CN1174574A - 棒状杆菌中调节基因表达的dna - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种DNA片段,它位于棒状杆菌苹果酸合成酶基因之前,并由此分离。任何编码蛋白质的结构基因均可插在该DNA片段的后面。将这样一个构建物转化到棒状杆菌之后,将调节插入到该DNA片段之后的结构基因的表达。本发明还涉及一种通过培养转化的棒状杆菌合成任一蛋白的方法。这种细菌含有一种可复制形式的来源于棒状杆菌苹果酸合成酶的DNA片段。编码待合成的蛋白质的结构基因插入到该片段的后面。由于编码待合成的蛋白质的结构基因的表达由位于其前面的DNA片段调节,一但合适的诱导剂加至培养基中,结构基因被表达,期望的蛋白质被合成。

Description

棒状杆菌中调节基因表达的DNA
本发明涉及棒状杆菌中调节基因表达的DNA。
生物体处于生长过程之中，因而提供了重新合成的细胞物质。因此，很多细胞组分，如氨基酸和卟啉从柠檬酸循环的代谢产物出发，进行重新合成(gebidet)。其前题是：由柠檬酸循环代谢产物进行重新合成。当微生物生长于乙酸盐、乙醇、或脂肪酸上时，柠檬酸循环的代谢产物通过被称为乙醛酸循环的反应途径重新合成(Kornberg，Biochem J99(1966)1-11)，乙醛酸循环的关键酶是异柠檬酸裂解酶和苹果酸合成酶。然而，除了在乙酸、乙醇、和脂肪酸上生长之外，在很多生物体中，所提及的酶并非在碳水化合物上生长所必需的，因为活性，换言之，这两种酶的重新合成是通过培养基的碳源调节的。
基于其棒状外形，谷氨酸棒状杆菌及其近亲种属蜜糖杆菌，黄色短杆菌和乳发酵短杆菌被看作棒状细菌。此外，这些种类亦被称为“谷氨酸-细菌”，因为在某些生长环境下，在其培养基中产生大量谷氨酸盐。因为可用于氨基酸，嘌呤和蛋白的生产，例举的微生物具有重要的工业价值。已证实谷氨酸棒状杆菌，蜜糖杆菌，黄色短杆菌和乳发酵短杆菌在乙酸盐如乙醇上生长，表明其具有乙醛酸循环，即亦具有异柠檬酸酶和苹果酸合成酶(为了大致了解，参见：Kinoshita，Amino acids，inBiology of industrial organisms，1985，pp.115-142，Benjamin/cummings Publishing)。
尽管多年来应用于工业，这些生物体只是借助于近年来发展的分子生物学方法，为达到应用的目的，将棒状杆菌进行遗传突变，一般说来，经过克隆的基因在载体上处于其特有的启动子控制之下，在棒状杆菌中以高拷贝形式出现。这样，在很多情况下，少数基因的强的过量表达表现出不利于棒状杆菌生长，因此不利于所期望的产物的产生。其原因在于，一种相关的基因产物的过量产生对于细胞的新陈代谢是有毒性的，因而延缓了细胞生长。这样的情况可以例举编码脱调节的(deregulierte)酶的突变基因的同源过表达，即其活性未曾过多受到终产物抑制，如编码脱调节的高丝氨酸脱氢酶的homl-基因的同源过量表达(Reinscheid et al.，Appl Environm Microbiol 60(1994)，126-132)。然而我们知道这一种情形，一种非突变基因在同源体系中的过量表达对于谷氨酸棒状杆菌的生长是有害的(如Eikmanns等，微生物学140(1994)1817-1828)。但也常有这样的问题，当基因不来自于棒状杆菌时，也能有这样的过度表达。为了在棒状杆菌中表达所需基因，而无需忍受相应基因产物的生长抑制，存在着多种可能性：一个期望的基因以单拷贝整合到棒状杆菌染色体上，由于在生物体中仅存在该基因的一个拷贝，一般不会出现由相应基因产物引起的毒性效应。本方法的缺点在于为了实现预期目标，该方法耗费大量精力。此外通过插入基因的一个拷贝，很少能有足量预期物质产生。
一种替代向棒状杆菌染色体插入基因的方法是：在棒状杆菌中，以低拷贝数克隆一个处于载体上基因。这样具有此种优点：相应的基因产品以相对低的量产生因而多半对细胞无毒。然而，在这种情况下，产生的基因产物的相对较低的量对于生物工程上的应用是一缺点。
因而我们预期由于这种基因产物对于生产即生物的生长的不利影响的出现，较大量的基因产物仅在预期的时间点产生。为达到这一目的，提供了一种预期基因，在其可调节的启动子之后克隆  非其特有的启动子。就可调节的大肠杆菌启动子lac，λpL和trp而言，已表明能够在棒状杆菌中调节多种插入基因的表达(Tsnchiya和Morinaga，Bio/Technology 6(1988)428-431)。然而这些启动子具有多种不利之处：这些例举的启动子，不是来自于棒状杆菌生物体，因而是外源DNA。通过向棒状杆菌中插入这样的一个启动子，这些重组子生物体被视为具有严格的规定的安全性。另一个前提是：这三个所需要的诱导基因的启动子的任一个，就工业目的来说都是相对地令人不感兴趣的。由于诱导基因的lac启动子需要相对昂贵的物质IPTG，这样的启动子应用于大生产是不盈利的。λPL启动子通过热激活。热不仅损伤生物体而且引起损伤产生的产物，因而该启动子就棒状杆菌而言是基本没有工业价值的。trp启动子将通过色氨酸缺乏激活。由于假定应用生产棒状杆菌色氨酸缺乏突变体的启动子，一般说来棒状杆菌不会遭受色氨酸缺乏。这样的突变体的应用相对耗资巨大，因而迄今未发现trp启动子开始应用于棒状杆菌的生物技术中。
就可调节启动子而言，一种理想的情形是：提供了一种可通过一种易得的，价廉物美的物质调节的棒状杆菌启动子。迄今已被描述的唯一的棒状杆菌启动子是异柠檬酸裂合酶基因的启动子(EP-OS 0 530765)。只要在培养基中没有糖，这个启动子将引起基因表达。然而在大多数发酵基质中将加入糖作为碳源，获得可调节的启动子是有意义的，该启动子在糖存在的条件下，借助于一种价廉物美的诱导物亦会引起基因表达。
因而本发明的目的是：提供一种制备的DNA片段，该片段使多种基因在棒状杆菌中不依赖于培养基中的碳源而能够调节表达。
本发明相关的目的通过一个位于苹果酸合成酶基因之前，并从其分离的DNA片段解决，在构建到载体和转化到棒状杆菌之后，该片段将调节插入到该DNA片段之后的编码蛋白质的结构基因的表达。
现已查明，棒状杆菌中苹果酸合成酶基因的表达可通过诱导物如乳酸、丙酮酸和/或乙酸的出现而诱导。当培养基有其他碳源时，该诱导仍可通过乳酸完成。甚至于如在完全培养基中在糖出现时仍有显著的乳酸诱导。
分离位于棒状杆菌苹果酸合成酶之前的DNA片段之后，将任一编码欲合成的蛋白的结构基因插入其后，该构建物连接于载体中，随即转化到棒状杆菌中。当培养这种转化体时，在任一时间点，加入诱导物如乳酸、丙酮酸及乙酸，在此，结构基因在期望的时间点表达，因而合成期望的蛋白质。本发明相关的，提供的DNA片段使多种基因在棒状杆菌中表达成为可能。由于该分离的DNA来源于棒状杆菌中，上述调节在同源系统中完成。因而本发明相关的DNA区域首次提供了这种可能性，在同源系统中，通过一种廉价的诱导物，如乙酸，而且不依赖于发酵培养基的组成，在棒状杆菌中调节基因表达。
优选制备位于谷氨酸棒状杆菌的苹果酸合成酶基因之前，并由此即，从谷氨酸棒状杆菌中分离的DNA片段；分离该苹果酸合成酶(aceB)以及表达和调节所需的结构物。表2中描述了DNA序列和由此推导的氨基酸序列，在表2中，aceB-基因的核糖体结合位点是下划线的，且有“RBS”标志。aceB的转录的潜在终止子通过反向平行的箭头表示。
因而可以确认：来自于苹果酸合成酶基因的，现有的如表2中的1至547位核苷酸的DNA区域，用于调节表达及给出了其他基因。
实施例1.在多种培养基上生长的谷氨酸棒状杆菌的细胞提取物的苹果酸合成
酶基因的活性的研究
用谷氨酸棒状杆菌菌株ATCC 13032(野生型)的提取物，测定了在多种培养基上生长之后的苹果酸合成酶(MSY)的活性，以研究碳源对于酶活性的影响。为此细胞在30℃，于10ml 2×TY完全培养基(Sambrook等人，分子克隆，实验室手册，1989，冷泉港实验室)振摇(120 UpM)温孵14小时。随即细胞通过离心沉降，用pH 6.8缓冲液(0.1M磷酸钾)洗一遍，然后悬浮于1ml同样的缓冲液。随即将获得的细胞悬浮液接种到60ml培养基中，以达到光密度OD600为1.0。就应用的培养基而言，涉及2×TY-完全培养基或CgC-基本培养基(Eikmanns等，应用微生物生物技术学34(1991)617-622)加入1％葡萄糖、乙酸、丙酮酸、乳酸、柠檬酸、琥珀酸、富马酸如葡萄糖盐作为碳源应用。培养物在30℃再次温孵，并跟踪OD600值。当OD600达到8-10时，离心收集细胞，用pH7.6(50mM Tris/HCl)洗涤一遍，悬浮于1ml同种缓中液中，在Branson-Sonifier  W250(10分钟，其脉中有20％间隔，且其功率为30瓦)中通过超声处理而破碎。为去除细胞碎片，将匀浆物于Sigma  2K 15冷冻离心机中于4℃，13000UpM，离心30分钟，随即将澄清的上清(粗提物)用于MSY-活性测定。
酶活测定包含于1.0ml的50mM Tris/HCl(pH 7.6)40mMMgCl2，2mM乙醛酸钠，0.15mM乙酰-辅酶A，和粗提物的终体积中。该混合物于30℃温孵。两分钟之后于232nm测定吸光度，其基于乙酰CoA的硫酯键的裂解而给出。乙酰CoA于232nm处的消光系数为4.5mM-1cm-1(Stadtman，酶学方法，Vol 3，1957，纽约，学术出版社)。粗提物的蛋白含量借助于Biuret-法(Bradford，分析生物化学72(1976)248-254)测定。测出的具体的苹果酸合成酶活性在表1中给出。
表1中显示了生长于2×TY完全培养基及CgC基本培养基以葡萄糖、柠檬酸、琥珀酸、富马酸及谷氨酸为碳源的MSY的活性，大约是0.04U/mg蛋白质。在以乳酸盐和丙酮盐为碳源的CgC基本培养基上，其MSY-活性提高为0.173U/mg蛋白和0.192U/mg。最高的MSY活性为2,212U/mg蛋白，在生长于以乙酸盐为碳源的MSY-基本培养基上被观测到。乙酸盐加到上述培养基时，同样引起较强的MSY活性提高，为0.500U/mg蛋白质至1,330U/mg蛋白。该结果表明，在谷氨酸棒状杆菌中，MSY活性通过培养基的碳源调节。2.来源于谷氨酸棒状杆菌的MSY-基因的分离和亚克隆
为从谷氨酸棒状杆菌中分离MSY基因(aceB)，按已知方法(Sambrook et al，分子克隆，实验室手册，1989，冷泉港实验室出版社)构建基于柯斯质粒(Cosmid)pHC79(Hohn和Collins，基因11(1980)291-298)的棒状杆菌柯斯质粒基因文库。为此将从谷氨酸棒状杆菌中分离染色体DNA (Eikmanns et al.，微生物学140(1994)1817-1828)，并用Sau 3A部分消化。当获得的片段连接到柯斯质粒pHC79的BamHI位点之后，连接物(Ansatz)包装到λ噬菌体的蛋白衣壳中，转化大肠杆菌ED 8654(Murray et al.Mol GenGenet 150(1977)53-61)。按照Sternberg等人(基因1(1979)255-280)的方法进行在λ噬菌体的蛋白质衣壳中的重组体柯斯质粒包装，按Sambrook等人的方法进行转染大肠杆菌ED 8654(分子克隆，实验室手册，1989，冷泉港实验室出版社)，从获得的总共30个重组大肠杆菌克隆中分离出相应的柯斯质粒(Sambrook et al，分子克隆，实验室手册，1989，冷泉港实验室出版社)并经酶Hind III限制性酶切分析。表明有24个含有被研究的柯斯质粒插入，证明该插入片段的大小约为35kb。总共有2200个载有柯斯质粒的大肠杆菌克隆，按已知方法(Sambrook et al，分子克隆，实验室手册，1989，冷泉港实验室出版社)制备柯斯质粒DNA。为了从谷氨酸棒状杆菌分离ace B基因，按已知方法(Sambrook等，分子克隆，实验室手册，1989，冷泉港实验室出版社)将柯斯质粒基因文库转化到MSY-缺陷的大肠杆菌突变株DV 21A05中(Vanderwinkel和De Vlieghere欧洲生物化学杂志5(1968)81-90)。由于MSY-缺陷，突变体DV 21A05在以乙酸盐为唯一碳源的情况下几乎不生长。用柯斯质粒基因文库转化这些突变体后总共获得1000个克隆。在这些克隆中显示出总共有3个克隆在以乙酸盐为唯一碳源的M9基本培养基(Sambrook等，分子克隆，实验室手册，1989，冷泉港实验室出版社)上的生长。从这些克隆中分离出相应的柯斯质粒之后(Sambrook等人，分子克隆，实验室手册，1989，冷泉港实验室出版社)，再次转化E.coli突变体DV 21A05，生成的克隆再次在以乙酸盐为唯一碳源的M9-培养基上生长。猜想来源于谷氨酸棒状杆菌的aceB-基因局限于这三个柯斯质粒里。
为了将来源于谷氨酸棒状杆菌的aceB-基因以较小片段插入，用限制性酶Sau 3A部分消化这三个柯斯质粒，按已知方法(Sambrook等，分子克隆，实验室手册，1989，冷泉港实验室出版社)在电场中在0.8％琼脂糖凝胶上拆分。在3.0kb至6.0kb大小范围内的片段通过电洗脱(Sambrook等，分子克隆，实验室手册，1989，冷泉港实验室出版社)从凝胶中分离，且连接到载体pHCYC 184(张和Cohen，细菌杂志(1978)1141-1156)的BamHI酶切位点上。用该连接混合物转化大肠杆菌DV 21A05，再次研究获得的转化子在以乙酸盐为唯一碳源时生长的能力。用这种方法可以分离到这样的克隆，其质粒允许突变体DV21A05在乙酸盐上生长。从这些重组子菌株中分离相应的质粒，并进行染色体图谱分析。其中一个质粒pAB-17的限制性图谱如图1描述。从这一质粒中，按已知方法，将MSY编码DNA片段通过BfrI-PvuI限制性酶切作为3kb片段分离，并连接到谷氨酸棒状杆菌/大肠杆菌-穿梭载体pEKU(Eikmanns等，基因102(1991)93-98)。当载体中，插入片段的取向相互独立的情况下，新构建的质粒被称为pEKB1a和pEKB1b。这两个质粒的限制性图谱在图2中展示。3.MSY结构基因和邻近区域的核苷酸序列分析
为了测序，将两个来源于质粒pAB-17的重叠部分片段，1.6kbBfrI-KpnI和1.8kb SpnI-PvuI-片段按已知方法分离。这两个片段的悬垂末端将用Klenow聚合酶填平为平整末端(Sambrook等，分子克隆，实验室手册，1989，冷泉港实验室出版社)且连结到质粒pUC 18(Vieira和Messing，基因19(1982)259-268)的合适位点上。如此生成的质粒将按照Henikoff(基因28(1984)351-359)的方法，用于制备缺失构建物，该构建物随即通过链终止法测序。此时获得的3kb BfrI-PvuI-片段的全部序列在表2中描述。此外表2还描述由aceB基因推导的来自于谷氨酸棒状杆菌的MSY的蛋白质序列，处于该基因之前的核糖体结合位点和处于该基因之后的转录终止结构。4.谷氨酸棒状杆菌菌株的MSY活性，该菌株的质粒上载有MSY-基
因
通过电穿孔法(Liebl等，FEMS Microbiol Lett 65(1989)299-304)将质粒pEKB1a和pEKB1b导入谷氨酸棒状杆菌，形成的菌株被称为WT(pEKB1a)和WT(pEKB1b)按已知方法，将新构建的谷氨酸棒状杆菌菌株在以葡萄糖、葡萄糖/乙酸盐以及乙酸盐作为碳源的CgC基本培养基上生长，直至OD600达到8-10。制备粗提物且以此测定MSY比活。测定的MSY活性在表3中描述。
与谷氨酸棒状杆菌野生型(WT)和含有起始载体pEK0的谷氨酸棒状杆菌菌株WT(pEK0)相比，谷氨酸棒状杆菌菌株WT(pEKB1a)和WT(pEKB1b)显示了在所有三种碳源上生长时的明显提高的活性。该结果证明：来源于谷氨酸棒状杆菌的aceB-基因有功能地处于3kbBfrI-PvuI片段上。与这些菌株生长于葡萄糖上相比，谷氨酸棒状杆菌菌株(pEKB1a)和WT(pEKB1b)在CgC-葡萄糖/乙酸盐上生长，其MSY活性几乎高出8倍。与生长在CgC葡萄糖上相比，这两个菌株生长在以乙酸盐为唯一碳源的CgC基本培养基上时，其MSY活性甚至高出16至18倍。该结果证实：在分离的片段上，存在着所有aceB-基因表达和调节所需的结构物，即启动子和调节序列。这些结构物位于aceB基因的前面。该克隆的片段在实际的aceB结构基因之前还有584bp(见表2)，用于表达和调节的结构大概局限于该DNS区内。5.来源于谷氨酸棒状杆菌的aceB-基因的调节和表达的研究
为了证明观测到的MSY的调节涉及基因水平上的调节，而不是涉及酶本身的调节(如通过抑制激活或共价修饰)，以其蛋白质模式(Proteinmuster)研究在具有葡萄糖的CgC基本培养基上生长的谷氨酸棒状杆菌WT如WT(pEKB1a)细胞和在具有乙酸盐的CgC基本培养基上生长的谷氨酸棒状杆菌WT(pEKB1a)细胞的提取物。这样一来将提及的菌株按已知方法于相应培养基上培养，制备其粗提物按Laemmli(自然227(1970)680-685)在变性条件下于12.5％聚丙烯酰胺凝胶上拆分(图3)。为了定位粗提物中的MSY-蛋白带，来自于谷氨酸棒状杆菌的MSY纯化至均一(见附图1)平行于在变性条件下的粗提物电泳(图3)。谷氨酸棒状杆菌WT于CgC-乙酸盐上生长之后，与这些菌株生长于CgC-葡萄糖相比，显示出明显的强烈的蛋白带。菌株WT(pEKB1a)表明在CgC乙酸盐生长后有一较强的MSY蛋白带。由带的强度可以估计，在菌株中MSY占总细胞蛋白的约20％。这一结果表明，这些aceB表达和调节必需的结构，在环境的诱导下，导致了大量的蛋白质的新合成。此外，通过此结果，显然观测到的在乙酸盐上生长之后的MSY活性的提高，是由于MSY蛋白的新合成引起的。6.在一独立体系中，从功能上测试处于aceB-基因的DNS区域
在aceB-基因前的DNS区用已知方法作为574bp BfrI-DraI-片段分离，悬垂末端用Klenow聚合酶填平，并连接到用Klenow聚合酶填平的载体pEKplCm的SalI酶切位点(Eikmanns等，基因102(1991)93-98)。该质粒在插入位点之后载有氯霉素乙酰转移酶-基因(cat)，然而没有启动子，即，质粒pEKplCm无法产生cat基因。BfrI-DraI片段连接到载体pEKplCm之后，用已知方法测序，可以确定，BfrI-DraI片段取向是在位于aceB-基因之前的cat-基因之前。相应质粒被称为pIWI。用已知方法将质粒pIWI导入谷氨酸棒状杆菌之后，测定在CgC-葡萄糖，CgC-葡萄糖/乙酸盐及CgC-乙酸盐上生长的该菌株的氯霉素-乙酰转移酶活性(CAT)。为此，待研究的菌株按已知方法在上述培养基中培养，直到OD600为8到10，制备粗提物，按Shaw(酶学方法43(1975)737-755)测定其CAT比活。该反应包含于1.0ml终体积的100mM  Tris/HCl pH7.8，1mM乙酰辅酶A，1mM 5，5-二硫双-(2-硝基苯酸)和粗提物中，用2.5mM氯霉素启动反应。该混合物于30℃温孵，经2分钟后，将提取的混合物于412nm处测定。粗提物蛋白质含量用Biuret法(Bradford，分析化学72(1976)248-254)测定。测得的CAT比活于表4中给出。然而在研究的条件下，谷氨酸棒状杆菌WT未被证实具有CAT活性，而重组体菌株谷氨酸棒状杆菌在所有的碳源上都显示了CAT活性。但是，生长于CgC-葡萄糖上的CAT活性比生长于CgC-葡萄糖/乙酸盐上低20倍，比生长于CgC-乙酸盐上低50倍。该结果证明：分离的574bp BfrI-DraI片段能够调节外源基因的基因表达。乙酸盐可诱导外源基因，甚至于在糖存在时。附录I
从谷氨酸棒状杆菌中纯化MSY
为从谷氨酸棒状杆菌中纯化MSY，采用60ml在CgC-乙酸盐培养基中培养的OD600为8至10的培养物。细胞用20ml 50mM吗啉代乙磺酸(MES)/NaOH pH6.0洗两遍，悬浮于1ml加入5U/ml DNase，15μg/mg RNase和100μm苯甲磺酰基氟化物的同一缓冲液中。按已知方法进行细胞碎片的增溶和分离。所有的纯化步骤于4℃进行。细胞提取物用50mM MES/NaOH pH稀释到10ml。于183,000×g超速离心2小时后，将上清借助于HR 5/5 Mono Q-阴离子交换柱色谱(Pharmacia  LKB，Freiburg德国)进行FPLC制备。第一次色谱纯化时，MSY用NaCl梯度为0.1M至0.4M的50mM MES/NaOH pH6洗脱。为进行第二次色谱，将部分纯化的MSY的缓冲液借助于超滤由50mMMES/NaOH pH6.0转换为50mM Tris/HCl pH8。进行第二次色谱纯化时，MSY用NaCl梯度为0.2M至0.5M的50mM Tris/HCl pH8洗脱。进行第二次色谱拆分时，流速定为1ml/min。第二次拆分的流出液一般以1ml级分收集，且测定MSY活性。具有活性的级分一般进行合并。表1：在不同碳源上生长的谷氨酸棒状杆菌的粗提物的苹果酸合成酶
(MSY)活性培养基                      MSY比活(U/mg蛋白)2×TY-完全培养基                0.0302×TY-完全培养基+1％乙酸盐      0.840CgC-基本培养基(MM)+1％葡萄糖    0.040CgC-MM+1％乙酸盐                2.212CgC-MM+1％丙酮酸盐              0.192CgC-MM+1％乳酸盐                0.173CgC-MM+1％柠檬酸盐              0.038CgC-MM+1％琥珀酸盐              0.045CgC-MM+1％富马酸盐              0.034CgC-MM+1％葡糖酸盐              0.041CgC-MM+1％乙酸盐+1％葡萄糖      0.970CgC-MM+1％乙酸盐+1％丙酮酸盐    0.730CgC-MM+1％乙酸盐+1％乳酸盐      0.860CgC-MM+1％乙酸盐+1％柠檬酸盐    0.500CgC-MM+1％乙酸盐+1％琥珀酸盐    0.920CgC-MM+1％乙酸盐+1％富马酸盐    0.910CgC-MM+1％乙酸盐+1％葡糖酸盐    1.330表2
          .         .         .         .         .         .         .         .         .1 CTTAAGTGCTGATTCGCAATGGGCGGTGCCGACCACAAAGTATGAGCTAATGCACTGTCACTGTTTCGACGTGATGTGCATCGGTTTGCG
          .         .         .         .         .         .         .         .         .91 TGGTGGCGTGGTTCACACATTGCTCCATCGGGCATTGGTGCGTCAATCGGTTTGGGTTTTTAAGTTTTGTGCGGGGGTGGTCACCCCTGT
          .         .         .         .         .         .         .         .         .181 TGTGAAGTTTGCAAAGTTCTGGCTTCGCAGAAAAAGTGGGCGGGGGAGTTGCTAGTACGGATGTACTGGGCAAATGCTCTGAAATGGGAA
          .         .         .         .         .         .         .         .         .271 AATGCAGGCACCGCAACGTTCCGTAGGTTTCGAAGGTGTGACCTAGATAAAAGTCGGGGTTAGGCGGGGGTAATGACTTAGTAAAGTTCG
          .         .         .         .         .         .         .         .         .361 CAAACCCCTTTTGCTGGTGACGGTGATCACTTAGTCTGATCACATCGCCAAACACGATAAGGGTTGAAATCGAAAGAAGAGTGGCACCTA
          .         .         .         .         .         .         .         .         .451 GATTCCAGAGGTAGTCAGAGTGCTTTTCTTAAAAGAGTTTTCACAACCGTTAACGCGTAGCCAAACAAGAAGGATTCGCATTCTTCTGGT
          .         .         .         .         .         .         .         .         .541 TTAGGCACAGGTCATCTAAAACCCATGCTTTAAAAGGAGCCTTCAATGACTGAACAGGAACTGTTGTCTGCTCAGACTGCCGACAACGCT
                                  RBS          M  T  E  Q  E  L  L  S  A  Q  T  A  D  N  A
          .         .         .         .         .         .         .         .         .631 GGAACTGACAGCACCGAACGCGTTGACGCGGGCGGAATGCAGGTTGCAAAAGTTCTCTACGACTTTGTAACCGAAGCGGTACTCCCTCGC
  G  T  D  S  T  E  R  V  D  A  G  G  M  Q  V  A  K  V  L  Y  D  F  V  T  E  A  V  L  P  R
          .         .         .         .         .         .         .         .         .721 GTGGGTGTGGATGCGGAAAAGTTCTGGTCCGGATTCGCCGCCATCGCCCGGGACCTCACCCCACGCAACCGCGAGCTGCTTGCTCGCCGC
  V  G  V  D  A  E  K  F  W  S  G  F  A  A  I  A  R  D  L  T  P  R  N  R  E  L  L  A  R  R
          .         .         .         .         .         .         .         .         .811 GATGAACTGCAGATGCTTATCGACGACTACCACCGCAACAACTCCGGCACCATCGACCAAGAGGCGTACGAGGATTTCCTCAAAGAAATC
  D  E  L  Q  M  L  I  D  D  Y  H  R  N  N  S  G  T  I  D  Q  E  A  Y  E  D  F  L  K  E  I
          .         .         .         .         .         .         .         .         .901 GGATACTTGGTTGAGGAGCCAGAAGCTGCAGAAATCCGTACCCAAAACGTCGATACGGAAATCTCCAGCACCGCAGGACCTCAGCTGGTT
  G  Y  L  V  E  E  P  E  A  A  E  I  R  T  Q  N  V  D  T  E  I  S  S  T  A  G  P  Q  L  V
          .         .         .         .         .         .         .         .         .991 GTTCCAATTCTGAACGCACGCTTCGCGCTGAACGCTGCCAATGCTCGCTGGGGTTCCCTCTACGATGCGTTGTACGGCACCAACGCCATC
  V  P  I  L  N  A  R  F  A  L  N  A  A  N  A  R  W  G  S  L  Y  D  A  L  Y  G  T  N  A  I
          .         .         .         .         .         .         .         .         .1081 CCAGAAACTGATGGCGCTGAAAAGGGCAAGGAGTACAACCCGGTCCGCGGCCAGAAGGTCATCGAGTGGGGTCGTGAATTCCTCGACAGC
  P  E  T  D  G  A  E  K  G  K  E  Y  N  P  V  R  G  Q  K  V  I  E  W  G  R  E  F  L  D  S
          .         .         .         .         .         .         .         .         .1171 GTTGTCCCACTGGACGGTGCTTCGCATGCCGATGTTGAGAAGTACAACATCACCGATGGAAAGCTTGCAGCCCACATTGGAGATAGCGTC
  V  V  P  L  D  G  A  S  H  A  D  V  E  K  Y  N  I  T  D  G  K  L  A  A  H  I  G  D  S  V表2(续页)
          .         .         .         .         .         .         .         .         .1261 TACCGACTGAAAAACCGTGAATCCTACCGTGGCTTCACCGGCAACTTCCTTGATCCAGAAGCAATCCTGCTGGAAACCAACGGCCTGCAC
  Y  R  L  K  N  R  E  S  Y  R  G  F  T  G  N  F  L  D  P  E  A  I  L  L  E  T  N  G  L  H
          .         .         .         .         .         .         .         .         .1351 ATCGAGCTGCAGATCGATCCTGTCCACCCAATCGGCAAGGCAGACAAGACTGGTCTCAAAGACATCGTTTTGGAATCTGCGATCACCACG
  I  E  L  Q  I  D  P  V  H  P  I  G  K  A  D  K  T  G  L  K  D  I  V  L  E  S  A  I  T  T
          .         .         .         .         .         .         .         .         .1441 ATCATGGACTTCGAAGACTCCGTTGCAGCTGTTGATGCTGAAGACAAGACCTTAGGTTACTCTAACTGGTTCGGACTCAACACCGGCGAA
  I  M  D  F  E  D  S  V  A  A  V  D  A  E  D  K  T  L  G  Y  S  N  W  F  G  L  N  T  G  E
          .         .         .         .         .         .         .         .         .1531 CTGAAAGAAGAGATGTCCAAGAACGGACGCATCTTCACCCGTGAGCTCAACAAGGACCGCGTCTACATTGGCCGCAATGGTACCGAGCTG
  L  K  E  E  M  S  K  N  G  R  I  F  T  R  E  L  N  K  D  R  V  Y  I  G  R  N  G  T  E  L
          .         .         .         .         .         .         .         .         .1621 GTTCTGCACGGTCGTTCCCTGCTGTTCGTCCGCAACGTTGGTCACCTCATGCAAAACCCATCCATCTTGATTGATGGCGAGGAGATCTTC
  V  L  H  G  R  S  L  L  F  V  R  N  V  G  H  L  M  Q  N  P  S  I  L  I  D  G  E  E  I  F
          .         .         .         .         .         .         .         .         .1711 GAAGGCATCATGGATGCTGTCTTGACCACTGTTTGTGCCATCCCAGGAATTGCTCCGCAGAACAAGATGCGCAATTCCCGCAAGGGCTCC
  E  G  I  M  D  A  V  L  T  T  V  C  A  I  P  G  I  A  P  Q  N  K  M  R  N  S  R  K  G  S
          .         .         .         .         .         .         .         .         .1801 ATCTACATCGTGAAGCCTAAGCAGCACGGCCCTGAAGAAGTCGCGTTCACCAACGAGCTCTTCGGCCGCGTTGAGGATCTGCTTGATCTG
  I  Y  I  V  K  P  K  Q  H  G  P  E  E  V  A  F  T  N  E  L  F  G  R  V  E  D  L  L  D  L
          .         .         .         .         .         .         .         .         .1891 CCACGCCACACCTTGAAGGTTGGTGTTATGGATGAGGAGCGTCGCACGTCCGTGAACCTGGATGCCAGCATCATGGAAGTTGCTGACCGC
  P  R  H  T  L  K  V  G  V  M  D  E  E  R  R  T  S  V  N  L  D  A  S  I  M  E  V  A  D  R
          .         .         .         .         .         .         .         .         .1981 TTGGCATTCATCAACACTGGCTTCCTGGACCGCACCGGCGATGAAATCCACACCTCCATGGAAGCAGGCGCCATGGTGCGCAAGGCTGAT
  L  A  F  I  N  T  G  F  L  D  R  T  G  D  E  I  H  T  S  M  E  A  G  A  M  V  R  K  A  D
          .         .         .         .         .         .         .         .         .2071 ATGCAGACCGCACCGTGGAAGCAGGCCTACGAGAACAACAACGTTGATGCAGGTATTCAGCGTGGTCTTCCTGGCAAGGCTCAGATCGGT
  M  Q  T  A  P  W  K  Q  A  Y  E  N  N  N  V  D  A  G  I  Q  R  G  L  P  G  K  A  Q  I  G
          .         .         .         .         .         .         .         .         .2161 AAGGGCATGTGGGCGATGACTGAACTCATGGCAGAAATGCTGGAGAAGAAGATCGGCCAGCCACGCGAAGGCGCCAACACTGCATGGGTT
  K  G  M  W  A  M  T  E  L  M  A  E  M  L  E  K  K  I  G  Q  P  R  E  G  A  N  T  A  W  V表2(续页)
          .         .         .         .         .         .         .         .         .2251 CCTTCACCAACTGGTGCGACGCTGCACGCAACGCACTACCACTTGGTTGATGTGTTCAAGGTTCAAGACGAACTGCGTGCTGCCGGCCGC
  P  S  P  T  G  A  T  L  H  A  T  H  Y  H  L  V  D  V  F  K  V  Q  D  E  L  R  A  A  G  R
          .         .         .         .         .         .         .         .         .2341 CGCGACAGCCTGCGCAACATTCTCACCATTCCAACCGCACCAAACACCAATTGGTCTGAGGAAGAGAAGAAGGAAGAGATGGACAACAAC
  R  D  S  L  R  N  I  L  T  I  P  T  A  P  N  T  N  W  S  E  E  E  K  K  E  E  M  D  N  N
          .         .         .         .         .         .         .         .         .2431 TGCCAGTCCATCCTCGGATACGTTGTGCGCTGGGTTGAGCACGGTGTTGGTTGCTCCAAGGTTCCAGACATCCATGACATCGACCTCATG
  C  Q  S  I  L  G  Y  V  V  R  W  V  E  H  G  V  G  C  S  K  V  P  D  I  H  D  I  D  L  M
          .         .         .         .         .         .         .         .         .2521 GAAGACCGCGCAACGCTGCGTATTTCCTCGCAGATGCTGGCCAACTGGATCCGCCATGATGTTGTCTCGAAGGAGCAGGTCTTGGAGTCA
  E  D  R  A  T  L  R  I  S  S  Q  M  L  A  N  W  I  R  H  D  V  V  S  K  E  Q  V  L  E  S
          .         .         .         .         .         .         .         .         .2611 CTGGAACGAATGGCAGTGGTCGTCGACAAGCAAAATGCGGGCGACGAGGCCTACCGCGATATGGCGCCGAACTACGACGCCTCCCTCGCC
  L  E  R  M  A  V  V  V  D  K  Q  N  A  G  D  E  A  Y  R  D  M  A  P  N  Y  D  A  S  L  A
          .         .         .         .         .         .         .         .         .2701 TTCCAGGCGGCTAAGGACTTGATTTTCGAAGGCACCAAGTCCCCATCGGGCTACACCGAGCCCATCTTGCACGCACGCCGCCGCGAGTTC
  F  Q  A  A  K  D  L  I  F  E  G  T  K  S  P  S  G  Y  T  E  P  I  L  H  A  R  R  R  E  F
          .         .         .         .         .         .         .         .         .2791 AAAGCAAAAAACTAAGCACGCTTTTCGACGCTTACCTGCATCCCAACGGTGACTGACTGCCCCGGAGCCACCCTCACTCCTTTTTGGTCA
  K  A  K  N  -
          .         .         .         .         .         .         .         .         .2881 GCACCCAAAAGCGCCGGTTCAACACACACAAAGTCGCGCCATTCACCTTCGCCAATATCGGCCACGGTGGAGGCGCGACTTTCGCCTGGA
                              ---------------------→       ←---------------------
          .         .         .         .         .         .         .         .         .2971 TTCCACACCACAGTGGAATCATGACCATCGCCCTCAATGGTGATGATGCGATCG表3：在以葡萄糖、葡萄糖/乙酸盐及乙酸盐为碳源的CgC基本培养基生
长的谷氨酸棒状杆菌野生型(WT)和具有质粒pEK0、pEKB1a
和pEKB1b的重组谷氨酸棒状杆菌菌株的粗提物的苹果酸合成酶
(MSY)的比活。谷氨酸                   MSY比活(U/mg蛋白质)棒状杆菌     CgC-葡萄糖  CgC-葡萄糖/乙酸盐 CgC-乙酸盐WT               0.040        0.970         2.11WT(pEK0)         0.038        0.954         2.23WT(pEKB1a)       0.350        3.120         6.22WT(pEKB1b)       0.374        3.240         6.08表4：在以葡萄糖、葡萄糖/乙酸盐及乙酸盐为碳源的CgC基本培养基生
长的谷氨酸棒状杆菌的野生型(WT)和重组谷氨酸棒状杆菌菌株
WT(pIWI)的粗提物的氯霉素乙酰基转移酶(CAT)的比活谷氨酸                    CAT比活(U/mg蛋白质)棒状杆菌    CgC-葡萄糖    CgC-葡萄糖/乙酸盐    CgC-乙酸盐WT           0.001            0.001             0.001WT(pIWI)     0.026            0.620             1.320

Claims (9)

1.一种位于棒状杆菌苹果酸合成酶基因之前且从该基因分离的DNA片段，在构建入载体并转化到棒状杆菌中之后，它调节任一编码蛋白质、且插入到该DNA片段之后的结构基因的表达。
2.权利要求1的DNA片段，其来源于谷氨酸棒状杆菌的苹果酸合成酶基因。
3.权利要求2的DNA片段，其具有表2所示的1至574位核苷酸，其中表2是要求的组成部分。
4.上述权利要求1至3之一的DNA片段，其具有任一插在后面的(nachgeschalteten)的结构基因。
5.载体，含有权利要求1至4之任一的DNA片段。
6.重组体棒状杆菌细胞，含有可复制形式的权利要求1至4之任一的DNA片段。
7.权利要求6的重组体棒状杆菌细胞，含有权利要求5的载体。
8.通过培养转化子棒状杆菌生产任一蛋白质的方法，该转化子棒状杆菌含有一种可复制的从棒状杆菌分离的DNA片段，编码待合成的蛋白质的结构基因插入到该片段的后面，该片段调节编码待合成蛋白质的结构基因的表达，该转化子棒状杆菌培养于加入了诱导物的培养基中，随后结构基因表达，从而合成期望的蛋白质。
9.权利要求8的方法，其特征在于，乳酸盐、丙酮酸盐，特别是乙酸盐作为诱导物加至培养基中。
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