CN104059959A - 以罗汉果苦果、落地果为原料合成甜味皂苷的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种以罗汉果苦果、落地果为原料合成甜味皂苷的方法，包括以下步骤：1)取罗汉果苦果或落地果，破碎，加水或45%～55%体积的乙醇提取，提取液过大孔树脂柱层析，得到罗汉果苦味皂苷，其中罗汉果苷Ⅱ和/或苷Ⅲ的含量≥50%；2)取罗汉果苦味皂苷溶于水中，加入淀粉和环糊精葡萄糖基转移酶，于60～65℃条件下酶催化反应至完全，灭酶活，过滤，收集滤液；3)所得滤液过大孔树脂柱或硅胶柱层析，水洗，收集30～40%体积的乙醇洗脱液；或者是将滤液直接过氧化铝柱或活性炭柱，收集流出液；将收集的30～40%体积的乙醇洗脱液或流出液浓缩、干燥，即得。本发明从根本上解决罗汉果生长过程中的苦果和落地果问题。

Description

以罗汉果苦果、落地果为原料合成甜味皂苷的方法

技术领域

本发明属于食品化学领域，具体涉及一种以罗汉果苦果、落地果为原料合成甜味皂苷的方法。

背景技术

罗汉果(Siraitia grosvenorii(Swingle)C.Jeffrey)，原产桂北山区，用其成熟干果泡制的饮品味甜清新、风味独特，是广西著名的药食两用特产。其甜味成分罗汉果皂苷(mogrosides)已被提取并开发成为高级的甜味剂使用。罗汉果甜苷的甜度达到蔗糖的约300倍，其甜味纯正无后苦味，并且热量几乎为零，因而作为功能性无糖甜味剂现已广泛应用于保健食品及饮料添加行业，具备极佳的市场开发前景。

罗汉果皂苷是一类葫芦烷型的四环三萜皂苷，目前已经从罗汉果中提取出了二十多种不同的天然罗汉果皂苷成分，不同罗汉果皂苷的区别主要是苷元3位和24位连接的葡萄糖链结构不同，通过分析罗汉果皂苷的结构与味觉的关系可以发现：苷元本身是苦味的，而苷元的3位和24位连接的葡萄糖残基总数为1～3个时是苦味(苦苷)或无味的，连接4～6个葡萄糖残基则是甜味的(甜苷)，其口味的苦与甜是由苷元所连接的葡萄糖残基数目所决定的，而糖链上葡萄糖残基相互连接的不同位置只能改变皂苷的相对甜度。罗汉果皂苷的结构式如下所示：

从罗汉果中提取作为甜味剂使用的罗汉果总皂苷正是这部份含有4～6个葡萄糖的皂苷的混合物，其中尤其以罗汉果皂苷V含量最高，一般可以达到总量的约30%～40%。在罗汉果果实中，其皂苷的形成规律是由苷元合成一糖苷和二糖苷，再逐渐增加葡萄糖残基的数目，最后合成出4～6个葡萄糖的皂苷，与此同时罗汉果果实的口味也由苦涩逐渐变为清甜。通常罗汉果由授粉结果到可以采摘上市至少要70天的时间。

作为罗汉果主产区的广西桂林地区，受气候因素影响，每年10月中下旬后气温开始逐渐转冷，同时受植株营养消耗影响，会造成许多开花较晚的罗汉果果实无法达到完全成熟，因而会产生所谓的苦果；又由于土壤、环境、气候以及种植过程中的管理不到位，每年在罗汉果生产中都会有大量的落地果现象产生。每年因这两种情况造成的资源浪费都十分巨大，占到总挂果量的15～30%。

为了解决罗汉果生产中的苦果和落果问题，目前主要是从新品种的培育以及田间管理入手，希望能够减少苦果和落地果的产生，但由于苦苷是罗汉果自身生物合成甜苷过程中所必须经历的一个阶段，因此现行的方法并不能从根本上解决问题。如果能够直接将苦果和落地果作为资源利用起来，直接将罗汉果苦味皂苷转变为有用的甜味皂苷将会使罗汉果资源得到更充分的利用和开发。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种以罗汉果苦果、落地果为原料合成甜味皂苷的方法。该方法将未成熟的罗汉果(包括苦果、嫩果等)和/或落地果作为资源利用起来，不仅从根本上解决罗汉果生长过程中的苦果和落地果问题，还可以提高果农的收入。

本发明所述的以罗汉果苦果、落地果为原料合成甜味皂苷的方法，包括以下步骤：

1)苦味皂苷的制备：取罗汉果苦果或落地果，破碎，加水或45%～55%体积的乙醇提取，提取液过大孔树脂柱层析，水洗树脂柱至流出液无色，然后用70～90%体积的乙醇洗脱，洗脱液回收乙醇，干燥，得到罗汉果苦味皂苷，其中罗汉果苷Ⅱ和/或苷Ⅲ的含量≥50%；

2)酶催化反应：取罗汉果苦味皂苷溶于水中，加入罗汉果苦味皂苷重量1～4倍的淀粉，再按400～650U/g罗汉果苦味皂苷的量加入环糊精葡萄糖基转移酶，于60～65℃条件下酶催化反应至完全，灭酶活，反应液过滤，收集滤液；

3)后处理：所得滤液过大孔树脂柱或硅胶柱层析，水洗，乙醇梯度洗脱，收集30～40%体积的乙醇洗脱液；或者是将滤液直接过氧化铝柱或活性炭柱，收集流出液；将收集的30～40%体积的乙醇洗脱液或流出液浓缩、干燥，得到罗汉果甜味皂苷混合物。

由上述方法获得的罗汉果甜味皂苷混合物为包括三糖苷、四糖苷、五糖苷和六糖苷的混合物，其中合成得到的非天然结构的三糖苷并无苦味，又由于三个糖的皂苷(即三糖苷)因为苷元结构不变因而其作为罗汉果皂苷的保健作用不变，因此在本申请中并不刻意去除。

上述方法中：

步骤1)中，所述大孔树脂为聚苯乙烯型，具体可以是D101、D102、HP-20、AB-8或DM131等。如果该方法制得的罗汉果苦味皂苷中罗汉果苷Ⅱ和/或苷Ⅲ的含量没有达到50%，最好是经进一步纯化后再用于后续工序，否则，其中的罗汉果苦味皂苷转化成甜味皂苷的转化率不高。该方法中，提取的方式可以是煎煮提取(以水为溶媒时)或常温浸提(以乙醇为溶媒时)，提取的次数为1～3次，每次1～2h，每次提取时水或乙醇的加入量通常为罗汉果重量的1～8倍；洗脱时优选是用30%体积的乙醇洗去甜味成分后再换用70～90%体积的乙醇，洗脱液还可进一步采用阴离子型大孔树脂(具体可以是D900、D311等)后再浓缩、干燥。

步骤2)中，所述的淀粉可以是选自糊精、水溶性淀粉、马铃薯淀粉和玉米淀粉中的一种或两种以上的组合，当淀粉的选择为上述两种以上的组合时，它们之间的配比可以是任意配比；所述淀粉的用量根据罗汉果苦味皂苷中苦味皂苷含量的多少在上述范围内浮动，一般情况下，当苦味皂苷的含量较大时，淀粉的用量相对少些，反之亦然。所述水的用量可根据需要确定，通常为罗汉果苦味皂苷重量的5～15倍；所述环糊精葡萄糖基转移酶的加入量优选为550～650U/g罗汉果苦味皂苷。酶催化反应是否完全，采用TLC或HPLC跟踪检测，直至苦味皂苷不再减少为止；在上述限定条件下，酶催化反应至完全大约需要18～24h。该步骤中，通过将反应体系加热至100℃并保持5～10min以达到灭酶活(即终止反应)的目的。

步骤3)中，所述大孔树脂为聚苯乙烯型，具体可以是D101、D102、HP-20、AB-8或DM131等。所述的硅胶柱为反相硅胶柱。在经大孔树脂柱或硅胶柱层析后，乙醇梯度洗脱时，通常是从20%体积的乙醇开始洗脱，以每上升5%体积或10%体积或15%体积或20%体积的浓度为一个梯度进行梯度洗脱(每个梯度浓度的乙醇洗脱时用的量约为柱体积的1～2倍)，收集30～40%体积的乙醇洗脱液，优选是收集30～35%体积的乙醇洗脱液。也可以不用乙醇梯度洗脱，而是只用一个体积浓度的乙醇洗脱，只是这样洗脱溶剂的用量较大、且所得的罗汉果甜味皂苷混合物中甜味皂苷的含量较少而已，这样情况下，用于洗脱的乙醇的浓度为50～80%体积。

与现有技术相比，本发明以未完全成熟的罗汉果和/或落地果提取的罗汉果苦味皂苷为原料，使用环糊精葡萄糖基转移酶催化糖基转移的方法，以延长罗汉果苦味皂苷上葡萄糖链长度，将罗汉果苦味皂苷转变为非天然结构的甜味皂苷，充分利用了未成熟的罗汉果(可以是苦果、嫩果等)和/或落地果等资源浪费，不仅从根本上解决罗汉果生长过程中的苦果和落地果问题，还可以提高果农的收入。

附图说明

图1为本发明实施例4步骤1)制得的罗汉果苦味皂苷的高效液相色谱图；

图2为本发明实施例4步骤2)中酶催化反应过程的高效液相色谱图。

具体实施方式

下面以具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于这些实施例。

罗汉果中主要的甜味物质是四到六个糖的皂苷，三个糖的皂苷有些是无味的有些则是苦味的。

本申请中及以下各实施例中所涉及的罗汉果甜味皂苷均为包括三糖苷、四糖苷、五糖苷和六糖苷的混合物，罗汉果甜味皂苷总含量是指包括三糖苷、四糖苷、五糖苷和六糖苷的总含量，其中合成得到的非天然结构的三糖苷并无苦味，而且三个糖的皂苷因为苷元结构不变因而其作为罗汉果皂苷的保健作用不变，因此在本申请中并不刻意去除。

以下各实施例中乙醇的浓度均为体积浓度。

实施例1

1)制备罗汉果苦味皂苷：

取新鲜嫩果50个(2.3Kg)，洗净，破碎，置于提取容器中，加入7.5L水煎煮提取1h，过滤，滤渣再加入6L水煎煮提取1h，过滤，滤渣再加入6L水煎煮提取1h，合并滤液，得到提取液；提取液过D101大孔树脂柱，先水洗树脂柱至流出液无色，然后用30%的乙醇洗脱(除去提取液中罗汉果的甜味皂苷)，直至洗脱液甜味消失或变苦后再用80%乙醇洗脱，薄层层析跟踪检测，收集80%乙醇洗脱液，减压浓缩，干燥，得到罗汉果苦味皂苷70g，经检测，其中罗汉果皂苷Ⅱ和罗汉果皂苷Ⅲ的总含量为53%重量；

2)酶催化反应：

取3g步骤1)制得的罗汉果苦味皂苷溶于35ml蒸馏水中，加入12g水溶性淀粉和1800U的环糊精葡萄糖基转移酶，于65℃条件下进行酶催化反应至完全(TLC跟踪检测，约24h)，升温至100℃并保温5min，终止反应，反应液冷却后过滤，收集滤液；

3)后处理：

所得滤液过C18反相硅胶柱，先水洗硅胶柱至流出液澄清(洗去吸附在硅胶柱上的淀粉)，然后用2倍柱体积的20%乙醇洗脱，再用2倍柱体积的40%乙醇洗脱，收集40%乙醇的洗脱液，浓缩、真空干燥，即得到合成的罗汉果甜味皂苷混合物1.5g(白色)。经检测，其中罗汉果甜味皂苷总含量＞90%。

实施例2

1)制备罗汉果苦味皂苷：

取罗汉果落地果20Kg，洗净，破碎，置于提取罐中，加入原料重量1倍的50%乙醇室温浸提12h，过滤，滤渣再加入原料重量1倍的50%乙醇室温浸提12h，过滤，滤渣加入原料重量1倍的50%乙醇室温浸提12h，合并滤液，得到提取液；提取液过D101大孔树脂柱，先水洗树脂柱至流出液无色，然后用1.5倍柱体积的30%乙醇洗脱(除去提取液中罗汉果的甜味皂苷)，再用80%乙醇洗脱，薄层层析跟踪检测，收集80%乙醇洗脱液，用强碱性阴离子交换树脂脱色，收集流出液，减压浓缩，干燥，得到罗汉果苦味皂苷400g。经检测，其中罗汉果皂苷Ⅱ和罗汉果皂苷Ⅲ的总含量为68%重量；

2)酶催化反应：

取10g步骤1)制得的罗汉果苦味皂苷溶于150ml蒸馏水中，加入30g糊精和6000U的环糊精葡萄糖基转移酶，于65℃保温条件下进行酶催化反应至完全(TLC跟踪检测，约20h)，升温至100℃并保温5min，终止反应，反应液冷却后过滤，收集滤液；

3)后处理：

所得滤液过C18反相硅胶柱，先水洗硅胶柱至流出液澄清(洗去吸附在硅胶柱上的淀粉)，然后用1倍柱体积的20%乙醇洗脱，再用1倍柱体积的30%乙醇洗脱，再用1倍柱体积的40%乙醇洗脱，收集30%和40%乙醇的洗脱液，浓缩、真空干燥，即得到合成的罗汉果甜味皂苷混合物6.5g(白色)。经检测，其中罗汉果甜味皂苷总含量＞98%。

实施例3

1)制备罗汉果苦味皂苷：

取罗汉果落地果100Kg，洗净，破碎，置于提取罐中，加入原料重量8倍的水煎煮提取3h，过滤，滤渣再加入原料重量5倍的水煎煮提取1h，合并滤液，得到提取液；提取液过AB-8大孔树脂柱，先水洗树脂柱至流出液无色，然后用30%的乙醇洗脱(除去提取液中罗汉果的甜味皂苷)，直至洗脱液甜味消失后再用90%乙醇洗脱，薄层层析跟踪检测，收集90%乙醇洗脱液，减压浓缩，干燥，得到罗汉果苦味皂苷2.3Kg，经检测，其中罗汉果皂苷Ⅱ和罗汉果皂苷Ⅲ的总含量为57%重量；

2)酶催化反应：

取82g步骤1)制得的罗汉果苦味皂苷溶于1.5L蒸馏水中，加入320g马铃薯淀粉和50000U的环糊精葡萄糖基转移酶，于60℃条件下进行酶催化反应至完全(TLC跟踪检测，约24h)，升温至100℃并保温5min，终止反应，反应液冷却后过滤，收集滤液；

3)后处理：

所得滤液过氧化铝填料柱，收集流出液，浓缩、喷雾干燥，即得到合成的罗汉果甜味皂苷混合物(接近白色)243g。经检测，其中罗汉果甜味皂苷总含量＞30%。

实施例4

1)制备罗汉果苦味皂苷：

取实施例1步骤1)制得的罗汉果苦味皂苷5g，经C18反相硅胶柱层析，乙醇梯度淋洗，收集45～50%乙醇洗脱液，减压干燥制得本实施例所需的罗汉果苦味皂苷(其高效液相色谱图如图1所示)，经检测，其中罗汉果皂苷Ⅱ＞92%；

2)酶催化反应：

取2g上述步骤1)制得的罗汉果苦味皂苷溶于10ml蒸馏水中，加入2g水溶性淀粉和1200U的环糊精葡萄糖基转移酶，于60℃条件下进行酶催化反应至完全(HPLC跟踪检测，约18h，图2为反应过程的HPLC图谱)，升温至100℃并保温5min，终止反应，反应液冷却后过滤，收集滤液；

3)后处理：

所得滤液过C18反相硅胶柱，先水洗硅胶柱至流出液澄清(洗去吸附在硅胶柱上的淀粉)，然后用1倍柱体积的20%乙醇洗脱，再用1倍柱体积的25%乙醇洗脱，之后用1倍柱体积的30%乙醇洗脱，再用1倍柱体积的35%乙醇洗脱，最后用1倍柱体积的40%乙醇洗脱，合并收集30%和35%乙醇的洗脱液，40%乙醇的洗脱液单独收集，分别进行浓缩、喷雾干燥，得到合成的罗汉果甜味皂苷混合物A(30～35%乙醇洗脱部分，白色粉末)1.2g，以及罗汉果甜味皂苷混合物B(40%乙醇洗脱部分，白色粉末)0.6g。

经液质联用（HPLC-ESIMS）确定图2中12分钟之后所出各峰的分子量均为罗汉果苷II与不同数量葡糖糖残基分子量之和，即均是罗汉果苷II经糖基转移的产物，对图中所标出的主要峰进行归属如下：苷II（HPLC：18.734min，MS：799.7）、三糖苷（HPLC：17.951，17.276min，MS：961.8）、四糖苷（HPLC：16.233,15.676min，MS:1124.0）、五糖苷（HPLC:15.120,14.659,14.324,13.909min,MS:1286.1）。

含量测试以标准品罗汉果苷II或罗汉果苷V配制标准溶液，以HPLC峰面积对浓度做标准曲线，测定产物的罗汉果甜味皂苷总含量。

经测试，罗汉果甜味皂苷混合物A(30～35%乙醇洗脱部分)主要含有四糖苷和五糖苷，另外还有少量的三糖苷和六糖苷，其中罗汉果甜味皂苷总含量＞99%,味道很甜。

罗汉果甜味皂苷混合物B(40%乙醇洗脱部分)主要含有三糖苷，其中罗汉果甜味皂苷总含量＞99%,有淡淡的特有味道，既不甜也不苦。

实施例5

1)制备罗汉果苦味皂苷：

同实施例1；

2)酶催化反应：

取3g步骤1)制得的罗汉果苦味皂苷溶于35ml蒸馏水中，加入6g玉米淀粉和1200U的环糊精葡萄糖基转移酶，于65℃条件下进行酶催化反应至完全(TLC跟踪检测，约24h)，升温至100℃并保温5min，终止反应，反应液冷却后过滤，收集滤液；

3)后处理：

所得滤液过HP-20大孔树脂柱，先水洗至流出液澄清(洗去溶于水的淀粉、多糖等不吸附的物质)，然后用2倍柱体积的60%乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩、真空干燥，即得到合成的罗汉果甜味皂苷混合物3.3g(淡黄色)。经检测，其中罗汉果甜味皂苷总含量＞50%。

实施例6

1)制备罗汉果苦味皂苷：

同实施例2；

2)酶催化反应：

取50g步骤1)制得的罗汉果苦味皂苷溶于1.5L蒸馏水中，加入15g糊精和27500U的环糊精葡萄糖基转移酶，于62℃条件下进行酶催化反应至完全(TLC跟踪检测，约24h)，升温至100℃并保温5min，终止反应，反应液冷却后过滤，收集滤液；

3)后处理：

所得滤液过活性炭柱，收集流出液，浓缩、喷雾干燥，即得到合成的罗汉果甜味皂苷混合物(接近白色)161g。经检测，其中罗汉果甜味皂苷总含量＞30%。

Claims (5)

1.以罗汉果苦果、落地果为原料合成甜味皂苷的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)苦味皂苷的制备：取罗汉果苦果或落地果，破碎，加水或45%～55%体积的乙醇提取，提取液过大孔树脂柱层析，水洗树脂柱至流出液无色，然后用70～90%体积的乙醇洗脱，洗脱液回收乙醇，干燥，得到罗汉果苦味皂苷，其中罗汉果苷Ⅱ和/或苷Ⅲ的含量≥50%；

2)酶催化反应：取罗汉果苦味皂苷溶于水中，加入罗汉果苦味皂苷重量1～4倍的淀粉，再按400～650U/g罗汉果苦味皂苷的量加入环糊精葡萄糖基转移酶，于60～65℃条件下酶催化反应至完全，灭酶活，反应液过滤，收集滤液；

3)后处理：所得滤液过大孔树脂柱或硅胶柱层析，水洗，乙醇梯度洗脱，收集30～40%体积的乙醇洗脱液；或者是将滤液直接过氧化铝柱或活性炭柱，收集流出液；将收集的30～40%体积的乙醇洗脱液或流出液浓缩、干燥，得到罗汉果甜味皂苷混合物。

2.根据权利要求1所述的用环糊精葡萄糖基转移酶催化罗汉果苦味皂苷合成甜味皂苷的方法，其特征在于：步骤1)中，所述大孔树脂为聚苯乙烯型。

3.根据权利要求1所述的用环糊精葡萄糖基转移酶催化罗汉果苦味皂苷合成甜味皂苷的方法，其特征在于：步骤2)中，所述的淀粉选自糊精、水溶性淀粉、马铃薯淀粉和玉米淀粉中的一种或两种以上的组合。

4.根据权利要求1所述的用环糊精葡萄糖基转移酶催化罗汉果苦味皂苷合成甜味皂苷的方法，其特征在于：步骤2)中，所述环糊精葡萄糖基转移酶的加入量为550～650U/g罗汉果苦味皂苷。

5.根据权利要求1所述的用环糊精葡萄糖基转移酶催化罗汉果苦味皂苷合成甜味皂苷的方法，其特征在于：步骤3)中，所述大孔树脂为聚苯乙烯型。