CN103804440B

CN103804440B - 一种莱苞迪苷c的纯化工艺

Info

Publication number: CN103804440B
Application number: CN201410029293.6A
Authority: CN
Inventors: 赵军; 杨文国; 宋云飞; 李元元; 李宇钰
Original assignee: GUILIN LAIYIN BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: GUILIN LAIYIN BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date: 2014-01-22
Filing date: 2014-01-22
Publication date: 2015-08-12
Anticipated expiration: 2034-01-22
Also published as: CN103804440A

Abstract

本发明公开了一种莱苞迪苷C的纯化工艺，包括以下步骤：1)将粗甜菊提取物用溶剂A结晶，取母液过大孔树脂柱，先用碱液和酸液洗柱，再用水洗柱至流出液呈中性，之后用pH为3～5的10～30v/v%乙醇洗脱，最后用pH为7～8的60～85v/v%乙醇洗脱，收集60～85v/v%乙醇洗脱液，浓缩，干燥，得到莱苞迪苷C粗品；2)取莱苞迪苷C粗品用溶剂B溶解，用酸调其pH为3～5，2～10℃条件下析晶，收集晶体，水洗至中性，干燥，即得莱苞迪苷C。采用本发明所述工艺只需进行一次结晶即可获得RC含量达97%以上的产品，且RC总回收率达75%以上；工艺简单易操作，有利于工业化生产。

Description

一种莱苞迪苷C的纯化工艺

技术领域

本发明涉及植物中活性成分的提取纯化技术领域，具体涉及一种莱苞迪苷C的纯化工艺。

背景技术

甜菊糖是一种从菊科草本植物甜叶菊(或称甜菊叶)中精提的新型天然甜味剂，它具有高甜度、低热能的特点，其甜度是蔗糖的200～300倍，热值仅为蔗糖的1/300。经大量科学实验及他国长期食用历史证明，甜菊糖苷无毒无副作用，无致癌物，食用安全，是一种可替代蔗糖非常理想的甜味剂；而南美洲使用甜叶菊作为药草和代糖已经有几百年历史。国际甜味剂行业的资料显示，甜菊糖苷已在亚洲、北美、南美洲和欧盟各国广泛应用于食品、饮料、调味料的生产中。

甜菊糖是一类由甜叶菊醇这种四环二萜化合物连接不同数目的配糖体组成的糖甙混合物。目前研究发现的有12种物质，被人们认可并且做过医学毒理实验的有八种，具体为：(1)甜菊糖甙(stevioside)(St)；(2)甜菊醇双糖甙(steviolbioside)；(3)莱苞迪苷A(rebaudioside A)(RA)；(4)莱苞迪苷B(rebaudioside B)(RB)(5)莱苞迪苷C(rebaudioside C)(RC)；(6)莱苞迪苷D(rebaudioside D)(RD)；(7)莱苞迪苷E(rebaudioside E)(RE)；(8)杜尔可甙A(dulcoside A)(DA)。这些配糖体中,含量高,且有经济价值的糖甙体有St、RA、RC、DA四种。这些不同的组分的口味均不同，能够面对不同的消费人群。目前市面上的甜叶菊产品主要是RA和STV，公开号为CN102321132A的发明专利公开了一种甜菊糖甙RC粗提取物的提纯方法，具体是将母液糖配置为15～20mg/ml的料液，将料液以1.5～3.0L/min的速度流过大孔吸附树脂柱；待吸附完全后，用75%～80%质量浓度的乙醇洗脱吸附在树脂柱上的甜菊糖甙，分段收集洗脱液，确定临界点，将临界点的洗脱液在60～80℃的温度下浓缩，将得到的固体和液体分别干燥，得到RC含量达30%以上粗制甜菊糖甙。该方法操作简单，但所得产品中RC含量不高。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种方法简单易操作、所得RC含量高且收率也高的莱苞迪苷C的纯化工艺。

本发明所述的莱苞迪苷C的纯化工艺，包括以下步骤：

1)将粗甜菊提取物用溶剂A结晶，取母液过大孔树脂柱，先用碱液洗柱，然后用酸液洗柱，再用水洗柱至流出液呈中性，之后用pH为3～5的10～30v/v%乙醇洗脱，最后用pH为7～8的60～85v/v%乙醇洗脱，收集60～85v/v%乙醇洗脱液，浓缩，干燥，得到莱苞迪苷C粗品；其中：

所述粗甜菊提取物中莱苞迪苷C的含量≥10wt%，优选莱苞迪苷C的含量为12～13wt%。

所述的溶剂A为60～80v/v%甲醇、60～80v/v%乙醇、60～80v/v%丙酮或60～80v/v%乙酸乙酯；

所述的碱液为0.5～3w/w%的氢氧化钠水溶液或0.5～3w/w%的氢氧化钾水溶液；

所述的酸液为0.5～3w/w%的盐酸水溶液或0.5～3w/w%的硫酸水溶液；

2)取莱苞迪苷C粗品用溶剂B溶解，用酸调其pH为3～5，2～10℃条件下析晶，收集晶体，水洗至中性，干燥，即得莱苞迪苷C；其中：

所述的溶剂B为50～60v/v%甲醇或50～60v/v%乙酸乙酯；

所述的酸为冰醋酸或甲酸。

本发明通过先对粗甜菊提取物进行结晶，可以使其中的RC含量提高到20%以上，且原料中的RA、STV有了显著的减少，有利于后序柱层析中RC的分离。然后对吸附了母液的大孔树脂柱进行碱处理，有效去除被吸附的黄酮色素等物质；再进行酸处理，在起到中和作用的同时去除一些弱碱性杂质；上述酸碱处理既不会对产品中的RC造成破坏，而且在实现除杂目的的同时还有利于后序的结晶操作，提高所得产品中RC的含量及收率。之后再用调了pH值的乙醇进行洗脱，并结合酸性条件下进行结晶的技术方案，使得在进行一次结晶所得产品中的RC含量和收率得到显著提高，所得产品的RC含量达97%以上(HPLC法，下同)，收率达75%以上(以莱苞迪苷C粗品中RC的为基准计算)。

上述技术方案中，

步骤1)中，所述粗甜菊提取物中莱苞迪苷C的含量通常为10～13%，如果其中RC含量高于13%，则所得产品的收率会进一步提高，通常可达88%以上。该步骤中，所述大孔树脂的型号通常为D101、LX-8、AB-8、LXA-8、HP-100或HP-20。该步骤中，溶剂A的用量与现有常规技术相同，通常情况下，溶剂A的用量为粗甜菊提取物用量的4～6倍。

步骤1)中，在洗脱过程中，优选先用pH为4的10～30v/v%乙醇洗脱，再用pH为7.5的60～85v/v%乙醇洗脱。该步骤中，在用pH为3～5的10～30v/v%乙醇洗脱时，其用量通常为柱床体积的2～3倍；再用pH为7～8的60～85v/v%乙醇进行洗脱时，采用薄层层析跟踪检测，以收集含目标成分的洗脱液。

步骤1)中，所述的碱液优选是1～1.5w/w%的氢氧化钠水溶液或1～1.5w/w%的氢氧化钾水溶液；所述的酸液优选是1～1.5w/w%的盐酸水溶液或1～1.5w/w%的硫酸水溶液。用于洗柱的碱液和酸液的用量通常是洗柱至其流出液呈碱性或酸性即可，一般情况下，碱液和酸液的用量分别为柱床体积的2～4倍。

步骤2)中，将莱苞迪苷C粗品用溶剂B溶解后，优选是将该溶液的pH调至4。析晶通常在搅拌条件下进行，析晶时间通常为12～48h。该步骤中，溶剂B的用量通常为莱苞迪苷C粗品用量的4～6倍。

申请人在大量试验的基础上发现：

1、在其它条件相同的条件下，将莱苞迪苷C粗品用溶剂B溶解后在酸性条件下进行结晶与莱苞迪苷C粗品用溶剂B溶解后不调pH值直接进行结晶相比，所得产品中的RC含量及收率都有很大的差异，结果如表1所示：

表1：(该表中涉及的百分比均为重量百分比)

2、在其它条件相同的条件下，在上大孔树脂柱层析前先对粗甜菊提取物进行结晶，可以使其中的RC含量提高到20%以上，且原料中的RA，STV有了显著的减少，有利于后序柱层析中RC的分离，试验结果如下述表2所示：

表2：(该表中涉及的百分比均为重量百分比)

3、在其它条件相同的条件下，在母液过大孔树脂柱后，对大孔树脂柱先用碱液、酸液处理，再用调了pH值的乙醇梯度洗脱下来的样品中RC含量及收率，与不对大孔树脂柱进行碱液、酸液处理且用不调pH值的乙醇梯度洗脱下来的样品高，试验结果如下述表3所示：

表3：(该表中涉及的百分比均为重量百分比)

4、其它条件相同的条件下，所用原料中粗甜菊提取物中莱苞迪苷C的含量进行变化时，最后所得产品中的RC含量仍为98～99%，但收率会有一定的提高，约提高6～8个百分点。

与现有技术相比，本发明通过先对粗甜菊提取物进行结晶，可以使其中的RC含量提高到20%以上，且原料中的RA、STV有了显著的减少，有利于后序柱层析中RC的分离；然后对吸附了母液的大孔树脂柱进行酸碱处理，同时用调了pH值的乙醇梯度洗脱，从而可以一次性获得莱苞迪苷RC含量在40%以上的样品，含量远高于其它柱层析的效果；最后将洗脱下来的样品在酸性条件下进行结晶，使得在进行一次结晶所得产品中的RC含量和收率得到显著提高，所得产品的RC含量达97%以上(HPLC法，下同)，收率达75%以上(以莱苞迪苷C粗品中的　RC为基准计算)。整个方法简单易操作，而且采用成熟的柱层析工艺，有利于工业化生产。

具体实施方式

下面以具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于这些实施例。

实施例1

1)取RC含量为10%的粗甜菊提取物干粉300g，用原料4倍量的60v/v%甲醇结晶处理后，母液进D101大孔树脂柱，先用2倍柱床体积的1w/w%的氢氧化钠水溶液洗柱，然后用2倍柱床体积的1w/w%的盐酸水溶液洗柱，之后水洗树脂柱至流出液呈中性，之后再用2.5倍柱床体积的pH为3的20v/v%乙醇(用甲酸调pH值)洗脱，最后用pH为7.5的60v/v%乙醇(用甲酸调pH值)洗脱，薄层层析跟踪检测，收集60v/v%乙醇洗脱液，浓缩，干燥，得到莱苞迪苷C粗品70g；所得粗品中甜菊糖总苷含量为91%，其中RC含量为40.5%，RA含量为31%；

2)将上述所得的莱苞迪苷C粗品加入到结晶罐中，加入相当于莱苞迪苷C粗品5倍量的50v/v%甲醇，密封，加热使其溶解，用甲酸调溶液的pH=3，降温至2～10℃下搅拌析晶24h,滤去母液，晶体用大量水洗至中性，干燥，得到产品25g。经检测，产品中RC含量为98%，RC总回收率为81.7%。

对比例1

1)取RC含量为10%的粗甜菊提取物干粉300g，用原料4倍量的60v/v%甲醇结晶处理后，母液进D101大孔树脂柱，先用2倍柱床体积的1w/w%的氢氧化钠水溶液洗柱，然后用2倍柱床体积的1w/w%的盐酸水溶液洗柱，之后水洗树脂柱至流出液呈中性，之后再用2.8倍柱床体积的20v/v%乙醇洗脱，最后用60v/v%乙醇洗脱，薄层层析跟踪检测，收集60v/v%乙醇洗脱液，浓缩，干燥，得到莱苞迪苷C粗品72g；所得粗品中甜菊糖总苷含量为93%，其中RC含量为33%，RA含量为28%；

2)将上述所得的莱苞迪苷C粗品加入到结晶罐中，加入相当于莱苞迪苷C粗品5倍量的50v/v%甲醇，密封，加热使其溶解，用甲酸调溶液的pH=3，降温至2～10℃下搅拌析晶24h,滤去母液，晶体用大量水洗至中性，干燥，得到产品14.5g。经检测，产品中RC含量为91%，RC总回收率为43.98%。

实施例2

1)取RC含量为11%的粗甜菊提取物干粉400g，用原料4倍量的70v/v%乙醇结晶处理后，母液进LX-8大孔树脂柱，先用3倍柱床体积的0.5w/w%的氢氧化钠水溶液洗柱，然后用2倍柱床体积的1w/w%的硫酸水溶液洗柱，之后水洗树脂柱至流出液呈中性，之后再用2.9倍柱床体积的pH为3.5的25v/v%乙醇(用冰醋酸调pH值)洗脱，最后用pH为8.0的70v/v%乙醇(用冰醋酸调pH值)洗脱，薄层层析跟踪检测，收集70v/v%乙醇洗脱液，浓缩，干燥，得到莱苞迪苷C粗品90g；所得粗品中甜菊糖总苷含量为93%，其中RC含量为41.5%，RA含量为32%；

2)将上述所得的莱苞迪苷C粗品加入到结晶罐中，加入相当于莱苞迪苷C粗品5倍量的55v/v%甲醇，密封，加热使其溶解，用甲酸调溶液的pH=3，降温至2～4℃下搅拌析晶24h,滤去母液，晶体用大量水洗至中性，干燥，得到产品36g。经检测，产品中RC含量为98.5%，RC总回收率为80.6%。

实施例3

1)取RC含量为13%的粗甜菊提取物干粉350g，用原料4倍量的75v/v%丙酮结晶处理后，母液进HP-20大孔树脂柱，先用2倍柱床体积的1.5w/w%的氢氧化钾水溶液洗柱，然后用3倍柱床体积的1w/w%的盐酸水溶液洗柱，之后水洗树脂柱至流出液呈中性，之后再用3倍柱床体积的pH为4的28v/v%乙醇(用冰醋酸调pH值)洗脱，最后用pH为7.5的65v/v%乙醇(用冰醋酸调pH值)洗脱，薄层层析跟踪检测，收集65v/v%乙醇洗脱液，浓缩，干燥，得到莱苞迪苷C粗品103g；所得粗品中甜菊糖总苷含量为94%，其中RC含量为43%，RA含量为33%；

2)将上述所得的莱苞迪苷C粗品加入到结晶罐中，加入相当于莱苞迪苷C粗品6倍量的60v/v%乙酸乙酯，密封，加热使其溶解，用冰醋酸调溶液的pH=4，降温至4～8℃下搅拌析晶20h,滤去母液，晶体用大量水洗至中性，干燥，得到产品41g。经检测，产品中RC含量为98.8%，RC总回收率为89%。

实施例4

1)取RC含量为12%的粗甜菊提取物干粉300g，用原料5倍量的80v/v%乙酸乙酯结晶处理后，母液进AB-8大孔树脂柱，先用3倍柱床体积的3w/w%的氢氧化钾水溶液洗柱，然后用3倍柱床体积的3w/w%的盐酸水溶液洗柱，之后水洗树脂柱至流出液呈中性，之后再用2倍柱床体积的pH为5的30v/v%乙醇(用冰醋酸调pH值)洗脱，最后用pH为7.0的85v/v%乙醇(用冰醋酸调pH值)洗脱，薄层层析跟踪检测，收集85v/v%乙醇洗脱液，浓缩，干燥，得到莱苞迪苷C粗品73g；所得粗品中甜菊糖总苷含量为92%，其中RC含量为44.5%，RA含量为30.5%；

2)将上述所得的莱苞迪苷C粗品加入到结晶罐中，加入相当于莱苞迪苷C粗品4倍量的50v/v%乙酸乙酯，密封，加热使其溶解，用冰醋酸调溶液的pH=3.5，降温至4～8℃下搅拌析晶24h,滤去母液，晶体用大量水洗至中性，干燥，得到产品30g。经检测，产品中RC含量为98.7%，RC总回收率为82.25%。

实施例5

1)取RC含量为10%的粗甜菊提取物干粉400g，用原料6倍量的65v/v%乙醇结晶处理后，母液进AB-8大孔树脂柱，先用2倍柱床体积的1w/w%的氢氧化钾水溶液洗柱，然后用2倍柱床体积的1.5w/w%的盐酸水溶液洗柱，之后水洗树脂柱至流出液呈中性，之后再用2.5倍柱床体积的pH为4.5的10v/v%乙醇(用甲酸调pH值)洗脱，最后用pH为7.5的80v/v%乙醇(用甲酸调pH值)洗脱，薄层层析跟踪检测，收集80v/v%乙醇洗脱液，浓缩，干燥，得到莱苞迪苷C粗品92g；所得粗品中甜菊糖总苷含量为92.5%，其中RC含量为43.5%，RA含量为28.9%；

2)将上述所得的莱苞迪苷C粗品加入到结晶罐中，加入相当于莱苞迪苷C粗品5倍量的55v/v%乙酸乙酯，密封，加热使其溶解，用甲酸调溶液的pH=4.5，降温至8～10℃下搅拌析晶36h,滤去母液，晶体用大量水洗至中性，干燥，得到产品35.5g。经检测，产品中RC含量为98.1%，RC总回收率为87.06%。

Claims

1.一种莱苞迪苷C的纯化工艺，包括以下步骤：

1)将粗甜菊提取物用溶剂A结晶，取母液过大孔树脂柱，先用碱液洗柱，然后用酸液洗柱，再用水洗柱至流出液呈中性，之后用pH为3～5的10～30v/v％乙醇洗脱，最后用pH为7～8的60～85v/v％乙醇洗脱，收集60～85v/v％乙醇洗脱液，浓缩，干燥，得到莱苞迪苷C粗品；其中：

所述粗甜菊提取物中莱苞迪苷C的含量≥10wt％；

所述的溶剂A为60～80v/v％甲醇、60～80v/v％乙醇或60～80v/v％丙酮；

所述的碱液为0.5～3w/w％的氢氧化钠水溶液或0.5～3w/w％的氢氧化钾水溶液；

所述的酸液为0.5～3w/w％的盐酸水溶液或0.5～3w/w％的硫酸水溶液；

所述的溶剂B为50～60v/v％甲醇；

所述的酸为冰醋酸或甲酸。

2.根据权利要求1所述的莱苞迪苷C的纯化工艺，其特征在于：步骤1)中，所述大孔树脂的型号为D101、LX-8、AB-8、LXA-8、HP-100或HP-20。

3.根据权利要求1所述的莱苞迪苷C的纯化工艺，其特征在于：步骤1)中，在洗脱过程中，先用pH为4的10～30v/v％乙醇洗脱，再用pH为7.5的60～85v/v％乙醇洗脱。

4.根据权利要求1所述的莱苞迪苷C的纯化工艺，其特征在于：步骤2)中，将莱苞迪苷C粗品用溶剂B溶解，用酸调其pH为4。