KR101472273B1 - ＣＧＴａｓｅ의 세포 표면 발현 재조합 벡터 - Google Patents

Abstract

본 발명은 CGTase를 발현하는 재조합 벡터 시스템에 대한 것이며 특히 CGTase를 전세포 생물촉매(whole cell biocatalyst)로 이용할 수 있도록 CGTase가 박테리아 및 효모의 세포 표면에 발현되는 재조합 벡터 시스템에 대한 것이다.
본원 발명에 따른 CGTase 포함 재조합 벡터는 상기 벡터로 형질전환된 숙주의 세포 표면에 CGTase를 발현하므로 숙주세포에서 CGTase를 추출 및 정제하는 복잡한 단계를 거치지 않고 표면에 CGTase를 발현한 숙주 세포를 전세포 효소로 사용할 수 있다.

Description

ＣＧＴａｓｅ의 세포 표면 발현 재조합 벡터{RECOMBINANT VECTOR FOR SURFACE EXPRESSION OF CGTASE}

본 발명은 CGTase를 발현하는 재조합 벡터 시스템에 대한 것이며 특히 CGTase를 전세포 생물촉매(whole cell biocatalyst)로 이용할 수 있도록 CGTase가 박테리아 및 효모의 세포 표면에 발현되는 재조합 벡터 시스템에 대한 것이다.

전통적인 바이오 촉매반응 특히 효소반응을 위해서는 촉매에 해당하는 효소를 발현하고 정제해서 사용하거나 유기 용매 내 반응과 같은 특정반응을 위해서는 고정화와 같은 안정화과정을 거쳐야 한다. 따라서 효소 생물전환공정 개발을 위해서는 효소 생산비용이 가장 중요한 경제성 결정요인이 되고 있고, 고정화과정 또한 대부분 화학적인 반응을 통해 이루어지고 있어 효소 활성을 낮추거나 안정성에 변화를 줄 수 있다. 최근 효소나노입자를 통해서 일부 해결할 수 있음이 보고되고 있으나 실제 산업적인 스케일에 적용하기에는 아직도 고가인 단점이 있다. 또한 고정화가 가능할지라도 화학합성 레진 등에 고정화된 효소를 이용한 반응에서는 기질이나 반응산물의 물질전달문제가 여전히 남아 있다. 고정화담체를 이용할 경우 반응액의 약 10% 이상을 사용할 수 없는 점은 단위 고정화 담체당 활성을 갖는 효소의 절대량(enzyme loading capacity)이 높아야 하는 제한점도 발생하게 된다.

반면 박테리아나 효모 등 미생물 표면에 발현되는 효소의 경우 매우 다양한 장점을 갖는다. 우선 효소를 분리정제하지 않고 단순히 세포를 배양하고 회수하는 것으로 효소를 대량으로 준비할 수 있다. 따라서 효소생산 코스트를 획기적으로 낮추어 경제적인 경쟁력을 가질 수 있다. 화학합성 고정화 담체는 대부분 수백 ㎛이며 박테리아 세포는 대부분 1~2㎛이다. 따라서 단위 부피 표면적이 박테리아가 수백배 더 높게 되어 단위 부피당 효소 고정능이 높고 결과적으로 고정화 효소의 활성이 높은 장점이 있다.

최근 대장균에서 목적단백질의 세포외 분비·생산을 위해 다양한 방법들이 개발이 되어왔으나, 여러 가지 문제점들이 남아있다. 본 발명에서는 CGTase를 세포표면에서 발현시키는 효율적인 방법을 제안하고자 한다.

본원 발명은 상기와 같은 문제점을 해소하기 위해 안출된 것으로서, CGTase가 대장균 또는 효모와 같은 숙주의 세포표면에 발현될 수 있도록 재조합된 재조합 표면 발현 벡터를 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 전세포 효소로 사용할 수 있는 상기 재조합 벡터로 재조합된 형질전환 숙주를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본원 발명은 상기와 같은 목적을 달성하기 위해, CGTase를 코딩하는 유전자를 포함하며, CGTase가 숙주의 세포 표면에 발현되도록 하는 재조합 표면 발현 벡터를 제공한다.

상기 CGTase는 Geobacillus spp . 또는 Bacillus spp . 에서 유래된 것이 바람직하며 더욱 바람직하게는 Geobacillus stearothermophilus에서 유래된 것이다.

또한, 상기 CGTase는 서열목록 1번의 아미노산 서열로 이루어지며, 상기 CGTase를 코딩하는 유전자는 서열목록 2번의 염기서열로 이루어지는 것일 수 있다.

상기 벡터는 OmpA 유전자와 리포프로테인 시그날 펩타이드의 유전자의 융합 유전자 및 상기 CGtase를 코딩하는 유전자를 포함한다. 상기 융합 유전자는 서열번호 3의 염기서열로 이루어질 수 있다.

그리고, 본원 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다. 여기에서 상기 숙주 세포는 상기 숙주 세포는 박테리아일 수 있다.

또한 상기 벡터는 GPI 결합 단백질(glycosylphosphophatidyllinositol(GPI) anchored protein)과 CGTase를 코딩하는 유전자를 포함하는 것일 수 있다.

상기 GPI 결합 단백질은 Saccharomyces ceerecisiae 유래의 TIP1 단백질일 수 있으며, 상기 TIP1 단백질은 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지는 것일 수 있다.

그리고, 본원 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다. 상기 숙주 세포는 효모일 수 있다.

본원 발명에 따른 CGTase 포함 재조합 벡터는 상기 벡터로 형질전환된 숙주의 세포 표면에 CGTase를 발현하므로 숙주세포에서 CGTase를 추출 및 정제하는 복잡한 단계를 거치지 않고 표면에 CGTase를 발현한 숙주 세포를 전세포 효소로 사용할 수 있다.

도 1은 E. Coil 의 리포프로테인 시그날 펩타이드 유전자와 세포 외막 단백질 유전자의 융합 유전자를 얻기 위한 클로닝 방법을 개략적으로 도시한 것이다.
도 2는 trc 프로모터 부분을 포함한 리포프로테인 시그날 펩타이드 유전자, 세포 외막 단백질 유전자 및 CGTase 유전자가 pGEMT easy 플라스미드에 삽입된 재조합 플라스미드를 도시한 것이다.
도 3은 재조합 플라스미드로 형질전환된 E. Coil 의 세포 표면에 CGTase가 발현된 형상을 도시한 것이다.
도 4는 형질전환된 E. Coil 에서 표층 발현된 CGTase의 활성을 확인한 것을 나타낸 것이다.
도 5는 Saccharomyces cerecisiae 유래 GPI 결합 단백질인 TIP1 유전자와 G. stearothermophilus 유래 CGTase 유전자를 포함하는 재조합 벡터의 클로닝 과정을 개략적으로 도시한 것이다.
도 6은 TIP1 유전자와 G. stearothermophilus 유래 CGTase 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 나타낸 것이다.
도 7은 형질전환된 P. pastoris 에서 표층 발현된 CGTase의 활성을 확인한 것을 나타낸 것이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 CGTase를 코딩하는 유전자를 포함하며, CGTase가 숙주의 세포 표면에 발현되도록 하는 재조합 표면 발현 벡터를 제공한다. 또한 상기 발현 벡터로 형질전환된 숙주 및 이를 이용한 전세포 생물 촉매(whole cell biocatalyst)를 제공한다.

용어

"융합 단백질(fusion protein)"은 한 단백질 서열의 N-말단 또는 C-말단에 다른 단백질이 연결되거나 다른 아미노산 서열이 부가된 단백질을 의미한다.

"형질전환"은 세포가 이종의 DNA를 복제하거나, 상기 DNA를 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 DNA에 의해 암호된 단백질을 발현하도록 세포에 이종의 DNA를 도입하는 것을 의미한다. 형질전환 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 형질전환 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

"작동 가능하게 연결된"은 단편이 배열되어서 그들은 일제히 그들의 의도한 목적, 예를 들면, 전사는 프로모터에서 개시하고 암호화 단편을 통해 종료암호로 진행하는데 작용하는 것을 나타낸다.

"기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 원래 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 나타내며 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 것을 의미한다.

이하 첨부된 도면을 중심으로 하여 본원 발명을 상세하게 설명한다.

CGTase(cyclodextrin glucanotransferase)는 Bacillus 속이 생산하는 당전이 효소로, 2-Ο-α-D-glucopyranosyl L-ascorbic acid (AA-2G)를 제조하는데 사용된다.

CGTase는 스타치나 아밀로오스, 아밀로펙틴, 말토올리고사카라이드 등의 기질에 작용하여 사이클로덱스트린을 합성하는 분자 내 당전이 반응인 고리화 반응응(cyclization)과 분자간 당전이 반응인 커플링 반응 및 불균등화 반응(disproportionation)을 매개하는 다기능 효소이다. CGTase의 주작용은 사이클로덱스트린 합성 반응으로 스타치로부터 글루코오스 6~8개가 α-1,4-glucosidic 결합으로 환상 연결된 비환원성의 α, β, γ-사이클로덱스트린을 생산한다.

CGTase는 Geobacillus stearothermophilus, Bacillus macerans, B. circulans, B. obhensis , B. megaterium , B. coagulans , B. firmus, B. stearothermophilus, alkalophilic Bacillus sp. 등의 주로 Bacillus 속 세균이 생산하는 것으로 알려져 있다.

CGTase는 Geobacillus stearothermophilus, Bacillus macerans, B. circulans, B. obhensis , B. megaterium , B. coagulans , B. firmus, B. stearothermophilus, alkalophilic Bacillus sp. 에서 유래된 것일 수 있다. 바람직하게는 CGTase의 범위는 Geobacillus stearothermophilus 에서 유래된 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. 상기 기능적 동등물들은 사이클로덱스트린 합성 반응으로 스타치로부터 글루코오스 6~8개가 α-1,4-glucosidic 결합으로 환상 연결된 비환원성의 α, β, γ-사이클로덱스트린을 생산할 수 있도록 서열번호 1로 표시되는 아미노산과 실질적으로 동질의 생리활성을 갖는 것이다.

본원 발명에 따른 재조합 벡터는 CGTase를 코딩하는 유전자를 포함하는 것으로서 상기 CGTase가 숙주세포의 표면에 발현되도록 하는 것이다.

상기 CGTase 단백질을 코딩하는 유전자는 CGTase 단백질을 코딩하는 DNA 또는 RNA일 수 있다. DNA는 cDNA, 게놈 DNA 또는 인위적인 합성 DNA를 포함한다. DNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. DNA는 코딩(coding) 가닥 또는 넌코딩(non-coding) 가닥일 수 있다.

또한 본 발명은 상기 제조합 벡터로 형질전환되는 숙주 세포를 제공한다. 상기 숙주 세포는 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 세포 표면 발현에 유리하도록 발현된 외래단백질을 분해할 수 있는 세포내 또는 세포외 단백질 분해효소를 생산하지 못하도록 변형된 것이 바람직하다. 상기 숙주세포는 원핵생물세포 또는 진핵생물세포일 수 있다. 상기 원핵생물세포는 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 바이러스, E. Coil 및 바실러스(Bacillus)로 이루어진 군으로부터 선택된 것이 바람직하다. 상기 진핵생물세포는 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 포유동물 세포, 곤충 세포, 효모 또는 식물 세포인 것이 바람직하다.

상기 숙주세포는 E. Coil일 수 있다. 복잡한 막구조를 가지고 있는 E. Coil에서 세포 표면 발현을 성공적으로 수행하기 위해서는 우선 세포 표면에 발현시키고자 하는 외래 단백질을 세포 표면까지 안정적이며 효율적으로 이동시킬 수 있는 표면 발현 모체의 사용이 요구된다. E. Coil의 외막 단백질의 경우 3차원 구조가 세포외막을 통과하는 루프 구조를 가지고 있으므로, 다양한 단백질을 발현할 수 있는 융합 부위(site)를 제공할 수 있는 장점이 있다. 표면 발현 모체로 사용될 수 있는 외막 단백질은 OmpA(Outermembrane Protein A), OmpS, LamB, OprF, PhoE 등d을 예로 들 수 있다.

본 발명은 또한, 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다. 본원 발명에 따른 재조합 벡터를 원핵세포에 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.

또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 구체적인 일 실시형태에 있어서, E. Coil를 형질전환하기 위한 재조합 벡터는 E. Coil의 OpmA 유전자와 리포프로테인 시그날 펩타이드 유전자를 융합한 유전자를 포함한다. 상기 융합 유전자는 리포프로테인 시그날 펩타이드 유전자와 OmpA 유전자가 서로 작동가능하게 연결된 것으로서 리포프로테인 유전자의 리포프로테인 시그날 펩타이드를 암호화하고 있는 9개의 아미노산을 OpmA의 N 말단에 연결된 것이다. 본원 발명의 구체적인 일 실시형태에 따르면 CGTase는 OmpA 유전자의 표적신호인 C 말단에 연결되는데, 상기 CGTase가 숙주 세포의 표층에 안정적으로 발현되어 표면 부착되는 것은 OmpA 유전자 단편 부분에 의해, 세포질에서 세포외막까지의 이동은 리포프로테인 시그날 단백질 유전자 단편 부분에 의해 이루어진다.

또 다른 구체적인 일 실시형태에 있어서, P. pastoris를 형질전환하기 위한 재조합 벡터는 CPI 결합 단백질인 TIP1를 코딩하는 유전자와 CGTase를 코딩하는 유전자를 포함한다. 상기 벡터는 바람직하게는 pPIC9K인 것인데, 도입된 CGTase와 같은 목적 단백질을 숙주 세포 외부로 분비하기 위해 α-factor 분비 서열이 포함되어 있을 수 있다.

상기 재조합 벡터는 CGTase 유전자와 CGtase 유전자를 세포 표면에 발현시킬 수 있도록 고안된 유전자가 삽입된 어떤 재조합벡터도 될 수 있으나, 바람직하게는 원핵세포 또는 진핵세포에서 발현할 수 있는 프로모터를 포함하는 벡터에 삽입된 재조합 벡터일 수 있다. 더욱 바람직하게는 도 2 및 도 7의 개열지도를 갖는 재조합벡터인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 CGTase 유전자 및 CGTase의 세포 표면에 발현시키는 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

본원 발명에 따른 재조합 벡터는 strong 프로모터가 포함된 것이 바람직하다. 상기 strong 프로모터의 예로는 trc 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터, lac 프로모터, trp 프로모터 등이 있으며, 여기에서 바람직하게는 trc 프로모터인 것이다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예

하기 실시예에서는 대장균(E. coli JM109) 및 효모(P. pastoris SMD1168)를 숙주로 이용하였으나, 그 외에 다른 대장균이나, 박테리아, 효모 및 곰팡이를 숙주로 사용하여 CGTase 표면 발현용 재조합 벡터를 도입시킨 다음, 이를 이용하여 CGTase를 발현시키는 것 역시 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

또한, 하기 실시예에서는 CGTase 도입 대상 유전자로 Geobacillus stearothermophilus NO2인 특정 균주 유래인 것만을 예시하였으나, 숙주세포에서 발현되어 동일한 활성을 나타내는 한 그 제한이 없다는 것은 당업자에게 자명하다.

E. coli 를 숙주로 한 CGTase 의 표면 발현

1-1. CGTase 유전자의 합성

본 실시예서 사용한 CGTase 유전자는 「 SHINSUKE et al. 1992. Cyclozation characteristics of cyclodextrin glucanotransferase are conferred by the NH2-terminal region of the enzyme」에 개시된 염기 서열을 토대로 합성한 것(서열목록 2)으로서 G. stearothermophilus NO2 유래의 CGTase 염기 서열과 동일한 것을 사용하였다. 또한 상기 CGTase DNA는 하기의 프라이머를 이용해서 증폭하였다.

F: 5' GGATTCGGCTGGAAATCTTAATAAGG 3' (BamHI)

B: 5' GTCGACTTAGTTCTGCCAATCCACTAT 3' (Sali)

1-2. 리포프로테인 시그날 펩타이드 ( Lpp ) 유전자와 세포 외막 단백질( OmpA ) 유전자의 융합

하기 기술된 방법을 통해 Lpp-OmpA 융합 유전자 단편(서열번호 3)을 얻었다(도 1)

대장균의 세포 외막 단백질(OmpA) 유전자(서열번호 5)를 확보하기 위하여, E. coli JM109 genomic DNA를 주형으로 하고, 하기 프라이머쌍을 사용하여 PCR(변성 94℃ 30초, 어닐링 45℃ 30초 신장 72℃ 30초, 30회 반복)을 수행하였다.

F: 5' CAACGCTAAAATCGATCAGGGTATTAACCCGTATGTTGGCTTTG 3'

B: 5' CCATGGGTTGTCCGGACGAGTGCC 3' (NcoI)

또한, 대장균의 리포프로테인 시그널 펩타이드 유전자(서열번호 6)를 확보하기 위하여, E. coli JM109 genomic DNA 를 주형으로 하고, 하기 프라이머쌍을 사용하여 PCR(변성 94℃ 30초, 어닐링 45℃ 30초 신장 72℃ 30초, 30회 반복)을 수행하였다.

F: 5' CCATGGGTAAAGCTACTAAACTGGTA 3' (NcoI)

B: 5' CAAAGCCAACATACGGGTTAATACCCTGATCGATTTTAGCGTTG 3'

다음으로 상기에서 얻어진 각각의 PCT 산물인 서열번호 5의 OmpA 유전자와 서열번호 6의 리포프로테인 시그널 펩타이드 유전자를 주형으로 첨가하고 Lpp F 프라이머와 OmpA B 프라이머를 이용하여 PCR(변성 94℃ 30초, 어닐링 45℃ 30초 신장 72℃ 30초, 30회 반복)을 수행하였다. 상기와 같이 Lpp B 프라이머 부분과 OmpA F 프라이머는 서로 동일한 서열을 가지도록 디자인되어 있어 상기 PCR을 통해 리포프로테인 시그널 펩타이드 유전자와 OmpA 유전자의 융합 산물인 융합 유전자(서열번호 3)를 얻을 수 있었다.

1-3. 재조합 벡터

1-2에서 수득한 서열목록 3의 Lpp-OmpA 융합 유전자 단편을 pGEMT easy 플라스미드로 서브클로닝한 후 trc 프로모터하에 발현시키기 위해 상기 융합 유전자 단편을 pTRC99A 플라스미드의 NcoI 사이트로 삽입하였다. 또한, 상기 실시예 1-1을 통해 수득한 CGTase 유전자는 pGEMT easy 플라스미드로 서브클로닝 한 후 Lpp-OmpA가 삽입되어진 pTRC99A의 BamHI, SalI 위치로 삽입시켰다.

한편, pTRC99A 플라스미드는 lacI^q의 존재하에 IPTG를 이용한 유도발현 시스템이므로 CGTase가 항시 발현되도록 하기 위해 trc-Lpp-OmpA-CGTase 부분을 lacI^q가 존재하지 않는 벡터인 pGEMT easy내로 삽입하여 재조합 벡터를 얻었다. 상기 trc-Lpp'OmpA-CGTase 유전자는 trc 프로모터 결합 프라이머(5' CCGACATCATAACGGTTC 3')와 CGTase B 프라이머를 이용하였다.

1-4. E. coli JM109 의 형질전환

상기 실시예 1-3에서 얻어진 재조합 벡터를 E. coli JM109 내로 도입하여 형질전환하였다. 상기 형질전환은 CaCl₂방법을 사용하였다. E. coli JM109를 LB 배지에서 시드 배양한 후 새로운 LB 배지 100ml 에 상기 시드 배양액 1ml를 첨가하였다. 상기 LB 배지의 OD600이 약 0.6이 될 때까지 까지 배양한 후 원심분리로 셀다운시켰다(4℃, 4000 x g, 5분). 다음으로 상등액을 버리고 가라앉은 셀에 1/2 volume의 100mM CaCl₂를 첨가하여 셀을 현탁시키고 상기와 동일한 조건으로 다시 원심분리하여 셀다운시켰다. 다음으로 1/10 volume의 CaCl₂로 재현탁시킨 상태로 5분간 방치하였다. 상기 재현탁 용액에 상기 1-3에서 얻은 재조합 벡터를 넣고 이를 얼음속에서 15분간 방치하였다. 다음으로 42℃ 온수조에 90초간 넣어 열충격을 가하였다. 다음으로 여기에 새로운 LB 배지 1ml 첨가하고 37℃에서 약 1 시간 정도 배양시켰다. 상기 배양물을 암피실린이 50㎍/ml이 포함된 LB 플레이트상에 도말하고 12시간 배양 후 E. coli JM109의 형질전환 결과를 확인하였다.

효모를 숙주로 한 CGTase 의 표면발현

2-1. CGTase 유전자의 합성

본 실시예서 사용한 CGTase 유전자는 「 SHINSUKE et al. 1992. Cyclozation characteristics of cyclodextrin glucanotransferase are conferred by the NH2-terminal region of the enzyme」에 개시된 염기 서열을 토대로 합성한 것(서열목록 2)으로서 G. stearothermophilus NO2 유래의 CGTase 염기 서열과 동일한 것을 사용하였다. 또한 상기 CGTase DNA는 하기의 프라이머를 이용해서 증폭하였다.

F: 5' GAATTCGCTGGAAATCTTAATAAGG 3' (EcoRI)

B: 5' GAATTCGTTCTGCCAATCCACTAT 3' (EcoRI)

2-2. TIP1 유전자 클로닝

TIP1 유전자(서열번호 7)를 확보하기 위하여, S. cerevisiae EBY-100를 주형으로 하고, 상기 프라이머쌍을 사용하여 PCR(변성 94℃ 30초, 어닐링 45℃ 30초 신장 72℃ 30초, 30회 반복)을 수행하였다.

F: 5' GAATTCATGTCCGTTTCCAAGATTG 3' (EcoRI)

B: 5' GCGGCCGCTTATAACAATAAAGCAG (NotI)

2-3. 재조합 벡터

상기 실시예 2-1를 통해 얻어진 CGTase 유전자를 pGEMT easy내로 서브클로닝 하였다. 또한, 실시예 상기 2-2를 통해 얻어진 TIP1 유전자를 pGEMT easy내로 서브클로닝 한 후 pPIC9K의 EcoRI, NotI 위치로 삽입하였다. 다음으로 상기 TIP1 유전자가 삽입된 pPIC9K 플라스미드의 EcoRI 위치에 상기 CGTase 유전자를 삽입하여 재조합 벡터를 얻었다.

2-4. P. pastoris 의 형질전환

상기 실시예 2-3을 통해 얻어진 재조합 벡터(재조합 pPIC9K 플라스미드)를 P. pastoris SMD1168내로 형질도입시켰다. 상기 형질도입은 인비트로젠의 Pichia expression kit을 이용한 LiCl 형질전환방법에 따랐다.

YPD 배지에 P. pastoris SMD1168을 하룻밤 배양한 후, 이를 다시 100ml 배지에 1% 되게 접종하여 OD600=0.6~0.8까지 배양하였다. 이후 원심분리(22℃, 1500 x g, 10분) 후 상등액을 버리고 침전된 셀을 멸균된 증류수로 세척하였다. 이를 다시 원리분리(22℃, 1500 x g, 10분) 한 후 100mM LiCl 1ml에 재현탁시킨 후 이를 다시 원리분리하고(22℃, 1500 x g, 10분) 100mM LiCl 400㎕에 재현탁시킨 후 이중 50㎕을 취하였다. 상기 50㎕의 재현탁액에 PEG3350 240㎕를 넣고, 1M LiCl 36㎕를 첨가하였다. 다음으로 여기에 샐먼 스펌(salmon sperm) DNA 2mg/ml 첨가하였다. 이렇게 하여 플라스미드가 삽입될 수 있는 전능세포를 제조하였다. 다음으로 2-3에서 얻은 pPIC9K 플라스미드를 salI으로 처리하고 10㎍을 취하여 상기 전능세포에 첨가한 후 30℃에서 30분간 배양하였다. 다음으로 이를 42℃ 온수조에 넣고 약 25분간 방치하였다. 다음으로 히스티딘이 첨가되지 않은 MD(1.34% YNB, 4 x 10-5% 비오틴, 2% 글루코오즈) 플레이트에 도말하였다. 이후 약 30℃에서 2~3일 배양하였다. 상기 플라스미드가 P. pastoris SMD1168 (HIS4 mutant)의 HIS4 site내로 삽입되었음을 확인하였다.

CGTase 의 발현 및 활성 확인

3-1 CGTase 의 발현 유도

상기 실시예 1 및 2를 통해 얻어진 형질전환 숙주를 BMMY(효모 추출물 10g/l, 펩톤 20g/l, 비오틴 0.4mg/l, 효모 질소 베이스(아미노산 없음) 13.4g/l, 100mM 칼슘 포스페이트(pH 6.0), 0.5% (v/v) 메탄올)에서 배양하여 CGTae 발현을 유도하였다.

3-2 CGTase 활성 확인

발현된 CGTase의 활성을 확인하기 위해 상기 실시예 3-1을 통해 얻어진 배양물을 하기 상술하는 배지에 점적하는 방식으로 진행하였다.

3-2-1 형질전환 E. coli 에서 발현된 CGTas 의 활성 확인

실시예 1을 통해 얻어진 형질전환된 E. coli를 하기 조성의 배지에 점적하고 37℃의 조건에서 10시간 가량 배양시킨 후 상기 점적된 주변의 배지의 변화를 살폈다. 도 4는 상기 활성 실험 결과를 나타낸 사진이다. 상기 도 4를 살펴보면 형질전환된 E. coli가 점적된 주변의 배지의 색상이 다른 부분에 비해 백색으로 변화된 것을 확인할 수 있었다. 이는 상기 형질전환된 E. coli 표면에 발현된 CGTase 에 의해서 배지 중 스타치가 싸이클로덱스트린으로 전환되었으며 이것이 배지 중 페놀프탈레인과 반응한 결과이다. 이를 통해 표면 발현 CGTase가 추출 정제된 CGTase와 동일한 수준으로 활성을 나타냄을 확인하였다.

상기 배지의 조성은 다음과 같았다: 트립톤 1%, NaCl 0.5%, 효모 추출물 0.5%, 용해성 스타치 1g, 페놀프탈레인 0.03%, 콘고 레드 0.02%, 아가 1.5%.

3-2-2 형질전환 P. pastoris 에서 발현된 CGTase 의 활성 확인

실시예 2를 통해 얻어진 형질전환된 P. pastoris를 하기 조성의 배지에 점적하고 37℃의 조건에서 10시간 가량 배양시킨 후 상기 점적된 주변의 배지의 변화를 살폈다. 도 7은 상기 활성 실험 결과를 나타낸 사진이다. 도 7를 살펴보면 형질전환된 P. pastoris가 점적된 주변의 배지의 색상이 다른 부분에 비해 백색으로 변화된 것을 확인할 수 있었다. 이는 형질전환된 P. pastoris 의 표면에 발현된 CGTase 에 의해서 배지 중 스타치가 싸이클로덱스트린으로 전환되었으며, 이것이 배지 중 페놀프탈레인과 반응한 결과이다. 이를 통해 표면 발현 CGTase가 추출 정제된 CGTase와 동일한 수준으로 활성을 나타냄을 확인하였다. 상기 배지의 조성은 다음과 같았다: 효모 추출물 1%, 2% 펩톤, 2% 클루코오스, 용해성 스타치 1g, 페놀프탈레인(phenolphthalein) 0.03%, 콘코 레드(congo red) 0.02%, 아가 1.5%.

3-3 효소활성도 측정

50mM 인산 버퍼(pH 6.0) 1.5ml에 1% 용해성 스타치와 0.035 mM 메틸 오렌지를 첨하였다. 그 후 동결건조시킨 CGTase 표층발현균을 혼합액에 가하여 30℃ ~ 80℃에서 3시간 반응시킨 후 6N HCl을 가하여 반응을 정지시켰다. 다음으로 이를 500nm에서 흡광도를 측정하고 하기 표 1과 같이 정리하였다. 하기 표 1에서 1 unit은 1분당 위의 조건에서 α-CD 1μmole 생성하는 효소량을 의미한다. 특정 활성은 각 효소 활성을 건조균체 농도값으로 나눈 값을 의미한다.

온도	특정활성
	CGTase(대장균)	GTase(효모)
30	1.12±0.04	0.34±0.09
40	2.34±0.12	1.25±0.03
50	2.23±0.09	2.22±0.12
60	7.03±0.08	8.81±0.06
70	4.03±0.11	7.23±0.11
80	3.02±0.21	5.12±0.13

<110> LSM <120> Recombinant vector for surface expression of CGTase <130> A1 <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 711 <212> PRT <213> Geobacillus stearothermophilus <220> <221> PEPTIDE <222> (32)..(711) <223> mature form (680 amino acid) <400> 1 Met Arg Arg Trp Leu Ser Leu Val Leu Ser Met Ser Phe Val Phe Ser 1 5 10 15 Ala Ile Phe Ile Val Ser Asp Thr Gln Lys Val Thr Val Glu Ala Ala 20 25 30 Gly Asn Leu Asn Lys Val Asn Phe Thr Ser Asp Val Val Tyr Gln Ile 35 40 45 Val Val Asp Arg Phe Val Asp Gly Asn Thr Ser Asn Asn Pro Ser Gly 50 55 60 Ala Leu Phe Ser Ser Gly Cys Thr Asn Leu Arg Lys Tyr Cys Gly Gly 65 70 75 80 Asp Trp Gln Gly Ile Ile Asn Lys Ile Asn Asp Gly Tyr Leu Thr Asp 85 90 95 Met Gly Val Thr Ala Ile Trp Ile Ser Gln Pro Val Glu Asn Val Phe 100 105 110 Ser Val Met Asn Asp Ala Ser Gly Ser Ala Ser Tyr His Gly Tyr Trp 115 120 125 Ala Arg Asp Phe Lys Lys Pro Asn Pro Phe Phe Gly Thr Leu Ser Asp 130 135 140 Phe Gln Arg Leu Val Asp Ala Ala His Ala Lys Gly Ile Lys Val Ile 145 150 155 160 Ile Asp Phe Ala Pro Asn His Thr Ser Pro Ala Ser Glu Thr Asn Pro 165 170 175 Ser Tyr Met Glu Asn Gly Arg Leu Tyr Asp Asn Gly Thr Leu Leu Gly 180 185 190 Gly Tyr Thr Asn Asp Ala Asn Met Tyr Phe His His Asn Gly Gly Thr 195 200 205 Thr Phe Ser Ser Leu Glu Asp Gly Ile Tyr Arg Asn Leu Phe Asp Leu 210 215 220 Ala Asp Leu Asn His Gln Asn Pro Val Ile Asp Arg Tyr Leu Lys Asp 225 230 235 240 Ala Val Lys Met Trp Ile Asp Met Gly Ile Asp Gly Ile Arg Met Asp 245 250 255 Ala Val Lys His Met Pro Phe Gly Trp Gln Lys Ser Leu Met Asp Glu 260 265 270 Ile Asp Asn Tyr Arg Pro Val Phe Thr Phe Gly Glu Trp Phe Leu Ser 275 280 285 Glu Asn Glu Val Asp Ala Asn Asn His Tyr Phe Ala Asn Glu Ser Gly 290 295 300 Met Ser Leu Leu Asp Phe Arg Phe Gly Gln Lys Leu Arg Gln Val Leu 305 310 315 320 Arg Asn Asn Ser Asp Asn Trp Tyr Gly Phe Asn Gln Met Ile Gln Asp 325 330 335 Thr Ala Ser Ala Tyr Asp Glu Val Leu Asp Gln Val Thr Phe Ile Asp 340 345 350 Asn His Asp Met Asp Arg Phe Met Ile Asp Gly Gly Asp Pro Arg Lys 355 360 365 Val Asp Met Ala Leu Ala Val Leu Leu Thr Ser Arg Gly Val Pro Asn 370 375 380 Ile Tyr Tyr Gly Thr Glu Gln Tyr Met Thr Gly Asn Gly Asp Pro Asn 385 390 395 400 Asn Arg Lys Met Met Ser Ser Phe Asn Lys Asn Thr Arg Ala Tyr Gln 405 410 415 Val Ile Gln Lys Leu Ser Ser Leu Arg Arg Asn Asn Pro Ala Leu Ala 420 425 430 Tyr Gly Asp Thr Glu Gln Arg Trp Ile Asn Gly Asp Val Tyr Val Tyr 435 440 445 Glu Arg Gln Phe Gly Lys Asp Val Val Leu Val Ala Val Asn Arg Ser 450 455 460 Ser Ser Ser Asn Tyr Ser Ile Thr Gly Leu Phe Thr Ala Leu Pro Ala 465 470 475 480 Gly Thr Tyr Thr Asp Gln Leu Gly Gly Leu Leu Asp Gly Asn Thr Ile 485 490 495 Gln Val Gly Ser Asn Gly Ser Val Asn Ala Phe Asp Leu Gly Pro Gly 500 505 510 Glu Val Gly Val Trp Ala Tyr Ser Ala Thr Glu Ser Thr Pro Ile Ile 515 520 525 Gly His Val Gly Pro Met Met Gly Gln Val Gly His Gln Val Thr Ile 530 535 540 Asp Gly Glu Gly Phe Gly Thr Asn Thr Gly Thr Val Lys Phe Gly Thr 545 550 555 560 Thr Ala Ala Asn Val Val Ser Trp Ser Asn Asn Gln Ile Val Val Ala 565 570 575 Val Pro Asn Val Ser Pro Gly Lys Tyr Asn Ile Thr Val Gln Ser Ser 580 585 590 Ser Gly Gln Thr Ser Ala Ala Tyr Asp Asn Phe Glu Val Leu Thr Asn 595 600 605 Asp Gln Val Ser Val Arg Phe Val Val Asn Asn Ala Thr Thr Asn Leu 610 615 620 Gly Gln Asn Ile Tyr Ile Val Gly Asn Val Tyr Glu Leu Gly Asn Trp 625 630 635 640 Asp Thr Ser Lys Ala Ile Gly Pro Met Phe Asn Gln Val Val Tyr Ser 645 650 655 Tyr Pro Thr Trp Tyr Ile Asp Val Ser Val Pro Glu Gly Lys Thr Ile 660 665 670 Glu Phe Lys Phe Ile Lys Lys Asp Ser Gln Gly Asn Val Thr Trp Glu 675 680 685 Ser Gly Ser Asn His Val Tyr Thr Thr Pro Thr Asn Thr Thr Gly Lys 690 695 700 Ile Ile Val Asp Trp Gln Asn 705 710 <210> 2 <211> 2136 <212> DNA <213> Geobacillus stearothermophilus <220> <221> gene <222> (94)..(2136) <223> mature form sequence (2043 bp) <400> 2 atgagaagat ggctttcgct agtcttgagc atgtcatttg tatttagtgc aatttttata 60 gtatctgata cgcagaaagt caccgttgaa gcagctggaa atcttaataa ggtaaacttt 120 acatcagatg ttgtctatca aattgtagtg gatcgatttg tggatggaaa tacatccaat 180 aatccgagtg gagcattatt tagctcagga tgtacgaatt tacgcaagta ttgcggtgga 240 gattggcaag gcatcatcaa taaaattaac gatgggtatt taacagatat gggtgtgaca 300 gcgatatgga tttctcagcc tgtagaaaat gtattttctg tgatgaatga tgcaagcggt 360 tcagcctcct atcatggtta ttgggcgcgc gatttcaaaa agccaaaccc gttttttggt 420 accctcagtg atttccaacg tttagttgat gccgcacatg caaaaggaat aaaggtaatt 480 attgactttg cccccaacca tacttctcct gcttcagaaa cgaatccttc ttatatggaa 540 aacggacgac tgtacgataa tgggacattg cttggcggtt acacaaatga tgccaacatg 600 tattttcacc ataacggtgg aacaacgttt tccagcttag aggatgggat ttatcgaaat 660 ctgtttgact tggcggacct taaccatcag aaccctgtta ttgataggta tttaaaagat 720 gcagtaaaaa tgtggataga tatggggatt gatggtatcc gtatggatgc ggtgaagcac 780 atgccgtttg gatggcaaaa atctctgatg gatgagattg ataactatcg tcctgtcttt 840 acgtttgggg agtggttttt gtcagaaaat gaagtggacg cgaacaatca ttactttgcc 900 aatgaaagtg gaatgagttt gctcgatttt cgtttcggac aaaagcttcg tcaagtattg 960 cgcaataaca gcgataattg gtatggcttt aatcaaatga ttcaagatac ggcatcagca 1020 tatgacgagg ttctcgatca agtaacattc atagacaacc atgatatgga tcggtttatg 1080 attgacggag gagatccgcg caaggtggat atggcacttg ctgtattatt gacatcccgt 1140 ggcgtaccga atatttacta tggtacagag caatacatga ccggtaacgg cgatccaaac 1200 aatcgtaaga tgatgagttc attcaataaa aatactcgcg cgtatcaagt gattcaaaaa 1260 ctatcttctc tccgacgaaa caatccggcg ttagcttatg gtgataccga acagcgttgg 1320 atcaatggcg atgtgtatgt gtatgagcga cagtttggca aagatgttgt gttagttgcc 1380 gttaatcgta gttcaagcag taattactcg attactggct tatttacagc tttaccagca 1440 ggaacatata cggatcagct tggcggtctt ttagacggaa atacaattca agtcggttca 1500 aatggatcag ttaatgcatt tgacttagga ccgggggaag tcggtgtatg ggcatacagt 1560 gcaacagaaa gcacgccaat tattggtcat gttggaccga tgatggggca agtcggtcat 1620 caagtaacca ttgatggcga aggattcgga acaaatacgg gcactgtgaa gttcggaacg 1680 acagctgcca atgttgtgtc ttggtctaac aatcaaatcg ttgtggctgt accaaatgtg 1740 tcaccaggaa aatataatat taccgtccaa tcatcaagcg gtcaaacgag tgcggcttat 1800 gataactttg aagtactaac aaatgatcaa gtgtcagtgc ggtttgttgt taataacgcg 1860 actaccaatc tagggcaaaa tatatacatt gttggcaacg tatatgagct cggcaactgg 1920 gacactagta aggcaatcgg tccaatgttc aatcaagtgg tttactccta tcctacatgg 1980 tatatagatg tcagtgtccc agaaggaaag acaattgagt ttaagtttat taaaaaagac 2040 agccaaggta atgtcacttg ggaaagtggt tcaaatcatg tttatacgac accaacgaat 2100 acaaccggaa aaattatagt ggattggcag aactaa 2136 <210> 3 <211> 446 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lpp-OmpA hybrid gene <220> <221> gene <222> (9)..(92) <223> Lipoprotein signal peptide and mature form of amino acid (9) <220> <221> gene <222> (99)..(440) <223> OmpA <400> 3 ccatgggtaa agctactaaa ctggtactgg gcgcggtaat cctgggttct actctgctgg 60 caggttgctc cagcaacgct aaaatcgatc agggtattaa cccgtatgtt ggctttgaaa 120 tgggttacga ctggttaggt cgtatgccgt acaaaggcag cgttgaaaac ggtgcataca 180 aagctcaggg cgttcaactg accgctaaac tgggttaccc aatcactgac gacctggaca 240 tctacactcg tctgggtggc atggtatggc gtgcagacac taaatccaac gtttatggta 300 aaaaccacga caccggcgtt tctccggtct tcgctggcgg tgttgagtac gcgatcactc 360 ctgaaatcgc tacccgtctg gaataccagt ggaccaacaa catcggtgac gcacacacca 420 tcggcactcg tccggacaac ccatgg 446 <210> 4 <211> 210 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 4 Met Ser Val Ser Lys Ile Ala Phe Val Leu Ser Ala Ile Ala Ser Leu 1 5 10 15 Ala Val Ala Asp Thr Ser Ala Ala Glu Thr Ala Glu Leu Gln Ala Ile 20 25 30 Ile Gly Asp Ile Asn Ser His Leu Ser Asp Tyr Leu Gly Leu Glu Thr 35 40 45 Gly Asn Ser Gly Phe Gln Ile Pro Ser Asp Val Leu Ser Val Tyr Gln 50 55 60 Gln Val Met Thr Tyr Thr Asp Asp Ala Tyr Thr Thr Leu Phe Ser Glu 65 70 75 80 Leu Asp Phe Asp Ala Ile Thr Lys Thr Ile Val Lys Leu Pro Trp Tyr 85 90 95 Thr Thr Arg Leu Ser Ser Glu Ile Ala Ala Ala Leu Ala Ser Val Ser 100 105 110 Pro Ala Ser Ser Glu Ala Ala Ser Ser Ser Glu Ala Ala Ser Ser Ser 115 120 125 Lys Ala Ala Ser Ser Ser Glu Ala Thr Ser Ser Ala Ala Pro Ser Ser 130 135 140 Ser Ala Ala Pro Ser Ser Ser Ala Ala Pro Ser Ser Ser Ala Glu Ser 145 150 155 160 Ser Ser Lys Ala Val Ser Ser Ser Val Ala Pro Thr Thr Ser Ser Val 165 170 175 Ser Thr Ser Thr Val Glu Thr Ala Ser Asn Ala Gly Gln Arg Val Asn 180 185 190 Ala Gly Ala Ala Ser Phe Gly Ala Val Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu 195 200 205 Leu Leu 210 <210> 5 <211> 342 <212> DNA <213> Escherichia coli TOP10F <220> <221> gene <222> (46)..(159) <223> hybrid part <400> 5 aacccgtatg ttggctttga aatgggttac gactggttag gtcgtatgcc gtacaaaggc 60 agcgttgaaa acggtgcata caaagctcag ggcgttcaac tgaccgctaa actgggttac 120 ccaatcactg acgacctgga catctacact cgtctgggtg gcatggtatg gcgtgcagac 180 actaaatcca acgtttatgg taaaaaccac gacaccggcg tttctccggt cttcgctggc 240 ggtgttgagt acgcgatcac tcctgaaatc gctacccgtc tggaatacca gtggaccaac 300 aacatcggtg acgcacacac catcggcact cgtccggaca ac 342 <210> 6 <211> 237 <212> DNA <213> Escherichia coli TOP10F <220> <221> gene <222> (1)..(60) <223> signal peptide fragement <220> <221> gene <222> (61)..(237) <223> mature protein fragement <400> 6 atgaaagcta ctaaactggt actgggcgcg gtaatcctgg gttctactct gctggcaggt 60 tgctccagca acgctaaaat cgatcagctg tcttctgacg ttcagactct gaacgctaaa 120 gttgaccagc tgagcaacga cgtgaacgca atgcgttccg acgttcaggc tgctaaagat 180 gacgcagctc gtgctaacca gcgtctggac aacatggcta ctaaataccg caagtaa 237 <210> 7 <211> 633 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 7 atgtccgttt ccaagattgc tttcgtttta agtgccattg cctctttggc cgtcgctgac 60 accagcgccg ccgaaactgc tgaattgcaa gctattatcg gtgacatcaa ctctcatctt 120 tctgactact tgggtctaga aactggcaac agtggattcc aaattccatc tgatgtcttg 180 agtgtgtatc aacaagtcat gacttacacc gatgacgctt acactacctt gtttagtgaa 240 ttggactttg atgctatcac taagacaatt gttaaattgc catggtacac cacaagattg 300 agttctgaaa tcgctgctgc tcttgcctcc gtttccccag cttcttccga ggctgcatct 360 tcttccgagg ctgcatcttc ttccaaggct gcatcttctt ccgaagctac atcctctgcc 420 gctccatcct cttctgctgc cccatcttct tctgctgccc catcatcatc tgccgaatca 480 tcttctaagg ccgtttcttc ttctgtcgct ccaactacct cttctgtcag cacttctaca 540 gtcgaaactg cttccaatgc cggtcaaaga gtcaatgcag gcgctgcctc tttcggtgct 600 gttgttgcag gtgcagctgc tttattgtta taa 633

Claims (14)

1. CGTase가 숙주의 세포 표면에 발현되도록 하는 재조합 표면 발현 벡터로서,
   상기 벡터는 GPI 결합 단백질(glycosylphosphophatidyllinositol(GPI) anchored protein)과 CGTase를 코딩하는 유전자를 포함하는 것이고,
   상기 CGTase는 Geobacillus spp. 또는 Bacillus spp. 에서 유래된 것이고,
   상기 CGTase는 서열목록 1번의 아미노산 서열로 이루어지는 것이며,
   상기 CGTase를 코딩하는 유전자는 서열목록 2번의 염기서열로 이루어지는 것이고,
   상기 GPI 결합 단백질은 Saccharomyces cerevisiae 유래의 TIP1 단백질인 것이고,
   상기 TIP1 단백질은 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지는 것인, 벡터
   
2. 제1항에 따른 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
   
3. 제2항에 있어서, 상기 숙주 세포는 효모인 것인, 숙주 세포.
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