JPS62296886A - アミノ交換反応によるｌ−ホスフイノスリシンの製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ６、発明の詳細な説明 光学活性な、非タンパク性アミノ酸は知られたかまたは
あジうる生物学的活性ゆえに大変重要である。Ｌ−ジヒ
ドロヤシフェニルアラニン（Ｌ−ドーパ）またはα−メ
チルドーパのような幾ｆ１かのものは医薬分野に効果的
に使用されるし、またはホスフィノスリシン（ｐｈｏｓ
ｐｈｉｎｏｔｈｒｉ−Ｃ１ｎｅ）のように植物保護に使
用される。その他のものには医薬の前駆物質、例えば半
合成ペニシリンであるアンピシリンおよびアモキ、シシ
リン製造におけるＤ−フェニルグリシンｐＨ７’１−ｉ
ｄβ−ｐ−ヒドロキシフェニルグリシンがあげられる。

これらはまた精製化学薬品合成のための価値ある前駆物
質でもあｐうる。アミノ酸訪導体の不斉合成においては
特に第三ロイシンも採用されてきた（Ｕ、５ｃｈ６１１
ｋｏｐｆ氏のｒＰｕｒｅ　ａｎｄ　Ａｐｐｌ。

Ｃｈｅｍ、Ｊ　５５，１７９９〜１８０６（１９８３）
）。

非タンパク性の光学活性アミノ酸は化学的経路でのみ製
造されるのが好ましい。その場合立体選択的に操作でき
ず、最終生成物としてラセミ化合物が得られるという欠
点がある。これに対し＃素による方法は簡単に調製でき
る中間体から酵素工程を用いることによりキラール化合
物が選択的に合成されうるという利点を非常にしばしば
有する。このことは２つの立体異性化合物のうちの一方
のみが生物学的に活性である場合に特に好都合である。

トランスアミナーゼを用いる生物学的変換による天然の
、いわゆるタンノξり性アミノ酸の合成それ自体は知ら
れている。ヨーロツ、ｏ特許出願第１５２．２７５号に
はアミノトランスフェラーゼの過剰生産によう特徴づけ
られる遺伝子工学的に修飾された微生物を用いるアミノ
交換反応によるフェニルアラニンの製法が記載されてい
る。ヨーロッパ特許出願用１．３５，８４６号ではα−
ケト酸をエシエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ）から単離されるトランスアミナーゼの存在下
に７ミノ基供与体としてのＬ−アスパラギン酸と反応さ
せることにより天然のし一アミノ酸を製造している。そ
れＫよシα−ケト酸に相当するＬ−アミノ酸、ならびに
アスパラギン酸から生成するオキサロアセテートが形成
される。

フェニルピルビン酸からより高収率にＬ−フェニルアラ
ニンを製造するためのエシェリヒア・：”）　（Ｅ、ｃ
ｏｌｉ）、バラコツカス・デニトリフィカンス（Ｐａｒ
ａｃｏｃｃｕｓ　ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、トル
ラ（Ｔｏｒｕ―λロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ
）およびストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
）の系列の微生物の選択および突然変異は西ドイツ特許
出願第３．４２３，９３６号に報告されている。

天然には存在しない、いわゆる非タン／ぐり性アミノ酸
はこれまで酵素による生物学的変換法によっては製造さ
れなかった。

今、非タンパク性アミノ酸でらるＬ−第三ロイシンおよ
びＬ−ホスフィノスリシンがアミノ変換反応により非常
に良好な収率で合成されうろことが見出された。ｆ重々
の天然のタンパク性アミノ酸がトランスアミナーゼを用
いて合成されうろことは知られていたとしても、酵素の
特異性ゆえに非タンパク性アミノ酸が天然に存在しない
α二ケト酸を前駆物質として用いてこの方法により同様
に製造され少ることはＭ（べきことである。それゆえ相
当する前駆物質が、天然のアミノ酸の前駆物質において
はこの形態で存在しない疎水性残基を有するにも拘らず
トランスアミナーゼの活性中心によって受容されそして
変換されることは驚くべきことである。

従って不発ＦＪＡは３，６−シメチルー２−オキンーブ
タン酸および（３−カルボキシ−６−オキソ−プロビル
）−メチルホスフィン酸またはそれぞれ相当する塩をア
ミノ基供与体の存在下にアミノ交換することからなるＬ
−第三ロイシンおよびＬ−ホスフィノスリシンの製造法
に関する。

以下に本発明について詳細に説明する。

多数の生物体例えば微生物、植物および豚の心臓のよう
な動物器官から得られる＃素はα−ケト酸をアミノ交換
反応によシ天然のＬ−アミノｐｌＩＫ変換させうる。こ
れら生物体まｆｃはそれらの醇累は本発明に使用されう
る。しかしながら、トランスアミナーゼを有する微生物
、例えばバラコツカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、アル
カリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、リゾビウム（
Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ）　、セラシア（Ｓｅｒｒａｔｉａλアグロ
バクテリクム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）およびス
トレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属の微生
物または腸内菌群の細菌を用いて操作するのが好ましい
。特Ｋ］Ｅｆましい微生物はアルカリゲネス・７エカリ
ス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ）　Ｄ
ＳＭ　４１１５　。

アルカリゲネス・デニ）　リフ　イカ：ｙ　ｘ（Ａｌｃ
ａｌｉ−ｇｅｎｅＢ　ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎａ）　
ＤＳＭ　４１１４、シ二−ドモナス−バクシモビリス（
ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ）
ＤＳＭ　４１２０　、シュードモナス種（Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａ、５ａｐｓｅ、）　ＤＳＭ　４１１９、セラシ
ア・プリムシカ（Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｐｌｙｍｕｔｈｉ
ｃａ）　ＤＳＭ　４１１５　、アグロパクテリクム−７
メファシエｙ　ス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍ
ｅｆａｃｉｅｎｓ）、エシエリヒア・コリＤＨ１、エシ
エリヒア・コリＡＴＣＣ１１３０３、エンテロバクター
・アグロメランス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ａｇｇ
ｌｏｍｅｒａｎｓ）ＤＳＭ　４１２２、−Ｚンテロバク
タ一種（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｓｐｅｃ、）ＤＳＭ
　４１２１　、バラコッ力ス−デニトリフィカ７　ス（
Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ　ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）
ＤＳＭ　６５　、ストレフトミセス・ヒグロスコピクス
（５ｔｒｅｐｔｏ可ｃｅｓｈｙｇｒｏｓｃ○ｐ土ＣＵＳ
）およびストレプトミセス・ビリドクロモデネス（Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏ−ｇ
ｅｎｅｓ）ならびに３種の土壌単離物ＤＳＭ４１１３．
１４１１７およびＤＳＭ４１１Ｂである。

これらの微生物はそれらが自由に入手できないかまたは
当業者が本発明を実施できる程度゛に記載されていない
場合は「ドイツ微生物寄託機関（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓ
ａｍｍｌｕｎｇ　ｆｕｒ　Ｍｉｋｒｏ　ｏｒｇａｎｉｓ
ｍ（ＤＳＭと略記））」に寄託されている。

ホスフィノスリシン抵抗性であるかまたは唯一の窒素源
としてホスンイノスリシンを利用する菌株、例えばアル
カリゲネス・フエカリスＤＳＭ４４１５．アグロバクテ
リウム・ツメフアシエンスならびに土壌単離物ＤＳＭ　
４．１１５が選択される場合は比較的高い酵素活性が得
られうる。これは好都合であるが、絶対に必ｇ々わけで
はない。同様にそれ自体知られた方法で選択ふ・よび突
然変異させることによｐ、培地中のよυ多重の６，３−
ジメチル−２−オキソブタン酸、フニニルピルビン酸ま
たは（３−カルボキシ−３−オキソプロビル）−メチル
ホスフィン酸またはそれらの塩Ｖこ対し、α−クト酸に
対する適合性ゆえにアミノ交換反応をより高収率に進行
せしめる微生物を以後の操作用に選択することができる
。６，５−ジメチル−２−オキソブタン酸またはその塩
はトリメチル酢酸をチオニルクロンイドおよびＫＣＮの
存在下に常法によりけん化することにエフ容易に得られ
うる。（５−カルボキシ−３−オキンープロビル）−メ
チルホスフィン酸またはその塩も同様に知られ六方法に
よシ製造され−る（Ｈａｎｓ　Ｂｅｙｅｒ氏のｒＬｅｈ
ｒｂｕｃｈｄｅｒ　ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ　Ｃｈｅｍ
ｉｅ　（Ｔｅｘｂｏｏｋ　ｏｆ　ＯｒｇａｎｉｃＣｈｅ
ｍ１ｓｔｒｙ月、　Ｓ、Ｈ１ｒｚｅｌ出版、Ｓｔｕｔｔ
ｇａｒｔ）。

遺伝子工学的に操作された微生物を本発明方法に使用す
る場合も良好な収量が得られる。

ｔｙｒＢ遺伝子ま±は１１ｖＥ遺伝子を含有するプレス
ミドで形質転換されたエシエリヒア・コリＡＴＣＣ１１
３０３を用いるのが特に好ましく、ここでｔｙｒＢ遺伝
子は芳香族トランスアミナーゼをそして１ｌｖＥ遺伝子
は脂肪族トランスアミナーゼをそれぞれコードする。か
くの如く繰作された菌株は例えば西ドイツ特許出願Ｐ　
３６３１８２９．９号またはＰ　３６３６７２２．２号
の記載により胸裏されうる。

アミノ交換反応は培養と同時に行われうる。

その場合ホスフィノスリシン九対して抵抗性を有する微
生物例えばアルカリゲネス・フエカリスＤＳＭ　４１１
５およびアグロバクテリウム・ツメフアシエンスを用い
て操作するのが好ましい。

しかしながら微生物はその生育に最適の培養基中で適描
な好ましい温度条件および通気条件下に栄養溶液１ｊ乾
ジ乾燥重量約４〜６０ノとなるまで培養するのが好まし
い。それぞれの微生物に最も好都合な条件は当業者に知
られているかまたは簡単な予備実験によ少判定されうる
。次に細胞を栄養溶液中に、または栄養溶液から分離し
てα−ケト酸の７ミノ化に使用する。アミノ交換反応は
細胞全体を用いであるいは破壊し走廁胞を用いても実施
でき、慣用の破壊法が用いられる。アミノ交換反応は細
胞抽出物、単離された総タンツクｌＸまたはｆｆ製トラ
ンスアミナーゼを用いても同様に実施できろ。しかしな
がら例えば価格などの実際的理由から、完全な細胞全体
を用いて操作するのが好ましい。しかしながらその寿命
が比較的長いことおよび反応をより良好に調節しうろこ
とのゆえにトランスアミナーゼを単離使用することもＰ
１様に好都合であシうる。さらに、微生物または酵素を
固定した形態で使用することも可能でおる。固定には知
られた方法、好都合には西ドイツ特許出願公開第３，２
３７：３１号および同第３．２４３．５９１号記載の方
法が用いられる。

微生物または単離された酵素系は好ましい実施形態にお
いては・α−ケト酸およびアミノ基供与体の添加の下に
おいてそのトランスアミナーゼ活性が著しくマイナスの
影響を受けることがないように生理的緩衝液中に懸濁す
る。微生物の量に応じ、微生物の形態でかまたは単離さ
れた酵素系の形態で反応混合物に添加される酵素活性は
広範囲に変動しうる。好都合には活性は１０〜２０００
０μモル／分？ｌである。反応混合物は＃累活性１５［
）０〜２０００μモル／分・ｌに相当する細胞量を含有
するのが好ましい。

アミノ基供与体としてはアミノ酸が使用される。どのア
ミノ酸が用いられるのが好ましいかは実質上微生物また
は単離された酵素系の如何によるものであるが、これは
簡単な予備試験により判定されうる。例えばバリン、ロ
イシン、インロイシン、メチオニン、チロシンおよびフ
ェニルアラニン、特にアスパラギン、アスパラギン酸、
グルタミン、グルタミン酸およびグリシンが適当である
。これらのアミノ酸は、Ｌ−形のみが本発明に利用され
るのでＬ−形における放離の酸または適当な塩（用いら
れる培地に相当して）として使用される。Ｌ−第三ロイ
シンの製造にはα−ケト酸として６．３−ジメチル−２
−オキソ−ブタン酸が使用され、一方し−ホスフィノス
リシンの製造には（３−カルボキシ−６−オキソ−プロ
ビル）−メチルホスフィン酸が使用される。それらの塩
も使用でき、その場合当然トランスアミナーゼ活性に著
明にマイナスに影響しないイオンが選択される。ナトリ
ウム、カリウムおよびアンモニウム塩が好ましい。アミ
ノ基供与体はα−ケト酸に対し等モル景または過剰に添
加される。１：１〜５：１好ましくは１：１〜２：１な
る割合が適当であることが判明した。

反応混合物への反応体の添加は、水中における溶液とし
てまたは固形物質を添加することにより同時に行われう
る０しかしながら反応混合物の重量に基づき０．１〜４
．５チ特に０．２〜２％の量で１〜９０時間好ましくは
２〜４０時間にわたシ段階的にまたは継続的に添加する
のが好ましい。

田５〜９、特にｐｉ（７〜８．５で操作するのが好まし
い。その他アミノ変換反応は１０℃〜６５℃、特に２０
〜５０℃の温度範囲で実施するのが好都合である。これ
よジ温度が低いと酵素反応が遅くなってゆき、一方これ
よシ温度が高いとり素が不活化されてゆく。

最も好都合な操作法はそれぞれの微生物の如何に応じた
ものであり、そして簡単な予備試験により容易に決定さ
れうる。

微生物をアミノ交換反応期間前ま九は期間中は透過性と
なすことが特に好都合であると判明し念。これはトルエ
ン、セチルトリメチルアンモニウムブロマイド、ジメチ
ルスルホキシド等のような適当な薬剤をイ゛ンキュベー
ション培地に添加することによシなされうる。

以下の実施例によｐ本発明をよシ詳細に説明する。チ記
載は別に断わシ、なければ重量によるものとする。

実施例　１ 微生物の培養と後処理 寄託されるかまたは自由に入手しうる前記細菌をＬＢ−
培地（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ−培地：１１Ｄｉｏ
ｒバクト（Ｂａｃｔｏ）−）リプトン／　ｓ　ｔ　’ク
ト９９抽出物／　１０　ｔ　ＮａＣ１（ｐＨ７，５）　
］　またはＭ９−最少培地〔１７Ｉ当Ｆ）　６　？　Ｎ
ａ２ＨＰＱ４／’５１’　ＫＨ２ＰＯ４／［１，５ｆ　
ＮａＣ１／　１　　ｆ’　ＮＨ４Ｃｌ／２　ｒｄ　１　
ＭＭｇＳＯ４＋　１０　ｍｊ２０チグ／Ｌ、　コース＋
　０．１ｄＩ　Ｍ　ＣａＣｌ２　＋　１　ｍｌ　’Ｉ％
ビタミンＢｌ　（サイアミノ）（ｐＨ７，４））中の液
体培養液４００ｒＩｔ中で３０℃（エシエリヒア・コリ
以外の全ての細ｅＭ）または６７℃（エシエリヒア・コ
リＤＨ１）で−夜培養した。

次に細菌を遠心分離しそして細胞ベレットをｒｉｌ　７
．０の洗伊緩衝液（１０ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４、ｊＱｍ
ＭＮａＣｌ）中で数回洗いそして終ジに細胞はレッド６
２につき洗浄緩衝液５ｄ中に懸濁した。この細胞を１分
間の超音波処理を５回行うことによシ崩壊させそして細
胞断片を遠心分離した。かくして得られた溶解物上澄み
液は一２０℃で数ケ月間保存されうる。

実施例　２ タンパク質の単離 タンパク質を単離するには、溶解物上澄み液５−ずつに
洗浄緩衝液を加えてそれぞれ５０ゴとなしそして硫酸ア
ンモニウムを６５チまで添加することにようタンパク質
を沈澱させた。

１０００Ｃ１’で１５分間遠心分離したのちタンパク質
はレットを１０　ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ７，０）
　、１　ｍＭＥＤＴＡ　、　２％グリセリンおよびｊ　
ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含有する溶液５−
中にそれぞれ再懸濁させた。これらの懸濁液も閤じ〈−
２０℃で保存されうる。精製効果をより良くするために
タンパク質の一部は硫酸アンモニウムで２回沈澱させた
。

タンパク質測定はビウレット法で行われた。

前記し＋７’（教示に従って行われた調製物中のタンパ
ク質含量は大抵の場合５〜１０ｍ９／−でめった。

アルカリゲネス・フエカリスＤＳＭ４１１５およびＤＳ
Ｍ　４１１３から得られるトランスアミナーゼの部分精
製を行うには、硫酸アンモニウムをそれぞれ１０％刻み
で２５チから７５％添加してタンパク質を分別沈澱させ
そして個々のフラクションのトランスアミナーゼ活性に
ついて検査（下記参照）した。最大の比活性を有するタ
ンパク質フラクションをセファデックスＧ１００を含有
するゲル濾過カラムに適用しそして１０ｍＭのＮａ２Ｈ
ＰＯ４（ｐＨ７，０）を用いて溶離した。トランスアミ
ナーゼ比活性が最大である溶出液クラクションを硫酸ア
ンモニウムで反復沈澱させることＫよシ濃縮しそして１
０　ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐｉ（７，０）、１ｍＭ　
ＥＤＴＡ　、　２　％グリセリンおよび１　ｍＭ　ＤＴ
Ｔを含有する溶液中に５Ｑ／ｖｔｔとなるようにとった
。

（セファデックス（Ｓ　ｅｐｈａｄｅｘ）■Ｇ１００）
ポリデキストシンカ２ムフラクシヨンの分子量は標準分
子量タンパク質との比較により測定した。

単離されたトランスアミナーゼフラクションの純度はタ
ン／ぞり質試料を１０％ＳＤＳ　／ポリアクリルアミド
ゲル中で電気泳動すること罠よシ検査した。

実施例　３ 液体培養におけるホスフィノスリシン合成試験唯一のＮ
源として３　ｙ　／　ｌ　（２０ｍＭ　）のＬ−グルタ
ミン酸および２　ｔ／ｌ　（１０ｍＭ）のナトリウム−
（３−カルボ午シー３−オキソーフ四ヒル）−メチルホ
スフィネートを含有するＬＢ培地中の各細菌菌株の５−
培養物を３０℃で調製した。１日および２日後に１−の
試料を採取しそして細菌細胞を９５℃に２０分間加熱す
ることにより殺した。遠心分離したのち上澄み液をとり
出しそしてアミノ酸分析器（ＡＡ−分析器）中でホスフ
ィノスリシン形成について検べた。アルカリゲネス・フ
エカリスＤ８Ｍ　４１１５は２４時間後ＫＡＸを０．３
ｆ’／ＶのＬ−ホスフィノスリシン（α−ケト酸に基づ
き１５％の変換率）に変換した。

４８時間後には５？／ｌのＬ−ホスフィノスリシン（２
５％の変換率）が得られた。

実施例　４ 細胞抽出物およびタンパク質単離物を用いるトランスア
ミナーゼ試験 細菌の溶解物上澄み液および単離された総タンパク質、
ならびにアルカリゲネス・フエカリスＤＳＭ　４１１５
およびＤＳＭ　４１１３から得られた富化されたトラン
スアミチーゼフラクションを１０　ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ
４および１０　ｒｒＪＡ　Ｎａ（’ｌ（ｍ７．０　）を
含有する溶液を用いてタンパク質含量２０〜６０１１９
／ゴに調整しそしてＮＨ２−供与体としての８０ｍＭＬ
−グルタミン酸および２０　ｍＭナトリウム−（３−カ
ルボキシ−５−オキソ−プロピル）−メチルホスフイネ
ートを含有する標準バッチ中３０℃でインキュベーショ
ンした。実験条件の如何に応じインキュベーシミン時間
０〜２４時間で１００μｊの試料を採取し、タンノ々り
質を９５℃で１０分間変性させ、遠心分離しそして反応
上澄み液を以−分析器中でホスフィノスリシンについて
検査した。

対照反応は何ら供与体アミノ酸またはナトリウム−（３
−カルボキシ−３−オキソ−プロピル）−メチルホスフ
ィネートを含有しないか、または熱不活化したタンパク
質（９５℃、１０分間）を用いて行われた。

特異的なトランスアミナーゼ阻害剤として１０鮨のヒド
ロキシルアミノを添加することによりホスフィノスリシ
ン形成が完全に抑制された。

ホスフィノスリシン−トランスアミナーゼ比活性はタン
パク質１７１ｇにつき１時間につき形成されたホスフィ
ノスリシンのｎモルで示され、アミノ交換の反応性はタ
ンバク質１１９尚シまなは１！！当夛当分１で性成され
るホスフィノスリシンのμモル（Ｕ／タンパク質ｓｇま
たはＵ／ｌ）で示される。１単位（ロ）はＬ−ホスフィ
ノスリシンへの変換毎分１μモルに相痛する。

ａ）だ解物上澄み液（未精製）を用いるＬ−ホスホノス
リシン（ＰＴＣ）合成 りＳＭ　４１１５　　Ｕ／ｌ） Ｕ／Ｊ　） ｂ）単離された全タンパク質（（ＮＨ４）　２ＳＯ４で
機知を用いるＬ−ＰＴＣ合成 ＤＳＭ４１１５ Ｃ）精製トランスアミナーゼ酵素を用いるＬ−ＰＴＣ合
成 り８Ｍ４１１５ ＤＳＭ４１１３　　　υ、２ル４９タン／ぞり質　　３
．８？／ｌ　　　　９５チロ０００Ｕ／Ｊ 実施例　５ ホスフィノスリシン合成の立体選択性に関する試験 アミノ変換反応によるホスフィノスリシン生成に関する
立体特異性をＮ−アセチルトランスフェラーゼ反応によ
シ検査した。この酵素は２〜６の土壌細菌で検出（例え
ば酉ドイツ特許出願Ｐ　５６２８７４７．４）されそし
て知られた方法で単離されうる。このものはＬ−ホスフ
ィノスリシンとのみ立体特異的に反応してそれがアセテ
ルー　Ｃ０Ａ−依存性反応により定量的に対応するＮ−
アセチル肪導体に変換される。

試験においては、アミノ交換反応によりホスフィノスリ
シンが形成されている実施例４で得られた反応上澄み液
をアルビカンス・フェカリスＤＳＭ　４１１５から得ら
れたタンノぐり質（１１９／ｍｌ）および１０ｍＭのア
セチルＣＯＡと３０℃で５時間インキュベーションした
。反応上澄み液を次に再び未反応ホスフィノスリシンに
ついて頽−分析器で検査した。

アミノ交換反応により酵素的に形成されたホスフィノス
リシンはそれぞれＮ−７セチルトランスフ工ラーゼ反応
により完全に崩壊きれた。

これはアミノ変換反応の立体選択性を証明している。純
粋なＬ−ホスフィノスリシンが形成されている。

実施例　６ エシエリヒア・コリＡＴＣＣ１１３０３の選択エシエリ
ヒア・コリＡＴＣＣ１１３ｏ３’ｂ常法によシ培養しそ
してＥ、Ａｄｅｌｂｅｒｇ氏他のｒ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　
。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ、Ｊ　１８．７８８
（１９６５）の記載によｐＮ−メチル−Ｎ−二トローＮ
−二トロソグアニジン（ＭＮａ）を用いて突然変異させ
た。ＭＮＧで処理した細胞を下記組成を有する圧熱滅菌
された寒天上に画線した。　　　　′ フマル酸　　　　　　　　５　ノ／ノ 肉エキス　　　　　　　２０　　’／／１アスパラギン
酸　　　　２０　　ｔ７ｉＫＨ２ＰＯ４２９／１ ＭｇＳＯ４・７　Ｈ２Ｏ０，５？／１ ＣａＣＪ２・２　Ｈ２Ｏ０１９／ｌ 寒　　天　　　　　　　　　　　　２０　　？／１水酸
化ナトリウム溶液を用いてＰＩ（７，２Ｋ調整フェニル
ピルベートの滅菌濾過された溶液をまだ熱い寒天溶液に
フェニルピルベートの最終濃度が２４　ｔ／ｌとなるよ
うに注いだ。このプレートを６７℃で４日間インキュベ
ーションした。

直径１Ｂ以上のコロニーを単離した。生育する菌株の２
０チが出発菌株に比較して高いトランスアミナーゼ活性
を有していた。

トランスアミナーゼ活性はＳ　ｉ　ｇｍａテストキット
００３９０を用いて測定された。

実施例　７ ａ、エシェリヒア−コリからのコスミドｐ工λ（Ｓ６０
２６の単離および消化 トランスボゾンＴｎ９０３のカナマイシン抵抗性が存在
する商業的に入手しうるＥｃｏＲＩ断片（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ社Ｊｌｉｉ　、　Ｕｐｐｓａｌａ　、スウェーデ
ン）を、コスミド１）ＬＡＦＲＩ（ＡＴＣＣ３７１６７
）の独特のＥｃｏＲＩ切断部位切断部口中ニングするこ
とによりコスミドｐＩＭｓ　６０２６を誘導する。Ｂａ
ｍＨＩでの消化そして続く再連結によシ商業的に入手し
うるＥｃｏＲＩ断片の大部分が欠失されて、１個のＢａ
ｍＨＩ切断部位が２個のＥｃｏＲＩ切断部位によフ両側
をはさまれた短いＤＮＡ片のみが挿入物として残存する
。

エシエリヒア・コリＨＢ１０１から；スミドｐＩＭｓ６
０２６を単離するにはＨｕｍｐｈｒｅｙｓ氏他の方法（
Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ　３８３．
４５７〜６３（１９７５））またはＢｉｒｎｂｏｉｍ氏
他によるアルカリ分解（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒ
ａｓ、７，１５１３（１９７９）］のいずれかに従い１
０倍の規模で実施した。いずれの場合もプラスオドＤＮ
ＡはＣ５ＣＪ昨ｔＢｒ密度勾配遠心分離によシ少くとも
１回は精製した。

このコスミドｐＩＭｓ　６０２６を＆！造者Ｎｅｗ　Ｅ
ｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓの教示に従い操作して制限
醇素ＢａｍＨ工で完全に消化した。この消化が完結した
かどうか検査するには制限調製物の一部分を０．８％ア
ガロ−スケ゛ルに適用して電気泳動にかけた＠エチジウ
ムブロマイドで着色しそして短波長Ｗ光線（２５４ｎｍ
）で照射して１本のバンドのみが見られる場合は完全な
消化を示すものとされた。

消化されたコスミドＤＮＡからフェノール処理により制
限酵素を除去し、ＤＮＡをエタノールで沈澱させ、７０
チエタノールで洗いそして真空下に乾燥したのち適当量
のＴｇ緩衝液（１０ｍＭのトリスおよび１１ＩＩＩＭの
ＥＤＴＡ、ｐＨ８，０＞中にとった。

選択により、製造者Ｅｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈ
ｅｉｍの教示に従いアルカリホスファターゼでさらに処
理した。１μｌのアルカリホスファターゼ（ＣＩＰ）を
添加したのち３７℃で３０分間インキュベーションし、
フェノール処理により反応混合物から酵素を除去し、そ
してＤＮＡを前記したようにして精製した。これを終り
にＴＥ緩衝液中に再懸濁し７＋、。

ｂ、エシエリヒア・コリＡＴＣＣ１ｊ３０３からのＤＮ
Ａの部分消化 Ｍａｒｍｕｒ氏のｒｌ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、Ｊ　５！１
．１５５〜１６２（１９６１）記載の方法に従いエシエ
リヒア・コリＡＴＣＣ１１３０３から全ＤＮＡを単離し
な。この単離された全ＤＮＡを制限酵素５ａｕ３Ａを用
いて部分消化すると主に２０〜３０　ｋｂの寸法の断片
が生成しな。

この目的には予備実５験においてこの反応に最適のＤＮ
Ａ　：醇素比ならびにＤＮＡに及ぼす酵素の最適作用時
間が判定された。適当な操作法はＢＲＬ社から出された
パンフレット「ＦｏｃｕｓＪ　７　（２）　＊　３（１
９８５）に記載されている。最適と定められた反応時間
経過後、？！＃累を６５℃に１０分間加熱することＫよ
り破壊しそして所望の寸法範囲内のＤＮＡ断片が形成さ
れたかどうかをアガロースメル電気泳動【よフ適轟なり
ＮＡ−マーカー例えば７アージλのＥｃｏＲＩ消化され
たＤＮＡを用いて検査した。

Ｃ１制限部位の連結 エシエリヒア・コリＡＴＣＣ１１３０３から得られる総
ＤＮＡを５ａｕ３Ａで部分消化したものをＢａｍＨＩで
完全に９ＪＷｒシそしてアルカリ７オス７アターゼ処理
したｐＩＭｓ　６０２６コスミドＤＮＡと約１＝５なる
モル比で混合した。生成した混合物を、ＮｅｗＥｎｇｌ
ａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓの教示に従い酵素Ｔ４−ＤＮＡ
リガーゼにとって最適のイオン濃度を生ずるように数倍
濃度の俵衝液で処理し、そして酵素１μｌと−ｒＪに１
６℃で少くとも１４時間インキュベーションした。反応
混合物の総量は５０μ！でろシ、総ＤＮＡ饋度は２０μ
ｇ／Ｉｎｌでめった。

ｄ、λ−ファージ中へのパッケージングリガーゼ反応が
行われた後、実施例３で得られたＤＮＡをｉｎ　Ｖｉｔ
ｒＱでλ−ファージの頭部にパッケージングした。この
目的に必要な抽出物はＢ、Ｈｏｈｎ氏のｒＲ８ｃＯｒｎ
ｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　１ｎＥｎ　ｚ
ｙｍｏ　１０　ｇ７　Ｊ　６８　ｒ　Ａｃａｄ　ｅｍ　
ｉ　ＣＰ　ｒ　ｅ　５１　Ｓ　＊　ＮｅＷＹｏ　ｒ　ｋ
　＊２９９〜３０９頁（１９７９）記載の方法により２
種の異なる細菌菌株から得ることができるしま之はＢｏ
ｓｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ社またはＡｍａｒ
ｓｈａｍ　Ｂｕｃｈｌｅｒ。

Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ社から得られりる。

実施例３で得られた混合物３μ！を直前に解凍されたＡ
ｍａｒｓｈａｍ社の細菌抽出物と水冷下に充分によく混
合した。この混合物を２０℃で６０〜６０分間インキュ
ベーションしそして次にＳＭ−緩衝液（’Ｉ　００ｍＭ
　ＮａＣ１、１０ｍＭ　ＭｇＳＯ４、５０ｍ１４トリス
−ＨＣｌ（ｐＨ７，５’）および０．０１係ゼラチン）
２００μｌを加えた。この混合物を直接形質導入反応に
かけるかま７ＩＣＩｆｉ１０μｌのクロロホルムを添加
したのち後程の使用時まで４℃で保存した。

ｅ、エシエリヒア・コリＤＧ　３０の形質導入１％Ｂａ
ｃｔｏ　−トリプトン、０．５チ醇母エキスおよび０．
５％ＮａＣｌからなるＬ−ブイヨン５−に０．４％のマ
ルトースを加えそして定常生長期にあるエシエリヒア・
コリＤ（）　３０の液体培養物５０μｌを接極した。早
期定常期に達するまでこの混合物を３７℃で１２時間イ
ンキュベーションした。細菌を遠心分離しそして１０ミ
リモルＭｇＣ！！２水溶液２．５ｄ中に注意深く再懸濁
した。

実施例４記載の混合物１０μＪＫ濃細菌懸濁液２０μｌ
を加えそして室温で５０分間インキュベーションした。

次にＬ−ブイヨン２００μｌをこれに加え、この混合物
を時々ｖＲ盪しながら６７℃で１時間インキュベーショ
ンした。

この調製物５０μｌずつを２０μｇ／ｍｌのテトラサイ
クリンを含有するし一ブイヨンー寒天上に塗布し念。こ
のプレートを３７℃で少くとも１２時間インキュベーシ
ョンした。前記した操作法により、１つの調製物から平
均１０００個のコロニーを得ることができた。

ｆ、　　ａｓｐＣ，１ｌｖＥまたはｔｙｒＢ遺伝子を有
するエシエリヒア・コリＤＣ）　３０の選択 ２０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有するＬ−ブイ
ヨンー寒天上で前記し六方法に従いエシェリヒア・コ！
ｊ　Ｄ（）　３０の形質導入により得られた約８００個
のコロニーを最少寒天上ＶＣ「拾い移し」た。最少寒天
はアミノ酸イソロイシン、ロイシン、バリン、アスパラ
ギン酸およびフェニルアラニンを補充された、グルコー
ス含：＠Ｍ９培地（Ｍｉｌｌｅｒ、「Ｅｃｐｅｒｉｍｓ
ｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓＪ
、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、１９７２　
）から々る０しかしながら菌株ＤＧ　３Ｑが同じく最早
や合成できないアミノ酸チロシンは培地に添加されなか
った。８００個の「拾い移しコたココニーのうち７個が
最少培地上で生育できた。

エシエリヒア・コリＤＧ　３０中の３　ｍのありうる遺
伝子ａｓｐＣｓ　１ｌｖＥおよびｔｙｒＢを区別するた
めにこれら７種のコロニーを、遺伝子の１つによりコー
ドされるトランスアミナーゼの１つに対して基質特異性
を示す１アミノ酸をそれぞれ除外して前記したアミノ酸
を補充した前記最少培地上に再び「拾い移し」た。

その結果を以下の表に示す。

想定された基質以外を補充した最少培地１　　　　　　
＋　　　　＋　　　　−＋　　　　　ｔｙｒＢ２　　　
　　＋　　　　＋　　　　　　　　＋　　　　　ｔｙｒ
Ｂ３　　　　−　　　　＋−＋　　　　＋ｐＨ１ｖＥ４
　　　　　　　　　＋−＋　　　　＋ｐＨ１ｖＥ５　　
　　　＋　　　　＋　　　　−＋　　　　　ｔｙｒＢ６
　　　　　＋　　　　＋　　　　−＋　　　　　ｔｙｒ
Ｂ７　　　　−＋−＋　　　　＋ｐＨ１ｖＥ＋　＝生育
良好 ＋−ミ生育不良 −に生育せず ｇ、ｔｙｒＢ遺伝子の位置測定 Ｍａｎｉａｔｉｓ氏他、Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒ
ｂｏｒ　、　３６６〜３７０（１９８２）　Ｋよるミニ
分析を行うことにより、実施例６で得られたクローン１
〜７からコスミドＤＮＡが得られた。次にこのコスミド
ＤＮＡ　ヲエシエリヒア・コリＤＨ１（ＡＴＣＣ３３８
４９）中に導入し、そこからこれらは良好な収率で再び
単離できた。

本来エシエリヒア・コリＤ（）　３０　（実施例６参照
）のクローン３から得られたプラスミドＤＮＡを、この
ＤＮＡで形質転換された菌株エシエリヒア・コリＤＥｔ
ｊから単離しそして制限酵素５ａｌＩおよびＳｍａＩを
用い製造者Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂ。

の教示に従い完全に消化した。ベクターｐＡＴ１５３も
Ｃ１ａＩを用いて完全に消化し、これを次にアルカリホ
スファターゼでさらに処理した。２ｆｌのＤＮＡを一緒
にし、実施例４記載の方法に従い相互に連結しそして菌
株エシエリヒア・コリＡＴＣＣ１ｆ３０３のコンピテン
トな細胞をリガーゼ調製物の一部分、例えば１０μｌを
用いて形質転換した。５０μｇ、／ｌ１ｎｌのアンピシ
リンを含有するＬ−ブイヨンプレート上の抵抗性のコロ
ニーを選択し、そして２０μｇ７ｍｌのテトラサイクリ
ンを含有するし一ブイヨンプレート上の「レプリカ培養
」によシマーカー不活化および従ってと９込みについて
検査した。表現型ＡｐｒＴＣ５を示すコ篇ニーから、ミ
ニ分析法によりプラスミドＤＮＡを単離しそして制限酵
素Ｃ１ａＩを用いて完全に消化することによシベクター
ｐＡＴ１５３中におけるＣＪａ工断片の存在について検
査した。

ｈ、　　）ランスアミナーゼ活性の検査実施例７で得ら
れたクローンをＡＰＰＡＴ試験（フェニルピルベート−
アミノトランスフェラーゼ分析装置、Ｓｉｇｍａ−テス
トキットＧＯ３９０、α・・ケトグルタレートをフェニ
ルピルベートによ）置換を用い芳香族トランスアミナー
ゼ活性、すなわちｔｙｒＢの遺伝子産物について検査し
た。形質転換されでいない出発菌株エシェリヒア・コＩ
Ｊ　ＡＴＣＣ１１３０３を比較用に用いた。ここで１例
においては出発菌株エシエリヒア・コリＡＴＣＣｆ１３
０３に比較してｔｙｒＢ活性の著明な増加、すなわち５
〜１０倍の増加が測定された。

適轟なマーカーを使用するアガロースゲル電気泳動によ
り、約２．７　ＭＤの寸法のＣ１ａＩ断片がとり込まれ
て含有されるｐＡＴ　１５３ベクターがｔｙｒＢ遺伝子
活性の増大を示す菌株中に含有されることを示すことが
できた。単離されたプラスミドＤＮＡを用いて新たにプ
ラスミド不含菌株エシエリヒア・コリＡＴＣＣ’　１１
３０３を形質転換した場合、あらゆる場合にｔｙｒＢ遺
伝子活性が約５〜１０倍増加することが観察された。

１１ｖＥ遺伝子を用いるエシエリヒア・コリＡＴＣＣ１
１３０５の形質転換も同様な方法で行われる。

実施例　８ Ｌ−第三ロイシンの調製 ａ、エシエリヒア・コリＡＴＣＣ１１３０３の実施例６
によυ選択された菌株を下記栄養溶液中で培養した。

フマル酸　　　　　　　　　１０　　？／１肉エキス　
　　　　　　　　２０　　？／１アスパラギン酸　　　
　　　８ｙ／１ ＫＨ２ＰＯ４２１７１ ＭｇＳＯ４・７　Ｒ２００゜５　ｆ／ＩＣａＣＡ！２・
２　Ｒ２００，１ｔ／１３．３−ジメチル−２−ナキソ
ーブタン酸　　　　４　　　ｆ／１水酸化ナトリウム溶
液を用いて［）８７．４に調整３７℃で４８時間生育さ
せた後、細胞を遠心分離した。ＲＰＣ−８カラム上のＨ
ＰＬＣ（移動相、１００ｍＭのＮａ−アセテート（ｐＨ
７，２）およびメタノールから々るグラジェント）によ
り上澄み液中に０．９　ｊ／ｌのＬ−２−アミノ−３，
３−ジメチル−ブタン酸（第三ロイシン）が測定された
。

ｂ、　　ａ１胞物質を実施例８ａと同様にして培養しそ
して１０ミリモル／ｌのトリス−ＨＣｌ緩衝ｔ（ｐＨ７
，４）ＧＦＩの１０ｆ／ノのアスパラギン酸および４１
／ｌの３．３−ジメチル−２−オキソ−ブタン酸からな
る溶液中で振盪しながらインキュベーションした。３７
℃で２４時間後、ＨＰＬＣによシｔ９９／ｊのＬ−２−
アミノ−３，３−ジメチル−ブタン酸が測定された。

実施例　９ Ｌ−ホスフィノスリシンの調製 細胞物質を実施例８と同様にするが６．３−ジメチル−
２−オキンーブタン酸の代りに４２／ｌのジメチルピル
ベートを用いて培養した。４８時間後細胞を遠心分離し
、緩衝液で洗いそして１０ミリモル／ｌのトリス／　Ｈ
Ｃｌ　（ｐＨ７，４）中の４２／ｌのナトリウム−（６
−カルボキシ−３−オキソ−プロピル）−メチルホスフ
ィネートおよび８ｙ／ノのアスノぐラギン酸ナトリウム
からなろ水溶液中３７℃で２４時間インキュベーション
した。次に細胞を遠心分離しそして上澄み液中に形成さ
れ之し−ホスフィノスリシン量をＨＰＬＣ分析により測
定した。３．２Ｆ／ノのホスフィノスリシンが測定され
た。

実施例　１０ 組換え型ａｉ認を用いるＬ−ホスフィノスリシンの１１
Ｍ１製 プラスミドによりコードされた１ｌｖＥ）ランスアミナ
ーゼ活性を有する実施例７で得られるエシエリヒア・コ
リ菌株を下記栄養溶液中で発酵させた。

グルコース　　　　　　　　　５　　ｆ／ｌＮａ２ＨＰ
Ｏ４５，５？／１ ｘＦ２ＰＯ４１，８ヴ１ （ＫＨ４）２ＨＰＯ４１２？／１ （ＮＨ４）２３０４　　　　　　　　　　６　　ｙ／１
ＭｇＳＯ４０，２？／１ 酵母エキス　　　　　　　　１？／ｇ ＮａＯＨを用いてｐＨ７，４に調整 ４時間生育させたのち毎時０．５〜２０？／ｌのグルコ
ース指数補給を開始した。１６時間生育させたあとで細
胞は乾燥重量２０？／ｌそしてトランスアミナーゼ活性
１！５０００μモル／分／ｌを有していた。発酵後細胞
をそれ以上洗浄することなく直接１００−の反応バッチ
中に使用した。

反応混合物は１Ｑミリモル／ｌのトリス／ＨＣ１緩衝液
（ｐＨ７，４）中ｉｃ　１５００μモル／分／ｊのトラ
ンスアミナーゼ活性、０゜１ｍｌのポリオキシエチレン
ソルビタンモノオレエート（ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）Ｒ
８０）、９０ミリモル／ｌのナトリウム−（３−カルボ
キシ−３−オキソ−プロピル）−メチルホスフィネート
および２００ミリモル／ｌのグルタミン酸を含有しそし
て６７℃で穏やかに振盪した。２４時間抜細胞を遠心分
離しそして上演み液中のＬ−ホスフィノスリシンをＨＰ
ＬＣ分析によシ測定した。７０ミリモル／ｌのＬ−ホス
フィノスリシンが測定された。

特許出願人　　ヘキスト・アクテエンゲゼルシャフト外
２名 ０発　明　者　　リューデイガー・マル　　ドイクヴア
ルト　　　　　　　イン

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）３，３−ジメチル−２−オキソ−ブタン酸および（
   ３−カルボキシ−３−オキソ−プロピル）−メチルホス
   フィン酸またはこれら化合物の塩をアミノ基供与体とし
   てのアミノ酸の存在下にそれぞれアミノ交換することか
   らなるＬ−第三ロイシンおよびＬ−ホスフィノスリシン
   の製法。 ２）微生物を用いてアミノ交換反応が行われることから
   なる特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３）パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、アルカリ
   ゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、リゾビウム（Ｒｈ
   ｉｚｏｂｉｕｍ）、シユードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏ
   ｎａｓ）、セラシア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、アグロバク
   テリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）およびストレ
   プトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属の微生物ま
   たは腸内菌群の細菌によりアミノ交換反応が行われるこ
   とからなる特許請求の範囲第２項記載の方法。 ４）アルカリゲネス・フエカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎ
   ｅｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ）ＤＳＭ４１１５、アルカリゲ
   ネス・デニトリフイカンス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　
   ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）ＤＳＭ　４１１４、シユ
   ードモナス・パウシモビリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
   　ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ）ＤＳＭ　４１２０、シユ
   ードモナス種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐｅｃ．）
   ＤＳＭ　４１１９、セラシア・プリムシカ（Ｓｅｒｒａ
   ｔｉａ　ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ）ＤＳＭ　４１１６、ア
   グロバクテリウム・ツメフアシエンス（Ａｇｒｏｂａｃ
   ｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、エシエリヒ
   ア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＤＨ１
   、エシエリヒア・コリＡＴＣＣ　１１３０３、エンテロ
   バクター・アグロメランス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ
   　ａｇｇｌｏ−ｍｅｒａｎｓ）ＤＳＭ　４１２２、エン
   テロバクター種（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐｅｃ
   ．）ＤＳＭ　４１２１、パラコッカス・デニトリフイカ
   ンス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ　ｄｅｎｉｔｒｉ−ｆｉｃ
   ａｎｓ）ＤＳＭ　６５、ストレプトミセス・ヒグロスコ
   ピクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｈｙｇｒｏｓｃｏ
   ｐｉｃｕｓ）およびストレプトミセス・ビリドクロモゲ
   ネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｖｉｒｉｄｏｃｈｒ
   ｏｍｏｇｅｎｅｓ）または３種の土壌単離物ＤＳＭ　４
   １１３、ＤＳＭ　４１１７およびＤＳＭ　４１１８を用
   いてアミノ交換反応が行われることからなる特許請求の
   範囲第１および第２項記載の方法。 ５）遺伝子操作をした微生物を用いてアミノ交換反応が
   行われることからなる特許請求の範囲第２項記載の方法
   。 ６）ｔｙｒＢ遺伝子またはｉｌｖＥ遺伝子を含有するプ
   ラスミドで形質転換されたエシエリヒア・コリＡＴＣＣ
   　１１３０３を用いてアミノ交換反応が行われることか
   らなる特許請求の範囲第５項記載の方法。 ７）細胞抽出物、単離された総タンパク質または精製ト
   ランスアミナーゼを用いてアミノ交換反応が行われるこ
   とからなる特許請求の範囲第１〜６項のいずれか１項記
   載の方法。 ８）アミノ基供与体とα−ケト酸とが１：１〜５：１の
   比率で用いられることからなる特許請求の範囲第１〜７
   項のいずれか１項記載の方法。 ９）アミノ基供与体とα−ケト酸とが１：１〜２：１の
   比率で用いられることからなる特許請求の範囲第８項記
   載の方法。 １０）アミノ交換反応がｐＨ５〜９で実施されることか
   らなる特許請求の範囲第１〜９項のいずれか１項記載の
   方法。 １１）アミノ交換反応がｐＨ７〜８．５で実施されるこ
   とからなる特許請求の範囲第１０項記載の方法。 １２）アルカリゲネス・フエカリスＤＳＭ　４１１５、
   アルカリゲネス・デニトリフイカンスＤＳＭ　４１１４
   、シユードモナス・パウシモビリスＤＳＭ　４１２０、
   シユードモナス種ＤＳＭ　４１１９、セラシア・プリム
   シカＤＳＭ　４１１６、エンテロバクター・アグロメラ
   ンスＤＳＭ　４１２２、エンテロバクター種ＤＳＭ　４
   １２１および３種の土壌単離物ＤＳＭ　４１１３、ＤＳ
   Ｍ　４１１７およびＤＳＭ　４１１８および特許請求の
   範囲第１〜１０項のいずれか１項記載の方法に使用でき
   る場合のそれらの突然変異体および変種。