CN109497229B - 一种改善甜茶苷提取物口感的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种改善甜茶苷提取物口感的方法。本发明一种改善甜茶苷提取物口感的方法，将甜茶苷提取物进行生物酶酶解之后，所得酶解产物在羟丙基‑被他环糊精、氧化淀粉作为辅料条件下利用糖基化酶对甜茶苷提取物进行糖基化，将所得甜茶苷糖基化产物进行乙醇醇沉纯化、串联氧化铝层析柱纯化，浓缩干燥之后获得所需产品。本发明最终所得产品外观白色、口感好、无回苦味，无青涩味。本发明全程只用到水和乙醇作为溶剂，没有用到有毒有机试剂，制备过程中溶剂残留少、制备方法绿色环保，操作简单，很适合工业大生产。

Description

一种改善甜茶苷提取物口感的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种改善甜茶苷提取物口感的方法。

背景技术

甜茶(Rubus Suatrssimus S.Lee)，蔷薇科悬钩子属、多年生有刺灌木，叶甜可食，主要分布于广西。甜茶中所含的主要甜味成分是甜茶苷，甜茶苷是一种二萜糖体，分子式C₃₂H₅₀O₁₃。甜茶苷的甜度约为蔗糖甜度的300倍，而热值仅是蔗糖的5％。甜茶苷低热值的特性，可代替蔗糖用于高血压、糖尿病、肥胖症等患者以及老年人和儿童的食品、保健品和药品中，是一种品质优良的添加剂。

甜茶苷即使在纯化的状态下，仍然具有苦味、涩味、口感差等不足，为了去除苦味、适应口感要求，扩大它的用途，适应人们对甜味和风味的更高要求，有必要对甜茶苷进行脱苦除涩处理，改善口感，满足市场需要。发明专利转葡糖基化甜茶苷提取物及其制备方法与用途(专利申请号CN201510941265.6)公开了使用支链淀粉酶和异麦芽糖酶、β-半乳糖苷酶、糊精蔗糖酶或环糊精葡糖酸转移酶对甜茶苷进行糖基化，所得衍生物葡糖基化甜茶苷作为甜味增强剂用于消费品中，用以改善消费品的口感。虽然所得衍生物的甜味口感有所增加，但综合口感还不是很理想，还是存在一些回苦味以及青涩味。

发明内容

为了解决上述现有技术的不足之处，本发明提供了一种改善甜茶苷提取物口感的方法，本方法所得产物甜度增强，降低甜茶苷的苦味、涩味，所得产物还具有蜂蜜味及果香味，综合口感具有一种特别的风味。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

一种改善甜茶苷提取物口感的方法，所述方法包括利用糖基化酶对甜茶苷提取物进行糖基化的步骤，所述糖基化酶为α-环糊精转移酶、γ-环糊精转移酶和β葡聚糖酶，其中，所述甜茶苷提取物进行糖基化所用的辅料为羟丙基-被他环糊精、氧化淀粉中一种或混合。

优选的是，以kg/ml计，所述甜茶苷提取物和糖基化酶质量体积比为1︰3～1︰15。

优选的是，所述甜茶苷提取物和糖基化所用的辅料质量比为1︰1～1︰3.5。

优选的是，所述甜茶苷提取物糖基化所需PH为3.5～4.0，温度为45℃～48℃，糖基化时间为5～10小时。

优选的是，所述甜茶苷提取物进行糖基化之前还包括生物酶对甜茶苷提取物进行酶解的步骤，所述生物酶为蛋白酶、果胶裂解酶、纤维素酶中一种或混合。

优选的是，所述生物酶用量为甜茶苷提取物重量的千分之一到千分之五。

优选的是，所述生物酶酶解温度为45℃～48℃，酶解时间为1～3小时。

优选的是，所述方法还包括将糖基化产物进行灭酶、乙醇醇沉纯化、氧化铝层析柱纯化、有机膜浓缩、干燥的步骤。

优选的是，所述乙醇醇沉纯化时间为3～5小时，所述乙醇为食用级乙醇，所述乙醇用量为4～5倍甜茶苷提取物重量。

优选的是，所述氧化铝层析柱纯化是使用≥3根氧化铝层析柱以串联的方式对乙醇醇沉纯化所得滤液进行吸附，当层析柱流出液中甜茶苷质量含量≥1％时停止吸附，然后用50％(v/v)乙醇进行洗脱，收集第≥2根氧化铝层析柱流出液。

本发明有益效果如下：

1、本发明最终所得产品外观白色、口感好、无回苦味，无青涩味。本发明所得的甜茶苷糖基化产物能屏蔽苦味、涩味同时，还拥有让人意想不到的果香味及蜂蜜味的特性，是一种热量值低，甜度高，口感好甜味剂。

2、本发明全程只用到水和乙醇作为溶剂，没有用到有毒有机试剂，制备过程中溶剂残留少、制备方法绿色环保，操作简单，很适合工业大生产。

3、在从甜茶中提取甜茶苷的过程中，有些杂质不能彻底去除，因此本发明利用蛋白酶、果胶裂解酶、纤维素酶对甜茶苷提取物进行酶解，能进一步去除多糖、蛋白等其他影响口感的杂质成分。

4、本发明利用α-环糊精转移酶，γ-环糊精转移酶，β葡聚糖酶对甜茶苷进行糖基化，所得糖基化产物收率高，水溶性更好。

5、乙醇醇沉纯化能进一步去除蛋白质和醇不溶性杂质，同时去除多余的糖基化所用辅料，能进一步有效的保证最终产物的口感。

6、氧化铝柱层析可以很好的脱色和纯化，通过乙醇对其进行一次性洗脱所获得的产品品质更好，通过串联氧化铝层析柱既能确保每根层析柱都能达到吸附饱和，从而最大程度的利用氧化铝层析柱，又能保证生产的连续性，提高了生产效率，同时，串接起来进行醇洗的方式，使得在前层析柱被洗脱掉的甜茶苷糖基化产物又会被在后层析柱重新吸附，提高了甜茶苷糖基化产物的收率。

7、有机膜浓缩加喷雾干燥所得的产品可以满足食品要求。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，但本发明的实施方式并不局限于实施例表示的范围。这些实施例仅用于说明本发明，而非用于限制本发明的范围。此外，在阅读本发明的内容后，本领域的技术人员可以对本发明作各种修改，这些等价变化同样落于本发明所附权利要求书所限定的范围。

本发明以下实施例所使用的甜茶苷提取物产于桂林莱茵生物科技股份有限公司，所含甜茶苷质量含量为85％，所使用的甜茶苷提取物是从甜茶、甜叶菊或其他含有甜茶苷的植物中提取所得；本发明实施例所使用的蛋白酶、果胶裂解酶、纤维素酶、α-环糊精转移酶，γ-环糊精转移酶，β葡聚糖酶均购于诺维信(中国)生物技术有限公司；本发明实施例所使用本发明实施例所使用的原料和化学试剂，如无特殊说明，均通过常规商业途径获得。

以下实施例中甜茶苷含量均通过安捷伦(agilent)高效液相色谱仪进行测定，高效液相色谱检测条件：色谱柱C18(4.6mm×250mm,5um),流动相为磷酸水:乙腈＝70:30；检测波长为210nm；流速为1mL/min；进样量为10uL。

实施例1

取甜茶苷提取物1kg，加入2倍重量纯水溶解，用高压均质机打碎1次30分钟。将打碎产物倒入反应釜中于45℃温度下，加入蛋白酶酶解1小时，所述蛋白酶加入量为甜茶苷提取物重量的千分之五，再加入1kg羟丙基-被他环糊精作为辅料，继续加入α-环糊精转移酶1ml，γ-环糊精转移酶1ml，β-葡聚糖酶1ml，加入5％体积分数(v/v)柠檬酸调节PH至3.5，45℃保温酶解10小时。糖基化反应结束后将产物加热到80℃保持30分钟，放冷到常温，加入4倍甜茶苷提取物重量的食用乙醇，进行醇沉5小时，100目滤布滤过，收集上清液直接进入3根串联氧化铝柱进行吸附，当流出液检测到甜茶苷质量含量达1％时停止进样，然后用50％(v/v)乙醇一次性洗脱，收集第二根和第三根氧化铝层析柱的流出液。利用有机膜浓缩到15波美度，喷雾干燥，即得所需产品。

实施例2

取甜茶苷提取物1kg，加入2.5倍重量纯水溶解，用高压均质机打碎2次，每次20分钟。将打碎产物倒入反应釜中于46℃温度下，加入蛋白酶和果胶裂解酶酶解2小时，所述蛋白酶、果胶裂解酶加入总量为甜茶苷提取物重量的千分之三，再加入2.5kg氧化淀粉作为辅料，继续加入α-环糊精转移酶3ml，γ-环糊精转移酶3ml，β-葡聚糖酶3ml，5％(v/v)柠檬酸调节PH4.0，46℃保温酶解8小时。糖基化反应结束后将产物加热到82℃保持25分钟，放冷到常温，加入4.5倍甜茶苷提取物重量的食用乙醇，进行醇沉4小时，200目滤布滤过，收集上清液直接进入4根串联氧化铝柱进行吸附，当流出液检测到甜茶苷质量百分含量达到2％时停止进样，然后用50％(v/v)乙醇一次性洗脱，收集第二根、第三根和第四根氧化铝层析柱的流出液。利用有机膜浓缩到18波美度，喷雾干燥，即得所需产品。

实施例3

取甜茶苷提取物1kg，加入3倍重量纯水溶解，用高压均质机打碎3次，每次10分钟。将打碎产物倒入反应釜中于48℃温度下，加入蛋白酶、果胶裂解酶、纤维素酶三种酶酶解3小时，所述蛋白酶、果胶裂解酶、纤维素酶加入总量为甜茶苷提取物重量的千分之一，再加入3.5kg辅料，辅料由羟丙基-被他环糊精和氧化淀粉组成，继续加入α-环糊精转移酶5ml，γ-环糊精转移酶5ml，β-葡聚糖酶5ml，5％(v/v)柠檬酸调节PH4.0，48℃保温酶解5小时。糖基化反应结束后将产物加热到85℃保持20分钟，放冷到常温，加入5倍甜茶苷提取物重量的食用乙醇，进行醇沉3小时，100目滤布滤过，收集上清液直接进入3根串联氧化铝柱进行吸附，当流出液检测到甜茶苷质量百分含量到1％时停止进样，然后用50％(v/v)乙醇一次性洗脱，收集第二根和第三根氧化铝层析柱的流出液。利用有机膜浓缩到20波美度，喷雾干燥，即得所需产品。

对比例1

本对比例用于评价添加α-环糊精转移酶作为糖基化酶的技术方案与本发明技术方案取得的技术效果差异：

取甜茶苷提取物1kg，加入2倍重量纯水溶解，用高压均质机打碎1次30分钟。将打碎产物倒入反应釜中于45℃温度下，加入蛋白酶酶解1小时，所述蛋白酶加入量为甜茶苷提取物重量的千分之五，再加入1kg羟丙基-被他环糊精作为辅料，继续加入α-环糊精转移酶3ml，加入5％体积分数(v/v)柠檬酸调节PH至3.5，45℃保温酶解10小时。糖基化反应结束后将产物加热到80℃保持30分钟，放冷到常温，加入4倍甜茶苷提取物重量的食用乙醇，进行醇沉5小时，100目滤布滤过，收集上清液直接进入3根串联氧化铝柱进行吸附，当流出液检测到甜茶苷质量含量达1％时停止进样，然后用50％(v/v)乙醇一次性洗脱，收集第二根和第三根氧化铝层析柱的流出液。利用有机膜浓缩到15波美度，喷雾干燥，即得所需产品。

对比例2

本对比例用于评价添加γ-环糊精转移酶作为糖基化酶的技术方案与本发明技术方案取得的技术效果差异：

取甜茶苷提取物1kg，加入2倍重量纯水溶解，用高压均质机打碎1次30分钟。将打碎产物倒入反应釜中于45℃温度下，加入蛋白酶酶解1小时，所述蛋白酶加入量为甜茶苷提取物重量的千分之五，再加入1kg羟丙基-被他环糊精作为辅料，继续加入γ-环糊精转移酶3ml，加入5％体积分数(v/v)柠檬酸调节PH至3.5，45℃保温酶解10小时。糖基化反应结束后将产物加热到80℃保持30分钟，放冷到常温，加入4倍甜茶苷提取物重量的食用乙醇，进行醇沉5小时，100目滤布滤过，收集上清液直接进入3根串联氧化铝柱进行吸附，当流出液检测到甜茶苷质量含量达1％时停止进样，然后用50％(v/v)乙醇一次性洗脱，收集第二根和第三根氧化铝层析柱的流出液。利用有机膜浓缩到15波美度，喷雾干燥，即得所需产品。

对比例3

本对比例用于评价添加β-葡聚糖酶作为糖基化酶的技术方案与本发明技术方案取得的技术效果差异：

取甜茶苷提取物1kg，加入2倍重量纯水溶解，用高压均质机打碎1次30分钟。将打碎产物倒入反应釜中于45℃温度下，加入蛋白酶酶解1小时，所述蛋白酶加入量为甜茶苷提取物重量的千分之五，再加入1kg羟丙基-被他环糊精作为辅料，继续加入β-葡聚糖酶3ml，加入5％体积分数(v/v)柠檬酸调节PH至3.5，45℃保温酶解10小时。糖基化反应结束后将产物加热到80℃保持30分钟，放冷到常温，加入4倍甜茶苷提取物重量的食用乙醇，进行醇沉5小时，100目滤布滤过，收集上清液直接进入3根串联氧化铝柱进行吸附，当流出液检测到甜茶苷质量含量达1％时停止进样，然后用50％(v/v)乙醇一次性洗脱，收集第二根和第三根氧化铝层析柱的流出液。利用有机膜浓缩到15波美度，喷雾干燥，即得所需产品。

对比例4

本对比例用于评价添加糊精蔗糖酶作为糖基化酶的技术方案与本发明技术方案取得的技术效果差异：

取甜茶苷提取物1kg，加入2倍重量纯水溶解，用高压均质机打碎1次30分钟。将打碎产物倒入反应釜中于45℃温度下，加入蛋白酶酶解1小时，所述蛋白酶加入量为甜茶苷提取物重量的千分之五，再加入1kg羟丙基-被他环糊精作为辅料，继续加入糊精蔗糖酶3ml，加入5％体积分数(v/v)柠檬酸调节PH至3.5，45℃保温酶解10小时。糖基化反应结束后将产物加热到80℃保持30分钟，放冷到常温，加入4倍甜茶苷提取物重量的食用乙醇，进行醇沉5小时，100目滤布滤过，收集上清液直接进入3根串联氧化铝柱进行吸附，当流出液检测到甜茶苷质量含量达1％时停止进样，然后用50％(v/v)乙醇一次性洗脱，收集第二根和第三根氧化铝层析柱的流出液。利用有机膜浓缩到15波美度，喷雾干燥，即得所需产品。

对比例5

本对比例用于评价添加环糊精糖基转移酶作为糖基化酶的技术方案与本发明技术方案取得的技术效果差异：

取甜茶苷提取物1kg，加入2倍重量纯水溶解，用高压均质机打碎1次30分钟。将打碎产物倒入反应釜中于45℃温度下，加入蛋白酶酶解1小时，所述蛋白酶加入量为甜茶苷提取物重量的千分之五，再加入1kg羟丙基-被他环糊精作为辅料，继续加入环糊精糖基转移酶3ml，加入5％体积分数(v/v)柠檬酸调节PH至3.5，45℃保温酶解10小时。糖基化反应结束后将产物加热到80℃保持30分钟，放冷到常温，加入4倍甜茶苷提取物重量的食用乙醇，进行醇沉5小时，100目滤布滤过，收集上清液直接进入3根串联氧化铝柱进行吸附，当流出液检测到甜茶苷质量含量达1％时停止进样，然后用50％(v/v)乙醇一次性洗脱，收集第二根和第三根氧化铝层析柱的流出液。利用有机膜浓缩到15波美度，喷雾干燥，即得所需产品。

对比例6

本对比例用于评价甜茶苷糖基化之前不进行酶解除杂的技术方案与本发明技术方案取得的技术效果差异：

取甜茶苷提取物1kg，加入2倍重量纯水溶解，用高压均质机打碎1次30分钟。加入1kg羟丙基-被他环糊精作为辅料，继续加入α-环糊精转移酶1ml，γ-环糊精转移酶1ml，β-葡聚糖酶1ml，加入5％体积分数(v/v)柠檬酸调节PH至3.5，45℃保温酶解10小时。糖基化反应结束后将产物加热到80℃保持30分钟，放冷到常温，加入4倍甜茶苷提取物重量的食用乙醇，进行醇沉5小时，100目滤布滤过，收集上清液直接进入3根串联氧化铝柱进行吸附，当流出液检测到甜茶苷质量含量达1％时停止进样，然后用50％(v/v)乙醇一次性洗脱，收集第二根和第三根氧化铝层析柱的流出液。利用有机膜浓缩到15波美度，喷雾干燥，即得所需产品。

实施例1～3甜茶苷提取物经糖基化之后所剩余的甜茶苷含量较低，相应的糖基化率比较高，对比例1～6将相应的工艺参数改变之后，所剩余的甜茶苷含量较高，实施例1～3以及对比例1～6检测方法一样，实施例及对比例所得产品对比情况见表1。

表1剩余甜茶苷含量

以下实验对所得糖基化产物进行感官分析

以5％蔗糖溶液的甜度为标准，对照品(所述对照品是根据申请号为CN201510941265.6的发明专利转葡糖基化甜茶苷提取物及其制备方法与用途中实施例I所述方法制得的产品)、本实施例1-3制得的甜茶苷糖基化产物作为样品1、样品2和样品3，再分别将它们配制成相当于5％蔗糖溶液的甜度，分别以苦味、涩味、果香味、蜂蜜味和综合口味5个指标作对比(人工品尝)，感官评价记分采用十分制，作为标准品的5％蔗糖溶液的各项指标均为5，最高分数为10分。所得感官对比数据如以下表2所示：

表2感官评价

感官指标	标准品	对照品	样品1	样品2	样品3
						回苦味	5.0	6.4	5.2	5.3	5.4
涩味	5.0	6.1	5.4	5.1	5.3
						果香味	5.0	5.0	6.8	8.2	7.1
蜂蜜味	5.0	5.0	7.8	6.8	7.3
						综合口味	5.0	5.5	7.5	8.0	7.1

由表1可知，对照品的回苦味、涩味数值最大的；且没有令人愉悦的果香味或蜂蜜味，因而其综合口感中最不理想。

样品1-3产品的回苦味以及涩味数值之间相差不大，略带一丝丝可以接受的余味，但其带有较明显的果香味以及蜂蜜味，在很大程度上提高了该样品的综合口感，上述分析可知，本发明所得的甜茶苷糖基化产物在屏蔽苦味、涩味同时，还拥有让人意想不到的果香味及蜂蜜味的特性，是一种热量值低，甜度高，口感好且无毒副作用的甜味剂，尤其适用于饮食行业。

Claims (7)

1.一种改善甜茶苷提取物口感的方法，其特征在于，所述方法包括利用糖基化酶对甜茶苷提取物进行糖基化的步骤，所述糖基化酶为α-环糊精转移酶、γ-环糊精转移酶和β葡聚糖酶，其中，所述甜茶苷提取物进行糖基化所用的辅料为羟丙基-被他环糊精、氧化淀粉中一种或混合；

以kg/ml计，所述甜茶苷提取物和糖基化酶质量体积比为1︰3～1︰15；

所述甜茶苷提取物进行糖基化之前还包括生物酶对甜茶苷提取物进行酶解的步骤，所述生物酶为蛋白酶、果胶裂解酶、纤维素酶中一种或混合，所述生物酶用量为甜茶苷提取物重量的千分之一到千分之五。

2.根据权利要求1所述的改善甜茶苷提取物口感的方法，其特征在于，所述甜茶苷提取物和糖基化所用的辅料质量比为1︰1～1︰3.5。

3.根据权利要求1所述的改善甜茶苷提取物口感的方法，其特征在于，所述甜茶苷提取物糖基化所需PH为3.5～4.0，温度为45℃～48℃，糖基化时间为5～10小时。

4.根据权利要求1所述的改善甜茶苷提取物口感的方法，其特征在于，所述生物酶酶解温度为45℃～48℃，酶解时间为1～3小时。

5.根据权利要求1所述的改善甜茶苷提取物口感的方法，其特征在于，所述方法还包括将糖基化产物进行灭酶、乙醇醇沉纯化、氧化铝层析柱纯化、有机膜浓缩、干燥的步骤。

6.根据权利要求5所述的改善甜茶苷提取物口感的方法，其特征在于，所述乙醇醇沉纯化时间为3～5小时，所述乙醇为食用级乙醇，所述乙醇用量为4～5倍甜茶苷提取物重量。

7.根据权利要求6所述的改善甜茶苷提取物口感的方法，其特征在于，所述氧化铝层析柱纯化是使用≥3根氧化铝层析柱以串联的方式对乙醇醇沉纯化所得滤液进行吸附，当层析柱流出液中甜茶苷质量含量≥1％时停止吸附，然后用50％(v/v)乙醇进行洗脱，收集第≥2根氧化铝层析柱流出液。