JPWO2011001889A1 - 光学活性α−アミノ酸のラセミ化方法 - Google Patents

光学活性α−アミノ酸のラセミ化方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、特定のγ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼを産出する微生物の生菌体もしくはその処理物を用いて、光学活性α−アミノ酸をラセミ化する方法に関する。本発明によれば、ラセミα−アミノ酸を高品質かつ安価に製造することができる。

Description

関連出願の参照
本願は、先行する日本国特許出願である特願２００９−１５４２８７号（出願日：２００９年６月２９日）に基づくものであって、その優先権の利益を主張するものであり、その開示内容全体は参照することによりここに組み込まれる。
発明の背景
発明の分野
本発明は、光学活性α−アミノ酸のラセミ化方法に関する。
関連技術
各種工業薬品、農薬、及び医薬品の製造中間体として利用されるＤ体又はＬ体の光学活性α−アミノ酸を、光学分割剤を使用して製造する際、残存する他方の光学異性体であるＬ体又はＤ体のα−アミノ酸を、再び原料であるラセミα−アミノ酸とするラセミ化は重要な方法である。
光学活性α−アミノ酸をラセミ化する方法としては、化学的なラセミ化法が知られている。例えば、酸性又はアルカリ性水溶液中、高温でα−アミノ酸をラセミ化する方法が知られている（米国特許第２５８６１５４号明細書，米国特許第４７６９４８６号明細書）。しかしながら、これらの方法は反応条件が過酷であり、副生成物が多くなる。また、触媒を用いてのラセミ化方法も知られている。例えば、酸性条件下、サリチルアルデヒドを触媒としてラセミ化する方法が知られている（特開平１１−２２８５１２号公報，特開平１１−３２２６８４号公報（前記２件の日本国公開公報の対応欧州公報はＥＰ０９３７７０５Ａ））。しかしながら、これらの方法もまた反応条件が過酷であり、α−アミノ酸の収率の低下が認められる。
光学活性α−アミノ酸のラセミ方法としては、酵素を使用したラセミ化も知られている。一般的にはアラニンラセマーゼやグルタミン酸ラセマーゼ、プロリンラセマーゼといった酵素がアミノ酸をラセミ化する。しかしながら、これらの酵素は一般的に基質特異性が高く、種々の光学活性α−アミノ酸からラセミα−アミノ酸を製造する際に用いることは不向きである。
光学活性α−アミノ酸をラセミ化する酵素としては、低基質特異性のアミノ酸ラセマーゼも知られている（国際公開第２００３／０７４６９０号、文献（左右田健次、生化学実験講座１１ アミノ酸代謝と生体アミン(上)、東京化学同人、Ｐ．２７５−２９６（１９７６）））。しかしながら、該酵素は、光学活性脂肪族α−アミノ酸に対して活性が低く、種々の光学活性α−アミノ酸のラセミ化に適用することは難しい。
その他の方法としては、例えば、微生物を利用してのα−アミノ酸のラセミ化方法も知られている（特開２００４−５７０１４号公報）。しかしながら、ここに開示されている微生物は芳香族α−アミノ酸に対するラセミ化活性しか有さないので、同様に種々の光学活性α−アミノ酸のラセミ化に適用することは難しい。
上述のとおり、光学活性α−アミノ酸をラセミ化する手段がいくつも知られているが、いずれも何らかの問題を含んでいる。このため、種々の光学活性α−アミノ酸に適用でき、かつ、効率的にラセミ化する方法が依然として求められていた。
本発明者等は今般、本来はγ−アミノ酪酸と２−オキソグルタル酸の反応に関わる酵素であるγ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼに分類される酵素が、幅広い光学活性α−アミノ酸をラセミ化する活性を持つことを予想外にも見出した。本発明はかかる知見に基づくものである。
本発明の目的は、各種工業薬品、農薬，及び医薬品の製造中間体として重要な光学活性α−アミノ酸を、ラセミα−アミノ酸を原料として光学分割剤を使用して製造する際に、残存する他方のＬ体又はＤ体のα−アミノ酸から、再び原料として使用しうるラセミα−アミノ酸を高品質かつ安価に製造するための方法を提供することにある。このようにして得られるラセミα−アミノ酸を原料として、高収率で所望の光学活性α−アミノ酸をさらに得ることが可能となる。
すなわち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１） Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ属、ＬａｃｔｏｂａｃIｌｌｕｓ属、ＷｅIｓｓｅｌｌａ属、Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、ＡｍIｎｏｂａｃｔｅｒIｕｍ属、ＡｌｋａｌIｐｈIｌｕｓ属、ＣｌｏｓｔｒIｄIｕｍ属、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属、ＴｈｅｒｍｏｆIｌｕｍ属、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ属、ＡｎｏｘｙｂａｃIｌｌｕｓ属、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｕｓ属、Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｕｓ属、ＳｙｍｂIｏｂａｃｔｅｒIｕｍ属、Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃｕｓ属、ＢａｃIｌｌｕｓ属、ＡｃIｄｏｂａｃｔｅｒIａ属、ＣｌｏｓｔｒIｄIｕｍ属、ＤｅIｎｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｐｅｌｏｂａｃｔｅｒ属、ＧｅｏｂａｃIｌｌｕｓ属、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ属、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ属、ＳｏｌIｂａｃｔｅｒ属、Ｃｏｐｒｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ属、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ属、Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ属、Ｎｏｓｔｏｃ属、ＨｅｒｐｅｔｏｓIｐｈｏｎ属、Ｍｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ属、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｂａｃｔｅｒ属、Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ属、ＣａｌｄIｖIｒｇａ属、Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｕｓ属、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ属、Ｇｅｍｍａｔａ属、Ａｎａｂａｅｎａ属、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ属、ＰIｃｒｏｐｈIｌｕｓ属、又はＣｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ属に由来するγ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼを産出する微生物の生菌体もしくはその処理物を用いて、光学活性なα−アミノ酸をラセミ化することを含んでなる、光学活性α−アミノ酸のラセミ化方法。
（２） γ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼが、
Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏIｄｅｓ ｓｕｂｓｐ． ｍｅｓｅｎｔｅｒｏIｄｅｓ、
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔIｃｕｓ ｓｕｂｓｐ． ｓａｐｒｏｐｈｙｔIｃｕｓ、
ＬａｃｔｏｂａｃIｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、
ＬａｃｔｏｂａｃIｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒI、
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐIｄｅｒｍIｄIｓ、
Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｃIｔｒｅｕｍ、又は
Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒIｋｏｓｈII
に属する菌に由来するものである、（１）に記載の方法。
（３） γ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼが、
Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏIｄｅｓ ｓｕｂｓｐ． ｍｅｓｅｎｔｅｒｏIｄｅｓ ＡＴＣＣ ８２９３、
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔIｃｕｓ ｓｕｂｓｐ． ｓａｐｒｏｐｈｙｔIｃｕｓ ＡＴＣＣ １５３０５、
ＬａｃｔｏｂａｃIｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ IＦＯ ３９５６、
ＬａｃｔｏｂａｃIｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒI ＤＳＭ ２００１６、
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐIｄｅｒｍIｄIｓ ＡＴＣＣ １２２２８、
Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｃIｔｒｅｕｍ ＮＢＲＣ １０２４７６、又は
Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒIｋｏｓｈII ＯＴ−３
に由来するものである、（１）又は（２）に記載の方法。
（４） γ-アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼが、下記（ａ）〜（ｃ）から選択されるポリペプチドである、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法：
（ａ） 配列番号１、２、３、４、５、６、７及び８で表されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、
（ｂ） 前記（ａ）のアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸残基が、欠損、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、又は
（ｃ） 前記（ａ）のアミノ酸配列に対して７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
（５） 下記（ａ）〜（ｃ）から選択されるγ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼを用いて、光学活性なα−アミノ酸をラセミ化することを含んでなる、光学活性α−アミノ酸のラセミ化方法：
（ａ） 配列番号１、２、３、４、５、６、７及び８で表されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、
（ｂ） 前記（ａ）のアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸残基が、欠損、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、又は
（ｃ） 前記（ａ）のアミノ酸配列に対して７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
（６） γ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼが、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏIｄｅｓ ｓｕｂｓｐ． ｍｅｓｅｎｔｅｒｏIｄｅｓ ＡＴＣＣ ８２９３由来であって、下記（ａ１）〜（ｃ１）から選択されるポリペプチドである、（１）〜（５）のいずれかに記載の方法：
（ａ１） 配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、
（ｂ１） 前記（ａ１）のアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸残基が、欠損、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、又は
（ｃ１） 前記（ａ１）のアミノ酸配列に対して７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
（７） γ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼが、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔIｃｕｓ ｓｕｂｓｐ． ｓａｐｒｏｐｈｙｔIｃｕｓ ＡＴＣＣ １５３０５由来であって、下記（ａ２）〜（ｃ２）から選択されるポリペプチドである、（１）〜（５）のいずれかに記載の方法：
（ａ２） 配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、
（ｂ２） 前記（ａ２）のアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸残基が、欠損、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、又は
（ｃ２） 前記（ａ２）のアミノ酸配列に対して７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
（８） γ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼが、ＬａｃｔｏｂａｃIｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ IＦＯ ３９５６由来であって、下記（ａ３）〜（ｃ３）から選択されるポリペプチドである、（１）〜（５）のいずれかに記載の方法：
（ａ３） 配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、
（ｂ３） 前記（ａ３）のアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸残基が、欠損、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、又は
（ｃ３） 前記（ａ３）のアミノ酸配列に対して７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
（９） γ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼが、ＬａｃｔｏｂａｃIｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒI ＤＳＭ ２００１６由来であって、下記（ａ４）〜（ｃ４）から選択されるポリペプチドである、（１）〜（５）のいずれかに記載の方法：
（ａ４） 配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、
（ｂ４） 前記（ａ４）のアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸残基が、欠損、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、又は
（ｃ４） 前記（ａ４）のアミノ酸配列に対して７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
（１０） γ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼが、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐIｄｅｒｍIｄIｓ ＡＴＣＣ １２２２８由来であって、下記（ａ５）〜（ｃ５）から選択されるポリペプチドである、（１）〜（５）のいずれかに記載の方法：
（ａ５） 配列番号５で表されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、
（ｂ５） 前記（ａ５）のアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸残基が、欠損、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、又は
（ｃ５） 前記（ａ５）のアミノ酸配列に対して７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
（１１） γ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼが、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｃIｔｒｅｕｍ ＮＢＲＣ １０２４７６由来であって、下記（ａ６）〜（ｃ６）から選択されるポリペプチドである、（１）〜（５）のいずれかに記載の方法：
（ａ６） 配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、
（ｂ６） 前記（ａ６）のアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸残基が、欠損、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、又は
（ｃ６） 前記（ａ６）のアミノ酸配列に対して７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
（１２） γ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼが、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒIｋｏｓｈII ＯＴ−３由来であって、下記（ａ７）〜（ｃ７）から選択されるポリペプチドである、（１）〜（５）のいずれかに記載の方法：
（ａ７） 配列番号７または８で表されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、
（ｂ７） 前記（ａ７）のアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸残基が、欠損、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、又は
（ｃ７） 前記（ａ７）のアミノ酸配列に対して７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
（１３） 光学活性α−アミノ酸が、下記式（I）で表される１種以上のものである、（１）〜（１２）のいずれかに記載の方法：
Figure 2011001889
 ［式中、Ｒは、
メチル基もしくはヒドロキシ基により置換されていてもよい、ベンジル基；又は
炭素数１〜４の直鎖状もしくは分岐鎖状のアルキル基（ここでアルキル基は、ヒドロキシ基、メチルチオ基、チオール基、アミド基、もしくはイミダゾイル基により置換されていてもよい）
である］。
（１４） 光学活性α−アミノ酸が、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、tert-ロイシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、メチオニン、アスパラギン、チロシン、セリン及び２−アミノ酪酸からなる群より選択される１種以上のものである、（１３）に記載の方法。
（１５） 光学活性α−アミノ酸がＬ体である、（１）〜（１４）のいずれかに記載の方法。
（１６） 光学活性α−アミノ酸がＤ体である、（１）〜（１４）のいずれかに記載の方法。
また、本発明の別の態様によれば、以下の発明が提供される。
（２’） γ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼが、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏIｄｅｓ ｓｕｂｓｐ． ｍｅｓｅｎｔｅｒｏIｄｅｓ ＡＴＣＣ ８２９３由来であり、配列番号１で表される、あるいは配列番号１に示されるアミノ酸配列から１個又は複数個のアミノ酸が欠損、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列である、（１）記載の光学活性α−アミノ酸のラセミ化方法。
（３’） γ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼが、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔIｃｕｓ ｓｕｂｓｐ． ｓａｐｒｏｐｈｙｔIｃｕｓ ＡＴＣＣ １５３０５由来であり、配列番号２で表される、あるいは配列番号２に示されるアミノ酸配列から１個又は複数個のアミノ酸が欠損、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列である、（１）記載の光学活性α−アミノ酸のラセミ化方法。
（４’） γ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼが、ＬａｃｔｏｂａｃIｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ IＦＯ ３９５６由来であり、配列番号３で表される、あるいは配列番号３に示されるアミノ酸配列から１個又は複数個のアミノ酸が欠損、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列である、（１）記載の光学活性α−アミノ酸のラセミ化方法。
（５’） γ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼが、ＬａｃｔｏｂａｃIｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒI ＤＳＭ ２００１６由来であり、配列番号４で表される、あるいは配列番号４に示されるアミノ酸配列から１個又は複数個のアミノ酸が欠損、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列である、（１）記載の光学活性α−アミノ酸のラセミ化方法。
（６’） γ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼが、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐIｄｅｒｍIｄIｓ ＡＴＣＣ １２２２８由来であり、配列番号５で表される、あるいは配列番号５に示されるアミノ酸配列から１個又は複数個のアミノ酸が欠損、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列である、（１）記載の光学活性α−アミノ酸のラセミ化方法。
（７’） γ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼが、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｃIｔｒｅｕｍ ＮＢＲＣ １０２４７６由来であり、配列番号６で表される、あるいは配列番号６に示されるアミノ酸配列から１個又は複数個のアミノ酸が欠損、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列である、（１）記載の光学活性α−アミノ酸のラセミ化方法。
（８’） γ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼが、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒIｋｏｓｈII ＯＴ−３由来であり、配列番号７又は８で表される、あるいは配列番号７又は８に示されるアミノ酸配列から１個又は複数個のアミノ酸が欠損、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列である、（１）記載の光学活性α−アミノ酸のラセミ化方法。
（９’） γ-アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼを産出する菌体又はその処理物が、配列番号１、２、３、４、５、６、７又は８で表される、あるいは配列番号１、２、３、４、５、６、７又は８に示されるアミノ酸配列から１個又は複数個のアミノ酸が欠損、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列であるγ-アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼを産出するように改変された遺伝子組換え菌或いはその処理物である（１）記載の光学活性α−アミノ酸のラセミ化方法。
（１０’） 光学活性α−アミノ酸がアラニン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、セリン及び２−アミノ酪酸から選ばれる１種以上である（１）〜（９’）のいずれかに記載の光学活性α−アミノ酸のラセミ化方法。
本発明においては光学活性α−アミノ酸に対して、α−アミノ酸のラセミ化活性を有するγ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼを産出する微生物の生菌体又はその処理物を使用することによって、α−アミノ酸の誘導体化等の工程を経ることなくラセミ化が可能となる。本発明によれば、各種工業薬品、農薬，及び医薬品の製造中間体として有用な種々の光学活性α−アミノ酸を、高品質で、効率的かつ安価にラセミ化することができる。従来は、ラセミα−アミノ酸を原料として光学分割して残存する他方のＬ体又はＤ体のα−アミノ酸を、原料として有効に利用し、所望の光学活性アミノ酸を得ることができるので、薬品や農薬等の分野において極めて有用である。
発明の具体的説明
γ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ
本発明において用いられるγ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼは、光学活性α−アミノ酸をラセミ化する活性を有するものである。
ここで、「光学活性α−アミノ酸をラセミ化する活性を有する」とは、光学活性α−アミノ酸、すなわちＬ体又はＤ体のα−アミノ酸の一方のみからなるか、又はＬ体又はＤ体のいずれかに存在比が偏った状態にある混合物に作用して、ラセミ化することをいい、目的とする酵素（又はポリペプチド）がこのようなラセミ化する活性を有するか否かは、慣用の方法にしたがって測定することができ、例えば、後述する実施例（実施例１〜５）に記載の方法により確認することができる。ラセミ化する活性を有するか否かの確認に関してより具体的には、実施例の記載に従って所望の酵素を使い、Ｌ体又はＤ体のα−アミノ酸を基質として反応させ、反応後にＬ体とＤ体の比率に変動が起こった場合に活性があると判断できる。この場合の変動は、光学活性が低下するような変動である。確認されたＬ体とＤ体の比率の変動が少ない場合でも、菌体量や酵素量を変更することでその変動幅を増減できる。
本発明において、典型的には、γ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼは、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ属、ＬａｃｔｏｂａｃIｌｌｕｓ属、ＷｅIｓｓｅｌｌａ属、Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、ＡｍIｎｏｂａｃｔｅｒIｕｍ属、ＡｌｋａｌIｐｈIｌｕｓ属、ＣｌｏｓｔｒIｄIｕｍ属、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属、ＴｈｅｒｍｏｆIｌｕｍ属、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ属、ＡｎｏｘｙｂａｃIｌｌｕｓ属、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｕｓ属、Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｕｓ属、ＳｙｍｂIｏｂａｃｔｅｒIｕｍ属、Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃｕｓ属、ＢａｃIｌｌｕｓ属、ＡｃIｄｏｂａｃｔｅｒIａ属、ＣｌｏｓｔｒIｄIｕｍ属、ＤｅIｎｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｐｅｌｏｂａｃｔｅｒ属、ＧｅｏｂａｃIｌｌｕｓ属、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ属、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ属、ＳｏｌIｂａｃｔｅｒ属、Ｃｏｐｒｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ属、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ属、Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ属、Ｎｏｓｔｏｃ属、ＨｅｒｐｅｔｏｓIｐｈｏｎ属、Ｍｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ属、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｂａｃｔｅｒ属、Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ属、ＣａｌｄIｖIｒｇａ属、Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｕｓ属、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ属、Ｇｅｍｍａｔａ属、Ａｎａｂａｅｎａ属、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ属、ＰIｃｒｏｐｈIｌｕｓ属又はＣｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ属に由来するものである。
好ましくは、該γ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼは、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ属、ＬａｃｔｏｂａｃIｌｌｕｓ属、ＷｅIｓｓｅｌｌａ属、Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、ＡｍIｎｏｂａｃｔｅｒIｕｍ属、ＡｌｋａｌIｐｈIｌｕｓ属、ＣｌｏｓｔｒIｄIｕｍ属、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属又はＴｈｅｒｍｏｆIｌｕｍ属に由来するものであり、より好ましくは、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ属、ＬａｃｔｏｂａｃIｌｌｕｓ属、Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、ＡｍIｎｏｂａｃｔｅｒIｕｍ属、ＡｌｋａｌIｐｈIｌｕｓ属、ＣｌｏｓｔｒIｄIｕｍ属又はＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属に由来するものである。
本発明のより好ましい態様によれば、γ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼは、
Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏIｄｅｓ ｓｕｂｓｐ． ｍｅｓｅｎｔｅｒｏIｄｅｓ
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔIｃｕｓ ｓｕｂｓｐ． ｓａｐｒｏｐｈｙｔIｃｕｓ
ＬａｃｔｏｂａｃIｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、
ＬａｃｔｏｂａｃIｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒI、
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐIｄｅｒｍIｄIｓ、
Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｃIｔｒｅｕｍ、又は
Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒIｋｏｓｈIIに由来するものであり、
さらに好ましくは、
Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏIｄｅｓ ｓｕｂｓｐ． ｍｅｓｅｎｔｅｒｏIｄｅｓ ＡＴＣＣ ８２９３、
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔIｃｕｓ ｓｕｂｓｐ． ｓａｐｒｏｐｈｙｔIｃｕｓ ＡＴＣＣ １５３０５、
ＬａｃｔｏｂａｃIｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ IＦＯ ３９５６、
ＬａｃｔｏｂａｃIｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒI ＤＳＭ ２００１６、
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐIｄｅｒｍIｄIｓ ＡＴＣＣ １２２２８、
Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｃIｔｒｅｕｍ ＮＢＲＣ １０２４７６、又は
Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒIｋｏｓｈII ＯＴ−３
に由来するものである。
本発明におけるγ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼは、下記（ａ）〜（ｃ）から選択されるポリペプチドである：
（ａ） 配列番号１、２、３、４、５、６、７及び８で表されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、
（ｂ） 前記（ａ）のアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸残基が、欠損、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、又は
（ｃ） 前記（ａ）のアミノ酸配列に対して７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
前記（ｂ）のポリペプチド（以下において「改変ポリペプチド」ということがある）は、
配列番号１、２、３、４、５、６、７及び８で表されるアミノ酸配列からなる群より選択されるいずれかのアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸残基が、欠損、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる。このとき、前記（ａ）のポリペプチドと同様に、光学活性α−アミノ酸をラセミ化する活性を有する。ここで、欠損、置換もしくは付加されてもよいアミノ酸の数は、例えば１〜４０個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１〜８個であり、最も好ましくは１〜４個である。
「欠損」（欠失）には、アミノ酸配列の端からアミノ酸残基を欠失したもの及びアミノ酸配列の途中のアミノ酸残基が欠失したものも含まれる。
また「付加」には、アミノ酸配列の端にアミノ酸残基を付加したもの及びアミノ酸配列の途中にアミノ酸残基を付加（挿入）したものも含まれる。
前記（ｂ）の改変ポリペプチドは、好ましくは、配列番号１、２、３、４、５、６、７及び８で表されるアミノ酸配列からなる群より選択されるいずれかのアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸残基が保存的置換されたアミノ酸配列からなり、かつ、光学活性α−アミノ酸をラセミ化する活性を有するポリペプチドであることができる。
ここで「保存的置換」とは、ペプチドの活性を実質的に改変しないように、１又は複数個（好ましくは数個）のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置換えることを意味する。例えば、ある疎水性残基を別の疎水性残基によって置換する場合、ある極性残基を同じ電荷を有する別の極性残基によって置換する場合などが挙げられる。このような置換を行うことができる機能的に類似のアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において公知である。具体例を挙げると、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
なお、アミノ酸の欠損、置換又は付加による改変は、例えばそれをコードするＤＮＡに、例えば、周知技術である部位特異的変異誘発（例えば、NucleIc AcId Research, Vol.10, No.20, p.6487-6500, 1982参照）を施すことにより行うことが出来る。他の方法としては、遺伝子を変異源で処理する方法、及び遺伝子を選択的に開裂し、次に選択されたヌクレオチドを除去、付加及び／又は置換し、次いで連結する方法などがある。
前記（ｃ）のポリペプチド（以下において「相同ポリペプチド」ということがある）は、
配列番号１、２、３、４、５、６、７及び８で表されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列、すなわち、γ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼのアミノ酸配列に関して７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる限り、特に限定されるものではない。該「同一性」の％は、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上である。この（ｃ）における相同ポリペプチドは、前記（ａ）のポリペプチドと同様に、光学活性α−アミノ酸をラセミ化する活性を有する。
本明細書において、「同一性」の数値はいずれも、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であればよく、例えば全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢI）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ（BasIc local alIgnment search tool）http://www.ncbI.nlm.nIh.gov/BLAST/ においてデフォルト（初期設定）のパラメーターを用いることにより、算出することができる。
本発明におけるγ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼは、下記の（I）〜（vII）のいずれかであることが好ましい：
（I） Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏIｄｅｓ ｓｕｂｓｐ． ｍｅｓｅｎｔｅｒｏIｄｅｓ ＡＴＣＣ ８２９３由来であって、下記（ａ１）〜（ｃ１）から選択されるポリペプチド：
（ａ１） 配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、
（ｂ１） 前記（ａ１）のアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸残基が、欠損、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、又は
（ｃ１） 前記（ａ１）のアミノ酸配列に対して７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、ポリペプチド；
（II） Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔIｃｕｓ ｓｕｂｓｐ． ｓａｐｒｏｐｈｙｔIｃｕｓ ＡＴＣＣ １５３０５由来であって、下記（ａ２）〜（ｃ２）から選択されるポリペプチド：
（ａ２） 配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、
（ｂ２） 前記（ａ２）のアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸残基が、欠損、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、又は
（ｃ２） 前記（ａ２）のアミノ酸配列に対して７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、ポリペプチド；
（III） ＬａｃｔｏｂａｃIｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ IＦＯ ３９５６由来であって、下記（ａ３）〜（ｃ３）から選択されるポリペプチドである：
（ａ３） 配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、
（ｂ３） 前記（ａ３）のアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸残基が、欠損、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、又は
（ｃ３） 前記（ａ３）のアミノ酸配列に対して７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、ポリペプチド；
（Iv） ＬａｃｔｏｂａｃIｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒI ＤＳＭ ２００１６由来であって、下記（ａ４）〜（ｃ４）から選択されるポリペプチド：
（ａ４） 配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、
（ｂ４） 前記（ａ４）のアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸残基が、欠損、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、又は
（ｃ４） 前記（ａ４）のアミノ酸配列に対して７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、ポリペプチド； 又は
（ｖ） Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐIｄｅｒｍIｄIｓ ＡＴＣＣ １２２２８由来であって、下記（ａ５）〜（ｃ５）から選択されるポリペプチド：
（ａ５） 配列番号５で表されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、
（ｂ５） 前記（ａ５）のアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸残基が、欠損、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、又は
（ｃ５） 前記（ａ５）のアミノ酸配列に対して７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
（vI） γ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼが、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｃIｔｒｅｕｍ ＮＢＲＣ １０２４７６由来であって、下記（ａ６）〜（ｃ６）から選択されるポリペプチド：
（ａ６） 配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、
（ｂ６） 前記（ａ６）のアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸残基が、欠損、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、又は
（ｃ６） 前記（ａ６）のアミノ酸配列に対して７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
（vII） γ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼが、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒIｋｏｓｈII ＯＴ−３由来であって、下記（ａ７）〜（ｃ７）から選択されるポリペプチド：
（ａ７） 配列番号７または８で表されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、
（ｂ７） 前記（ａ７）のアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸残基が、欠損、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、又は
（ｃ７） 前記（ａ７）のアミノ酸配列に対して７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
なお、ここで（ｂ１）〜（ｂ７）及び（ｃ１）〜（ｃ７）のポリペプチドは光学活性α−アミノ酸をラセミ化する活性を有するものであり、これらにおける欠損、置換もしくは付加されるアミノ酸の数及び同一性の％は、前記（ｂ）と（ｃ）に従って確認できる。
光学活性α−アミノ酸のラセミ化方法
本発明の光学活性α−アミノ酸のラセミ化方法は、前記したγ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼを産出する微生物の生菌体もしくはその処理物を用いて、光学活性なα−アミノ酸をラセミ化することを含んでなる。
本発明の光学活性α−アミノ酸の生化学的ラセミ化に使用される微生物は、α−アミノ酸のラセミ化活性を有するγ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼを産出する微生物であれば良い。また、これら微生物から人工的変異手段によって誘導される変異株、あるいは細胞融合もしくは遺伝子組換え法等の遺伝学的手法により誘導される組換え株等の何れの株であっても上記能力を有するものであれば本発明に使用できる。本発明では、前記γ-アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼを産出するように改変された遺伝子組換え菌が好適に利用できる。
より詳しくは、本発明において、γ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼを産出する微生物は、例えば、モレキュラー・クローニング第３版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＣｌｏｎIｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、３ｒｄ Ｅｄ．（ｅｄ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ Ｄ．Ｗ．）、Ｃｏｌｄ ＳｐｒIｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ ＳｐｒIｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２００１）等に記載された方法等にしたがって、γ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを、宿主細胞において発現できるよう遺伝子組み換えすることによって得ることができる。
すなわち、所望の構造遺伝子を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えＤＮＡを作製する。該組換えＤＮＡを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、本発明におけるγ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼを生産する形質転換体を得ることができる。
宿主細胞としては、細菌、放線菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。好ましくは、大腸菌EscherIchIa colI、放線菌Streptomyces等の細菌が挙げられる。
組換えＤＮＡとしては、上記宿主細胞において自立複製ないしは染色体中への組み込みが可能で、本発明のＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡを含有してなる組換えＤＮＡは、原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、本発明のＤＮＡ、転写終結配列より構成された組換えＤＮＡであることが好ましい。また、該組換えＤＮＡには、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていても良い。
使用可能な発現ベクターとしては、例えば、ｐＴＡ２（東洋紡績株式会社製）、ＨｅｌIｘ１（ロシュ・ダイアグノティクス社製）、ｐＫＫ２３３−２（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）、ｐＳＥ２８０（インビトロジェン社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（プロメガ社製）、ｐＱＥ−８（キアゲン社製）、ｐＥＴ２４（ノバジェン社製）、pBluescrIpt II SK(+)、pBluescrIpt II SK(-)（ストラタジーン社製）、ｐＵＣ１９［Gene,33,103(1985)］、ｐＳＴＶ２８（宝酒造株式会社製）、ｐＵＣ１１８（宝酒造株式会社製）、ｐIＪ６９０２［Mol.MIcrobIol.,58,1276(2005)］、ｐＳＥＴ１５２［J.Mol.MIcrobIol.BIotechnol.,4、417(2002)］等を例示することができる。
プロモーターとしては、宿主細胞中で機能し得るものであれば特に制限はなく、いずれのものでも使用可能である。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、Ｔ７プロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター等の大腸菌やファージ等に由来するプロモーター等を挙げることができる。
宿主細胞としての原核生物としては、エシェリシア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、ストレプトミセス属等に属する微生物が挙げられる。
具体例として、本発明者らが新たに作製した、配列番号１又は２で表されるγ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼを発現する能力を有するエシェリシア コリ（Ｅ．ｃｏｌI）ＤＨ５α株の作製方法を、以下に示す。
ＤＮＡ供与体微生物であるＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏIｄｅｓ ｓｕｂｓｐ． ｍｅｓｅｎｔｅｒｏIｄｅｓ ＡＴＣＣ ８２９３、又はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔIｃｕｓ ｓｕｂｓｐ． ｓａｐｒｏｐｈｙｔIｃｕｓ ＡＴＣＣ １５３０５の培養は、通常資化し得る炭素源、窒素源、各微生物に必須な無機塩、栄養素等を含有させた培地を用いて行われる。培養時のｐＨは４〜１０の範囲が好ましく、温度は２０〜５０℃が好ましい。培養は１日〜１週間程度好気的に行われる。
なお、本発明において、培養する微生物の培養条件(培地組成、培地ｐＨ、培養温度、培地への菌体播種量、培養時間等)は、微生物種に応じた文献や、寄託や保存機関において示された情報に基づいて、適宜決定することができる。
Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏIｄｅｓ ｓｕｂｓｐ． ｍｅｓｅｎｔｅｒｏIｄｅｓ ＡＴＣＣ ８２９３、又はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔIｃｕｓ ｓｕｂｓｐ． ｓａｐｒｏｐｈｙｔIｃｕｓ ＡＴＣＣ １５３０５のゲノムＤＮＡ塩基配列情報を元に、プライマーを設計する。Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏIｄｅｓ ｓｕｂｓｐ． ｍｅｓｅｎｔｅｒｏIｄｅｓ ＡＴＣＣ ８２９３、又はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔIｃｕｓ ｓｕｂｓｐ． ｓａｐｒｏｐｈｙｔIｃｕｓ ＡＴＣＣ １５３０５より抽出した染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲでγ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを増幅し、プラスミドベクター（ｐＵＣ１９）と結合する。これを前者に対してｐＡＴ８、後者に対してｐＡＴ１５と命名する。ｐＡＴ８、又はｐＡＴ１５をＥ．ｃｏｌI（ＤＨ５α）に形質転換し、γ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼを発現する組換え菌をＤＨ５α／ｐＡＴ８、ＤＨ５α／ｐＡＴ１５と命名する。
上記の工程中でＤＮＡ、組換え体宿主としてのＥ．ｃｏｌIの取扱いに必要な一般的な操作は、当業者間で通常行われているものであり、例えば、モレキュラー・クローニング第３版に従えば容易に実施できる。使用する酵素、試薬類も全て市販の製品を用いることができ、特に断らない限り製品で指定されている使用条件に従えば完全にそれらの目的を達成することができる。該菌からの全ＤＮＡ抽出は、例えばＳａIｔｏら（ＢIｏｃｈIｍ．ＢIｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，７２，６１９−６２９，１９６３）の方法に準じて行うことができる。
γ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼを産出する微生物の培養は、用いる菌により至適な生育条件が異なるため、培養条件は特に限定されず用いる菌に合わせて適宜設定されればよい。例えば大腸菌ＤＨ５αを宿主とした遺伝子組換え菌であれば、一般的にｐＨ７、温度３７℃が好適な培養条件となる。このようにして培養した微生物は、生菌体又は該生菌体の処理物、さらには精製した酵素として反応に使用される。
ここで、該処理物としては、例えば、培養液（培養物）、培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物を遠心分離して得られる菌体（分離菌体）、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、菌体破砕物（例えば、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物）、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、該菌体の蛋白質分画物、又は該菌体より抽出して得られる酵素標品などを挙げることができる。また、常法に従って菌体又は酵素を固定化して使用することもできる。
培養物（発現細胞や培養上清）から所望のポリペプチドを精製する方法としては、例えば、硫安塩析、イオン交換セルロースを用いるイオン交換カラムクロマトグラフィー、分子篩ゲルを用いる分子篩カラムクロマトグラフィー、プロテインＡ結合多糖類を用いる親和性カラムクロマトグラフィー、透析、又は凍結乾燥などを挙げることができる。また、合成法の場合は、液相法、固相法など常法に従い合成することが可能であり、通常、自動合成機を利用することができる。化学修飾物の合成は常法により行なうことができる。
ラセミ化反応に供する原料の光学活性α−アミノ酸はＤ体でもＬ体でも、どちらかに偏ったものでも良く、具体的にはアラニン、グルタミン、グルタミン酸、バリン、ロイシン、イソロイシン、tert-ロイシン、ノルバリン、ノルロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン、チロシン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、２−アミノ酪酸、オルニチン等が挙げられる。これらは２以上を組み合わせてもよい。
ラセミ化反応に供する原料の光学活性α−アミノ酸は下記式（I）で表すこともできる。
Figure 2011001889
 ［式中、Ｒは、
メチル基もしくはヒドロキシ基により置換されていてもよい、ベンジル基（好ましくはヒドロキシ基により置換されていてもよい、ベンジル基）；又は
炭素数１〜４の直鎖状もしくは分岐鎖状のアルキル基（ここでアルキル基は、ヒドロキシ基（−ＯＨ）、メチルチオ基（−Ｓ−ＣＨ３）、チオール基（−ＳＨ）、アミド基（−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ２）、もしくはイミダゾイル基により置換されていてもよい）
である］。
ラセミ化反応に供する原料の光学活性α−アミノ酸は、好ましくはアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、ノルバリン、ノルロイシン、tert-ロイシン、フェニルアラニン、チロシン、メチオニン、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、プロリン、２−アミノ酪酸及びオルニチンからなる群より選択されるものであり、より好ましくはアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、ノルバリン、ノルロイシン、tert-ロイシン、フェニルアラニン、チロシン、メチオニン、セリン、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、２−アミノ酪酸及びオルニチンからなる群より選択されるものであり、さらに好ましくは、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、tert-ロイシン、アスパラギン、ヒスチジン、フェニルアラニン、メチオニン、アスパラギン、チロシン、セリン及び２−アミノ酪酸からなる群より選択されるものであり、さらにより好ましくはアラニン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、セリン及び２−アミノ酪酸からなる群より選択されるものである。その由来が化学的に得られたものでも、生物的に得られたものでもよく、挟雑物があっても良いが、酵素が阻害を受けて活性を損なう事があるので、精製されたものを使用することが好ましい。
よって本発明の別の態様によれば、下記（ａ）〜（ｃ）から選択されるγ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼを用いて、光学活性なα−アミノ酸をラセミ化することを含んでなる、光学活性α−アミノ酸のラセミ化方法が提供される：
（ａ） 配列番号１、２、３、４、５、６、７及び８で表されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、
（ｂ） 前記（ａ）のアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸残基が、欠損、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、又は
（ｃ） 前記（ａ）のアミノ酸配列に対して７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
本発明において、ラセミ化反応は、水溶液中で行われ、α−アミノ酸の濃度は０．１ｗｔ％〜飽和濃度、酵素量は、該酵素を含む微生物の乾燥菌体基準で、原料α−アミノ酸重量の０．００００１〜３倍が好ましく、０．００２〜０．５倍がより好ましい。反応温度は１０〜７０℃が好ましく、より好ましくは３０〜６０℃であり、ｐＨは４〜１３が好ましく、より好ましくは５〜１０、さらに好ましくは６〜９である。
光学活性α−アミノ酸の製造方法
本発明の別の態様によれば、光学分割されてＤ体もしくはＬ体のいずれかが富化されたα−アミノ酸に、本発明によるラセミ化方法を適用して、ラセミ化したα−アミノ酸から、所望する（目的の）Ｄ体もしくはＬ体を光学分割して得ることを含んでなる、光学活性α−アミノ酸の製造方法が提供される。
ここで光学分割する方法として、例えば、後述するような分割剤を使用する方法が挙げられる。
本発明の別の好ましい態様によれば、
下記式（１）で示されるＬ−α−アミノ酸と、下記式（２）で示されるＤ−α−アミノ酸との混合物に、Ｄ体又はＬ体のいずれか一方の光学異性体と立体選択的に溶解度の低い塩を形成する分割剤を作用させ、Ｄ体又はＬ体のα−アミノ酸の一方をジアステレオマー塩の固体として分離し（光学分割工程）、
残留するＬ体又はＤ体の富化したα−アミノ酸混合物に、本発明にによるγ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ、又はそれを産出する微生物の生菌体もしくはその処理物を作用させて、ラセミ化し（ラセミ化工程）、
これを、再度分割剤を用いたジアステレオマー塩形成による立体選択的分割に付す（光学分割工程）
ことによって、所望のＤ体又はＬ体のα−アミノ酸を得ることを特徴とする、光学活性α−アミノ酸の製造法が提供される。これにより、所望の光学活性α−アミノ酸を好収率で取得することが可能となる。
Figure 2011001889
Figure 2011001889
したがって、例えば、Ｄ体とＬ体の混合物に、Ｌ体と立体選択的に溶解度の低い塩を形成する分割剤を作用させ、Ｌ体をジアステレオマー塩の固体として分離し、残りのＤ体若しくはＤ体とＬ体の混合物にアミノ酸ラセミ化活性を有する微生物の生菌体等を作用させることにより得られたＬ体の富化した混合物を再度光学分割することにより新たなＬ体が得られる。これを繰り返すことにより、Ｄ体とＬ体の混合物からＬ体のα−アミノ酸を得ることができる（同様にＤ体のα−アミノ酸を得ることもできる）。
ここで、式（１）または（２）におけるＲは、メチル基もしくはヒドロキシ基により置換されていてもよい、ベンジル基；又は炭素数１〜４の直鎖状もしくは分岐鎖状のアルキル基である。Ｒ基のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ノルマルブチル基、セカンダリーブチル基などが挙げられる。中でもエチル基が好ましい。アルキル基は、ヒドロキシ基、メチルチオ基、チオール基、アミド基、もしくはイミダゾイル基により置換されていてもよい。
光学活性α−アミノ酸の具体例として、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、tert-ロイシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、メチオニン、アスパラギン、チロシン、セリン及び２−アミノ酪酸等が挙げられる。
また、式（１）で示されるＬ−α−アミノ酸と式（２）で示されるＤ−α−アミノ酸の混合物としては、ラセミ体が好適に利用される。該混合物はＬ体又はＤ体のどちらか一方に偏った混合物であってもよい。また該混合物はＬ体又はＤ体のどちらか一方の光学活性α−アミノ酸をラセミ化して得られたものであってもよい。また、式（１）及び式（２）で示されるα−アミノ酸のラセミ混合物は、その製法および品質等に特に制限はなく、例えば、シュトレッカー法によって容易に得られるα−アミノニトリルを加水分解する方法によって得ることができる。
α−アミノ酸を光学分割する方法としては、種々の方法が知られており、本発明においては、Ｄ体又はＬ体のいずれか一方の光学異性体と、溶解度の低い塩を立体選択的に形成しうる分割剤を使用する方法が好ましく使用できる。この方法によれば、分割剤によって、立体選択的に、溶解度の低いジアステレオマー塩形成させ、これを溶解度の違いを利用して固体化して、これを濾別等によって分離することによって、光学分割を行うことができる。例えば、ラセミの２−アミノ酪酸と半当量の（Ｒ）−２−フェノキシプロピオン酸を水に加熱溶解した後、冷却、晶析することでＬ−２−アミノ酪酸／（Ｒ）−２−フェノキシプロピオン酸を取得することができる。
本発明において使用可能な分割剤としては、目的とするアミノ酸や光学異性体の状態などに応じて適宜選択することができ、具体例としては、酒石酸、マンデル酸、２−フェノキシプロピオン酸類などが挙げられる。本発明においては、後処理の容易さから、２−フェノキシプロピオン酸類が特に好適である。分割剤は、所望のα−アミノ酸を得た後、分離して回収し、それを、さらに次の光学分割工程で再利用してもよい。
以下に本発明を実施例により具体的に説明する。ただし、本発明はこれら実施例によって制限されるものではない。
反応液の分析におけるＨＰＬＣ分析条件は以下の通りであった。
ＨＰＬＣ分析条件（１）
溶離液 １ｍＭ ＣｕＳＯ４ 水溶液
流量 １ｍＬ／ｍIｎ
カラム ＳＵＭIＣＨIＲＡＬ ＯＡ−５０００
（株式会社住化分析センター社製）
カラム恒温槽 ３０℃
検出器 ＵＶ２５４ｎｍ
ＨＰＬＣ分析条件（２）
溶離液 ５０ｍＭ ＨＣｌＯ４ 水溶液
流量 ０．２ｍＬ／ｍIｎ
カラム ＣＲＯＷＮＰＡＫ ＣＲ（＋） ５μｍ
４．０×１５０ｍｍ （ダイセル化学工業株式会社社製）
カラム恒温槽 ３０℃
検出器 ＵＶ２０５ｎｍ
製造例１
Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏIｄｅｓ ｓｕｂｓｐ． ｍｅｓｅｎｔｅｒｏIｄｅｓ ＡＴＣＣ ８２９３、又はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔIｃｕｓ ｓｕｂｓｐ． ｓａｐｒｏｐｈｙｔIｃｕｓ ＡＴＣＣ １５３０５のゲノムＤＮＡ情報（http://gIb.genes.nIg.ac.jp/）から得られたγ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子とされる塩基配列に基づき、プライマーを設計した。
ここでの「γ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子とされる塩基配列」とはアルゴリズムＢＬＡＳＴ［Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．ＳｃI．ＵＳＡ，９０，５８７３（１９９３）］により相同性検索を行った結果、４−ａｍIｎｏｂｕｔｙｒａｔｅ ａｍIｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅに分類される塩基配列である。ＢＬＡＳＴの具体的な手法は公知である（http://www.ncbI.nlm.nIh.gov.）。
ＡＴＣＣにより指定された培地及び培養温度でＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏIｄｅｓ ｓｕｂｓｐ． ｍｅｓｅｎｔｅｒｏIｄｅｓ ＡＴＣＣ ８２９３、及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔIｃｕｓ ｓｕｂｓｐ． ｓａｐｒｏｐｈｙｔIｃｕｓ ＡＴＣＣ １５３０５を培養し、それらより抽出した染色体ＤＮＡを鋳型として、プライマーＡＴ８−ＦとＡＴ８−Ｒ（配列番号９及び配列番号１０）又はＡＴ１５−ＦとＡＴ１５−Ｒ（配列番号１１及び配列番号１２）を用いてＰＣＲを行った。
Figure 2011001889
得られたＰＣＲ反応生成物を精製し、制限酵素ＨIｎｄIII及びＸｂａIで消化し、同様の酵素で消化したｐＵＣ１９（宝酒造株式会社社製）に連結してｐＡＴ８及びｐＡＴ１５を作製後、Ｅ．ｃｏｌI（ＤＨ５α）（東洋紡績株式会社より入手）に塩化カルシウム法で形質転換した。５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に形質転換株を塗布し、生育したクローンを取得して形質転換株ＤＨ５α／ｐＡＴ８及びＤＨ５α／ｐＡＴ１５を得た。
製造例２
ＬａｃｔｏｂａｃIｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ IＦＯ ３９５６、ＬａｃｔｏｂａｃIｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒI ＤＳＭ ２００１６、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐIｄｅｒｍIｄIｓ ＡＴＣＣ １２２２８、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｃIｔｒｅｕｍ ＮＢＲＣ １０２４７６、又はＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒIｋｏｓｈII ＯＴ−３のゲノムＤＮＡ情報（http://gIb.genes.nIg.ac.jpp://gIb.genes.nIg.ac.jp/）から得られたγ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子とされる塩基配列に基づき、製造例１と同様にして、プライマーを設計した。
指定された培地及び温度でＬａｃｔｏｂａｃIｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ IＦＯ ３９５６、ＬａｃｔｏｂａｃIｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒI ＤＳＭ ２００１６、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐIｄｅｒｍIｄIｓ ＡＴＣＣ １２２２８、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｃIｔｒｅｕｍ ＮＢＲＣ １０２４７６、又はＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒIｋｏｓｈII ＯＴ−３を培養しそれらより抽出した染色体ＤＮＡを鋳型として、プライマーＡＴ９−ＦとＡＴ９−Ｒ（配列番号１３及び配列番号１４）、ＡＴ１０−ＦとＡＴ１０−Ｒ（配列番号１５及び配列番号１１６）、ＡＴ１１−ＦとＡＴ１１−Ｒ（配列番号１７及び配列番号１８）、ＡＴ１２−ＦとＡＴ１２−Ｒ（配列番号１９及び配列番号２０）、ＡＴ１３−ＦとＡＴ１３−Ｒ（配列番号２１及び配列番号２２）又はＡＴ１４−ＦとＡＴ１４−Ｒ（配列番号２３及び２４）を用いてＰＣＲを行った。
Figure 2011001889
得られたＰＣＲ反応生成物を精製し、ＬａｃｔｏｂａｃIｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ IＦＯ ３９５６、Ｓｔａｐｈｙlｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐIｄｅｒｍIｄIｓ ＡＴＣＣ １２２２８、又はＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｃIｔｒｅｕｍ ＮＢＲＣ １０２４７６の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ反応生成物に対しては制限酵素ＮｄｅI及びＥｃｏＲIで消化し、ＬａｃｔｏｂａｃIｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒI ＤＳＭ ２００１６の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ反応生成物に対しては制限酵素ＮｄｅＩ及びＳａｌ1で消化した。Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒIｋｏｓｈII ＯＴ−３に関してはＡＴ１３−Ｆ及びＡＴ１３−Ｒをプライマーとして、染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ反応生成物に対しては制限酵素ＰｓｔＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、ＡＴ１４−Ｆ及びＡＴ１４−Ｒをプライマーとして、染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ反応生成物に対しては制限酵素ＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで消化した。
プライマーＮｄｅＦ、ＮｄｅＲ（配列番号２５及び配列番号２６）とＱｕIｋＣｈａｎｇeＲ ＳIｔｅ−ＤIｒｅｃｔｅｄ ＭｕｔａｇｅｎｅｓIｓ ＫIｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を使用してｐＴＶ１１８Ｎ（宝酒造株式会社製）のｌａｑＺαの開始コドン（ＡＴＧ）の位置に制限酵素ＮｄｅＩ切断配列（ＣＡＴＡＴＧ）を導入したｐＴＶ１１８Ｎ−ＮｄｅＩを作製した。
Figure 2011001889
ＡＴ９−ＦとＡＴ９−Ｒ、ＡＴ１０−ＦとＡＴ１０−Ｒ、ＡＴ１１−ＦとＡＴ１１−Ｒ、ＡＴ１２−ＦとＡＴ１２−Ｒ及びＡＴ１４−ＦとＡＴ１４−Ｒを用いたＰＣＲ反応の生成物を消化した制限酵素であるＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで消化したｐＴＶ１１８Ｎ−ＮｄｅＩに各ＰＣＲ産物を連結してｐＡＴ９、ｐＡＴ１０、ｐＡＴ１１、ｐＡＴ１２及びｐＡＴ１４を作製した。さらにＡＴ１３−ＦとＡＴ１３−Ｒを用いたＰＣＲ反応の生成物を消化した制限酵素であるＰｓｔＩ及びＥｃｏＲＩで消化したｐＵＣ１９に該ＰＣＲ産物を連結してｐＡＴ１３を作製した。その後、ｐＡＴ９、ｐＡＴ１０、ｐＡＴ１１、ｐＡＴ１２、ｐＡＴ１３及びｐＡＴ１４をＥ．ｃｏｌI（ＤＨ５α）に塩化カルシウム法で形質転換した。５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に形質転換株を塗布し、生育したクローンを取得して形質転換株ＤＨ５α／ｐＡＴ９、ＤＨ５α／ｐＡＴ１０、ＤＨ５α／ｐＡＴ１１、ＤＨ５α／ｐＡＴ１２、ＤＨ５α／ｐＡＴ１３及びＤＨ５α／ｐＡＴ１４を得た。
実施例１
製造例で作製したＤＨ５α／ｐＡＴ８を５００ｍＬのＬＢ培地で３７℃、１７時間培養した。遠心分離にて集菌後、Ｄ−２−アミノ酪酸のラセミ化反応に供した。
Ｄ−２−アミノ酪酸５０ｇを蒸留水４５０ｇに溶解して、ＤＨ５α／ｐＡＴ８を０．７５ｇ（乾燥重量相当）添加した。５０℃で２４時間撹拌し、遠心分離にて除菌した。この反応液をＨＰＬＣ（分析条件（１））にて分析したところ、Ｌ−２−アミノ酪酸とＤ−２−アミノ酪酸の比は０．９９：１であった。
実施例２
製造例で作製したＤＨ５α／ｐＡＴ１５を５００ｍＬのＬＢ培地で３７℃、１７時間培養した。遠心分離にて集菌後、Ｄ−２−アミノ酪酸のラセミ化反応に供した。
Ｄ−２−アミノ酪酸５０ｇを蒸留水４５０ｇに溶解して、水酸化ナトリウム水溶液にてｐＨ８に調整後、ＤＨ５α／ｐＡＴ１５を０．７５ｇ（乾燥重量相当）添加した。５０℃で２４時間撹拌し、遠心分離にて除菌した。この反応液をＨＰＬＣ（分析条件（１））にて分析したところ、Ｌ−２−アミノ酪酸とＤ−２−アミノ酪酸の比は０．０９６：１であった。
実施例３
製造例で作製したＤＨ５α／ｐＡＴ８、ＤＨ５α／ｐＡＴ１５を２００ｍＬのＬＢ培地で３７℃、１７時間培養した。遠心分離にて集菌、純水に懸濁後、超音波により細胞を破砕した。再び遠心分離にて残渣を除き、上清２００ｍｌをラセミ化反応に供した。
ｐＨ７．５に調整した５％のＤ−２−アミノ酪酸水溶液２００ｍＬに上清を添加し、３７℃で２４時間撹拌した。この反応液をＨＰＬＣ（分析条件（１））にて分析したところ、Ｌ−２−アミノ酪酸とＤ−２−アミノ酪酸の比はＤＨ５α／ｐＡＴ８を使用した場合０．７５：１、ＤＨ５α／ｐＡＴ１５を使用した場合０．０８：１であった。
実施例４
製造例で作製したＤＨ５α／ｐＡＴ８、ＤＨ５α／ｐＡＴ１５を２００ｍＬのＬＢ培地で３７℃、１７時間培養した。遠心分離にて集菌後、表４記載の各アミノ酸のラセミ化反応に供した。
ｐＨ７．５に調整した各アミノ酸水溶液１００ｇに対して集菌した菌体を基質濃度２．５％のものは０．２５ｇ（乾燥重量相当）、１％のものは０．１ｇ（乾燥重量相当）、さらに基質濃度０．０１５％のものは０．００１５ｇ（乾燥重量相当）懸濁して、３７℃で２４時間撹拌した。この反応液をＨＰＬＣ（分析条件（２））で分析した。
分析結果は表４に示されるとおりであった。
Figure 2011001889
実施例５
製造例で作製したＤＨ５α／ｐＡＴ９、ＤＨ５α／ｐＡＴ１０、ＤＨ５α／ｐＡＴ１１を２００ｍＬのＬＢ培地で３７℃、１７時間培養した。遠心分離にて集菌後、Ｄ−２−アミノ酪酸のラセミ化反応に供した。
ｐＨ７に調整した１０％Ｄ−２−アミノ酪酸水溶液２００ｍＬに対して、集菌した菌体０．２ｇ（乾燥重量相当）を懸濁し、ピリドキサール５‘リン酸（ＰＬＰ）を終濃度４０μＭ添加して、４０℃で２４時間撹拌した。この反応液をＨＰＬＣ（分析条件（１））で分析したところ、Ｌ−２−アミノ酪酸とＤ−２−アミノ酪酸の比はそれぞれ下記の通りであった。
ＤＨ５α／ｐＡＴ９を使用した場合、 ０．０５３：１。
ＤＨ５α／ｐＡＴ１０を使用した場合、 ０．９６５：１。
ＤＨ５α／ｐＡＴ１１を使用した場合、 ０．０６７：１。
実施例６
製造例で作製したＤＨ５α／ｐＡＴ１２を２００ｍＬのＬＢ培地で３０℃、１７時間培養した。遠心分離にて集菌後、Ｄ−２−アミノ酪酸のラセミ化反応に供した。
ｐＨ７に調整した１０％Ｄ−２−アミノ酪酸水溶液２００ｍＬに対して、集菌した菌体０．２ｇ（乾燥重量相当）を懸濁し、ＰＬＰを終濃度１００μＭ添加して、４０℃で２４時間撹拌した。この反応液をＨＰＬＣ（分析条件（１））で分析したところ、Ｌ−２−アミノ酪酸とＤ−２−アミノ酪酸の比は１：１であった。
実施例７
製造例で作製したＤＨ５α／ｐＡＴ１３、ＤＨ５α／ｐＡＴ１４を２００ｍＬのＬＢ培地で３７℃、１７時間培養した。遠心分離にて集菌後、Ｄ−２−アミノ酪酸のラセミ化反応に供した。
ｐＨ７に調整した１％Ｄ−２−アミノ酪酸水溶液１００ｍＬに対して、集菌した菌体を０．１ｇ（乾燥重量相当）懸濁し、７０℃で２４時間撹拌した。この反応液をＨＰＬＣ（分析条件（１））で分析したところ、Ｌ−２−アミノ酪酸とＤ−２−アミノ酪酸の比はそれぞれ下記の通りであった。
ＤＨ５α／ｐＡＴ１３を使用した場合、 ０．３６０：１。
ＤＨ５α／ｐＡＴ１４を使用した場合、 ０．０７８：１。
実施例８： α−アミノ酸の製造法
＜工程１＞
特開２００６−１６９１５８号公報に記載の方法に従って行った。具体的には、ラセミの２−アミノ酪酸１００ｇ、（Ｒ）−２−フェノキシプロピオン酸をＬ−２−アミノ酪酸と等モル量の８０ｇ、蒸留水９００ｇを混合して終夜還流撹拌した。溶液の温度を２０〜３０℃まで冷却し、生じた結晶をろ過、蒸留水でリンス後乾燥し、ジアステレオマー結晶１１０．５ｇを得た。結晶中のＬ−２−アミノ酪酸の光学純度はＨＰＬＣ分析より９９％ｅｅ以上であった。
＜工程２＞
工程１で得られたジアステレオマー結晶５０ｇに対して酢酸エチル２００ｍｌ、水２００ｍｌを加え、室温下で２時間撹拌した。その後分液し、水層に酢酸エチル２００ｍｌを加え、室温下で２時間撹拌した。水相を濃縮してＬ−２−アミノ酪酸を１７．２ｇ（収率９５％）得た。得られたＬ−２−アミノ酪酸の光学純度はＨＰＬＣ分析より９９％ｅｅ以上であった。
また、酢酸エチル層を濃縮して定量的に（Ｒ）−２−フェノキシプロピオン酸を回収した。
＜工程３＞
製造例１で作製したＤＨ５α／ｐＡＴ８を５００ｍＬのＬＢ培地で３７℃、１７時間培養した。遠心分離にて集菌後、以降のラセミ化反応に供した。
工程１で得られた、ろ液を濃縮し、５０％アセトン水溶液に懸濁し、室温で２ｈ撹拌した。ろ過乾燥後、得られた結晶５０ｇを蒸留水４５０ｇに溶解して、集菌したＤＨ５α／ｐＡＴ８を添加した。４０℃で２４時間撹拌し、遠心分離にて除菌した。この反応液をＨＰＬＣにて分析したところ、Ｌ−２−アミノ酪酸とＤ−２−アミノ酪酸の比は０．９９：１であった。
＜工程４＞
工程３で得られた２−アミノ酪酸水溶液に、工程２で回収した（Ｒ）−２−フェノキシプロピオン酸をＬ−２−アミノ酪酸と等モル量の４０ｇ加え、終夜還流撹拌した。溶液の温度を２０〜３０℃まで冷却し、生じた結晶をろ過リンス後乾燥し、ジアステレオマー結晶５５．３ｇを得た。結晶中のＬ−２−アミノ酪酸の光学純度はＨＰＬＣ分析より９９％ｅｅ以上であった。
実施例９〜１２
工程３において、ＤＨ５α／ｐＡＴ８の代わりに製造例２で作製したＤＨ５α／ｐＡＴ９、ＤＨ５α／ｐＡＴ１０、ＤＨ５α／ｐＡＴ１１、又は製造例１で作製したＤＨ５α／ｐＡＴ１５を使用した以外は、実施例８と同様にして実施した。
工程１で得られた、ろ液を濃縮し、５０％アセトン水溶液に懸濁し、室温で２ｈ撹拌した。ろ過乾燥後、得られた結晶５０ｇを蒸留水４５０ｇに溶解して、集菌したＤＨ５α／ｐＡＴ９、ＤＨ５α／ｐＡＴ１０、ＤＨ５α／ｐＡＴ１１又はＤＨ５α／ｐＡＴ１５を添加した。４０℃で２４時間撹拌し、遠心分離にて除菌した。
この反応液をＨＰＬＣにて分析した結果を表５に示す。
この反応液（２−アミノ酪酸水溶液）に対し、実施例８の工程４と同様にして光学分割を行った。得られたジアステレオマー結晶中のＬ−２−アミノ酪酸の光学純度はＨＰＬＣ分析より、いずれも９９％ｅｅ以上であった。
Figure 2011001889
実施例１３
工程３において、ＤＨ５α／ｐＡＴ８の代わりに製造例２で作製したＤＨ５α／ｐＡＴ１２を使用し、かつ培養温度を３０℃とした以外は、実施例８と同様にして実施した。
工程１で得られた、ろ液を濃縮し、５０％アセトン水溶液に懸濁し、室温で２ｈ撹拌した。ろ過乾燥後、得られた結晶５０ｇを蒸留水４５０ｇに溶解し、ピリドキサール５‘リン酸（ＰＬＰ）を終濃度１００μＭ添加して、集菌したＤＨ５α／ｐＡＴ１２を添加した。４０℃で２４時間撹拌し、遠心分離にて除菌した。この反応液をＨＰＬＣにて分析したところ、Ｌ−２−アミノ酪酸とＤ−２−アミノ酪酸の比は１：１であった。
この反応液（２−アミノ酪酸水溶液）に対し、実施例１の工程４と同様にして光学分割を行った。得られたジアステレオマー結晶中のＬ−２−アミノ酪酸の光学純度はＨＰＬＣ分析より、いずれも９９％ｅｅ以上であった。
実施例１４及び１５
工程３において、ＤＨ５α／ｐＡＴ８の代わりに製造例２で作製したＤＨ５α／ｐＡＴ１３又はＤＨ５α／ｐＡＴ１４を使用した以外は、実施例８と同様にして実施した。
工程１で得られた、ろ液を濃縮し、５０％アセトン水溶液に懸濁し、室温で２ｈ撹拌した。ろ過乾燥後、得られた結晶５０ｇを蒸留水４５０ｇに溶解し、集菌したＤＨ５α／ｐＡＴ１３又はＤＨ５α／ｐＡＴ１４を添加した。４０℃で９６時間撹拌し、遠心分離にて除菌した。この反応液をＨＰＬＣにて分析したところ、ＤＨ５α／ｐＡＴ１３を使用した場合Ｌ−２−アミノ酪酸とＤ−２−アミノ酪酸の比は０．４４５：１、ＤＨ５α／ｐＡＴ１４を使用した場合のＬ−２−アミノ酪酸とＤ−２−アミノ酪酸の比は０．２４８：１であった。
この反応液（２−アミノ酪酸水溶液）に対し、実施例１の工程４と同様にして光学分割を行った。得られたジアステレオマー結晶中のＬ−２−アミノ酪酸の光学純度はＨＰＬＣ分析より、いずれも９９％ｅｅ以上であった。

Claims (16)

  1. Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ属、ＬａｃｔｏｂａｃIｌｌｕｓ属、ＷｅIｓｓｅｌｌａ属、Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、ＡｍIｎｏｂａｃｔｅｒIｕｍ属、ＡｌｋａｌIｐｈIｌｕｓ属、ＣｌｏｓｔｒIｄIｕｍ属、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属、ＴｈｅｒｍｏｆIｌｕｍ属、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ属、ＡｎｏｘｙｂａｃIｌｌｕｓ属、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｕｓ属、Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｕｓ属、ＳｙｍｂIｏｂａｃｔｅｒIｕｍ属、Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃｕｓ属、ＢａｃIｌｌｕｓ属、ＡｃIｄｏｂａｃｔｅｒIａ属、ＣｌｏｓｔｒIｄIｕｍ属、ＤｅIｎｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｐｅｌｏｂａｃｔｅｒ属、ＧｅｏｂａｃIｌｌｕｓ属、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ属、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ属、ＳｏｌIｂａｃｔｅｒ属、Ｃｏｐｒｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ属、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ属、Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ属、Ｎｏｓｔｏｃ属、ＨｅｒｐｅｔｏｓIｐｈｏｎ属、Ｍｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ属、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｂａｃｔｅｒ属、Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ属、ＣａｌｄIｖIｒｇａ属、Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｕｓ属、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ属、Ｇｅｍｍａｔａ属、Ａｎａｂａｅｎａ属、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ属、ＰIｃｒｏｐｈIｌｕｓ属、又はＣｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ属に由来するγ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼを産出する微生物の生菌体もしくはその処理物を用いて、光学活性なα−アミノ酸をラセミ化することを含んでなる、光学活性α−アミノ酸のラセミ化方法。
  2. γ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼが、
    Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏIｄｅｓ ｓｕｂｓｐ． ｍｅｓｅｎｔｅｒｏIｄｅｓ、
    Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔIｃｕｓ ｓｕｂｓｐ． ｓａｐｒｏｐｈｙｔIｃｕｓ、
    ＬａｃｔｏｂａｃIｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、
    ＬａｃｔｏｂａｃIｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒI、
    Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐIｄｅｒｍIｄIｓ、
    Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｃIｔｒｅｕｍ、又は
    Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒIｋｏｓｈII
    に属する菌に由来するものである、請求項１に記載の方法。
  3. γ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼが、
    Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏIｄｅｓ ｓｕｂｓｐ． ｍｅｓｅｎｔｅｒｏIｄｅｓ ＡＴＣＣ ８２９３、
    Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔIｃｕｓ ｓｕｂｓｐ． ｓａｐｒｏｐｈｙｔIｃｕｓ ＡＴＣＣ １５３０５、
    ＬａｃｔｏｂａｃIｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ IＦＯ ３９５６、
    ＬａｃｔｏｂａｃIｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒI ＤＳＭ ２００１６、
    Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐIｄｅｒｍIｄIｓ ＡＴＣＣ １２２２８、
    Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｃIｔｒｅｕｍ ＮＢＲＣ １０２４７６、又は
    Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒIｋｏｓｈII ＯＴ−３
    に由来するものである、請求項１又は２に記載の方法。
  4. γ-アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼが、下記（ａ）〜（ｃ）から選択されるポリペプチドである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法：
    （ａ） 配列番号１、２、３、４、５、６、７及び８で表されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、
    （ｂ） 前記（ａ）のアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸残基が、欠損、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、又は
    （ｃ） 前記（ａ）のアミノ酸配列に対して７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
  5. 下記（ａ）〜（ｃ）から選択されるγ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼを用いて、光学活性なα−アミノ酸をラセミ化することを含んでなる、光学活性α−アミノ酸のラセミ化方法：
    （ａ） 配列番号１、２、３、４、５、６、７及び８で表されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、
    （ｂ） 前記（ａ）のアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸残基が、欠損、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、又は
    （ｃ） 前記（ａ）のアミノ酸配列に対して７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
  6. γ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼが、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏIｄｅｓ ｓｕｂｓｐ． ｍｅｓｅｎｔｅｒｏIｄｅｓ ＡＴＣＣ ８２９３由来であって、下記（ａ１）〜（ｃ１）から選択されるポリペプチドである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法：
    （ａ１） 配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、
    （ｂ１） 前記（ａ１）のアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸残基が、欠損、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、又は
    （ｃ１） 前記（ａ１）のアミノ酸配列に対して７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
  7. γ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼが、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔIｃｕｓ ｓｕｂｓｐ． ｓａｐｒｏｐｈｙｔIｃｕｓ ＡＴＣＣ １５３０５由来であって、下記（ａ２）〜（ｃ２）から選択されるポリペプチドである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法：
    （ａ２） 配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、
    （ｂ２） 前記（ａ２）のアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸残基が、欠損、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、又は
    （ｃ２） 前記（ａ２）のアミノ酸配列に対して７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
  8. γ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼが、ＬａｃｔｏｂａｃIｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ IＦＯ ３９５６由来であって、下記（ａ３）〜（ｃ３）から選択されるポリペプチドである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法：
    （ａ３） 配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、
    （ｂ３） 前記（ａ３）のアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸残基が、欠損、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、又は
    （ｃ３） 前記（ａ３）のアミノ酸配列に対して７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
  9. γ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼが、ＬａｃｔｏｂａｃIｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒI ＤＳＭ ２００１６由来であって、下記（ａ４）〜（ｃ４）から選択されるポリペプチドである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法：
    （ａ４） 配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、
    （ｂ４） 前記（ａ４）のアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸残基が、欠損、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、又は
    （ｃ４） 前記（ａ４）のアミノ酸配列に対して７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
  10. γ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼが、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐIｄｅｒｍIｄIｓ ＡＴＣＣ １２２２８由来であって、下記（ａ５）〜（ｃ５）から選択されるポリペプチドである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法：
    （ａ５） 配列番号５で表されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、
    （ｂ５） 前記（ａ５）のアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸残基が、欠損、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、又は
    （ｃ５） 前記（ａ５）のアミノ酸配列に対して７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
  11. γ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼが、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｃIｔｒｅｕｍ ＮＢＲＣ １０２４７６由来であって、下記（ａ６）〜（ｃ６）から選択されるポリペプチドである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法：
    （ａ６） 配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、
    （ｂ６） 前記（ａ６）のアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸残基が、欠損、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、又は
    （ｃ６） 前記（ａ６）のアミノ酸配列に対して７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
  12. γ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼが、 Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒIｋｏｓｈII ＯＴ−３由来であって、下記（ａ７）〜（ｃ７）から選択されるポリペプチドである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法：
    （ａ７） 配列番号７または８で表されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、
    （ｂ７） 前記（ａ７）のアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸残基が、欠損、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、又は
    （ｃ７） 前記（ａ７）のアミノ酸配列に対して７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
  13. 光学活性α−アミノ酸が、下記式（I）で表される１種以上のものである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法：
    Figure 2011001889
     ［式中、Ｒは、
    メチル基もしくはヒドロキシ基により置換されていてもよい、ベンジル基；又は
    炭素数１〜４の直鎖状もしくは分岐鎖状のアルキル基（ここでアルキル基は、ヒドロキシ基、メチルチオ基、チオール基、アミド基、もしくはイミダゾイル基により置換されていてもよい）
    である］。
  14. 光学活性α−アミノ酸が、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、tert-ロイシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、メチオニン、アスパラギン、チロシン、セリン及び２−アミノ酪酸からなる群より選択される１種以上のものである、請求項１３に記載の方法。
  15. 光学活性α−アミノ酸がＬ体である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 光学活性α−アミノ酸がＤ体である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
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JP2516625B2 (ja) * 1986-06-02 1996-07-24 三菱化学株式会社 Ｌ−スレオニンの製造法
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