KR20070017562A - 신규한 오메가아미노트랜스퍼라제, 이의 유전자 및 이의이용 방법 - Google Patents

신규한 오메가아미노트랜스퍼라제, 이의 유전자 및 이의이용 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 광학활성 아릴아민을 유일한 질소원으로 포함하는 최소배지를 이용하여 토양으로부터 L형 광학선택성이 높은 아미노기 전이효소 활성을 갖는 통성 혐기성 그람음성간균(비브리오 프루비알리스 JS17 : Vibrio fluvialis JS17) 및 그람음성간균 알칼리제네스 데니트리피칸스 YOP(Alcaligenes denitrificans YOP)을 분리하여, 분리된 미생물로부터 오메가아미노트랜스퍼라제(트랜스아미나제)를 코딩하는 유전자를 제공한다.
광학활성아민,아미노기전이효소,오메가아미노트랜스퍼라제,오메가트랜스아미나제

Description

신규한 오메가아미노트랜스퍼라제, 이의 유전자 및 이의 이용 방법{NEW OMEGAAMINOTRANSFERASE, GENE THEREOF AND METHOD OF USING THE SAME}
도 1 은 비브리오 프루비알리스 JS17로부터 생산된 오메가아미노트랜스퍼라제의 아미노산 서열 및 폴리뉴클레오티드의 서열을 나타내는 도식이다.
도 2 는 알칼리제네스 YOP로부터 생산된 오메가아미노트랜스퍼라제의 아미노산 서열 및 폴리뉴클레오티드의 서열을 나타내는 도식이다.
도 3 은 비브리오 프루비알리스 JS17로부터 생산된 오메가아미노트랜스퍼라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현용 벡터 pET24ma에 재조합시키는 과정을 나타내는 도식이다.
도 4 는 알칼리제네스 데니트리피칸스 YOP로부터 생산된 오메가아미노트랜스퍼라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현용 벡터 pET23b에 재조합 시키는 과정을 나타내는 도식이다.
도 5 는 오메가아미노트랜스퍼라제의 반응 개략도이다.
본 발명은 신규의 효소, 상기 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 효소 를 발현시키기 위한 발현 벡터, 상기 발현 벡터를 이용하여 숙주 세포를 형질전환시켜 얻어진 형질 전환체 및 이러한 형질 전환체로부터 생성된 효소를 사용하여 광학활성아민을 생산하는 방법에 관한 것이다.
보다 상세하게는, 본 발명은 토양에서 분리한 L 형 광학선택성을 갖는 신규한 미생물로부터 수득된 오메가아미노트랜스퍼라제, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 상기 폴리뉴클레오티드로 형질 전환된 형질 전환체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 유전자를 사용하여 광학선택적 아릴 아민을 생산하는 방법에 관한 것이다.
아미노산 및 광학활성아민을 제조하기 위한 아미노트랜스퍼라제에 대한 연구가 진행되고 있고, 또한 이들은 생체 대사에 있어 중요한 역할을 하여 생물계에는 어디에나 편제되어 있음이 밝혀져있다 (strling, 1992; Taylor, 1990; Chao,1999). 이 효소들은 사용기질의 다양성, 높은 안정성 등의 장점에도 불구하고, 아미노기 전이반응의 기본적 특성인 낮은 평형상수 값으로 인하여 산업화하는 데에는 한계가 있었다 (Taylor, 1998).
최근에는 비천연 아미노산과 D-아미노산을 효율적으로 생산해낼수 있는 공정들이 개발되어 졌으며, 후자의 경우 커플링된 효소반응 또는 형질전환된 균체의 반응을 통해 생산물을 제거함으로써 반응의 평형상수에 의해 제기되는 문제를 극복하는 방안들이 제시되었다.(Bartsch, 1996; Stinson, 1997; Taylor, 1998; Chao 1999)
아미노트랜스퍼라제는 사용되는 기질의 카르복실기의 위치를 기준으로 하여 아미노기가 도입되는 위치에 따라 알파아미노트랜스퍼라제와 오메가아미노트랜스퍼라제로 분류되며, 알파아미노산의 알파아미노기를 전이하는 알파아미노트랜스퍼라제와는 달리 오메가아미노트랜스라제는 베타아미노산의 베타아미노기를 전이하는 대표적인 반응을 가짐으로써 알파자리가 아닌 다른 위치의 아미노기 전이 특성을 가진다(Yonaha et al, 1980; Christen et al, 1985).
본 발명의 목적은 천연 또는 비천연 광학활성아민을 광학분할반응을 통해 생산할 수 있는 효소 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 유전자 재조합 기술을 이용하여 상기 효소를 효율적으로 생산하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 상기 효소를 생산하는 형질전환체를 제공하고, 이러한 형질 전환체로부터 생성된 효소를 사용하여 광학활성아민을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 광학활성아민의 아미노기 전이효소 활성을 갖는 신규한 효소에 관한 것이다. 상기 효소는 서열 목록 서열번호 1 또는 3 으로 나타낸 아미노산서열, 또는 그의 하나 이상의 아미노산서열의 치환, 삽입, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
바람직하게는 상기 효소는 그람음성간균 미생물로부터 유래할 수 있다. 더욱 바람직하게는, 미생물은 비브리오 프루비알리스 JS17(Vibrio fluvialis JS17)과 알칼리제네스 데니트리피칸스 YOP(Alcaligenes denitrificans YOP)이다.
하나의 양태로서, 본 발명은 상기 기재된 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 에 관한 것이다. 좀더 상세하게는, 본 발명은 광학활성아민의 아미노기 전이효소 활성을 갖는 신규한 오메가아미노트랜스퍼라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
하나의 양태로서, 본 발명은 상기 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다. 바람직하게는, 발현 벡터는 pET24ma 및 pET23b 일 수 있다.
하나의 양태로서, 본 발명은 상기 기재된 벡터를 사용하여 숙주 세포를 형질전환함으로써 수득되는 형질전환체에 관한 것이다.
바람직하게는, 숙주 세포는 대장균일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 형질전환체는 대장균 DH5α일 수 있다.
하나의 양태로서, 본 발명은 오메가아미노트랜스퍼라제를 이용하여 광학활성아민을 광학특이적으로 생산하는 방법에 관한 것이다.
하기에서 본 발명을 상세하게 설명할 것이다.
본 발명에서 사용되는 용어들은 하기의 의미를 갖는다 :
(1) 아미노기 전이효소 : 아미노기를 한 분자에서 다른 분자로 옮기는 반응을 촉매하는 효소.
(2) 광학분할반응 : 양쪽 거울상이성질체(enantiomer)가 동일한 비율로 섞여 있는 라세믹 혼합물(racemic mixture)로부터 순수한 한쪽 거울상이성질체만을 분리(resolution)해내는 반응.
(3) 아미노기 공여체 : 아미노기 전이반응에서 아미노기를 제공하는 물질.
(4) 아미노기 수용체 : 아미노기 전이반응에서 아미노기를 전달받는 물질.
(5) bp : 염기쌍.
(6) 클로닝 : DNA 절편을 재조합 DNA 클로닝 벡터에 혼입시키고 이러한 재조합 DNA를 사용하여 숙주세포를 형질전환시키는 방법.
(7) 코스미드 : 숙주세포 내에서 플라스미드와 동일한 방식으로 복제할 수 있을 뿐 아니라 파지 헤드로 패키징(packaging)될 수도 있는 프라스미드인 제조합 DNA 클로닝 벡터.
(8) 게놈라이브러리 : 특정 유기체의 실질적으로 모든 DNA 서열을 대표하는 DNA 절편들이 클로닝된 재조합 DNA 클로닝 벡터 세트.
(9) kb : 킬로 염기쌍.
(10) ORF : 오픈리딩 프레임.
(11) PCR : 중합 효소 연쇄반응 - DNA의 어떤 영역을 특이적으로 증폭시키는 방법.
신규한 오메가아미노트랜스퍼라제 특성을 갖는 미생물의 선별
본원발명의 호열성 미생물의 선별을 위해 본 발명자들은 하기 표 1 의 조성을 가진, 광학활성 아릴아민인 (s)-α-메틸벤질아민을 유일한 질소원으로 포함하는 최소배지를 제조하고, 이를 이용하여 토양으로부터 표 1 에 기재된 (s)-α-메틸벤질아민을 질소원으로 사용하고, (s)-α-메틸벤질아민에 특이성을 갖는 아미노기 전이효소를 함유하고 있는 미생물을 선별하였다.
광학활성아민을 유일한 질소원으로 포함하는 최소배지성분
구분 성분 조성 비고
탄소원 글리세롤 100∼500mM
질소원 광학활성아민 20∼100mM
완충성분 KH2PO4 K2HPO4 1.31g/L 2.68g/L
CaCl2 MgSO4·H2O 0.2∼1mM 1∼5g/L
미량성분 ZnCl2 0.1∼0.5mg/L
MnSO4 0.1∼0.5mg/L
CuSO4·5H2O 0.1∼0.5mg/L
CoCl2·6H2O 0.1∼0.5mg/L
NiSO4 0.1∼0.5mg/L
H3BO3 0.02∼0.1mg/L
Na2MoO4·2H2O 2∼10mg/L
FcSO4·7H2O 4∼20mg/L
EDTA 0.5∼2.5mg/L
고체배지 아가 3%
*본 발명의 최소배지를 이용하는 선별 방법은 성장 속도에 따라 미생물을 선별하는 간단한 방법으로서, 아미노기 전이효소의 활성이 낮은 미생물은 배양 단계에서 자발적으로 제거되므로, 광학활성 아릴아민에 기질특이성을 나타내는 아미노기 전이효소를 함유한 고 활성 미생물을 선별할 수 있다 (표 2a 및 2b).
본 발명에서 선별된 미생물은 신규한 것으로서, 본 발명자들은 이의 16S rRNA 부분 서열을 코딩하는 DNA 서열의 특징을 통해 비브리오 프루비알리스 균 및 알칼리제네시스 데니트리피칸스 균으로 파악하고, 이를 각각 비브리오 프루비알리스 JS17 및 알칼리제네시스 데니트리피칸스 YOP 으로 명명하였다.
본원발명의 선별된 미생물 중 활성이 높은 것을 이용하여 클로닝하고, 이를 발현시켜, 기질특이성을 확인한 결과, 이 미생물은 광학활성 아민을 아미노기 공여체로 사용하는 아미노기 전이효소를 함유하고 있음을 알 수 있었다 (실시예 9 의 표 3, 4 및 5). 또한 얻어진 결과로부터 기존의 아미노기 전이효소중 오메가아미노트랜스퍼라제로 알려진 것과 비교하여 기질특이성 면에서 상이하여 신규한 오메가아미노트랜스퍼라제임을 알수 있었다. 하기 표 2a 및 2b 에는 오메가아미노트랜스퍼라제의 일반적 기질에 대한 특이성을 요약하였다.
ω-아미노산의 아미노 공여체 특이성:피루베이트 전달효소
아미노산a 상대적 활성
타우린 3.6
하이포타우린 132.0
아미노에틸 히드로겐 술페이트 1.5
2-아미노에탄 티오술페이트 0.7
3-아미노프로판 술폰에이트 80.0
글리신 0.4
β-알라닌 100
γ-아미노부티레이트 40.0
5-아미노발레레이트 6.0
6-아미노카프로에이트 8.2
7-아미노헵타노에이트 35.0
8-아미노옥타노에이트 77.0
DL-3-아미노-n-부티레이트 96.4
DL-3-아미노이소부티레이트 54.2
α인서트:p-아미노벤조에이트,L-카노신,L-글루타메이트,아미노메탄 술폰에이트,L-아스파르테이트,L-세린,L-α-아미노부티레이트,L-페닐알라닌,L-시스테인,L-오르니틴 및 D- 및 L-리신
ω-아미노산과 아민의 반응성:피루베이트 전달효소
아민α 상대적 활성
β-알라닌 100
에틸아민 30
에탄올아민 5
n-프로필아민 35
이소프로필아민 40
n-부틸아민 60
이소부틸아민 50
sec-부틸아민 30
n-아밀아민 80
이소아밀아민 30
n-헥실아민 65
n-헵틸아민 60
n-옥틸아민 45
벤질아민 45
펜에틸아민 54
티라민 5
트립타민 20
히스타민 10
1,2-디아미노에탄 12
1,4-디아미노부탄 55
1,5-디아미노펜탄 38
1,6-디아미노헥산 87
1,7-디아미노헵탄 92
1,8-디아미노옥탄 25
a인서트:메틸아민,tert-부틸아민,tert-아밀아민,1,3-디아미노프로판,스퍼미딘,애그마틴
본 발명의 효소는 통상의 방법을 사용하여 이를 함유하는 미생물로부터 정제할 수 있다. 예를 들면, 미생물을 적당한 배지에서 배양하고, 배양물을 원심분리하여 미생물을 수확한다. 미생물을, 예컨대, 음파 파쇄기로 파쇄하고, 이를 원심분리하여 세포 추출물을 수득한다. 이어서, 수득된 추출물을 염석 (예, 암모늄설페이트 침전), 막투석 등과 같은 기술을 단독으로 또는 조합하여 수행하여 효소를 정제한다.
본 발명의 효소는 서열 목록의 서열 번호 1 또는 3 의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 하나 이상의 아미노산 서열의 치환, 삽입, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열 또는 그의 일부를 갖고, 광학활성아민의 아미노기 전이효소 활성을 갖는 효소는 당해 기술 분야에 공지되어 있는 통상의 방법을 이용하여 서열 목록의 서열 번호 1 또는 3 의 아미노산 서열로부터 제조할 수 있다. 본 발명의 아미노산 서열에는 광학활성 아민 및 기타 기존의 기질과는 다른 비천연 아민류를 생산할 수 있는 광학활성아민의 아미노기 전이효소의 활성을 갖는 오메가아미노트랜스라제를 코딩할 수 있는 한 임의의 아미노산 서열이 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 상기 기재된 효소 중 임의의 한 개를 코딩하는 임의의 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 예는 서열 목록의 서열 번호 1 또는 3 의 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 엄격한 조건하에서 상기 폴리뉴클레오티드와 혼성화될 수 있는 폴리뉴클레오티드이다.
엄격한 조건하에 서열 목록의 서열 번호 1 또는 3 의 뉴클레오티드 서열을 갖는 효소와 혼성화될 수 있는 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 1 또는 3 의 뉴클레오티드 서열이 DNA 프로브로 사용되는 경우, 콜로니 혼성화법, 플라크 혼성화법, 써던 혼성화법 등으로 수득되는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 구체적으로, 폴리뉴클레오티드는 하기와 같이 동정될 수 있다. 콜로니 또는 플라크로부터 유래되는 폴리뉴클레오티드가 고정되는 필터에 65℃에서 0.7 내지 1.0M NaCl 중에서 서열 번호 1 또는 3 의 뉴클레오티드 서열과 혼성화가 수행되고, 그 후 필터는 65℃에서 0.1 내지 2 배 농도를 갖는 SSC 용액 (1 배 농도 SSC 용액은 150 mM 염화나트륨 및 15 mM 시트르산 나트륨을 포함)으로 세척된다.
혼성화는 문헌 [Molecular Cloning, A laboratory manual, 2 판, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989] 등에 기재된 과정에 따라 수행될 수 있다. 구체적으로, 상기 기재된 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오티드의 예로서, 서열번호 1 또는 3 의 뉴클레오티드 서열과 60% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드가 포함된다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 광학활성아민의 아미노기 전이효소 활성을 가진 미생물로부터 수득될 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 기원으로서 사용되는 미생물은 그람음성간균 미생물로부터 유래할 수 있으며, 가장 바람직하게는, 비브리오 프루비알리스 JS17(Vibrio fluvialis JS17)과 알칼리제네스 데니트리피칸스 YOP(Alcaligenes denitrificans YOP)이다.
하기에, 광학활성아민의 아미노기 전이효소 활성을 가진 미생물로부터 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 제조하는 방법이 기재될 것이며, 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니다.
처음에, 정제된 효소 및 적당한 엔도펩티다제로 효소를 절단함으로서 수득된 펩티드 단편의 아미노산 서열을 에드만 법에 의해 시퀀싱한다. 이 아미노산 서열 정보를 기초로 하여, 뉴클레오티드 프라이머를 합성한다. 그 후, 염색체 DNA를 폴리뉴클레오티드가 기원이 된 미생물로부터 전형적인 뉴클레오티드 단리법 (예컨대, [Cell, 18, 1261 (1979)] 에 기재된 Hereford 법)을 사용하여 제조한다. 상기 기재된 뉴클레오티드 프라이머 및 이 염색체 DNA를 주형으로 사용하여 PCR을 수행함으로서 효소 유전자의 일부를 증폭시킨다. 또한, 효소 유전자의 증폭된 부분을 예를 들어 문헌 [Anal.Biochem., 132, 6 (1983)]에 기재된 랜덤 프라이머 표식법으로 표식하여 뉴클레오티드 프로브를 제조한다. 미생물의 염색체 DNA를 적당한 제한 효소에 의해 절단한다. 생성된 단편을 벡터에 함입하고, 차례로 벡터를 적당한 숙주 세포에 도입함으로써, 미생물의 염색체 DNA 의 DNA 라이브러리를 구축한다. 이 DNA 라이브러리를 콜로니 혼성화법, 플라크 혼성화법 등에 따라 상기 기재된 뉴클레오티드 프로브를 이용하여 스크리닝함으로써, 효소 유전자를 포함하는 DNA를 수득한다. 상기와 같이 수득된 효소 유전자를 포함하는 DNA 단편의 뉴클레오티드 서열을 디데옥시 시퀀싱법, 디데옥시 사슬 종결법 등으로 시퀀싱할 수 있다. 예를 들면, 뉴클레오티드 서열의 시퀀싱을 ABI3000 DNA 시퀀서(퍼킨 엘머)를 이용하여 수행할 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드가 발현되는 숙주 미생물로 도입하기 위한 벡터는 효소 유전자가 적당한 숙주 미생물에서 발현될 수 있는 한, 임의의 벡터일 수 있다. 상기와 같은 벡터의 예로서, 플라스미드 벡터, 파지 벡터 및 코스미드 벡터가 포함된다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드를 갖는 벡터가 도입되는 숙주 세포의 예로서, 박테리아, 효모, 식물 세포, 동물 세포가 포함된다. 대장균이 특히 바람직하다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 통상적인 방법을 사용하여 숙주 세포로 도입될 수 있다. 대장균이 숙주 세포로서 사용되는 경우, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 예컨대, 염화칼슘법을 사용하여 도입될 수 있다.
이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예로서 상세히 설명하나, 본 발명의 기술적 범위가 반드시 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다. 하기 실시예에서 특별한 언급이 없으면, 모든 퍼센트는 최종 조성물의 100 중량%를 기준으로 한다.
실시예
실시예 1
그람음성간균, 비브리오 프루비알리스 JS17 및 알칼리제네스 데니트리피칸스 YOP의 선별
상기 표 1 의 최소배지 100mL을 토양시료 10g에 첨가하고, 60℃에서 2시간 교반한다. 혼탁액 1mL을 최소배지 2mL에 첨가하여 60℃에서 2일간 배양하였다. 상기 배양액 1mL을 새로운 최소배지 2mL에 첨가하고 60℃에서 1일간 배양하는 과정을 3회 반복한 후, 배양액 0.2mL을 상기 액체 최소배지와 3% 한천으로 구성되는 고체최소배지에 플레이팅하여 37℃에서 1일간 배양하여 콜로니를 얻었다. 상기 미생물 콜로니를 새로운 액체최소배지 2mL에 접종하고 37℃에서 1일간 배양하여 반응시키고 활성이 가장 높은 콜로니를 동정하여, 비브리오 프루비알리스 JS17 및 알칼리제네스 YOP으로 명명하였다.
실시예 2
오메가아미노트랜스퍼라제 추출물의 생산
효모추출물(4g/L), 펩톤(8g/L), 염화나트륨(3g/L)으로 구성된 배지(이하 완전배지)에 배양된 세포를 PBS완충용액(pH 7)으로 3회 세척하여 회수된 세포외부의 배지성분을 제거하였다. 회수된 세포(이하 세포)를 3배 내지 5배 (부피비)의 10mM 인산완충용액, 20mM 피리독살 5-인산, 2mM 에틸렌디아민테트라아세트산, 1mM 페닐메틸설포닐플로라이드, 0.01% (w/w) 2-메르캅토에탄올, 10% 글리세롤로 구성된 완충용액에 혼탁한 후, 음파파쇄기를 이용하여 세포를 파쇄하였다. 5% 내지 15% 바람직하게는 8% 내지 12%의 글리세롤을 음파파쇄시 사용되는 완충용액에 첨가하여 주면 음파파쇄에 의한 내열성 방향족 아미노기 전이효소의 실활을 감소시킬 수 있다. 상기 파쇄 세포추출물을 12,000rpm에서 30분간 원심분리 후, 상등액을 회수하고 투석하여 최종 오메가아미노트랜스퍼라제 추출물을 생산하였다.
실시예 3
오메가아미노트랜스퍼라제의 정제
실시예 2 에서 얻어진 추출물을 암모늄설페이트을 천천히 가하면서 교반하여 포화도가 35%에 이르렀을 때, 평형시간 30분후, 12,000rpm에서 침전시킨다. 이후 상등액을 회수 55%까지 가하여 평형시간 30분후, 12,000rmp으로 침전시키고, 이 침전물을 100mM 인산완충용액(pH7.0)에 용해시켰다. 이 용해액을 20μM피리독살 5-인산이 포함된 50mM 트리스완충용액(pH6.0)을 이용하여 막투석하였다. 투석물질은 Q-세파로즈 FF(10mmⅩ30㎝, 파머샤, 스웨덴)을 이용하여 분획하였고, 얻어진 활성 용액을 다시 막투석하였다. 얻어진 막투석 물질은 부틸 세파로즈 FF 컬럼(10mmⅩ30㎝, 파머샤.)를 이용하여 분획을 하고, 이를 막투석하여 정제된 오메가아미노트랜스퍼라제를 획득하였다.
실시예 4
오메가아미노트랜스러파제의 N 말단 및 내부 펩타이드 서열 결정
실시예 3 에서 얻어진 정제된 오메가아미노트랜스퍼라제의 N 말단 아미노산의 서열은 10% SDS 전기영동의 산물인 겔을 PVDF 막으로 옮긴후(바이오 래드) 에드만 분해기법을 이용하는 Procise 491 Sequencer (어플라이드 바이오시스템, 칼리프)를 이용하여 결정하였다. 내부 펩타이드의 서열 결정은 서열결정용 트립신(프로메가)으로 처리후 아쿠아포어 역상 컬럼(어플라이드바이오시스템)과 마이크로 그레이언드 엘시(어플라이드 바이오시스템)을 이용하여 분획하였으며, 그 서열은 서열목록의 서열 번호 1 및 3 과 같다.
실시예 5
비브리오 프루비알리스 JS17 및 알칼리제네스 데니트리피칸스 YOP로부터 전체 세포 DNA 단리
완전배지에 배양한 세포를 4℃에서 4,000rpm 으로 10분 원심분리하여 세포를 펠렛화 했다. 상층액을 제거하고 세포 펠렛을 15mL의 용해완충용액(15% 수크로즈, 25mM EDTA, 25mM Tris 완충용액)으로 녹인후, 4℃에서, 4,000rpm으로 원심분리하여 상등액을 버리고, 라이소자임(TSB완충용액내에 5mg/mL)을 넣고, 37℃ 에서 10분간 반응시켰다. 이후 0.5M EDTA 1.2mL를 넣고, 37℃에서 5분 방치후, 10% SDS 1mL를 넣고, 70℃에서 10분간 얼음물에 방치후, 5M 포타슘아세테이트 2.5mL를 넣고, 얼음물에 15분간 방치하였다. 상기 용액의 양과 동일한 양의 페놀-클로로포름 혼합물(50:50)을 넣고, 30분간 혼합한 후, 4℃ 에서 4000rpm 으로 10분간 원심분리하여 상등액을 획득하였다. 얻어진 용액의 0.5배에 달하는 클로로포름을 첨가하여, 서서히 진탕시킨 후, 4℃ 에서 4000rpm 으로 원심분리하고, 다시 상등액을 회수하여, 이를 50㎍/mL 의 양에 달하도록 RNase처리로 37℃ 에서 1시간동안 반응시켰다. 이후, 0.8배에 달하는 아이소프로판올과 2.5배에 달하는 에탄올를 첨가하고, 서서히 진탕시킨 후, 구멍을 막은 파스퇴르 피펫을 이용하여 전체세포 DNA를 수집 에펜튜브에 옮겼다. 완전히 마르도록 건조 후, TE 완충용액으로 녹여 사용하였다.
실시예 6
게놈 코스미드 라이브러리의 제조
실시예 5 의 과정을 거처 단리된 전체세포 DNA를 제한 효소 Sau3AI으로 소화 처리한 후, 30-40kb 크기 범위의 부분-소화된 DNA 단편이 최대농도가 되도록하는 효소 대 전체 세포 DNA의 적당한 비율을 결정하여, 0.5M EDTA를 이용하여 반응을 정지시켰다. 생성된 용액으로부터 빙냉된 에탄올을 이용하여 부분-소화된 DNA 단편을 획득하였다. 코스미드 라이브러리의 제조에 사용된 벡터는 선별을 위한 암프라마이신 내성 유전자를 함유하는 pOJ446이었으며, 이를 제한효소 BamHI 과 HpaI으로 소화 처리하였다. Sau3AI으로 소화된 게놈 DNA를 pOJ446의 탈인산화된 BamHI부위에 부분-소화된 인서트 대 벡터의 양을 조절하여 라이게이션시켰다. 라이게이션 혼합물을 제조업자의 지시에 따라, 기가팩 Ⅲ 골드 패키징 익스트렉트(스트라타진)을 이용하여 팩키징시키고, 이를 대장균 균주 XLI-blue MRF 세포를 이용하여 재조합하였다. 암프라마이신를 함유한 완전배지에서 콜로니가 획득되었다. 실시예 7
코스미드 라이브러리의 스크리닝 및 오메가아미노트랜스퍼라제 유전자를 포함하는 코스미드의 확인
실시예 4 에서 획득된 N 말단 및 내부 펩타이드 서열을 이용하여 역전사시켜 프라이머를 제조하고, 이어서 PCR을 실시하여 생성물을 수득하고, 이를 32P 올리고뉴클레오타이드 탐침(동위원소 라벨링 기법)을 이용하여 코스미드 라이브러리중 대표적인 클론을 선택하였다.
서던 블롯 기법을 이용하여 탐침과 혼성화하며, PstI 제한효소 자리를 가지는 3.7kb에 달하는 단편을 확인하고, 이를 PstI으로 소화하여 pGEM-3(프로메가)에 서브클로닝하고, 이를 대장균 XL1-Blue MRF에 형질전환 시킨후, DNA를 획득하여 ABI3000 DNA 시퀀서(퍼킨-엘머)를 이용하여 서열을 결정하였다. 결정된 서열은 펩타이드 서열로 전사시켜 블라스트 기법을 이용하여 다른 오메가아미노트랜스퍼라제와 동일성을 검사하였다.
실시예 8
발현용 벡터에의 재조합 및 형질전환된 대장균에서의 발현
수득된 오메가아미노트랜스퍼라제의 유전자 서열은 각각 NdeI/BamHI 제한효소로 소화 처리하여, 그 분획을 각각 pET24ma(히로시 사카모토로부터 증여받음, 파리) 및 pET23b(노바젠)에 각각 라이게이션하여 재조합 플라스미드를 생성시키고, 발현용 대장균 균주인 BL21(DE3)에 형질전환시켰다. 수득된 형질전환 대장균은 각각 카나마이신과 엠피실린을 함유한 배지에서 인큐베이션시켰으며, 세포 현탁도가 0.75 및 0.6 이 되었을 때, IPTG를 부가하고, 추가로 5 시간 더 배양함으로써 효소의 발현을 유도하였다.
실시예 9
유도 발현된 효소를 이용한 아릴아민의 광학분할 반응 및 다양한 아민 공여체에 대한 활성 측정
오메가아미노트랜스퍼라제의 활성도는 1 유닛을 37℃ 및 pH 7.0에서 50mM (s)-α-메틸벤질아민과 10mM 파이루베이트를 반응시켰을 때 1μM의 아세토페논이 생성되는 것으로 정의하며, 아민공여체에 대한 활성도는 다양한 아민공여체 20mM 과 파이루베이트 20mM을 반응하여 생성되는 L-알라닌의 양을 측정하였고, 아민 수용체에 대한 활성도는 다양한 아민수용체 20mM 과 (s)-α-메틸벤질아민 20mM을 반응시켜 생성되는 아세토페논의 양으로 측정하였다. 반응액의 부피는 200μL이며, 반응의 정지는 75μL 16%(V/V) 퍼클로릭에시트를 사용하였다. 이의 결과는 하기 표 3, 4 및 5 에 기재하였다.
비브리오 프루비알리스 JS17 유래의 트랜스아미나제의 기질 특이성
아미노공여체 상대적초기비율(%)a 아미노수용체 상대적초기비율(%)b
(S)-α-메틸벤질아민(MBA) 100 피루베이트 100
(S)-1-아미노인단 122 옥살아세톤 n.r.
(S)-1-메틸-3-페닐프로필아민 61 α-케토글루타레이트 n.r.
β-알라닌c n.r.d 글리옥시레이트 60
γ-아미노부티르산 n.r. 프로피온알데히드 8
오르니틴 n.r. 부티르알데히드 36
6-아미노헥산산 n.r. 벤즈알데히드 17
스퍼미딘 n.r.
1,3-디아미노프로판 n.r.
L-알라닌e 10
a각 아미노공여체(20mM) 및 피루베이트(20mM)를 기질로 사용하고 초기반응 속도를 생성된 L-알라닌을 분석하여 측정하였다.
b(S)-α-MBA(20mM) 및 각 아미노 수용체 (20mM)를 사용하고, 초기 반응을 생성된 아세토페논을 분석하여 측정하였다.
cβ-알라닌은 HPLC 상의 L-알라닌에 대해 거의 동일한 체류 시간을 보이기 때문에 L-알라닌 농도의 측정은 어렵다. 따라서,생성된 피루베이트대신에 10mM 글리옥실레이트를 사용하고, 생성된 글리신을 분석하였다.
d비반응.상대적초기비율은 20mM(S)-α-MBA 및 20mM 피루베이트와 반응비율의 1% 미만이다.
eL-알라닌 반응성은 아미노 수용체로서 글리옥실레이트를 사용하여 측정하고, 글리옥실레이트를 이용한 (S)-α-MBA 의 것과 비교하여Tekl. 20 개의 천연아미노산중, L-알라닌을 제외한 모든 아미노산이 인서트(insert)이었다(즉,1% 미만의 상댁적 초기 비율)
알칼리제네시스 YOP 의 기질 특이성
화합물 구조 상대활성a(%)Yop
(L)β-알라닌 H- 100
(L)β-아미노-n-부티르산 CH3- 1000
(L)β-류신 (CH3)2CH- 43
(L)β-호모류신 CH3CH2CH(CH3)- 26
(L)β-호모이소류신 (CH3)2CHCH2- 5
(L)3-아미노-3-페닐프로판산 C6H6- n.r.
(R,S)sec-부틸아민 CH3CH2- 73
(R,S)1,2-디메틸프로필아민 (CH3)2CH- 75
(R,S)1,3-디메틸부틸아민 (CH3)CHCH2- 5
(R,S)2-아미노헵탄 CH3CH2CH2CH2CH2- 91
(R,S)1,5-디메틸헥실아민 (CH3)2CH2CH2CH2CH2- 83
(S)MBA 140
(R,S)α-에틸벤질아민 3
(R,S)1-아미노인단 26
a피루베이트(10mM) 및 각 아미노 공여체(20mM)를 사용하고, 초기 반응 비율은 소비된 피루베이트를 분석하여 측정하였다.
b비반응. 상대 초기 비율은 20mM(L)β-알라닌산 및 10mM 피루베이트의 반응 비율의 1 % 미만이다.
알칼리제네시스 YOP 의 기질 특이성
아미노 수용체 상대적 초기 비율(%)a yop
피루베이트 100
옥살아세테이트 n.r.
α-케토글루타레이트 n.r.
글리옥실레이트 16
프로피온알데히드 36
부티르알데히드 41
피루비알데히드 n.r.
에틸락토아세테이트 2
a(S)-α-MBA(20mM) 및 각 아미노 수용체 (20mM)를 사용하고, 초기 반응 비율을 생성된 아세토페논을 분석하여 측정하였다.
b비반응.상대적 초기 비율은 20mM(S)-α-MBA 및 20 mM 피루베이트를 이용한 반응 비율의 1 % 미만이다.
일반적으로, 오메가아미노트랜스퍼라제는 베타알라닌을 주요 기질로 사용하 여 알파자리가 아닌 아미노산 및 아민에 대한 반응성을 보이는 것으로 알려져 있다. 본 발명에서는 기존에 알려진 오메가아미노트랜스퍼라제와는 그 기질 특이성면에서 현저히 다른 신규한 오메가아미노트랜스퍼라제를 스크리닝, 그 유전자 서열을 확인하였다. 이 신규한 오메가아미노트랜스퍼라제들은 기존의 오메가아미노트랜스퍼라제에 비하여 그 서열이 기존의 오메가아미노트랜스퍼라제와 상이하며, 광학활성의 아릴아민 및 기타 기존의 기질과는 다른 비천연 아민류들을 생산할 수 있다는 장점을 가진다.
<110> seoul university <120> NEW OMEGAAMINOTRANSFERASE, GENE THEREOF AND METHOD OF USING THE SAME <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1416 <212> DNA <213> Vibrio fluvialis JS17 <220> <221> CDS <222> (1)..(1413) <400> 1 atg aac aaa ccg caa agc tgg gaa gcc cgg gcc gag acc tat tcg ctc 48 Met Asn Lys Pro Gln Ser Trp Glu Ala Arg Ala Glu Thr Tyr Ser Leu 1 5 10 15 tat ggt ttc acc gac atg cct tcg ctg cat cag cgc ggc acg gtc gtc 96 Tyr Gly Phe Thr Asp Met Pro Ser Leu His Gln Arg Gly Thr Val Val 20 25 30 gtg acc cat ggc gag gga ccc tat atc gtc gat gtg aat ggc cgg cgt 144 Val Thr His Gly Glu Gly Pro Tyr Ile Val Asp Val Asn Gly Arg Arg 35 40 45 tat ctg gac gcc aac tcg ggc ctg tgg aac atg gtc gcg ggc ttt gac 192 Tyr Leu Asp Ala Asn Ser Gly Leu Trp Asn Met Val Ala Gly Phe Asp 50 55 60 cac aag ggg ctg atc gac gcc gcc aag gcc caa tac gag cgt ttt ccc 240 His Lys Gly Leu Ile Asp Ala Ala Lys Ala Gln Tyr Glu Arg Phe Pro 65 70 75 80 ggt tat cac gcc ttt ttc ggc cgc atg tcc gat cag acg gta atg ctg 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Ile Ala Leu Ala Tyr His Arg 115 120 125 gcg cgc ggc gag gcg cag cgc acc cgc ctc atc ggg cgc gag cgc ggc 432 Ala Arg Gly Glu Ala Gln Arg Thr Arg Leu Ile Gly Arg Glu Arg Gly 130 135 140 tac cac ggc gtg ggc ttc ggc ggc att tcc gtg ggc ggc atc tcg ccc 480 Tyr His Gly Val Gly Phe Gly Gly Ile Ser Val Gly Gly Ile Ser Pro 145 150 155 160 aac cgc aag acc ttc tcc ggc gcg ctg ctg ccg gcc gtg gac cac ctg 528 Asn Arg Lys Thr Phe Ser Gly Ala Leu Leu Pro Ala Val Asp His Leu 165 170 175 ccg cac acc cac agc ctg gaa cac aac gcc ttc acg cgc ggc cag ccc 576 Pro His Thr His Ser Leu Glu His Asn Ala Phe Thr Arg Gly Gln Pro 180 185 190 gag tgg ggc gcg cac ctg gcc gac gag ttg gaa cgc atc atc gcc ctg 624 Glu Trp Gly Ala His Leu Ala Asp Glu Leu Glu Arg Ile Ile Ala Leu 195 200 205 cac gac gcc tcc acc atc gcg gcc gtg atc gtc gag ccc atg gcc ggc 672 His Asp Ala Ser Thr Ile Ala Ala Val Ile Val Glu Pro Met Ala Gly 210 215 220 tcc acc ggc gtg ctc gtc ccg ccc aag ggc tat ctc gaa aaa ctg cgc 720 Ser Thr Gly Val Leu Val Pro Pro Lys Gly Tyr Leu Glu Lys Leu Arg 225 230 235 240 gaa atc acc gcc cgc cac ggc att ctg ctg atc ttc gac gaa gtc atc 768 Glu Ile Thr Ala Arg His Gly Ile Leu Leu Ile Phe Asp Glu Val Ile 245 250 255 acc gcg tac ggc cgc ctg ggc gag gcc acc gcc gcg gcc tat ttc ggc 816 Thr Ala Tyr Gly Arg Leu Gly Glu Ala Thr Ala Ala Ala Tyr Phe Gly 260 265 270 gta acg ccc gac ctc atc acc atg gcc aag ggc gtg agc aac gcc gcc 864 Val Thr Pro Asp Leu Ile Thr Met Ala Lys Gly Val Ser Asn Ala Ala 275 280 285 gtt ccg gcc ggc gcc gtc gcg gtg cgc cgc gaa gtg cat gac gcc atc 912 Val Pro Ala Gly Ala Val Ala Val Arg Arg Glu Val His Asp Ala Ile 290 295 300 gtc aac gga ccg caa ggc ggc atc gag ttc ttc cac ggc tac acc tac 960 Val Asn Gly Pro Gln Gly Gly Ile Glu Phe Phe His Gly Tyr Thr Tyr 305 310 315 320 tcg gcc cac ccg ctg gcc gcc gcc gcc gtg ctc gcc acg ctg gac atc 1008 Ser Ala His Pro Leu Ala Ala Ala Ala Val Leu Ala Thr Leu Asp Ile 325 330 335 tac cgc cgc gaa gac ctg ttc gcc cgc gcc cgc aag ctg tcg gcc gcg 1056 Tyr Arg Arg Glu Asp Leu Phe Ala Arg Ala Arg Lys Leu Ser Ala Ala 340 345 350 ttc gag gaa gcc gcc cac agc ctc aag ggc gcg ccg cac gtc atc gac 1104 Phe Glu Glu Ala Ala His Ser Leu Lys Gly Ala Pro His Val Ile Asp 355 360 365 gtg cgc aac atc ggc ctg gtg gcc ggc atc gag ctg tcg ccg cgc gaa 1152 Val Arg Asn Ile Gly Leu Val Ala Gly Ile Glu Leu Ser Pro Arg Glu 370 375 380 ggc gcc ccg ggc gcg cgc gcc gcc gaa gcc ttc cag aaa tgc ttc gac 1200 Gly Ala Pro Gly Ala Arg Ala Ala Glu Ala Phe Gln Lys Cys Phe Asp 385 390 395 400 acc ggc ctc atg gtg cgc tac acg ggc gac atc ctc gcg gtg tcg cct 1248 Thr Gly Leu Met Val Arg Tyr Thr Gly Asp Ile Leu Ala Val Ser Pro 405 410 415 ccg ctc atc gtc gac gaa aac cag atc ggc cag atc ttc gag ggc atc 1296 Pro Leu Ile Val Asp Glu Asn Gln Ile Gly Gln Ile Phe Glu Gly Ile 420 425 430 ggc aag gtg ctc aag gaa gtg gct tag 1323 Gly Lys Val Leu Lys Glu Val Ala 435 440 <210> 4 <211> 440 <212> PRT <213> Alcaligenes denitrificans YOP <400> 4 Met Ser Ala Ala Lys Leu Pro Asp Leu Ser His Leu Trp Met Pro Phe 1 5 10 15 Thr Ala Asn Arg Gln Phe Lys Ala Asn Pro Arg Leu Leu Ala Ser Ala 20 25 30 Lys Gly Met Tyr Tyr Thr Ser Phe Asp Gly Arg Gln Ile Leu Asp Gly 35 40 45 Thr Ala Gly Leu Trp Cys Val Asn Ala Gly His Cys Arg Glu Glu Ile 50 55 60 Val Ser Ala Ile Ala Ser Gln Ala Gly Val Met Asp Tyr Ala Pro Gly 65 70 75 80 Phe Gln Leu Gly His Pro Leu Ala Phe Glu Ala Ala Thr Ala Val Ala 85 90 95 Gly Leu Met Pro Gln Gly Leu Asp Arg Val Phe Phe Thr Asn Ser Gly 100 105 110 Ser Glu Ser Val Asp Thr Ala Leu Lys Ile Ala Leu Ala Tyr His Arg 115 120 125 Ala Arg Gly Glu Ala Gln Arg Thr Arg Leu Ile Gly Arg Glu Arg Gly 130 135 140 Tyr His Gly Val Gly Phe Gly Gly Ile Ser Val Gly Gly Ile Ser Pro 145 150 155 160 Asn Arg Lys Thr Phe Ser Gly Ala Leu Leu Pro Ala Val Asp His Leu 165 170 175 Pro His Thr His Ser Leu Glu His Asn Ala Phe Thr Arg Gly Gln Pro 180 185 190 Glu Trp Gly Ala His Leu Ala Asp Glu Leu Glu Arg Ile Ile Ala Leu 195 200 205 His Asp Ala Ser Thr Ile Ala Ala Val Ile Val Glu Pro Met Ala Gly 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420 425 430 Gly Lys Val Leu Lys Glu Val Ala 435 440

Claims (6)

  1. 서열 번호 3 의 염기 서열로 이루어진 오메가아미노트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자.
  2. 제 1 항에 따른 유전자 서열을 포함하는 재조합 벡터.
  3. 제 2 항에 있어서, 재조합 DNA 벡터는 도 3의 개열지도로 표시되는 벡터 pET24ma 및 도 4의 개열지도로 표시되는 벡터 pET23b 로 이루어진 군에서 선택되는 재조합 벡터.
  4. 제 2 항에 따른 재조합 벡터를 사용하여 숙주세포를 형질전환시킴으로서 수득되는 형질전환체.
  5. 제 4 항에 있어서, 숙주 세포가 대장균인 형질전환체.
  6. 제 5 항에 있어서, 형질전환체가 대장균 DH5α 인 형질전환체.
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