas combinações. Mais particularmente, as células podem ter atividade aumentada de E1, E2 e E3. De acordo com um exemplo, as células têm atividade aumentada de E1 e E2 ou de E1 e E3 ou de E2 e E3.

[083] A atividade da enzima oxido-redutase pode ser determinada por qualquer método conhecido na especialidade. Em particular, a atividade de oxido-redutase de tipo alqB pode ser determinada utilizando o método descrito no documento WO 2009/077461A1, a atividade de mono-oxigenase de tipo P450 pode ser determinada utilizando o método proporcionado por Scheps, D et al., 2011 e a atividade de ADH pelo método proporcionado por Benson, S., Shapiro, J., J. Bacteriol. 1976, 126, 794-798.

[084] As células geneticamente modificadas de acordo com um qualquer aspecto da presente invenção podem ser feitas contactar com o meio de um modo contínuo ou descontínuo no processo em lote (cultura em lote) ou no processo de alimentação-lote (processo de alimentação) ou processo de alimentação-lote repetido (processo de alimentação repetitivo), com o propósito da produção dos produtos supramencionados e, assim, desenvolvidos em cultura. Também é concebível um processo semi-contínuo, tal como o descrito no documento GB-A-1009370. Um resumo de métodos de cultura conhecidos encontra-se descrito no livro de Chmiel ou no livro de Storhas. O meio de cultura a utilizar deverá satisfazer de um modo adequado as necessidades das respectivas estirpes. Descrições de meios de cultura de diferentes estirpes de leveduras são apresentadas, por exemplo, por Klaus Wolf, 1996.

[085] As células de acordo com um qualquer aspecto da presente invenção podem ser procariotas ou eucariotas. Estas podem ser células de mamíferos (tais como, por exemplo, células provenientes do homem), células de plantas ou microrganismos, tais como leveduras, fungos ou bactérias, em que os microrganismos são particularmente preferidos e as bactérias e leveduras ainda mais preferidas.

[086] Como bactérias, leveduras ou fungos adequados refere-se, em particular, aquelas bactérias, leveduras ou fungos que se encontram depositados em ‘Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen’ (Coleção Alemã de Microrganismos e Culturas de Células) GmbH (DSMZ), Brunswick, Alemanha, como estirpes bacterianas, de leveduras ou fúngicas. As bactérias adequadas de acordo com a invenção pertencem aos géneros listados em:

[087] - http://www.dsmz.de/species/bacteria.htm,

[088] as leveduras adequadas de acordo com a invenção pertencem ao género listado em:

[089] - http://www.dsmz.de/species/yeasts.htm

[090] e os fungos adequados de acordo com a invenção são aqueles listados em:

[091] - http://www.dsmz.de/species/fungi.htm.

[092] Em particular, as células podem ser selecionadas entre o conjunto constituído pelos géneros Aspergillus, Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus, Acinetobacter, Alcaligenes, Lactobacillus, Paracoccus, Lactococcus, Candida, Pichia, Hansenula, Kluyveromyces, Saccharomyces, Escherichia, Zymomonas, Yarrowia, Methylobacterium, Ralstonia, Pseudomonas, Rhodospirillum, Rhodobacter, Burkholderia, Clostridium e Cupriavidus. Mais particularmente, as células podem ser selecionadas entre o conjunto constituído por Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Alcaligenes latus, Bacillus megaterium, Bacillus subtilis, Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum, Burkholderia andropogonis, B. brasilensis, B. caledonica, B. caribensis, B. caryophylli, B. fungorum, B. gladioli, B. glathei, B. glumae, B. graminis, B. hospita, B. kururiensis, B. phenazinium, B. phymatum, B. phytofirmans, B. plantarii, B. sacchari, B. singaporensis, B. sordidicola, B. terricola, B. tropica, B. tuberum, B. ubonensis, B. unamae, B. xenovorans, B. anthina, B. pyrrocinia, B. thailandensis, Candida blankii, Candida rugosa, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium efficiens, Escherichia coli, Hansenula polymorpha, Kluveromyces lactis, Methylobacterium extorquens, Paracoccus versutus, Pseudomonas argentinensis, P. borbori, P. citronellolis, P. flavescens, P. mendocina, P. nitroreducens, P. oleovorans, P. pseudoalcaligenes, P. resinovorans, P. straminea, P. aurantiaca, P. aureofaciens, P. chlororaphis, P. fragi, P. lundensis, P. taetrolens, P. antarctica, P. azotoformans, 'P. blatchfordae', P. brassicacearum, P. brenneri, P. cedrina, P. corrugata, P. fluorescens, P. gessardii, P. libanensis, P. mandelii, P. marginalis, P. mediterranea, P. meridiana, P. migulae, P. mucidolens, P. orientalis, P. panacis, P. proteolytica, P. rhodesiae, P. synxantha, P. thivervalensis, P. tolaasii, P. veronii, P. denitrificans, P. pertucinogena, P. cremoricolorata, P. fulva, P. monteilii, P. mosselii, P. parafulva, P. putida, P. balearica, P. stutzeri, P. amygdali, P. avellanae, P. caricapapayae, P. cichorii, P. coronafaciens, P. ficuserectae, 'P. helianthi', P. meliae, P. savastanoi, P. syringae, P. tomato, P. viridiflava, P. abietaniphila, P. acidophila, P. agarici, P. alcaliphila, P. alkanolytica, P. amyloderamosa, P. asplenii, P. azotifigens, P. cannabina, P. coenobios, P. congelans, P. costantinii, P. cruciviae, P. delhiensis, P. excibis, P. extremorientalis, P. frederiksbergensis, P. fuscovaginae, P. gelidicola, P. grimontii, P. indica, P. jessenii, P. jinjuensis, P. kilonensis, P. knackmussii, P. koreensis, P. lini, P. lutea, P. moraviensis, P. otitidis, P. pachastrellae, P. palleroniana, P. papaveris, P. peli, P. perolens, P. poae, P. pohangensis, P. psychrophila, P. psychrotolerans, P. rathonis, P. reptilivora, P. resiniphila, P. rhizosphaerae, P. rubescens, P. salomonii, P. segitis, P. septica, P. simiae, P. suis, P. thermotolerans, P. aeruginosa, P. tremae, P. trivialis, P. turbinellae, P. tuticorinensis, P. umsongensis, P. vancouverensis, P. vranovensis, P. xanthomarina, Ralstonia eutropha, Rhodospirillum rubrum, Rhodobacter sphaeroides, Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica e Zymomonas mobile. Ainda mais particularmente, as células podem ser selecionadas entre o conjunto constituído por Pseudomonas putida, Escherichia coli e Burkholderia thailandensis.

[093] De acordo com um qualquer aspecto da presente invenção, as células no seu estado selvagem podem ser incapazes de formar quantidades detectáveis de ramnolipídeos e/ou terem nenhuma ou nenhuma atividade detectável das enzimas E1, E2, E3 e/ou oxido-redutase.

[094] De acordo com um qualquer aspecto da invenção, é vantajoso que a célula seja capaz, no seu estado selvagem, de formar poli-hidroxialcanoatos com comprimentos de cadeia de mono-alcanoato de C6 a C16. Tais células são, por exemplo, Burkholderia sp., Burkholderia thailandensis, Pseudomonas sp., Pseudomonas putida, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas oleovorans, Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas citronellolis, Pseudomonas resinovorans, Comamonas testosteroni, Aeromonas hydrophila, Cupriavidus necator, Alcaligenes latus e Ralstonia eutropha. Neste sentido, as células de acordo com um qualquer aspecto da presente invenção podem ser geneticamente modificadas de um modo tal que, em comparação com o seu tipo selvagem, estas sejam capazes de formar menos poli-hidroxialcanoatos. Tais células encontram-se descritas, por exemplo, pelo menos por De Eugenio et al., 2010, e Rehm et al., 2001. Uma tal célula recombinante, capaz de formar menos poli-hidroxialcanoatos com o seu tipo selvagem, é, em particular, caracterizado pelo fato de, em comparação com o seu tipo selvagem, ter uma atividade diminuída de pelo menos uma enzima E9 ou E10.

[095] A E9 representa uma poli-hidroxialcanoato sintase, EC:2.3.1., em particular, que tem a sequência de polipeptídeos SEQ ID NO:20 (E9a) ou SEQ ID NO:21 (E9b) ou que tem uma sequência de polipeptídeos em que até 25%, 20%, 15%, em particular, até 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% dos radicais aminoácidos, em comparação com a respectiva sequência de referência SEQ ID NO:20 ou SEQ ID NO:21, são modificados por supressão, inserção, substituição ou uma sua combinação e que tem ainda pelo menos 10%, 50%, 80%, em particular, mais de 90% da atividade enzimática da enzima que tem a respectiva sequência de referência SEQ ID NO:20 SEQ ID NO:21, em que a atividade enzimática para uma enzima E9 (E9a e E9b) pode ser entendida como a aptidão para converter 3-hidroxialcanoíl-coenzima A em ácido poli-3-hidroxialcanóico e, em particular, 3-hidroxitetradecanoíl-coenzima A em ácido poli-3-hidroxitetradecanóico.

[096] A E10 representa uma 3-hidroxialcanoíl-ANTICORPO:coenzima A transferase, em particular, que tem a sequência de polipeptídeos SEQ ID NO:22 (E10a) ou SEQ ID NO:23 (E10b) ou que tem uma sequência de polipeptídeos em que até 25%, 20%, 15%, em particular, até 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% dos radicais aminoácidos são modificados, em comparação com a respectiva sequência de referência SEQ ID NO:22 ou SEQ ID NO:23, por supressão, inserção, substituição ou uma sua combinação e que tem ainda pelo menos 10%, 50%, 80%, em particular, mais de 90% da atividade enzimática da enzima que tem a respectiva sequência de referência SEQ ID NO:22 (E10a) ou SEQ ID NO:23 (E10b), em que a atividade enzimática para uma enzima E10 (E10a e E10b) pode ser entendida como a aptidão para converter 3-hidroxialcanoíl-ACP em 3-hidroxi-alcananoíl-coenzima A e, em particular, 3-hidroxialcananoíl-ACP em 3-hidroxitetradecanoíl-coenzima A.

[097] A atividade da enzima E9 (E9a e E9b) pode ser determinada, por exemplo, utilizando as amostras obtidas conforme descrito antes para as enzimas E1 a E3, misturando, em primeiro lugar, 560 μL de tris/HCl 100 mM, pH 7,5, 20 μL de 35 DTNB mM em DMSO e 20 μL de 3-hidroxidecanoíl-coenzima A 41 mM. Subsequentemente, adiciona-se 5 μg de enzima E9 purificada em 100 μL de tris/HCl, pH 7,5 e depois regista-se o aumento na extinção a 412 nm (provocado pela adição de 5,5’-ditiobis-(2-nitrobenzoato) (DTNB) a grupos SH livres) ao longo do tempo (ΔE/minuto), continuamente durante 1 minuto em um espectrofotómetro.

[098] A atividade da enzima E10 (E10a e E10b) pode ser determinada, por exemplo, utilizando as amostras obtidas tal como descrito antes para as enzimas E1 a E3. O ensaio padrão pode conter MgCl2 3 mm, hidroxidecanoíl- coenzima A 40 μm e E. coli ACP 20 μm em tris-HCl 50 mm, pH 7,5, em um volume total de 200 μL. Dá-se início à reação por meio da adição de 5 μg de enzima E10 purificada em 50 μL de tris/HCl, pH 7,5 e mantém-se a incubar durante 1 hora a 30°C. Interrompe-se a reação por meio da adição de ácido tricloroacético 50% (p/v) e 10 mg/mL de BSA (30 μL). A coenzima A libertada pode ser determinada espectrofotometricamente por registo do aumento na extinção a 412 nm, provocado pela adição de 5,5’-ditiobis-(2-nitrobenzoato) (DTNB) a grupos SH livres, ao longo do tempo.

[099] A expressão “atividade diminuída de uma enzima Ex” utilizada como referência a um qualquer aspecto da presente invenção pode ser entendia como designando uma atividade diminuída por um fator de pelo menos 0,5, em particular, de pelo menos 0,1, mais particularmente, de pelo menos 0,01, ainda mais particularmente, de pelo menos 0,001 e, muito mais particularmente, de pelo menos 0,0001. A expressão “atividade diminuída” também compreende sem atividade detectável (“atividade de zero”). A diminuição na atividade de uma determinada enzima pode ser efetuada, por exemplo, por mutação seletiva ou por outras medidas conhecidas pelos especialistas na matéria para a diminuição da atividade de uma determinada enzima.

[100] Em particular, um especialista na matéria poderá encontrar instruções para a modificação e diminuição da expressão de proteína e concomitante redução da atividade enzimática, em particular, para Pseudomonas e Burkholderia, por meio da interrupção de genes específicos, por exemplo, os descritos pelo menos por Dubeau et al. 2009., Singh & Rohm. 2008., Lee et al., 2009 e semelhantes.

[101] As células de acordo com um qualquer aspecto da presente invenção são caracterizadas pelo fato de a diminuição na atividade enzimática ser alcançada por modificação de um gene que compreende uma das sequências de ácidos nucleicos, em que a modificação é selecionado entre o conjunto constituído pela inserção de DNA exógeno no gene, supressão de pelo menos partes do gene, mutações pontuais na sequência do gene, interferência de RNA (siRNA), RNA ou modificação antisense (inserção, supressão ou mutações pontuais) de sequências regulatórias, tais como, por exemplo, promotores e terminadores ou de locais de ligação de ribossoma, que flanqueiam o gene.

[102] O DNA exógeno deverá ser entendido, neste contexto, como significando qualquer sequência de DNA que seja “exógena” ao gene (e não ao organismo), isto é, as sequências de DNA endógenas também funcionam neste sentido como “DNA exógeno”. Neste contexto, é particularmente preferido que o gene seja interrompido por inserção de um gene marcador de seleção, assim, o DNA exógeno é um gene marcador de seleção, em que, de preferência, a inserção é efetuada por recombinação homóloga no local do gene.

[103] Em particular, as células que podem ser utilizadas de acordo com um qualquer aspecto da presente invenção podem ser células de Pseudomonas putida, as quais apresentam uma síntese diminuída em poli- hidroxialcanoato em comparação com o seu tipo selvagem. Tais células encontram-se descritas, por exemplo, pelo menos como KTOY01 e KTOY02 em Ren et al.,1998, Huisman et al., 1991, De Eugenio et al., 2010 e Ouyang et al. 2007.

[104] Os ramnolipídeos formados de acordo com o método da presente invenção podem ser pelo menos de fórmula estrutural (I) ou seus sais,

[105] fórmula (I)

[106] em que

[107] m = 2, 1 ou 0 e, em particular, 1 ou 0,

[108] n = 1 ou 0 e, em particular, 1,

[109] R1 e R2 = de um modo independente entre si, representam radicais orgânicos idênticos ou diferentes com 2 a 24, de preferência, 5 a 13 átomos de carbono, em particular, radicais alquilo facultativamente ramificados, facultativamente substituídos, em particular, substituídos com hidroxi, facultativamente insaturados, em particular, facultativamente mono-, di- ou tri- insaturados, que podem ser selecionados entre o conjunto constituído por pentenilo, heptenilo, nonenilo, undecenilo e tridecenilo e (CH2)o-CH3 com o = 1 a 23 e, de preferência, 4 a 12.

[110] Para o caso em que a célula de acordo com um qualquer aspecto da invenção é capaz de formar um ramnolipídeo com m=1, então o radical pode ser

[111] definido por meio de R1 e R2 e é derivado do ácido 3-hidroxioctanoíl- 3-hidroxioctanóico, ácido 3-hidroxioctanoíl-3-hidroxidecanóico, ácido 3- hidroxidecanoíl-3-hidroxioctanóico, ácido 3-hidroxioctanoíl-3-hidroxidecenóico, 3-ácido hidroxidecenoíl-3-hidroxioctanóico, ácido 3-hidroxioctanoíl-3-hidroxi- dodecanóico, ácido 3-hidroxidodecanoíl-3-hidroxioctanóico, ácido 3-hidroxi- octanoíl-3-hidroxidodecenóico, ácido 3-hidroxidodecenoíl-3-hidroxioctanóico, ácido 3-hidroxidecanoíl-3-hidroxidecanóico, ácido 3-hidroxidecanoíl-3-hidroxi- decenóico, ácido 3-hidroxidecenoíl-3-hidroxidecanóico, ácido 3-hidroxidecenoíl- 3-hidroxidecenóico, ácido 3-hidroxidecanoíl-3-hidroxidodecanóico, ácido 3- hidroxidodecanoíl-3-hidroxidecanóico, ácido 3-hidroxidecanoíl-3-hidroxi- dodecenóico, ácido 3-hidroxidecanoíl-3-hidroxitetradecenóico, ácido 3-hidroxi- tetradecanoíl-3-hidroxidecenóico, ácido 3-hidroxidodecenoíl-3- hidroxidecanóico, ácido 3-hidroxidecanoíl-3-hidroxitetradecanóico, ácido 3- hidroxitetradecanoíl-3-hidroxidecanóico, ácido 3-hidroxidecanoíl-3- hidroxitetradecenóico, ácido 3-hidroxitetradecenoíl-3-hidroxidecanóico, ácido 3- hidroxidodecanoíl-3-hidroxidodecanóico, ácido 3-hidroxidodecenoíl-3- hidroxidodecanóico, ácido 3-hidroxidodecanoíl-3-hidroxidodecenóico, ácido 3- hidroxidodecanoíl-3-hidroxitetradecanóico, ácido 3-hidroxitetradecanoíl-3- hidroxidodecanóico, ácido 3-hidroxitetradecanoíl-3-hidroxitetradecanóico, ácido 3-hidroxihexadecanoíl-3-hidroxitetradecanóico, ácido 3-hidroxitetradecanoíl-3- hidroxihexadecanóico ou ácido 3-hidroxihexadecanoíl-3-hidroxihexadecanóico.

[112] É óbvio para um especialista na matéria que, de acordo com um qualquer aspecto da presente invenção, é possível formar misturas de diferentes ramnolipídeos de fórmula estrutural (I).

[113] Neste sentido, as células de acordo com um qualquer aspecto da presente invenção podem ser capazes de formar misturas de ramnolipídeos de fórmula estrutural (I), que são caracterizadas pelo fato de em mais de 80% em peso, mais de 90% em peso, em par5ticular, mais de 95% em peso, dos ramnolipídeos formados n ser igual a 1 e o radical definido por R1 e R2 ser derivado em menos de 10% em peso, menos de 5% em peso, em particular, menos de 2% em peso, de ramnolipídeos formados a partir do ácido 3- hidroxidecanoíl-3-hidroxioctanóico ou do ácido 3-hidroxioctanoíl-3- hidroxidecanóico,

[114] em que a % em peso indicada diz respeito à soma de todos os ramnolipídeos de fórmula estrutural (I) formados.

[115] Uma vez que as células de acordo com um qualquer aspecto da presente invenção podem ser utilizadas vantajosamente para a produção de ramnolipídeos e uma vez que estes lipídeos são subsequentemente facultativamente purificados, é vantajoso se as células de acordo com um qualquer aspecto da presente invenção tiverem uma atividade aumentada, em comparação com a de tipo selvagem, de pelo menos uma enzima E8, que catalisa a exportação de um ramnolipídeo de fórmula estrutural (I) a partir da célula para o meio envolvente.

[116] Neste sentido, as proteínas E8 são selecionadas entre o conjunto constituído por

[117] uma enzima E8 que tem uma sequência de polipeptídeos SEQ ID NO:16 (E8a), SEQ ID NO:17 (E8b), SEQ ID NO:18 (E8c) ou SEQ ID NO:19 (E8d) ou que tem uma sequência de polipeptídeos em que até 25%, até 20%, em particular, até 15%, em particular, até 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 35, 25, 1% dos radicais aminoácidos são modificados por supressão, inserção, substituição ou uma sua combinação, em comparação com a respectiva sequência de referência SEQ ID NO:16 (E8a), SEQ ID NO:17 (E8b), SEQ ID NO:18 (E8c) ou SEQ ID NO:19 (E8d), e que tem ainda pelo menos 50%, 65%, em particular, 80%, em particular, mais de 90% da atividade enzimática da enzima que tem a respectiva sequência de referência SEQ ID NO:16 (E8a), SEQ ID NO:17 (E8b), SEQ ID NO:18 (E8c) ou SEQ ID NO:19 (E8d), em que a atividade enzimática para uma enzima E8 (E8a, E8b E8c e E8d) é entendida como a aptidão para exportar um ramnolipídeo de fórmula estrutural (I) da célula para o meio envolvente.

[118] Quadro 1. Sequências das enzimas utilizadas de acordo com um qualquer aspecto da presente invenção.

[119] DESCRIÇÃO ABREVIADA DAS FIGURAS

[120] A figura 1 é um gráfico que ilustra a composição em percentagem dos produtos ramnolipídeos formados em função de diferentes fontes de carbono.

[121] EXEMPLOS

[122] A seguir são descritas variantes preferidas, as quais, conforme entendido pelos especialistas na matéria, poderão ser submetidas a variações ou modificações na concepção, construção ou operação sem se afastarem do âmbito das reivindicações. Estas variações, por exemplo, pretendem estar abrangidas pelo âmbito das reivindicações.

[123] Na produção de ramnolipídeos por Pseudomonas putida, antes de se determinar a concentração em produto nos diferentes exemplos, as amostras de reacção são diluídas imediatamente após a fermentação com acetona em uma proporção em volume de 1:1 e são centrifugadas a 21000 g e 4°C durante 2 minutos. Mede-se então o sobrenadante da amostra por HPLC.

[124] Exemplo 1 (um exemplo de comparação, não da invenção)

[125] Produção de ramnolipídeos com BS-PP-001 a partir de glicose

[126] Em uma placa de ágar-ágar LB que contém 50 mg/L de canamicina, um arco de inoculação de criocultura em glicerol da estirpe Pseudomonas putida KT2440 pBBR1MCS-2::ABC (BS-PP-001) foi colocado sob a forma de uma risca. O método de produção do vetor pBBR1MCS-2::ABC é proporcionado no exemplo 2 do documento DE102010032484A1. A Pseudomonas putida é então transformada com o vetor e armazenada. A placa de ágar-ágar é mantida a incubar durante 24 horas a 30°C. Um frasco de 100 mL com pás que contém 25 mL de meio LB com canamicina foi mantido a inocular com uma cultura individual de placa de ágar-ágar sobredesenvolvida e foi mantida a incubar em uma incubadora sob agitação durante 24 horas a 30°C e 200 r.p.m. para produzir uma pré-cultura. A pré-cultura foi submetida a centrifugação a 5500 g à temperatura ambiente durante 10 minutos. O sobrenadante foi então deitado fora. Colocou-se novamente em suspensão o aglomerado em 25 mL de meio M9 (composição: 6,8 g/L de Na2PO4.2H2O, 2,4 g/L de KH2PO4, 0,4 g/L de NaCl, 1,6 g/L de NH4Cl, 0,5 g/L de MgSO4.7H2O, 1 mL de solução de elementos vestigiais US3, constituída por 36,5 g/L de ácido clorídrico a 37%, 1,91 g/L de MnCl2.4H2O, 1,87 g/L de ZnSO4.7H2O, 0,84 g/L de Na-EDTA.2H2O, 0,3 g/L de H3BO3, 0,25 g/l de Na2MoO4.2H2O, 4,7 g/L de CaCl2.2H2O, 17,3 g/L de FeSO4.7H2O, 0,15 g/L de CuCl2.2H2O). Este passo de lavagem foi então repetido.

[127] Em um fermentador de 300 mL, adicionou-se 180 mL de meio M9, tal como descrito antes, com 20 g/L de glicose e com 50 mg/L de canamicina. Inoculou-se o fermentado com um volume grande de suspensão de pré-cultura para atingir um OD600 inicial de 0,4. Os parâmetros seguintes foram fixados durante a fermentação: gaseificação com ar 2 NL/h, concentração de oxigénio dissolvido ajustada a 30% através do ajuste da velocidade do agitador. Esta medição é efectuada utilizando um sensor de oxigénio padrão, temperatura de 30°C, valor inicial de pH de 7,4 (não regulado ao longo da experiência). Após 40 horas de fermentação, alimentou-se uma solução de glicose (concentração no fermentador de: 15 g/L) através de uma seringa. Em períodos de tempo específicos, foram recolhidas amostras do fermentador para determinar a concentração em ramnolipídeos e em dímeros de ácido gordo produzidos.

[128] Os resultados são apresentados no quadro 2 seguinte e na figura 1.

[129] Exemplo 2

[130] Produção de ramnolipídeos com BS-PP-001 a partir de ácido butírico

[131] A pré-cultura foi feita de um modo análogo ao descrito no exemplo 1 com glicose.

[132] Em um fermentador de 300 mL, adicionou-se 180 mL de meio M9, tal como descrito no exemplo 1, a 6,5 g/L de butirato de sódio e 50 mg/L de canamicina. Inoculou-se o fermentador com um volume grande de suspensão de pré-cultura para atingir um OD600 inicial de 0,4. Os parâmetros seguintes foram fixados durante a fermentação: gaseificação com ar 2 NL/h, velocidade do agitador a 300 r.p.m., temperatura 30°C, valor inicial de pH de 7,4 (não regulado ao longo da experiência). Após 40 horas de fermentação, alimentou- se uma solução de butirato de sódio (concentração no fermentador: 5 g/L de ácido butírico) através de uma seringa. A velocidade do agitador foi aumentada até 900 r.p.m..

[133] Em períodos de tempo específicos, foram recolhidas amostras do fermentador para determinar a concentração em ramnolipídeos e em dímeros de ácido gordo produzidos.

[134] Os resultados são apresentados no quadro 2 seguinte e na figura 1.

[135] Exemplo 3

[136] Produção de ramnolipídeos utilizando BS-PP-001 + alqB a partir de n-butano

[137] Em uma placa larga de ágar-ágar LB que contém 50 mg/L de canamicina, um arco de inoculação cheio de criocultura em glicerol da estirpe P. putida pBBR1MCS-2::ABC pBT10 (BS-PP001 + alqB) foi colocado sob a forma de riscas. Esta estirpe foi produzida por adição, à estirpe do exemplo 1, da construção de gene pBT10, conforme descrita nas páginas 36 e 37 (SEQ-ID 31) do documento WO 2009/077461A1. Manteve-se a placa de ágar-ágar a incubar durante 24 horas a 30°C.

[138] Três frascos de 100 mL com pás foram carregados com 25 mL de meio LB que contém canamicina e, cada um deles, foi inoculado com uma cultura individual de placa de ágar-ágar sobre-desenvolvida e manteve-se a incubar em uma incubadora com agitação durante 24 horas a 30°C e 200 r.p.m..

[139] Três frascos de um litro com pás, foram utilizados, cada um, para misturar 75 mL de meio M9 modificado (composição: 15 g/L de glicose, 6,8 g/L de Na2PO4, 3 g/L de KH2PO4, 0,5 g/L de NaCl, 2 g/L de NH4Cl, 15 g/L de extracto de levedura, 0,49 g/L de MgSO4x7H2O, 50 mg/L de sulfato de canamicina, 15 mL/L de solução de elementos vestigiais US3 constituída por 36,5 g/L de ácido clorídrico a 37%, 11,91 g/L de MnCl2.4H2O, 1,87 g/L de ZnSO4.7H2O, 0,84 g/L de Na-EDTA.2H2O, 0,3 g/L de H3BO3, 0,25 g/L de Na2MoO4.2H2O, 4,7 g/L de CaCl2.2H2O, 17,3 g/L de FeSO4.7H2O, 0,15 g/L de CuCl2.2H2O) e a pré-cultura dos frascos de 100 mL. Manteve-se as culturas a incubar a 30°C e 200 r.p.m.. Após 3 horas de incubação, activou-se os genes alqBGT por adição de diciclopropilcetona 0,4 mM. Manteve-se as culturas a incubar durante mais 16 horas a 25°C e 200 r.p.m..

[140] Combinou-se as culturas nos três frascos e centrifugou-se a 5500 g à temperatura ambiente durante 10 minutos. Deitou-se fora o sobrenadante. Colocou-se novamente em suspensão o aglomerado em 25 mL de meio M9 (cuja composição é proporcionada antes). Repetiu-se este passo de lavagem para a remoção de glicose e de outras possíveis fontes de carbono.

[141] Em um fermentador de 300 mL, adicionou-se 180 mL de meio M9 (cuja composição é proporcionada antes sem uma fonte de carbono), 50 mg/L de canamicina. Inoculou-se o fermentador com um volume grande de suspensão de pré-cultura proveniente do passo anterior para se atingir uma OD600 inicial de 10. Fixou-se os parâmetros seguintes durante a fermentação: gaseificação com uma mistura de butano/ar (25%/75%) 2 NL/h, velocidade do agitador fixada a 900 r.p.m., temperatura 30°C, valor inicial de pH de 7,4 (não regulado ao longo da experiência). Em períodos de tempo específicos, foram recolhidas amostras do fermentador para determinar a concentração em ramnolipídeos e em dímeros de ácido gordo produzidos. Os resultados são apresentados no quadro 2 seguinte e na figura 1.

[142] Quadro 2. Concentrações finais de ramnolipídeos e de dímeros de ácido gordo produzidos com base no substrato utilizado.

[143] Tal como pode ser observado, o quadro 2 mostra que a estirpe equipada com os genes rhlA, rhlB e rhlC de P. aeruginosa da espécie P. putida KT2440 (BS-PP-001) foi capaz de produzir cerca de 1 g/L de produtos, dos quais cerca de 110 mg/L eram di-ramnolipídeo e 81 mg/L eram mono- ramnolipídeo, bem como quase 800 mg de dímeros de ácido gordo indesejados, quando a glicose foi utilizada como substrato.

[144] Quando se utilizou butirato como única fonte de carbono, a quantidade de di-ramnolipídeo aumentou significativamente, ao passo que apenas se formou cerca de um terço de dímeros de ácido gordo indesejados. Em um outro exemplo, uma estirpe foi geneticamente modificada de forma a introduzi oxido-redutase AlqB de Pseudomonas putida GPO1 e foi alimentada com butano, como finte única de carbono. os resultados apresentados no quadro 2 mostram que foram formados até mais de 1000 mg/l de di- ramnolipídeo e foram produzidas quantidades não mensuráveis de dímeros de ácido gordo indesejados.

[145] Os resultados na figura 1 também ilustram a composição em percentagem do produto formado dependendo das diferentes fontes de carbono. é possível observar que a utilização de butirato reduz a quantidade de dímeros de ácido gordo indesejados de 81% até 64% e, com a utilização de butano e butanol, a quantidade de dímeros de ácido gordo formada não é mensurável.

[146] Exemplo 4

[147] Produção de ramnolipídeos utilizando BS-PP-001 + alqB a partir de 1-butanol

[148] Carregou-se três frascos de 100 mL, com pás, com 25 mL de meio LB que contém canamicina e tetraciclina e inoculou-se, cada um deles, com 100 μl de uma criocultura em glicerol da estirpe P. putida pBBRI MCS-2::ABC pBT10 (BS-PP001 + alqB). Esta estirpe foi produzida por adição, à estirpe do exemplo 1, da construção de gene pBT10, conforme descrito nas páginas 36 e 37 (SEQ-ID 31) do documento WO 2009/077461A1. Manteve-se os frascos a incubar em uma incubadora sob agitação durante 24 horas a 30°C e 200 r.p.m..

[149] Utilizou-se cada um de três frascos de 1 litro com pás para misturar 75 mL de meio M9 modificado (composição: 15 g/L de glicose, 6,8 g/L de Na2PO4, 3 g/L de KH2PO4, 0,5 g/L de NaCl, 2 g/L de NH4Cl, 15 g/L de extracto de levedura, 0,49 g/L de MgSO4x7H2O, 50 mg/L de sulfato de canamicina, 10 mg/l de tetraciclina, 15 ml/L de solução de elementos vestigiais US3 constituída por 36,5 g/L de ácido clorídrico a 37%, 11,91 g/L de MnCl2.4H2O, 1,87 g/L de ZnSO4.7H2O, 0,84 g/L de Na-EDTA.2H2O, 0,3 g/L de H3BO3, 0,25 g/L de Na2MoO4.2H2O, 4,7 g/L de CaCl2.2H2O, 17,3 g/L de FeSO4.7H2O, 0,15 g/L de CuCl2.2H2O) e a pré-cultura dos frascos de 100 mL. Manteve-se as culturas a incubar a 30°C e 200 r.p.m.. Após 3 horas de incubação, activou-se os genes alqBGT por adição de diciclopropilcetona 0,4 mM. Manteve-se as culturas a incubar durante mais 4 horas a 30°C e 200 r.p.m..

[150] Combinou-se as culturas nos três frascos e centrifugou-se a 5500 g à temperatura ambiente durante 10 minutos. Deitou-se fora o sobrenadante. Colocou-se novamente em suspensão o aglomerado em 25 mL de meio M9 (cuja composição é proporcionada antes). Repetiu-se este passo de lavagem para a remoção de glicose e de outras possíveis fontes de carbono.

[151] Em um fermentador de 300 mL, adicionou-se 180 mL de meio M9 (cuja composição é proporcionada antes sem uma fonte de carbono), 50 mg/L de canamicina. Inoculou-se o fermentador com 10 mL de suspensão de pré- cultura proveniente do passo anterior para se atingir uma OD600 inicial de 5. Fixou-se os parâmetros seguintes durante a fermentação: gaseificação com ar 3 NL/h, velocidade do agitador a 700 r.p.m., temperatura 30°C, valor inicial de pH de 7,0 (regulado ao longo da experiência com uma solução de amónia a 5%). A solução de butanol foi alimentada através de uma seringa (taxa de alimentação 0,2 g/(Lh)). Em períodos de tempo específicos, foram recolhidas amostras do fermentador para determinar a concentração em ramnolipídeos e em dímeros de ácido gordo produzidos. Os resultados são apresentados no quadro 2 anterior. REFERÊNCIAS 1. Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology, 2010, páginas 3037-51 2. Leitermann et al., 2009 3. Hermann et al., (Electrophoresis, 22: 1712.23 (2001) 4. Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. USA, 1989 5. Lohaus and Meyer (1989) Biospektrum, 5: 32-39; Lottspeich (1999) Angewandte Chemie 111: 2630-2647 6. Wilson et al. (2001) Journal of Bacteriology, 183: 2151-2155 7. Donahue et al. (2000) Journal of Bacteriology 182 (19): 5624-5627 8. Ray et al. (2000) Journal of Bacteriology 182 (8): 2277-2284 9. Freedberg et al. (1973) Journal of Bacteriology 115 (3): 816-823 10. Lohaus et al., Biospektrum 5 32-39 (1998) 11. Lottspeich, Angewandte Chemie 111: 2630-2647 (1999) 12. Wilson et al., Journal of Bacteriology 183: 2151-2155 (2001) 13. Martin et al. Bio/Technology 5, 137-146 (1987) 14. Guerrero et al. Genes 138, 35-41 (1994) 15. Tsuchiya and Morinaga Bio/Technology 6, 428-430 (1988) 16. Eikmanns et al. Genes 102, 93-98 (1991)) 17. Schwarzer and Pühler Bio/Technology 9, 84-87 (1991) 18. Reinscheid et al. Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994) 19. LaBarre et al. Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993) 20. Malumbres et al. Genes 134, 15-24 (1993) 21. Jensen and Hammer Biotechnology and Bioengineering 58, 191195 (1998) 22. Glover, D. M. (1985) DNA cloning: a practical approach, Vol. I-III, IRL Press Ltd., Oxford 23. Rodriguez, R.L. and Denhardt, D. T (eds) (1988) Vetors: a survey of molecular cloning vetors and their uses, 179-204, Butterworth, Stoneham 24. Goeddel, D. V. (1990) Systems for heterologous gene expression, Methods Enzymol. 185, 3-7 25. Sambrook, J.; Fritsch, E. F. and Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York 26. Schãfer et al., Applied and Environmental Microbiology 60: 756759 (1994) 27. Thierbach et al., Applied Microbiology and Biotechnology 29: 356-362 (1988) 28. Dunican and Shivnan, Bio/Technology 7: 1067-1070 (1989) 29. Tauch et al., FEMS Microbiology Let-ters 123: 343-347 (1994) 30. De Eugenio et al., Environ Microbiol. 2010. 12(1):207-21 31. Rehm et al., Appl Environ Microbiol. 2001. 67(7):3102-9 32. Dubeau et al. 2009. BMC Microbiology 9:263 33. Singh & Rohm. Microbiology. 2008. 154:797-809 34. Lee et al. FEMS Microbiol Lett. 2009. 297(1):38-48 35. Ren et al., Journal Applied Microbiology and Biotechnology 1998 Jun, 49(6):743-50 36. Huisman et al., J Biol Chem. 1991 Feb 5;266(4):2191-8 37. De Eugenio et al., Environ Microbiol. 2010. 12(1):207-21 38. Ouyang et al. Macromol Biosci. 2007. 7(2):227-33 39. “Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik” [Bioprocess Technology 1. Introduction to the Bioprocess Technique] (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) 40. ”Bioreaktoren und periphere Einrichtungen” [Bioreactors and Peripheral Devices], Vieweg Verlag, Brunswick/Wiesbaden, 1994 41. “Nonconventional yeast in biotechnology” (Ed. Klaus Wolf, Springer-Verlag Berlin, 1996) 42. Scheps, D., Malca, H., Hoffmann, B., Nestl, B. M, und Hauer, B. (2011) Org. Biomol. Chem., 9, 6727 43. Documentos WO 2012013554A1, DE-A-10031999, GB-A- 1009370, EP-A-0 472 869, US 4 601 893, WO-A-96/15246, JP-A-10-229891, WO 2009/077461A1 44. Burger, M. M., et al., 1963. J. Biol. Chem. 238:2595-2602. Burger, M. M.,et al., 1966. Methods Enzymol. 8:441-445.

Claims

1. Método para a preparação de pelo menos um ramnolipídeo, caracterizado por compreender: - fazer contactar uma célula recombinante com um meio que contém uma fonte de carbono e - desenvolver em cultura a célula sob condições adequadas para a preparação do ramnolipídeo a partir da fonte de carbono pela célula, em que a célula recombinante é produzida pela transformação, transdução, conjugação ou uma combinação destes métodos, utilizando um vetor que contém os genes que codificam enzimas E1, E2 e E3, tornando possível a expressão dos genes na célula, em que a expressão dos genes aumenta a atividade das enzimas E1, E2 e E3, em comparação com o tipo selvagem da célula, em que a enzima E1 é uma α/β hidrolase, a enzima E2 é uma ramnosil- transferase I e a enzima E3 é uma ramnosil-transferase II, e em que o tipo selvagem da célula contém nenhum ou pelo menos nenhuma atividade detectável das enzimas E1, E2 e E3 e as células recombinantes mostram uma atividade detectável de enzimas E1, E2 e E3em que a célula é uma célula bacteriana ou levedura e em que a fonte de carbono é uma molécula C4.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a molécula C4 ser selecionada entre o conjunto constituído por butano, 1-butanol, 2-butanol, 1-butanal, butanona, ácido butírico e suas combinações.

3. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado por a célula ter sido geneticamente modificada para que, em comparação com o tipo selvagem da célula, a célula tenha uma atividade aumentada da enzima oxido-redutase.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por a oxido-redutase ser selecionada entre o conjunto constituído por oxido-redutase de tipo alqB, mono-oxigenase e álcool desidrogenase dependente de NAD(P)H (ADH).

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por a célula recombinante ter uma atividade aumentada das enzimas E1, E2, E3 e oxido-redutase em comparação com o tipo selvagem da célula e em que a molécula C4 é butano.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por o meio compreender pelo menos 40% em peso do teor total em carbono no meio de moléculas C4.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por - a enzima E1 ser capaz de catalisar a conversão de 3-hidroxialcanoíl- ACP via ácido 3-hidroxialcanoíl-3-hidroxialcanóico-ACP em ácido hidroxialcanoíl-3-hidroxialcanóico, - a enzima E2 ser capaz de catalisar a conversão de dTDP-ramnose e 3-hidroxialcanoíl-3-hidroxialcanoato em a-L-ramnopiranosil-3-hidroxialcanoíl-3- hidroxialcanoato e - a enzima E3 ser capaz de catalisar a conversão de dTDP-ramnose e a-L-ramnopiranosil-3-hidroxialcanoíl-3-hidroxialcanoato em α-L-ramnopiranosil- (1-2)-a-L-ramnopiranosil-3-hidroxialcanoíl-3-hidroxialcanoato.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por - a enzima E1 compreender uma sequência de aminoácidos selecionada entre o conjunto constituído por SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 e seus fragmentos, - a enzima E2 ser selecionada entre o conjunto constituído por SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 e seus fragmentos e - a enzima E3 ser selecionada entre o conjunto constituído por SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15 e seus fragmentos, em que o fragmento compreende uma sequência de polipeptídeos em que até 25% dos radicais aminoácidos são modificados por supressão, inserção, substituição ou uma sua combinação, em compactação com a sequência da respectiva enzima e o fragmento compreender pelo menos 10% da atividade enzimática da respectiva enzima.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado por a célula ser selecionada entre um género do conjunto constituído por Aspergillus, Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus, Acinetobacter, Alcaligenes, Lactobacillus, Paracoccus, Lactococcus, Candida, Pichia, Hansenula, Kluyveromyces, Saccharomyces, Escherichia, Zymomonas, Yarrowia, Methylobacterium, Ralstonia, Pseudomonas, Rhodospirillum, Rhodobacter, Burkholderia, Clostridium e Cupriavidus.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado por a célula ser selecionada entre o conjunto constituído por P. putida GPp121, P. putida GPp122, P. putida GPp123, P. putida GPp124 e P. putida GPp104, P. putida KT42C1, P. putida KTOY01 ou P. putida KTOY02.

11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado por o ramnolipídeo compreender a fórmula estrutural (I),

Fórmula estrutural (I) em que m = 2, 1 ou 0 e, em particular, 1 ou 0, n = 1 ou 0 e, em particular, 1, R1 e R2 = de um modo independente entre si, representam radicais orgânicos idênticos ou diferentes que possuem radicais alquilo com 2 a 24, facultativamente ramificados, facultativamente substituídos, substituídos com hidroxi, facultativamente insaturados ou facultativamente mono-, di- ou tri- insaturados.