CN106661541B

CN106661541B - 被工程化为过表达辅助蛋白的重组宿主细胞

Info

Publication number: CN106661541B
Application number: CN201580032989.7A
Authority: CN
Inventors: B·加瑟; D·玛塔诺维克; M·布凯泰克斯
Original assignee: Valladogan Co ltd; Boehringer Ingelheim RCV GmbH and Co KG; Lonza AG
Current assignee: Boehringer Ingelheim RCV GmbH and Co KG; Lonza AG
Priority date: 2014-04-17
Filing date: 2015-04-16
Publication date: 2021-09-03
Anticipated expiration: 2035-04-16
Also published as: KR102373954B1; EP3132028A2; WO2015158808A2; JP2017511148A; US20170029827A1; CA2948369A1; EP3132028B1; JP2020072696A; JP7062633B2; KR20170002453A; US10865416B2; SG10201809146QA; SG11201608084TA; AU2015248815A1; EP4311857A2; WO2015158808A3; IL248376B; IL248376A0; AU2015248815B2; CN106661541A

Abstract

本发明属于重组生物技术领域，特别属于蛋白质表达领域。本发明一般涉及一种从宿主细胞中表达目标蛋白(POI)的方法。本发明特别涉及改善宿主细胞表达和/或分泌目标蛋白的能力，和宿主细胞在蛋白质表达中的用途。本发明还涉及细胞培养技术，更具体地涉及培养细胞以生产用于医学目的或食品的所需分子。

Description

被工程化为过表达辅助蛋白的重组宿主细胞

技术领域

背景技术

已经采用原核和真核宿主完成了目标蛋白(POI)的成功生产。最突出的实例是如大肠杆菌(Escherichia coli)的细菌，如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)或多形汉森酵母(Hansenula polymorpha)的酵母菌，如泡盛曲霉(Aspergillus awamori)或里氏木霉(Trichoderma reesei)的丝状真菌，或如CHO细胞的哺乳动物细胞。虽然一些蛋白质的产量容易以高效率实现，但是很多其它蛋白质仅以相对低的水平生产。

为了提高重组蛋白的分泌，一种策略是针对涉及蛋白质折叠和加工的宿主分泌途径。

在WO 93/25676中首次建议将编码蛋白质二硫键异构酶(PDI)的cDNA和编码异源二硫键键合蛋白质的cDNA的共表达作为增加异源蛋白产量的方法。WO 93/25676报道了通过与PDI共表达可以提高安逖斯塔辛(antistasin)和蜱抗凝血蛋白的重组表达。

WO 94/08012提供了通过增加Hsp70伴侣蛋白(即KAR2/BiP，或PDI伴侣蛋白质)的表达来提高酵母菌中过表达的蛋白质的分泌的方法。

WO 05/0617818和WO 06/067511提供了通过采用基于2μm的表达质粒在酵母菌中生产所需的异源蛋白的方法。已证明，当一个或多个伴侣蛋白与异源蛋白的基因在同一质粒上共表达时，异源蛋白的产量显著提高。

WO 2008/128701A2描述了通过利用蛋白质BMH2、BFR2、COG6、COY1、CUP5、IMH1、KIN2、SEC31、SSA4和SSE1中的一个来增加POI从真核细胞中的分泌的表达系统。

另一种增加蛋白质生产的方法基于激活未折叠蛋白反应(UPR)的转录因子HAC1的过表达。转录分析表明超过330个基因受HAC1的调控，这些基因中的多数涉及分泌细胞器的分泌或生物发生(biogenesis)。WO 01/72783描述了通过诱导升高的未折叠蛋白反应(UPR)来增加从真核细胞中分泌的异源蛋白质的量的方法，其中所述UPR受选自HAC1、PTC2和IRE1的蛋白质的共表达的调节。

Wentz等利用酿酒酵母的酵母菌表面展示基因文库，以通过应用合适的选择压力来鉴定分泌改善的菌株。发现酵母菌cDNA CCW12、SED1、CWP2、RPP0以温度依赖的方式增强scTCR展示。当在20℃下诱导时，ERO1增强蛋白分泌(Wentz等，Appl.Environ.Microbiol.(2007)73(4):1189-1198)。

Liu等(Biotechnol.Prog.(2006),22:1090-1095)证明在巴斯德毕赤酵母中Kar2的共过表达使rhG-CSF表达增加了5.6倍。将KAR2与Sec63、PDI1和YDJ1组合实现了2.8倍、6.5倍和5.94倍的增加。在Blatt等实施的实验中，KAR2(BiP)的共过表达使A33scFv在毕赤酵母中的表达增加了两倍。将KAR2与PDI1组合几乎消除了积极KAR2作用(Blatt等，Appl.Microbiol.Biotechnol.,2007,74:381-389)。

Guerfall等探讨了在巴斯德毕赤酵母(P.pastoris.)中过表达内源性HAC1的作用。此外，HAC1被组成型地和诱导型地过表达。在所有的例子中，证实了诱导的UPR的结果是增加的KAR2表达。全长HAC1的组成型过表达有很小或没有作用，而在四分之一的例子中，HAC1的诱导形式的过表达导致了蛋白质分泌的增加，在四分之三的例子中，HAC1的诱导形式的过表达导致了蛋白质分泌的降低(Guerfall等，Microbial Cell Factories,(2010),9:49)。

Sleep等证明LHS1的共过表达增加了rHA的浓度。LHS1与SIL1、JEM1和SCJ1组合，但效价(titer)低于单独与Jem1共过表达。在相同的时间，SIL1、LHS1和JEM1的共过表达使GM-CSF表达提高了1.45倍，而使rHA表达提高了近1.1和2倍，这取决于培养基(Sleep等，Applied and Environmental Microbiology,(2008)74(24):7759-7766)。

US 2009221030 A1描述了多种辅助蛋白(特别是BiP1)单独地和与其它辅助蛋白(特别是LHS1)组合在里氏木霉中的共表达。单独BiP1获得了最高表达值，而BiP1与LHS1的组合导致了分泌的蛋白效价降低8％。

US 8,440,456提供了巴斯德毕赤酵母的基因组序列，并公开了编码单一肽、分子伴侣和启动子的核酸序列。其公开了包含核酸序列的表达载体和能够过表达14种分子伴侣的遗传工程化的酵母菌。具体选择ROT1、SHR3和SIL1来试验，然而，SIL1未观察到表达，且ROT1或SHR3的过表达未能引起异源蛋白质分泌的任何显著增强。

在宿主细胞中高水平的蛋白产量可被一个或多个不同步骤，如折叠、二硫键的形成、糖基化、在细胞内转运或自细胞中释放限制。基于目前本领域最先进的知识，甚至当宿主生物体的全部基因组的DNA序列可获得时，许多涉及的机制仍然不能被完全理解且不能预测。

仍然需要改善宿主细胞生产和/或分泌目标蛋白的能力的方法。本发明的一个目的是提供提高重组蛋白质在宿主细胞中的产量的新方法，所述方法是简单且有效的并适用于工业方法。本发明的另一目的是提供实现上述目的的宿主细胞。又一目的是识别可用于提供所述宿主细胞的新的辅助蛋白及编码该辅助蛋白的序列。

必须指出的是，除非上下文另有明确指示，本文所用单数形式“一(a)”、“一种(an)”和“所述/该(the)”包括所提及的复数且反之亦然。因此，例如，提及的“一种宿主细胞”或“一种方法”分别包括一种或多种所述宿主细胞或方法，并且提及的“所述方法”包括本领域普通技术人员已知的可被修饰或置换的等效步骤和方法。类似地，例如，提及的“方法(methods)”或“宿主细胞(host cells)”分别包括“一种宿主细胞”或“一种方法”。

除非另有说明，一系列元素之前的术语“至少”将被理解为是指该系列中的每一元素。本领域技术人员将承认或采用常规实验能够确定，本文所述的本发明的具体实施方案的许多等价方案。这种等价方案意图被本发明所涵盖。

术语“和/或”无论在本文何处使用均包括“和”、“或”和“由所述术语连接的元素的全部或任意其它组合”的含义。例如，A、B和/或C的含义是A、B、C，A+B、A+C、B+C和A+B+C。

本文所用术语“约(about)”或“大约(approximately)”的含义是在给定值或范围的20％内，优选地10％内，和更优选地5％内。其还包括具体数目，如，约20包括20。

术语“少于”、“多于”或“大于”包括具体数目。例如，少于20的含义是≤20，多于20的含义是≥20。

本说明书及权利要求或项目全文中，除非上下文有其它要求，词语“包括/包含(comprise)”以及变形词语诸如“包括/包含(comprises)”和“包括/包含(comprising)”将被理解为意指包括陈述的整数(或步骤)、或整数(或步骤)的集合。其并不排除任何其它的整数(或步骤)、或整数(或步骤)的集合。当本文使用时，术语“包括/包含(comprising)”能够以术语“含有(containing)”、“由…组成(composed of)”、“包含(including)”、“具有(having)”或“携带(carrying)”替代。当本文使用时，“由…组成”排除了未在权利要求/项目中规定的任何整数或步骤。当本文使用时，“本质上由…组成”并不排除实质上不影响权利要求/项目的基本特征的和新特征的整数或步骤。本文的每一个实例中，术语“包括/包含”、“本质上由…组成”和“由…组成”中任意一个可被其它两个术语中的任意一个替代。

另外，在描述本发明的代表性实施方案时，本说明书可能将本发明的方法和/过程体现为特定的步骤顺序。然而，就方法或过程并不依赖于本文所陈述的特定步骤顺序来说，该方法或过程不应限于所描述的特定步骤顺序。本领域的普通技术人员能够理解，其他步骤的顺序也是可能的。因此，在本说明书中所描述的步骤的具体顺序不应被解释为对权利要求的限制。此外，涉及本发明的方法和/或过程的权利要求也不应被限制于字面所记载的其步骤的操作，而且本领域的技术人员能够容易地理解，这些顺序可以是变化的并且仍然被包含在本发明的精神和范围之内。

应该理解的是，本发明并不限于本文所述的具体的方法学、方案、材料、试剂和物质等。本文所使用的名词只用于描述特定实施方案的目的，其并不意在限定本发明的范围，本发明的范围仅由权利要求/项目限定。

本说明书全文所引用的所有的出版物和专利(包括所有的专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、指导书等)，无论在前还是在后，均以其全文并入本文。本文无任何内容能被解释为承认由于在先发明，本发明不早于这样的公开内容。就通过引入并入的材料与本说明书矛盾或不一致来说，本说明书将取代任何这样的材料。

发明概述

本发明部分地基于对多核苷酸序列(“本发明的多核苷酸”)的惊人的发现，该多核苷酸的表达、优选地过表达使得目标蛋白(POI)的产量增加。这一公开提供了这样的方法和材料：所述方法和材料可用于通过将宿主细胞工程化使得其能够过表达一种或多种新鉴定的多核苷酸序列以编码一种或多种辅助蛋白，改善POI的产量。

术语“产量”是指本文所述的POI或模型蛋白，特别是SDZ-Fab(SEQ ID NO:25和26)和HyHEL-Fab(SEQ ID NO:29和30)的量，其分别是例如从工程化宿主细胞中收获的，并且增加的产量可归因于宿主细胞生产或分泌的POI的量增加。产量可以以mg POI/g生物质(以干细胞重量或湿细胞重量来度量)的宿主细胞呈现。当本文使用时，术语“效价”同样地指生产的POI或模型蛋白的量，以mg POI/L培养上清液呈现。当从工程化宿主细胞中获得的产量与从工程化之前的宿主细胞(即未工程化的宿主细胞)中获得的产量相比较时，可以测定产量的增加。

优选地，当将“产量”用于本文所述的模型蛋白的上下文中时，其是按照实施例5c的描述测定的。因此，当将所述“产量”用于本文所述的模型蛋白的上下文中时，其还指“Fab产量”或“Fab效价”。Fab效价以mg/L表示，Fab产量以mg/g生物质(以干细胞重量或湿细胞重量来度量)表示。

简言之，用编码本文所述的辅助蛋白或其功能同系物的多核苷酸工程化分别表达模型蛋白HyHEL-Fab和SDZ-Fab的巴斯德毕赤酵母菌株CBS7435mut^S pPM2d_pAOX HyHEL和/或CBS7435mut^S pPM2d_pAOX SDZ(它们的产生参见实施例1)。对于共过表达，将编码辅助蛋白的基因克隆在巴斯德毕赤酵母GAP启动子的控制下，然后转化至实施例4中所述的生产Fab的菌株中。对于低表达，将编码KO靶标或其功能同系物的基因从生产Fab的菌株的基因组中敲除(参见实施例6)。在25℃下，将工程化的细胞于含有10g/L甘油和50μg/mL博来霉素(Zeocin)的YP-培养基中生长过夜(参见实施例5a)。将这种培养物的等分试样(对应终OD₆₀₀为2.0)转移至包含20g/L葡萄糖和葡萄糖料片的合成培养基M2中(描述于实施例5a)，并在25℃下培养25小时。将培养物洗涤并重悬浮于合成培养基M2中，并将等分试样(对应终OD₆₀₀为4.0)转移至用5g/L甲醇补充的合成培养基M2中。每12小时再添加3次的甲醇(5g/L)。48小时后，通过离心收获细胞。通过测量源于1mL细胞悬浮液的细胞团块的重量来测定生物质。所述上清液用于通过ELISA的SDZ-Fab或HyHEL-Fab的相应地定量(描述于实施例5c)。具体而言，抗-人IgG抗体(如ab7497，Abcam)用作包被抗体，如山羊抗-人IgG(Fab特异性)抗体(如碱性磷酸酶缀合的Sigma A8542)用作检测抗体。将商业的人Fab/κ，IgG片段用作起始浓度为100ng/mL的标准品，相应地稀释上清液样品。基于细胞被工程化为过表达多肽之前和之后的POI产量的比较，可测定产量的增加。示于实施例中的与模型蛋白SDZ-Fab和/或HyHEL-Fab相关的标准试验可以用于确定产量差异。

第一方面，本发明涉及一种或多种新发现的辅助蛋白及它或它们提高POI产量的用途。本发明基于、但不限于辅助蛋白HP1、HP2、HP3、HP4、HP5、HP6、HP7、HP8、HP9或HP10或其功能同系物。功能同系物的定义在本申请的后面部分限定。辅助蛋白HP1至HP9的氨基酸序列分别列于SEQ ID NO:1-9和162。本文使用的这种蛋白是指在本发明中，其复数形式或单数形式可互换，但是除非另有明确规定外，应当理解为单数形式。

本发明还涉及编码所述辅助蛋白的多核苷酸(以下称为“本发明的多核苷酸)和它们提高POI产量的单独的或组合的用途。可将所述多核苷酸引入宿主细胞，或若已经存在于所述细胞中，以使得该多核苷酸被过表达的方式操作它们。本发明的多核苷酸编码SEQ IDNO:1、2、3、4、5、6、7、8、9或162或其功能同系物中的任一个。所述多核苷酸序列的实例示于SEQ ID NO:13、14、15、16、17、18、19、20、21或163。

本发明提供一种分离的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列包含以下、本质上由以下组成或由以下组成：SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:163，并且可选地，所述多核苷酸可操作地连接至与该多核苷酸序列可为异源的启动子。此外，本发明提供分离的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:1-9或162中任一个的多肽序列或其功能同系物。优选地，本发明提供分离的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:1的多肽序列或其功能同系物。优选地，本发明提供分离的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:2的多肽序列或其功能同系物。优选地，本发明提供分离的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:3的多肽序列或其功能同系物。优选地，本发明提供分离的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:4的多肽序列或其功能同系物。优选地，本发明提供分离的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:5的多肽序列或其功能同系物。优选地，本发明提供分离的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:6的多肽序列或其功能同系物。优选地，本发明提供分离的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:7的多肽序列或其功能同系物。优选地，本发明提供分离的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:8的多肽序列或其功能同系物。优选地，本发明提供分离的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:9的多肽序列或其功能同系物。优选地，本发明提供分离的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:162的多肽序列或其功能同系物。在一些实施方案中，本发明提供一种分离的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列与选自SEQ ID NO:13、14、15、16、17、18、19、20、21或163的多核苷酸序列具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性。更优选地，所述分离的多核苷酸序列与SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:163具有100％的序列同一性。

本发明提供根据本发明的多核苷酸序列在其染色体中或以质粒、微型质粒、YAC、BAC、黏粒或其它任何载体等整合至宿主细胞中的用途。所述根据本发明的多核苷酸序列可以通过如转化或转染引入至宿主细胞中。另外，本发明提供这种多核苷酸序列在宿主细胞中制备目标蛋白的用途。

此外，本发明提供分离的多肽，所述多肽包含SEQ ID NO:1-9或162中任一个的多肽序列或其功能同系物。优选地，本发明提供分离的多肽，所述多肽包含SEQ ID NO:1的多肽序列或其功能同系物。优选地，本发明提供分离的多肽，所述多肽包含SEQ ID NO:2的多肽序列或其功能同系物。优选地，本发明提供分离的多肽，所述多肽包含SEQ ID NO:3的多肽序列或其功能同系物。优选地，本发明提供分离的多肽，所述多肽包含SEQ ID NO:4的多肽序列或其功能同系物。优选地，本发明提供分离的多肽，所述多肽包含SEQ ID NO:5的多肽序列或其功能同系物。优选地，本发明提供分离的多肽，所述多肽包含SEQ ID NO:6的多肽序列或其功能同系物。优选地，本发明提供分离的多肽，所述多肽包含SEQ ID NO:7的多肽序列或其功能同系物。优选地，本发明提供分离的多肽，所述多肽包含SEQ ID NO:8的多肽序列或其功能同系物。优选地，本发明提供分离的多肽，所述多肽包含SEQ ID NO:9的多肽序列或其功能同系物。优选地，本发明提供分离的多肽，所述多肽包含SEQ ID NO:162的多肽序列或其功能同系物。另一方面，本发明提供一种分离的多肽，所述多肽具有的多肽序列与选自SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9或162的氨基酸序列具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性。

第二方面，本发明提供一种用于制备目标蛋白的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞被工程化为过表达多核苷酸，所述多核苷酸编码具有示于SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9或162的氨基酸序列或其功能同系物的辅助蛋白，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9或162的氨基酸序列具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性。

优选地，本发明提供一种用于制备目标蛋白的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞被工程化为过表达多核苷酸，所述多核苷酸编码具有示于SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其功能同系物的辅助蛋白，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性。

优选地，本发明提供一种用于制备目标蛋白的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞被工程化为过表达多核苷酸，所述多核苷酸编码具有示于SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其功能同系物的辅助蛋白，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性。

优选地，本发明提供一种用于制备目标蛋白的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞被工程化为过表达多核苷酸，所述多核苷酸编码具有示于SEQ ID NO:3的氨基酸序列或其功能同系物的辅助蛋白，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性。

优选地，本发明提供一种用于制备目标蛋白的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞被工程化为过表达多核苷酸，所述多核苷酸编码具有示于SEQ ID NO:4的氨基酸序列或其功能同系物的辅助蛋白，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性。

优选地，本发明提供一种用于制备目标蛋白的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞被工程化为过表达多核苷酸，所述多核苷酸编码具有示于SEQ ID NO:5的氨基酸序列或其功能同系物的辅助蛋白，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性。

优选地，本发明提供一种用于制备目标蛋白的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞被工程化为过表达多核苷酸，所述多核苷酸编码具有示于SEQ ID NO:6的氨基酸序列或其功能同系物的辅助蛋白，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性。

优选地，本发明提供一种用于制备目标蛋白的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞被工程化为过表达多核苷酸，所述多核苷酸编码具有示于SEQ ID NO:7的氨基酸序列或其功能同系物的辅助蛋白，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性。

优选地，本发明提供一种用于制备目标蛋白的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞被工程化为过表达多核苷酸，所述多核苷酸编码具有示于SEQ ID NO:8的氨基酸序列或其功能同系物的辅助蛋白，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性。

优选地，本发明提供一种用于制备目标蛋白的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞被工程化为过表达多核苷酸，所述多核苷酸编码具有示于SEQ ID NO:9的氨基酸序列或其功能同系物的辅助蛋白，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性。

优选地，本发明提供一种用于制备目标蛋白的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞被工程化为过表达多核苷酸，所述多核苷酸编码具有示于SEQ ID NO:162的氨基酸序列或其功能同系物的辅助蛋白，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:162的氨基酸序列具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性。

在优选的实施方案中，与工程化为过表达所述辅助蛋白之前的宿主细胞相比，所述辅助蛋白，优选地当过表达时，可以使宿主细胞中模型蛋白SDZ-Fab(重链SEQ ID NO:25和轻链SEQ ID NO:26；图2)或HyHEL-Fab(重链SEQ ID NO:29和轻链SEQ ID NO:30；图2)的产量增加至少1％，如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或至少200％。工程化之前的宿主细胞不会过表达本发明的辅助蛋白，而工程化之后的宿主细胞在适宜的培养条件下能够过表达所述辅助蛋白。已惊奇地发现，在实施例中描述的示例性重组细胞都能够使模型蛋白SDZ-Fab或HyHEL-Fab产量增加至少20％(1.2倍改变)。在一些情况下，产量增加140％，如实施例7所示。

优选地，本发明提供一种用于制备目标蛋白的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞被工程化为过表达多核苷酸，所述多核苷酸编码具有示于SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其功能同系物的辅助蛋白，其中所述功能同系物与SEQ ID NO:1具有至少30％的序列同一性，其中，与工程化之前的宿主细胞相比，所述辅助蛋白，优选地当过表达时，可以使宿主细胞中模型蛋白SDZ-Fab或HyHEL-Fab的产量增加至少1％，如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或至少200％。

优选地，本发明提供一种用于制备目标蛋白的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞被工程化为过表达多核苷酸，所述多核苷酸编码具有示于SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其功能同系物的辅助蛋白，其中所述功能同系物与SEQ ID NO:2具有至少30％的序列同一性，其中，与工程化之前的宿主细胞相比，所述辅助蛋白，优选地当过表达时，可以使宿主细胞中模型蛋白SDZ-Fab或HyHEL-Fab的产量增加至少1％，如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或至少200％。

优选地，本发明提供一种用于制备目标蛋白的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞被工程化为过表达多核苷酸，所述多核苷酸编码具有示于SEQ ID NO:3的氨基酸序列或其功能同系物的辅助蛋白，其中所述功能同系物与SEQ ID NO:3具有至少30％的序列同一性，其中，与工程化之前的宿主细胞相比，所述辅助蛋白，优选地当过表达时，可以使宿主细胞中模型蛋白SDZ-Fab或HyHEL-Fab的产量增加至少1％，如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或至少200％。

优选地，本发明提供一种用于制备目标蛋白的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞被工程化为过表达多核苷酸，所述多核苷酸编码具有示于SEQ ID NO:4的氨基酸序列或其功能同系物的辅助蛋白，其中所述功能同系物与SEQ ID NO:4具有至少30％的序列同一性，其中，与工程化之前的宿主细胞相比，所述辅助蛋白，优选地当过表达时，可以使宿主细胞中模型蛋白SDZ-Fab或HyHEL-Fab的产量增加至少1％，如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或至少200％。

优选地，本发明提供一种用于制备目标蛋白的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞被工程化为过表达多核苷酸，所述多核苷酸编码具有示于SEQ ID NO:5的氨基酸序列或其功能同系物的辅助蛋白，其中所述功能同系物与SEQ ID NO:5具有至少30％的序列同一性，其中，与工程化之前的宿主细胞相比，所述辅助蛋白，优选地当过表达时，可以使宿主细胞中模型蛋白SDZ-Fab或HyHEL-Fab的产量增加至少1％，如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或至少200％。

优选地，本发明提供一种用于制备目标蛋白的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞被工程化为过表达多核苷酸，所述多核苷酸编码具有示于SEQ ID NO:6的氨基酸序列或其功能同系物的辅助蛋白，其中所述功能同系物与SEQ ID NO:6具有至少30％的序列同一性，其中，与工程化之前的宿主细胞相比，所述辅助蛋白，优选地当过表达时，可以使宿主细胞中模型蛋白SDZ-Fab或HyHEL-Fab的产量增加至少1％，如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或至少200％。

优选地，本发明提供一种用于制备目标蛋白的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞被工程化为过表达多核苷酸，所述多核苷酸编码具有示于SEQ ID NO:7的氨基酸序列或其功能同系物的辅助蛋白，其中所述功能同系物与SEQ ID NO:7具有至少30％的序列同一性，其中，与工程化之前的宿主细胞相比，所述辅助蛋白，优选地当过表达时，可以使宿主细胞中模型蛋白SDZ-Fab或HyHEL-Fab的产量增加至少1％，如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或至少200％。

优选地，本发明提供一种用于制备目标蛋白的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞被工程化为过表达多核苷酸，所述多核苷酸编码具有示于SEQ ID NO:8的氨基酸序列或其功能同系物的辅助蛋白，其中所述功能同系物与SEQ ID NO:8具有至少30％的序列同一性，其中，与工程化之前的宿主细胞相比，所述辅助蛋白，优选地当过表达时，可以使宿主细胞中模型蛋白SDZ-Fab或HyHEL-Fab的产量增加至少1％，如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或至少200％。

优选地，本发明提供一种用于制备目标蛋白的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞被工程化为过表达多核苷酸，所述多核苷酸编码具有示于SEQ ID NO:9的氨基酸序列或其功能同系物的辅助蛋白，其中所述功能同系物与SEQ ID NO:9具有至少30％的序列同一性，其中，与工程化之前的宿主细胞相比，所述辅助蛋白，优选地当过表达时，可以使宿主细胞中模型蛋白SDZ-Fab或HyHEL-Fab的产量增加至少1％，如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或至少200％。

优选地，本发明提供一种用于制备目标蛋白的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞被工程化为过表达多核苷酸，所述多核苷酸编码具有示于SEQ ID NO:162的氨基酸序列或其功能同系物的辅助蛋白，其中所述功能同系物与SEQ ID NO:162具有至少30％的序列同一性，其中，与工程化之前的宿主细胞相比，所述辅助蛋白，优选地当过表达时，可以使宿主细胞中模型蛋白SDZ-Fab或HyHEL-Fab的产量增加至少1％，如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或至少200％。

第三方面，本发明提供所述工程化宿主细胞在制备目标蛋白中的用途。所述宿主细胞可有利地用来引入编码一种或多种POI的多核苷酸，然后可以将该宿主细胞在适宜条件下培养以表达所述POI。

第四方面，本发明提供一种增加宿主细胞中目标蛋白的产量的方法，所述方法包括：过表达多核苷酸，所述多核苷酸编码具有示于SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9或162的氨基酸序列或其功能同系物的辅助蛋白，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9或162的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性。

优选地，所述方法包括：过表达多核苷酸，所述多核苷酸编码具有示于SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其功能同系物的辅助蛋白，其中所述功能同系物与SEQ ID NO:1具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性。

优选地，所述方法包括：过表达多核苷酸，所述多核苷酸编码具有示于SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其功能同系物的辅助蛋白，其中所述功能同系物与SEQ ID NO:2具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性。

优选地，所述方法包括：过表达多核苷酸，所述多核苷酸编码具有示于SEQ ID NO:3的氨基酸序列或其功能同系物的辅助蛋白，其中所述功能同系物与SEQ ID NO:3具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性。

优选地，所述方法包括：过表达多核苷酸，所述多核苷酸编码具有示于SEQ ID NO:4的氨基酸序列或其功能同系物的辅助蛋白，其中所述功能同系物与SEQ ID NO:4具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性。

优选地，所述方法包括：过表达多核苷酸，所述多核苷酸编码具有示于SEQ ID NO:5的氨基酸序列或其功能同系物的辅助蛋白，其中所述功能同系物与SEQ ID NO:5具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性。

优选地，所述方法包括：过表达多核苷酸，所述多核苷酸编码具有示于SEQ ID NO:6的氨基酸序列或其功能同系物的辅助蛋白，其中所述功能同系物与SEQ ID NO:6具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性。

优选地，所述方法包括：过表达多核苷酸，所述多核苷酸编码具有示于SEQ ID NO:7的氨基酸序列或其功能同系物的辅助蛋白，其中所述功能同系物与SEQ ID NO:7具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性。

优选地，所述方法包括：过表达多核苷酸，所述多核苷酸编码具有示于SEQ ID NO:8的氨基酸序列或其功能同系物的辅助蛋白，其中所述功能同系物与SEQ ID NO:8具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性。

优选地，所述方法包括：过表达多核苷酸，所述多核苷酸编码具有示于SEQ ID NO:9的氨基酸序列或其功能同系物的辅助蛋白，其中所述功能同系物与SEQ ID NO:9具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性。

优选地，所述方法包括：过表达多核苷酸，所述多核苷酸编码具有示于SEQ ID NO:162的氨基酸序列或其功能同系物的辅助蛋白，其中所述功能同系物与SEQ ID NO:162具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性。

第五方面，本发明提供一种增加宿主细胞中目标蛋白的产量的方法，所述方法包括：

—将宿主细胞工程化为过表达由多核苷酸编码的辅助蛋白，所述多核苷酸编码具有示于SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9或162的氨基酸序列或其功能同系物的辅助蛋白，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9或162的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性；

—在所述宿主细胞中重组编码目标蛋白的异源多核苷酸；和

—在适宜条件下培养所述宿主细胞以过表达所述辅助蛋白或功能同系物和一种或多种所述目标蛋白。

在用于增加蛋白产量的方法的上下文中，所述“工程化步骤”和“重组步骤”的顺序可以互换，使得“重组步骤”位于“工程化步骤”之前。尤其，如本文所述，当辅助蛋白过表达和/或KO蛋白低表达时，目标蛋白的产量增加。

优选地，本发明提供一种增加宿主细胞中目标蛋白的产量的方法，所述方法包括：

—将宿主细胞工程化为过表达由多核苷酸编码的辅助蛋白，所述多核苷酸编码具有示于SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其功能同系物的辅助蛋白，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性；

—在所述宿主细胞中重组编码目标蛋白的异源多核苷酸；和

—在适宜条件下培养所述宿主细胞以过表达所述辅助蛋白或所述功能同系物和一种或多种所述目标蛋白。

—将宿主细胞工程化为过表达由多核苷酸编码的辅助蛋白，所述多核苷酸编码具有示于SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其功能同系物的辅助蛋白，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性；

—在所述宿主细胞中重组编码目标蛋白的异源多核苷酸；和

—将宿主细胞工程化为过表达由多核苷酸编码的辅助蛋白，所述多核苷酸编码具有示于SEQ ID NO:3的氨基酸序列或其功能同系物的辅助蛋白，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性；

—在所述宿主细胞中重组编码目标蛋白的异源多核苷酸；和

—将宿主细胞工程化为过表达由多核苷酸编码的辅助蛋白，所述多核苷酸编码具有示于SEQ ID NO:4的氨基酸序列或其功能同系物的辅助蛋白，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性；

—在所述宿主细胞中重组编码目标蛋白的异源多核苷酸；和

—将宿主细胞工程化为过表达由多核苷酸编码的辅助蛋白，所述多核苷酸编码具有示于SEQ ID NO:5的氨基酸序列或其功能同系物的辅助蛋白，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性；

—在所述宿主细胞中重组编码目标蛋白的异源多核苷酸；和

—将宿主细胞工程化为过表达由多核苷酸编码的辅助蛋白，所述多核苷酸编码具有示于SEQ ID NO:6的氨基酸序列或其功能同系物的辅助蛋白，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性；

—在所述宿主细胞中重组编码目标蛋白的异源多核苷酸；和

—将宿主细胞工程化为过表达由多核苷酸编码的辅助蛋白，所述多核苷酸编码具有示于SEQ ID NO:7的氨基酸序列或其功能同系物的辅助蛋白，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性；

—在所述宿主细胞中重组编码目标蛋白的异源多核苷酸；和

—将宿主细胞工程化为过表达由多核苷酸编码的辅助蛋白，所述多核苷酸编码具有示于SEQ ID NO:8的氨基酸序列或其功能同系物的辅助蛋白，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性；

—在所述宿主细胞中重组编码目标蛋白的异源多核苷酸；和

—将宿主细胞工程化为过表达由多核苷酸编码的辅助蛋白，所述多核苷酸编码具有示于SEQ ID NO:9的氨基酸序列或其功能同系物的辅助蛋白，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性；

—在所述宿主细胞中重组编码目标蛋白的异源多核苷酸；和

—将宿主细胞工程化为过表达由多核苷酸编码的辅助蛋白，所述多核苷酸编码具有示于SEQ ID NO:162的氨基酸序列或其功能同系物的辅助蛋白，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:162的氨基酸序列具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性；

—在所述宿主细胞中重组编码目标蛋白的异源多核苷酸；和

第六方面，本发明提供一种在宿主细胞中制备目标蛋白的方法，所述方法包括：

—提供宿主细胞，所述宿主细胞被工程化为过表达多核苷酸，所述多核苷酸编码具有示于SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9或162的氨基酸序列或其功能同系物的辅助蛋白，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9或162的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性，其中所述宿主细胞包含编码目标蛋白的异源多核苷酸；

—在适宜条件下培养所述宿主细胞以过表达所述辅助蛋白和表达目标蛋白。

优选地，本发明提供一种在宿主细胞中制备目标蛋白的方法，所述方法包括：

—提供宿主细胞，所述宿主细胞被工程化为过表达多核苷酸，所述多核苷酸编码具有示于SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其功能同系物的辅助蛋白，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性，其中所述宿主细胞包含编码目标蛋白的异源多核苷酸；

—提供宿主细胞，所述宿主细胞被工程化为过表达多核苷酸，所述多核苷酸编码具有示于SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其功能同系物的辅助蛋白，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性，其中所述宿主细胞包含编码目标蛋白的异源多核苷酸；

—提供宿主细胞，所述宿主细胞被工程化为过表达多核苷酸，所述多核苷酸编码具有示于SEQ ID NO:3的氨基酸序列或其功能同系物的辅助蛋白，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性，其中所述宿主细胞包含编码目标蛋白的异源多核苷酸；

—提供宿主细胞，所述宿主细胞被工程化为过表达多核苷酸，所述多核苷酸编码具有示于SEQ ID NO:4的氨基酸序列或其功能同系物的辅助蛋白，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性，其中所述宿主细胞包含编码目标蛋白的异源多核苷酸；

—提供宿主细胞，所述宿主细胞被工程化为过表达多核苷酸，所述多核苷酸编码具有示于SEQ ID NO:5的氨基酸序列或其功能同系物的辅助蛋白，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性，其中所述宿主细胞包含编码目标蛋白的异源多核苷酸；

—提供宿主细胞，所述宿主细胞被工程化为过表达多核苷酸，所述多核苷酸编码具有示于SEQ ID NO:6的氨基酸序列或其功能同系物的辅助蛋白，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性，其中所述宿主细胞包含编码目标蛋白的异源多核苷酸；

—提供宿主细胞，所述宿主细胞被工程化为过表达多核苷酸，所述多核苷酸编码具有示于SEQ ID NO:7的氨基酸序列或其功能同系物的辅助蛋白，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性，其中所述宿主细胞包含编码目标蛋白的异源多核苷酸；

—提供宿主细胞，所述宿主细胞被工程化为过表达多核苷酸，所述多核苷酸编码具有示于SEQ ID NO:8的氨基酸序列或其功能同系物的辅助蛋白，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性，其中所述宿主细胞包含编码目标蛋白的异源多核苷酸；

—提供宿主细胞，所述宿主细胞被工程化为过表达多核苷酸，所述多核苷酸编码具有示于SEQ ID NO:9的氨基酸序列或其功能同系物的辅助蛋白，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性，其中所述宿主细胞包含编码目标蛋白的异源多核苷酸；

—提供宿主细胞，所述宿主细胞被工程化为过表达多核苷酸，所述多核苷酸编码具有示于SEQ ID NO:162的氨基酸序列或其功能同系物的辅助蛋白，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:162的氨基酸序列具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性，其中所述宿主细胞包含编码目标蛋白的异源多核苷酸；

附图说明

图1示出了HP1、HP2、HP3、HP4、HP5、HP6、HP7、HP8、HP9、HP10、KO1、KO2和KO3的氨基酸和多核苷酸序列。

图2示出了模型蛋白SDZ-Fab和HyHEL-Fab各自的重链和轻链的氨基酸和多核苷酸序列。

本发明的项目

1)一种用于制备目标蛋白的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞被工程化为过表达多核苷酸，所述多核苷酸编码具有示于SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9或162的氨基酸序列或其功能同系物的辅助蛋白，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9或162的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性。

2)项目 1的宿主细胞，其中与工程化之前的宿主细胞相比，所述辅助蛋白或所述其功能同系物，优选地当过表达时，使模型蛋白SDZ-Fab(SEQ ID NO.25和26)和/或HyHEL-Fab的产量增加，优选地至少20％(SEQ ID NO.29和30)。

3)前述项目中任一项的宿主细胞，其中所述过表达通过在所述宿主细胞中具有1、2、3、4或更多个拷贝的所述编码辅助蛋白或其功能同系物的多核苷酸实现。

4)前述项目中任一项的宿主细胞，其中所述多核苷酸整合在所述宿主细胞的基因组中。

5)项目4的宿主细胞，其中所述整合是异位地和/或在天然基因座上。

6)项目5的宿主细胞，其中至少一种所述多核苷酸被整合在所述宿主细胞基因组的AOX1、GAP、ENO1、TEF、HIS4、TYR1、HIS3、LEU2、URA3、LYS2、ADE2、TRP1、GAL1或ADH1基因座上。

7)项目1、2或3的宿主细胞，其中所述多核苷酸包含在载体或质粒中。

8)项目7的宿主细胞，其中所述载体为YIp型载体、YEp型载体、YRp型载体、YCp型载体、pGPD-2、pAO815、pGAPZ、pGAPZα、pHIL-D2、pHIL-S1、pPIC3.5K、pPIC9K、pPICZ、pPICZα、pPIC3K、pHWO10、pPUZZLE或2μm质粒。

9)前述项目中任一项的宿主细胞，其中所述过表达通过采用驱动所述多核苷酸表达的重组启动子实现。

10)项目9的宿主细胞，其中所述启动子为PAOX1、PTPI、PPGK、PGAPDH、PLAC、PGAL、PPGI、PGAP、PTEF、PENO1、PTPI、PRPS2、PRPS7、PRPS31、PRPL1、PFLD、PICL、PTHI、PSSA1、PHSP90、PKAR2、PGND1、PGPM1、PTKL1、PPIS1、PFET3、PFTR1、PPHO8、PNMT1、PMCM1、PUBI4、PRAD2、PPET9、PFMD、PGAL1、PADH1、PADH2/GAP、PCUP1或PMAL。

11)项目9的宿主细胞，其中所述多核苷酸的过表达通过采用增强子以增强所述启动子的活性来实现。

12)项目11的宿主细胞，其中所述增强子为酵母菌上游激活序列UAS/GAL。

13)前述项目中任一项的宿主细胞，其中所述宿主细胞为巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)、多形汉森酵母(Hansenula polymorpha)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)、和Komagataella和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。

14)前述项目中任一项的宿主细胞，其中2、3、4、5、6、7、8、或更多个选自SEQ IDNO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、162或其功能同系物的辅助蛋白过表达。

15)前述项目中任一项的宿主细胞，其中所述宿主细胞被工程化为低表达编码蛋白的多核苷酸，所述蛋白具有与示于SEQ ID NO:10、11或12的氨基酸序列具有至少50％的序列同一性的氨基酸。

16)前述项目中任一项的宿主细胞，所述宿主细胞包含编码所述目标蛋白的异源多核苷酸序列。

17)项目16的宿主细胞，其中所述目标蛋白为酶、治疗性蛋白、食品添加剂或饲料添加剂，优选地为解毒酶。

18)项目17的宿主细胞，其中所述治疗性蛋白包括抗体或抗体片段。

19)前述项目中任一项的宿主细胞，其中过表达通过修饰可操作地连接至所述多核苷酸的调控序列实现，所述多核苷酸编码辅助蛋白或其功能同系物。

20)前述项目中任一项的宿主细胞，其中所述宿主细胞被工程化为：

(i)过表达多核苷酸，所述多核苷酸编码具有示于SEQ ID NO:4的氨基酸序列或其功能同系物和示于SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其功能同系物的辅助蛋白；

(ii)过表达多核苷酸，所述多核苷酸编码具有示于SEQ ID NO:162的氨基酸序列或其功能同系物和示于SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其功能同系物的辅助蛋白；

(iii)过表达多核苷酸，所述多核苷酸编码具有示于SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其功能同系物和示于SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其功能同系物的辅助蛋白，并进一步被工程化为低表达编码具有示于SEQ ID NO:10的氨基酸或其功能同系物的蛋白质的多核苷酸，或

(iv)过表达多核苷酸，所述多核苷酸编码具有示于SEQ ID NO:4的氨基酸序列或其功能同系物和示于SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其功能同系物的辅助蛋白，并进一步被工程化为低表达编码具有示于SEQ ID NO:10的氨基酸或其功能同系物的蛋白质的多核苷酸。

21)前述项目中任一项的宿主细胞在制备目标蛋白中的用途。

22)增加宿主细胞中目标蛋白的产量的方法，所述方法包括：过表达多核苷酸，所述多核苷酸编码具有示于SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9或162的氨基酸序列或其功能同系物的辅助蛋白，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9或162的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性。

23)一种增加宿主细胞中目标蛋白的产量的方法，所述方法包括：

—将宿主细胞工程化为过表达多核苷酸，所述多核苷酸编码具有示于SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9或162的氨基酸序列或其功能同系物的辅助蛋白，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9或162的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性；

—在所述宿主细胞中重组编码目标蛋白的异源多核苷酸；

—在适宜条件下培养所述宿主细胞以过表达所述辅助蛋白或其功能同系物和所述目标蛋白，和可选地

—从细胞培养物中分离目标蛋白。

24)一种在宿主细胞中制备目标蛋白的方法，所述方法包括：

—在适宜条件下培养所述宿主细胞以过表达所述辅助蛋白或其功能同系物，和表达目标蛋白，和可选地

—从细胞培养物中分离目标蛋白。

25)项目22-24中任一项的方法，其中所述宿主细胞被工程化为低表达至少一种多核苷酸，所述多核苷酸编码蛋白质，所述蛋白质具有与示于SEQ ID NO:10、11和/或12的氨基酸序列具有至少50％的序列同一性的氨基酸。

26)项目25的方法，其中所述低表达通过以下实现：

a)修饰SEQ ID NO:10、11和/或12的启动子或其它基因调控序列，和/或

b)修饰SEQ ID NO:10、11和/或12的编码序列，从而降低由所述SEQ ID编码的蛋白质的体内半衰期/稳定性。

27)项目22-25中任一项的方法，其中，所述过表达通过在所述宿主细胞中具有1、2、3、4或更多个拷贝的所述编码辅助蛋白或其功能同系物的多核苷酸实现。

28)项目22-26中任一项的方法，其中所述多核苷酸整合在所述宿主细胞的基因组中。

29)项目28的方法，其中所述整合是异位地或在天然基因座上。

30)项目28的方法，其中所述多核苷酸被整合在所述宿主细胞基因组的AOX1、GAP、ENO1、TEF、HIS4、TYR1、HIS3、LEU2、URA3、LYS2、ADE2、TRP1、GAL1或ADH1基因座上。

31)项目22至27中任一项的方法，其中所述多核苷酸包含在载体或质粒中。

32)项目31的方法，其中所述载体为YIp型载体、YEp型载体、YRp型载体、YCp型载体、pGPD-2、pAO815、pGAPZ、pGAPZα、pHIL-D2、pHIL-S1、pPIC3.5K、pPIC9K、pPICZ、pPICZα、pPIC3K、pHWO10、或2μm质粒。

33)项目22至32中任一项的方法，其中所述过表达通过采用驱动所述多核苷酸表达的重组启动子实现。

34)项目33的方法，其中所述启动子为PAOX1、PTPI、PPGK、PGAPDH、PLAC、PGAL、PPGI、PGAP、PTEF、PENO1、PTPI、PRPS2、PRPS7、PRPS31、PRPL1、PFLD、PICL、PTHI、PSSA1、PHSP90、PKAR2、PGND1、PGPM1、PTKL1、PPIS1、PFET3、PFTR1、PPHO8、PNMT1、PMCM1、PUBI4、PRAD2、PPET9、PFMD、PGAL1、PADH1、PADH2/GAP、PCUP1或PMAL。

35)项目33的方法，其中所述多核苷酸的过表达通过采用增强子以增强所述启动子的活性来实现。

36)项目35的方法，其中所述增强子为酵母菌上游激活序列UAS/GAL。

37)项目22至26中任一项的方法，其中所述宿主细胞为巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)、多形汉森酵母(Hansenula polymorpha)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)、和Komagataella和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。

38)项目22至37中任一项的方法，其中2、3、4、5、6、7、8、或更多个选自SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、162或其功能同系物的辅助蛋白过表达。

39)项目22至38中任一项的方法，其中所述目标蛋白为酶、治疗性蛋白、食品添加剂或饲料添加剂，优选地为解毒酶。

40)项目39的方法，其中所述治疗性蛋白包括抗体或抗体片段。

41)项目22至40中任一项的方法，其中与工程化之前的宿主细胞相比，所述辅助蛋白，优选地当过表达时，使模型蛋白SDZ-Fab和/或HyHEL-Fab的产量增加至少20％。

42)一种分离的多核苷酸序列，所述分离的多核苷酸序列编码具有示于SEQ IDNO:1、2、3、4、5、6、7、8、9或162的氨基酸序列或其功能同系物的辅助蛋白，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9或162的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性。

43)项目42的分离的多核苷酸，其与SEQ ID NO:13、14、15、16、17、18、19、20、21或163中任一核苷酸序列具有100％的序列同一性。

44)根据项目42或43的分离的多核苷酸序列在整合至宿主细胞中的用途。

45)一种分离的多肽，所述分离的多肽包含与选自SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9或162的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性的多肽序列。

46)根据项目45的分离的多肽在制备目标蛋白中的用途。

47)根据项目42或43的多核苷酸在制备目标蛋白中的用途。

48)根据项目42或43的多核苷酸在制备宿主细胞中的用途。

49)一种组合物，所述组合物包括至少10％、20％、30％、40％或50％的目标蛋白和根据项目42或43的多核苷酸，其中所述多核苷酸可操作地与异源启动子连接。

发明详述

本发明部分地基于对辅助蛋白HP1、HP2、HP3、HP4、HP5、HP6、HP7、HP8、HP9和HP10的表达能增加目标蛋白的分泌这一惊人的发现。每一辅助蛋白的氨基酸序列及其在实施例中对应的命名列于下表1：

表1

特别地，在对巴斯德毕赤酵母中的分泌辅助因子的筛选中，鉴定了55个候选基因，通过湿-室表达实验(wet-lab expression experiment)验证这些候选基因以便选择最佳候选基因。最佳候选基因是这样的候选基因：与未过表达所述最佳候选基因的巴斯德毕赤酵母菌株(即，如本文所述的工程化之前的宿主细胞)相比，最佳候选基因使本文所描述的两种模型蛋白SDZ-Fab#9和/或HyHEL-Fab#8的产量增强20％或更高程度。为此，从55个基因中鉴定了9个最佳候选基因。当过表达时，分别地，4个最佳候选基因即PP7435_Chr3-0607、PP7435_Chr3-0933、PP7435_Chr2-0220(SBH1)、PP7435_Chr3-0639(CPR6)对模型蛋白SDZ-Fab和HyHEL Fab都显示出了大于20％的分泌和/或表达增强，另外5个候选基因(PP7435_Chr4-0108(MXR2)、PP7435_Chr1-1232、PP7435_Chr1-1225(MDR1)、PP7435_Chr1-0667、PP7435_Chr4-0448)对两种模型蛋白SDZ-Fab和HyHEL Fab中的一种显示出了>20-30％分泌产量增强。

然而，进一步鉴定了3个候选基因，即KO1(FLO8)、KO2(HCH1)、KO3(SCJ1)，为了增强分泌和/或表达，这3个候选基因的表达必须如通过敲除来降低或优选地消除，由此deltaKO1增强了两种模型蛋白的产量，deltaKO3和deltaKO2增强了HyHEL-Fab的产量。

筛选的依据是巴斯德毕赤酵母生产菌株与巴斯德毕赤酵母非生产菌株的转录谱之间的直接比较，这导致55个基因的鉴定。这些基因属于多种代谢途径并具有不同的功能，或甚至可具有未知功能。因此，从基因或由其编码的蛋白中没有明显针对由此获得的辅助因子的性质的教导。因此，为了验证潜在分泌辅助因子是否确实是实际条件下的辅助因子，必须进行试验。然而，显然潜在辅助因子确实是辅助因子并不是显而易见的，仅仅因为其是通过在生产菌株中增强的转录表现来确定的。事实上，潜在辅助因子对蛋白分泌可能没有积极作用或可能甚至具有负面作用。发明人确实观察到了上述事实，因为从55个基因中鉴定的两个编码伴侣蛋白的基因(SCJ1、HCH1)本应可以合理预期增强分泌，但却是相反的。因此，针对每一基因进行试验是必须的，且不存在由所述约60个基因中的任一个编码的蛋白确实是分泌辅助因子的教导。

因此，“真正的”分泌辅助因子的发现不是简单的事，而是创造性选择，因为仅从本发明的发明人自筛选中鉴定的蛋白的基因/蛋白序列或功能，无可获得的教导或所述教导不是显而易见的。

关于本文描述的必须过表达的最佳候选基因的其它不寻常之处在于，这些最佳候选基因不是典型的分泌辅助因子，即，其编码的蛋白所具有的功能不被视为在蛋白质分泌中发挥作用或甚至具有未知功能的基因。

对于必须从伴侣蛋白(KO2、KO3)中敲除的基因，人们曾预料过表达是有益的，但事实上，是所述缺失具有积极作用。对于在面包酵母(baker’syeast)中的絮凝中起作用的KO1，人们不曾预料其缺失增强了蛋白质分泌。面包酵母中的絮凝是当二倍体面包酵母丝状生长或当单倍体细胞扩散性生长时，然后这些细胞聚集的一种现象。然而，技术人员很可能不会假设敲除絮凝基因会增强蛋白质分泌。

本发明所用“辅助蛋白”是指增强目标蛋白的产量的蛋白。这一术语应被广泛理解且不应被局限于伴侣蛋白或伴侣样蛋白。本发明的公开内容明显呈现出，本发明的辅助蛋白的功能是变化的。本发明的辅助蛋白包含SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8或9中任一个的氨基酸序列或其功能同系物。本发明的辅助蛋白还可包含SEQ ID NO:162的氨基酸序列。本发明的辅助蛋白可以分别是由SEQ ID NO:13、14、15、16、17、18、19、20或21编码的，或者是由编码SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8或9的功能同系物的SEQ ID NO:13、14、15、16、17、18、19、20或21的变体中任一个的核苷酸序列编码的。本发明的辅助蛋白还可以是由SEQ ID NO:163或者编码SEQ ID NO:162的功能同系物的SEQ ID NO:163的变体的核苷酸序列编码的。对于本发明的目的，术语“辅助蛋白”还旨在分别包括HP1、HP2、HP3、HP4、HP5、HP6、HP7、HP8、HP9和HP10的功能同系物。例如，辅助蛋白HP1包含编码SEQ ID NO:4或编码SEQ ID NO:4的功能同系物的氨基酸序列。本发明提供分离的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列编码具有示于SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9或162的氨基酸序列或其功能同系物的辅助蛋白，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9或162的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性。

如本文所用，多肽的“同系物”或“功能同系物”是指在其一级、二级或三级结构的对应位置具有相同或保守性残基的多肽。该术语还延伸至两个或更多个编码同源多肽的核苷酸序列。特别地，与本发明的辅助蛋白同源的多肽对于全长天然序列或其任何片段具有至少约30％的氨基酸序列同一性。优选地，同源多肽与天然化合物或全长化合物的任何其它具体限定的片段具有至少约35％的氨基酸序列同一性，更优选地至少约40％的氨基酸序列同一性，更优选地至少约45％的氨基酸序列同一性，更优选地至少约50％的氨基酸序列同一性，更优选地至少约55％的氨基酸序列同一性，更优选地至少约60％的氨基酸序列同一性，更优选地至少约65％的氨基酸序列同一性，更优选地至少约70％的氨基酸序列同一性，更优选地至少约75％的氨基酸序列同一性，更优选地至少约80％的氨基酸序列同一性，更优选地至少约85％的氨基酸序列同一性，更优选地至少约90％的氨基酸序列同一性，如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性，更优选地至少约95％的氨基酸序列同一性。当这种同系物作为辅助蛋白的功能被验证时，该同系物称为“功能同系物”。功能同系物与其所源自的辅助蛋白履行相同或基本相同的功能，即该功能同系物使本文描述的模型蛋白SDZ-Fab和/或HyHEL-Fab的产量增加。所述功能可以通过本领域已知的实验，或优选地用如实施例7或实施例5C描述的，特别是在上文“Fab效价”或“Fab产量”的上下文中描述的，采用模型蛋白的实验测定。本发明提供的多核苷酸序列编码SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9或162或SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9或162的功能同系物。

一般而言，可采用本领域已知的任何突变程序，如定点突变、合成基因构建、半合成基因构建、随机突变、改组(shuffling)等等，来制备同系物。定点突变是一项在编码亲本的多核苷酸上的一个或多个限定的位点引入一个或多个(如若干)突变的技术。可以通过涉及包含所需突变的寡核苷酸引物的应用的PCR在体外完成定点突变。还可通过盒式突变在体外来实施定点突变，所述盒式突变涉及通过限制性酶在包含编码亲本的多核苷酸的质粒的位点上的切割和随后在该多核苷酸上的包含所述突变的寡核苷酸的连接。通常，消化所述质粒和所述寡核苷酸的限制性酶是相同的，从而允许质粒的粘性末端和插入物彼此相连。参见，如Scherer和Davis,1979,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:4949-4955；和Barton等,1990,Nucleic Acids Res.18:7349-4966。还可通过本领域已知的方法在体内完成定点突变。参见，如美国专利申请公开文本No.2004/0171 154；Storici等，2001,NatureBiotechnol.19:773-776；Kren等，1998,Nat.Med.4:285-290；和Calissano和Macino,1996,Fungal Genet.Newslett.43:15-16。合成基因构建需要体外合成设计的多核苷酸分子来编码目标多肽。可利用多种技术，如由Tian等(2004,Nature 432:1050-1054)描述的基于多路微芯片的技术及其中将寡核苷酸合成并装配至电流可编程的微流体芯片(photo-programmable microfluidic chip)上的类似技术来实施基因合成。采用已知的突变、重组和/或改组的方法，随后是相关的筛选程序，如由Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science241:53-57；Bowie和Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:2152-2156；WO 95/17413或WO 95/22625公开的那些，可以完成并测定单个或多个氨基酸置换、缺失和/或插入。其它可用的方法包括易出错(error-prone)PCR、噬菌体展示(如，Lowman等，1991,Biochemistry30:10832-10837；美国专利No.5,223,409；WO 92/06204)和定区域突变(Derbyshire等，1986,Gene 46:145；Ner等，1988,DNA 7:127)。可以将突变/改组方法与高通量、自动筛选方法组合，以检测由宿主细胞表达的克隆的、突变的多肽的活性(Ness等，1999,NatureBiotechnology 17:893-896)。可自宿主细胞中回收编码活性多肽的突变的DNA分子并采用本领域已知的标准方法对其快速测序。这些方法允许快速确定单个氨基酸残基在多肽中的重要性。通过将合成基因构建、和/或定点突变、和/或随机突变、和/或改组的各个方面组合来完成半合成基因构建。半合成构建以利用合成的多核苷酸片段的过程与PCR技术组合为特征。因此，限定区域的基因可以被从头合成，而其它区域可以采用位点特异性突变引物扩增，而还有其它区域可以经受易出错PCR或无错PCR扩增。然后，将多核苷酸子序列改组。可选地，可以从自然来源，如通过筛选近亲或远亲微生物的cDNA文库获得同系物。

可通过提供已经插入了同源序列的表达盒，转化携带编码测试蛋白如用于实施例部分的模型蛋白的一种或特定POI的序列的宿主细胞，和测定在相同条件下模型蛋白或POI的产量差异，来测试SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9或162的同系物的功能。

功能同系物还可以是所述辅助蛋白的生物活性片段。通常，一种蛋白的生物活性片段是指与全长蛋白发挥类似的或相当的生物作用的片段。可以通过如氨基-和或羧基-端缺失以及内部缺失生产这种片段或变体。

第一方面，本发明提供分离的多核苷酸序列，所述分离的多核苷酸序列编码SEQID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9或162或者SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9或162的功能同系物。所述分离的多核苷酸序列可以包含SEQ ID NO:13、14、15、16、17、18、19、20、21或163中的任一个。优选地，所述分离的多核苷酸序列由SEQ ID NO:13、14、15、16、17、18、19、20、21或163中任一个核苷酸序列组成。

另一方面，本发明提供一种分离的多肽，所述分离的多肽序列包含与选自SEQ IDNO:1、2、3、4、5、6、7、8、9或162的氨基酸序列具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性。

术语“分离的”是指处于自然界中未出现的形式或环境的物质。分离的物质的非限制性实例包括：(1)任何非天然存在的物质；(2)至少部分地从自然界中与其相关的天然存在的成分的一种或多种或全部中取出的任何物质，包括但不限于，任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅助因子；(3)相对于自然界中发现的物质，经由人工修饰的任何物质；或(4)通过相对于与其天然相关的其他组分增加物质的量来修饰的任何物质(如，在宿主细胞中的重组生产；编码所述物质的基因的多个拷贝；和使用与编码所述物质的基因天然相关的启动子相比更强的启动子)。

本发明提供上述分离的多核苷酸中的任一个在整合至宿主细胞中的用途。可选地，若一种或多种所述多核苷酸已经存在于所述宿主细胞中，可以以使得其过表达的方式操作该宿主细胞，如稍后所描述的。再一方面，本发明涉及所述多核苷酸在增加宿主细胞中的POI产量中的用途，其中所述编码POI的核苷酸序列与所述多核苷酸共表达。

“序列同一性”或“％同一性”是指使用标准化算法比对的至少两个多肽或多核苷酸序列之间的残基匹配的百分数。为了使得两条序列之间的比对最佳，这种算法可以以标准化的和可重现的方式在比较的序列中插入间隙(gap)，由此达到两条序列的更加有意义的比较。对于本发明的目的，采用NCBI BLAST程序2.2.29版本(2014年1月6日)(Altschul等，Nucleic Acids Res.(1997)25:3389-3402)测定两条氨基酸序列或核苷酸之间的序列同一性。可以采用设定如下参数的blastp测定两条氨基酸序列的序列同一性：矩阵：BLOSUM62，字长：3；期望值：10；空位权重：存在＝11，延伸＝1；过滤＝低复杂性激活的；过滤字符串：L；组合调整(Compositional adjustments):有条件的组合评分矩阵调整。对于本发明的目的，采用设定如下示例性参数的blastn的NCBI BLAST程序2.2.29版本(2014年1月6日)测定两条核苷酸序列的序列同一性：字长：11；期望值：10；空位权重：存在＝5，延伸＝2；过滤＝低复杂性激活的；匹配/失配得分：2，-3；过滤字符串：L；m。

第二方面，本发明提供一种工程化为过表达编码本发明的辅助蛋白的多核苷酸的宿主细胞。所述辅助蛋白分别包括HP1至HP9(SEQ ID NO:1-9)和HP10(SEQ ID NO:162)中的任一个或其功能同系物。

优选地，本发明提供一种用于制备目标蛋白的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞被工程化为过表达多核苷酸，该多核苷酸编码具有与示于SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9或162具有至少30％的序列同一性的氨基酸的辅助蛋白。

术语“表达多核苷酸”是指当将多核苷酸转录成mRNA且将mRNA翻译成多肽时。术语“过表达”通常是指大于或等于参考标准品显示的表达水平的任何量。在本发明中术语“过表达(的)”是指基因产物或多肽以高于宿主细胞遗传改变之前的或在限定条件下未被遗传改变的相当的宿主中的相同基因产物或多肽的表达的水平表达。若宿主细胞不包含给定基因产物，将该基因产物引入所述宿主细胞用于表达是可能的；在这种情况下，术语“过表达”包括任何可检测的表达。

如本文所用，术语“工程化的”宿主细胞为已经用遗传工程(即，通过人为干预)操作了的宿主细胞。当宿主细胞被“工程化为过表达”给定蛋白时，操作该宿主细胞从而使该宿主细胞具有表达、优选地过表达辅助蛋白或其功能同系物的能力，由此与操作之前的相同条件下的宿主细胞相比，给定蛋白如POI或模型蛋白的表达增加。

当将“工程化之前”用于本发明的宿主细胞的上下文中时，是指这种宿主细胞没有被编码辅助蛋白或其功能同系物的多核苷酸工程化。因此，该术语还指不过表达编码辅助蛋白或其功能同系物的多核苷酸的宿主细胞或没有被工程化为过表达编码辅助蛋白或其功能同系物的多核苷酸的宿主细胞。

本文所用术语“重组”是指用编码目标蛋白的异源多核苷酸装备本发明的宿主细胞，即，本发明的宿主细胞被工程化为包含编码目标蛋白的异源多核苷酸。这可以通过如转化或转染或用于将多核苷酸引入宿主细胞的任何其它本领域已知的适宜技术来实现。

过表达

正如将在后面详细描述的，以本领域技术人员已知的任何方式都可实现过表达。一般而言，可通过提高基因的转录/翻译，如通过提高所述基因的拷贝数或者改变或修饰与基因表达相关的调控序列或位点来实现过表达。例如，通过引入可操作地连接至调控序列(如启动子)的编码辅助蛋白或功能同系物的多核苷酸的一个或多个拷贝来实现过表达。例如，为了达到高表达水平，可将所述基因可操作地连接至强的组成型启动子和/或强的广谱表达型(ubiquitous)启动子。这种启动子可以是内源性启动子或重组启动子。可选地，可以将调控序列移除从而使表达变为组成型的。人们可以用增加给定基因表达的或导致给定基因组成型表达的异源启动子替换给定基因的天然启动子。例如，与工程化之前的并在相同条件下培养的宿主细胞相比，所述宿主细胞可以过表达所述辅助蛋白大于10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％或大于300％。额外地使用诱导型启动子可使宿主细胞培养过程中的表达增加。此外，还可通过以下方式实现过表达，例如修饰特定基因的染色体位置；改变与特定基因相邻的核酸序列，所述特定基因如核糖体结合位点或转录终止子；修饰与所述基因转录和/或与所述基因产物的翻译相关的蛋白(如，调控蛋白、抑制子、增强子、转录激活因子等等)；或任何其它本领域常规的使特定基因表达失调的常规技术(包括但不限于，反义核苷酸分子的应用，例如以阻断阻遏蛋白的表达，或者缺失或突变通常抑制需要过表达的基因的表达的转录因子的基因。延长mRNA的寿命也可提高表达水平。例如，某些终止子区可用于延长mRNA的半衰期(Yamanishi等，Biosci.Biotechnol.Biochem.(2011)75:2234和US 2013/0244243)。若包括多个拷贝的基因，这些基因既可以位于可变拷贝数的质粒中，也可以是在染色体中整合并扩增的。若所述宿主细胞不包含编码辅助蛋白的基因产物，则可以将基因产物引入宿主细胞用于表达。此时，“过表达”是指采用本领域技术人员已知的任何方法表达所述基因产物。

本领域技术人员将在Martin等(Bio/Technology 5,137-146(1987))、Guerrero等(Gene 138,35-41(1994))、Tsuchiya和Morinaga(Bio/Technology 6,428-430(1988))、Eikmanns等(Gene 102,93-98(1991))、EP 0 472 869、US 4,601,893、Schwarzer和

(Bio/Technology 9,84-87(1991))、Reinscheid等(Applied and EnvironmentalMicrobiology 60,126-132(1994))、LaBarre等(Journal of Bacteriology 175,1001-1007(1993))、WO 96/15246、Malumbres等(Gene 134,15-24(1993))、JP-A-10-229891、Jensen和Hammer(Biotechnology and Bioengineering 58,191-195(1998))和Makrides(Microbiological Reviews 60,512-538(1996))中，特别是在公知的遗传和分子生物教科书中发现相关说明。

辅助蛋白

本发明的辅助蛋白最初是从巴斯德毕赤酵母CBS7435菌株中分离的。该甲基营养型酵母毕赤酵母(Pichia pastoris)(Komagataella phaffii)CBS7435菌株是常用的毕赤酵母重组蛋白生产宿主的亲本菌株。其完整的基因组序列描述于Küberl等(J Biotechnol.(2011)154(4):312-20)中。编码本文所鉴定的辅助蛋白的这些基因迄今尚未与对蛋白质产量的有益作用相关联。

由于辅助蛋白在其它微生物中的存在，因此，设想其能够在广泛的宿主细胞中过表达。因此，辅助蛋白的序列可取自或源自其它原核或真核生物体，而不是采用对于其种或属而言为天然的序列。可以从多种来源，如从植物、昆虫、真菌或哺乳动物物种，优选地从酵母纲，优选地从酵母目，优选地从酵母科，优选地从Komagataella属中获得编码辅助蛋白的外源(foreign)DNA序列。

HP1-HP10

特别地，本发明涉及一种基因修饰的宿主细胞，该宿主细胞能够过表达辅助蛋白HP1、HP2、HP3、HP4、HP5、HP6、HP7、HP8、HP9或HP10或它们的组合，或者HP1、HP2、HP3、HP4、HP5、HP6、HP7、HP8、HP9或HP10或它们的组合的功能同系物。在一个优选的实施方案中设想了被工程化为反映这种组合的宿主细胞。优选地将这些宿主细胞用于本文描述的方法和用途中。该组合包括选自HP1、HP2、HP3、HP4、HP5、HP6、HP7、HP8、HP9、HP10的2种或更多种，如2、3、4、5、6、7、8或更多种辅助蛋白或功能同系物。

同样地，该组合包括一种或多种选自HP1、HP2、HP3、HP4、HP5、HP6、HP7、HP8、HP9、HP10或其功能同系物的辅助蛋白与选自KO1、KO2、KO3的KO蛋白的组合。在一个优选的实施方案中设想了被工程化为反映这种组合的宿主细胞。优选地将这些宿主细胞用于本文描述的方法和用途中。“反映”是指根据本发明的教导，本领域技术人员知道辅助蛋白过表达，而KO蛋白低表达。

然而，辅助蛋白HP3(SEQ ID NO:2)或其功能同系物与HP1(SEQ ID NO:4)或其功能同系物，或者辅助蛋白HP10(SEQ ID NO:162)或其功能同系物与HP3(SEQ ID NO:2)或其功能同系物的具体组合是优选地用于本发明的方法和用途中的本发明的宿主细胞的优选的实施方案。

此外，辅助蛋白HP2(SEQ ID NO:1)或其功能同系物与HP3(SEQ ID NO:2)或其功能同系物和KO蛋白KO1(SEQ ID NO:10)，或者辅助蛋白HP2(SEQ ID NO:1)或其功能同系物与HP1(SEQ ID NO:4)或其功能同系物和KO蛋白KO1(SEQ ID NO:10)的具体组合是优选地用于本发明的方法和用途中的本发明的宿主细胞的优选的实施方案。

优选地，本发明提供一种用于制备目标蛋白的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞被工程化为过表达多核苷酸，该多核苷酸编码具有与SEQ ID NO:1具有至少40％的序列同一性、与SEQ ID NO:2具有至少45％的序列同一性、与SEQ ID NO:3具有至少50％的序列同一性、与SEQ ID NO:4具有至少45％的序列同一性、与SEQ ID NO:5具有至少50％的序列同一性、与SEQ ID NO:6具有至少45％的序列同一性、与SEQ ID NO:7具有至少40％的序列同一性、与SEQ ID NO:8具有至少40％的序列同一性、与SEQ ID NO:9具有至少40％的序列同一性或与SEQ ID NO:162具有至少45％的序列同一性的氨基酸的辅助蛋白。这种宿主细胞用于本文所述的方法和用途中。

目标蛋白

本文所用术语“目标蛋白”(POI)是指在宿主细胞中通过重组技术生产的蛋白。更具体地，所述蛋白既可以是非天然地存在于宿主细胞中的多肽，即异源蛋白，也可以是对于所述宿主细胞而言天然的，即是宿主细胞的同源蛋白，但通过例如用含有编码POI的核酸序列的自我复制载体的转化、或通过重组技术将编码POI的核酸序列的一个或多个拷贝整合至宿主细胞的基因组、或通过控制编码POI的基因表达的一个或多个调控序列(如启动子序列)的重组修饰而生产的。一般而言，可以通过本领域技术人员熟知的重组表达方法生产本文提及的目标蛋白。

宿主细胞

如本文所用，“宿主细胞”是指一种能够表达蛋白和可选地分泌蛋白的细胞。这种宿主细胞用于本发明的方法。针对使宿主细胞表达一种多肽这一目的，使编码该多肽的核苷酸序列存在于该细胞或将其引入该细胞。本发明提供的宿主细胞可以是原核生物或真核生物。如本领域技术人员所理解的，原核细胞无核膜，而真核细胞具有核膜。真核细胞的实例包括但不限于：脊椎动物细胞、哺乳动物细胞、人细胞、动物细胞、无脊椎动物细胞、植物细胞、线虫细胞、昆虫细胞、干细胞、真菌细胞或酵母细胞。

酵母细胞的实例包括但不限于：酵母属(如酿酒酵母、克鲁维酵母(Saccharomyceskluyveri)、葡萄汁酵母菌(Saccharomyces uvarum))、Komagataella属(Komagataellapastoris、Komagataella pseudopastoris或Komagataella phaffii)、克鲁维酵母属(如乳酸克鲁维酵母、马克思克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus))、假丝酵母属(如产朊假丝酵母(Candina utilis)、可可假丝酵母(Candida cacaoi))、地霉属(如，发酵地霉(Geotrichum fermentans))、以及多形汉森酵母和解脂耶氏酵母。

毕赤酵母属是特别感兴趣的。毕赤酵母属包含许多种，包括巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)种、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)种、克鲁维毕赤酵母(Pichiakluyveri)种和安格斯毕赤酵母(Pichia angusta)种。最优选的是巴斯德毕赤酵母种。

已将前种巴斯德毕赤酵母分类并重新命名为Komagataella pastoris和Komagataella phaffii。因此巴斯德毕赤酵母与Komagataella pastoris和Komagataellaphaffii是同义词。

用于本发明的巴斯德酵母菌株的实例是X33及其亚型GS115、KM71、KM71H；CBS7435(mut+)及其亚型CBS7435mut^s、CBS7435mut^sΔArg、CBS7435mut^sΔHis、CBS7435mut^sΔArg、ΔHis、CBS7435mut^s PDI⁺、CBS 704(＝NRRL Y-1603＝DSMZ 70382)、CBS 2612(＝NRRL Y-7556)、CBS 9173-9189和DSMZ 70877及其突变体。

大肠杆菌的实例包括源自大肠杆菌K12菌株的那些，具体为，HMS 174、HMS174(DE3)、NM533、XL1-Blue、C600、DH1、HB101、JM109，以及源自B-菌株的那些，具体为BL-21、BL21(DE3)等。

根据进一步优选的实施方案，所述宿主细胞是巴斯德毕赤酵母、多形汉森酵母(Hansenula polymorpha)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、博伊丁假丝酵母(Candidaboidinii)、和Komagataella和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。其也可以是来自玉蜀黍黑粉菌(Ustilago maydis)的宿主细胞。

优选地，所述由宿主细胞表达的辅助蛋白是来自相同的细胞或是由相同的种、属或科的细胞重组的。如本文所用，“重组(的)”是指通过人为干预的遗传材料的改变。通常，重组是指通过分子生物(重组DNA技术)方法(包括克隆和重组)对病毒、细胞、质粒或载体中DNA或RNA的操作。借助参考重组细胞、多肽或核酸与天然存在的对应物(“野生型”)的区别来描述重组细胞、多肽或核酸。“重组细胞”或“重组宿主细胞”是指这样一种细胞或宿主细胞，所述细胞或宿主细胞已经被遗传改变从而包含了对所述细胞而言为非天然的核酸序列。

本文所用术语“制备”是指目标蛋白表达的过程。“用于制备目标蛋白的宿主细胞”是指可引入编码目标蛋白的核酸序列的宿主细胞。本发明中的重组宿主细胞并不一定包含编码目标蛋白的核酸序列。本领域技术人员理解，可以例如在试剂盒中提供所述宿主细胞，用于将所需核苷酸序列插入该宿主细胞中。

本文所用术语“核苷酸序列”或“核酸序列”是指DNA或RNA。“核酸序列”或“多核苷酸序列”或简单地“多核苷酸”是指从5’至3’端读出的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单链或双链聚合物。其包括自复制质粒、DNA或RNA的感染性聚合物和非功能DNA或RNA。

术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以与天然存在的氨基酸类似的方式发挥作用的氨基酸类似物(analog)和氨基酸模拟物(mimetic)。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些，以及之后修饰的那些氨基酸，如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指与天然存在的氨基酸具有相同的基础化学结构的化合物，即，将碳连接至氢、羰基、氨基和R基，如高丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亚砜、蛋氨酸的甲基锍。这些类似物具有修饰的R基(如正亮氨酸)或修饰的肽骨架，但是保留与天然存在的氨基酸相同的基础化学结构。氨基酸模拟物是指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构，但是以与天然存在的氨基酸类似的方式发挥功能的化学化合物。

术语“多肽”与“蛋白”互换使用。术语“多肽”是指一种含有两个或更多个氨基酸，典型地至少3个，优选地至少20个，更优选地至少30个，诸如至少50个氨基酸的蛋白或肽。因此，多肽包含氨基酸序列，和因此，有时包含氨基酸序列的多肽在本文中称为“包含多肽序列的多肽”。因此，本文中术语“多肽序列”与术语“氨基酸序列”互换使用。如所提及的，可通过插入一个或大于一个额外的所选辅助蛋白的拷贝来实现过表达。根据优选的实施方案，编码辅助蛋白的多核苷酸可以以每个细胞中单一拷贝或多个拷贝的形式呈现。这些拷贝可以是彼此毗邻的或彼此远离的。根据另一个优选的实施方案，本发明的方法使用编码辅助蛋白的重组核苷酸序列，所述重组核苷酸序列以每个细胞中单一拷贝或多个拷贝的形式提供在一个或多个适于整合入宿主细胞基因组的质粒中。这些拷贝可以是彼此毗邻的或彼此远离的。在一个实施方案中，可以通过每个宿主细胞表达多核苷酸的一个或多个拷贝，如2、3、4、5、6或更多个所述多核苷酸的拷贝来实现过表达。优选地，所述多核苷酸可操作地连接至在宿主细胞中提供多肽表达的转录和翻译调控序列。本文所用术语“转录调控序列”是指与基因核酸序列有关的并调控该基因转录的核苷酸序列。本文所用术语“翻译调控序列”是指与基因核酸序列有关的并调控该基因翻译的核苷酸序列。转录和/或翻译调控序列既可以位于质粒或载体中，也可以整合至宿主细胞的染色体。转录和/或翻译调控序列可以位于该序列所调控的基因的相同的核酸分子中。优选地，可以通过在每个宿主细胞中具有1、2、3、4或更多个编码HP1或其功能同系物的多核苷酸的拷贝来实现过表达。

优选地，可以通过在每个宿主细胞中具有1、2、3、4或更多个编码HP2或其功能同系物的多核苷酸的拷贝来实现过表达。

优选地，可以通过在每个宿主细胞中具有1、2、3、4或更多个编码HP3或其功能同系物的多核苷酸的拷贝来实现过表达。

优选地，可以通过在每个宿主细胞中具有1、2、3、4或更多个编码HP4或其功能同系物的多核苷酸的拷贝来实现过表达。

优选地，可以通过在每个宿主细胞中具有1、2、3、4或更多个编码HP5或其功能同系物的多核苷酸的拷贝来实现过表达。

优选地，可以通过在每个宿主细胞中具有1、2、3、4或更多个编码HP6或其功能同系物的多核苷酸的拷贝来实现过表达。

优选地，可以通过在每个宿主细胞中具有1、2、3、4或更多个编码HP7或其功能同系物的多核苷酸的拷贝来实现过表达。

优选地，可以通过在每个宿主细胞中具有1、2、3、4或更多个编码HP8或其功能同系物的多核苷酸的拷贝来实现过表达。

优选地，可以通过在每个宿主细胞中具有1、2、3、4或更多个编码HP9或其功能同系物的多核苷酸的拷贝来实现过表达。

优选地，可以通过在每个宿主细胞中具有1、2、3、4或更多个编码HP10或其功能同系物的多核苷酸的拷贝来实现过表达。

优选地，将编码辅助蛋白的多核苷酸和/或编码POI的多核苷酸整合至宿主细胞的基因组中。术语“基因组”通常是指以DNA(或对于某些病毒物种以RNA)编码的生物体的全部遗传信息。基因组可存在于染色体中、质粒或载体中或两者兼有。优选地，将编码辅助蛋白的多核苷酸整合至所述细胞的染色体中。

可以将编码辅助蛋白或其功能同系物的多核苷酸整合在其天然基因座上。“天然基因座”是指在特定染色体上的位置，其中编码辅助蛋白的多核苷酸位于例如如表1所示HP1至10的天然基因座。然而，在另一个实施方案中，存在于宿主细胞的基因组中的编码辅助蛋白的多核苷酸未在它们的天然基因座上，而是被异位地整合。术语“异位的整合”是指在微生物基因组中不是其通常染色体基因座的位点的核酸的插入，即预定的或随机的整合。可选地，可以将所述编码辅助蛋白或其功能同系物的多核苷酸整合在其天然基因座上和异位地整合。

对于酵母细胞，可以将编码辅助蛋白的多核苷酸和/或编码POI的多核苷酸插入所需的基因位，如AOX1、GAP、ENO1、TEF、HIS4(Zamir等，Proc.NatL Acad.Sci.USA(1981)78(6):3496-3500)、HO(Voth等，Nucleic Acids Res.2001June 15；29(12):e59)、TYR1(Mirisola等，Yeast 2007；24:761–766)、His3、Leu2、Ura3(Taxis等，BioTechniques(2006)40:73-78)、Lys2、ADE2、TRP1、GAL1、ADH1或在5S核糖体RNA基因的整合上。

在其它实施方案中，可以将编码辅助蛋白的多核苷酸和/或编码POI的多核苷酸整合在质粒或载体中。术语“质粒”和“载体”包括自主复制的核苷酸序列以及基因组整合的核苷酸序列。技术人员能够依据所使用的宿主细胞选用适宜的质粒或载体。

优选地，所述质粒是真核表达载体，优选为酵母表达载体。

质粒可用于在适宜的宿主生物体中克隆的重组核苷酸序列(即重组基因)的转录和它们mRNA的翻译。质粒还可用于通过本领域已知的方法，如J.Sambrook等，MolecularCloning:A Laboratory Manual(3rd edition),Cold Spring Harbor Laboratory,ColdSpring Harbor Laboratory Press,New York(2001)描述的方法，将靶多核苷酸整合至宿主细胞基因组中。“质粒”通常包括用于在宿主细胞中自主复制的起点、选择标记、多个限制性酶切割位点、适宜的启动子序列和转录终止子，所述组份可操作地连接在一起。将编码多肽的目标序列可操作地连接至在宿主细胞中提供多肽表达的转录和翻译调控序列。

当核酸被置于与相同核酸分子上的另一核酸序列的功能关系中时，该核酸是“可操作地连接”的。例如，当启动子能够作用于重组基因的编码序列的表达时，该启动子与该重组基因的编码序列是可操作地连接的。

在每个细菌细胞中，大多数质粒以仅一个拷贝存在。但是，一些质粒以较多拷贝数存在。例如，对于大肠杆菌的每条染色体，质粒ColE1通常以10至20个质粒拷贝存在。如果质粒中包含本发明的核苷酸序列，则每个宿主细胞中，该质粒可具有20-30、30-100或更多的拷贝数。使用高拷贝数的质粒，可以通过细胞过表达辅助蛋白。

本领域技术人员已知大量适宜的质粒或载体，并且很多质粒或载体是商购可获得的。Sambrook等编辑，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2nd Ed.),Vols.1-3,Cold Spring Harbor Laboratory(1989)，和Ausubel等编辑，Current Protocols inMolecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.,New York(1997)提供了适宜的载体的实例。

本发明的载体或质粒涵盖包含端粒(telomeric)、着丝粒(centromeric)和复制的起点(复制起点)序列的酵母人工染色体，所述酵母人工染色体是指可以被遗传修饰为含有异源DNA序列(如，大到3000kb的DNA序列)的DNA构建体。

本发明的载体或质粒还涵盖包含复制的起点序列(Ori)并可包含一个或多个解旋酶(如parA、parB和parC)的细菌人工染色体(BAC)，所述细菌人工染色体是指可以被遗传修饰为含有异源DNA序列(如，大到300kb的DNA序列)的DNA构建体。

将酵母作为宿主的质粒的实例包括YIp型载体、YEp型载体、YRp型载体、YCp型载体、pGPD-2、pAO815、pGAPZ、pGAPZα、pHIL-D2、pHIL-S1、pPIC3.5K、pPIC9K、pPICZ、pPICZα、pPIC3K、pHWO10、pPUZZLE和2μm质粒。这些载体是已知的，并且例如，这些载体描述在Cregg等，Mol Biotechnol.(2000)16(1):23-52中。

将大肠杆菌作为其宿主的质粒的实例包括pBR322、pUC18、pUC19、pUC118、pVC119、pSP64、pSP65、pTZ-18R/-18U、pTZ-19R/-19U、pGEM-3、pGEM-4、pGEM-3Z、pGEM-4Z、pGEM-5Zf(-)和pBluescript KSTM(Stratagene)。适于在大肠杆菌中表达的质粒的实例包括pAS、pKK223(Pharmacia)、pMC1403、pMC931和pKC30。

启动子

可通过修饰转录和翻译调控序列，包括例如提供宿主细胞中多核苷酸序列表达的启动子、增强子、多腺苷酸化信号、转录终止子、内核糖体进入位点(IRES)等等，来实现重组细胞中内源多肽的过表达。这种序列特异性地与涉及转录的细胞蛋白相互作用(Maniatis等，Science,236:1237-1245(1987))。示例性序列描述于，例如Goeddel,Gene ExpressionTechnology:Methods in Enzymology,Vol.185,Academic Press,San Diego,Calif.(1990)。

例如，可通过修饰启动子来实现重组细胞中内源性辅助蛋白的过表达，例如，为了实现高表达水平，通过用另一个更强的启动子替换可操作地连接至辅助蛋白的内源性启动子。这种启动子可以是诱导型的或组成型的。可以通过采用本领域已知的方法的突变或同源重组来实施内源性启动子的修饰。

可通过本领域已知的其它方法，例如通过如Marx等，2008(Marx,H.,Mattanovich,D.和Sauer,M.Microb Cell Fact 7(2008):23)和Pan等，2011(Pan等，FEMS Yeast Res.(2011)May；(3):292-8.)描述的遗传修饰辅助蛋白的内源性调控区域来实现编码辅助蛋白的多核苷酸的过表达，这种方法包括，例如增加辅助蛋白表达的重组启动子的整合。转化描述于Cregg等，(1985)Mol.Cell.Biol.5:3376-3385。“重组”启动子是指针对其驱动表达的序列。如本文所用，重组启动子的含义是，当该启动子对于给定序列而言不是天然启动子时，即，当该启动子与天然存在的启动子(“天然启动子”)不同时。有时这种启动子在本文中还称为异源启动子。

文本所用术语“启动子”是指有助于特定基因转录的区域。与无启动子存在时所表达的重组产物的量相比，启动子通常使从核苷酸序列表达的重组产物的量增加。可利用源自一个生物体的启动子来增强从源自另一生物体的序列的重组产物表达。可以通过采用本领域已知的方法的同源重组来将启动子整合至宿主细胞染色体中(如，Datsenko等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,97(12):6640-6645(2000))。此外，一个启动子元件能够增加串联连接的多条序列所表达的产物的量。因此，一个启动子元件能够增强一种或多种重组产物的表达。

可以通过启动子的转录效率来评估启动子活性。可通过测量从该启动子的mRNA转录的量来直接地测定启动子活性，如通过RNA印迹法、定量PCR，或通过测量自该启动子表达的基因产物的量来间接地测定启动子活性。

启动子可以是“诱导型启动子”或“组成型启动子”。“诱导型启动子”是指可以被某些因子的存在或缺少诱导的启动子，“组成型启动子”是指允许启动子的一种或多种相关基因连续转录的不受调控的启动子。

在优选的实施方案中，编码辅助蛋白和POI的核苷酸序列都被诱导型启动子驱动。在另一个优选的实施方案中，编码辅助蛋白和POI的核苷酸序列都被组成型启动子驱动。在又一个优选的实施方案中，编码辅助蛋白的核苷酸序列被组成型启动子驱动，编码POI的核苷酸序列被诱导型启动子驱动。在再一个优选的实施方案中，编码辅助蛋白的核苷酸序列被诱导型启动子驱动，编码POI的核苷酸序列被组成型启动子驱动。例如，HP可以被组成型GAP启动子驱动，POI可以被诱导型AOX1启动子驱动。在一个实施方案中，编码辅助蛋白和POI的核苷酸序列被相同启动子或就启动子活性和/或表达行为而言的相似启动子驱动。

本领域已知很多诱导型启动子。在Gatz,Curr.Op.Biotech.,7:168(1996)(还参见Gatz,Ann.Rev.Plant.Physiol.Plant Mol.Biol.,48:89(1997))的综述中描述了许多诱导型启动子。实例包括四环素抑制子系统(tetracycline repressor system)、Lac抑制子系统、铜诱导系统、水杨酸诱导系统(如PR1系统)、糖皮质激素诱导型(Aoyama等，1997)、醇诱导系统(如AOX启动子)和蜕皮激素诱导系统(ecdysome-inducible system)。还包括苯磺酰胺诱导型(美国专利No.5,364,780)和醇诱导型系统(WO 97/06269和WO 97/06268)以及谷胱甘肽S-转移酶启动子。

在Mattanovich等，Methods Mol.Biol.(2012)824:329-58中描述了与酵母宿主细胞一起使用的适宜的启动子序列，包括如磷酸丙糖异构酶(TPI)、磷酸甘油酸激酶(PGK)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH或GAP)的糖酵解酶及其变体、乳糖酶(LAC)和半乳糖苷酶(GAL)、巴斯德酵母(P.pastoris)葡萄糖-6-磷酸异构酶启动子(PPGI)、3-磷酸甘油酸激酶启动子(PPGK)、甘油醛磷酸脱氢酶启动子(PGAP)、翻译延伸因子启动子(PTEF)和巴斯德酵母烯醇酶1启动子(PENO1)、丙糖磷酸异构酶(PTPI)、核糖体亚基蛋白(PRPS2、PRPS7、PRPS31、PRPL1)、醇氧化酶启动子(PAOX)或其具有修饰特性的变体、甲醛脱氢酶启动子(PFLD)、异柠檬酸裂合酶启动子(PICL)、α-酮异己酸脱羧酶启动子(PTHI)、热休克蛋白家族成员的启动子(PSSA1、PHSP90、PKAR2)、6-磷酸葡糖酸脱氢酶(PGND1)、磷酸甘油酸变位酶(PGPM1)、转酮酶(PTKL1)、磷脂酰肌醇合成酶(PPIS1)、铁-O2-氧化还原酶(ferro-O2-oxidoreductase)(PFET3)、高亲和力铁通透酶(PFTR1)、抑制性碱性磷酸酶(PPHO8)、N-肉豆蔻酰基转移酶(PNMT1)、信息素应答转录因子(PMCM1)、泛素(PUBI4)、单链DNA核酸内切酶(PRAD2)、线粒体内膜的主要ADF/ATP载体的启动子(PPET9)(WO2008/128701)和甲酸脱氢酶(FMD)启动子。GAP启动子、AOX启动子或源自GAP或AOX启动子的启动子是特别优选的。AOX启动子可被甲醇诱导和例如被葡萄糖抑制。

适宜的启动子的进一步实例包括酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1、ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)、和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶(PGK)、和麦芽糖酶基因启动子(MAL)。

Romanos等，1992,Yeast 8:423-488描述了酵母宿主细胞的其它有用启动子。

与大肠杆菌一起使用的适宜的启动子序列包括质粒中的T7启动子、T5启动子、色氨酸(trp)启动子、乳糖(lac)启动子、色氨酸/乳糖(tac)启动子、脂蛋白(lpp)启动子和λ噬菌体PL启动子。

优选地，相对于辅助基因的启动子而言，驱动编码辅助蛋白的多核苷酸表达的启动子不是内源性的。优选地，采用重组启动子而不是辅助蛋白基因的内源性启动子。

增强子

在优选的实施方案中，通过采用增强子来增强驱动辅助蛋白表达的启动子活性来实现过表达。转录增强子相对不依赖于方向和位置，已在转录单位的5’和3’、内含子中以及其自身的编码序列中发现了转录增强子。增强子可以在编码序列的5’或3’位置被剪接入表达载体，但是优选位于启动子的5’位。大多数酵母基因含有仅一个UAS，其通常位于帽位的几百个碱基对中，并且当位于启动子的3’时，大多数酵母增强子(UAS)无法发挥功能，但是高等真核生物中的增强子在启动子的5’和3’都能发挥功能。

目前已知很多增强子序列来自于哺乳动物基因(球蛋白、RSV、SV40、EMC、弹性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白和胰岛素)。人们也可使用来自于真核细胞病毒的增强子，如SV40晚期增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤病毒复制起点晚期一侧的增强子和腺病毒增强子。酵母增强子，也称为上游激活序列(UAS)，如来自于酿酒酵母的UAS/Gal系统，可有利地与酵母启动子一起使用(描述于欧洲专利No.0317254和Rudoni等，TheInternationalJournal of Biochemistry and Cell Biology,(2000),32(2):215-224)。

在优选的实施方案中，本发明公开的2、3、4、5、6、7、8、9或更多类型的辅助蛋白过表达。例如，宿主细胞可被工程化为过表达2、3、4、5、6、7、8、9或更多个选自SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9或162或其功能同系物的辅助蛋白，其中其功能同系物具有与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9或162具有至少30％的序列同一性的氨基酸。

目标蛋白

设想可以将宿主细胞培养在对于辅助蛋白和目标蛋白的共表达适宜的条件下，该宿主细胞将表达目标蛋白并过表达多核苷酸，所述多核苷酸编码具有示于SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9或162的氨基酸序列或其功能同系物的辅助蛋白，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9或162中任一个的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性。

本文对目标蛋白(POI)没有限制。通常，POI是真核或原核多肽，其变体或衍生物。POI可以是任何真核或原核蛋白。Schmidt,Appl.Microbiol.Biotechnol.(2004),65:363-372或Kirk等，Curr.Opin.Biotechnol.(2002),13:345-351中描述了POI的实例。Schmidt的表1和表2中以及Kirk等的表1中提到的任何蛋白都涵盖在本文所用术语“POI”中。所述蛋白可以是天然分泌蛋白，也可以是细胞内蛋白(即非天然分泌的蛋白)。本发明还包括蛋白的生物活性片段。在另一个实施方案中，POI可以是氨基酸链或以复合物如二聚体、三聚体、异-二聚体、多聚体或寡聚体存在。

目标蛋白可以是用作营养的、膳食的(dietary)、消化的、补充剂的蛋白，如用在食品、饲料或化妆品中。所述食品可以是，例如，肉汤、甜点、谷物棒、糕饼(confectionery)、运动饮料、膳食产品或其他营养产品。优选地，所述目标蛋白是食品添加剂。

在另一个实施方案中，目标蛋白可用在动物饲料中。所述POI可以是如真菌毒素(mycotoxin)降解酶的解毒酶。解毒酶是指分解毒素，如降低其毒性的酶。真菌毒素是由容易定殖于作物的真菌产生的有毒次级代谢产物，并且真菌毒素经常以能够伤害作物并引起人和动物的健康难题为特征。真菌毒素降解酶包括黄曲霉毒素降解酶、玉米赤霉烯酮酯酶(zearalenone esterase)、玉米赤霉烯酮内酯酶(zearalenone lactonase)、玉米赤霉烯酮水解酶(zearalenone hydrolase)、伏马菌素羧酸酯酶(fumonisin carboxylesterase)、伏马菌素转氨酶(fumonisin aminotransferase)、氨基多元醇胺氧化酶(aminopolyol amineoxidase)、脱氧雪腐镰刀菌醇环氧化物水解酶(deoxynivalenol expoxide hydrolase)。所述POI还可以是降解赭曲霉毒素衍生物或麦角生物碱的酶。赭曲霉毒素是由曲霉或青霉家族的几种真菌作为次级代谢产物而产生的一组霉菌毒素，是由异香豆素的衍生物组成的弱有机酸。有三种公认的赭曲霉毒素，指定为A、B和C。赭曲霉毒素A是赭曲霉毒素家族最丰富的成员，并且因此是最常检测到的，但也是毒性最大的。赭曲霉毒素A(ochratoxin A)是存在于谷物及其它富含淀粉的食物中的肾毒性、致畸性、肝毒性和致癌性霉菌毒素。麦角生物碱是含有酰胺键的化合物，并包括，例如，麦角柯宁碱(ergocornine)、麦角异柯宁碱(ergocorninine)、麦角克碱(ergocristine)、麦角异克碱(ergocristinine)、麦角隐亭(ergocryptine)、麦角隐宁碱(ergocryptinine)、麦角新碱(ergometrine)、麦角辛(ergosine)、麦角胺(ergotamine)和麦角异胺(ergotaminine)。这些化合物对包括人和农场动物的活的生物体是有毒性的。这些酶的实例包括赭曲霉毒素酰胺酶、麦角胺水解酶、麦角胺淀粉酶。动物饲料中的真菌毒素降解酶对控制饲料的真菌毒素污染是有用的。

POI的进一步实例包括抗微生物蛋白，如乳铁蛋白、溶菌酶、乳铁素(lactoferricin)、lactohedrin、κ-酪蛋白、咕啉结合蛋白(haptocorrin)、乳过氧化物酶、牛奶蛋白、急性期蛋白(例如在生产动物中响应感染而正常产生的蛋白)和如溶菌酶和乳铁蛋白的小抗微生物蛋白。其它实例包括抗菌蛋白、抗病毒蛋白、急性期蛋白(在生产动物中响应感染而诱导的)、益生菌蛋白、抑菌蛋白和阳离子抗微生物蛋白。

“饲料”是指旨在或适合用于非人动物食用、摄入、消化的任何天然或人工饮食、膳食等或这些膳食的组份。“饲料添加剂”通常是指添加在饲料中的物质。饲料添加剂通常包括如维生素、矿物质、酶和合适的载体和/或赋形剂的一种或多种化合物。对于本发明而言，食品添加剂可以是酶或其它蛋白。可用作饲料添加剂的酶的实例包括植酸酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶。“食品”是指旨在或适合用于人食用、摄入、消化的任何天然或人工饮食膳食等或这些膳食的组份。

“食品添加剂”通常是指添加在食物中的物质。食品添加剂通常包括如维生素、矿物质、酶和合适的载体和/或赋形剂的一种或多种化合物。对于本发明而言，食品添加剂可以是酶或其他蛋白质。可用作食品添加剂的酶的实例包括蛋白酶、脂酶、乳糖酶、果胶甲基酯酶(pectin methyl esterase)、果胶酶、谷氨酰胺转移酶、淀粉酶、β-葡聚糖酶、乙酰乳酸脱羧酶和漆酶。

在一些实施方案中，所述食品添加剂是抗微生物蛋白，所述抗微生物蛋白包括：例如，(i)抗微生物牛奶蛋白(人或非人)乳铁蛋白、溶菌酶、乳铁素(lactoferricin)、lactohedrin、κ-酪蛋白、咕啉结合蛋白(haptocorrin)、乳过氧化物酶、α-1-抗胰蛋白酶和如IgA的免疫球蛋白；(ii)急性期蛋白，如C-反应蛋白(CRP)、乳铁蛋白、溶菌酶、血清淀粉样蛋白A(SAA)、铁蛋白、结合珠蛋白(Hp)、补体(complement)2-9(特别是补体-3)、血清粘蛋白、铜蓝血浆蛋白(Cp)、15-酮-13,14-二氢-前列腺素F2α(PGFM)、纤维素原(Fb)、α(1)-酸性糖蛋白(AGP)、α(1)-抗胰蛋白酶、甘露糖结合蛋白、脂多糖结合蛋白(lipoplysaccharidebinding protein)、α-2巨球蛋白和各种防御素；(iii)抗微生物肽，如杀菌肽、爪蟾抗菌肽(magainin)、防御素、速普肽(tachyplesin)、parasin l.buforin I、PMAP-23、moronecidin、anoplin、gambicin和SAMP-29；和(iv)其它抗微生物蛋白，包括CAP37、粒溶蛋白、分泌型白细胞蛋白酶抑制剂、CAP18、ubiquicidin、牛抗微生物蛋白-1、Ace-AMP1、速普肽(tachyplesin)、大防御素(big defensin)、Ac-AMP2、Ah-AMP1和CAP18。

酶：

POI可以是酶。优选的酶是可用于如制备洗涤剂、淀粉、燃料、纺织品、纸浆和纸、油、个人护理产品，或烘烤、有机合成等工业应用的那些。这些酶的实例包括用于污渍去除和清洁的蛋白酶、淀粉酶、脂酶、甘露聚糖酶和纤维素酶(cellulose)；用于淀粉液化和糖化的支链淀粉酶淀粉酶和淀粉葡糖苷酶；用于葡萄糖向果糖转化的葡萄糖异构酶；用于环糊精生产的环糊精-糖基转移酶；用于燃料和淀粉中粘度降低(xiscosity reduction)的木聚糖酶；用于烘烤中面团的稳定性和调整的淀粉酶、木聚糖酶、脂酶、磷脂酶、葡萄糖酶(glucose)、氧化酶、脂氧合酶、谷氨酰胺转移酶；在纺织品制备中用于牛仔布整理和棉花软化的纤维素酶；用于纺织品的脱浆的淀粉酶；用于精练的果胶裂解酶；用于漂白终止的过氧化氢酶；用于漂白的漆酶；用于过量染料去除的过氧化物酶；用在纸浆和纸制造中的脂酶、蛋白酶、淀粉酶、木聚糖酶、纤维素酶(cellulose)；用于酯交换反应的脂酶和用于脂肪和油的脂肪加工时脱胶的磷脂酶；用于有机合成中手性醇和酰胺的分辨的脂酶；用于半合成青霉素的合成的酰基转移酶，用于对应异构体羧酸的合成的腈水解酶；用于皮革生产的蛋白酶和脂酶；用于制备个人护肤品的淀粉葡萄糖苷酶、葡萄糖氧化酶和过氧化物酶(参见Kirk等，Current Opinion in Biotechnology(2002)13:345-351)。

治疗性蛋白

POI可以是治疗性蛋白。如本文更详细的描述，POI可以是但不限于，适合作为如抗体或抗体片段、生长因子、激素、酶、疫苗等的生物制药物质的蛋白。

所述POI可以是天然分泌的蛋白或细胞内蛋白(即非天然分泌的蛋白)。本发明还提供天然分泌或非天然分泌的蛋白的功能同系物、功能等价变体、衍生物和生物活性片段的重组生产。优选地，功能同系物是与序列相同或相应的并具有序列的功能特征。

所述POI可以与天然蛋白结构类似，和可以通过在C-和/或N-末端或者天然蛋白的侧链上添加一个或多个氨基酸，在天然氨基酸序列上置换一个或数个不同位点的一个或多个氨基酸，在天然蛋白的任一个或两个末端或者在氨基酸序列的一个或若干位点上缺失一个或多个氨基酸，或在天然氨基酸序列的一个或多个位点上插入一个或多个氨基酸，从天然蛋白质衍生。上述若干蛋白质的这些修饰是熟知的。

优选地，所述目标蛋白是哺乳动物多肽，或甚至更优选地是人多肽。特别优选的治疗性蛋白是指可施用于哺乳动物的任何多肽、蛋白、蛋白质变体、融合蛋白和/或其片段。设想但不是必须的，根据本发明的治疗性蛋白是细胞异源的。可通过本发明的细胞生产的蛋白的实例是但不限于，酶、调控蛋白、受体、肽激素、生长因子、细胞因子、支架结合蛋白(如anticalin)、结构蛋白、淋巴因子、粘附分子、受体、膜或转运蛋白，和可作为激动剂或拮抗剂和/或具有治疗或诊断用途的任何其他多肽。此外，所述目标蛋白可以是用于接种的抗原、疫苗、抗原结合蛋白、免疫刺激蛋白。其还可以是可包括本领域已知的任何合适的抗原结合抗体片段的抗体的抗原结合片段。例如，抗体片段可包括但不限于：Fv(一种包含VL和VH的分子)、单链Fv(scFV)(一种包含由肽连接子连接的VL和VH的分子)、Fab、Fab'、F(ab')₂、单结构域抗体(sdAb)(包含单可变结构域和3CDR的分子)和他们的多价呈现形式(presentation)。所述抗体或其片段可以是鼠、人、人源化或嵌合的抗体或其片段。治疗性蛋白的实例包括抗体、多克隆抗体、单克隆抗体、重组抗体、抗体片段，如Fab'、F(ab')2、Fv、scFv、di-scFv、bi-scFv、串联scFv、双特异性串联scFv、sdAb、纳米抗体、V_H和V_L，或人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、IgA抗体、IgD抗体、IgE抗体、IgG抗体、IgM抗体、胞内抗体、微抗体或单抗体(monobody)。

这些治疗性蛋白包括但不限于：胰岛素、胰岛素样生长因子、hGH、tPA、细胞因子，例如如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18的白细胞介素、干扰素(IFN)α、IFNβ、IFNγ、IFNω或IFNτ、肿瘤坏死因子(TNF)TNFα和TNFβ、TRAIL；G-CSF、GM-CSF、M-CSF、MCP-1和VEGF。

在优选的实施方案中，所述蛋白是抗体。术语“抗体”旨在包括含有具有适合并识别表位的特异性形状的分子结构的任何多肽链，其中一个或多个非共价结合相互作用稳定该分子结构与所述表位之间的复合物。原型的抗体分子是免疫球蛋白，且来自所有来源(如人、啮齿动物、兔、牛、羊、猪、狗、其它哺乳动物、鸡、其它禽类等)的所有类型的免疫球蛋白(IgG、IgM、IgA、IgE、IgD等)都被认为是“抗体”。已经描述了多个编码抗体的序列；其它抗体可通过本领域熟知的方法提出。

例如，可通过本领域已知的方法生产抗体或抗原结合片段。通常抗体生产细胞对所需抗原或免疫原敏感。从抗体生产细胞中分离的信使RNA用作采用PCR扩增制备cDNA的模板。通过将扩增的免疫球蛋白cDNA的合适区段插入表达载体中来生产载体文库，其中每一个载体含有保留了原始抗原特异性的一个重链基因和一个轻链基因。通过将重链基因文库与轻链基因文库组合构建组合文库。这得到了共表达重链和轻链(类似于抗体分子的Fab片段或抗原结合片段)的克隆文库。将携带这些基因的载体共转染至宿主细胞。当在转染的宿主中诱导抗体基因合成时，所述重链和轻链蛋白自组装以生产能够通过用抗原或免疫原筛选而检测的活性抗体。

编码抗体的目标序列包括由天然序列编码的那些，以及借助于遗传密码的简并性在序列上与已公开的核酸不同的核酸和它们的变体。变体多肽可包括氨基酸(aa)置换、添加或缺失。所述氨基酸置换可以是保守性氨基酸置换或消除非必须氨基酸的置换，例如以改变糖基化位点，或通过置换或缺失一个或多个对功能而言非必需的半胱氨酸残基来使错误折叠最少。可对变体进行设计从而使其保留或具有蛋白特定区域(如，功能结构域、起催化作用的氨基酸残基等)的增强的生物活性。变体还包括本文所公开的多肽的片段，特别是生物活性片段和/或对应于功能结构域的片段。克隆基因的体外诱变技术是已知的。本发明的主题还包括采用一般分子生物技术修饰从而改善了它们对蛋白质降解的抵抗的或优化了溶解性能的或使它们更适合作为治疗剂的多肽。

可通过将可变轻链和重链区(VK和VH)组合的重组方式来制备嵌合的抗体，所述可变轻链和重链区从一个物种的抗体生产细胞中获得，而恒定轻链和重链区来自另一物种。通常，为了生产主要是人结构域的抗体，嵌合的抗体利用啮齿动物或兔可变区和人恒定区。这些嵌合的抗体的生产是本领域熟知的，并且可通过标准手段实现(如，例如在美国专利No.5,624,659中所描述的)。

人源化抗体被工程化为含有甚至更多人样免疫球蛋白结构域，并仅结合(incorporate)动物来源抗体的互补决定区。这一过程通过仔细检查单克隆抗体的可变区的高变环序列，并使这些高变环序列与人抗体链的结构相装配来完成。尽管从表面上看是复杂的，但是这一过程已被直接实践。参见例如美国专利No.6,187,287。

除了完整的免疫球蛋白(或它们的重组对应物)，可合成包含表位结合位点(如Fab’、F(ab’)2或其他片段)的免疫球蛋白片段。可利用重组免疫球蛋白技术设计“片段”或最小免疫球蛋白。比如可通过合成可变轻链区和可变重链区生产本发明所用的“Fv”免疫球蛋白。还对抗体的组合感兴趣，如包含两个不同Fv特异性的双抗体。

可在翻译后修饰免疫球蛋白，如添加化学连接子、可检测部分(例如荧光染料)、酶、作用物(substrate)、化学发光部分等，或在本发明的方法和组合物中使用特异性结合部分，例如链霉亲和素、抗生物素蛋白或生物素等。

治疗性蛋白的进一步实例包括凝血因子(VII、VIII、IX)、镰刀菌属碱性蛋白酶、降钙素、CD4受体达贝泊汀(darbepoetin)、DNA酶(囊性纤维化)、促红细胞生成素、eutropin(人生长激素衍生物)、促卵泡激素(促滤泡素)、明胶、胰高血糖素、葡糖脑苷脂酶(戈谢病)、源自黑曲霉(A.niger)的葡糖淀粉酶、源自黑曲霉的葡萄糖氧化酶、促性腺激素、生长因子(GCSF、GMCSF)、生长激素(生长激素(somatotropine))、乙肝疫苗、水蛭素、人抗体片段、人载脂蛋白AI、人降钙素前体、人胶原酶IV、人表皮生长因子、人胰岛素样生长因子、人白细胞介素6、人层粘连蛋白、人前脱脂蛋白AI、人血清白蛋白胰岛素、胰岛素和突变蛋白、胰岛素、干扰素α和突变蛋白、干扰素β、干扰素γ(突变蛋白)、白细胞介素2、促黄体生成激素、单克隆抗体5T4、小鼠胶原蛋白、OP-1(成骨的，神经保护因子)、奥普瑞白介素(白细胞介素11-激动剂)、有机磷酸水解酶(organophosphohydrolase)、PDGF-激动剂、肌醇六磷酸酶、血小板衍化生长因子(PDGF)、重组血纤溶酶原激活剂G、葡萄球菌激酶、干细胞因子、破伤风毒素片段C、组织型纤溶酶原激活物和肿瘤坏死因子(参见Schmidt,Appl Microbiol Biotechnol(2004)65:363-372)。

前导序列

可将目标蛋白与引发POI自宿主细胞中分泌的前导序列连接。当旨在重组表达和分泌的POI是这样一种蛋白时，即其是非天然分泌的并因此缺乏天然分泌前导序列，或其核苷酸序列已经被克隆而不含其天然分泌前导序列时，使所述分泌前导序列存在于表达载体中是必须的。一般而言，任何对引发POI自宿主细胞中分泌有效的分泌前导序列均可用于本发明中。所述分泌前导序列可以来自于酵母源(如来自如酿酒酵母的MFa的酵母α-因子，或酵母磷酸酶)，来自于哺乳动物或植物源，或其它。对技术人员而言，适宜的分泌前导序列的选择是显而易见的。可选地，可以在将核苷酸序列克隆在表达载体中之前，通过技术人员已知的常规克隆技术，将所述分泌前导序列融合至编码旨在重组表达的POI的核苷酸序列，或者将包含天然分泌前导序列的编码POI的核苷酸序列克隆在表达载体中。在这些情况下，无需使表达载体中存在分泌前导序列。

也可以以每个细胞单一拷贝或多拷贝形式在一个或多个自主复制质粒中提供所述编码一种或多种POI的重组核苷酸序列，以及编码辅助蛋白的重组核苷酸序列。

可选地，所述编码POI的重组核苷酸序列和编码辅助蛋白的重组核苷酸序列以每个细胞单一拷贝或多拷贝的形式存在于相同质粒中。

KO蛋白的低表达

发明人还鉴定了几种所观察到的表达对自宿主细胞中POI的产量具有负面作用的蛋白(本文称为敲除(KO)蛋白，包括KO1、KO2、KO3及其功能同系物)。KO蛋白是指具有SEQ IDNO 10、11或12的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白，其中所述功能同系物与示于SEQ IDNO 10、11或12的氨基酸序列具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性。此外，已经发现，编码KO蛋白的基因的修饰(如突变或缺失)能够增加POI的产量。这一发现提供了通过将宿主细胞工程化为使得其低表达由发明人鉴定的基因来可用于进一步改善POI产量的方法和材料。若宿主细胞中存在KO1、KO2、KO3基因或功能同系物，则可将它们进行修饰以改善POI的产量。基于本文提供的序列，可采用本领域已知的任何方法来鉴定KO蛋白的存在。

所述蛋白列于表2：

表2

优选地，所述宿主细胞可被工程化为低表达多核苷酸，所述多核苷酸编码具有示于SEQ ID NO 10、11或12的氨基酸序列或其功能同系物的KO蛋白，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO 10、11或12的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性。例如，所述宿主细胞被工程化为低表达多核苷酸，该多核苷酸编码具有与示于SEQ ID NO 10的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性的氨基酸的蛋白质。例如，所述宿主细胞可被工程化为低表达多核苷酸，该多核苷酸编码具有与示于SEQ ID NO 11的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性的氨基酸的蛋白质。例如，所述宿主细胞可被工程化为低表达多核苷酸，该多核苷酸编码具有与示于SEQ ID NO 12的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性的氨基酸的蛋白质。

优选地，与工程化为低表达KO蛋白之前的宿主细胞相比，当低表达KO1、KO2和/或KO3时，宿主细胞中模型蛋白SDZ-Fab或HyHEL-Fab的产量可以增加至少1％，如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290或至少300％。

术语“低表达”通常是指小于参考标准显示的表达水平的任何量，所述参考标准是工程化为低表达KO蛋白之前的宿主细胞。本发明的术语“低表达(的)”是指基因产物或多肽以小于宿主细胞遗传改变之前的或未经遗传改变的可比宿主中的相同基因产物或多肽的表达的水平表达。所述术语“低表达”还涵盖基因产物或多肽的无表达。

可通过阻止KO1、KO2和KO3或其功能同系物中一个或多个的功能表达的任何方法来实施低表达。低表达的结果是不能发挥其功能。低表达的手段可包括基因沉默(如，RNAi基因反义)、敲除、改变表达水平、改变表达形式、通过诱变基因序列、破坏(disrupt)序列、插入、添加、突变、修饰表达调控序列等。

优选地，通过敲除宿主细胞中编码KO蛋白的多核苷酸来实现低表达。可通过缺失全部或部分编码序列来敲除基因。本领域已知使基因敲除的方法，如参见Kuhn和Wurst(Eds.)Gene Knockout Protocols(Methods in Molecular Biology)Humana Press(March27,2009)。还可通过移除所述基因序列的部分或全部来敲除基因。可选地，通过如抗性基因的核苷酸序列的插入来敲除或灭活基因。可选地，通过灭活基因的启动子可使该基因敲除或灭活。

在一个实施方案中，通过破坏宿主细胞中编码所述基因的多核苷酸来实现低表达。

“破坏”是一种在核苷酸或氨基酸序列中的改变，与破坏之前的原始序列相比，其导致一个或多个核苷酸或氨基酸残基的添加、缺失或置换。

“插入”或“添加”是一种在核酸或氨基酸序列中的改变，与破坏之前的原始序列相比，所述核酸或氨基酸序列中加入了一个或多个核苷酸或氨基酸残基。

“缺失”定义为一种在核苷酸或氨基酸序列中的改变，在所述核苷酸或氨基酸序列中相应地移除(即，缺失)了一个或多个核苷酸或氨基酸残基。缺失涵盖了全部序列的缺失、所述编码序列的部分的缺失或者单一核苷酸或氨基酸残基的缺失。

“置换”通常是指核苷酸或氨基酸残基被其它核苷酸或氨基酸残基替代。可通过定点突变、随机突变的产生和缺口双链体方法(gapped-duplex approach)(参见，如美国专利No.4,760,025；Moring等，Biotech.(1984)2:646；和Kramer等，Nucleic Acids Res.,(1984)12:9441)来实施“置换”。

优选地，破坏导致了移码突变、早期终止密码(early stop codon)、关键残基的点突变、无义的翻译或其它非功能蛋白产物。

在另一个实施方案中，通过破坏可操作地与所述多肽连接的启动子来实现低表达。启动子指导下游基因的转录。所述启动子是必须的，其与其他表达控制序列如增强子、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列以及增强子或激活子序列一起表达给定基因。因此，还可以破坏任何所述表达控制序列以阻碍所述多肽的表达。

在另一个实施方案中，通过转录后基因沉默(PTGS)来实现低表达。作为本领域常用的技术，PTGS通过异源RNA序列(对需要破坏的基因而言，往往是反义的)的表达降低基因的表达水平(Lechtreck等，J.Cell Sci(2002).115:1511-1522；Smith等，Nature(2000).407:319-320；Furhmann等，J.Cell Sci(2001).114:3857-3863；Rohr等，Plant J(2004).40(4):611-21)。

可通过本领域已知的减少基因表达的任何技术来实现“低表达”。例如，与所述多肽可操作地连接的启动子可被具有较低启动子活性的另一启动子替代。可以通过启动子的转录效率来评估启动子活性。可通过测量从该启动子的mRNA转录的量来直接地测定启动子活性，如通过RNA印迹法、定量PCR，或通过测量自该启动子表达的基因产物的量来间接地测定启动子活性。在另一个实施方案中，通过干预表达的KO蛋白的折叠，从而使该KO蛋白不能正确折叠成为功能性蛋白来实现低表达。例如，可引入突变以移除所述KO蛋白的二硫键的形成或破坏α螺旋和β折叠的形成。

又一方面，本发明提供所述工程化宿主细胞在制备目标蛋白中的用途。所述宿主细胞可有利地用于引入编码一种或多种POI的多肽，之后可将该宿主细胞在适宜的条件下培养以表达所述POI。在之后的关于本发明的方法部分描述了这一用途的细节。

可以通过将相关基因各自连接(ligating)至一个载体中，使编码辅助蛋白和POI的多核苷酸重组于所述宿主细胞中。可以构建携带所述基因的单一载体，或两个独立的载体，其中一个携带辅助蛋白基因而另一个携带POI基因。可通过采用一种或多种所述载体转化宿主细胞，将这些基因整合至所述宿主细胞的基因组中。在一些实施方案中，将编码POI的基因整合至所述基因组中，而将编码辅助蛋白的基因整合至质粒或载体中。在一些实施方案中，将编码辅助蛋白的基因整合至所述基因组中，而将编码POI的基因整合至质粒或载体中。在一些实施方案中，将编码POI和辅助蛋白的基因均整合至所述基因组中。在一些实施方案中，将编码POI和辅助蛋白的基因整合至质粒或载体中。若采用编码POI的多个基因，则将编码POI的一些基因整合至所述基因组中，而将另一些基因整合至相同或不同的质粒或载体中。若采用编码辅助蛋白的多个基因，则将编码辅助蛋白的一些基因整合至所述基因组中，而将另一些基因整合至相同或不同的质粒或载体中。可在本申请的以下部分找到更多教导。

通常，可采用重组宿主细胞，通过在合适的培养基中培养该宿主细胞，自培养物中分离表达的POI，并通过适合表达产物的方法将POI纯化，特别是将POI自细胞中分离，生产目标蛋白。

又一方面，本发明涉及增加宿主细胞中目标蛋白的产量的方法，所述方法包括过表达本发明的多核苷酸。所述多核苷酸编码具有与示于SEQ IDNO:1、2、3、4、5、6、7、8、9或162中任一个的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性的氨基酸的辅助蛋白。

如本文所用，术语“增加宿主细胞中目标蛋白的产量”是指与在相同培养条件下表达相同POI但是编码辅助蛋白的多核苷酸未过表达的相同细胞相比，目标蛋白的产量增加了。

本领域技术人员将理解，本发明的辅助蛋白的过表达已经表明增加了POI的产物产量。因此，对于表达具有应当被增加的水平的POI的给定宿主细胞，如果辅助蛋白不存在于该宿主细胞中，则可通过在该宿主细胞中表达任一种或若干种辅助蛋白而应用本发明，或者如果编码辅助蛋白的基因已经存在于该宿主细胞中，则可通过进一步增加该宿主细胞中辅助蛋白的表达水平而应用本发明。

再一方面，本发明提供一种增加宿主细胞中目标蛋白的产量的方法。所述方法包括(i)将宿主细胞工程化为表达或过表达辅助蛋白，(ii)在所述宿主细胞中重组编码目标蛋白的异源多核苷酸，和(iii)在适宜条件下培养所述宿主细胞以表达所述辅助蛋白和目标蛋白。应当注意，在(i)和(ii)中所述的步骤无需按照所述的顺序实施。可以首先实施(ii)中所述的步骤然后实施(i)中所述的步骤。在步骤(i)中，所述宿主细胞可被工程化为过表达多核苷酸，所述多核苷酸编码具有与示于SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9或162中任一个的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性的氨基酸的辅助蛋白。

本领域技术人员熟知用于操作如编码辅助蛋白和/或POI的多核苷酸序列、启动子、增强子、前导区(leader)等的程序，如J.Sambrook等，Molecular Cloning:ALaboratory Manual(3rd edition),Cold Spring Harbor Laboratory,Cold SpringHarbor Laboratory Press,New York(2001)描述的。

可通过多种手段，如通过同源重组或通过采用特异性靶向在整合位点的序列的混合重组酶(hybrid recombinase)，将外源或靶多核苷酸(如编码辅助蛋白或POI的多核苷酸)插入染色体中。典型地，所述外源或靶多核苷酸存在于载体(“插入载体”)中。典型地，在用于同源重组之前，这些载体是环状的和线性的。作为一种选择，所述外源或靶多核苷酸可以是稍后被重组至宿主细胞中的通过融合PCR连接的DNA片段或合成构建的DNA片段。除了同源臂之外，载体还含有适于选择或筛选的标记、复制起点和其它元件。还可以采用导致随机或非靶向整合的异源重组。异源重组是指DNA分子与显著不同的序列之间的重组。本领域已知重组的方法，例如在Boer等，Appl Microbiol Biotechnol(2007)77:513–523中所描述的。对于酵母细胞的遗传操作还可参考Primrose和Twyman的Principles of GeneManipulation and Genomics(第七版，Blackwell Publishing 2006)。

编码辅助蛋白和/或POI的多核苷酸还可存在于表达载体上。这些载体是本领域已知的并已经在上文描述过。在表达载体中，启动子置于编码异源蛋白的基因的上游，并调控所述基因的表达。由于多克隆载体的多克隆位点，其是特别有用的。对于表达，通常将启动子置于多克隆位点的上游。既可通过首先制备含有编码辅助蛋白和/或POI的完整DNA序列的DNA构建体，并随后将这一构建体插入适宜的表达载体中，也可以通过顺序地插入含有个体元件(如，前导序列、靶DNA序列)遗传信息的DNA片段，然后连接，来构建用于编码辅助蛋白和/或POI的多核苷酸的整合的载体。作为片段的限制和连接的替代，可把基于附着位点(att)的重组方法和重组酶用于将DNA序列插入载体中。这些方法由例如Landy(1989)Ann.Rev.Biochem.58:913-949描述，并是本领域技术人员已知的。

可通过将包含靶多核苷酸序列的载体或质粒引入细胞来获得根据本发明的宿主细胞。本领域熟知用于转染或转化真核细胞或者转化原核细胞的技术。这些技术可以包括脂囊泡介导的摄取、热休克介导的摄取、磷酸钙介导的转染(磷酸钙/DNA共沉淀)、病毒感染(特别是使用经修饰的病毒诸如例如经修饰的腺病毒)、显微注射和电穿孔。对于原核转化，技术可以包括热休克介导的摄取、与完整细胞的细菌原生质体融合、显微注射和电穿孔。用于植物转化的技术包括土壤杆菌(Agrobacterium)介导的转移(诸如通过根瘤土壤杆菌(A.tumefaciens)实现的)、被快速推进的钨或金微弹、电穿孔、显微注射和聚乙二醇介导的摄取。DNA可以是单链的或双链的、线性的或环状的、松弛的或超螺旋的DNA。对于用于转染哺乳动物细胞的多种技术，参见例如Keown等(1990)Processes in Enzymology185:527-537。

又一方面，本发明提供一种在宿主细胞中制备目标蛋白的方法，所述方法包括(i)提供宿主细胞，所述宿主细胞被工程化为过表达多核苷酸，所述多核苷酸编码具有与示于SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9或162的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性的氨基酸的辅助蛋白，其中所述宿主细胞包含编码目标蛋白的异源多核苷酸；和(ii)在适宜条件下培养所述宿主细胞以过表达所述辅助蛋白和表达目标蛋白。

应当理解，本文公开的方法可进一步包括在允许所述POI和辅助蛋白表达的条件下培养所述重组宿主细胞。然后，根据表达系统和表达的蛋白的性质，例如所述蛋白能否融合为单一肽和所述蛋白是可溶的还是膜结合的，可以从细胞或细胞培养基中分离重组生产的POI。本领域技术人员将理解，根据包括宿主细胞(特别是所采用的表达载体)的类型的因素，培养条件将改变。通常，信号肽含有带正电的N-末端，随后是疏水内核，随后是用于称为信号肽酶的酶的识别位点。在易位期间，这种酶从所述蛋白切割信号肽。将所述蛋白质从内质网转运至高尔基体，然后根据该蛋白质的性质进行分泌途径中多个路线的一个。所述蛋白可分泌至培养基中或可例如保留在细胞表面。某些包含胞外、跨膜和胞质结构域的受体是可被保留在细胞膜上的蛋白的实例，其中仅胞外结构域位于细胞外。某些分泌的蛋白的前导序列包含位于信号肽C-末端的肽，并在信号肽的切割后自成熟目标蛋白加工。这种前导区常常是指前原肽(prepro peptide)，其中前区(pre region)是信号序列，原区(proregion)是指前导区的剩余部分。

一个实例是酵母α-因子前导区，其含有信号肽(包括C-末端信号肽酶识别位点AlaLeuAla)，随后是含有构成KEX2蛋白酶加工位点的碱性氨基酸对LysArg的原区，紧随其后的是在原区的C-末端的肽GluAlaGluAla。这一前导区的加工涉及通过信号肽酶的信号肽的移除，随后是KEX2蛋白酶对Lys和Arg残基之间的切割。之后，通过是STE13基因的产物的肽酶将GluAlaGluAla残基移除(Julius等，Cell(1983)32:839)。在美国专利4,546,082中描述了所述酵母α-因子前导区。已经在用于酵母中异源蛋白的生产的重组表达系统中应用了衍生自由酵母细胞天然分泌的蛋白的信号肽。尽管某些哺乳动物信号肽在促进酵母中异源蛋白的分泌方面不是有效的，但是也已经报道了哺乳动物信号肽在酵母表达系统中的应用。

短语“在适宜的条件下培养，使得所需多肽表达”是指在适合或足够获得所需化合物的生产或获得所需多肽的条件(如温度、压力、pH、持续时间等)下维持和/或生长(growing)微生物。

通过用一种或多种辅助蛋白基因和/或POI基因转化获得的根据本发明的宿主细胞可优选首先在这样的条件下培养，所述条件允许宿主细胞在没有表达异源蛋白的负担下高效生长至大的细胞数量。当细胞准备进行POI表达时，选择并优化适宜的培养条件以产生POI。

作为示例，使用针对一种或多种辅助基因和/或一种或多种POI的不同启动子和/或拷贝和/或整合位点，可关于与一种或多种POI的表达有关的时间点和诱导强度来控制辅助基因的表达。例如，在POI表达的诱导之前，可首先表达一种或多种辅助蛋白。这样做具有如下优势：在POI翻译开始时所述一种或多种辅助蛋白已经存在。可选地，可在同一时间诱导一种或多种辅助蛋白和一种或多种POI。

一旦施加诱导刺激就会被激活的诱导型启动子可用于在该启动子控制下的基因的直接转录。在有诱导刺激的生长条件下，细胞通常比在正常条件下生长得慢，但因为培养物已经在前一阶段生长至大的细胞数量，培养系统整体产生大量的异源蛋白。诱导刺激优选是适当试剂(如针对AOX-启动子的甲醇)的添加或适当营养物(如针对MET3-启动子的甲硫氨酸)的消耗。此外，乙醇、甲胺、镉或铜的添加以及热或渗透压增加剂也可诱导表达。

优选将根据本发明的宿主在生物反应器中在优化的生长条件下培养以获得至少1g/L、更优选至少10g/L细胞干重、更优选至少50g/L细胞干重的细胞密度。不仅在实验室规模中，而且在中试或工业规模中，实现这样的生物分子产量是有益的。

根据本发明，由于辅助蛋白的共表达，即使在生物质保持较低的情况下都可高产量地获得POI。因此，在实验室、中试和工业规模中达到高单位产量(specific yield)是可行的，其中单位产量以mg POI/g干生物质衡量，可以在1至200的范围，如50至200，如100至200。当与无辅助蛋白过表达情况下的产物表达相比时，根据本发明的生产宿主的单位产量优选提供至少1.1倍，更优选至少1.2倍，至少1.3或至少1.4倍的增加，在一些情况下，可以显示超过2倍的增加。

根据本发明的宿主细胞可通过以下标准试验来测试其表达/分泌能力或产量：如ELISA、活性检验、HPLC、表面等离子体共振(Biacore)、蛋白质印迹法、毛细管电泳(Caliper)或SDS-Page。

优选将细胞培养在含有合适碳源的矿物质培养基中，由此进一步显著地简化分离过程。作为示例，所述矿物质培养基含有可利用碳源(例如葡萄糖、甘油、乙醇或甲醇)、含有常量元素(钾、镁、钙、铵、氯化物、硫酸盐、磷酸盐)和痕量元素(铜、碘、锰、钼酸盐、钴、锌和铁盐以及硼酸)的盐。

在酵母细胞的情况下，可以用上述一种或多种表达载体的一种或多种转化所述细胞，使这些细胞交配(mated)以形成二倍体菌株，并在被修饰为适合诱导启动子、选择转化子或扩增编码所需序列的基因的常规营养培养基中培养。本领域已知许多适于酵母菌生长的最低限度培养基。根据需要，可向这些培养基的任一种中补充盐(如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液(如HEPES、柠檬酸和磷酸盐缓冲液)、核苷(如腺嘌呤和胸腺嘧啶)、抗生素、痕量元素、维生素和葡萄糖或等效能源。还可包括以适当浓度的任何其它必须的补充物，这是本领域技术人员已知的。所述培养条件(如温度、pH等)是之前选择用于宿主细胞表达的条件，这是普通技术人员已知的。针对其它类型宿主细胞的细胞培养条件也是已知的并可由技术人员容易地确定。对各种微生物的培养基的描述例如涵盖在美国微生物学会(AmericanSociety for Bacteriology)的“一般细菌学方法手册”的指南(华盛顿D.C,USA,1981)中。

可以通过常规的培养方法，例如静止培养、试管培养、振荡培养(例如旋转振荡培养，摇瓶培养等)、掺气旋动培养(aeration spinner culture)或发酵，优选地连续或间歇地在液体培养基中培养(例如维持和/或生长)细胞。在一些实施方案中，在摇瓶或深孔板中培养细胞。在另一些实施方案中，在生物反应器(例如在生物反应器培养过程)中培养细胞。培养过程包括、但不限于，分批培养、进料分批培养和连续方法培养。术语“分批过程”和“分批培养”是指一个封闭的系统，该系统中的培养基组成、营养物、补充添加剂等在培养开始时已设定，并在培养期间不经受改变；但是，可尝试控制如pH和氧浓度的因素来阻止过度培养基酸化和/或细胞死亡。术语“进料分批过程”和“进料分批培养”是指具有以下例外的一种分批培养：随着培养的进行，添加(例如，以增量或连续方式添加)一种或多种底物或补充物。术语“连续过程”和“连续培养”是指一种系统，在该系统中将限定的培养基连续地添加至生物反应器，并同时将等量的所采用的或“条件化”的培养基移除，例如用于回收所需产物。已经开发了多种这样的过程并且这些过程是本领域熟知的。

在一些实施方案中，将细胞培养约12至24小时，在另一些实施方案中，将细胞培养约24至36小时，约36至48小时，约48至72小时，约72至96小时，约96至120小时，约120至144小时，或培养持续时间大于144小时。在又一些实施方案中，培养持续一段足以达到POI的所需生产产量的时间。

上述提及的方法可进一步包括分离表达的POI的步骤。若所述POI是从细胞中分泌出来的，则该POI可采用现有技术从培养基中分离并纯化。POI从细胞中分泌出来通常是优选的，因为可以从培养上清液中回收产物，而不是从当细胞被破坏以释放胞内蛋白时产生的复杂蛋白混合物中回收。蛋白酶抑制剂，如苯基甲基磺酰氟(PMSF)，在抑制纯化过程中的蛋白质降解可能是有益的，且可包括抗生素以阻止外来污染物的生长。可采用本领域已知的方法将组合物浓缩、过滤、透析等。可选地，培养的宿主细胞也可以通过超声波或机械法、酶法或化学法来破裂以得到含有所需POI的细胞提取物，从该细胞提取物中可以分离和纯化到POI。

对于获得POI的分离和纯化方法，可以使用利用溶解度差异的方法，比如盐析和溶剂沉淀；利用分子量差异的方法，比如超滤和凝胶电泳；利用电荷差异的方法，比如离子交换层析；利用特异亲和性的方法，比如亲和层析；利用疏水性差异的方法，比如反相高效液相层析；以及利用等电点差异的方法，比如等电点聚集。优选采用特异的纯化步骤来移除同时表达的并会对POI制品造成污染的任何辅助蛋白。

分离和纯化的POI可以通过常规方法，比如蛋白质印迹法或对其活性的特异性检验来鉴定。纯化POI的结构可以通过氨基酸分析、氨基-末端分析、一级结构分析等来定义。优选可以大量和高纯度水平获得POI，这样即可满足作为药物组合物中的活性成分或者作为饲料或食品添加剂的必要要求。

应当理解，本发明不受描述的特殊方法、规程、细胞系、动物的种或属、构建体和试剂限制，因为它们当然可以变化。也理解的是本文使用的术语只是用于描述特定实施方案，并不意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅由所附权利要求限定。

除非另有说明，本文所使用的所有科技术语具有本发明所属技术领域的普通技术人员所通常理解的相同含义。尽管与本文所述的那些类似或等同的任何方法、装置和材料都可用于本发明的实践或试验中，但是目前描述了优选的方法、装置和材料。

本文所提及的所有公开文本都用于描述和披露公开文本中所描述并且可能与目前描述的本发明结合使用的例如细胞系、构建体和方法的目的。上面以及本文全文讨论的公开文本单独提供，因为它们的公开早于本申请的申请日。本文无任何内容能被解释为承认由于在先发明，本发明不早于这样的公开内容。

提出下述实施例以向本领域普通技术人员提供如何制备和使用本发明的完整公开和描述，并且不是要限制权利要求中的被认为是本发明的且限定的范围。已经尝试保证所使用的数字(例如量、温度、浓度等)的准确性，但应该允许一些实验误差和偏差。除非另外说明，份是重量份，分子量是平均分子量，温度是摄氏度，并且压力是大气压或接近大气压。

实施例

以下实施例将证明，基于重组蛋白的过表达，新鉴定的辅助蛋白分别增加了重组蛋白的效价(以mg/L表示的每体积的产物)和产量(以mg/g生物质表示的每生物质的产物，生物质以干细胞重量或湿细胞重量来度量)。作为实例，在巴斯德毕赤酵母中重组抗体Fab片段和重组酶的产量增加。在振荡培养(在摇瓶或深孔板中进行)和实验室规模的进料-分批培养中显示出了积极作用。

实施例1 巴斯德毕赤酵母生产菌株的产生

a)分泌抗体Fab片段HyHEL的巴斯德毕赤酵母菌株的构建

将巴斯德毕赤酵母CBS7435(CBS，由Küberl等，2011对其基因组测序)mut^s变体用作宿主菌株。pPM2d_pGAP和pPM2d_pAOX表达载体是WO2008/128701A2中描述的pPuzzle_ZeoR载体骨架的衍生物，其包含pUC19细菌复制起点和博来霉素(Zeocin)抗生素抗性盒。异源基因的表达分别由巴斯德毕赤酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAP)启动子或醇氧化酶(AOX)启动子和酿酒酵母CYC1转录终止子介导。采用表3中HyHEL-HC和HyHEL-LC的引物，将抗体Fab片段HyHEL(图2)的轻链(LC)和重链(HC)从载体DNA模板(携带具有N-末端酿酒酵母α交配因子信号前导序列的目的基因)中扩增，并且将每一条链都连接到由SbfI和SfiI消化的载体pPM2d_pGAP和pPM2d_pAOX上。将所述LC片段连接到pPM2d_pGAP和pPM2d_pAOX变体上，其中启动子区中的一个限制性酶位点被换为另一个，以允许随后的线性化(在pPM2d_pGAP中是NdeI而不是AvrII，在pPM2d_pAOX中是Bsu36I而不是Bpu1102I)；将所述HC片段连接到所述载体的未修饰版本中。在LC和HC的序列验证之后，通过采用相容性限制性酶MreI和AgeI将两条链的表达盒组合到一个载体上。

在电穿孔(采用描述于Gasser等，2013.Future Microbiol.8(2):191-208中的标准的转化方案)至巴斯德毕赤酵母中之前，分别采用NdeI限制性酶(针对pPM2d_pGAP)或Bsu36I限制性酶(针对pPM2d_pAOX)将质粒线性化。在含有50μg/mL博来霉素(Zeocin)的YPD板(每升：10g酵母提取物、20g蛋白胨、20g葡萄糖、20g琼脂)上实施阳性转化体的筛选。使用菌落PCR(Colony PCR)来确保转化的质粒的存在。因此，通过将巴斯德毕赤酵母菌落蒸煮(cook)和冷冻各5分钟获得基因组DNA，并将其直接用于采用适当引物的PCR。

b)分泌抗体Fab片段SDZ的巴斯德毕赤酵母菌株的构建

采用表3中SDZ-HC和SDZ-LC的引物，将抗体Fab片段SDZ(图2)的轻链(LC)和重链(HC)从载体DNA模板(携带具有N-末端α交配因子信号前导序列的目的基因)中扩增，并且将每一条链都连接到分别由SbfI和SfiI消化的pPM2d_pAOX或具有Bsu36I限制性位点的pPM2d_pAOX的变体上。在LC和HC的序列验证之后，通过采用相容性限制性酶MreI和AgeI将两条链的表达盒组合到一个载体上。

在电穿孔(采用描述于Gasser等，2013.Future Microbiol.8(2):191-208中的标准的转化方案)至巴斯德毕赤酵母中之前，采用Bsu36I限制性酶将质粒线性化。在含有50μg/mL博来霉素(Zeocin)的YPD板(每升：10g酵母提取物、20g蛋白胨、20g葡萄糖、20g琼脂-琼脂)上实施阳性转化体的筛选。使用菌落PCR(Colony PCR)来确保转化的质粒的存在。因此，通过将巴斯德毕赤酵母菌落蒸煮(cook)和冷冻各5分钟获得基因组DNA，并将其直接用于采用适当引物的PCR。

表3示出了HyHEL LC和HC以及SDZ LC和HC的PCR扩增的寡核苷酸引物(α-交配因子_上游是所有Fab链的扩增的上游引物)。

表3

实施例2 恒化器(chemostat)培养用最大工作容积为1.0L的1.4LDASGIP反应器(Eppendorf，德国)实施培养。

采用了如下培养基：

PTM₁痕量盐储备溶液(每升)含有：6.0g CuSO₄·5H₂O、0.08g NaI、3.36g MnSO₄·H₂O、0.2g Na₂MoO₄·2H₂O、0.02g H₃BO₃、0.82g CoCl₂、20.0g ZnCl₂、65.0g FeSO₄·7H₂O和5.0mL H₂SO₄(95％-98％)。

甘油分批培养基(每升)含有：2g柠檬酸一水合物(C₆H₈O₇·H₂O)、39.2g甘油、20.8gNH₄H₂PO₄、0.5g MgSO₄·7H₂O、1.6g KCl、0.022g CaCl₂·2H₂O、0.8mg生物素和4.6mL PTM1痕量盐储备溶液。加入HCl以将pH设定至5。

葡萄糖恒化器培养基(每升)含有：2.5g柠檬酸一水合物(C₆H₈O₇·H₂O)、55.0g葡萄糖一水合物、21.8g NH₄H₂PO₄、1.0g MgSO₄·7H₂O、2.5g KCl、0.04g CaCl₂·2H₂O、4.0mg生物素和2.43mL PTM1痕量盐储备溶液。加入HCl以将pH设定至5。

甲醇/甘油恒化器培养基(每升)含有：2.5g柠檬酸一水合物(C₆H₈O₇·H₂O)、8.5g甲醇、50.0g甘油、21.8g NH₄H₂PO₄、1.0g MgSO₄·7H₂O、2.5g KCl、0.04g CaCl₂·2H₂O、4.0mg生物素和2.43mL PTM1痕量盐储备溶液。加入HCl以将pH设定至5。

通过搅拌器速度(400-1200rpm)和通气率(12-72标准升/小时(sL/h))空气将溶解氧控制在DO＝20％，将温度控制在25℃和通过NH₄OH(25％)的添加来控制pH设定值为5。根据需要通过消泡剂(5％Glanapon 2000)的添加来控制起泡。

为了开始培养，将0.4L的分批培养基无菌过滤并转移到无菌工作台下的发酵罐中，并以1的起始光密度(OD₆₀₀)接种(从在含有50μg/mL博来霉素(Zeocin)的、180rpm、28℃的YPG的巴斯德毕赤酵母过夜预先培养物中)。约24h的分批阶段达到了约20g/L的干生物质浓度，然后用恒化器培养基以40mL/h(μ＝D＝0.1/h)恒定进料，同时恒定地移除培养物以保持总体积恒定。在7次停留时间(70小时)后达到约25g/L的干生物质浓度，此时取用于微阵列实验的样品并终止培养。对每种生产菌株(采用葡萄糖恒化器培养基的CBS7435pGAPHyHEL-Fab和采用甲醇/甘油恒化器培养基的CBS7435mut^S pAOX HyHEL-Fab)和非生产性野生型对照菌株(分别为CBS7435pGAP对照和CBS7435mut^S pAOX对照)实施该恒化器培养三次，从而获得可靠的微阵列分析所需的生物学复制品。

在恒化器的稳态条件下约70小时后取样。在每一培养过程中进行常规取样作为光密度或酵母干质量的测定，定性显微镜检查和细胞活力分析。对于微阵列分析，按照如下取样并处理：为了最佳淬灭，将9mL细胞培养液(broth)立即与4.5mL冰冷的5％苯酚(Sigma)溶液(在无水乙醇中)混合，并等分。将每2mL在预冷却的收集管(GE healthcare,NJ)中离心(13,200rpm 1分钟)，完全移除上清液并将含有细胞沉淀的试管保存在-80℃直至RNA分离。

实施例3 转录组实验的微阵列&数据评估

a)RNA分离及用于微阵列杂交的样品制备

采用TRI试剂，根据供应商的说明(Ambion,US)，自恒化器样品细胞中分离RNA。将细胞沉淀物重悬浮于TRI试剂中并采用FastPrep 24(M.P.Biomedicals，CA)以5m s^-1用玻璃珠匀化40秒。添加氯仿后，离心样品，并通过加入异丙醇从水相中沉淀出总RNA。将团块用70％乙醇洗涤，干燥并重悬浮于无RNA酶的水中。通过使用Nanodrop 1000分光光度计(NanoDrop products,DE)测量OD₂₆₀来测定RNA浓度。使用无DNA试剂盒(Ambion,CA)从样品中移除剩余的DNA。将等于10μg RNA的样品体积在无RNA酶的水中稀释至50μL，然后加入DNA酶缓冲液I和rDNA酶I，并在37℃下温育30分钟。在加入DNA酶灭活试剂后，将样品离心并将上清液转移至新的试管中。如上所述再次测定RNA浓度。此外，采用RNA纳米芯片(Agilent)分析RNA的完整性。为了监测从扩增和标记到样品杂交的微阵列工作流程，使用Spike InKit(Agilent，产品编号：5188-5279)作为阳性对照。它包含来自腺病毒的10种不同的聚腺苷酸化转录物，这些聚腺苷酸化转录物与自身RNA样品一起扩增、标记和共杂交。采用QuickAmp标记试剂盒(Agilent，产品编号5190-0444)用Cy 3和Cy 5标记样品。因此，将500ng纯化的样品RNA在8.3μL无RNA酶的水中稀释，加入2μL Spike A或B和1.2μL T7启动子引物。将混合物在65℃下变性10分钟，并在冰上保持5分钟。然后加入8.5μL cDNA mastermix(每个样品：4μL 5×第一链缓冲液、2μL 0.1M DTT、1μL 10mM dNTP mix、1μL MMLV-RT、0.5μL RNA酶out)，在40℃下温育2小时，然后转移至65℃温育15分钟，并置于冰上5分钟。制备转录mastermix(每个样品：15.3μL无核酸酶水、20μL转录缓冲液、6μL 0.1M DTT、6.4μL 50％PEG，0.5μL RNA酶抑制剂、0.6μL无机磷酸酶、0.8μL T7RNA聚合酶、2.4μL花青素苷3或花青素苷5)并将其加至每一试管中，然后在40℃下温育2小时。为了纯化获得的被标记cRNA，采用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen，货号74104)。在-80℃下保存样品。在Nanodrop分光光度计上进行cRNA浓度和标记效率的定量。

b)微阵列分析

将基因表达杂交试剂盒(Agilent，货号5188-5242)用于被标记样品cRNA的杂交。为了制备杂交样品，用无核酸酶水将每300ng cRNA(Cy3和Cy5)和6μL 10倍封闭剂稀释至最终体积为24μL。加入1μL 25倍片段化缓冲液(fragmentation buffer)后，将混合物在60℃下温育30分钟。然后加入25μL GEx杂交缓冲液HI-RPM来停止反应。采用13,200rpm离心1分钟后，将样品在冰上冷却并立即用于杂交。使用内部设计的巴斯德毕赤酵母特异性寡核苷酸阵列(AMAD-ID：034821，8x15K定制阵列，Agilent)。根据微阵列杂交腔室用户指南(Agilent G2534A)进行微阵列杂交。首先，将衬垫载玻片(gasket slide)打开并放在腔室底座上，Agilent标签面朝上。将样品(每个阵列40μL)装载在8个方格中的每一个的中间。然后将微阵列载玻片仔细放置到衬垫载玻片上(Agilent标签面朝下)并放上腔室盖然后用夹具固定。所有样品以染料交换方式与参考池样品杂交。所述池RNA样品是通过将来自各种培养物的RNA等量混合产生的。在杂交炉中于65℃下杂交17小时。扫描前，洗涤微阵列芯片。因此，将腔室拆开，并将夹心载玻片(sandwich slide)彼此分离，同时浸没在洗涤缓冲液1中。将微阵列直接转移到另一个具有洗涤缓冲液1的器皿中，洗涤1分钟，转移到洗涤缓冲液2(温度至少30℃)中并再洗涤1分钟。通过用纸巾接触载玻片边缘使微阵列载玻片干燥后，将其放入载玻片保持器(Agilent，标签面朝上)中。将载玻片保持器放入转盘(carousel)中并开始扫描。

c)微阵列数据的数据采集和统计评价

使用G2565AA微阵列扫描仪(Agilent)以50nm的分辨率扫描图像，并将这些图像导入Agilent Feature Extraction 9.5软件。Agilent Feature Extraction 9.5用于定量点强度。然后将原始平均点强度数据导入开源软件R中，用于进一步标准化和数据分析。

在计算差异表达值之前，将强度数据进行标准化(无背景校正，采用载玻片内标准化方法Loess和载玻片间标准化方法Aquantile)。使用线性模型拟合(limma R package)来计算与差异表达值相关联的p值，随后使用Benjamini和Yekutieli的方法(limma Rpackage的BY方法)针对多重检验调整p值。对于HyHEL-Fab生产菌株与其各自对照相比，计算Log2倍的变化。

浏览微阵列数据以获得产生HyHEL-Fab的CBS7435和其非生产性宿主对照的一式三份的恒化组之间的表达水平(倍数改变＞1.5)上的显著差异(调整的p值＜0.05)。

表4显示了来自生产HyHEL-Fab的巴斯德毕赤酵母的微阵列分析的上调基因。

表4

实施例4 过表达鉴定的基因的菌株的产生

为了研究对Fab分泌的阳性效应，在两种不同的Fab生产菌株中过表达所鉴定的基因：CBS7435pPM2d_pAOX HyHEL，其是微阵列数据的来源(参见实施例3)和CBS7435pPM2d_pAOX SDZ(产生参见实施例1)。

a)所鉴定的潜在分泌辅助基因的扩增和向pPM2aK21表达载体中的克隆

采用示于表5的引物，通过PCR(Phusion Polymerase，New England Biolabs)从起始到终止密码子扩增在实施例3中鉴定的基因。将序列克隆至具有两个限制性酶SbfI和SfiI的pPM2aK21表达载体的MCS中。pPM2aK21是pPM2d(描述于实施例1a)的衍生物，其包含AOX终止子序列(用于整合入天然AOX终止子基因座)、大肠杆菌的复制起点(pUC19)、用于大肠杆菌和酵母中选择的抗生素抗性盒(kanMX，赋予对卡那霉素和G418的抗性)、用于目标基因(GOI)的表达盒，其由GAP启动子、多克隆位点(MCS)和酿酒酵母CYC1转录终止子组成。通过Sanger测序验证基因序列。

表5

b)鉴定的基因在巴斯德毕赤酵母Fab生产菌株中的共-过表达

将巴斯德毕赤酵母Fab过生产菌株CBS7435mut^S pAOX HyHEL-Fab和CBS7435mut^SpAOX SDZ-Fab用作宿主菌株以进行在实施例3中鉴定的和在实施例4a中克隆的基因的共-过表达。在转化至Fab生产菌株之前，所述含有在实施例3中鉴定的分泌辅助基因的pPM2aK21载体在AOX终止子序列中用限制性酶AscI线性化。在含有G418的YPD琼脂平板上选择阳性转化体。

实施例5 Fab表达的筛选

在小规模筛选中，与非工程化的亲本宿主相比，测试每个分泌辅助基因的8至12个转化体，并基于它们对细胞生长、Fab效价和Fab产量的影响进行排名。在所有测试的克隆中，发现PP7435_Chr3-0933、PP7435_Chr2-0220、PP7435_Chr3-0639、PP7435_Chr1-1232、PP7435_Chr1-1225、PP7435_Chr3-0607、PP7435_Chr4-0448、PP7435_Chr4-0108、PP7435_Chr1-0667显示最好的结果(使Fab效价或Fab产量增加至少1.2倍)。

在实施例7中，之后将所有这些克隆(除了PP7435_Chr1-0667)在生物反应器中培养以验证在受控生产过程中菌株的改进。

a)巴斯德毕赤酵母Fab生产菌株的小规模培养

将巴斯德毕赤酵母菌株的单一菌落接种于2mL含有10g/L甘油和50μg/mL博来霉素(Zeocin)的YP-培养基(10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨)，并在25℃下生长过夜。将这些培养物的等分试样(对应于终OD₆₀₀为2.0)转移到2mL补充有20g/L葡萄糖和葡萄糖饲料片(Kuhner,Switzerland；CAT#SMFB63319)的合成筛选培养基M2(在下面给出该培养基的组成)中，并于25℃下，以170rpm在24深孔板中温育25小时。通过离心洗涤培养物一次，然后将沉淀重悬于合成筛选培养基M2中，将等分试样(对应于终OD₆₀₀为4.0)转移到新鲜24深孔板中的2mL合成筛选培养基M2中。每12小时重复加入甲醇(5g/L)共48小时，然后在室温下以2500xg离心10分钟而收获细胞并准备用于分析。通过测量1mL细胞悬浮液的细胞重量来测定生物质，而在上清液中重组分泌蛋白的测定在以下实施例5b-6c中描述。

每升合成筛选培养基M2含有：22.0g柠檬酸一水合物、3.15g(NH₄)₂PO₄、0.49gMgSO₄*7H₂O、0.80g KCl、0.0268g CaCl₂*2H₂O、1.47mL PTM1痕量金属、4mg生物素；用KOH(固体)将pH设定至5。

b)SDS-PAGE&蛋白质印迹分析

采用

Bis-Tris系统进行蛋白质凝胶分析，其使用12％Bis-Tris或4-12％Bis-Tris凝胶和MOPS运行缓冲液(均来自Invitrogen)。电泳后，蛋白质或是通过银染色而显色，或是被转移至硝酸纤维素膜用于蛋白质印迹分析。因此，采用用于湿(槽(tank))转移的XCell II^TM印迹模块(Invitrogen)，根据制造商的说明，将蛋白质电印迹至硝酸纤维素膜上。在封闭后，用以下抗体探测蛋白质印迹：对于Fab轻链：抗-人κ轻链(结合的和游离的)-碱性磷酸酶(AP)缀合的抗体，Sigma A3813(1:5,000)；对于Fab重链：以1:1,000稀释的小鼠抗人IgG抗体(Ab7497，Abcam)和以1:5,000稀释的在山羊中产生的抗小鼠IgG(Fc特异性)-碱性磷酸酶抗体(A1418，Sigma)作为第二抗体。

基于用于AP-缀合物的NBT/BCIP系统或用于HRP缀合物的化学发光Super SignalWest Chemiluminescent Substrate(Thermo Scientific)，使用比色AP检测试剂盒(BioRad)进行检测。

c)通过ELISA的Fab的定量

采用抗-人IgG抗体(ab7497,Abcam)作为包被抗体和山羊抗-人IgG(Fc特异性)-碱性磷酸酶缀合的抗体(Sigma A8542)作为检测抗体，通过ELISA进行完整Fab的定量。人Fab/κ、IgG片段(Bethyl P80-115)用作标准品，起始浓度为100ng/mL，相应地稀释上清液样品。用pNPP(Sigma S0942)进行检测。包被-、稀释-和洗涤缓冲液是基于PBS(2mM KH₂PO₄、10mMNa₂HPO₄.2H₂O、2.7mM g KCl、8mM NaCl，pH 7.4)的，并相应地用BSA(1％(w/v))和/或吐温20(0.1％(v/v))来完成。

实施例6 低表达所选择的鉴定的基因的菌株的产生

一些在实施例3中鉴定的基因在生产HyHEL-Fab的巴斯德毕赤酵母宿主菌株中过表达时导致了较少分泌的Fab(实施例4和5中)。这些基因中的两个编码伴侣蛋白，即胞质伴侣蛋白PP7435_Chr3-1062(KO2)和ER-定位的伴侣蛋白PP7435_Chr1-0176(KO3)。由于通常认为伴侣蛋白具有表达/分泌增强作用，因此，上述这一发现是非常令人惊奇的。令发明人惊奇的是，PP7435_Chr1-0176的过表达是不利的，其使Fab的效价和产量降低至小于亲本非工程化的HyHEL-Fab或SDZ-Fab生产菌株的80％。PP7435_Chr3-1062的过表达也使HyHELFab的效价和产量降低至小于亲本非工程化菌株的80％。因此，在两种宿主菌株中，这些基因(PP7435_Chr1-0176/SCJ1、PP7435_Chr3-1062/HCH1)被破坏。在转录组学实验(实施例3)中发现许多絮凝相关基因被强烈下调(倍数变化<0.66)之后，另外选择絮凝转录因子PP7435_Chr4-0252/FLO8作为敲除靶标。

将巴斯德毕赤酵母Fab过生产菌株CBS7435mut^S pAOX HyHEL-Fab和CBS7435mut^SpAOX SDZ-Fab用作宿主菌株。按照Heiss等(2013)[Appl Microbiol Biotechnol.97(3):1241-9.]所描述的，采用分裂标记盒方法来产生具有被破坏基因座的转化体。使用能够在G418上生长的转化体的基因组DNA和在破坏盒外的引物(表6)，通过PCR进行阳性敲除菌株的验证。

表6列出了所有用于敲除盒(每个敲除靶标2个重叠的分裂标记盒)的构建的引物：通过PCR(Phusion聚合酶，New England Biolabs)，将引物对A_正向/A_反向、B_正向/B_反向、C_正向/C_反向、D_正向/D_反向用于扩增片段A、B、C和D。片段A从巴斯德毕赤酵母基因组DNA扩增，在相应ATG(靶基因的)的5起始(prime)方向上的1700bp开始，直到ATG的5起始方向的200bp。片段D从巴斯德毕赤酵母基因组DNA扩增，在相应ATG(靶基因的)的3起始方向上的200bp开始，直到ATG的3起始方向的1700bp。片段B由KanMX选择标记盒的前三分之二组成，并从pPM2aK21载体DNA模板中扩增。片段B由KanMX选择标记盒的后三分之二组成，并从pPM2aK21载体DNA模板中扩增。采用引物A_正向和B_反向通过重叠PCR使片段A和B退火在一起(AB)。采用引物C_正向和D_反向通过重叠PCR使片段C和D退火在一起(CD)。为了产生敲除菌株，用总共0.5μg的片段AB和CD的DNA转化生产Fab的宿主菌株，其中片段AB和CD也是重叠的。在含有500μg/mL G418的YPD琼脂平板上选择细胞。通过PCR，采用引物对检验(check)_正向(在靠近引物序列A_正向的5起始区域上结合)和检验_反向(在靠近引物序列D_反向的3起始区域上结合)验证阳性敲除克隆。由于用KanMX盒替代了400bp区域(ATG周围)，阳性敲除菌株的PCR产物条带(band)比野生型序列的PCR产物条带大。

表6

实施例7 进料分批培养

在进料分批生物反应器培养中分析在小规模培养中具有最佳性能(使模型蛋白的产量增加了至少1.2倍改变)的实施例5和6的辅助因子工程化菌株，用于验证生产宿主菌株的改进。使用了两种方案。

a)进料分批方案A

在具有1.0L的最大工作体积的1.4L DASGIP反应器(Eppendorf,Germany)中进行进料分批。培养温度控制在25℃，通过25％的氢氧化铵的添加将pH控制在5.0，通过控制搅拌器速度在400至1200rpm之间和空气流量在24至72sL/h之间将溶解氧浓度维持在20％饱和度以上。

将用于进料分批培养的接种物在含有100mL的YP培养基的摇瓶中培养，并在28℃和108rpm下温育约24小时，所述YP培养基含有20g/L甘油和50μg/mL博来霉素(Zeocin)。将培养物用于接种生物反应器中0.4L的起始体积至1.0的起始光密度(600nm)。在约24小时后完成分批，并给出第一(10mL)盐液(salt shot)。

然后将甘油进料分批溶液以5mL/h的恒定速率进料5小时。然后，向培养物中给予甲醇脉冲(2g)和盐液(10mL)。在通过培养物中溶解氧浓度的增加指示甲醇脉冲消耗后，以1.0g/h的进料速率开始用甲醇进料分批溶液的恒定进料。每10g新形成的生物质给出10mL的盐液，其对应于～43g甲醇进料培养基。随着生物质浓度的增加，当短时间关闭甲醇进料时培养物中溶解氧突然增加而导致甲醇累计能够被消除时，甲醇进料速率适当地增加。最终甲醇进料速度为2.5g/h。

经常采集样品用于生物质的测定和Fab的定量(如实施例6中所述)。在约100小时后，当细胞密度达到大于100g/L细胞干重时收获培养物。

培养基如下：

分批培养基(每升)含有：2g柠檬酸、12.4g(NH₄)₂HPO₄、0.022g CaCl₂·2H₂O、0.9gKCl、0.5g MgSO₄·7H₂O、40g甘油、4.6mL PTM1痕量盐储备溶液。用25％的HCl将pH设定至5。

甘油进料分批溶液(每升)含有：623g甘油、12mL PTM1痕量盐储备溶液和40mg生物素。PTM1的组成在实施例1中给出。

纯甲醇的甲醇进料分批溶液(每升)含有：12mL PTM1痕量盐储备溶液和40mg生物素。

盐液溶液(每升)含有：20.8g MgSO₄·7H₂O、41.6KCl、1.04g CaCl₂·2H₂O

b)进料分批方案B

将相应的菌株接种到装有50mL YPhyG的宽颈、带挡板(baffled)、有盖的300mL振荡摇瓶中，并在28℃下以110rpm振荡过夜(预培养物1)。从预培养物1中以OD₆₀₀(在600nm处测量的光密度)在下午晚些时候(倍增时间：约2小时)达到约20(针对YPhyG培养基测量)的方式接种预培养物2(宽颈、带挡板、有盖的1000mL振荡摇瓶中的100mL YPhyG)。预培养物2的温育也在28℃，110rpm下进行。

进料分批在1.0L工作体积的生物反应器(Minifors,Infors,Switzerland)中进行。将所有生物反应器(装有400mL pH约为5.5的BSM-培养基)从预培养2分别接种至OD600为2.0。一般而言，巴斯德毕赤酵母在甘油上生长以产生生物质，并且所述培养物随后经受甘油进料，随后是甲醇进料。

在初始分批阶段，将温度设定为28℃。在开始生产阶段之前的最后一小时期间，将其降至25℃并在整个剩余过程中保持在该水平，同时pH降至5.0并保持在该水平。将整个过程(级联控制：搅拌器，流量，氧补充)的氧饱和度设定为30％。以700至1200rpm施加搅拌并选择1.0-2.0L/min的流量范围(空气)。使用25％铵实现pH在5.0的控制。根据需要通过加入消泡剂Glanapon 2000控制发泡。

在分批阶段，生成生物质(μ～0.30/h)直至约110-120g/L的湿细胞重量(WCW)。经典的分批阶段(生物质产生)将持续约14小时。在11小时后开始以6g/(L*h)的恒定甘油进料，并持续5小时。第一取样点选为16小时(在下文中称为诱导时间的“0小时”)。

在约95小时的时间内供应总共290g的甲醇(其具有由方程1+0.04*t(g/L)定义的线性增加的进料速率)。

采用以下程序，在多个时间点取样：将取样的培养液(broth)的第一个3mL(用注射器)弃去。将1mL的新鲜采集样品(3-5mL)转移至1.5mL离心管中，并在13,200rpm(16,100g)下旋转5分钟。将上清液迅速转移至一个单独的小瓶中。

将1mL的培养液在称量去皮的Eppendorf小瓶中以13,200rpm(16,100g)离心5分钟，然后将所得的上清液准确地移除。将小瓶称重(精确度0.1mg)，并减去空瓶的皮重以获得湿细胞重量。

培养基如下：

YPhyG预培养基(每升)含有：20g植物蛋白胨、10g细菌酵母提取物、20g甘油

分批培养基：修饰的基础盐培养基(BSM)(每升)含有：13.5mL H₃PO₄(85％)、0.5gCaCl·₂H₂O、7.5g MgSO₄·7H₂O、9g K₂SO₄、2g KOH、40g甘油、0.25g NaCl、4.35mL PTM1、8.7mg生物素、0.1mL Glanapon 2000(消泡剂)

进料-溶液甘油(每kg)含有：600g甘油、12mL PTM1

进料-溶液甲醇含有：纯甲醇。

c)结果

表7列出了一些基因，与未工程化Fab生产对照菌株相比，这些基因的过表达显示出增加在进料分批生产过程中的巴斯德毕赤酵母中的Fab分泌。所述Fab产物效价通过ELISA定量(实施例5c)。生物质被测定为湿细胞重量或干细胞重量。产物效价和产量的改变以相对于相应对照菌株的倍数改变值表示。相对于平行地生长和取样的用于直接比较的AOX HyHEL和AOX SDZ亲本宿主，进料分批生产过程的倍数改变值表明了效价和产物产量的改善。

表7

如上所示，所有所列的基因在过表达后都成功地使模型蛋白SDZ-Fab或HyHEL-Fab的产量(mg/生物质)增加了至少20％(倍数改变＞1.2)。

表8列出了一些基因，与未工程化Fab生产对照菌株相比，这些基因的缺失显示出增加在进料分批生产过程中的巴斯德毕赤酵母中的Fab分泌。所述Fab产物通过ELISA定量(实施例5c)。产物效价和产量的改变以相对于相应对照菌株的倍数改变值表示。

表8

如上所示，所有所列的基因在低表达时能够使模型蛋白SDZ-Fab或HyHEL-Fab的Fab效价(mg/L)或Fab生产(mg/生物质)的产量增加至少28％(倍数改变＞1.28)。

实施例8：HP和HP与KO蛋白的组合

对于过表达靶标的组合，使用在组成型pGAP启动子(如实施例4a和b中描述的方法产生)控制下的过表达HP3(‘3’)或HP10(‘34’)的CBS7435mutS pAOX SDZ-Fab菌株。对于过表达与低表达靶标的组合，使用具有破坏的KO1基因座的CBS7435mutS pAOX SDZ-Fab菌株(在实施例6中描述)。在所有这些菌株中，编码模型蛋白SDZ-Fab的质粒基于博来霉素(Zeocin)作为选择标记，而共表达HP的质粒或盒用于携带两侧为共定向loxP识别位点的KanMX抗性盒的KO基因座的破坏。

在用另外的HP或KO盒转化之前，Cre重组酶再循环标记基因表达盒(KanMX–两侧为loxP位点)。因此，用附加型pTAC_Cre_HphMX4质粒转化背景菌株，该附加型pTAC_Cre_HphMX4质粒在酿酒酵母TPI启动子的控制下表达Cre重组酶，并且只要培养基中存在潮霉素(Hyg)的选择压力，该质粒就短暂地保持在巴斯德毕赤酵母中。在28℃下，将转化体在YPD/Zeo/Hyg琼脂平板上生长2天，然后在选择性琼脂平板上复印平板并在28℃下再生长2天。仅选择那些在2-3涂板轮次后丧失了在G418和Hyg上生长的能力的克隆用于24深孔板(DWP)筛选(在实施例5a中描述)。按照实施例5c中的描述测定Fab的效价和产量。用另一过表达HP蛋白(在实施例4a和b中描述)的质粒转化Fab产量和/或效价最佳的菌株。在选择性琼脂平板(含有Zeo和G418)上选择具有两个组合的HP或KO的转化体，并按照实施例5中的描述筛选Fab分泌。对于进一步的组合步骤，重复上述程序，从而得到具有三种组合等等的菌株。在所有筛选实验中，亲本(＝前)菌株用作参照。

结果如下—表9：

“起源菌株”是指相应地无HP或无敲除的巴斯德毕赤酵母菌株pAOX-SDZ-Fab#9。

“亲本菌株”是指表达SDZ-Fab的巴斯德毕赤酵母菌株，其作为宿主菌株用于分别用下一HP或KO的转化(例如，仅过表达HP3的菌株用于HP3和HP1的组合、过表达HP2的具有KO1敲除的菌株用于KO1HP2与HP3或HP1的组合)。可以看出，无论是与起源菌株相比还是与亲本菌株相比，每一组合都导致了模型蛋白SDZ-Fab的Fab效价的增加。与亲本菌株相比，Fab效价的增加表明HP或HP和KO蛋白的组合甚至可以进一步提高由模型蛋白SDZ-Fab例示的POI的产量。

序列表

<110> 贝林格尔·英格海姆RCV两合公司

山德士股份公司

VTU技术股份有限公司

隆萨有限公司

<120> 被工程化为过表达辅助蛋白的重组宿主细胞

<130> LC16310017P

<150> EP14165186.9

<151> 2014-04-17

<160> 163

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 95

<212> PRT

<213> 巴斯德毕赤酵母

<400> 1

Met Leu Asn Lys Leu Phe Ile Ala Ile Leu Ile Val Ile Thr Ala Val

1 5 10 15

Ile Gly Glu Thr Thr Thr Ser Ser Thr Thr Ala Ser Leu Ser Glu Ser

20 25 30

Pro Thr Leu Val Trp Val Thr Gly Thr Asp Ala Ser Gly Arg Leu Ala

35 40 45

Thr Thr Gln Ser Ala Tyr Thr Gln Gln Phe Ser Gln Leu Tyr Ser Ser

50 55 60

Ile Ala Ser Pro Ser Ser Gly Ser Ile Gly Leu Gly Thr Ile Gln Gly

65 70 75 80

Thr Val Gly Ile Val Arg Thr Tyr Glu Thr Ile Thr Leu Ala Ser

85 90 95

<210> 2

<211> 86

<212> PRT

<213> 巴斯德毕赤酵母

<400> 2

Met Ser Thr Ala Ile Pro Gly Gly Gln Arg Thr Leu Ala Lys Arg Arg

1 5 10 15

Ala Ala Asn Leu Asp Lys Lys Gln Asp Glu Pro Thr Ser Ala Arg Ser

20 25 30

Ala Gly Ala Gly Gly Ser Ser Ser Thr Met Leu Lys Leu Tyr Thr Asp

35 40 45

Glu Ala Gln Gly Leu Lys Val Asp Pro Leu Ile Val Leu Val Leu Ala

50 55 60

Val Gly Phe Ile Phe Ser Val Ile Gly Leu His Val Val Ala Lys Leu

65 70 75 80

Thr Gly Lys Leu Ile Asn

85

<210> 3

<211> 361

<212> PRT

<213> 巴斯德毕赤酵母

<400> 3

Met Thr Pro Arg Ser His Ile Phe Phe Asp Ile Ser Ile Asn Asn Gln

1 5 10 15

Pro Ala Gly Arg Ile Ile Phe Glu Leu Phe Asn Asp Ile Val Pro Lys

20 25 30

Thr Ala Glu Asn Phe Arg Ala Leu Ser Thr Gly Glu Lys Gly Ile Gly

35 40 45

Lys Ser Gly Lys Pro Leu His Tyr Lys Gly Ser Thr Phe His Arg Ile

50 55 60

Ile Lys Asp Phe Met Val Gln Gly Gly Asp Phe Thr Asn Gly Asn Gly

65 70 75 80

Thr Gly Gly Glu Ser Ile Tyr Gly Glu Lys Phe Glu Asp Glu Asn Phe

85 90 95

Gln Leu Thr His Asp Lys Pro Phe Leu Leu Ser Met Ala Asn Ala Gly

100 105 110

Pro Gly Thr Asn Gly Ser Gln Phe Phe Ile Thr Thr Val Pro Thr Pro

115 120 125

His Leu Asp Asn Lys His Val Val Phe Gly Lys Val Ile Ala Gly Lys

130 135 140

Ala Thr Val Arg Lys Ile Glu Arg Asn Ser Glu Gly Glu Ala Pro Ile

145 150 155 160

Glu Pro Val Val Ile Glu Asp Cys Gly Glu Leu Pro Glu Asp Ala Asp

165 170 175

Leu Thr Ile Ser Asp Glu Thr Gly Asp Lys Tyr Glu Glu Val Leu Lys

180 185 190

Asp Asn Glu Asn Ile Asp Ile Asp Asp Phe Glu Gln Val Tyr Gln Ala

195 200 205

Ile Thr Glu Ile Lys Glu Leu Gly Thr Lys Tyr Phe Lys Asn Gly Asp

210 215 220

Thr Lys Ile Ala Phe Glu Lys Tyr Gln Lys Ala Ala Asn Tyr Leu Leu

225 230 235 240

Glu Tyr Ile Pro Ser Asp Leu Ser Glu Glu Gln Ser Ser Lys Leu Glu

245 250 255

Leu Leu Lys Thr Ser Val Phe Ser Asn Val Ala Leu Ala Gly Leu Lys

260 265 270

Val Ser Lys Phe Lys Asp Thr Ile Lys Tyr Ala Thr Leu Val Ile Glu

275 280 285

Asp Glu Ser Ala Asp Ala Lys Ala Lys Ser Lys Gly Tyr Tyr Arg Arg

290 295 300

Gly Ser Ala Tyr Ser Ser Leu Lys Asp Glu Asp Ser Ala Ile Ser Asp

305 310 315 320

Phe Gln Lys Ala Leu Glu Leu Ser Pro Gly Asp Pro Ala Ile Ser Gln

325 330 335

Ser Leu Gln Arg Thr Thr Lys Ala Arg Lys Asp Arg Leu Ala Lys Glu

340 345 350

Lys Ala Ala Leu Ser Lys Phe Phe Glu

355 360

<210> 4

<211> 274

<212> PRT

<213> 巴斯德毕赤酵母

<400> 4

Met Ser Ser Asp Ala Val Glu Gln Leu Glu Asn Phe Gln Leu Ile Lys

1 5 10 15

Phe Asp Arg Phe Asp Pro Ser Thr Gln Ser Thr Ile Arg Ile Ala Arg

20 25 30

Ser Pro Lys Pro Ile Pro Val Lys Val Val Ile Val Gly Asp Gly Gly

35 40 45

Cys Gly Lys Thr Cys Leu Leu Asn Val Phe Ala Thr Gly Thr Phe Pro

50 55 60

Glu Ala Tyr Val Pro Thr Ile Ile Glu Asn Val Val Ile Thr Leu Val

65 70 75 80

Thr Pro Thr Gly Gln Ile Ala Ala Val Thr Leu Trp Asp Thr Ala Gly

85 90 95

Gln Glu Glu Tyr Asp Arg Leu Arg Pro Leu Ser Tyr Ser Asp Val Asp

100 105 110

Val Val Leu Leu Cys Tyr Ser Ile Asp Asn Leu Ser Thr Phe His Asn

115 120 125

Val Ala Asp Lys Trp Tyr Pro Glu Val Ala His Phe Cys Pro Asn Thr

130 135 140

Pro Ile Ile Leu Val Gly Thr Lys Ser Asp Met Arg Arg His Gln Lys

145 150 155 160

Ser Gln Pro His Phe Val Ser Pro Gln Asp Ser Ser Gln Leu Ala Arg

165 170 175

Gln Met Gly Ala Val Met Asn Ile Glu Cys Ser Ala Lys Glu Val Ser

180 185 190

Asn Val Asn Ile Val Phe Asp Ala Ala Val Ser Tyr Cys Leu Ser Asn

195 200 205

Ser Arg Pro Lys Thr Arg Gly Asp Asn Asp Asn Asn Arg Ser Asn Arg

210 215 220

Arg Leu Ser Arg Ala Lys Arg Ala Ser Met Phe Ile Arg Gly Lys Asp

225 230 235 240

Val Ser Ser Thr Ser Gly Asn Ser Arg Glu Glu Leu Val Glu Tyr Asp

245 250 255

Gln Asp Gly Leu Ala Ile Ile Pro Asp Arg Lys Lys Arg Lys Cys Ser

260 265 270

Ile Ile

<210> 5

<211> 127

<212> PRT

<213> 巴斯德毕赤酵母

<400> 5

Met Thr Asn Trp Lys Ala Ile Leu Thr Pro Ala Gln Tyr Gln Val Leu

1 5 10 15

Arg Leu Gly Gly Thr Glu Arg Pro Tyr Thr Gly Gln Tyr Val Asn Phe

20 25 30

Lys Lys Asn Gly Thr Tyr Leu Cys Ser Gly Cys Gln Thr Pro Leu Tyr

35 40 45

Lys Ser Gly Thr Lys Phe Asp Ser Ser Cys Gly Trp Pro Ala Phe Tyr

50 55 60

Glu Ala Leu Pro Gly Ala Val Lys Arg Ile Glu Asp Asn Ser Leu Gly

65 70 75 80

Met Arg Arg Ile Glu Ile Arg Cys Ser Lys Cys Asp Gly His Leu Gly

85 90 95

His Val Phe Glu Gly Glu Gly Phe Asp Thr Pro Thr Asp Ser Arg His

100 105 110

Cys Val Asn Ser Ile Ser Leu Lys Phe Gln Gly Glu Glu Glu Asn

115 120 125

<210> 6

<211> 1027

<212> PRT

<213> 巴斯德毕赤酵母

<400> 6

Met Thr Thr Asn Gly Gln Lys Arg Gln Lys Thr Arg Lys Pro Leu Leu

1 5 10 15

Ile Asn Ala Phe Val Met Gly Cys Ala Gly Leu Gln Asn Pro Gly Leu

20 25 30

Trp Lys His Pro Lys Asp Ser Ser His Arg Phe Asn Gln Ile Asp His

35 40 45

Trp Thr Tyr Leu Ala Lys Leu Ala Glu Lys Gly Lys Phe Asn Ala Leu

50 55 60

Phe Ile Ala Asp Val Leu Gly Gly Tyr Asp Val Tyr Lys Gly Pro Glu

65 70 75 80

Asn Leu Ala Thr Pro Ala Val Ala Gly Ala Gln Trp Pro Val Thr Glu

85 90 95

Pro Ser Ala Val Val Ser Ala Met Ala Ala Val Thr Thr Asn Leu Ala

100 105 110

Phe Gly Val Thr Phe Ser Thr Ile Ser Glu Ala Pro Tyr His Phe Ala

115 120 125

Arg Arg Leu Ser Thr Leu Asp His Leu Thr Lys Gly Arg Ile Gly Trp

130 135 140

Asn Val Val Ser Ser Tyr Leu Glu Ser Ala Ala Arg Asn Leu Leu Asn

145 150 155 160

Gly Glu Lys Leu Asp Glu His Asp Gln Arg Tyr Leu Lys Ala Glu Glu

165 170 175

Tyr Ile Gln Ile Val Tyr Glu Leu Leu Leu Ser Ser Trp Arg Asp Asp

180 185 190

Ala Val Val Leu Asp Lys Lys Ala Gly Val Tyr Thr Asp Pro Thr Arg

195 200 205

Phe Arg Lys Ile Asn Phe Glu Gly Lys Phe Phe Lys Val Pro Gly Pro

210 215 220

His Ile Val Asp Pro Thr Pro Gln Arg Leu Pro Val Ile Leu Gln Ala

225 230 235 240

Gly Thr Ser Lys Val Gly Lys Glu Phe Ala Ala Lys His Ala Glu Ile

245 250 255

Val Phe Val Ile Ser Phe Ser Pro Asp Asp Leu Lys Pro Lys Ile Ala

260 265 270

Glu Val Arg Gln Leu Ala Lys Glu Lys Phe Gly Arg Asn His Asp Asp

275 280 285

Ile Lys Phe Val Ala Leu Ala Thr Pro Val Ile Gly Ala Thr His Glu

290 295 300

Leu Ala Glu Glu Lys Tyr Gln Glu Leu Leu Ser Tyr Gly Asp Ile Glu

305 310 315 320

Gly Ala Gln Ala Leu Phe Gly Gly Trp Thr Gly Ile Asp Leu Ser Gln

325 330 335

Tyr Gly Glu Asp Glu Glu Leu Gly Asn Val Ser Ser Asn Ala Met Arg

340 345 350

Gly Ala Val Gln Asn Trp Thr Lys Ala Ile Pro Asn Glu Lys Arg Trp

355 360 365

Thr Arg Lys Val Ile Ala Lys Gln Ile Thr Val Gly Gly Leu Gly Pro

370 375 380

Ala Phe Val Gly Thr Pro Glu Glu Ile Ala Asp Glu Leu Glu His Trp

385 390 395 400

Ser Asp His Ala Gly Leu Asp Gly Phe Asn Phe Thr Tyr Ala Val Asn

405 410 415

Pro Leu Ser Phe Glu Glu Ile Val Glu Asp Leu Ile Pro Val Leu Gln

420 425 430

Arg Arg Gly Leu Ala Gln Lys Glu Tyr Pro Asn Pro Glu Thr Gly Ser

435 440 445

Thr Phe Arg Lys Asn Leu Phe Gly Thr Asp Phe Val Pro Ser Thr His

450 455 460

Pro Ala Tyr Asn Leu Arg Trp Arg Ala Gly Val Ser Lys Glu Glu Phe

465 470 475 480

Glu Lys Ser Leu Asn Ala Thr Thr Asn Trp Tyr Ser Ser Phe Ala Arg

485 490 495

Ser Gly Ala Leu Gly Glu Leu His Asn Thr Cys Arg Ile Leu Tyr Leu

500 505 510

Gln Ile Val Lys Tyr Lys Tyr Arg Leu Arg Val Arg Ser Glu Gly Asn

515 520 525

Ser Ile Pro Phe Ala Lys Met Thr Lys Glu Asn Glu Ala Lys Arg Gln

530 535 540

Lys Thr Ser Gln Pro Lys Ala Lys Lys Gln Leu Ile Ile Asn Ala Phe

545 550 555 560

Met Ser Gly Ser Ser Gly Asn Gln Ser Pro Gly Leu Trp Ser Tyr Pro

565 570 575

Gly Asp Lys Ser Thr Glu Tyr Thr Thr Leu Asp Tyr Trp Val Glu Leu

580 585 590

Ala Gln Lys Leu Glu Lys Ala Lys Phe His Ser Ile Phe Ile Ala Asp

595 600 605

Val Leu Gly Gly Tyr Asp Val Tyr Asn Gly Pro Gly Asn Tyr Ser Ala

610 615 620

Ala Ala Lys Ser Gly Ala Gln Phe Pro Met Ile Glu Pro Ser Ala Ala

625 630 635 640

Val Thr Ala Met Ala Ala Ala Thr Lys Ser Ile Thr Phe Gly Val Thr

645 650 655

Phe Ser Thr Ile Ser Glu Ala Pro Tyr His Phe Ala Arg Arg Leu Gly

660 665 670

Thr Leu Asp Leu Leu Thr Asn Gly Arg Val Gly Trp Asn Ile Val Ser

675 680 685

Ser Tyr Leu Asp Ser Ala Ala Arg Asn Leu Leu Asn Gly Glu Pro Leu

690 695 700

Pro Leu His Ala Asp Arg Tyr Lys Arg Ala Glu Glu Phe Leu Gln Val

705 710 715 720

Val Tyr Arg Leu Phe Leu Ser Ser Trp Arg Asp Asp Ala Tyr Lys Leu

725 730 735

Asp Lys Lys Thr Arg Thr Phe Ala Asp Pro Lys Leu Ile Arg Thr Ile

740 745 750

Asp His Val Gly Glu Phe Phe Asn Val Pro Gly Pro Gln Phe Leu Pro

755 760 765

Pro Thr Pro Gln Arg Leu Pro Leu Ile Leu Gln Ala Gly Thr Ser Lys

770 775 780

Val Gly Met Asp Tyr Ala Ala Lys His Ala Glu Val Val Phe Leu Ala

785 790 795 800

Ser Phe Asp Pro Glu Ser Leu Gln Glu Lys Ile Lys Thr Val Arg Asp

805 810 815

Ile Ala Glu Thr Lys Tyr Asn Arg Pro Arg Asp Ser Ile Lys Phe Leu

820 825 830

Ile Leu Ile Thr Val Val Ile Ala Asp Thr His Glu Asp Ala Val Lys

835 840 845

Arg Tyr Glu Asp Leu Ala Ser Tyr Ala Asp Leu Glu Gly Ala Gln Ala

850 855 860

Leu Phe Ser Gly Trp Thr Gly Ile Asp Ile Gly Lys Tyr Gly Glu Asp

865 870 875 880

Glu Pro Leu Glu His Val Glu Ser Asn Ala Ile Lys Ser His Val Lys

885 890 895

Asn Trp Thr Lys Phe Lys Asp Asn Lys Pro Arg Ala Arg Lys Asp Ile

900 905 910

Ala Lys Gln Ile Gly Val Gly Gly Ser Gly Pro Leu Leu Val Gly Ser

915 920 925

Val Gln Glu Ile Ala Asp Glu Leu Glu Arg Trp Ala Glu Val Ser Asp

930 935 940

Leu Asp Gly Phe Asn Phe Ala Tyr Ala Asp Tyr Pro Gln Thr Phe Asp

945 950 955 960

Asp Ile Ile Glu Lys Leu Leu Pro Glu Leu Asn Lys Arg Gly Val Phe

965 970 975

Trp Asp Asp Tyr Lys Ile Pro Gly Gly Thr Phe Arg Glu Ser Val Phe

980 985 990

Gly Arg Lys Phe Val Asp Lys Asp His Pro Ala Tyr Asp Leu Arg Trp

995 1000 1005

Arg Ser Asp Gln Thr Arg Glu Glu Phe Glu Lys Lys Leu Ala Glu

1010 1015 1020

Leu Glu Lys Lys

1025

<210> 7

<211> 546

<212> PRT

<213> 巴斯德毕赤酵母

<400> 7

Met Ser His Leu Leu Leu Arg Asp Ser Phe Trp Gly Arg Thr Ile Tyr

1 5 10 15

His Leu Ser Lys His Arg Tyr Phe Ser Phe Pro Glu Glu Lys Asp Gly

20 25 30

Phe Ile Ala Pro Glu Lys Tyr Tyr Leu Asn Met Asp Gln Val Ser Ile

35 40 45

His Ala Glu Ser Glu Lys Asn Ile Val Glu Gly Leu Val Asp Thr Ser

50 55 60

Asn Ser Ser Leu Glu Glu Val Lys Thr Thr Arg Val Ile Val Asp Trp

65 70 75 80

Asp Glu Tyr Asp Gln Lys Glu Asn Pro Gln Asn Trp Ser Ser Leu Leu

85 90 95

Lys Cys Phe Val Val Phe Glu Val Gly Ile Leu Thr Val Ala Val Tyr

100 105 110

Met Gly Ser Ala Ile Tyr Thr Pro Gly Ile Glu Asp Ile Met Arg Asp

115 120 125

Leu Asn Val Ser Arg Thr Val Ala Thr Leu Pro Leu Thr Leu Phe Val

130 135 140

Ile Gly Tyr Ala Val Gly Pro Met Ile Phe Ser Pro Met Ser Glu His

145 150 155 160

Pro Ala Ile Gly Arg Thr Thr Ile Tyr Val Trp Thr Leu Phe Ile Phe

165 170 175

Ala Ile Leu Gln Ile Pro Thr Ala Leu Thr Thr Asn Ile Ala Gly Phe

180 185 190

Cys Ile Leu Arg Phe Ile Gly Gly Phe Phe Ala Ser Pro Ala Leu Ala

195 200 205

Thr Gly Pro Ala Ser Val Gly Asp Val Ile Ala Ile Pro His Leu Pro

210 215 220

Val Gly Leu Gly Leu Trp Ser Ile Cys Ala Val Cys Gly Pro Ser Leu

225 230 235 240

Gly Pro Leu Phe Gly Ala Ile Phe Ser Gln Leu Val Ser Trp Arg Trp

245 250 255

Cys Phe Trp Phe Leu Leu Ile Thr Ser Gly Thr Leu Phe Ile Val Leu

260 265 270

Gly Phe Thr Leu Pro Glu Thr Tyr Val Pro Thr Leu Leu Tyr Arg Lys

275 280 285

Ala Arg Arg Leu Arg Ala Leu Thr Lys Asn Glu Leu Ile Ile Ser Lys

290 295 300

Gly Glu Leu Asp Ile Gln Asp Arg Thr Ala Lys Glu Val Leu Ile Glu

305 310 315 320

Cys Leu Trp Arg Pro Val Asp Ile Ser Phe Arg Asp Pro Val Val Leu

325 330 335

Met Ile Asn Leu Tyr Ile Ser Met Val Tyr Ser Ile Trp Tyr Ile Trp

340 345 350

Phe Glu Ala Phe Pro Ile Val Phe Leu Glu Ile Tyr Gly Phe Ser Leu

355 360 365

Ile Gly Met Gly Ala Ser Phe Ala Gly Ile Leu Ile Gly Val Leu Ile

370 375 380

Cys Ser Ala Cys Tyr Cys Tyr Ala Cys His Val Thr Phe Ala Arg Arg

385 390 395 400

Ile Ile Ala Asn Glu Thr Ile His Pro Glu Phe Phe Val Pro Gly Ala

405 410 415

Ile Ile Gly Gly Cys Ile Met Pro Thr Gly Ile Phe Ile Leu Gly Trp

420 425 430

Thr Ala Thr Lys Ser Val His Trp Ile Val Pro Ile Ile Gly Ser Gly

435 440 445

Leu Phe Ala Ala Gly Gly Tyr Leu Ile Phe Gln Thr Leu Phe Asn Tyr

450 455 460

Leu Ala Met Ser Phe Pro Arg Tyr Met Ala Ser Ala Phe Ala Gly Asn

465 470 475 480

Asp Leu Phe Arg Ser Phe Ser Ala Ser Val Phe Pro Leu Phe Gly His

485 490 495

Ala Leu Tyr Ala Asn Leu Gly Ser Glu Lys Phe Pro Val Gly Trp Gly

500 505 510

Ser Ser Val Leu Gly Phe Ile Thr Val Ala Met Ile Ala Ile Pro Val

515 520 525

Thr Phe Met Arg Tyr Gly Pro Arg Leu Arg Ala Asn Ser Arg Tyr Ala

530 535 540

Gly Pro

545

<210> 8

<211> 355

<212> PRT

<213> 巴斯德毕赤酵母

<400> 8

Met Thr Asp Tyr Val Thr Ser Lys Arg Pro Asp Asn Val Leu Asn Trp

1 5 10 15

Thr Ser Ile His Val Ser Ser Trp Ile Gly Glu Thr Ile Pro Glu Ile

20 25 30

Asp Pro Ser Leu Leu Gln Asn Phe Leu Glu His Asp Ile Ala Gly Asp

35 40 45

Val Leu Pro Tyr Leu Lys Ser Glu Asp Leu Lys Glu Ile Gly Ile Asn

50 55 60

Glu Leu Lys His Arg Ile Ser Ile Lys Lys Asn Ile His Glu Leu Leu

65 70 75 80

Val Ser Asn Glu Lys His Ile Asp Thr Ser Ile Leu Ser Asp Thr Ala

85 90 95

Thr Glu Leu Gly Thr Leu Ile Leu Thr Asn Lys Phe Ile Thr Gln Met

100 105 110

Ala Asn Arg Lys Asn Val Val Asp Asp Ser Thr His His Ser Asn Asn

115 120 125

Arg Arg Leu Thr Glu Gln Phe Asn Lys Leu Arg Lys Asp Leu Leu Pro

130 135 140

Ile Phe Lys Trp Ile Lys Glu Thr Gln Pro Leu Pro Thr Pro Glu Asn

145 150 155 160

Thr His Phe Ala Asn Met Gly Ser Val Pro Ala Ser Pro Val Glu His

165 170 175

Thr Ser Gly Glu Ser Thr Leu Ser Asn Pro Ser Leu Ser Thr Ile Asn

180 185 190

Ala Gly Glu Gly Val Asn Ser Ala Val Ala Gly Gln Ser Leu Gly Arg

195 200 205

Lys Pro Thr Leu Ser Ser Arg Arg Gln Ser His Ala Leu Ser Pro Thr

210 215 220

Gly Glu His Leu Asn Val Ser Ser Ser Ser Pro Ser Thr Gly Asn Phe

225 230 235 240

Glu Thr Leu Asn Gly Glu Arg Pro Asn Leu Arg Ser Ala Ser Ser Gly

245 250 255

Ser Gln Glu His Thr Glu Asn Glu Leu Leu Lys Pro Leu Arg Val Lys

260 265 270

Ala Asp Glu Pro Cys Tyr Lys Val Ile Gln Asn Ala Met Lys Arg His

275 280 285

Gly Leu Ser Val Asp Asp Trp Arg Lys Tyr Ala Leu Val Ile Cys Tyr

290 295 300

Gly Asp Glu Glu Arg Val Leu Gly Leu His Glu Lys Pro Gly Ser Ile

305 310 315 320

Phe Lys Glu Leu Lys Asp Gln Lys Gln Asn Pro Ala Ile Met Leu Arg

325 330 335

Gln Ile Asp Thr Asn Asn Asp Asp Gln Asn His Ile Glu Thr Pro Gly

340 345 350

Gly Arg Leu

355

<210> 9

<211> 194

<212> PRT

<213> 巴斯德毕赤酵母

<400> 9

Met Arg Phe Ser Asn Val Val Leu Thr Ala Ile Ala Ala Ala Gly Val

1 5 10 15

Gln Ala Asp Glu Ala Leu Tyr Thr Val Phe Tyr Asn Asp Val Thr Glu

20 25 30

Asn Ala Gln Glu Tyr Leu Ser Tyr Ile Gln Ala Asn Thr Ala Ala Gly

35 40 45

Phe Thr Asp Leu Leu Ser Leu Tyr Thr Glu Leu Ala Thr Tyr Thr Asp

50 55 60

Asp Ser Tyr Thr Ser Ile Phe Thr Glu Glu Asp Phe Pro Ala Ser Glu

65 70 75 80

Leu Ser Ser Phe Val Val Asn Leu Pro Trp Tyr Ser Ser Arg Ile Glu

85 90 95

Pro Gln Val Ala Ala Ala Glu Thr Gly Glu Ser Glu Glu Glu Ser Glu

100 105 110

Thr Gly Glu Ser Glu Glu Glu Ser Glu Thr Gly Glu Glu Thr Glu Thr

115 120 125

Glu Thr Gly Ser Glu Ser Glu Ser Glu Ser Glu Ser Glu Thr Ser Ala

130 135 140

Thr Gly Thr Gly Thr Gly Thr Ser Ala Ser Glu Ser Ala Glu Thr Glu

145 150 155 160

Thr Ser Thr Asp Ala Ala Val Ser Ile Asp His Pro Lys Ser Thr Leu

165 170 175

Leu Met Gly Leu Thr Ala Ala Val Val Ser Ile Thr Phe Gly Val Phe

180 185 190

Ala Leu

<210> 10

<211> 806

<212> PRT

<213> 巴斯德毕赤酵母

<400> 10

Met Asn Lys Pro Asn Gly Ser Glu Gln Gln Pro Pro Ser Arg Gly Met

1 5 10 15

Lys Gln Glu Ser Gly Gly Pro Val Thr Ser Ser Thr Thr Pro Gly Thr

20 25 30

Asn Thr Gly Leu Glu Asn Ser His Ser Met Gly Ala Asp Met Glu Pro

35 40 45

Asp Val Gly Ala Thr Ser Pro Arg His Leu Leu Asn Gly Tyr Ile Tyr

50 55 60

Asp Tyr Leu Val Lys Ser Asn Met Gln Asn Leu Ala Asp Gln Phe Ala

65 70 75 80

Gln Glu Thr Glu Leu Leu Glu Thr Asp Leu Thr Val Pro Met Asp Thr

85 90 95

Pro Ser Gly Tyr Leu Leu Glu Trp Trp Met Val Phe Trp Asp Leu Phe

100 105 110

Asn Ala Arg Leu Lys Gln Arg Gly Ser Gln Lys Ala His Gln Tyr Ile

115 120 125

Gln Leu Asn Met Leu Arg Gln Gln Gln Gln Arg Thr Met Arg Asn Thr

130 135 140

Ala Arg Val Gln Lys Val Pro Leu Arg Pro His Thr Gln Ser Ser Pro

145 150 155 160

Ser Met Ser Gln Thr Phe Ile Pro Gln Gln Pro Gln Gln Gln Ala Gln

165 170 175

Gly Gln Gln His Ala Gln Ala Gln Ala Gln Val Gln Ala His Gln Gln

180 185 190

Ala Gln His His Ala Gln Ala Gln Val Pro Val Gln Pro Gln Gln His

195 200 205

Gln Leu Gly Gly Gln Thr Gln Gln Gln Gln Ser Ile Asn Thr Gly Ser

210 215 220

Pro Ala Gly Pro Asn Ala Ile Asn Ser Arg Val Gln His Leu Ala Gln

225 230 235 240

Gln Gln Met Asn His Leu Arg Gln Gln Ala Thr Ala Thr Thr Gln Gln

245 250 255

Pro Ile Pro Gln Gln Asn Ile Pro Ser Asn Gln Gln Gly Pro Thr Gly

260 265 270

Pro Tyr Pro Thr Ser Pro Ser Arg Arg Pro Arg Leu Leu Ser Asn Glu

275 280 285

Ser Gly Ala Ser Ala Pro Ser Val Met Thr Lys Ser Gln Leu Gln Gly

290 295 300

Val Pro Pro Ser Gln Gln Pro His Gln Gln Gln Gly Gln Gln Val Gly

305 310 315 320

Pro Pro Asn Gln His Gln Gly Gln Ser Ser Ser Phe Tyr Ser Gly Met

325 330 335

Pro Pro Gln Gly Val Val Val Pro His Gln Phe Asn Pro Gln Gln Tyr

340 345 350

Ala Asn Met Leu Ala Arg Gln Gln His Val Gln Ala Gln Gln Gln Val

355 360 365

Gln Leu Gln Gln Val Gln His Val Gln Gln Arg Gln Gln Gln Asp Gln

370 375 380

Gln Gln His Arg Leu Ser Ala Gly Ser Pro Gly His Pro Ser Phe Gly

385 390 395 400

Val Phe Gln Gln Pro Pro Pro Met Ser Asn His Asn Gln Val Met Ile

405 410 415

Asn Gln Gln Gly Glu Thr Phe Phe Asp Pro His Ser Pro Tyr Ala Gln

420 425 430

Pro Asn Gly Tyr Pro Gln Pro Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln

435 440 445

Gln Gln Gln Gln Gln Gln Pro Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln

450 455 460

Gln Lys Gln Gln Pro Pro Pro Pro Pro Arg Gln Pro Gln Arg Gln Gln

465 470 475 480

Ala Met Ala Met Ala Pro Leu Pro His Ser Thr Ser Ala Ala Gly Thr

485 490 495

Pro His Ser Ser Thr Thr Pro Arg Phe Ser Gln Pro Gly Pro Val Tyr

500 505 510

Gln Gln Pro Leu Pro Ala Ser Gln Pro Gln His Ser Pro Pro Ser Ser

515 520 525

Ile Gln Gln Pro Glu Leu Val Pro Thr Pro Gly Ser Gln His Gln Gln

530 535 540

Ile Ala Gln Pro Gln Ser Gln Ser Gln His Gln Gln Ser Gln Gln Ser

545 550 555 560

Gln Ser Ser Ala Ser Lys Ile Val Gly Ile Gln Glu Tyr Gln Lys Glu

565 570 575

Leu Met Met Leu Glu Lys Gln Asn Lys Gln Arg His Asp Met Ala Cys

580 585 590

Lys Lys Gly Ser Gly His Phe Ser Asn Phe Asp Pro Ile Pro Glu His

595 600 605

Thr Pro Pro Glu Pro Lys Phe Asn Val Asn Val Met Leu Pro Pro Gln

610 615 620

Asn Ser Ala Val Val Thr Lys Asn Thr Pro Gly Thr Ser Pro Gly Thr

625 630 635 640

Gln Thr Gln Asn Thr Ala His Ser Thr Gly Asn Thr Ser Ala Gly Ser

645 650 655

Thr Pro Asn Asn Val Ala Pro Val Arg Lys Lys Lys Glu Pro Ala Lys

660 665 670

Lys Lys Ala Lys Lys Ala Thr Glu Pro Pro Thr Pro Thr Thr Pro Gln

675 680 685

Thr Pro Ile Ala Ala Arg Thr His Gln Asn Ser Thr Gly Gly Ile Pro

690 695 700

Gly Asn Asn Ala Ala Thr Lys Arg Arg Lys Arg Glu Pro Leu Val Asp

705 710 715 720

Gln Thr Val Ser Pro Asn Leu Asn Glu Ala Ser Lys Ser Thr Lys Thr

725 730 735

Gly Lys Ile Ser Ser Gln Thr Asp Phe Thr Gly Ser Asp Asn Gly Phe

740 745 750

Leu Gln Asp Phe Gly Asp Gly Thr Gly Pro Pro Thr Gly Thr Asp Asp

755 760 765

Met Glu Phe Asp Phe Asn Ser Phe Leu Asn Asn Glu Thr Gly Glu Pro

770 775 780

Asn Ser Ser Thr Ile His Phe Asp Asn Val Phe Asn Trp Gly Glu Gly

785 790 795 800

Thr Glu Ala Gly Asp Leu

805

<210> 11

<211> 149

<212> PRT

<213> 巴斯德毕赤酵母

<400> 11

Met Val Val His Asn Pro Asn Asn Trp His Trp Val Asp Lys Asn Cys

1 5 10 15

Leu Pro Trp Ala Lys Ser Tyr Phe Gln Glu Val Leu Pro Asn Thr Thr

20 25 30

Gln Lys Asn Asp Ala Tyr Glu Ile Val Val Thr Ser Val Asp Leu Val

35 40 45

Asp Gly Asp Cys Asp Val Thr Gln Arg Lys Gly Val Thr Lys Cys Ile

50 55 60

Phe Asp Leu Lys Ile Gln Val Ser Ala Thr Val Lys Val Asn Thr Asn

65 70 75 80

Ser Glu Val Glu Glu Ile Ser Tyr Thr Val Thr Leu Pro Glu Leu Val

85 90 95

His Asp Gln Asp Glu Asp Glu Tyr Glu Tyr Val Ile Glu Gly Asn Leu

100 105 110

Asp His Lys Ser Gln Ile Arg Lys Leu Leu Thr Pro Leu Leu Thr Glu

115 120 125

Lys Leu Ser Lys Phe Gln Gln Ala Leu Ile Asp Ala His Thr Gln Asp

130 135 140

Val Gln His Ser Thr

145

<210> 12

<211> 354

<212> PRT

<213> 巴斯德毕赤酵母

<400> 12

Met Lys Ile Trp Leu Val Leu Leu Leu Val Phe Ala Thr Val Phe Ala

1 5 10 15

Glu Thr Asp Tyr Tyr Lys Val Leu Gly Val Ala Lys Asn Ala Asp Glu

20 25 30

Lys Asp Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Ser Leu Ser Lys Lys Phe His Pro

35 40 45

Asp Lys Asn Pro Gly Asp Asp Glu Ala Ala Gln Lys Phe Ile Gln Val

50 55 60

Gly Glu Ala Tyr Asp Val Leu Gly Asp Pro Glu Lys Arg Gln Arg Tyr

65 70 75 80

Asp Arg Phe Gly Ala Glu Gly Leu Asp Ser Arg Gln Glu Gln Phe His

85 90 95

Asp Pro Phe Asp Met Phe Gln Gln Phe Phe Gly Gly Gly Gly Gln Gln

100 105 110

His Arg Gly Lys Pro Lys Gly Lys Ser Ser Leu Leu His Leu Glu Phe

115 120 125

Ser Leu Gln Asp Phe Tyr Asn Gly Ala Ser Asn Asp Phe Arg Ile Glu

130 135 140

Met Gln Asn Ile Cys Glu Thr Cys Ser Gly Ser Gly Ser Gln Asp Gly

145 150 155 160

Lys Val His Gln Cys Asp Thr Cys Lys Gly His Gly Arg Val Val Gln

165 170 175

Thr Arg Gln Phe Gly Gly Gly Met Gln Gln Arg Phe Glu Thr Ile Cys

180 185 190

Pro Lys Cys Ser Gly Thr Gly Asn Leu Ile Thr His Lys Cys Lys Lys

195 200 205

Cys Gln Gly Asn Arg Val Val Arg Gly Pro Arg Ile His Asn Val His

210 215 220

Leu Gly Ala Gly Thr Ser Arg Asn His Val Glu Ile Leu Glu Gly Gln

225 230 235 240

Gly Asp Gln Ser Pro Asp Trp Ile Ala Gly Asp Leu Gln Ile Met Phe

245 250 255

Lys Glu Lys Ala Glu Gly Asn Met Gly Tyr Arg Arg Ile Gly Asn Asn

260 265 270

Leu Tyr Arg Asp Glu Ala Leu Thr Leu Lys Glu Ala Leu His Gly Gly

275 280 285

Trp Glu Arg Gln Ile Ala Phe Leu Asp Lys Ile Glu Asn Thr Ile Thr

290 295 300

Leu Ser Lys Lys Lys Gly Glu Val Val Val Asp Gly Gln Val Asp Thr

305 310 315 320

Ile Lys Gly Arg Gly Met Pro Leu His Asp His Tyr Asp Glu His Gly

325 330 335

Asp Leu Phe Ile Lys Tyr His Ile Ile Tyr Pro Gln Gln Ile Arg Asp

340 345 350

Glu Leu

<210> 13

<211> 288

<212> DNA

<213> 巴斯德毕赤酵母

<400> 13

atgttaaaca agctgttcat tgcaatactc atagtcatca ctgctgtcat aggcgagacg 60

actacgtcat ctaccactgc cagtctctcc gaaagcccta ctctggtttg ggtgactggc 120

actgatgcaa gtgggagatt ggcaactaca cagtctgctt acactcaaca gttttcacag 180

ttatactcat ccatagcatc tccatcaagt ggtagcatag gcctgggtac tatccagggg 240

actgttggaa ttgtcagaac atatgagaca attacccttg ccagctaa 288

<210> 14

<211> 261

<212> DNA

<213> 巴斯德毕赤酵母

<400> 14

atgtctacag caattccagg aggacagaga acgttagcta aaagaagagc agcaaacttg 60

gataagaaac aggatgaacc aacctccgcc agatctgccg gtgctggagg ttcttcgtct 120

accatgctaa agttgtacac agacgaggcc caaggtttga aagttgatcc tttaattgtt 180

cttgttcttg ctgttggttt cattttcagt gtcattggtt tgcacgttgt tgctaagctg 240

acaggaaagt tgatcaacta a 261

<210> 15

<211> 1086

<212> DNA

<213> 巴斯德毕赤酵母

<400> 15

atgactcccc gttctcatat tttctttgac atctccatca acaaccagcc agctggcaga 60

ataatctttg agctcttcaa tgacattgtt cctaagacag cagagaattt tagagcttta 120

tctactggtg agaaaggtat aggtaagtct gggaaaccat tgcactacaa gggttctact 180

ttccatagga tcattaagga ttttatggta caaggtggtg actttaccaa cggtaacggt 240

actggaggcg aatccatata tggagaaaaa tttgaagatg aaaatttcca attgactcat 300

gacaaaccgt tccttctctc tatggcaaac gctggaccag gaactaatgg atcccagttt 360

tttatcacca ccgttcctac tcctcatctg gataacaagc atgtagtgtt tggaaaagta 420

attgctggta aagccacagt tagaaagatt gaaagaaact ccgaaggtga agctccaatt 480

gaacccgttg tcattgagga ctgtggtgaa cttccagaag acgcagattt gaccatctcc 540

gacgagactg gagacaagta tgaggaagtt ctgaaagata atgagaacat agacatcgat 600

gactttgaac aggtctacca ggccatcact gaaatcaaag aattgggtac aaagtatttc 660

aaaaatggtg acaccaaaat cgccttcgaa aagtatcaaa aggctgctaa ttatttgctg 720

gaatacatac catcagattt atcagaggaa cagagctcta agttggagct gctaaaaaca 780

tctgtcttct ccaacgtggc attggctgga ctgaaagttt ccaagttcaa agacacgatt 840

aagtatgcca cattggtcat tgaggatgaa tctgcggatg caaaggccaa gtccaaaggc 900

tactaccgta gaggaagtgc ttacagctca ctgaaagacg aagattcagc catctcagat 960

ttccagaaag cacttgaatt atccccaggt gatcctgcaa ttagccaatc tctacaaaga 1020

accacgaagg ccagaaaaga ccgtcttgcc aaagagaaag ctgctttgtc taagttcttt 1080

gagtag 1086

<210> 16

<211> 825

<212> DNA

<213> 巴斯德毕赤酵母

<400> 16

atgtcgtctg atgctgtgga gcaacttgaa aacttccagt tgatcaagtt cgacagattc 60

gatccttcaa cgcaatcgac tatcagaata gcgcgatctc ccaaaccaat tccagtcaag 120

gttgtgatag tgggagatgg tggatgtgga aagacatgtc ttctcaatgt ctttgccact 180

ggaacgtttc ctgaggcgta tgtccccaca atcatagaaa atgtggttat tacattggtg 240

accccaactg gccagatagc tgccgttact ctgtgggata ctgcagggca agaagagtac 300

gacagattga gacccctaag ctactccgac gttgacgtgg tcttgctgtg ctacagcata 360

gacaatctgt ccacctttca taatgtggcc gacaaatggt acccagaagt ggcacatttt 420

tgtccaaaca caccgatcat cttggtaggt accaaatctg atatgcggcg tcatcagaag 480

agtcagccgc actttgtatc tccccaggat tcgtcgcagt tggcaaggca gatgggggca 540

gtgatgaaca tcgagtgttc tgcgaaggag gtttcaaacg tcaatatcgt ttttgatgct 600

gctgtgtcgt actgtttgag taacagcagg cccaagacca gaggggataa tgacaacaat 660

aggagtaaca gacggctaag tagagccaag cgagccagca tgtttataag gggtaaggat 720

gttagctcaa cgtcaggaaa ctctcgggaa gaacttgttg aatacgatca agatgggttg 780

gcaataatac cggacagaaa gaaacgcaaa tgtagcatta tttga 825

<210> 17

<211> 384

<212> DNA

<213> 巴斯德毕赤酵母

<400> 17

atgactaact ggaaagcgat attgactccc gctcaatacc aagtcctccg tttgggcgga 60

acagaaagac cgtataccgg acagtatgtg aacttcaaga aaaatggaac ctacttgtgt 120

agtgggtgtc aaactccgct ttacaaaagt ggcacaaaat ttgattcatc ttgtggttgg 180

cctgcattct atgaagcatt acctggagca gttaaacgaa tagaagacaa ttcgcttgga 240

atgcgaagaa tagaaatcag atgctccaaa tgtgatggac atcttggcca tgtttttgag 300

ggtgagggat ttgacactcc aacagattcc agacattgtg tcaacagcat cagcctaaaa 360

tttcaaggtg aagaagagaa ctaa 384

<210> 18

<211> 3084

<212> DNA

<213> 巴斯德毕赤酵母

<400> 18

atgactacaa acggccagaa aagacaaaaa actcgcaaac cacttttgat caacgcattt 60

gtcatgggat gtgctgggtt acagaatcct ggtttatgga agcatcccaa ggactcatcc 120

catagattta atcagattga tcactggact tatttggcca agttagccga aaaggggaag 180

tttaatgcgc tcttcattgc cgacgtcttg ggtggctatg atgtctacaa aggacctgag 240

aatttagcca ctcctgctgt ggctggagcc cagtggcctg tcaccgagcc cagtgctgtg 300

gtctccgcca tggctgcagt cacaactaac ttggcgtttg gagtgacgtt ctctactatc 360

agcgaagccc cctatcattt tgccagaaga ctgtccactt tagaccactt gaccaagggt 420

agaataggat ggaatgttgt ttcatcttac ttggagagtg ctgctcgtaa cctcttgaat 480

ggtgaaaaat tggacgagca tgaccaaaga tacttgaaag ctgaagagta cattcaaata 540

gtttatgagc tgttgttatc gtcttggaga gatgatgcag tagttttaga caagaaagct 600

ggtgtttata ctgacccaac aagatttcga aagatcaact ttgaaggtaa atttttcaaa 660

gttccgggac cacatattgt tgaccccacc cctcaaagac tgcctgtgat tcttcaagct 720

ggtacttcta aagttggtaa ggagtttgct gctaagcatg ccgagattgt gtttgtcatt 780

tcattttctc cagatgattt gaaacccaag attgcagaag ttcgtcaact ggccaaagaa 840

aagtttggta gaaaccacga cgatattaag tttgttgccc ttgcaacccc tgttattgga 900

gccacacatg aactagctga agaaaagtac caagagttac taagttatgg tgatattgaa 960

ggtgctcaag ccttatttgg agggtggact ggcattgacc tctctcaata tggcgaagat 1020

gaagaactag gaaatgttag ttccaatgct atgcgtggcg ctgtacaaaa ctggactaaa 1080

gcaattccaa atgagaagcg ttggacacgt aaggttattg ctaaacagat taccgttggt 1140

ggtctaggtc cagctttcgt tggaacccca gaagaaatcg ccgatgagct ggaacactgg 1200

tccgaccacg ctggtttgga cggattcaac ttcacttatg ctgtcaaccc gctttctttc 1260

gaagagatag tggaagactt gattccagtt cttcagcgaa gagggttggc ccaaaaggaa 1320

tacccaaatc cagaaactgg aagcacattc cgtaaaaacc tttttggaac agactttgta 1380

ccatctaccc acccagctta taacttaaga tggagggctg gtgtgtccaa ggaagaattc 1440

gaaaagtccc taaacgccac aacaaattgg tattccagtt tcgctaggtc aggtgctcta 1500

ggtgaattgc ataatacatg caggattctc tatctccaaa tagtgaaata taaatatagg 1560

cttcgagtcc gttcagaagg gaatagcatc cccttcgcca aaatgaccaa ggaaaatgaa 1620

gccaagaggc agaaaacctc tcaaccaaaa gcgaagaagc aattgattat caatgctttc 1680

atgtcaggct cttcgggtaa ccaatcgcca ggactgtggt cgtaccctgg agacaaatca 1740

acagagtata ctaccctaga ttactgggtg gagttagctc aaaagctgga aaaggccaaa 1800

ttccattcta tcttcattgc cgatgttctg ggtggatatg acgtttacaa tggacctgga 1860

aactacagtg ctgctgcaaa atctggtgcc caatttccaa tgattgaacc aagtgctgca 1920

gttactgcca tggctgctgc taccaagtca ataacgttcg gagtgacttt ttccactata 1980

agtgaggcac cttatcattt tgcaagaaga ttgggaactt tagatctgct gacaaacgga 2040

agagtcggct ggaatatcgt ctcttcgtat cttgacagtg ccgccagaaa tcttttgaat 2100

ggagaaccac tccctctcca tgcagaccgt tataagagag ccgaagaatt cctacaagtt 2160

gtatatcggt tattcctttc ttcatggaga gacgatgctt ataaattgga taagaaaacc 2220

agaacctttg ctgacccaaa acttattaga actatcgacc acgttggaga gttcttcaat 2280

gtcccaggcc cccagttcct accacccact cctcagagac taccgctgat tttgcaggct 2340

ggtacttcca aggttggtat ggattatgct gcaaaacatg cagaggttgt ctttttagct 2400

tcatttgacc cagagtcact ccaagaaaaa atcaaaacag tgagagatat cgctgaaacc 2460

aagtacaaca gaccaagaga ttcaatcaaa ttcttaattt tgataacagt agtcatagct 2520

gatacacacg aagatgccgt gaagagatac gaagatctcg ccagttatgc tgatctggaa 2580

ggggcccaag cactgttcag tggttggact ggaatagata ttggaaagta tggtgaagat 2640

gaacctcttg agcatgtgga atctaacgct attaagagcc atgttaagaa ctggactaag 2700

ttcaaggaca ataagcctag agccagaaaa gatatcgcta aacagattgg agttggaggc 2760

tcaggtccct tacttgttgg atctgtacaa gagatagccg acgagcttga gagatgggca 2820

gaagtctctg acctcgatgg ctttaacttc gcttacgcag attaccccca aacttttgat 2880

gatatcattg aaaaactgct tccagagttg aacaagagag gtgtgttctg ggatgattat 2940

aaaattccag gtggaacctt cagagagagc gtgtttggaa gaaagttcgt tgataaggat 3000

catcctgctt atgatctgag atggagaagt gaccaaacta gggaggagtt tgaaaagaaa 3060

ctggctgaat tggagaaaaa ataa 3084

<210> 19

<211> 1641

<212> DNA

<213> 巴斯德毕赤酵母

<400> 19

atgtctcatc tattactgcg tgacagcttt tggggaagga ccatctacca tctgagtaaa 60

cacaggtatt tctcttttcc tgaagagaaa gatggtttca ttgctcctga aaagtactac 120

ctgaatatgg accaagtatc gatacatgct gaatctgaga aaaatatagt ggaaggtttg 180

gtagacactt caaattcttc gttggaggaa gtaaagacca ctagagtcat agtcgactgg 240

gatgaatatg atcagaaaga aaatccccaa aactggagct cgcttttaaa gtgcttcgtt 300

gtttttgaag tgggaatctt aaccgtagct gtttatatgg gatctgcaat ttacactccc 360

ggtatagaag atattatgag agatctcaat gttagcagaa cggtggcaac acttccatta 420

accttgtttg tgattggata cgctgtgggt ccaatgatat tctcccccat gtctgagcat 480

cccgctatcg gaaggacaac gatatatgtg tggaccctgt tcatatttgc tatactacaa 540

atcccaacgg ccctgaccac taacattgct ggattttgca ttttgaggtt tattggaggg 600

ttttttgcgt caccagcatt agctacaggt ccagcttctg taggtgatgt tattgcaatc 660

ccgcacttgc ctgtagggtt aggcctttgg agtatctgtg ctgtttgtgg tccttctcta 720

ggaccacttt ttggagccat attttcccaa cttgtgagtt ggaggtggtg cttctggttt 780

ctgttaatta cctctgggac actatttata gttcttggct tcactttacc agaaacgtat 840

gtaccaaccc ttctttacag aaaggctagg aggctacgag cattaacaaa aaacgaactg 900

attatcagca aaggggagtt agatattcag gacagaactg ccaaggaagt tttgattgaa 960

tgcttatgga ggccagtcga catatcattc agagaccccg ttgtcttgat gataaatctt 1020

tacatttcaa tggtttattc tatttggtac atttggtttg aagcgtttcc tattgtattc 1080

ttagagatat atggattcag ccttattgga atgggagcta gttttgccgg aatcttaatt 1140

ggtgtcttaa tatgctctgc gtgctattgc tatgcgtgtc atgttacttt tgcaagaaga 1200

ataattgcaa acgaaaccat tcatcctgag ttctttgtac cgggcgctat tattggaggt 1260

tgcataatgc ccactggaat ctttattttg ggatggactg ccaccaaaag tgtccactgg 1320

attgtaccta taataggtag cggtttattt gctgctggtg gttatctcat tttccagaca 1380

ctcttcaact accttgcaat gtctttccct agatacatgg catcagcttt tgccggaaat 1440

gatcttttca ggtccttttc tgccagtgtt ttcccactgt ttggacatgc actatatgcc 1500

aacttgggat ccgaaaagtt ccctgttggt tggggttctt ctgtactggg gttcatcact 1560

gttgcaatga tcgcaattcc agtaactttc atgagatatg gtccaagatt gcgtgcaaat 1620

tctagatatg ccgggccatg a 1641

<210> 20

<211> 1068

<212> DNA

<213> 巴斯德毕赤酵母

<400> 20

atgacggact atgtcacttc taagcggcca gataacgtgc tcaattggac aagtattcat 60

gtatcgtcct ggatagggga gactattcct gagatcgatc caagtctact ccaaaatttt 120

ttagaacatg acattgcggg agatgttcta ccctacttga agtctgaaga tctgaaggaa 180

attgggatca acgagctcaa gcacagaatc tctataaaaa agaacattca tgaacttctt 240

gtgagcaatg aaaagcacat tgataccagt attctatcag acaccgctac cgagctagga 300

actttgatac tgactaataa attcataacc cagatggcga acagaaagaa tgttgtagat 360

gattccactc atcattcgaa taacagaagg ctcactgaac agtttaataa gcttcgcaaa 420

gatcttttgc cgatattcaa atggatcaag gagacccaac cattacccac tccagagaat 480

acacatttcg caaatatggg ttcagtacca gcatctcctg tggagcatac ttcaggtgag 540

tcaacattgt ctaaccccag tctaagcacc atcaatgctg gcgaaggagt gaactctgca 600

gttgcagggc aatctctcgg gaggaaacct acattatcct ccagaagaca atcacatgct 660

ttgtctccaa ctggtgaaca cctgaatgtg tcatcatcat ctccttcgac ggggaatttt 720

gaaactctga atggagaaag acccaatctt agatctgctt cgtcaggatc acaggaacat 780

actgagaacg aactattgaa gccgttgaga gttaaagcag atgagccttg ctataaggtg 840

attcagaatg ccatgaaaag acatggctta tcggtagatg attggcgcaa gtatgctttg 900

gtcatctgct atggagatga agaacgagta ctaggcttac atgaaaaacc tgggagtatc 960

ttcaaggaac tcaaagatca gaaacagaat cctgcaatca tgcttcgtca aattgacact 1020

aataatgacg atcagaacca tattgaaacc cctggaggga gattatga 1068

<210> 21

<211> 585

<212> DNA

<213> 巴斯德毕赤酵母

<400> 21

atgagatttt ctaacgtcgt tttaactgca attgccgctg ccggcgtaca ggcagatgaa 60

gccctttaca ctgtgttcta caatgatgtc actgagaacg cccaagagta tctgtcttac 120

atccaggcca atactgcggc tggtttcact gacctcttga gtctgtacac tgaactggcc 180

acttacaccg acgattctta cacaagtatc tttactgagg aggatttccc tgcgagcgaa 240

ctttcatcgt tcgttgttaa cctgccatgg tattcctcca gaattgagcc acaagttgcg 300

gctgctgaaa ctggtgaaag tgaggaggaa tcagagactg gtgaaagtga ggaagaatca 360

gagactggtg aggagacaga aactgagact ggatctgagt ctgaatctga gtctgaatcg 420

gagacctccg ctactggcac tggcactggc acctccgcct ctgagagcgc ggagactgaa 480

acttctaccg acgctgctgt gtctatcgat cacccaaagt ccaccttatt gatgggtttg 540

actgccgcag ttgtcagtat cactttcgga gtctttgcct tgtaa 585

<210> 22

<211> 2421

<212> DNA

<213> 巴斯德毕赤酵母

<400> 22

atgaacaagc caaacgggtc tgaacaacaa ccaccgtcac gcggaatgaa gcaagagtca 60

ggaggcccag ttacttcatc tacgacgccg ggtaccaata ctggcctaga aaactctcat 120

tccatggggg cggatatgga gcctgatgtt ggtgctacct ctcctcgcca tcttcttaat 180

gggtacattt acgattattt agtcaaatct aacatgcaaa atttggctga tcaatttgcc 240

caagagacgg agctcttaga aacagacttg acagtaccaa tggatacgcc ttcaggctat 300

cttctagaat ggtggatggt attctgggac cttttcaatg cccgcctaaa gcaacggggt 360

tcacagaagg cccaccagta tattcagttg aacatgctac gacaacagca acagaggacc 420

atgcgaaata cagcccgtgt tcaaaaagtc ccgttgaggc cacacaccca atcatctcct 480

tcaatgtcac agacttttat tccacagcag cctcaacagc aagcacaggg acaacagcac 540

gcccaggctc aagcccaagt gcaagcacat cagcaagccc aacaccacgc gcaggcacaa 600

gtgccagtgc aaccgcaaca gcaccagcta ggaggccaaa ctcaacagca gcaatccatt 660

aacactgggt ctcctgcggg tccaaatgct atcaactcgc gtgttcaaca cttagcacaa 720

caacagatga atcaccttcg ccagcaggcg actgccacta cgcaacaacc tatcccgcaa 780

cagaatatcc catcaaacca acagggtcct acaggccctt atcctacttc cccttcaaga 840

agaccgagat tactgtctaa cgaatcgggt gcaagtgcac cctctgtaat gacaaagtca 900

cagctccaag gagtccctcc ctcacaacaa ccacaccagc agcaaggtca gcaggtaggc 960

ccccctaatc aacatcaagg tcaatcttct tccttttatt cgggcatgcc tcctcaaggg 1020

gtcgtggttc ctcatcagtt caatcctcag cagtatgcca atatgctagc aagacaacag 1080

catgtacaag ctcaacaaca ggttcagtta caacaggtcc aacatgtaca acagagacaa 1140

cagcaagacc aacaacaaca ccgcctgtcc gccggttcac cggggcaccc ttcatttggc 1200

gtttttcaac aacctcctcc gatgtcaaac cataatcagg tcatgatcaa tcagcaggga 1260

gaaacttttt ttgatccaca ttctccatat gctcaaccta acgggtaccc ccagccacag 1320

caacaacaac aacaacagca acaacaacaa caacagcagc aaccgcaaca gcagcagcag 1380

cagcagcagc aacagaagca gcaaccacca ccaccaccac gacagcctca gcgccaacaa 1440

gcgatggcca tggctcctct gcctcactct acttctgccg ccggtactcc tcactcgtcc 1500

accacaccta gattctcgca acctggtcct gtttatcagc agcctttacc tgcatctcaa 1560

ccgcaacatt ctccgccttc ttctattcag cagccggagc tagttccaac tccagggtca 1620

caacatcagc aaatagcaca accacaatca cagagccaac accagcaatc gcaacagtct 1680

caatcaagtg cttctaaaat tgtaggtata caggagtatc agaaagagct aatgatgctt 1740

gagaaacaga acaaacagcg tcatgacatg gcatgtaaga agggaagcgg gcatttttct 1800

aactttgatc caattccaga gcacacaccg cccgaaccaa aatttaatgt gaatgtaatg 1860

ctccctcccc agaactctgc agtggtcacg aagaatactc ccggaacttc acctggtaca 1920

caaactcaaa acactgcaca tagtactggt aacacttctg cggggtctac accaaataat 1980

gtcgcacctg tacgaaagaa aaaggagcca gctaaaaaga aggcaaagaa agctactgag 2040

cccccgactc ccactactcc acagactcca attgcagcta ggacacatca aaactctaca 2100

ggcggcattc ctggtaataa tgctgctact aagcgacgaa aacgggagcc gctggttgat 2160

caaactgttt cacctaacct taacgaagct tccaagtcaa caaagaccgg aaaaatttca 2220

tctcaaactg actttacagg ttctgacaat ggattcttac aggattttgg cgatggaact 2280

ggtcctccca ctggaaccga tgatatggaa tttgatttta acagttttct taataacgaa 2340

actggcgaac ctaatagttc aaccattcat tttgacaatg tattcaattg gggagaaggt 2400

accgaagccg gagatttata g 2421

<210> 23

<211> 450

<212> DNA

<213> 巴斯德毕赤酵母

<400> 23

atggtggtgc acaaccctaa taactggcac tgggtcgaca agaactgcct tccttgggcc 60

aaaagctact ttcaggaagt ccttccaaac accactcaga agaatgacgc ctatgaaata 120

gtggtaacat ctgtggacct tgtagatgga gactgcgatg tcactcaacg taaaggtgtt 180

accaaatgta tttttgatct gaagatacag gtatctgcaa ccgtcaaagt caacacgaac 240

agtgaagtag aggagatcag ttatacagtg acattacctg aactggtgca cgaccaggac 300

gaggatgaat atgaatacgt aatagaggga aatttggatc acaagtctca aattagaaag 360

ctactcactc ctctgttgac cgagaagtta tcaaagtttc aacaagcttt gatagacgct 420

catactcagg atgttcagca tagtacctag 450

<210> 24

<211> 1065

<212> DNA

<213> 巴斯德毕赤酵母

<400> 24

atgaagatat ggctggtact tcttttagtt tttgccacgg tgtttgccga gacagattat 60

tataaagttc ttggagtagc taaaaatgcg gatgaaaaag atatcaagaa ggcctacaga 120

tcgttgagta agaagtttca tccagataag aacccgggtg atgatgaagc cgctcaaaag 180

ttcattcaag ttggagaagc ttatgatgtg cttggtgatc ccgagaagcg tcaaaggtat 240

gacagatttg gagcagaagg actggactca agacaggaac aattccatga tccatttgac 300

atgtttcaac agttcttcgg aggaggtgga cagcaacaca gaggcaaacc aaagggtaag 360

agttccttgt tacatttaga attcagtcta caagactttt acaatggtgc tagtaacgac 420

tttagaatcg aaatgcagaa tatctgtgaa acttgttctg gatcaggttc acaagacggg 480

aaagttcatc aatgtgacac ttgcaaaggg cacgggcgtg ttgttcaaac gagacagttt 540

ggtggtggca tgcaacagag gtttgaaaca atttgcccaa aatgttcagg aacaggaaat 600

ctgatcactc acaagtgtaa gaaatgccaa ggaaaccgtg tagttagagg acccagaatt 660

cacaatgtgc atttgggggc gggaactagt aggaaccatg ttgagatcct ggaaggtcag 720

ggagaccagt ctccagactg gattgcaggt gatctacaaa tcatgttcaa ggagaaagcc 780

gaaggcaaca tggggtatag aagaatagga aacaacctgt acagagacga agcattaacg 840

ctgaaagagg cattgcatgg tggctgggag agacaaattg cgtttttgga taaaatagag 900

aacacgatta ctctttccaa gaagaaagga gaggtggtag ttgacggcca agtagacacc 960

atcaagggta gagggatgcc attacatgac cactatgacg aacatggtga tctctttatc 1020

aagtaccata tcatttaccc gcaacaaatt agagacgaat tgtga 1065

<210> 25

<211> 312

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 25

Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser

1 5 10 15

Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln

20 25 30

Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe

35 40 45

Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu

50 55 60

Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val

65 70 75 80

Ser Leu Glu Lys Arg Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu

85 90 95

Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe

100 105 110

Thr Phe Ser His Tyr Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys

115 120 125

Gly Leu Glu Trp Val Ala Asn Ile Glu Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr

130 135 140

Tyr Val Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala

145 150 155 160

Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr

165 170 175

Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Leu Glu Gly Leu His Gly Asp Gly

180 185 190

Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

195 200 205

Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser

210 215 220

Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe

225 230 235 240

Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly

245 250 255

Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu

260 265 270

Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr

275 280 285

Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg

290 295 300

Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro

305 310

<210> 26

<211> 299

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 26

Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser

1 5 10 15

Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln

20 25 30

Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe

35 40 45

Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu

50 55 60

Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val

65 70 75 80

Ser Leu Glu Lys Arg Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu

85 90 95

Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Ile Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln

100 105 110

Gly Val Ser Ser Ala Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala

115 120 125

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro

130 135 140

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Pro Asp Phe Thr Leu Thr Ile

145 150 155 160

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Phe

165 170 175

Asn Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

180 185 190

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

195 200 205

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

210 215 220

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

225 230 235 240

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

245 250 255

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

260 265 270

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

275 280 285

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

290 295

<210> 27

<211> 939

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 27

atgagattcc catctatttt caccgctgtc ttgttcgctg cctcctctgc attggctgcc 60

cctgttaaca ctaccactga agacgagact gctcaaattc cagctgaagc agttatcggt 120

tactctgacc ttgagggtga tttcgacgtc gctgttttgc ctttctctaa ctccactaac 180

aacggtttgt tgttcattaa caccactatc gcttccattg ctgctaagga agagggtgtc 240

tctctcgaga agagagaggt ccaattggtc caatctggtg gaggattggt tcaaccaggt 300

ggatctctga gattgtcttg tgctgcttct ggtttcacct tctctcacta ctggatgtca 360

tgggttagac aagctcctgg taagggtttg gaatgggttg ctaacatcga gcaagatgga 420

tcagagaagt actacgttga ctctgttaag ggaagattca ctatttcccg tgataacgcc 480

aagaactcct tgtacctgca aatgaactcc cttagagctg aggatactgc tgtctacttc 540

tgtgctagag acttggaagg tttgcatggt gatggttact tcgacttatg gggtagaggt 600

actcttgtca ccgtttcatc tgcctctacc aaaggacctt ctgtgttccc attagctcca 660

tgttccagat ccacctccga atctactgca gctttgggtt gtttggtgaa ggactacttt 720

cctgaaccag tgactgtctc ttggaactct ggtgctttga cttctggtgt tcacaccttt 780

cctgcagttt tgcagtcatc tggtctgtac tctctgtcct cagttgtcac tgttccttcc 840

tcatctcttg gtaccaagac ctacacttgc aacgttgacc ataagccatc caataccaag 900

gttgacaaga gagttgagtc caagtatggt ccaccttaa 939

<210> 28

<211> 900

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 28

atgagattcc catctatttt caccgctgtc ttgttcgctg cctcctctgc attggctgcc 60

cctgttaaca ctaccactga agacgagact gctcaaattc cagctgaagc agttatcggt 120

tactctgacc ttgagggtga tttcgacgtc gctgttttgc ctttctctaa ctccactaac 180

aacggtttgt tgttcattaa caccactatc gcttccattg ctgctaagga agagggtgtc 240

tctctcgaga agagagctat ccagttgact caatcaccat cctctttgtc tgcttctgtt 300

ggtgatagag tcatcctgac ttgtcgtgca tctcaaggtg tttcctcagc tttagcttgg 360

taccaacaaa agccaggtaa agctccaaag ttgctgatct acgacgcttc atcccttgaa 420

tctggtgttc cttcacgttt ctctggatct ggatcaggtc ctgatttcac tctgactatc 480

tcatcccttc aaccagaaga ctttgctacc tacttctgtc aacagttcaa ctcttaccct 540

ttgacctttg gaggtggaac taagttggag atcaagagaa ctgttgctgc accatcagtg 600

ttcatctttc ctccatctga tgagcaactg aagtctggta ctgcatctgt tgtctgctta 660

ctgaacaact tctacccaag agaagctaag gtccaatgga aggttgacaa tgccttgcaa 720

tctggtaact ctcaagagtc tgttactgag caagactcta aggactctac ttactccctt 780

tcttccacct tgactttgtc taaggctgat tacgagaagc acaaggttta cgcttgtgag 840

gttactcacc aaggtttgtc ttctcctgtt accaagtctt tcaacagagg tgaatgctaa 900

<210> 29

<211> 303

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 29

Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser

1 5 10 15

Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln

20 25 30

Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe

35 40 45

Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu

50 55 60

Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val

65 70 75 80

Ser Leu Glu Lys Arg Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu

85 90 95

Val Lys Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Asp

100 105 110

Ser Ile Thr Ser Asp Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn

115 120 125

Arg Leu Glu Tyr Met Gly Tyr Val Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr

130 135 140

Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys

145 150 155 160

Asn Gln Tyr Tyr Leu Asp Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala

165 170 175

Thr Tyr Tyr Cys Ala Asn Trp Asp Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

180 185 190

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

195 200 205

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

210 215 220

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

225 230 235 240

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

245 250 255

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

260 265 270

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

275 280 285

Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

290 295 300

<210> 30

<211> 299

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 30

Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser

1 5 10 15

Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln

20 25 30

Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe

35 40 45

Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu

50 55 60

Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val

65 70 75 80

Ser Leu Glu Lys Arg Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu

85 90 95

Ser Val Thr Pro Gly Asn Ser Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln

100 105 110

Ser Ile Gly Asn Asn Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser

115 120 125

Pro Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro

130 135 140

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile

145 150 155 160

Asn Ser Val Glu Thr Glu Asp Phe Gly Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser

165 170 175

Asn Ser Trp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

180 185 190

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

195 200 205

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

210 215 220

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

225 230 235 240

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

245 250 255

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

260 265 270

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

275 280 285

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

290 295

<210> 31

<211> 915

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 31

atgagattcc catctatttt caccgctgtc ttgttcgctg cctcctctgc attggctgcc 60

cctgttaaca ctaccactga agacgagact gctcaaattc cagctgaagc agttatcggt 120

tactctgacc ttgagggtga tttcgacgtc gctgttttgc ctttctctaa ctccactaac 180

aacggtttgt tgttcattaa caccactatc gcttccattg ctgctaagga agagggtgtc 240

tctctcgaga agagagacgt tcaattgcaa gaatctggtc catccttggt taagccatcc 300

cagactttgt ccttgacttg ttccgttact ggtgactcca tcacttctga ctactggtcc 360

tggatcagaa agttcccagg taacagattg gagtacatgg gttacgtttc ttactccggt 420

tccacttact acaacccatc cttgaagtcc agaatctcca tcactagaga cacttccaag 480

aaccagtact acttggactt gaactccgtt actactgagg acactgctac ttactactgt 540

gctaactggg acggtgacta ttggggtcaa ggtactttgg ttactgtttc ctccgcttcc 600

actaagggtc catctgtttt tccattggct ccatcctcca agtctacttc aggtggtact 660

gctgctttgg gttgtttggt taaggactac ttcccagagc cagttactgt ttcttggaac 720

tccggtgctt tgacttccgg tgttcacact ttcccagctg tcttgcaatc ctccggtctg 780

tactccttgt cctccgttgt tactgttcct tcttcctcct tgggtactca aacttacatc 840

tgtaacgtta accacaagcc atccaacact aaggttgaca agagagttga gccaaagtcc 900

tgtgacaagt aatag 915

<210> 32

<211> 903

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 32

atgagattcc catctatttt caccgctgtc ttgttcgctg cctcctctgc attggctgcc 60

cctgttaaca ctaccactga agacgagact gctcaaattc cagctgaagc agttatcggt 120

tactctgacc ttgagggtga tttcgacgtc gctgttttgc ctttctctaa ctccactaac 180

aacggtttgt tgttcattaa caccactatc gcttccattg ctgctaagga agagggtgtc 240

tctctcgaga agagagacat cgttttgact caatccccag ctactttgtc cgttactcca 300

ggtaactccg tttccttgtc ctgtagagct tcccagtcca tcggtaacaa cttgcactgg 360

tatcagcaga agtctcacga gtccccaaga ctgttgatca agtacgcttc ccaatccatc 420

tccggtatcc catctagatt ctctggttct ggttccggta ctgacttcac tttgtccatc 480

aactccgttg agactgagga cttcggtatg tacttctgtc agcaatccaa ctcctggcca 540

tacacttttg gtggtggtac taagttggag atcaagagaa ctgttgctgc tccatccgtt 600

ttcatcttcc caccatctga cgagcagttg aagtctggta ctgcttccgt tgtttgtttg 660

ttgaacaact tctacccaag agaagctaag gttcagtgga aggttgacaa cgccttgcaa 720

tccggtaact cccaagagtc cgttactgaa caagactcca aggactctac ttactccttg 780

tcctccactt tgactttgtc caaggctgac tacgagaagc acaaggttta cgcttgtgag 840

gttactcacc agggtttgtc ctccccagtt actaagtcct tcaacagagg tgagtgttaa 900

tag 903

<210> 33

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 33

actacctgca ggcgaaacga tgagattccc atc 33

<210> 34

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 34

tcatggccga ggcggcccta ttacttgtca caggactttg gctc 44

<210> 35

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 35

ctatggccga ggcggcccta ttaacactca cctctgttg 39

<210> 36

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 36

tatcggccga ggcggcccta ttacttacct ggggacaag 39

<210> 37

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 37

ctatggccga ggcggcccta ttaacactca cctctgttg 39

<210> 38

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 38

cttgcctgca ggatgctaac ggccagttgg tc 32

<210> 39

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 39

gatcggccga ggcggcctca gcagtattcc caccagaatc 40

<210> 40

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 40

cttgcctgca ggatgtcagt tcatttcgtt atagcagc 38

<210> 41

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 41

gatcggccga ggcggcctca tataaaaggt ttatcataat tctcatcctc ag 52

<210> 42

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 42

gaaacctgca ggatgtctga atttgttgct aaaattaaca ttc 43

<210> 43

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 43

gatcggccga ggcggcctta ggcggttgga acgttc 36

<210> 44

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 44

gaaacctgca ggatgtctca tctattactg cgtgacagc 39

<210> 45

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 45

gatcggccga ggcggcctca tggcccggca tatctag 37

<210> 46

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 46

gacacctgca ggatgtctga atcctccagt atctctctag ttg 43

<210> 47

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 47

gatcggccga ggcggcccta gatacatccc aaaagtgcac cg 42

<210> 48

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 48

gatacctgca ggatgatcct gggttcagtt tggg 34

<210> 49

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 49

gatcggccga ggcggcccta aaagtttgct gcagcatttg aag 43

<210> 50

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 50

cttgcctgca ggatgggttg ctttagattt tgtctgg 37

<210> 51

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 51

gatcggccga ggcggcccta tttgtatacg tgctgtggag cc 42

<210> 52

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 52

cttgcctgca ggatgttaaa caagctgttc attgcaatac tc 42

<210> 53

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 53

gatcggccga ggcggcctta gctggcaagg gtaattgtct c 41

<210> 54

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 54

gacacctgca ggatggctcc tcaaacacca agg 33

<210> 55

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 55

gatcggccga ggcggcctca aaaaaacaat ctcaaaatct ccag 44

<210> 56

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 56

gtaccctgca ggatgaccaa ggaaaatgaa gcc 33

<210> 57

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 57

gatcggccga ggcggcctta ttttttctcc aattcagcca g 41

<210> 58

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 58

gaaacctgca ggatgctgtt gtcacatacc atgatacttc 40

<210> 59

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 59

gatcggccga ggcggcctta agattgcttc tttttgagat tgg 43

<210> 60

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 60

gaaacctgca ggatgacgga ctatgtcact tctaagcg 38

<210> 61

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 61

gatcggccga ggcggcctca taatctccct ccagggg 37

<210> 62

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 62

gaaacctgca ggatgtcgtc tgatgctgtg gag 33

<210> 63

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 63

gatcggccga ggcggcctca aataatgcta catttgcgtt tctttc 46

<210> 64

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 64

cttgcctgca ggatgtctta tacgtcggac aacaaagag 39

<210> 65

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 65

gatcggccga ggcggcctta cgtgtatccg cttcctctgt ac 42

<210> 66

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 66

gatacctgca ggatgaactt gtacctaatt acattactat tcgc 44

<210> 67

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 67

gatcggccga ggcggcctta gaacccacat tgatttggat actg 44

<210> 68

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 68

gaaacctgca ggatgtcgtt atcaaccttt ctaggcg 37

<210> 69

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 69

gatcggccga ggcggcctca gactctactc atcattttgt cttcctc 47

<210> 70

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 70

gaaacctgca ggatgatgta caggaactta ataattgcta ctgc 44

<210> 71

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 71

gatcggccga ggcggcccta acactctatg aggtctacaa tgtccaac 48

<210> 72

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 72

catgcctgca ggatgtctac agcaattcca ggaggac 37

<210> 73

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 73

gatcggccga ggcggcctta gttgatcaac tttcctgtca gcttag 46

<210> 74

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 74

gacacctgca ggatgagtgg tgaccataag agctttacg 39

<210> 75

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 75

gatcggccga ggcggcctta ctgtgtacca taccgatcca atcc 44

<210> 76

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 76

cttgcctgca ggatgactaa ctggaaagcg atattgactc c 41

<210> 77

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 77

gatcggccga ggcggcctta gttctcttct tcaccttgaa attttaggc 49

<210> 78

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 78

gcaacctgca ggatgtctta tcgccctcag tttcaac 37

<210> 79

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 79

gatcggccga ggcggcctca atagatcttt ttcttttcat caaaactcaa c 51

<210> 80

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 80

gatacctgca ggatggtggt gcacaaccct aataac 36

<210> 81

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 81

gatcggccga ggcggcccta ggtactatgc tgaacatcct gagtatgag 49

<210> 82

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 82

gaaacctgca ggatgagatt ttctaacgtc gttttaactg c 41

<210> 83

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 83

gatcggccga ggcggcctta caaggcaaag actccgaaag tg 42

<210> 84

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 84

gacacctgca ggatgactgt gcctgatctg aaagaaac 38

<210> 85

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 85

gatcggccga ggcggcctca ggccagcgca acg 33

<210> 86

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 86

cttgcctgca ggatgaagat atggctggta cttcttttag tttttg 46

<210> 87

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 87

gatcggccga ggcggcctca caattcgtct ctaatttgtt gcg 43

<210> 88

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 88

cttgcctgca ggatggagca ggttccagtc g 31

<210> 89

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 89

gatcggccga ggcggcctta ttcatcataa acttcttcta tggtggc 47

<210> 90

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 90

cttgcctgca ggatggatcc tttttcaatt cttctcac 38

<210> 91

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 91

gatcggccga ggcggcccta ctttggagac agatcttcca ccttaac 47

<210> 92

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 92

gaaacctgca ggatgaccag tcaaggattt ttggatc 37

<210> 93

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 93

gatcggccga ggcggcccta tatgctatca accatctcca tcaaataac 49

<210> 94

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 94

gacacctgca ggatgactcc ccgttctcat attttc 36

<210> 95

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 95

gatcggccga ggcggcccta ctcaaagaac ttagacaaag cagctttctc 50

<210> 96

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 96

gatccctgca ggatggcaga agaagaacc 29

<210> 97

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 97

gatcggccga ggcggcccta attagtaata cttgcttcta tttcctggta caac 54

<210> 98

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 98

gaaccctgca ggatgatttt gagcaagctg tcgtttagac 40

<210> 99

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 99

gatcggccga ggcggcctta tttattaaca atgacatcat cttcaaactc g 51

<210> 100

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 100

cttgcctgca ggatgggtgc cattggaatg 30

<210> 101

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 101

gatcggccga ggcggcccta ttgcagaaca ttcgatatcc aatc 44

<210> 102

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 102

gatacctgca ggatgctacc attttcgtac gacgtg 36

<210> 103

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 103

gatcggccga ggcggcccta taactctcca ttctcctcgt cgatc 45

<210> 104

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 104

gatccctgca ggatgaaaat attaagtgca ttgcttcttc tttttac 47

<210> 105

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 105

gatcggccga ggcggcctta tagctcttgg tgtaataact gggg 44

<210> 106

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 106

cttgcctgca ggatgtctaa accctacaag ctgataggtg ag 42

<210> 107

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 107

gatcggccga ggcggcctta atcttctcca gcaggtatct catcc 45

<210> 108

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 108

cttgcctgca ggatgaatca attttctcta gcttcacaag taaac 45

<210> 109

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 109

gatcggccga ggcggcccta ctcggttaat ggtccgagtg c 41

<210> 110

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 110

gacacctgca ggatgagtta taggaaagac aacaaacaaa ag 42

<210> 111

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 111

gatcggccga ggcggcctta gaaggcagct tcatcatcg 39

<210> 112

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 112

cttgcctgca ggatgagcag cttcagagtt ctagacttgg 40

<210> 113

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 113

gatcggccga ggcggcctta cagatcaacg aatcc 35

<210> 114

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 114

gatacctgca ggatgaacat ctttagaatc ctaggtaagt ttcc 44

<210> 115

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 115

gatcggccga ggcggcctca ttctggcagc ttgaatttc 39

<210> 116

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 116

cttgcctgca ggatgtccac aactactaag aaaaacaaga acagg 45

<210> 117

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 117

gatcggccga ggcggcctta ccatgcaccc tttcctctc 39

<210> 118

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 118

cttgcctgca ggatgtcaga ggagtaagaa ccacaaacag 40

<210> 119

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 119

gatcggccga ggcggcctca atttattcta ggttttttgg ttcgg 45

<210> 120

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 120

gtaccctgca ggatgatggc aagtccaacc g 31

<210> 121

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 121

gatcggccga ggcggcccgc aacaacgctg gttg 34

<210> 122

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 122

cttgcctgca ggatgagtaa ccagtataat ccgtatgagc ag 42

<210> 123

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 123

gatcggccga ggcggcccta tcttccccag tttccgacac 40

<210> 124

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 124

gttacctgca ggatgtctac agagaacaaa gcagagacaa aac 43

<210> 125

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 125

gatcggccga ggcggcccta tttctttgct tcagcgtttg c 41

<210> 126

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 126

cttgcctgca ggatgttaaa cttaatatcc acaataagtg ggtg 44

<210> 127

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 127

gatcggccga ggcggcctta agcaggagca gataaccaag c 41

<210> 128

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 128

cttgcctgca ggatgggtag aaggaaaata gagataaatc cg 42

<210> 129

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 129

gatcggccga ggcggcctca gctcttctta gtcacactgc ttg 43

<210> 130

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 130

cttgcctgca ggatgtcact tcaactgtcc attatcttcg 40

<210> 131

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 131

gatcggccga ggcggcccta ctcgtccttc ttgttgctct tctc 44

<210> 132

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 132

cgaacatcca tcaccaaaac ac 22

<210> 133

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 133

gttgtcgacc tgcagcgtac ggtgttgccg cgaaatg 37

<210> 134

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 134

catttcgcgg caacaccgta cgctgcaggt cgacaac 37

<210> 135

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 135

cggtgagaat ggcaaaagct tatg 24

<210> 136

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 136

aagcccgatg cgccagagtt g 21

<210> 137

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 137

cgtctcttgg gcaaattgat cagtggatct gatatcacct a 41

<210> 138

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 138

taggtgatat cagatccact gatcaatttg cccaagagac g 41

<210> 139

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 139

gactgttgcg attgctggtg 20

<210> 140

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 140

atccaggaca cgctcatcaa g 21

<210> 141

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 141

gtgtgtgctc tggaattgga tc 22

<210> 142

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 142

agaggaggtt gaatgcgaag aag 23

<210> 143

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 143

gttgtcgacc tgcagcgtac ttctggtgag cttatatggc agtagttac 49

<210> 144

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 144

gtaactactg ccatataagc tcaccagaag tacgctgcag gtcgacaac 49

<210> 145

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 145

cggtgagaat ggcaaaagct tatg 24

<210> 146

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 146

aagcccgatg cgccagagtt g 21

<210> 147

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 147

ctcgggatca ccaagcacaa gtggatctga tatcaccta 39

<210> 148

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 148

taggtgatat cagatccact tgtgcttggt gatcccgag 39

<210> 149

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 149

tcaaagtatg ctgggaagaa tgg 23

<210> 150

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 150

tggattgtct cggaggcg 18

<210> 151

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 151

tactatgact atgggagacc tgggtg 26

<210> 152

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 152

tgaagcatcc cacccactg 19

<210> 153

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 153

gttgtcgacc tgcagcgtac ccttcgcaga ctgtaattat tggc 44

<210> 154

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 154

gccaataatt acagtctgcg aagggtacgc tgcaggtcga caac 44

<210> 155

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 155

cggtgagaat ggcaaaagct tatg 24

<210> 156

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 156

aagcccgatg cgccagagtt g 21

<210> 157

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 157

gttgactttg acggttgcag atacagtgga tctgatatca ccta 44

<210> 158

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 158

taggtgatat cagatccact gtatctgcaa ccgtcaaagt caac 44

<210> 159

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 159

ttctctcctt gattatcggt ctctttc 27

<210> 160

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 160

tggcagatga cttcacaaac g 21

<210> 161

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 161

gtggcatctt tcataacgac atctc 25

<210> 162

<211> 478

<212> PRT

<213> 巴斯德毕赤酵母

<400> 162

Met Ser Ser Phe Arg Val Leu Asp Leu Val Lys Pro Phe Thr Pro Phe

1 5 10 15

Leu Pro Glu Val Ile Ser Pro Glu Arg Lys Val Pro Phe Gln Gln Lys

20 25 30

Leu Met Trp Thr Gly Val Thr Leu Leu Ile Phe Leu Val Met Ser Glu

35 40 45

Ile Pro Leu Tyr Gly Ile Thr Ser Ser Asp Ser Ser Asp Pro Leu Phe

50 55 60

Trp Leu Arg Met Met Leu Ala Ser Asn Arg Gly Thr Leu Met Glu Leu

65 70 75 80

Gly Ile Ser Pro Ile Val Thr Ser Gly Met Val Phe Gln Leu Leu Gln

85 90 95

Gly Ile Gln Ile Leu Asp Val Asn Met Glu Asn Lys Ala Asp Arg Glu

100 105 110

Leu Phe Gln Thr Ala Gln Lys Val Phe Ala Ile Leu Leu Ser Ile Gly

115 120 125

Gln Ala Thr Val Tyr Val Leu Thr Gly Met Tyr Gly Pro Pro Gly Glu

130 135 140

Leu Gly Val Gly Val Cys Leu Leu Leu Val Leu Gln Leu Val Phe Ala

145 150 155 160

Gly Ile Val Val Ile Leu Leu Asp Glu Leu Leu Gln Lys Gly Tyr Gly

165 170 175

Leu Gly Ser Gly Ile Ser Leu Phe Met Ala Thr Asn Ile Cys Glu Gln

180 185 190

Ile Phe Trp Lys Thr Phe Ala Pro Thr Thr Val Asn Arg Gly Arg Gly

195 200 205

Lys Glu Phe Glu Gly Ala Phe Ile Ser Phe Phe His Leu Ile Leu Thr

210 215 220

Lys Lys Asp Lys Lys Arg Ala Leu Leu Glu Ser Phe Tyr Arg Asp Asn

225 230 235 240

Ala Pro Asn Met Phe Gln Val Ile Ala Thr Leu Val Val Phe Phe Thr

245 250 255

Val Val Tyr Leu Gln Gly Phe Arg Leu Glu Ile Pro Val Lys Ser Thr

260 265 270

Arg Gln Arg Gly Pro Tyr Gly Thr Tyr Pro Ile Arg Leu Phe Tyr Thr

275 280 285

Ser Asn Met Pro Ile Met Leu Gln Ser Ala Leu Thr Ser Asn Ile Phe

290 295 300

Ile Ile Ser Gln Met Leu Tyr Ser His Phe Pro Asp Asn Ala Phe Val

305 310 315 320

Lys Leu Ile Gly Thr Trp Glu Ala Gln Pro Gly Ser Ala Gln Leu Phe

325 330 335

Ala Ala Ser Gly Leu Ala Tyr Tyr Met Gln Pro Pro Met Ser Leu Ser

340 345 350

Gln Ala Leu Leu Asp Pro Ile Lys Thr Val Val Tyr Val Val Phe Val

355 360 365

Leu Thr Thr Cys Ala Ile Phe Ser Lys Thr Trp Ile Glu Ile Ser Gly

370 375 380

Ser Ser Pro Arg Asp Val Ala Lys Gln Phe Lys Asp Gln Gly Leu Val

385 390 395 400

Ile Ala Gly His Arg Asp Ala Thr Val Tyr Lys Glu Leu Lys Lys Ile

405 410 415

Ile Pro Thr Ala Ala Ala Phe Gly Gly Ala Thr Ile Gly Ala Leu Ser

420 425 430

Val Val Ser Asp Leu Leu Gly Thr Leu Gly Ser Gly Thr Ser Ile Leu

435 440 445

Leu Ala Val Thr Thr Ile Tyr Gly Tyr Tyr Glu Leu Ala Val Lys Glu

450 455 460

Gly Gly Phe Ser Lys Gly Gly Pro Ser Gly Phe Val Asp Leu

465 470 475

<210> 163

<211> 1437

<212> DNA

<213> 巴斯德毕赤酵母

<400> 163

atgagcagct tcagagttct agacttggta aagcccttta ccccatttct gcctgaggtt 60

atctctccag agagaaaggt cccctttcaa cagaagttga tgtggactgg agtcactctt 120

ctgatcttct tggtcatgag tgaaattccc ctgtatggta tcacttcaag tgactcctct 180

gaccctttgt tttggctgcg tatgatgttg gcctctaaca gaggaacgct gatggagtta 240

ggtatctctc ctattgtcac ttctggaatg gtgttccaac tgttgcaggg aatccaaatc 300

ttggacgtga acatggaaaa caaagcagac agagagttgt tccaaactgc tcaaaaagtg 360

ttcgccattt tgctgagtat cggacaagct actgtttatg ttttaactgg aatgtatggc 420

ccccctggtg aactaggagt tggtgtctgt cttttgttgg ttcttcaatt ggtgtttgca 480

ggtattgtgg tcattttgtt ggatgaactc ttacaaaaag gttacggttt aggaagtgga 540

atttctcttt tcatggccac caacatttgt gagcagattt tttggaagac ttttgctcct 600

accaccgtta accgtggaag aggtaaggaa tttgaaggag ctttcatttc tttctttcac 660

ctgatcttga ccaagaagga caagaagaga gctctgttgg aatcatttta cagagacaac 720

gctccaaaca tgttccaagt tattgctact cttgtcgtct ttttcaccgt tgtctatctt 780

cagggcttcc gtttggagat tccagttaag tctacccgtc aaagaggtcc ttacggaact 840

tacccaatca gattgttcta cacatccaac atgccaatca tgttacaatc cgctttgacc 900

tcaaacattt tcattatttc ccagatgttg tattcacact tccctgacaa tgcctttgtt 960

aagctcattg gaacttggga agctcaacct ggttcagcac aactgtttgc tgcctcggga 1020

ttagcctact acatgcagcc tccaatgtcc ctgagtcaag ctttattaga ccctatcaag 1080

actgtcgtct acgttgtgtt tgttttgacc acttgtgcca tcttctccaa gacatggatt 1140

gagatttcgg gatcttcccc aagagacgtt gctaagcaat tcaaagacca aggattggtt 1200

attgctggac acagagatgc tactgtttac aaggagttga agaagattat accaacagcc 1260

gctgcatttg gaggtgccac aattggtgca ctttccgttg tttccgacct tttgggtact 1320

ttaggttcgg gaacctccat ccttttggct gttacaacca tctatggtta ctacgagttg 1380

gctgttaagg aaggtggttt ttcaaagggt ggaccctctg gattcgttga tctgtaa 1437

Claims

1.一种用于制备目标蛋白的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris），并且被工程化为表达编码目标蛋白的异源多核苷酸序列和过表达多核苷酸，过表达的所述多核苷酸编码氨基酸序列示于SEQ ID NO:1的辅助蛋白，其中与工程化之前的宿主细胞相比，所述辅助蛋白能够使模型蛋白SDZ-Fab和/或HyHEL-Fab的产量增加，并且其中所述模型蛋白SDZ-Fab的重链和轻链分别示于SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26，所述模型蛋白HyHEL-Fab的重链和轻链分别示于SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30。

2.根据权利要求1所述的宿主细胞，其中过表达的所述多核苷酸整合在所述宿主细胞的基因组中或包含在载体或质粒中。

3.根据权利要求1所述的宿主细胞，其中所述多核苷酸的过表达通过(i)采用驱动所述多核苷酸表达的重组启动子或(ii)修饰可操作地连接至所述多核苷酸的调控序列实现。

4.根据权利要求1所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞进一步被工程化为低表达至少一种多核苷酸，低表达的所述多核苷酸编码氨基酸序列示于SEQ ID NO:10和/或11和/或12的蛋白质。

5.根据权利要求1所述的宿主细胞，其中所述目标蛋白为酶、治疗性蛋白、食品添加剂或饲料添加剂。

6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其中所述治疗性蛋白为抗体或抗体片段。

7.根据权利要求1所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞被工程化为：

(i)过表达多核苷酸，过表达的所述多核苷酸编码氨基酸序列示于SEQ ID NO:1的辅助蛋白和氨基酸序列示于SEQ ID NO:2的辅助蛋白，并进一步被工程化为低表达编码氨基酸序列示于SEQ ID NO:10的蛋白质的多核苷酸，或

(ii)过表达多核苷酸，过表达的所述多核苷酸编码氨基酸序列示于SEQ ID NO:4的辅助蛋白和氨基酸序列示于SEQ ID NO:1的辅助蛋白，并进一步被工程化为低表达编码氨基酸序列示于SEQ ID NO:10的的蛋白质的多核苷酸。

8.权利要求1至7中任一项所述的宿主细胞在制备异源目标蛋白中的用途。

9.一种增加宿主细胞中目标蛋白的产量的方法，其中所述宿主细胞是巴斯德毕赤酵母，所述方法包括：

—将宿主细胞工程化为过表达多核苷酸，过表达的所述多核苷酸编码氨基酸序列示于SEQ ID NO:1的辅助蛋白；

—在所述宿主细胞中重组编码目标蛋白的异源多核苷酸；

—在适宜条件下培养所述宿主细胞以过表达所述辅助蛋白和表达所述目标蛋白，和，

—从细胞培养物中分离所述目标蛋白。

10.一种在宿主细胞中生产目标蛋白的方法，其中所述宿主细胞是巴斯德毕赤酵母，所述方法包括：

—提供宿主细胞，所述宿主细胞被工程化为过表达多核苷酸，过表达的所述多核苷酸编码氨基酸序列示于SEQ ID NO:1的辅助蛋白，其中所述宿主细胞包含编码目标蛋白的异源多核苷酸；

—在适宜条件下培养所述宿主细胞以过表达所述辅助蛋白并表达所述目标蛋白，和，

—从细胞培养物中分离所述目标蛋白。

11.根据权利要求9至10中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞进一步被工程化为低表达至少一种多核苷酸，低表达的所述多核苷酸编码氨基酸序列示于SEQ ID NO:10和/或11和/或12的蛋白质。