CN108277180A - 一株产环糊精葡萄糖基转移酶的罗汉果内生菌菌株及其筛选方法和应用 - Google Patents

一株产环糊精葡萄糖基转移酶的罗汉果内生菌菌株及其筛选方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株产环糊精葡萄糖基转移酶的罗汉果内生菌菌株及其筛选方法和应用，属于微生物技术领域。该菌株的名称为芽孢杆菌ND‑6(Bacillus sp.ND‑6)，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15227，保藏日期为2018年1月16日。本发明还公开了上述环糊精葡萄糖基转移酶的罗汉果内生菌菌株的筛选方法、利用上述产环糊精葡萄糖基转移酶的罗汉果内生菌菌株生产环糊精葡萄糖基转移酶的方法，以及该环糊精葡萄糖基转移酶的应用。本发明的罗汉果内生菌菌株，可以产生环糊精葡萄糖基转移酶，且该环糊精葡萄糖基转移酶的酶活高(10660‑11200U/mL)。

Description

一株产环糊精葡萄糖基转移酶的罗汉果内生菌菌株及其筛选 方法和应用
技术领域
本发明涉及一株产环糊精葡萄糖基转移酶的罗汉果内生菌菌株及其筛选方法和应用，属于微生物技术领域。
背景技术
罗汉果[Siraitia grosvenorii(Swingle)C.Jeffrey]为葫芦科罗汉果属的多年生宿根茎性藤本植物罗汉果的果实，是我国特有植物，生长于广西、广东、江西、湖南及贵州等地，其中广西桂林市永福县是罗汉果发源地和主产地。罗汉果果实富含多种人体必需氨基酸、微量元素以及多种维生素等，此外含有黄酮、多糖、甜苷和多酚等活性成分。现代药理研究证实，罗汉果具有多种药理作用如镇咳平喘、润肠通便、降血糖、抗氧化和提高免疫力等，具有良好的保健价值。
现代研究表明，罗汉果对各种疾病起主要效果的就是果实中含有比蔗糖甜300倍的强甜物质罗汉果甜苷V，但是它只占三萜总苷的30％-40％，含量低，致使甜苷V生产和使用成本高，应用范围受到严重制约。研究证实，罗汉果甜苷V是随着成熟度的增加由低苷类转化而来的，未成熟的嫩果中主要含有罗汉果苦苷A(mogroside ⅡE)，此外还有无味的罗汉果苷Ⅲ。而在化学结构上，罗汉果苦味皂苷与甜味皂苷拥有完全相同的苷元部分，主要区别在于苷元的3位和24位连接的葡萄糖链不同。如果苷元的3位和24位连接的葡萄糖残基总数为1-3个，是苦味的(即苷ⅡE，味苦)，连接的葡萄糖残基总数为4-6个时，则都是强甜味的(如甜苷V，味极甜)。
2011年Tang qi等人研究，罗汉果生长至50-70d，是罗汉果甜苷V急剧积累期，果实中调控罗汉果苷元糖基化的葡萄糖基转移酶(UDPG)基因表达水平大幅上调，说明罗汉果随着果实的成熟，在苦苷转化为甜苷的过程中，葡萄糖基转移酶发挥着重要的作用。但是，目前在生产中仍然存在大量的苦果，其来源大概有三种：一是由于气候等原因在罗汉果生长成熟季节中有可能一些低苷类没有转化为甜苷V；二是每年罗汉果生产季节的末期大量因生长期短未能成熟的果；三是罗汉果甜苷提取纯化过程中去掉的味苦的罗汉果苦苷。目前在罗汉果残次果(苦果)和罗汉果甜苷V的生产中所残余的罗汉果皂苷Ⅱ和皂苷Ⅲ尚未利用，一般都废弃，不但资源未能有效利用，而且对环境治理造成巨大的压力。
植物内生菌是指其生活史中某一阶段或整个阶段生活在生长健康的植物组织或细胞内，并对宿主植物没有引起明显病害症状的一类微生物群，其主要包括内生细菌、内生真菌、内生放线菌这三种类群。植物内生真菌独特多样性的微生物类群，造就了其非常丰富的次级代谢产物，是近年来人们寻找新型杀虫、抗菌、抗肿瘤、抗氧化等天然药物的重要资源。近年来，新药研究的一个热点问题在于天然药物的筛选，大多数情况下以天然产物为先导。近年来的研究表明，内生真菌与宿主协同进化，可以产生与宿主相同或相似的代谢产物。如果能从罗汉果中分离出内生菌，筛选出参与罗汉果甜苷形成的葡萄糖基转移酶，对于罗汉果苦苷的脱苦或者变为甜苷有着重要的实际应用意义。
但目前尚未有关产葡萄糖基转移酶的罗汉果内生菌的相关报道。鉴于此，有必要研发一株产葡萄糖基转移酶的罗汉果内生菌菌株，既可以解决罗汉果生产中所产生罗汉果皂苷Ⅱ和皂苷Ⅲ被废弃又污染环境的问题，又可变废为宝，避免资源浪费。
发明内容
本申请的发明人先从罗汉果根、茎和果实中分离出罗汉果内生菌菌株，再采用筛选培养基筛选出产环糊精葡萄糖基转移酶的罗汉果内生菌菌株，然后将该产环糊精葡萄糖基转移酶的罗汉果内生菌菌株用于生产环糊精葡萄糖基转移酶，该环糊精葡萄糖基转移酶既可用于罗汉果苦苷Ⅱ的脱苦，还可用于对无味的皂苷Ⅲ进行酶解并获得了甜味成分，并且在转化过程中获得了其它皂苷成分。
本发明的目的之一，是提供一株产环糊精葡萄糖基转移酶的罗汉果内生菌菌株。本发明的罗汉果内生菌菌株，可以产生环糊精葡萄糖基转移酶，且该环糊精葡萄糖基转移酶的酶活高(10660-11200U/mL)。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一株产环糊精葡萄糖基转移酶的罗汉果内生菌菌株，该菌株的名称为芽孢杆菌ND-6(Bacillus sp.ND-6)，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏单位地址：中国 北京，保藏编号为CGMCC No.15227，保藏日期为2018年1月16日。
本发明的目的之二，是提供一种上述产环糊精葡萄糖基转移酶的罗汉果内生菌菌株的筛选方法。本发明的筛选方法简单，能够快速筛选得到产环糊精葡萄糖基转移酶的罗汉果内生菌菌株。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种上述产环糊精葡萄糖基转移酶的罗汉果内生菌菌株的筛选方法，包括如下步骤：
步骤1：从罗汉果的根、茎和果实中分离、纯化出罗汉果内生菌菌株，接种于斜面培养基上，4℃保藏，备用；
步骤2：初筛
从步骤1的斜面培养基中，挑取罗汉果内生菌菌种，稀释涂布接种于第一筛选培养基平板上，30℃培养2-5d后，挑出有黄色透明圈的菌落并接种到液体发酵培养基中，于30℃、160r/min摇瓶培养2-3d，离心，取上清液，得到发酵液；
各取200μL发酵液，分别滴加至已打孔的新的第一筛选培养基平板上和第二筛选培养基平板上，40℃水浴反应30min，分别计算黄色透明圈的直径与洞孔直径的比值、白色透明圈的直径与洞孔直径的比值，分别选出比值最大的菌株、以及比值较大的3-5株菌株，作为初筛菌株；
步骤3：复筛
将步骤2得到的初筛菌株的发酵液进行酶活测定，选出酶活最高的菌株、以及酶活次高的菌株，作为复筛的菌株；
步骤4：再复筛
将步骤3得到的复筛菌株，接种到新的液体发酵培养基中，于37℃、 160r/min摇瓶培养2-3d，4000r/min离心10min，取上清液，得到含有酶的发酵液，进行酶活测定，最后对比步骤3复筛的结果，选出酶活高且稳定的菌株，即得到产环糊精葡萄糖基转移酶的罗汉果内生菌菌株。
本发明的步骤1中，罗汉果生长于广西桂林市龙胜县。
步骤1中，从罗汉果的根、茎和果实中分离、纯化出罗汉果内生菌菌株的方法为：
罗汉果材料的消毒：在超净工作台上，将洗净的罗汉果根、茎和果实，分别用以下方法进行表面消毒处理。
根：先用75％(v/v)酒精浸泡2min，再用质量百分数为3.0％的NaClO 溶液浸泡5min，然后用75％(v/v)酒精浸泡30s,最后用无菌水冲洗5次，每次5min。
茎：先用75％(v/v)酒精浸泡3min，再用质量百分数为3.0％的NaClO 溶液浸泡8min，然后75％(v/v)酒精浸泡30s，最后用无菌水冲洗5次，每次5min。
果实：先用75％(v/v)酒精浸泡3min，无菌水冲洗2次，再用质量百分数为3.0％的NaClO溶液浸泡10min，无菌水冲洗2次，最后用75％(v/v) 酒精浸泡30s，无菌水冲洗3次，每次5min。
在以上的根、茎和果实在表面消毒处理中最后一次无菌水冲洗的下来的水中，吸取1mL涂布于PDA培养基平板上(至少设三个重复),在30℃培养 5d，做为阴性对照。如果阴性对照上没有任何微生物菌落生长，则为消毒合格，可以进行下一步罗汉果组织材料的剪切和接种。
对已完成表面消毒处理的罗汉果的根、茎和果实进行剪切，取大小约为 0.5cm×0.5cm×0.2cm的组织，分别接种到PDA培养基平板上(至少设三个重复)，分别置于26℃、37℃培养，观察生长情况，待PDA培养基平板上罗汉果组织周围长出菌落，分别挑起各菌落再在PDA培养基平板上稀释涂布进行分离、纯化，最后得到各个单的菌落，即得到罗汉果内生菌菌株。
其中，PDA培养基由如下方法制备得到：称取已去皮马铃薯200g，切块，煮30min，四层纱布过滤，加入蔗糖20g，琼脂20g，水定容至1000mL，自然pH值，0.1MPa下121℃灭菌30min。
步骤1中，罗汉果内生菌菌株，接种于斜面培养基上，4℃保藏，是普通菌种保藏的方法，为保持菌种活力一般3个月转接一次，备用。
步骤2中，已打孔的新的第一筛选培养基平板上和第二筛选培养基平板，是指在第一筛选培养基平板上和第二筛选培养基平板上，用10mm的打孔器，将培养基进行打孔。打孔的目的是在筛选目的菌株时用于加入各个内生菌株的发酵液以便观察是否其中含有目的酶——环糊精葡萄糖基转移酶，如有该酶的产生则会和平板上的底物发生反应，会在洞的周围出现特征的颜色。
当发酵液(可能含有目的酶)分别滴加至已打孔的新的第一筛选培养基平板上和第二筛选培养基平板上，40℃水浴反应30min后，如果第一筛选培养基平板上的洞周围出现黄色透明圈，其原因是酚酞在环糊精的疏水空腔内会形成无色的二价阴离子，表明有环糊精生成，说明该菌株所产酶具有环化作用；同时，如果第二筛选培养基平板上的洞周围出现透明圈，说明该菌株所产酶具有水解淀粉的作用，两种现象都出现则说明罗汉果内生菌产生了环糊精葡萄糖基转移酶。
步骤3中，酶活的测定方法为[1,2]：
取10μL稀释的待测发酵液(含有目的酶)，加入0.2mol/L pH值为9.0 的甘氨酸-NaOH缓冲液0.2mL，再加入0.2mL的质量百分数为0.2％的马铃薯淀粉溶液，震荡，于40℃水浴10min后，立即加入0.5mol/L的醋酸0.5mL，终止反应，然后加入质量百分数为0.005％的碘液显色。同时以蒸馏水为空白，以不加酶液为对照，在700nm波长下测定吸光度(OD)。每分钟使吸光度下降10％的酶量定义为一个酶活单位。
计算公式为：
一个酶活单位(U/mL)＝(a-b)/a×1000×酶液稀释倍数
式中：a为对照组的吸光度；b为样品的吸光度。
步骤4中，将步骤3得到的复筛菌株，接种到液体发酵培养基中时，每株菌株至少设三个重复。酶活高且稳定，是指初筛和复筛时菌株所产的酶活最高且数据稳定。其中，稳定是指本发明的菌株所产的酶，无论是初筛还是复筛，所得到的酶活都在一定范围内的。
此外，本申请的发明人根据初筛所得菌株的平板菌落特征——浅黄色、粘稠状、易挑起，以及只能通过显微镜的油镜下才能观察到菌体特征这些特点，可初步判定步骤2得到的初筛菌株的类型为细菌。因此，在步骤4中，培养温度采用细菌的培养适温37℃。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，步骤1中，所述斜面培养基由可溶性淀粉10g、蛋白胨5g、酵母浸膏5g、K2HPO4 0.2g、MgSO4·7H2O 0.2g、Na2CO3 0.1g、琼脂20g和水1L 组成，自然pH值。
上述斜面培养基在使用前，先于0.1MPa下121℃灭菌15min。
进一步，步骤2中，所述第一筛选培养基由可溶性淀粉10g、蛋白胨5g、酵母浸膏10g、K2HPO4 0.2g、MgSO4·7H2O 0.2g、Na2CO3 0.1g、酚酞0.3g、甲基橙0.1g、琼脂20g和水1L组成，混合均匀后，自然pH值。
采用上述进一步的有益效果是：环糊精葡萄糖基转移酶在第一筛选培养基中产生环糊精，环糊精可与酚酞染料反应形成包结复合物，从而可在第一筛培养基平板上出现黄色透明圈(环化作用)。
上述第一筛选培养基在使用前，先于0.1MPa下121℃灭菌15min。
进一步，步骤2和步骤4中，所述液体发酵培养基均由可溶性淀粉10g、蛋白胨5g、酵母浸膏12g、K2HPO4 0.2g、MgSO4·7H2O 0.2g、Na2CO3 0.1g和水1L组成，混合均匀后，自然pH值。
上述液体发酵培养基在使用前，先于0.1MPa下121℃灭菌15min。
进一步，步骤2中，所述离心的转速为4000r/min，时间为10min。
进一步，步骤2中，所述第二筛选培养基由如下方法制备得到：称取已去皮马铃薯200g,切块，煮沸30min，四层纱布过滤，加入蔗糖20g、琼脂 20g和可溶性淀粉20g，水定容至1L，自然pH值。
采用上述进一步的有益效果是：第二筛选培养基中的可溶性淀粉在环糊精葡萄糖基转移酶的水解作用下变成透明圈(水解作用)。因为葡萄糖基转移酶应同时应具有水解作用和环化作用，通过同一菌株在上述两种筛选培养基上出现的特征所筛选出的菌株正是本发明的目的菌株。
上述第二筛选培养基在使用前，先于0.1MPa下121℃灭菌15min。
进一步，步骤2中，所述打孔的孔径为10mm，所述平板的直径为12cm。
进一步，步骤4中，所述离心的转速为4000r/min，时间为10min。
本发明的产环糊精葡萄糖基转移酶的罗汉果内生菌菌株，具有以下特性：
(1)个体形态：菌体呈杆状，革兰氏染色为阳性，有芽孢，且芽孢位于菌体中间。
(2)在固体培养基(配方详见上述斜面培养基)平板上的菌落性状：菌落呈圆形、中间皱起，边缘平整，略带黄色。
(3)在液体发酵培养基中发酵液较混浊，液面有菌膜，底有絮状沉淀。
(4)生长温度30-45℃，pH值自然；产酶适温45-55℃，pH值8.0，好氧；酶反应温度35-50℃，酶作用的适宜pH值为6.0。
(5)金属离子除Ca2+对环糊精葡萄糖基转移酶有促进作用，其它金属离子对环糊精葡萄糖基转移酶有不同程度的抑制作用，其抑制程度的大小依次为Mn2+＞Fe2+＞Li+＞Cu2+＞Mg2+＞Na+＞K+。
本发明的产环糊精葡萄糖基转移酶的罗汉果内生菌菌株的鉴定
本申请的发明人将上述筛选得到的产环糊精葡萄糖基转移酶的罗汉果内生菌菌株暂时命名为ND-6。为了进一步确定菌株ND-6的种属,用细菌的 16S rDNA通用引物从ND-6的基因组DNA中PCR扩增得到1条1445bp的条带, 将PCR扩增产物测序,获得的序列进行同源序列检索(送检单位：北京六合华大基因科技有限公司武汉分公司),结果显示ND-6与Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus subtilis、Bacillus sp.、Bacillus velezensis等的16S rDNA序列同源性超过99％。因此，菌株ND-6在分子系统发育分类学上鉴定为Bacillussp.，即芽孢杆菌属。该结果与生理生化鉴定结果相符，因此综合菌落形态、菌体形态特征观察、分子生物学测序结果，最终确定ND-6菌株为芽孢杆菌，命名为Bacillussp.ND-6，简称ND-6。
本发明的目的之三，是提供利用上述产环糊精葡萄糖基转移酶的罗汉果内生菌菌株生产环糊精葡萄糖基转移酶的方法。本发明采用上述产环糊精葡萄糖基转移酶的罗汉果内生菌菌株Bacillus sp.ND-6为出发菌株，接种在液体产酶培养基中，经液体好氧发酵后，离心，再经硫酸铵分步沉淀法和柱层析法，制得环糊精葡萄糖基转移酶。本发明的环糊精葡萄糖基转移酶可实现转糖基的作用，既可使罗汉果苦苷脱去苦味，使无味的罗汉果苷变为甜味的甙Ⅳ等，亦可催化可溶性淀粉生成环糊精。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种利用上述产环糊精葡萄糖基转移酶的罗汉果内生菌菌株生产环糊精葡萄糖基转移酶的方法，包括如下步骤：
步骤1：发酵产酶
步骤1.1：斜面菌种活化
斜面培养基由可溶性淀粉10g、蛋白胨5g、酵母浸膏5g、K2HPO4 0.2g、 MgSO4·7H2O0.2g、Na2CO3 0.1g、琼脂20g和水1L组成，自然pH值；
将上述产环糊精葡萄糖基转移酶的罗汉果内生菌菌株划线接种于上述试管斜面培养基上，于37℃培养12h，即得活化的斜面菌种；
步骤1.2：种子培养
种子培养基由可溶性淀粉10g、蛋白胨5g、酵母浸膏5g、K2HPO4 0.2g、 MgSO4·7H2O0.2g、Na2CO3 0.1g和水1L组成，自然pH值；
用接种环挑取步骤1.1得到的活化的斜面菌种，接入装有种子培养基的锥形瓶中，于37℃、160r/min摇床培养24h，即得种子液；
步骤1.3：产酶发酵
产酶发酵培养基由环糊精10g、蛋白胨5g、酵母浸膏10g、K2HPO4 0.2g、 MgSO4·7H2O 0.2g、Na2CO3 0.1g、CaCO3 0.1g和水1L组成，pH值调至8.0；
将步骤1.2得到种子液按照10％(v/v)-15％(v/v)的接种量，接入装有600mL产酶发酵培养基的1000mL锥形瓶中，先于37℃、120r/min摇床培养16h，再于40-45℃、160r/min摇床培养56h，然后离心，收集上清液；
步骤2：酶初步纯化
在步骤1.3收集的上清液中加入终浓度为10％-30％的硫酸铵，4℃冷藏 12h,离心，收集上清液；在上清液中，再加入终浓度为40％-80％的硫酸铵，4℃冷藏过夜，收集沉淀物，冷冻干燥后，得到粗酶，再用去离子水溶解为质量百分数为10％-15％的粗酶溶液；
步骤3：酶进一步纯化
将步骤2得到的粗酶溶液进行透析，得到透析后的酶液；
步骤4：离子交换层析
将步骤3得到的透析后的酶液上样于已经经过缓冲液平衡好的DEAE-琼脂糖凝胶柱或DEAE-52纤维素柱中，用洗脱液进行洗脱，分别收集洗脱液, 分别测定其酶活和蛋白质浓度，合并具有酶活的洗脱液，得到收集样；
步骤5：凝胶层析
将步骤4得到的收集样进行Sephadex G-200分子筛层析，用洗脱液进行洗脱，分别收集洗脱液，分别测定其酶活和蛋白质浓度，合并具有酶活的洗脱液，冷冻干燥后，即得环糊精葡萄糖基转移酶。
本发明的步骤1.2中，所述用接种环挑取步骤1.1得到的活化的斜面菌种，接入装有种子培养基的锥形瓶中，具体是指用接种环挑取5接种环的步骤1.1得到的活化的斜面菌种，接入装有70mL种子培养基的250mL锥形瓶中。
步骤1.3中，所述装有产酶发酵培养基的锥形瓶，具体是指装有600mL 产酶发酵培养基的1000mL锥形瓶。
步骤1.3中，收集的上清液经测定，所产酶活高达10660-11200U/mL。该产酶发酵培养基适于发酵产酶，是本发明以环糊精葡萄糖基转移酶的活力为指标，在反复优化试验基础上获得的高产酶培养基配方。且产酶发酵采用分段发酵法，就是菌体生长温度和发酵产酶的温度是不同的。菌体生长阶段温度为37℃，120r/min摇床培养16h；发酵产酶的温度为40-45℃、160r/min 摇床培养56h。
步骤1.1中的斜面培养基、步骤1.2中的种子培养基和步骤1.3中的产酶发酵培养基，在使用前，均需在0.1MPa下121℃灭菌15min。
步骤2中，在步骤1.3收集的上清液中加入终浓度为10％-30％的硫酸铵，是为了析出杂蛋白。然后，再加入终浓度为40％-80％的硫酸铵，是为了析出目的蛋白。
步骤4中，所述蛋白质浓度的测定方法[3]为：
蛋白质标准曲线的制备，以牛血清白蛋白为标准样品，测定280nm波长下的吸光度，绘制标准曲线，得到得回归方程。
样品蛋白质含量的测定：分别测定待测液在280nm波长下的吸光度，对照蛋白质标准曲线，求出蛋白质含量。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，步骤1.3中，所述离心的转速为4000r/min，时间为10min。
进一步，步骤2中，所述离心的转速为5000r/min，时间为20min。
进一步，步骤2中，所述冷冻的温度为0-10℃。
进一步，步骤3中，所述透析的具体方法为：
将步骤2得到的粗酶溶液置于透析袋中，在透析液中透析20h，期间每隔6h更换一次透析液，共更换两次透析液，其中，所述粗酶溶液与透析液的体积比为1:10-1:30。
更进一步，所述透析液为pH值为7.0的磷酸钠缓冲液。
更进一步，所述透析，在结束时用质量百分数为1％的BaCl2溶液检查硫酸铵是否残存。
进一步，步骤4中，所述缓冲液为pH值为7.0的磷酸钠缓冲液；所述 DEAE-琼脂糖凝胶析柱或DEAE-52纤维素柱的内径均为2.5cm，高度均为 65cm；所述洗脱液为含1.0-1.5mol/L KCI溶液的pH值为7.0的磷酸钠缓冲液；所述洗脱液为4mL/管；所述洗脱的流速为2mL/min；所述洗脱的体积为 3-5个柱体积。
进一步，步骤4中，所述合并具有酶活的洗脱液为测定各收集管在280nm 下的光吸收值和各管的酶活力，合并有酶活力的各收集管的酶液。
一般说来在整个洗脱过程中各洗脱管中酶活的高低呈正态分布，其中占正态分布80％的区域中各管的酶活较高。即一开始洗脱时是没有的，然后慢慢增多，达到最大值，然后又慢慢减少的至没有的过程。一般就把占正态分布80％的各管收集起来。
进一步，步骤5中，所述洗脱液为含1.0-1.5mol/L KCI溶液的pH值为 7.0的磷酸钠缓冲液；所述分别收集洗脱液为4mL/管；所述洗脱的流速为 0.4mL/min；所述洗脱的体积为3-5个柱体积。
进一步，步骤5中，所述合并具有酶活的洗脱液为测定各收集管在280nm 下的光吸收值和各管的酶活力，合并有酶活力的各收集管的酶液。
进一步，步骤5中，所述环糊精葡萄糖基转移酶的纯度≥95.6％。
本发明的目的之四，是提供利用上述环糊精葡萄糖基转移酶在罗汉果苦苷转化中的应用。本发明的环糊精葡萄糖基转移酶可以用于具有苦味的未成熟的罗汉果残次果的苦苷转化中，在罗汉果残次果加工利用领域具有广阔的应用前景。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：上述环糊精葡萄糖基转移酶在罗汉果苦苷转化中的应用。
现有技术中，罗汉果皂苷的脱苦用也可以用其它的环糊精葡萄糖基转移酶，但是没有本发明的优势。因为本发明的环糊精葡萄糖基转移酶是来自于罗汉果共生的内生菌，由于同源性，这个酶更加适用于罗汉果苦苷的转化，转化率高，效果好。同时，本发明筛选的罗汉果内生菌所产的环糊精葡萄糖基转移酶的酶活高达11200U/mL，也提高了罗汉果苦苷转化效率。
本申请的发明人发现，上述发酵所产的环糊精葡萄糖基转移酶对罗汉果苦苷ⅡE转化最佳作用条件为：用pH值为6.6的磷酸缓冲液将罗汉果苦苷ⅡE配成浓度为1mg/mL的罗汉果苦苷ⅡE溶液，将底物(可溶性淀粉或β- 环糊精)用去离子水配制成浓度为3-7mg/mL的底物溶液。取1mL罗汉果苦苷ⅡE溶液、1mL底物溶液和12μL环糊精葡萄糖基转移酶溶液(用pH值6.6 的磷酸缓冲液配制成的含有1000U/mL的酶液)，反应温度50℃、反应时间 18-24h，得到脱苦的转化产物。
以罗汉果苦苷ⅡE为对照。将脱苦的转化产物和罗汉果苦苷ⅡE溶液分别置于沸水浴中灭酶30min后，冷却至室温，感官品尝。
上述脱苦的转化产物经20人品尝，与对照相比，苦味明显减轻。
本申请的发明人发现，上述环糊精葡萄糖基转移酶对罗汉果苷Ⅲ转化最佳作用条件为：用pH值为6.6的磷酸缓冲液将罗汉果苷Ⅲ配成浓度为1mg/mL 的罗汉果苷Ⅲ溶液，底物(可溶性淀粉或β-环糊精)用去离子水配制成浓度为3-5mg/mL的底物溶液。取10mL罗汉果苷Ⅲ溶液、10mL底物溶液和8μ L环糊精葡萄糖基转移酶溶液(用pH值为6.6的磷酸缓冲液配制成的含有1000U/mL的酶液)，反应温度45℃、反应时间16-20h，得到甜味的转化产物。
以罗汉果苷Ⅲ为对照，罗汉果苷Ⅲ为无味。将甜味的转化产物和罗汉果苷Ⅲ分别置于沸水浴中灭酶30min后，冷却至室温，感官品尝。
上述甜味的转化产物经20人品尝，与对照相比，有较强的甜味。
本发明的目的之五，是提供利用上述环糊精葡萄糖基转移酶在罗汉果皂苷转化中的应用。本发明的环糊精葡萄糖基转移酶可以用于罗汉果皂苷转化中，在罗汉果残次果加工利用领域具有广阔的应用前景。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：上述环糊精葡萄糖基转移酶在罗汉果皂苷转化中的应用。
本申请的发明人采用二步转化法，用上述环糊精葡萄糖基转移酶转化罗汉果皂苷(苦苷ⅡE或苷Ⅲ)。上述二步转化法，是直接用含有环糊精葡萄糖基转移酶的发酵液进行转化，不用纯化酶和苦苷。
具体方法为：
用接种环将斜面培养基上的产环糊精葡萄糖基转移酶的罗汉果内生菌菌种，无菌接种到新鲜的种子培养基中(250mL锥形瓶装100mL种子培养基)， 37℃，160r/min条件下培养12-16h，待菌体浓度达到107-109个/mL，即得种子培养液。以5％-10％的接种量将上述种子培养液接种至新鲜液体发酵培养基中(1000mL锥形瓶装500-650mL液体培养基)。
在40-45℃、160r/min摇床培养60h，然后再加入罗汉果皂苷(苦苷ⅡE 或苷Ⅲ)溶液(最终在溶液中的浓度为8-12mg/mL)和底物(可溶性淀粉或β-环糊精，最终在溶液中的浓度为20mg/mL)，在50℃条件下保温24-36h。保温结束后，在4000r/min条件下离心20-30min，得到含有转化产物的溶液。
本申请的发明人采用三步转化法，用上述环糊精葡萄糖基转移酶转化罗汉果皂苷(苦苷ⅡE或苷Ⅲ)。上述三步法，也是直接用含有酶的发酵液进行转化，不用纯化酶和苦苷，但是发酵的过程比二步转化法多了一步。
具体方法为：
用接种环将斜面培养基上的产环糊精葡萄糖基转移酶的罗汉果内生菌菌种，无菌接种到新鲜的液体种子培养基中(250mL锥形瓶装100mL液体培养基)，37℃，160r/min条件下培养12-14h，待菌体浓度达到 107-109个/mL，即得种子培养液。以5％-10％的接种量将上述种子培养液接种至新鲜液体种子培养基中(1000mL锥形瓶装500mL-650mL液体培养基)。相同的条件下继续培养12-14h，待菌体浓度达到106-108个/mL时，以10％-15％的接种量接种到发酵培养基中，在40-45℃、160r/min摇床培养48h，然后加入罗汉果皂苷(苦苷ⅡE或苷Ⅲ)溶液(最终在溶液中的浓度为8-12mg/mL) 和底物(可溶性淀粉或β-环糊精，最终在溶液中的浓度为30mg/mL)，在 50℃条件下保温24-36h。保温结束后，在4000r/min条件下，离心15-25min，得到含有转化产物的溶液。
转化产物的分离纯化
将含有转化产物的发酵液置于分液漏斗中，第一次加入发酵液1/2-1/3 体积的正丁醇，充分振荡，静置分层，分离出上层正丁醇相。下层发酵液再加入下层发酵液1/4-1/6体积的正丁醇，同法萃取2次。将所得到的正丁醇相合并减压蒸馏，蒸干后用10％(v/v)的乙醇溶解，得到含有上述转化产物的10％(v/v)的乙醇溶液，然后采用HP-20大孔吸附树脂纯化。
HP-20大孔吸附树脂纯化条件如下：将含有上述转化产物的10％(v/v) 的乙醇溶液上样直至不吸附为止，静置吸附3h，然后去离子水洗脱体积3BV，流速3BV/h；30％(v/v)乙醇洗脱杂质流速3BV/h，洗脱体积3-5BV；70％(v/v) 乙醇洗脱转化产物，流速3BV/h，洗脱体积3-5BV；再用90％(v/v)乙醇溶液洗脱，流速3BV/h，洗脱体积3BV；分别收集各洗脱液。
将70％(v/v)乙醇溶液洗脱所得液体浓缩回收乙醇得到转化产物，再冷冻干燥，得到罗汉果皂苷(苦苷ⅡE或苷Ⅲ)转化后的产物。将90％(v/v) 乙醇溶液洗脱所得液体浓缩回收乙醇得到转化产物，再冷冻干燥，得到其它转化产物。
上述罗汉果皂苷(苦苷ⅡE或苷Ⅲ)转化后的产物，即为甜味的罗汉果甜甙,可以作为甜味剂添加于食品中。而其它转化产物，即为其它甙类，可以作为研究其它生理活性的化合物。
本发明的有益效果是：
1.本发明的罗汉果内生菌菌株，可以产生环糊精葡萄糖基转移酶，且该环糊精葡萄糖基转移酶的酶活高(10660-11200U/mL)。
2.本发明的筛选方法简单，能够快速筛选得到产环糊精葡萄糖基转移酶的罗汉果内生菌菌株。
3.本发明的环糊精葡萄糖基转移酶可实现转糖基的作用，既可使罗汉果苦甙脱去苦味，使无味的罗汉果甙变为甜味的甙，亦可催化可溶性淀粉生成环糊精。
4.本发明的环糊精葡萄糖基转移酶可以用于具有苦味的未成熟的罗汉果残次果的苦苷转化中，在罗汉果残次果加工利用领域具有广阔的应用前景。
5.本发明的环糊精葡萄糖基转移酶可以用于罗汉果皂苷转化中，转化后得到新的结构的罗汉果皂苷化合物，为更多应用提供基础材料，在罗汉果加工利用领域具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明的产环糊精葡萄糖基转移酶的罗汉果内生菌菌株的菌落图。
图2为本发明的产环糊精葡萄糖基转移酶的罗汉果内生菌菌株细胞形态及芽孢染色图(10X显微镜视野)。
图3为本发明的产环糊精葡萄糖基转移酶的罗汉果内生菌菌株初筛中菌株发酵液在第一筛选培养基平板上的变色圈图。图中浅黄色部分为甲基橙背景下环糊精－酚酞的无色复合物，红色部分为含有甲基橙与酚酞的背景色。
图4为本发明的产环糊精葡萄糖基转移酶的罗汉果内生菌菌株初筛中菌株发酵液在第一筛选培养基平板上的变色圈图的空白对照图。
图5为本发明的产环糊精葡萄糖基转移酶的罗汉果内生菌菌株初筛中菌株在第二筛选培养基平板上的透明圈图。
图6为pH值对本发明的罗汉果内生菌菌株产环糊精葡萄糖基转移酶活性的影响。
图7为温度对本发明的罗汉果内生菌菌株产环糊精葡萄糖基转移酶活性的影响。
图8为本发明的产环糊精葡萄糖基转移酶的罗汉果内生菌菌株的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物图。
图9为本发明的产环糊精葡萄糖基转移酶的罗汉果内生菌菌株的系统发育图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1：一株产环糊精葡萄糖基转移酶的罗汉果内生菌菌株
一株产环糊精葡萄糖基转移酶的罗汉果内生菌菌株，该菌株的名称为芽孢杆菌ND-6(Bacillus sp.ND-6)，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)， 保藏编号为CGMCC No.15227，保藏日期为2018年1月16日。
实施例2：一种上述产环糊精葡萄糖基转移酶的罗汉果内生菌菌株的筛选方法
一种上述产环糊精葡萄糖基转移酶的罗汉果内生菌菌株的筛选方法，包括如下步骤：
步骤1：从罗汉果的根、茎和果实中分离、纯化出罗汉果内生菌菌株的方法为：
罗汉果材料的消毒：在超净工作台上，将洗净的罗汉果根、茎和果实，分别用以下方法进行表面消毒处理。
根：先用75％(v/v)酒精浸泡2min，再用质量百分数为3.0％的NaClO 溶液浸泡5min，然后用75％(v/v)酒精浸泡30s,最后用无菌水冲洗5次，每次5min。
茎：先用75％(v/v)酒精浸泡3min，再用质量百分数为3.0％的NaClO 溶液浸泡8min，然后75％(v/v)酒精浸泡30s，最后用无菌水冲洗5次，每次5min。
果实：先用75％(v/v)酒精浸泡3min，无菌水冲洗2次，再用质量百分数为3.0％的NaClO溶液浸泡10min，无菌水冲洗2次，最后用75％(v/v) 酒精浸泡30s，无菌水冲洗3次，每次5min。
在以上的根、茎和果实在表面消毒处理中最后一次无菌水冲洗的下来的水中，吸取1mL涂布于PDA培养基平板上(至少设三个重复),在30℃培养5d，做为阴性对照。如果只有阴性对照上没有任何微生物菌落生长，则为消毒合格，可以进行下一步罗汉果组织材料的剪切和接种。
对已完成表面消毒处理的罗汉果的根、茎和果实进行剪切，取大小约为 0.5cm×0.5cm×0.2cm的组织，分别接种到PDA培养基平板上(至少设三个重复)，分别置于26℃、37℃培养，观察生长情况，待PDA培养基平板上罗汉果组织周围长出菌落，分别挑起各菌落再在PDA培养基平板上稀释涂布进行分离、纯化，最后得到各个单的菌落，即得到罗汉果内生菌菌株。
其中，PDA培养基由如下方法制备得到：称取已去皮马铃薯200g，切块，煮30min，四层纱布过滤，加入蔗糖20g，琼脂20g，水定容至1000mL，自然pH值，0.1MPa下121℃灭菌30min。
将罗汉果内生菌菌株接种于斜面培养基上，4℃保藏，备用。
其中，所述斜面培养基由可溶性淀粉10g、蛋白胨5g、酵母浸膏5g、K2HPO4 0.2g、MgSO4·7H2O 0.2g、Na2CO3 0.1g、琼脂20g和水1L组成，自然pH值， 0.1MPa下121℃灭菌15min。
步骤2：初筛
从步骤1的斜面培养基中，挑取罗汉果内生菌菌种，接种于第一筛选培养基平板上，30℃培养2-5d后，挑出有黄色透明圈的菌落、并接种到液体发酵培养基中，于30℃、160r/min摇瓶培养2-3d，4000r/min离心10min，取上清液，得到发酵液(可能含有目的酶)。
其中，所述第一筛选培养基由可溶性淀粉10g、蛋白胨5g、酵母浸膏10g、 K2HPO40.2g、MgSO4·7H2O 0.2g、Na2CO3 0.1g、酚酞0.3g、甲基橙0.1g、琼脂20g和水1L组成，混合均匀后，自然pH值，0.1MPa下121℃灭菌15min。
所述液体发酵培养基由可溶性淀粉10g、蛋白胨5g、酵母浸膏12g、K2HPO4 0.2g、MgSO4·7H2O 0.2g、Na2CO3 0.1g和水1L组成，混合均匀后，自然pH 值，0.1MPa下121℃灭菌15min。
各取200μL发酵液(可能含有目的酶)，分别滴加至已打孔的新的第一筛选培养基平板上和第二筛选培养基平板上，40℃水浴反应30min，分别计算黄色透明圈的直径与洞孔直径的比值(如图3、图4所示)、白色透明圈的直径与洞孔直径的比值(如图5所示)，分别选出比值最大的菌株、以及比值较大的3-5株菌株，作为初筛菌株。
其中，所述打孔的孔径为10mm，所述平板的直径为12cm。
所述第二筛选培养基由如下方法制备得到：称取已去皮马铃薯200g,切块，煮沸30min，四层纱布过滤，加入蔗糖20g、琼脂20g和可溶性淀粉20g，水定容至1L，自然pH值，0.1MPa下121℃灭菌15min。
步骤3：复筛
将步骤2得到的初筛菌株的发酵液(含有目的酶)进行酶活测定，选出酶活最高的菌株、以及酶活次高的菌株，作为复筛菌株。
其中，酶活的测定方法为：
取10μL稀释的待测发酵液(含有目的酶)，加入0.2mol/L pH值为9.0 的甘氨酸-NaOH缓冲液0.2mL，再加入0.2mL的质量百分数为0.2％的马铃薯淀粉溶液，震荡，于40℃水浴10min后，立即加入0.5mol/L的醋酸0.5mL，终止反应，然后加入质量百分数为0.005％的碘液显色。同时以蒸馏水为空白，以不加酶液为对照，在700nm波长下测定吸光度(OD)。使吸光度下降10％的酶量定义为一个酶活单位。
计算公式为：
一个酶活单位(U/mL)＝(a-b)/a×1000×酶液稀释倍数
式中：a为对照组的吸光度；b为样品的吸光度。
步骤4：再复筛
将步骤3得到的复筛菌株，接种到新的液体发酵培养基中，于37℃、 160r/min摇瓶培养2-3d，离心，取上清液，得到含有酶的发酵液，进行酶活测定，最后对比步骤3复筛的结果，选出酶活高且稳定的菌株，即得到产环糊精葡萄糖基转移酶的罗汉果内生菌菌株。
其中，所述液体发酵培养基由可溶性淀粉10g、蛋白胨5g、酵母浸膏12g、 K2HPO40.2g、MgSO4·7H2O 0.2g、Na2CO3 0.1g和水1L组成，混合均匀后，自然pH值，0.1MPa下121℃灭菌15min。
实施3：上述产环糊精葡萄糖基转移酶的罗汉果内生菌菌株的鉴定
如图1、图2所示，产环糊精葡萄糖基转移酶的罗汉果内生菌菌株，具有以下特性：
(1)个体形态：菌体呈杆状，革兰氏染色为阳性，有芽孢，且芽孢位于菌体中间。
(2)在固体培养基(配方详见上述斜面培养基)平板上的菌落性状：菌落呈圆形、中间皱起，边缘平整，略带黄色。
(3)在液体发酵培养基中发酵液较混浊，液面有菌膜，底有絮状沉淀。
(4)生长温度30-45℃，自然pH值；产酶温度35-45℃，pH值8.0，好氧；酶反应温度35-50℃，酶作用的适宜pH值为6.0。
金属离子对本发明的产环糊精葡萄糖基转移酶的罗汉果内生菌菌株酶活性的影响，如表1所示。
表1金属离子对本发明的产环糊精葡萄糖基转移酶的罗汉果内生菌菌株酶活性的影响
由表1可知，金属离子除Ca2+对环糊精葡萄糖基转移酶有促进作用，其它金属离子对环糊精葡萄糖基转移酶有不同程度的抑制作用，其抑制程度的大小依次为Mn2+＞Fe2+＞Li+＞Cu2+＞Mg2+＞Na+＞K+。
pH值对本发明的罗汉果内生菌菌株所产的环糊精葡萄糖基转移酶活性的影响，详见图6。由图6可知，该酶在pH值为5.0-7.0范围内的相对酶活都在75％以上，其中在pH值为6.0时，该酶活力达到最高峰；在pH值低于 5.0或高于7.0时，酶活力都会下降。该酶稳定的pH值为5.0-6.0。
温度对本发明的罗汉果内生菌菌株所产的环糊精葡萄糖基转移酶活性的影响，详见图7。如图7所示，该酶最适作用温度为60℃，相对酶活达到最高值；当温度在30-60℃范围内，随温度的升高，相对酶活力升高；当温度大于60℃时，该酶随温度的升高，相对酶活迅速下降。热稳定性研究发现，该酶在30-50℃时比较稳定，保温0.5h后酶活力保持84％以上，说明该酶对温度不太敏感，热稳定性较高。
本申请的发明人将上述筛选得到的产环糊精葡萄糖基转移酶的罗汉果内生菌菌株暂时命名为ND-6。该菌株的基因组DNA采用酶解法提取，得到的 DNA样品储存于-20℃，将该DNA样品作为DNA模板进行16S rRNA基因PCR 扩增：
上游引物27f：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'(如SEQID NO.2所示)；
下游引物1492r：5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'(如SEQID NO.3所示)。
反应体系为：
16S rDNA PCR扩增程序为：
PCR产物送北京六合华大基因科技有限公司武汉分公司测序；测序结果如SEQIDNO.1所示。产环糊精葡萄糖基转移酶的罗汉果内生菌菌株的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物图,如图8所示。自上而下，Marker条带组成分别为100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp、3000bp和5000bp。其中，750bp条带浓度为60ng/3μL,显示为加亮带，其余条带浓度均为 30ng/3μL。经扩增，得到1条1445bp的条带。
将所测得的16S rDNA序列进行同源序列检索,如图9所示，ND-6与 Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus subtilis、Bacillus sp.、Bacillus velezensis等的16S rDNA序列同源性超过99％。因此，菌株ND-6在分子系统发育分类学上鉴定为Bacillus sp.，即芽孢杆菌属。该结果与生理生化鉴定结果相符，因此综合菌落形态、菌体形态特征观察、分子生物学测序结果，最终确定ND-6菌株为芽孢杆菌，命名为Bacillus sp.ND-6，简称ND-6。
实施例3
一种利用上述产环糊精葡萄糖基转移酶的罗汉果内生菌菌株生产环糊精葡萄糖基转移酶的方法，包括如下步骤：
步骤1：发酵产酶
步骤1.1：斜面菌种活化
斜面培养基由可溶性淀粉10g、蛋白胨5g、酵母浸膏5g、K2HPO4 0.2g、 MgSO4·7H2O0.2g、Na2CO3 0.1g、琼脂20g和水1L组成，自然pH值；
将上述产环糊精葡萄糖基转移酶的罗汉果内生菌菌株划线接种于上述试管斜面培养基上，于37℃培养12h，即得活化的斜面菌种；
步骤1.2：种子培养
种子培养基由可溶性淀粉10g、蛋白胨5g、酵母浸膏5g、K2HPO4 0.2g、MgSO4·7H2O0.2g、Na2CO3 0.1g和水1L组成，自然pH值，0.1MPa下121℃灭菌15min。
用接种环挑取5接种环的步骤1.1得到的活化的斜面菌种，接入装有 70mL种子培养基的250mL锥形瓶中，于37℃、160r/min摇床培养24h，即得种子液。
步骤1.3：产酶发酵
产酶发酵培养基由环糊精10g、蛋白胨5g、酵母浸膏10g、K2HPO4 0.2g、 MgSO4·7H2O 0.2g、Na2CO3 0.1g、CaCO3 0.1g和水1L组成，pH值调至8.0， 0.1MPa下121℃灭菌15min。
将步骤1.2得到种子液按照10％(v/v)-15％(v/v)的接种量，接入装有600mL产酶发酵培养基的1000mL锥形瓶中，先于37℃、120r/min摇床培养16h，再于40-45℃、160r/min摇床培养56h，然后4000r/min离心10min，收集上清液。
步骤2：酶初步纯化
在步骤1.3收集的上清液中加入终浓度为10％-30％的硫酸铵，4℃冷藏 12h,5000r/min离心20min，收集上清液；在上清液中，再加入终浓度为 40％-80％的硫酸铵，4℃冷藏过夜，收集沉淀物，0℃-10℃冷冻干燥后，得到粗酶，再用去离子水溶解为质量百分数为10％-15％的粗酶溶液。
步骤3：酶进一步纯化
将步骤2得到的粗酶溶液置于透析袋中，在透析液中透析20h，期间每隔6h更换一次透析液，共更换两次透析液，得到透析后的酶液。
其中，所述粗酶溶液与透析液的体积比为1:10-1:30。所述透析液为pH 值为7.0的磷酸钠缓冲液。在透析结束时用质量百分数为1％的BaCl2溶液检查硫酸铵是否残存。
步骤4：离子交换层析
将步骤3得到的透析后的酶液上样于已经经过缓冲液平衡好的DEAE-琼脂糖凝胶柱或DEAE-52纤维素柱中，用洗脱液进行洗脱，分别收集洗脱液, 分别测定其酶活和蛋白质浓度，合并具有酶活的洗脱液，得到收集样。
其中，所述缓冲液为pH值为7.0的磷酸钠缓冲液；所述DEAE-琼脂糖凝胶析柱或DEAE-52纤维素柱的内径均为2.5cm，高度均为65cm；所述洗脱液为含1.0-1.5mol/L KCI溶液的pH值为7.0的磷酸钠缓冲液；所述分别收集洗脱液为4mL/管；所述洗脱的流速为2mL/min；所述洗脱的体积为3-5个柱体积。
所述合并具有酶活的洗脱液为测定各收集管在280nm下的光吸收值和各管的酶活力，合并有酶活力的各收集管的酶液。
一般说来在整个洗脱过程中各洗脱管中酶活的高低呈正态分布，其中占正态分布80％的区域中各管的酶活较高。即一开始洗脱时是没有的，然后慢慢增多，达到最大值，然后又慢慢减少的至没有的过程。一般就把占正态分布80％的各管收集起来。
所述蛋白质浓度的测定方法为[3]：
蛋白质标准曲线的制备，以牛血清白蛋白为标准样品，测定280nm波长下的吸光度，绘制标准曲线，得到得回归方程。
样品蛋白质含量的测定：分别测定待测液在280nm波长下的吸光度，对照蛋白质标准曲线，求出蛋白质含量。
步骤5：凝胶层析
将步骤4得到的收集样进行Sephadex G-200分子筛层析，用洗脱液进行洗脱，收集洗脱液，测定酶活和蛋白质浓度，合并具有酶活的洗脱液，冷冻干燥后，即得环糊精葡萄糖基转移酶。
其中，所述洗脱液为含1.0-1.5mol/L KCI溶液的pH值为7.0的磷酸钠缓冲液；所述分别收集洗脱液为4mL/管；所述洗脱的流速为0.4mL/min；所述洗脱的体积为3-5个柱体积。
步骤5中，所述合并具有酶活的洗脱液为测定各收集管在280nm下的光吸收值和各管的酶活力，合并有酶活力的各收集管的酶液。
所述环糊精葡萄糖基转移酶的纯度≥95.6％。
实施例4
上述环糊精葡萄糖基转移酶在罗汉果苦苷转化中的应用。
本申请的发明人发现，上述发酵所产的环糊精葡萄糖基转移酶对罗汉果苦苷ⅡE转化最佳作用条件为：用pH值为6.6的磷酸缓冲液将罗汉果苦苷ⅡE配成浓度为1mg/mL的罗汉果苦苷ⅡE溶液，将底物(可溶性淀粉或β- 环糊精)用去离子水配制成浓度为3-7mg/mL的底物溶液。取1mL罗汉果苦苷ⅡE溶液、1mL底物溶液和12μL环糊精葡萄糖基转移酶溶液(用pH值6.6 的磷酸缓冲液配制成的含有1000U/mL的酶液)，反应温度50℃、反应时间 18-24h，得到脱苦的转化产物。
以未酶解的浓度为1mg/mL的罗汉果苦苷ⅡE为对照。将脱苦的转化产物和罗汉果苦苷ⅡE分别置于沸水浴中灭酶30min后，冷却至室温，感官品尝。
感官检验法：感官评价小组由20人组成，分别对上述脱苦的转化产物和罗汉果苦苷ⅡE进行感官评定，感官评价后记录结果，去掉最高分和最低分后取平均值。
罗汉果苦苷转化后的产物评分标准：酶解前罗汉果甙类溶液即罗汉果苦苷ⅡE溶液(有较重的后苦味)60分；与酶解前罗汉果苦苷ⅡE溶液的后苦味相比略有改进61-70分；去除罗汉果苦苷ⅡE溶液的后苦味效果较明显， 71-80分；有甜味但略带苦味，81-90分；有甜味基本感觉不到苦味91-100 分。
按照罗汉果苦苷苦味评分标准，脱苦后的转化产物经20人感官评价结果达85分，脱苦效果显著。
本申请的发明人发现，上述环糊精葡萄糖基转移酶对罗汉果苷Ⅲ转化最佳作用条件为：用pH值为6.6的磷酸缓冲液将罗汉果苷Ⅲ配成浓度为1mg/mL 的罗汉果苷Ⅲ溶液，底物(可溶性淀粉或β-环糊精)用去离子水配制成浓度为3-5mg/mL的底物溶液。取10mL罗汉果苷Ⅲ溶液、10mL底物溶液和8μ L环糊精葡萄糖基转移酶溶液(用pH值为6.6的磷酸缓冲液配制成的含有 1000U/mL的酶液)，反应温度45℃、反应时间16-20h，得到甜味的转化产物。
以未酶解的浓度为1mg/mL的罗汉果苷Ⅲ溶液为对照，罗汉果苷Ⅲ为无味。将甜味的转化产物和罗汉果苷Ⅲ溶液分别置于沸水浴中灭酶30min后，冷却至室温，感官品尝。
感官检验法：感官评价小组由20人组成，分别对上述甜味的转化产物和罗汉果苷Ⅲ溶液进行感官评定，感官评价后记录结果，去掉最高分和最低分后取平均值。
罗汉果苷Ⅲ转化后产物的评分标准：酶解前罗汉果苷Ⅲ溶液(没有甜味) 60分；与酶解前罗汉果苷Ⅲ溶液的味相比略有甜味61-70分；甜味增加效果较明显，71-80分；有较高的甜味，81-90分；很甜91-100分。
上述甜味的转化产物经20人感官评价结果达82分，具有较高的甜味。
上述环糊精葡萄糖基转移酶在罗汉果皂苷(苦苷ⅡE或苷Ⅲ)转化中的应用。
本申请的发明人采用二步转化法，用上述环糊精葡萄糖基转移酶转化罗汉果皂苷(苦苷ⅡE或苷Ⅲ)。上述二步转化法，是直接用含有环糊精葡萄糖基转移酶的发酵液进行转化，不用纯化酶和苦苷。
具体方法为：
用接种环将斜面培养基上的产环糊精葡萄糖基转移酶的罗汉果内生菌菌种，无菌接种到新鲜的种子培养基中(250mL锥形瓶装100mL种子培养基)， 37℃，160r/min条件下培养12-16h，待菌体浓度达到107-109个/mL，即得种子培养液。以5％-10％的接种量将上述种子培养液接种至新鲜液体发酵培养基中(1000mL锥形瓶装500-650mL液体培养基)。
在40-45℃、160r/min摇床培养60h，然后再加入罗汉果皂苷(苦苷ⅡE 或苷Ⅲ)溶液(最终在溶液中的浓度为8-12mg/mL)和底物(可溶性淀粉或β-环糊精，最终在溶液中的浓度为20mg/mL)，在50℃条件下保温24-36h。保温结束后，在4000r/min条件下离心20-30min，得到含有转化产物的溶液。
本申请的发明人采用三步转化法，用上述环糊精葡萄糖基转移酶转化罗汉果皂苷(苦苷ⅡE或苷Ⅲ)。上述三步法，也是直接用含有酶的发酵液进行转化，不用纯化酶和苦苷，但是发酵的过程比二步转化法多了一步。
具体方法为：
用接种环将斜面培养基上的产环糊精葡萄糖基转移酶的罗汉果内生菌菌种，无菌接种到新鲜的液体种子培养基中(250mL锥形瓶装100mL液体培养基)，37℃，160r/min条件下培养12-14h，待菌体浓度达到107-109个/mL，即得种子培养液。以5％-10％的接种量将上述种子培养液接种至新鲜液体种子培养基中(1000mL锥形瓶装500mL-650mL液体培养基)。相同的条件下继续培养12-14h，待菌体浓度达到106-108个/mL时，以10％-15％的接种量接种到发酵培养基中，在40-45℃、160r/min摇床培养48h，然后加入罗汉果皂苷 (苦苷ⅡE或苷Ⅲ)溶液(最终在溶液中的浓度为8-12mg/mL)和底物(可溶性淀粉或β-环糊精，最终在溶液中的浓度为30mg/mL)，在50℃条件下保温24-36h。保温结束后，在4000r/min条件下，离心15-25min，得到含有转化产物的溶液。
转化产物的分离纯化
将含有转化产物的发酵液置于分液漏斗中，第一次加入发酵液1/2-1/3 体积的正丁醇，充分振荡，静置分层，分离出上层正丁醇相。下层发酵液再加入下层发酵液1/4-1/6体积的正丁醇，同法萃取2次。将所得到的正丁醇相合并减压蒸馏，蒸干后用10％(v/v)的乙醇溶解，得到含有上述转化产物的10％(v/v)的乙醇溶液，然后采用HP-20大孔吸附树脂纯化。
HP-20大孔吸附树脂纯化条件如下：将含有上述转化产物的10％(v/v) 的乙醇溶液上样直至不吸附为止，静置吸附3h，然后去离子水洗脱体积3BV，流速3BV/h；30％(v/v)乙醇洗脱杂质流速3BV/h，洗脱体积3-5BV；70％(v/v) 乙醇洗脱转化产物，流速3BV/h，洗脱体积3-5BV；再用90％(v/v)乙醇溶液洗脱，流速3BV/h，洗脱体积3BV；分别收集各洗脱液。
将70％(v/v)乙醇溶液洗脱所得液体浓缩回收乙醇得到转化产物，再冷冻干燥，得到罗汉果皂苷(苦苷ⅡE或苷Ⅲ)转化后的产物。将90％(v/v) 乙醇溶液洗脱所得液体浓缩回收乙醇得到转化产物，再冷冻干燥，得到其它转化产物。
上述罗汉果皂苷(苦苷ⅡE或苷Ⅲ)转化后的产物，即为甜味的罗汉果甜甙,可以作为甜味剂添加于食品中。而其它转化产物，即为其它甙类，可以作为研究其它生理活性的化合物。
本发明在培养基制备时，所述自然pH值，是在本发明所述的培养基组成条件下，不需要另外调节pH值。
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[3].详见张龙翔等.生化实验方法和技术(第二版)[M].北京:高等教育出版社,1997.99-108.
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 广西师范大学
<120> 一株产环糊精葡萄糖基转移酶的罗汉果内生菌菌株及其筛选方法和应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1445
<212> DNA
<213> 产环糊精葡萄糖基转移酶的罗汉果内生菌菌株ND-6(Bacillus sp. )
<400> 1
gggcgcgtgc tatacatgca gtcgagcgga cagatgggag cttgctccct gatgttagcg 60
gcggacgggt gagtaacacg tgggtaacct gcctgtaaga ctgggataac tccgggaaac 120
cggggctaat accggatgct tgtttgaacc gcatggttca aacataaaag gtggcttcgg 180
ctaccactta cagatggacc cgcggcgcat tagctagttg gtgaggtaac ggctcaccaa 240
ggcgacgatg cgtagccgac ctgagagggt gatcggccac actgggactg agacacggcc 300
cagactccta cgggaggcag cagtagggaa tcttccgcaa tggacgaaag tctgacggag 360
caacgccgcg tgagtgatga aggttttcgg atcgtaaagc tctgttgtta gggaagaaca 420
agtgccgttc aaatagggcg gcaccttgac ggtacctaac cagaaagcca cggctaacta 480
cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgttg tccggaatta ttgggcgtaa 540
agggctcgca ggcggtttct taagtctgat gtgaaagccc ccggctcaac cggggagggt 600
cattggaaac tggggaactt gagtgcagaa gaggagagtg gaattccacg tgtagcggtg 660
aaatgcgtag agatgtggag gaacaccagt ggcgaaggcg actctctggt ctgtaactga 720
cgctgaggag cgaaagcgtg gggagcgaac aggattagat accctggtag tccacgccgt 780
aaacgatgag tgctaagtgt tagggggttt ccgcccctta gtgctgcagc taacgcatta 840
agcactccgc ctggggagta cggtcgcaag actgaaactc aaaggaattg acgggggccc 900
gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gaagcaacgc gaagaacctt accaggtctt 960
gacatcctct gacaatccta gagataggac gtccccttcg ggggcagagt gacaggtggt 1020
gcatggttgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac 1080
ccttgatctt agttgccagc attcagttgg gcactctaag gtgactgccg gtgacaaacc 1140
ggaggaaggt ggggatgacg tcaaatcatc atgcccctta tgacctgggc tacacacgtg 1200
ctacaatggg cagaacaaag ggcagcgaaa ccgcgaggtt aagccaatcc cacaaatctg 1260
ttctcagttc ggatcgcagt ctgcaactcg actgcgtgaa gctggaatcg ctagtaatcg 1320
cggatcagca tgccgcggtg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca 1380
cgagagtttg taacacccga agtcggtgag gtaacctttt ggagccagcc gccgaaggtg 1440
acaga 1445
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tacggctacc ttgttacgac tt 22

Claims (10)

1.一株产环糊精葡萄糖基转移酶的罗汉果内生菌菌株，其特征在于，该菌株的名称为芽孢杆菌ND-6(Bacillus sp.ND-6)，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15227，保藏日期为2018年1月16日。
2.一种如权利要求1所述的产环糊精葡萄糖基转移酶的罗汉果内生菌菌株的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：从罗汉果的根、茎和果实中分离、纯化出罗汉果内生菌菌株，接种于斜面培养基上，4℃保藏，备用；
步骤2：初筛
从步骤1的斜面培养基中，挑取罗汉果内生菌菌种，稀释涂布接种于第一筛选培养基平板上，30℃培养2-5d后，挑出有黄色透明圈的菌落并接种到液体发酵培养基中，于30℃、160r/min摇瓶培养2-3d，离心，取上清液，得到发酵液；
各取200μL发酵液，分别滴加至已打孔的新的第一筛选培养基平板上和第二筛选培养基平板上，40℃水浴反应30min，分别计算黄色透明圈的直径与洞孔直径的比值、白色透明圈的直径与洞孔直径的比值，分别选出比值最大的菌株、以及比值较大的3-5株菌株，作为初筛菌株；
步骤3：复筛
将步骤2得到的初筛菌株的发酵液进行酶活测定，选出酶活最高的菌株、以及酶活次高的菌株，作为复筛的菌株；
步骤4：再复筛
将步骤3得到的复筛菌株，接种到新的液体发酵培养基中，于37℃、160r/min摇瓶培养2-3d，4000r/min离心10min，取上清液，得到含有酶的发酵液，进行酶活测定，最后对比步骤3复筛的结果，选出酶活高且稳定的菌株，即得到产环糊精葡萄糖基转移酶的罗汉果内生菌菌株。
3.根据权利要求2所述的一株产环糊精葡萄糖基转移酶的罗汉果内生菌菌株的筛选方法，其特征在于，步骤1中，所述斜面培养基为可溶性淀粉10g、蛋白胨5g、酵母浸膏5g、K2HPO40.2g、MgSO4·7H2O 0.2g、Na2CO3 0.1g、琼脂20g和水1L，自然pH值。
4.根据权利要求2所述的一株产环糊精葡萄糖基转移酶的罗汉果内生菌菌株的筛选方法，其特征在于，步骤2中，所述第一筛选培养基由可溶性淀粉10g、蛋白胨5g、酵母浸膏10g、K2HPO4 0.2g、MgSO4·7H2O 0.2g、Na2CO3 0.1g、酚酞0.3g、甲基橙0.1g、琼脂20g和水1L组成，混合均匀后，自然pH值；步骤2和步骤4中，所述液体发酵培养基均由可溶性淀粉10g、蛋白胨5g、酵母浸膏12g、K2HPO4 0.2g、MgSO4·7H2O 0.2g、Na2CO3 0.1g和水1L组成，混合均匀后，自然pH值；步骤2中，所述第二筛选培养基由如下方法制备得到：称取已去皮马铃薯200g,切块，煮沸30min，四层纱布过滤，加入蔗糖20g、琼脂20g和可溶性淀粉20g，水定容至1L，自然pH值。
5.一种利用权利要求1所述的产环糊精葡萄糖基转移酶的罗汉果内生菌菌株生产环糊精葡萄糖基转移酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：发酵产酶
步骤1.1：斜面菌种活化
斜面培养基由可溶性淀粉10g、蛋白胨5g、酵母浸膏5g、K2HPO4 0.2g、MgSO4·7H2O 0.2g、Na2CO3 0.1g、琼脂20g和水1L组成，自然pH值；
将上述产环糊精葡萄糖基转移酶的罗汉果内生菌菌株划线接种于上述试管斜面培养基上，于37℃培养12h，即得活化的斜面菌种；
步骤1.2：种子培养
种子培养基由可溶性淀粉10g、蛋白胨5g、酵母浸膏5g、K2HPO4 0.2g、MgSO4·7H2O 0.2g、Na2CO3 0.1g和水1L组成，自然pH值；
用接种环挑取步骤1.1得到的活化的斜面菌种，接入装有种子培养基的锥形瓶中，于37℃、160r/min摇床培养24h，即得种子液；
步骤1.3：产酶发酵
产酶发酵培养基由环糊精10g、蛋白胨5g、酵母浸膏10g、K2HPO4 0.2g、MgSO4·7H2O0.2g、Na2CO3 0.1g、CaCO3 0.1g和水1L组成，pH值调至8.0；
将步骤1.2得到种子液按照10％(v/v)-15％(v/v)的接种量，接入装有600mL产酶发酵培养基的1000mL锥形瓶中，先于37℃、120r/min摇床培养16h，再于40-45℃、160r/min摇床培养56h，然后离心，收集上清液；
步骤2：酶初步纯化
在步骤1.3收集的上清液中加入终浓度为10％-30％的硫酸铵，4℃冷藏12h,离心，收集上清液；在上清液中，再加入终浓度为40％-80％的硫酸铵，4℃冷藏过夜，收集沉淀物，冷冻干燥后，得到粗酶，再用去离子水溶解为质量百分数为10％-15％的粗酶溶液；
步骤3：酶进一步纯化
将步骤2得到的粗酶溶液进行透析，得到透析后的酶液；
步骤4：离子交换层析
将步骤3得到的透析后的酶液上样于已经经过缓冲液平衡好的DEAE-琼脂糖凝胶柱或DEAE-52纤维素柱中，用洗脱液进行洗脱，分别收集洗脱液,分别测定其酶活和蛋白质浓度，合并具有酶活的洗脱液，得到收集样；
步骤5：凝胶层析
将步骤4得到的收集样进行Sephadex G-200分子筛层析，用洗脱液进行洗脱，分别收集洗脱液，分别测定其酶活和蛋白质浓度，合并具有酶活的洗脱液，冷冻干燥后，即得环糊精葡萄糖基转移酶。
6.根据权利要求5所述的生产环糊精葡萄糖基转移酶的方法，其特征在于，步骤3中，所述透析的具体方法为：
将步骤2得到的粗酶溶液置于透析袋中，在透析液中透析20h，期间每隔6h更换一次透析液，共更换两次透析液，其中，所述粗酶溶液与透析液的体积比为1:10-1:30。
7.根据权利要求5所述的生产环糊精葡萄糖基转移酶的方法，其特征在于，步骤4中，所述缓冲液为pH值为7.0的磷酸钠缓冲液；所述DEAE-琼脂糖凝胶析柱或DEAE-52纤维素柱的内径均为2.5cm，高度均为65cm；所述洗脱液为含1.0-1.5mol/L KCI溶液的pH值为7.0的磷酸钠缓冲液；所述分别收集洗脱液为4mL/管；所述洗脱的流速为2mL/min；所述洗脱的体积为3-5个柱体积。
8.根据权利要求5所述的生产环糊精葡萄糖基转移酶的方法，其特征在于，步骤5中，所述洗脱液为含1.0-1.5mol/L KCI溶液的pH值为7.0的磷酸钠缓冲液；所述分别收集洗脱液为4mL/管；所述洗脱的流速为0.4mL/min；所述洗脱的体积为3-5个柱体积；所述环糊精葡萄糖基转移酶的纯度≥95.6％。
9.一种权利要求5所述的环糊精葡萄糖基转移酶在罗汉果苦苷转化中的应用。
10.一种权利要求5所述的环糊精葡萄糖基转移酶在罗汉果苷Ⅲ转化中的应用。
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