JP7496814B2 - 改良されたトランスアミナーゼタンパク質をコードする核酸 - Google Patents
改良されたトランスアミナーゼタンパク質をコードする核酸 Download PDFInfo
- Publication number
- JP7496814B2 JP7496814B2 JP2021504748A JP2021504748A JP7496814B2 JP 7496814 B2 JP7496814 B2 JP 7496814B2 JP 2021504748 A JP2021504748 A JP 2021504748A JP 2021504748 A JP2021504748 A JP 2021504748A JP 7496814 B2 JP7496814 B2 JP 7496814B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- seq
- amino acid
- nucleotide
- positions
- nucleic acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims description 369
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims description 187
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims description 187
- 102000003929 Transaminases Human genes 0.000 title description 22
- 108090000340 Transaminases Proteins 0.000 title description 22
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 625
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 625
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 596
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 367
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 363
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 330
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 315
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 claims description 193
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 171
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 147
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 103
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 93
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 89
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 claims description 71
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 22
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 22
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 18
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 578
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 573
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 290
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 104
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 68
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 61
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 54
- 239000000370 acceptor Substances 0.000 description 53
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 41
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 41
- 241000186073 Arthrobacter sp. Species 0.000 description 35
- -1 antibiotic Chemical class 0.000 description 35
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 35
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- 241000194107 Bacillus megaterium Species 0.000 description 27
- 108010003989 D-amino-acid oxidase Proteins 0.000 description 26
- 102100026908 D-amino-acid oxidase Human genes 0.000 description 26
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 26
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 26
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 26
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 26
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 25
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 25
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 25
- NGVDGCNFYWLIFO-UHFFFAOYSA-N pyridoxal 5'-phosphate Chemical compound CC1=NC=C(COP(O)(O)=O)C(C=O)=C1O NGVDGCNFYWLIFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 25
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 25
- HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 8-[3-(1-cyclopropylpyrazol-4-yl)-1H-pyrazolo[4,3-d]pyrimidin-5-yl]-3-methyl-3,8-diazabicyclo[3.2.1]octan-2-one Chemical class C1(CC1)N1N=CC(=C1)C1=NNC2=C1N=C(N=C2)N1C2C(N(CC1CC2)C)=O HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 24
- 230000008569 process Effects 0.000 description 24
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 23
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 22
- 235000008206 alpha-amino acids Nutrition 0.000 description 22
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 22
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 20
- 239000000047 product Substances 0.000 description 19
- 235000007682 pyridoxal 5'-phosphate Nutrition 0.000 description 18
- 239000011589 pyridoxal 5'-phosphate Substances 0.000 description 18
- JJWLVOIRVHMVIS-UHFFFAOYSA-N isopropylamine Chemical compound CC(C)N JJWLVOIRVHMVIS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical class CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 15
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 14
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 13
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 13
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 13
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 12
- SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N L-2-aminopentanoic acid Chemical compound CCC[C@H](N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 12
- 238000005576 amination reaction Methods 0.000 description 12
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 12
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 12
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 12
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 12
- 238000005891 transamination reaction Methods 0.000 description 12
- 229960004441 tyrosine Drugs 0.000 description 12
- 150000004715 keto acids Chemical class 0.000 description 11
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 10
- IAJOBQBIJHVGMQ-BYPYZUCNSA-N glufosinate-P Chemical compound CP(O)(=O)CC[C@H](N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 10
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 10
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 9
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 9
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 9
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 9
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 9
- BTNMPGBKDVTSJY-UHFFFAOYSA-N keto-phenylpyruvic acid Chemical compound OC(=O)C(=O)CC1=CC=CC=C1 BTNMPGBKDVTSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 9
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 8
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 8
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 8
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 7
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 241000221523 Rhodotorula toruloides Species 0.000 description 7
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 7
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 7
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 7
- 150000001336 alkenes Chemical class 0.000 description 7
- 150000001345 alkine derivatives Chemical class 0.000 description 7
- 150000001370 alpha-amino acid derivatives Chemical class 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 150000003017 phosphorus Chemical class 0.000 description 7
- 229960001327 pyridoxal phosphate Drugs 0.000 description 7
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 7
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 7
- KKADPXVIOXHVKN-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxyphenylpyruvic acid Chemical compound OC(=O)C(=O)CC1=CC=C(O)C=C1 KKADPXVIOXHVKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N D-alpha-Ala Natural products CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 6
- 229960003767 alanine Drugs 0.000 description 6
- 150000001371 alpha-amino acids Chemical class 0.000 description 6
- 150000004982 aromatic amines Chemical class 0.000 description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 6
- 150000001924 cycloalkanes Chemical class 0.000 description 6
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- KDVFRMMRZOCFLS-UHFFFAOYSA-N 2-oxopentanoic acid Chemical compound CCCC(=O)C(O)=O KDVFRMMRZOCFLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- BKAJNAXTPSGJCU-UHFFFAOYSA-N 4-methyl-2-oxopentanoic acid Chemical compound CC(C)CC(=O)C(O)=O BKAJNAXTPSGJCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000194110 Bacillus sp. (in: Bacteria) Species 0.000 description 5
- QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N D-alanine Chemical compound C[C@@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N 0.000 description 5
- 150000008574 D-amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 5
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 5
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 5
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 150000004716 alpha keto acids Chemical class 0.000 description 5
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 5
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 5
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 5
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 5
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 5
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 5
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 5
- 238000001694 spray drying Methods 0.000 description 5
- YJTNHDYMQPHXFO-UHFFFAOYSA-N 4-(hydroxymethylphosphinyl)-2-oxobutyric acid Chemical compound CP(O)(=O)CCC(=O)C(O)=O YJTNHDYMQPHXFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000001142 4-methyl-2-oxopentanoic acid Substances 0.000 description 4
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N beta-alanine Chemical compound NCCC(O)=O UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 4
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 4
- 229960005190 phenylalanine Drugs 0.000 description 4
- WGYKZJWCGVVSQN-UHFFFAOYSA-N propylamine Chemical compound CCCN WGYKZJWCGVVSQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 4
- IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4-[hydroxy(methyl)phosphoryl]butanoic acid Chemical compound CP(O)(=O)CCC(N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000001903 2-oxo-3-phenylpropanoic acid Substances 0.000 description 3
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 3
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 3
- 108050004635 D-amino acid aminotransferases Proteins 0.000 description 3
- 241000660147 Escherichia coli str. K-12 substr. MG1655 Species 0.000 description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000186807 Listeria seeligeri Species 0.000 description 3
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 3
- FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylacetamide Chemical compound CN(C)C(C)=O FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 241000607598 Vibrio Species 0.000 description 3
- DEDGUGJNLNLJSR-UHFFFAOYSA-N alpha-hydroxycinnamic acid Natural products OC(=O)C(O)=CC1=CC=CC=C1 DEDGUGJNLNLJSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000003674 animal food additive Substances 0.000 description 3
- 230000002210 biocatalytic effect Effects 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 3
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 3
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 125000000468 ketone group Chemical group 0.000 description 3
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 3
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000007833 oxidative deamination reaction Methods 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 238000006268 reductive amination reaction Methods 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- BHRZNVHARXXAHW-UHFFFAOYSA-N sec-butylamine Chemical compound CCC(C)N BHRZNVHARXXAHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000000707 stereoselective effect Effects 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 3
- XJEVHMGJSYVQBQ-UHFFFAOYSA-N 2,3-dihydro-1h-inden-1-amine Chemical compound C1=CC=C2C(N)CCC2=C1 XJEVHMGJSYVQBQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- WECUIGDEWBNQJJ-UHFFFAOYSA-N 4-phenylbutan-2-amine Chemical compound CC(N)CCC1=CC=CC=C1 WECUIGDEWBNQJJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000186063 Arthrobacter Species 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 2
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N Dioxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 239000005561 Glufosinate Substances 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N Histamine Chemical compound NCCC1=CN=CN1 NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 2
- SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N L-norVal-OH Natural products CCCC(N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IMNFDUFMRHMDMM-UHFFFAOYSA-N N-Heptane Chemical compound CCCCCCC IMNFDUFMRHMDMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000589597 Paracoccus denitrificans Species 0.000 description 2
- NBBJYMSMWIIQGU-UHFFFAOYSA-N Propionic aldehyde Chemical compound CCC=O NBBJYMSMWIIQGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 2
- 241000589540 Pseudomonas fluorescens Species 0.000 description 2
- 241000316848 Rhodococcus <scale insect> Species 0.000 description 2
- 241000187693 Rhodococcus rhodochrous Species 0.000 description 2
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- UCTWMZQNUQWSLP-UHFFFAOYSA-N adrenaline Chemical compound CNCC(O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 UCTWMZQNUQWSLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- 150000003973 alkyl amines Chemical class 0.000 description 2
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000003975 aryl alkyl amines Chemical class 0.000 description 2
- 238000011914 asymmetric synthesis Methods 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WGQKYBSKWIADBV-UHFFFAOYSA-N benzylamine Chemical compound NCC1=CC=CC=C1 WGQKYBSKWIADBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940000635 beta-alanine Drugs 0.000 description 2
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 description 2
- 238000010364 biochemical engineering Methods 0.000 description 2
- VHRGRCVQAFMJIZ-UHFFFAOYSA-N cadaverine Chemical compound NCCCCCN VHRGRCVQAFMJIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 2
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 2
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N diethanolamine Chemical compound OCCNCCO ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910001882 dioxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 2
- VWWQXMAJTJZDQX-UYBVJOGSSA-N flavin adenine dinucleotide Chemical compound C1=NC2=C(N)N=CN=C2N1[C@@H]([C@H](O)[C@@H]1O)O[C@@H]1CO[P@](O)(=O)O[P@@](O)(=O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C2=NC(=O)NC(=O)C2=NC2=C1C=C(C)C(C)=C2 VWWQXMAJTJZDQX-UYBVJOGSSA-N 0.000 description 2
- 235000019162 flavin adenine dinucleotide Nutrition 0.000 description 2
- 239000011714 flavin adenine dinucleotide Substances 0.000 description 2
- 229940093632 flavin-adenine dinucleotide Drugs 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 2
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 2
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 2
- 239000011147 inorganic material Substances 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 2
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- VIKNJXKGJWUCNN-XGXHKTLJSA-N norethisterone Chemical compound O=C1CC[C@@H]2[C@H]3CC[C@](C)([C@](CC4)(O)C#C)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 VIKNJXKGJWUCNN-XGXHKTLJSA-N 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 2
- 239000011368 organic material Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- GQYBCIHRWMPOOF-UHFFFAOYSA-N p-hydroxyphenylpyruvic acid Natural products OC(=O)C(O)=CC1=CC=C(O)C=C1 GQYBCIHRWMPOOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000006479 redox reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- MFFMDFFZMYYVKS-SECBINFHSA-N sitagliptin Chemical compound C([C@H](CC(=O)N1CC=2N(C(=NN=2)C(F)(F)F)CC1)N)C1=CC(F)=C(F)C=C1F MFFMDFFZMYYVKS-SECBINFHSA-N 0.000 description 2
- 229960004034 sitagliptin Drugs 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RQEUFEKYXDPUSK-ZETCQYMHSA-N (1S)-1-phenylethanamine Chemical compound C[C@H](N)C1=CC=CC=C1 RQEUFEKYXDPUSK-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- JRZGPXSSNPTNMA-JTQLQIEISA-N (1s)-1,2,3,4-tetrahydronaphthalen-1-amine Chemical class C1=CC=C2[C@@H](N)CCCC2=C1 JRZGPXSSNPTNMA-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- XHOXKVFLASIOJD-JTQLQIEISA-N (1s)-1-phenylbutan-1-amine Chemical compound CCC[C@H](N)C1=CC=CC=C1 XHOXKVFLASIOJD-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- XJEVHMGJSYVQBQ-VIFPVBQESA-N (1s)-2,3-dihydro-1h-inden-1-amine Chemical compound C1=CC=C2[C@@H](N)CCC2=C1 XJEVHMGJSYVQBQ-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- IAJOBQBIJHVGMQ-SCSAIBSYSA-N (2R)-glufosinate Chemical compound C[P@@](O)(=O)CC[C@@H](N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-SCSAIBSYSA-N 0.000 description 1
- NXMXETCTWNXSFG-BYPYZUCNSA-N (2s)-1-methoxypropan-2-amine Chemical compound COC[C@H](C)N NXMXETCTWNXSFG-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- WECUIGDEWBNQJJ-VIFPVBQESA-N (2s)-4-phenylbutan-2-amine Chemical compound C[C@H](N)CCC1=CC=CC=C1 WECUIGDEWBNQJJ-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- JRZGPXSSNPTNMA-UHFFFAOYSA-N 1,2,3,4-tetrahydronaphthalen-1-amine Chemical compound C1=CC=C2C(N)CCCC2=C1 JRZGPXSSNPTNMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QAEDTLFWHIEVPK-UHFFFAOYSA-N 1-[3-(trifluoromethyl)-6,8-dihydro-5h-[1,2,4]triazolo[4,3-a]pyrazin-7-yl]-4-(2,4,5-trifluorophenyl)butane-1,3-dione Chemical compound C1=C(F)C(F)=CC(F)=C1CC(=O)CC(=O)N1CC2=NN=C(C(F)(F)F)N2CC1 QAEDTLFWHIEVPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CUZLJOLBIRPEFB-UHFFFAOYSA-N 1-methoxypropan-2-one Chemical compound COCC(C)=O CUZLJOLBIRPEFB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RQEUFEKYXDPUSK-UHFFFAOYSA-N 1-phenylethylamine Chemical compound CC(N)C1=CC=CC=C1 RQEUFEKYXDPUSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XHLHPRDBBAGVEG-UHFFFAOYSA-N 1-tetralone Chemical class C1=CC=C2C(=O)CCCC2=C1 XHLHPRDBBAGVEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-N 2-oxoglutaric acid Chemical compound OC(=O)CCC(=O)C(O)=O KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCCN1CCOCC1 DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- APRRQJCCBSJQOQ-UHFFFAOYSA-N 4-amino-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical group OS(=O)(=O)C1=CC(O)=C2C(N)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=C1 APRRQJCCBSJQOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LQGKDMHENBFVRC-UHFFFAOYSA-N 5-aminopentan-1-ol Chemical compound NCCCCCO LQGKDMHENBFVRC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SZBGXBOFCGNPEU-UHFFFAOYSA-N 5-aminopentanal Chemical compound NCCCCC=O SZBGXBOFCGNPEU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JJMDCOVWQOJGCB-UHFFFAOYSA-N 5-aminopentanoic acid Chemical compound [NH3+]CCCCC([O-])=O JJMDCOVWQOJGCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CNRGMQRNYAIBTN-UHFFFAOYSA-N 5-hydroxypentanal Chemical compound OCCCCC=O CNRGMQRNYAIBTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VBKPPDYGFUZOAJ-UHFFFAOYSA-N 5-oxopentanoic acid Chemical compound OC(=O)CCCC=O VBKPPDYGFUZOAJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 6-aminohexanoic acid Chemical compound NCCCCCC(O)=O SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001453369 Achromobacter denitrificans Species 0.000 description 1
- 241000222518 Agaricus Species 0.000 description 1
- 244000251953 Agaricus brunnescens Species 0.000 description 1
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 description 1
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 1
- 241000589156 Agrobacterium rhizogenes Species 0.000 description 1
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 1
- 108010031025 Alanine Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 108010041525 Alanine racemase Proteins 0.000 description 1
- PAYRUJLWNCNPSJ-UHFFFAOYSA-N Aniline Chemical group NC1=CC=CC=C1 PAYRUJLWNCNPSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100272669 Aromatoleum evansii boxA gene Proteins 0.000 description 1
- 241000185996 Arthrobacter citreus Species 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 241001037822 Bacillus bacterium Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- IZRXRVBFLSRAIB-UHFFFAOYSA-N CCCCCCOC(=O)C(=O)CCCC Chemical compound CCCCCCOC(=O)C(=O)CCCC IZRXRVBFLSRAIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000819038 Chichester Species 0.000 description 1
- 241000588879 Chromobacterium violaceum Species 0.000 description 1
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 1
- RGJOEKWQDUBAIZ-IBOSZNHHSA-N CoASH Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-IBOSZNHHSA-N 0.000 description 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- SNDPXSYFESPGGJ-SCSAIBSYSA-N D-2-aminopentanoic acid Chemical compound CCC[C@@H](N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-SCSAIBSYSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N D-OH-Asp Natural products OC(=O)C(N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VVNCNSJFMMFHPL-VKHMYHEASA-N D-penicillamine Chemical compound CC(C)(S)[C@@H](N)C(O)=O VVNCNSJFMMFHPL-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-MRVPVSSYSA-N D-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-MRVPVSSYSA-N 0.000 description 1
- 229930182832 D-phenylalanine Natural products 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-MRVPVSSYSA-N D-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-MRVPVSSYSA-N 0.000 description 1
- 229930195709 D-tyrosine Natural products 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 102000003983 Flavoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010057573 Flavoproteins Proteins 0.000 description 1
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M Formate Chemical compound [O-]C=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108090000698 Formate Dehydrogenases Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylethanolamin Natural products NCCOP(O)(=O)OCC(O)CO JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930194542 Keto Natural products 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 229930195714 L-glutamate Natural products 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N L-norleucine Chemical compound CCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 1
- BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N Methyl tert-butyl ether Chemical compound COC(C)(C)C BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000019695 Migraine disease Diseases 0.000 description 1
- 101100087528 Mus musculus Rhoj gene Proteins 0.000 description 1
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FSVCELGFZIQNCK-UHFFFAOYSA-N N,N-bis(2-hydroxyethyl)glycine Chemical compound OCCN(CCO)CC(O)=O FSVCELGFZIQNCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Chemical group 0.000 description 1
- BZQFBWGGLXLEPQ-UHFFFAOYSA-N O-phosphoryl-L-serine Natural products OC(=O)C(N)COP(O)(O)=O BZQFBWGGLXLEPQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 1
- 241000589776 Pseudomonas putida Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 101100467813 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) RBS1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000223259 Trichoderma Species 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 241000607291 Vibrio fluvialis Species 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 101150063416 add gene Proteins 0.000 description 1
- 230000002730 additional effect Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 229930013930 alkaloid Natural products 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229940124277 aminobutyric acid Drugs 0.000 description 1
- 229960002684 aminocaproic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000000202 analgesic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012801 analytical assay Methods 0.000 description 1
- 150000001448 anilines Chemical class 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940127003 anti-diabetic drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003472 antidiabetic agent Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 239000007998 bicine buffer Substances 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- ZTQSAGDEMFDKMZ-UHFFFAOYSA-N butyric aldehyde Natural products CCCC=O ZTQSAGDEMFDKMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001728 carbonyl compounds Chemical class 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N coenzime A Natural products OC1C(OP(O)(O)=O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005516 coenzyme A Substances 0.000 description 1
- 229940093530 coenzyme a Drugs 0.000 description 1
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000366 copper(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- UFULAYFCSOUIOV-UHFFFAOYSA-N cysteamine Chemical compound NCCS UFULAYFCSOUIOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009615 deamination Effects 0.000 description 1
- 238000006481 deamination reaction Methods 0.000 description 1
- KDTSHFARGAKYJN-UHFFFAOYSA-N dephosphocoenzyme A Natural products OC1C(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 KDTSHFARGAKYJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- RXKJFZQQPQGTFL-UHFFFAOYSA-N dihydroxyacetone Chemical compound OCC(=O)CO RXKJFZQQPQGTFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 235000015244 frankfurter Nutrition 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical compound NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 125000003147 glycosyl group Chemical group 0.000 description 1
- HHLFWLYXYJOTON-UHFFFAOYSA-N glyoxylic acid Chemical compound OC(=O)C=O HHLFWLYXYJOTON-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 229940094991 herring sperm dna Drugs 0.000 description 1
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 1
- 229960001340 histamine Drugs 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000010907 mechanical stirring Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 229960003151 mercaptamine Drugs 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- QCAWEPFNJXQPAN-UHFFFAOYSA-N methoxyfenozide Chemical compound COC1=CC=CC(C(=O)NN(C(=O)C=2C=C(C)C=C(C)C=2)C(C)(C)C)=C1C QCAWEPFNJXQPAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 206010027599 migraine Diseases 0.000 description 1
- 125000004108 n-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- RIWRFSMVIUAEBX-UHFFFAOYSA-N n-methyl-1-phenylmethanamine Chemical compound CNCC1=CC=CC=C1 RIWRFSMVIUAEBX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002887 neurotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005580 one pot reaction Methods 0.000 description 1
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 1
- 238000002888 pairwise sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000007793 ph indicator Substances 0.000 description 1
- 150000008104 phosphatidylethanolamines Chemical class 0.000 description 1
- BZQFBWGGLXLEPQ-REOHCLBHSA-N phosphoserine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)COP(O)(O)=O BZQFBWGGLXLEPQ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 101150025733 pub2 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000005086 pumping Methods 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 102200128611 rs397508272 Human genes 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 230000013715 transcription antitermination Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 239000003039 volatile agent Substances 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Images
Description
本発明は、改良されたω-トランスアミナーゼ(ω-TA)活性を有するタンパク質類、改良されたω-TA活性を有するそれぞれのタンパク質をコードする核酸分子、およびキラルアミンおよびアミノ酸の立体選択的合成のための方法、またはエナンチオマー混合物中のキラルアミン異性体の増加方法に関する。
生体触媒は、自然界で利用可能な酵素に基づくことができる。より多くの場合、特定の生成物を産生したいという願望が、特定の酵素に対する需要を生み出し、この酵素は、経済的に実行可能な量の目的生成物を大量に産生することに適応している。酵素工学は、所定の生成物の経済的生産に向けて酵素を最適化するための1つの選択肢である。
アミンとアミノ酸は、タンパク質や核酸の一部としてだけでなく、神経伝達物質(例えばアドレナリンやヒスタミン)として、補酵素の前駆体(例えば補酵素Aのシステアミン)として、あるいは複合脂質(例えば、ホスファチジルエタノールアミンのエタノールアミン)の前駆体としても、自然界に広く存在している。特に、アルカロイドとして医薬的に分類される高置換アミンは、生命の様々な形態で見出される生物学的効果並びに莫大な多様な構造を示す。抗生物質性、鎮痛作用、神経毒性活性のようなアミンの生物活性は、医薬品としての可能性を高め、新薬の探索において非常に有望な候補となる。キラルアミンの立体中心の絶対配置は、生体分子との相互作用、ひいては生体系への影響のタイプにとってきわめて重要である。所望の標的分子の生産のためには、正しいキラリティの生成がしばしば課題となる。(Schaetzle,2011,Inaugural Dissertation,Ernst-Moritz-Arndt-University of Greifswald,Germany,“Identification,characterization and application of novel (R)-selective amine transaminases”)。
製薬会社のパイプラインにある活性化合物の多くは、キラルである。光学活性アミンは、多くの活性な医薬および農産物の合成のための重要なクラスの化合物に属する。例えば、L-フェニルアラニンは動物飼料の重要な添加物である。エナンチオマー的に純粋なアミノ酸の化学合成のための商業的に実行可能なプロセスは利用できない。それにもかかわらず、ラセミ体の混合物を純粋な異性体に分割することは、場合によっては生体触媒プロセスによって可能であるため、ラセミ体アミノ酸の化学合成は依然として重要である。(Breuerら,2004、Angewandte Chemie International Edition 43,788-824)。
アミントランスアミナーゼまたはω-トランスアミナーゼ(ω-TA)は、キラルな第一級アミンの産生にとって非常に重要な生体触媒である。ω-TAは、ピリドキサール-5’-リン酸(PLP)を補因子として利用し、アミノ供与体からカルボニル部分へのアミノ基の転移を触媒する。それゆえ、反応混合物は2つのアミン(アミノ供与体と生成物)と2つのカルボニル化合物(ケトン基質と副生成物)からなる。これまで、(S)-選択的および(R)-選択的トランスアミナーゼの両方が見出され、よく記述されている。この酵素は、立体選択性が高く、直接的不斉アミノ化の可能性を有し、安価なアミノ供与体を用いてアキラルなケトンから直接的に高いエナンチオマー過剰でキラルなアミンを生成する。(Feskoら、2013,J.Molecular Catalysis B,Enzymatic 96,103-110)。
トランスアミナーゼは、多種多様なキラルアミンおよびアミノ酸の生体触媒合成において注目を集めている。トランスアミナーゼは、ラセミ体アミノ酸の速度論的分割(一つの異性体を混合物として除去する)または対応するプロキラルケト基質から出発する不斉合成のいずれにも適用できる。トランスアミナーゼによって触媒される反応は、受容体の還元アミノ化と同時に供与体の酸化的脱アミノ化を伴う酸化還元反応と見なされることができる。(Rudatら、2012,AMB Express 2:11)。
Cannら(2012,Org.Process Res.Dev.16,1953-1966)は、片頭痛薬の製造のための前駆体であるα-アミノエステルの立体選択的生産のためのω-トランスアミナーゼの使用の成功を開示している。酵素的対化学的合成の利点と欠点を論じている。
US4,950,606では、光学活性アミンの製造過程について述べている。このプロセスでは、Bacillus megateriumおよびPseudomonas putida由来のω-トランスアミナーゼは、アミノ供与体からのアミノ基のエナンチオ選択的転移によって、プロキラルケトンまたはケト酸をアミンに変換する。アミンの(R)-および(S)-配置が得られ得る。
Parkら(2013,Organic&Biomolecular Chemistry 11,6929-6933)は、アミン供与体としてイソプロピルアミンおよびその他の様々な化合物を用いることにより、ケト酸からの非天然アミノ酸のエナンチオ選択的合成における様々なトランスアミナーゼの挙動を開示している。
Parkら(2013,ChemCatChem 5,1734-1738)は、プロキラルアルキルケトンの熱力学的に好ましい不斉アミノ化のために(R)-または(S)-選択的ω-トランスアミナーゼを用いることが可能であることを、ワンポット反応にラセミ体アリールアルキルアミンをアミノ供与体として用いることで実証している。この反応では、過剰量のアミノ供与体の添加や共生成物の除去を必要としない。
アミノ供与体として2-プロピルアミン、1-プロピルアミンおよびラセミ-2-ブチルアミンを用いると、アラニンをアミノ供与体として用いる反応と比較して、ω-トランスアミナーゼ触媒反応は、最大3倍高い変換をもたらすことが実証されている。アミノ酸β-アラニンとアスパラギンは、アミノ供与体として乏しかった。芳香族残基を含むいくつかのメチルケトンについて、過剰の2-ブチルアミンまたは1-フェニルエチルアミンをアミノ供与体として用いた場合、光学的に純粋なアミンが高収率で得られた。平衡をシフトさせるためのそれ以上の工程は不要であった。(Feskoら、2013,J.Molecular Catalysis B,Enzymatic 96,103-110)。
Shin&Kim(2001,Biosci.Biotechno.Biochem.65(8),1782-1788)は、アミン供与体として、(S)-α-メチルベンジルアミン((S)-α-MBA)、1-メチル-3-フェニルプロピルアミン、1-アミノテトラリンまたは1-アミノインダンを含むアリールアミンを用いたω-トランスアミナーゼの単離を開示している。良好なアミノ受容体は、ケト酸であるピルビン酸とグリオキシル酸、あるいはアルデヒドであるプロピオンアルデヒドとブタルアルデヒドであることが分かった。
US6,133,018は、メトキシアセトンとアキラルなアミノ供与体2-アミノプロパンをω-トランスアミナーゼと接触させることによる、(S)-1-メトキシ-2-アミノプロパンの生成を開示している。
D-アラニンをアミノ供与体として用いるD-アミノ酸アミノトランスフェラーゼ(トランスアミナーゼ)によって触媒されるケト酸のそれぞれのD-アミノ酸への変換によるD-アミノ酸の産生のための4つの酵素系は、Galkinら(1997,J.Fermentation and Bioengeneering 83(3),299-300)に以下のように記載する。D-アミノ酸の方向への反応平衡を駆動するために、さらに反応をD-アミノ酸アミノトランスフェラーゼと縮合させた。ピルビン酸とアンモニアはアラニンデヒドロゲナーゼによってL-アラニンに変換され、同時にNADHをNADに還元する。L-アラニンは、アラニンラセマーゼによってD-アラニンに変換される。NADからのNADHの再利用は、ギ酸デヒドロゲナーゼによって触媒されるギ酸からの二酸化炭素の生成によって確立される。ピルビン酸は、D-アミノ酸アミノトランスフェラーゼ反応によってアラニンから再利用される。グルタミン酸、ロイシン、ノルロイシンおよびメチオニンのD-エナンチオマーは高収率で生産できたが、D-フェニルアラニンおよびD-チロシンは低収率で合成され、D-ノルバリンは30%の接近でしか生産できず、アミノ酪酸はラセミ混合物としてのみ生産された。
WO2010/089171A2は、トランスアミナーゼ活性を有する酵素によって触媒される反応において、多環式環系を含む少なくとも1つのケト基中の少なくとも1つのケト基をアミノ基にアンモニア化するための方法を開示する。
WO2015/195707A1(US2015361468A1)は、トランスジェニック細菌による5炭素ポリマー構成単位の生産を開示している。細菌の生合成経路は、ω-トランスアミナーゼを含む複数の酵素の導入によって操作される。ω-トランスアミナーゼは、グルタル酸セミ-アルデヒドの5-アミノペンタノエートへの触媒反応と逆反応、5-アミノペンタノールから5-オキソペンタノール、カダベリンから5-アミノペンタナール、N5-アセチル-1,5-ジアミノペンタンからN5-アセチル-5-アミノペンタナールへの触媒反応を示し、L-グルタミン酸/2-オキソグルタル酸またはL-アラニン/ピルビン酸を、それぞれアミノ供与体/受容体として用いた。
KR20030072067は、L-選択的芳香族アミノ酸トランスフェラーゼ(トランスアミナーゼ)を含む好熱性Bacillus sp.T30株の単離、およびこの株の高反応温度での芳香族L-アミノ酸の生産のための生体触媒としての使用を開示し、それによりケト酸基質の溶解度を増加させる。
Koszelewskiら(2010,ChemCat Chem 2(1),73-77、「Supporting Information」を含む)は、対応するプロキラルアミンからのエナンチオマー的に純粋なアミンの合成およびラセミアミンの分割のための全細胞触媒の使用を開示している。Bacillus megaterium SC6394由来の異なるω-トランスアミナーゼ、Alcaligenes denitrificans Y2k-2、Chromobacterium violaceum DSM30191、Vibrio fluvialisのω-トランスアミナーゼのW57G変異体、およびArthrobacter種由来のCNB05-01と呼ばれる変異体は、Escherichia coli細胞で発現する。凍結乾燥したEscherichia coli細胞を、速度論的分割と立体選択的アミノ化反応に用いた。
トランスアミナーゼの使用により到達可能な生成物の範囲は、ケトンに隣接する位置でエチル基よりもかなり大きい基質を受け入れないために、大部分の天然に存在するω-トランスアミナーゼの特性により制限される(Savileら、2010、Science 329、305-309、「Supporting information」を含む)。Parkら(2014、Adv.Synth.Catal.356、212-220)は、n-ブチル基(例えば、2-オキソヘキサン酸n-ヘキシル)までの置換基を有する基質を受け入れたが、分枝鎖α-ケト酸を受け入れなかったParacoccus denitrificans由来の(S)-選択的ω-トランスアミナーゼを発見した。Paracoccus denitrificansからの(S)選択的ωトランスアミナーゼの変異体(V153A)は、直鎖のケト酸(S)-1-フェニルブチルアミンに対して活性の改善を示したが、分岐ケト酸を受け入れなかった。
それぞれの野生型配列のアミノ酸配列と比較して17アミノ酸置換を含む中温性Arthrobacter citreus ω-トランスアミナーゼの変異体は、アミン供与体としてのイソプロピルアミンの存在下で置換テトラロンから置換(S)-アミノテトラリンを産生する反応において、熱安定性の改善および比活性の有意な改善を示す。(Martinら、2007、Biochemical Engineering Journal 37,246-255)。
Savileら(2010、Science 329、305-309、「Supporting Information」を含む)は、ω-トランスアミナーゼを含む生体触媒プロセスによる複雑な抗糖尿病薬シタグリプチンの製造を開示する。Arthrobacter sp.(R)選択的ω-トランスアミナーゼ(ATA-117)の種々の変異体を作製した。酵素は広い基質範囲を示し、イソプロピルアミンおよび有機溶媒に対する耐性が増加する。これらの酵素により、種々のトリフルオロメチル置換アミンおよびフェニルアミンを産生することができた。野生型酵素と比較して27アミノ酸置換を含むArthrobacter sp.(R)-選択的ω-トランスアミナーゼ(ATA-117)の最適化変異体を用いて、アミン供与体としてイソプロピルアミンの存在下でプロシタグリプチンケトンのアミノ化によりシタグリプチンを生産した。
WO2006/06339(US7,247,460)は、それぞれの場合に野生型酵素と比較した場合、熱安定性であり、増加した反応速度および高いアミン供与体濃度に対する耐性を有するArthrobacter citerus ω-トランスアミナーゼ変異体を開示している。
Angewandte Chemie International Edition、43,788-824,2004
AMB Express,2:11、2012
Org.Process Res.Dev.16,1953-1966、2012
Organic&Biomolecular Chemistry、11,6929-6933、2013
ChemCatChem、5,1734-1738、2013
J.Molecular Catalysis B,Enzymatic、96,103-110、2013
Biosci.Biotechno.Biochem.65(8),1782-1788、2001
J.Fermentation and Bioengeneering、83(3),299-300、1997
ChemCat Chem、2(1),73-77、2010
Science、329、305-309、2010
Adv.Synth.Catal.356、212-220、2014
Biochemical Engineering Journal、37,246-255、2007
Science、329、305-309、2010
トランスアミナーゼのいくつかの改良がこれまでに達成されているが、不利な平衡、基質および生成物阻害、不十分な熱安定性、不十分な基質特異性およびときにトランスアミナーゼの低いエナンチオ選択性のような、アミンの不斉合成またはラセミアミンの分割の間に生じる制限は、産業スケールでの広範囲のアミンの効率的生産のためにまだ克服しなければならない。
したがって、ω-トランスアミナーゼのさらなる改良が必要である。特に、所望のアミノ化された、エナンチオマー富化された、または純粋な生成物の生産に関して、好ましくは、特定のおよび/または経済的に実行可能な生産プロセスの下で、更なるω-トランスアミナーゼの改良プロセスが必要である。
本発明は、それらのアミノ酸配列における改変を含むω-トランスアミナーゼ(ω-TAs)変異体、又は、それらのアミノ酸配列における追加の改変を含むω-TAsの更なる改変変異体、これらの変異体、及び、各々の野生型ω-TAsと比較して、改良された反応速度、改良された基質受容性及び改良された比活性を有する、更なるアミノ酸改変を含む更なる改変変異体を提供する。したがって、本発明の改変体およびさらなるアミノ酸改変を含む改変体は、それぞれの野生型ω-TAの使用によって達成できない、新しいアミノ化生成物またはそれぞれの生成物の前駆体の生産方法において、アミノ化生成物の経済的に効率的な生産プロセスの開発を可能にする。
本明細書に記載されているω-TA変異体またはさらなる改変変異体は、既知の野生型および他の既知のω-TAよりも有利である。特に、本明細書に記載されている改変型または変異型ω-TAは、それぞれの野生型ω-トランスアミナーゼでは産生できない、例えば分枝鎖または芳香族アミノ酸のような、エナンチオマー的に濃縮されたまたはエナンチオマー的にほぼ純粋または純粋な化合物を産生できるという利点を有する。本明細書中に記載されるω-TAのさらなる改変された変異体は、それらが、ホスホ-アミノ酸のエナンチオマー的に富化された、ほぼ純粋な、または純粋な化合物を生成し得るという利点を有する。
配列番号3の1~477位は、受託番号5G09_AのGenPept(PDB)由来のBacillus megaterium由来の野生型ω-トランスアミナーゼ(ω-TA)のアミノ酸配列を表す。
配列番号6の1~479位は、受託番号5G2P_AのGenPept(PDB)に由来するArthrobacter sp.由来の野生型ω-TAのアミノ酸配列を表す。
配列番号9の1~476位は、受託番号KRF52528.1のGenPept(PDB)に由来するBacillus sp.(土壌76801D1、由来の野生型ω-TAのアミノ酸配列を表す。
配列番号12の1~476位は、国際公開第2006/06336A2号の配列番号16から誘導できるArthrobacter sp.由来のω-TA変異体のアミノ酸配列を表す。
配列番号15の1~476位は、WO2006/06336A2の配列番号2から誘導できるArthrobacter sp.由来の野生型ω-TAのアミノ酸配列を表す。
本明細書中に記載されるのはω-TA活性を有するタンパク質であり、ここで、これらのタンパク質のアミノ酸配列は、ω-TA活性を有する既知のタンパク質の変異体を表す。特に、本明細書に記載されているω-TA活性を有するタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号3の1~477位までのアミノ酸で表される、および/または配列番号6の1~479位までのアミノ酸で表される、および/または配列番号9の1~476位までのアミノ酸で表される、および/または配列番号12の1~476位までのアミノ酸で表される、および/または配列番号15の1~476位までのアミノ酸で表される変異体であって、ここで、配列番号3、配列番号6、配列番号9、配列番号12および配列番号15のそれぞれにおけるアミノ酸配列において、少なくとも25、64、88、157、165、169、174、187、197、239、327、328、384、389、391、396、410および414位のアミノ酸は、配列番号3、配列番号6、配列番号9、配列番号12および配列番号15に示される配列のそれぞれのアミノ酸位置で与えられるアミノ酸とは異なる。
略称「ω-TA」が使用され、ここでは「ω-トランスアミナーゼ」を意味する。
本明細書中で使用される用語「変異体」とは、当該技術分野で知られている主題とは異なる主題を意味する。核酸分子およびタンパク質変異体に関しては、それぞれ、既知の配列から逸脱するが、同じ機能を有するタンパク質をコードするか、または同じ反応、例えばω-TA活性を有するタンパク質をコードする機能を有する核酸配列またはアミノ酸配列を含むと理解される。核酸分子配列およびアミノ酸配列が既知の核酸配列およびタンパク質配列から逸脱することは、その配列が、対応して既知の核酸配列またはアミノ酸配列と比較して、ヌクレオチドまたはアミノ酸の置換(置換)および/または欠失および/または挿入をそれぞれ含むことを意味する。
本発明の第1の実施形態はω-TA活性を有するタンパク質に関し、ここで、タンパク質は、以下よりなる群から選択される:
a) 25位のアミノ酸がFとは異なり、64位のアミノ酸がLとは異なり、88位のアミノ酸がTとは異なり、157位のアミノ酸がTとは異なり、165位のアミノ酸がRとは異なり、169位のアミノ酸がVとは異なり、174位のアミノ酸がEとは異なり、187位のアミノ酸がSとは異なり、197位のアミノ酸がMとは異なり、239位のアミノ酸がSとは異なり、327位のアミノ酸がSとは異なり、328位のアミノ酸がVとは異なり、384位のアミノ酸がYとは異なり、389位のアミノ酸がIとは異なり、391位のアミノ酸がDとは異なり、396位のアミノ酸がKとは異なり、410位のアミノ酸がHとは異なり、414位のアミノ酸がPとは異なる以外は、配列番号3に示す1~477位のアミノ酸配列を含むタンパク質;
b) 25位のアミノ酸がFとは異なり、64位のアミノ酸がLとは異なり、88位のアミノ酸がTとは異なり、157位のアミノ酸がTとは異なり、165位のアミノ酸がRとは異なり、169位のアミノ酸がVとは異なり、174位のアミノ酸がEとは異なり、187位のアミノ酸がSとは異なり、197位のアミノ酸がTとは異なり、239位のアミノ酸がSとは異なり、327位のアミノ酸がSとは異なり、328位のアミノ酸がVとは異なり、384位のアミノ酸がYとは異なり、389位のアミノ酸がIとは異なり、391位のアミノ酸がDとは異なり、396位のアミノ酸がKとは異なり、410位のアミノ酸がHとは異なり、414位のアミノ酸がPとは異なる以外は配列番号6に示す1~479位のアミノ酸配列を含むタンパク質;
c) 25位のアミノ酸がFとは異なり、64位のアミノ酸がLとは異なり、88位のアミノ酸がTとは異なり、157位のアミノ酸がTとは異なり、165位のアミノ酸がRとは異なり、169位のアミノ酸がVとは異なり、174位のアミノ酸がEとは異なり、187位のアミノ酸がSとは異なり、197位のアミノ酸がMとは異なり、239位のアミノ酸がSとは異なり、327位のアミノ酸がSとは異なり、328位のアミノ酸がVとは異なり、384位のアミノ酸がYとは異なり、389位のアミノ酸がIとは異なり、391位のアミノ酸がDとは異なり、396位のアミノ酸がKとは異なり、410位のアミノ酸がHとは異なり、414位のアミノ酸がPとは異なる以外は、配列番号9に示す1~476位のアミノ酸配列を含むタンパク質;
d) 25位のアミノ酸がFとは異なり、64位のアミノ酸がLとは異なり、88位のアミノ酸がTとは異なり、157位のアミノ酸がTとは異なり、165位のアミノ酸がRとは異なり、169位のアミノ酸がVとは異なり、174位のアミノ酸及び187位のアミノ酸がSとは異なり、Eとは異なり、197位のアミノ酸がTとは異なり、239位のアミノ酸がSとは異なり、327位のアミノ酸がSとは異なり、328位のアミノ酸がVとは異なり、384位のアミノ酸がYとは異なり、389位のアミノ酸がIとは異なり、391位のアミノ酸がDとは異なり、396位のアミノ酸がKとは異なり、410位のアミノ酸がHとは異なり、414位のアミノ酸がPとは異なる以外は配列番号12に示す1~476位のアミノ酸配列を含むタンパク質;
e) 25位のアミノ酸がFとは異なり、64位のアミノ酸がLとは異なり、88位のアミノ酸がTとは異なり、157位のアミノ酸がTとは異なり、165位のアミノ酸がRとは異なり、169位のアミノ酸がVとは異なり、174位のアミノ酸および187位のアミノ酸がSとは異なり、Eとは異なり、197位のアミノ酸がMとは異なり、239位のアミノ酸がSとは異なり327位のアミノ酸がSとは異なり、328位のアミノ酸がVとは異なり、384位のアミノ酸がYとは異なり、389位のアミノ酸がIとは異なり、391位のアミノ酸がDとは異なり、396位のアミノ酸がKとは異なり、410位のアミノ酸がHとは異なり、414位のアミノ酸がPとは異なる以外は配列番号15に示す1~476位のアミノ酸配列を含むタンパク質;
f) a)、b)、c)、d)、e)またはf)に示すいずれかのアミノ酸配列における、少なくとも60%、好ましくは70%、より好ましくは80%、さらにより好ましくは90%、よりさらに好ましくは95%、よりさらに特に好ましくは96%、特に好ましくは97%、最も好ましくは98%又は特定に好ましくは99%同一性のアミノ酸配列を有し、
各場合において、25位に対応するアミノ酸がFとは異なり、64位に対応するアミノ酸がLとは異なり、88位に対応するアミノ酸がTとは異なり、157位に対応するアミノ酸がTとは異なり、165位に対応するアミノ酸がRとは異なり、169位に対応するアミノ酸がVとは異なり、174位に対応するアミノ酸がEとは異なり、187位に対応するアミノ酸がSとは異なり、197位に対応するアミノ酸がTまたはMとは異なり、239位に対応するアミノ酸がSとは異なり、327位に対応するアミノ酸がSとは異なり、328位に対応するアミノ酸がVとは異なり、384位に対応するアミノ酸がYとは異なり、389位に対応するアミノ酸がIとは異なり、391位に対応するアミノ酸がDとは異なり、396位に対応するアミノ酸がKとは異なり、410位に対応するアミノ酸がHとは異なり、414位に対応するアミノ酸がPとは異なる、タンパク質。
各場合において、25位に対応するアミノ酸がFとは異なり、64位に対応するアミノ酸がLとは異なり、88位に対応するアミノ酸がTとは異なり、157位に対応するアミノ酸がTとは異なり、165位に対応するアミノ酸がRとは異なり、169位に対応するアミノ酸がVとは異なり、174位に対応するアミノ酸がEとは異なり、187位に対応するアミノ酸がSとは異なり、197位に対応するアミノ酸がTまたはMとは異なり、239位に対応するアミノ酸がSとは異なり、327位に対応するアミノ酸がSとは異なり、328位に対応するアミノ酸がVとは異なり、384位に対応するアミノ酸がYとは異なり、389位に対応するアミノ酸がIとは異なり、391位に対応するアミノ酸がDとは異なり、396位に対応するアミノ酸がKとは異なり、410位に対応するアミノ酸がHとは異なり、414位に対応するアミノ酸がPとは異なる、タンパク質。
アミノ酸略号A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Yの意味は、以下の表4の下の段落「配列の記述」の元に導かれる。
第1のアミノ酸配列(例えば、配列番号3の64位)の「x位に相当するアミノ酸」とは、第1のアミノ酸配列と比較した場合の第2のアミノ酸配列のアミノ酸が、第2のアミノ酸配列のアミノ酸番号が第1のアミノ酸配列のアミノ酸番号と異なる場合の第1のアミノ酸配列と第2のアミノ酸配列とのペアワイズ配列アラインメントにおいて、第1のアミノ酸配列の位置xに現れることを意味する。
本発明の文脈において、配列同一性または配列が同一であるという用語「同一性」は、第1の核酸またはアミノ酸配列が、別の(第2の)核酸またはアミノ酸配列とそれぞれ配列長全体にわたって共有する同一のアミノ酸またはヌクレオチドの数をパーセントで表したものを意味すると理解される。
「配列同一性」は、例えばGAPまたはBESTFITまたはEmbossプログラム「Needle」のような公知のソフトウェアで構成される全体的または局所的アラインメントアルゴリズムを用いて、2つのアミノ酸または2つのヌクレオチド配列のアラインメントによって決定することができる。これらのソフトウェアは、NeedlemanおよびWunschのグローバルアラインメントアルゴリズムを用いて、2つのシークエンスを全長にわたってアラインメントし、マッチ数を最大化し、ギャップ数を最小化する。一般に、デフォルトのパラメータが用いられ、ギャップ生成ペナルティ=10、ギャップ伸長ペナルティ=0.5(ヌクレオチドおよびタンパク質のアラインメントともに)である。ヌクレオチドの場合、使用するデフォルトスコアリングマトリクスは、DNAFULLであり、タンパク質の場合、デフォルトスコアリングマトリクスは、Blosum62である(Henikoff&Henikoff,1992,PNAS 89,10915-10919)。シークエンスアラインメントとパーセンテージシークエンス同一性のスコアは、例えば、EBIの世界中のウェブサイト(ebi.ac.uk/Tools/emboss/)でアクセス可能なEMBOSSなどのソフトウェアを用いて決定することができる。あるいは、一般的に知られているアルゴリズムやFASTA、BLASTのような出力フォーマットを用いてデータベース(EMBL、GenBankなど)に対して検索することでシークエンスの類似性や同一性を判定することができるが、好ましくは、ヒットを取得し、ペアワイズにアラインメントして、シークエンスの同一性を最終的に判定することができる。
好ましくは、ω-TA活性を有するタンパク質に関する同一性は、配列番号18の下で与えられたアミノ酸配列との比較によって決定され、ω-TA活性を有するタンパク質をコードする核酸分子に関する同一性は、配列番号16または17の下で与えられた核酸配列を、コンピュータプログラムの助けを借りて、それぞれ他のタンパク質または核酸分子と比較することによって決定される。互いに比較する配列が異なる長さの場合、同一性は、より短い配列がより長い配列と共有するアミノ酸またはヌクレオチドの数のそれぞれのパーセントにおける同一性を決定することによって決定される。好ましくは、同一性は、公知で公的に利用可能なコンピュータプログラムClustalW(Thompsonら、Nucleic Acids Research 22(1994)、4673-4680)を用いて決定される。ClustalWは、Julie Thompson(Thompson@EMBL-Heidelberg.DE)およびToby(Gibson@EMBL-Heidelberg.DE)、European Bioinformatics Institute、Meyerhofstrasse 1,D 69117 ハイデルベルク、ドイツ、により公表されている。ClustalWは、特にIGBMC(Institut de Genetique et de Biologie Moleculaire et Cellulaire,B.P.163,67404 Illkirch Cedex, France;ftp://ftp-igbmc.u-strasbg.fr/pub/)およびEBI(European Bioinformatics Institute,Wellcome Trust Genome Campus,Hinxton,Cambridge CB10 1SD,UK)のすべてのミラーリングインターネットページの、様々なインターネットページからダウンロードできる。
好ましくは、バージョン1.8のClustalWコンピュータプログラムを使用して、本発明の文脈で記述されるタンパク質と他のタンパク質との同一性を決定する。ここでパラメータは、以下のように設定しなければならない:KTUPLE=1、TOPDIAG=5、WINDOW=5、PAIRGAP=3、GAPOPEN=10、GAPEXTEND=0.05、GAPDIST=8、MAXDIV=40、MATRIX=GONNET、ENDGAPS(オフ)、NOPGAP、NOHGAP。
好ましくは、バージョン1.8のClustalWコンピュータプログラムを用いて、本発明に関連して記載された核酸分子のヌクレオチド配列と他の核酸分子のヌクレオチド配列との同一性を測定する。ここでは、以下のようにパラメータを設定する必要がある:
KTUPLE=2、TOPDIAGS=4、PAIRGAP=5、DNAMATRIX:IUB、GAPOPEN=10、GAPEXT=5、MAXDIV=40、TRANSITIONs:非加重。
KTUPLE=2、TOPDIAGS=4、PAIRGAP=5、DNAMATRIX:IUB、GAPOPEN=10、GAPEXT=5、MAXDIV=40、TRANSITIONs:非加重。
さらに、同一性は、問題の核酸分子またはそれらによってコードされるタンパク質間に機能的および/または構造的等価性が存在することを意味する。機能的等価性とは、核酸分子配列またはアミノ酸配列がω-TA活性を有するタンパク質をコードすることを意味する。上記の分子と相同であり、かつこれらの分子の誘導体を表す核酸分子は、一般的に、これらの分子の改変体であり、これは、同じ生物学的機能を有するかまたは同じ反応を触媒する、すなわちω-TA活性を有するタンパク質をコードする。これらは、天然に存在する変異体、例えば他の種由来の配列、または突然変異のいずれかであってもよく、これらの変異が天然の様式で生じていてもよく、または標的突然変異誘発によって導入されたものであってもよい。さらに、変異体は、合成的に製造される配列であってもよい。対立遺伝子変異体は、自然発生の変異体、または合成的に製造された変異体、または組換えDNA技術により生成された変異体のいずれかであり得る。しかしながら、本発明に関しては、これらの変異体は、ω-TA活性を有するタンパク質をコードし、本発明に係るタンパク質に関して本明細書に記載されるアミノ酸置換(置換)、欠失または挿入を含むことが決定的である。
特殊なタイプの誘導体は、例えば、遺伝コードの縮重の結果として本発明に記載されている核酸分子とは異なる核酸分子である。
NC-IUBMB(International Union of Biochemistry and Molecular Biology)によると、トランスアミナーゼ(TAs)は、トランスフェラーゼ(EC2)のクラスに属する。トランスフェラーゼは、ある化合物(一般に供与体とみなされる)から別の化合物(一般に受容体とみなされる)に、基、例えばメチル基またはグリコシル基を転移する酵素である。トランスフェラーゼのグループは、窒素性基を転移する酵素(EC2.6)を含む。TAsによって触媒される反応は、一般式(I)に従ってカルボニル基を含む化合物に-NH2基と-Hを転移させることによって、カルボニル受容体の還元的アミノ化と併せて、(アミン)供与体の酸化的脱アミノ化を伴う酸化還元反応と正式にみなすことができる。
TAsでも触媒される逆反応は、一般式(Ia)に従って正式に記述できる。
TAsは、ピリドキサール5'-リン酸(PLP)依存酵素である。TA触媒反応に特有の特徴は、アミノ基の転移(共有結合性の基質-補酵素中間体を含む十分に確立された機構による)であり、トランスフェラーゼの中から特定のサブクラス、指定されたトランスアミナーゼまたはアミノトランスフェラーゼ(EC2.6.1)へのこれらの酵素の割り当てを正当化する。
TAsは、α-TAsおよびω-TAsとして当該技術分野でさらに一般的に分類される。この命名法は、それぞれのTAsが転移するアミノ酸のアミノ酸基の相対的な位置に基づいている。アミンカルボン酸に関して、α-TAsはα-炭素のみのアミノ基のアミノ基転移を触媒し、ここでω-TAsは、非α-アミンにも作用し、それぞれの基質の遠位アミノ基を転移する。(Shinら、2003,Appl Microbiol Biotechnol 61,463-471)。しかしながら、いくつかのω-TAsが、カルボキシル基を持たない(第一級)アミン化合物のアミノ基転移を触媒することができることは、当該技術分野において公知である(Rudatら、2012、AMB Express 2(11);Shinら、2003、Appl Microbiol Biotechnol 61、463-471)。
あるタンパク質がTA活性を有する場合、特にω-TAsは、当該技術分野で既知かつ記述されている方法で検出することができる。CuSO4/MeOHによるα-アミノ酸の青染色に基づくタンパク質のω-TA活性を検出するアッセイは、Hwang&Kim(2004,Enzyme and Microbiol Technology 34(5),429-436)により開発された。Truppoら(2009,Org.Biomol.Chem.7,395-398)は、多酵素カスケードpH-指示薬アッセイに基づくω-TAsの高スループットスクリーニングのためのアッセイについて記載しており、さらに従来のHPLC分析アッセイを開示している。
本発明によるタンパク質がω-TA活性を有するか否かを検出するためにどの方法を用いるかは決定的ではない。好ましくは、本発明に関連して、「一般的方法」の下に記載される方法項目4が、本発明によるタンパク質がω-TA活性を有するかどうかを検出するために使用され、特に、この方法は、本発明によるω-TA変異体がω-TA活性を有するかどうかを検出するために使用される。
さらなるアミノ酸改変を含むω-TA変異体、好ましくは「一般的方法」に記載される方法項目7は、本発明によるタンパク質がω-TA活性を有するか否かを検出するために使用される。
本発明の好ましい実施態様において、本発明によるタンパク質は(S)-選択的ω-TAである。
用語「(S)-選択的」とは、本発明に関連して、一般式(I)による(アミン)受容体の還元的アミノ化により、(R)-エナンチオマーよりもエナンチオマー過剰で(S)-エナンチオマーを生成することを意味する。
(S)-選択的ω-TAsによって触媒される反応は、一般式(II)に従って正式に記述できる。
本発明によるω-TA変異体タンパク質は、配列番号3、6、9、12または15に示されるアミノ酸配列に関して、本明細書中に上記されたアミノ酸配列と比較して、さらなるアミノ酸改変(アミノ酸置換、欠失または挿入)を示し得る。
上述の項目a)またはc)のω-TA変異体に加えて、配列番号3の1~477位までのアミノ酸配列、または配列番号9の1~477位までのアミノ酸配列は、それぞれ、2位および/または48位および/または164位および/または242位および/または245位および/または311位および/または353位および/または424位に追加のアミノ酸置換を有することができ、
および/または、
配列番号3に示されるアミノ酸配列は、202位および/または205位および/または359位および/または475位および/または476位に追加のアミノ酸置換、および/または、477位にアミノ酸の欠失を有することができ、および/または、配列番号9に示されるアミノ酸配列は、69位および/または90位および/または268位および/または318位および/または322位および/または452位に追加のアミノ酸置換を有することができる。
および/または、
配列番号3に示されるアミノ酸配列は、202位および/または205位および/または359位および/または475位および/または476位に追加のアミノ酸置換、および/または、477位にアミノ酸の欠失を有することができ、および/または、配列番号9に示されるアミノ酸配列は、69位および/または90位および/または268位および/または318位および/または322位および/または452位に追加のアミノ酸置換を有することができる。
上記項目b)およびd)に記載のω-TA変異体に加えて、配列番号6の1~479位までに示されるアミノ酸配列、または配列番号12の1~476位までに示されるアミノ酸配列は、それぞれ、46位および/または60位および/または185位および/または186位および/または195位および/または205位および/または252位および/または268位および/または409位および/または436位に追加のアミノ酸置換、および/または、配列番号6に示されるアミノ酸配列において、477位および/または478位および/または479位のアミノ酸を欠失させることができる。
上記項目e)のω-TA変異体に加えて、配列番号15の1~476位までに示されるアミノ酸配列は、48位および/または164位および/または242位および/または245位および/または255位および/または424位に追加のアミノ酸置換を有することができる。
したがって、本発明のさらなる実施形態は、さらなるアミノ酸改変を含む本発明のタンパク質に関するものであり、好ましくは、それらの実施形態はω-TA活性を有するタンパク質であり、ここでタンパク質は、以下よりなる群から選択され:
a) 25位のアミノ酸がFと異なり、64位のアミノ酸がLと異なり、88位のアミノ酸がTと異なり、157位のアミノ酸がTと異なり、165位のアミノ酸がRと異なり、169位のアミノ酸がVと異なり、174位のアミノ酸がEと異なり、187位のアミノ酸がSと異なり、197位のアミノ酸がMと異なり、239位のアミノ酸がSと異なり、327位のアミノ酸がSと異なり、328位のアミノ酸がVと異なり、384位のアミノ酸がYと異なり、389位のアミノ酸がIと異なり、391位のアミノ酸がDと異なり、396位のアミノ酸がKと異なり、410位のアミノ酸はHと異なり、414位のアミノ酸はPと異なり、2位のアミノ酸はSと異なり、48位のアミノ酸はDと異なり、164位のアミノ酸はYと異なり、202位のアミノ酸はDと異なり、205位のアミノ酸はLと異なり、242位のアミノ酸はAと異なり、245位のアミノ酸はAと異なり、311位のアミノ酸はLと異なり、353位のアミノ酸はFと異なり、359位のアミノ酸はDと異なり、424位のアミノ酸はKと異なり、475位のアミノ酸はAと異なり、476位のアミノ酸はLと異なり、477位のアミノ酸は欠失している以外は、配列番号3に示す1~477位のアミノ酸配列を含むタンパク質;
a) 25位のアミノ酸がFと異なり、64位のアミノ酸がLと異なり、88位のアミノ酸がTと異なり、157位のアミノ酸がTと異なり、165位のアミノ酸がRと異なり、169位のアミノ酸がVと異なり、174位のアミノ酸がEと異なり、187位のアミノ酸がSと異なり、197位のアミノ酸がMと異なり、239位のアミノ酸がSと異なり、327位のアミノ酸がSと異なり、328位のアミノ酸がVと異なり、384位のアミノ酸がYと異なり、389位のアミノ酸がIと異なり、391位のアミノ酸がDと異なり、396位のアミノ酸がKと異なり、410位のアミノ酸はHと異なり、414位のアミノ酸はPと異なり、2位のアミノ酸はSと異なり、48位のアミノ酸はDと異なり、164位のアミノ酸はYと異なり、202位のアミノ酸はDと異なり、205位のアミノ酸はLと異なり、242位のアミノ酸はAと異なり、245位のアミノ酸はAと異なり、311位のアミノ酸はLと異なり、353位のアミノ酸はFと異なり、359位のアミノ酸はDと異なり、424位のアミノ酸はKと異なり、475位のアミノ酸はAと異なり、476位のアミノ酸はLと異なり、477位のアミノ酸は欠失している以外は、配列番号3に示す1~477位のアミノ酸配列を含むタンパク質;
b) 25位のアミノ酸がFと異なり、64位のアミノ酸がLと異なり、88位のアミノ酸がTと異なり、157位のアミノ酸がTと異なり、165位のアミノ酸がRと異なり、169位のアミノ酸がVと異なり、174位のアミノ酸がEと異なり、187位のアミノ酸がSと異なり、197位のアミノ酸がTと異なり、239位のアミノ酸がSと異なり、327位のアミノ酸がSと異なり、328位のアミノ酸がVと異なり、384位のアミノ酸がYと異なり、389位のアミノ酸がIと異なり、391位のアミノ酸がDと異なり、396位のアミノ酸がKと異なり、410位のアミノ酸はHと異なり、414位のアミノ酸はPと異なり、46位のアミノ酸はTと異なり、60位のアミノ酸はCと異なり、185位のアミノ酸はCと異なり、186位のアミノ酸はSと異なり、195位のアミノ酸はSと異なり、205位のアミノ酸はYと異なり、252位のアミノ酸はVと異なり、268位のアミノ酸はSと異なり、409位のアミノ酸はRと異なり、436位のアミノ酸はAと異なり、477位、478位、479位のアミノ酸は欠失している以外は、配列番号6に示す1~479位のアミノ酸配列を含むタンパク質;
c)25位のアミノ酸がFと異なり、64位のアミノ酸がLと異なり、88位のアミノ酸がTと異なり、157位のアミノ酸がTと異なり、165位のアミノ酸がRと異なり、169位のアミノ酸がVと異なり、174位のアミノ酸がEと異なり、187位のアミノ酸がSと異なり、197位のアミノ酸がMと異なり、239位のアミノ酸がSと異なり、327位のアミノ酸がSと異なり、328位のアミノ酸がVと異なり、384位のアミノ酸がYと異なり、389位のアミノ酸がIと異なり、391位のアミノ酸がDと異なり、396位のアミノ酸がKと異なり、410位のアミノ酸はHと異なり、414位のアミノ酸はPと異なり、2位のアミノ酸はSと異なり、48位のアミノ酸はDと異なり、69位のアミノ酸はPと異なり、90位のアミノ酸はSと異なり、164位のアミノ酸はYと異なり、242位のアミノ酸はAと異なり、245位のアミノ酸はAと異なり、268位のアミノ酸はTと異なり、311位のアミノ酸はLと異なり、318位のアミノ酸はEと異なり、322位のアミノ酸はRと異なり、353位のアミノ酸はSと異なり、424位のアミノ酸はKと異なり、452位のアミノ酸はEと異なる以外は、配列番号9に示す1~476位のアミノ酸配列を含むタンパク質;
d) 25位のアミノ酸がFと異なり、64位のアミノ酸がLと異なり、88位のアミノ酸がTと異なり、157位のアミノ酸がTと異なり、165位のアミノ酸がRと異なり、169位のアミノ酸がVと異なり、174位のアミノ酸がEと異なり、187位のアミノ酸がSと異なり、197位のアミノ酸がTと異なり、239位のアミノ酸がSと異なり、327位のアミノ酸がSと異なり、328位のアミノ酸がVと異なり、384位のアミノ酸がYと異なり、389位のアミノ酸がIと異なり、391位のアミノ酸がDと異なり、396位のアミノ酸がKと異なり、410位のアミノ酸はHと異なり、414位のアミノ酸はPと異なり、46位のアミノ酸はTと異なり、60位のアミノ酸はCと異なり、185位のアミノ酸はCと異なり、186位のアミノ酸はCと異なり、195位のアミノ酸はSと異なり、205位のアミノ酸はYと異なり、252位のアミノ酸はVと異なり、268位のアミノ酸はSと異なり、409位のアミノ酸はRと異なり、436位のアミノ酸はAと異なる以外は、配列番号12に示す1~476位のアミノ酸配列を含むタンパク質;
e) 25位のアミノ酸がFと異なり、64位のアミノ酸がLと異なり、88位のアミノ酸がTと異なり、157位のアミノ酸がTと異なり、165位のアミノ酸がRと異なり、169位のアミノ酸がVと異なり、174位のアミノ酸がEと異なり、187位のアミノ酸がSと異なり、197位のアミノ酸がMと異なり、239位のアミノ酸がSと異なり、327位のアミノ酸がSと異なり、328位のアミノ酸がVと異なり、384位のアミノ酸がYと異なり、389位のアミノ酸がIと異なり、391位のアミノ酸がDと異なり、396位のアミノ酸がKと異なり、410位のアミノ酸がHと異なり、414位のアミノ酸がPと異なり、48位のアミノ酸がDと異なり、164位のアミノ酸がYと異なり、242位のアミノ酸がAと異なり、245位のアミノ酸がAと異なり、255位のアミノ酸がFと異なり、424位のアミノ酸がKと異なる以外は、配列番号15に示す1~476位のアミノ酸配列を含むタンパク質;
f) a)(配列番号3に示す1~477位のアミノ酸配列)における、少なくとも60%、好ましくは70%、より好ましくは80%、さらにより好ましくは90%、よりさらに好ましくは95%、よりさらに特に好ましくは96%、特に好ましくは97%、最も好ましくは98%又は特定に好ましくは99%同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質であって、
25位に相当するアミノ酸がFとは異なり、64位に相当するアミノ酸がLと異なり、88位に相当するアミノ酸がTとは異なり、157位に相当するアミノ酸がRとは異なり、165位に相当するアミノ酸がRと異なり、169位に相当するアミノ酸がVと異なり、174位に相当するアミノ酸がEとは異なり、187位に相当するアミノ酸がSと異なり、197位のアミノ酸がMと異なり、239位に相当するアミノ酸がMと異なり、327位に対応するアミノ酸がSと異なり、328位に対応するアミノ酸はVと異なり、384位に対応するアミノ酸がYと異なり、389位に対応するアミノ酸がIと異なり、391位に対応するアミノ酸がDと異なり、396位に対応するアミノ酸がKと異なり、410位に対応するアミノ酸がHと異なり、414位に対応するアミノ酸がPと異なり、2位に対応するアミノ酸がSと異なり、48位に対応するアミノ酸がDと異なり、164位に対応するアミノ酸がYと異なり、202位に対応するアミノ酸がDと異なり、205位に対応するアミノ酸がLと異なり、242位に対応するアミノ酸がAと異なり、245位に対応するアミノ酸がAと異なり、311位に対応するアミノ酸がLと異なり、353位に対応するアミノ酸がFと異なり、359位に対応するアミノ酸がDと異なり、424位に対応するアミノ酸がKと異なり、475位に対応するアミノ酸がAと異なり、476位に対応するアミノ酸がLと異なり、477位に対応するアミノ酸が欠失している、タンパク質;
25位に相当するアミノ酸がFとは異なり、64位に相当するアミノ酸がLと異なり、88位に相当するアミノ酸がTとは異なり、157位に相当するアミノ酸がRとは異なり、165位に相当するアミノ酸がRと異なり、169位に相当するアミノ酸がVと異なり、174位に相当するアミノ酸がEとは異なり、187位に相当するアミノ酸がSと異なり、197位のアミノ酸がMと異なり、239位に相当するアミノ酸がMと異なり、327位に対応するアミノ酸がSと異なり、328位に対応するアミノ酸はVと異なり、384位に対応するアミノ酸がYと異なり、389位に対応するアミノ酸がIと異なり、391位に対応するアミノ酸がDと異なり、396位に対応するアミノ酸がKと異なり、410位に対応するアミノ酸がHと異なり、414位に対応するアミノ酸がPと異なり、2位に対応するアミノ酸がSと異なり、48位に対応するアミノ酸がDと異なり、164位に対応するアミノ酸がYと異なり、202位に対応するアミノ酸がDと異なり、205位に対応するアミノ酸がLと異なり、242位に対応するアミノ酸がAと異なり、245位に対応するアミノ酸がAと異なり、311位に対応するアミノ酸がLと異なり、353位に対応するアミノ酸がFと異なり、359位に対応するアミノ酸がDと異なり、424位に対応するアミノ酸がKと異なり、475位に対応するアミノ酸がAと異なり、476位に対応するアミノ酸がLと異なり、477位に対応するアミノ酸が欠失している、タンパク質;
g) b)(配列番号6に示す1~476位のアミノ酸配列)における、少なくとも60%、好ましくは70%、より好ましくは80%、さらにより好ましくは90%、よりさらに好ましくは95%、よりさらに特に好ましくは96%、特に好ましくは97%、最も好ましくは98%又は特定に好ましくは99%同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質であって、
25位に相当するアミノ酸はFと異なり、64位に相当するアミノ酸はLと異なり、88位に相当するアミノ酸はTと異なり、157位に相当するアミノ酸はTと異なり、165位に相当するアミノ酸はRと異なり、169位に相当するアミノ酸はVと異なり、174位に相当するアミノ酸はEと異なり、187位に相当するアミノ酸はSと異なり、197位のアミノ酸はTと異なり、239位に相当するアミノ酸はSと異なり、327位に対応するアミノ酸はSと異なり、328位に対応するアミノ酸はVと異なり、384位に対応するアミノ酸はYと異なり、389位に対応するアミノ酸はIと異なり、391位に対応するアミノ酸はDと異なり、396位に対応するアミノ酸はKと異なり、410位に対応するアミノ酸はHと異なり、414位に対応するアミノ酸はPと異なり、46位に対応するアミノ酸はTと異なり、60位に対応するアミノ酸はCと異なり、185位に対応するアミノ酸はCと異なり、186位に対応するアミノ酸はSと異なり、195位に対応するアミノ酸はSと異なり、205位に対応するアミノ酸はYと異なり、252位に対応するアミノ酸はVと異なり、268位に対応するアミノ酸はSと異なり、409位に対応するアミノ酸はSと異なり、436位に対応するアミノ酸はAと異なり、477位および478位および479位に対応するアミノ酸が欠失している、タンパク質;
25位に相当するアミノ酸はFと異なり、64位に相当するアミノ酸はLと異なり、88位に相当するアミノ酸はTと異なり、157位に相当するアミノ酸はTと異なり、165位に相当するアミノ酸はRと異なり、169位に相当するアミノ酸はVと異なり、174位に相当するアミノ酸はEと異なり、187位に相当するアミノ酸はSと異なり、197位のアミノ酸はTと異なり、239位に相当するアミノ酸はSと異なり、327位に対応するアミノ酸はSと異なり、328位に対応するアミノ酸はVと異なり、384位に対応するアミノ酸はYと異なり、389位に対応するアミノ酸はIと異なり、391位に対応するアミノ酸はDと異なり、396位に対応するアミノ酸はKと異なり、410位に対応するアミノ酸はHと異なり、414位に対応するアミノ酸はPと異なり、46位に対応するアミノ酸はTと異なり、60位に対応するアミノ酸はCと異なり、185位に対応するアミノ酸はCと異なり、186位に対応するアミノ酸はSと異なり、195位に対応するアミノ酸はSと異なり、205位に対応するアミノ酸はYと異なり、252位に対応するアミノ酸はVと異なり、268位に対応するアミノ酸はSと異なり、409位に対応するアミノ酸はSと異なり、436位に対応するアミノ酸はAと異なり、477位および478位および479位に対応するアミノ酸が欠失している、タンパク質;
h) c)(配列番号9に示す1~479位のアミノ酸配列)における、少なくとも60%、好ましくは70%、より好ましくは80%、さらにより好ましくは90%、よりさらに好ましくは95%、よりさらに特に好ましくは96%、特に好ましくは97%、最も好ましくは98%又は特定に好ましくは99%の
同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質であって、
25に対応するアミノ酸はFと異なり、64位に対応するアミノ酸はLと異なり、88位に対応するアミノ酸はTと異なり、157位に対応するアミノ酸はTと異なり、165位に対応するアミノ酸はRと異なり、169位に対応するアミノ酸はVと異なり、174位に対応するアミノ酸はEと異なり、187位に対応するアミノ酸はSと異なり、197位のアミノ酸はMと異なり、239位に対応するアミノ酸はSと異なり、327位に対応するアミノ酸はSと異なり、328位に対応するアミノ酸はVと異なり、384位に対応するアミノ酸はYと異なり、389位に対応するアミノ酸はIと異なり、391位に対応するアミノ酸はDと異なり、396位に対応するアミノ酸はKと異なり、410位に対応するアミノ酸はHと異なり、414位に対応するアミノ酸はPと異なり、2位に対応するアミノ酸はSと異なり、48位に対応するアミノ酸はDと異なり、69位に対応するアミノ酸はPと異なり、90位に対応するアミノ酸はSと異なり、164位に対応するアミノ酸はYと異なり、242位に対応するアミノ酸はAと異なり、245位に対応するアミノ酸はAと異なり、268位に対応するアミノ酸はTと異なり、311位に対応するアミノ酸はLと異なり、318位に対応するアミノ酸はEと異なり、322位に対応するアミノ酸はRと異なり、353位に対応するアミノ酸はSと異なり、424位に対応するアミノ酸はKと異なり、452位に対応するアミノ酸はEと異なる、タンパク質;
同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質であって、
25に対応するアミノ酸はFと異なり、64位に対応するアミノ酸はLと異なり、88位に対応するアミノ酸はTと異なり、157位に対応するアミノ酸はTと異なり、165位に対応するアミノ酸はRと異なり、169位に対応するアミノ酸はVと異なり、174位に対応するアミノ酸はEと異なり、187位に対応するアミノ酸はSと異なり、197位のアミノ酸はMと異なり、239位に対応するアミノ酸はSと異なり、327位に対応するアミノ酸はSと異なり、328位に対応するアミノ酸はVと異なり、384位に対応するアミノ酸はYと異なり、389位に対応するアミノ酸はIと異なり、391位に対応するアミノ酸はDと異なり、396位に対応するアミノ酸はKと異なり、410位に対応するアミノ酸はHと異なり、414位に対応するアミノ酸はPと異なり、2位に対応するアミノ酸はSと異なり、48位に対応するアミノ酸はDと異なり、69位に対応するアミノ酸はPと異なり、90位に対応するアミノ酸はSと異なり、164位に対応するアミノ酸はYと異なり、242位に対応するアミノ酸はAと異なり、245位に対応するアミノ酸はAと異なり、268位に対応するアミノ酸はTと異なり、311位に対応するアミノ酸はLと異なり、318位に対応するアミノ酸はEと異なり、322位に対応するアミノ酸はRと異なり、353位に対応するアミノ酸はSと異なり、424位に対応するアミノ酸はKと異なり、452位に対応するアミノ酸はEと異なる、タンパク質;
i) d)(配列番号12に示す1~476位のアミノ酸配列)における、少なくとも60%、好ましくは70%、より好ましくは80%、さらにより好ましくは90%、よりさらに好ましくは95%、よりさらに特に好ましくは96%、特に好ましくは97%、最も好ましくは98%又は特定に好ましくは99%同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質であって、
25位に対応するアミノ酸はFと異なり、64位に対応するアミノ酸はLと異なり、88位に対応するアミノ酸はTと異なり、157位に対応するアミノ酸はTと異なり、165位に対応するアミノ酸はRと異なり、169位に対応するアミノ酸はVと異なり、174位に対応するアミノ酸はEと異なり、187位に対応するアミノ酸はSと異なり、197位のアミノ酸はTと異なり、239位に対応するアミノ酸はSと異なり、327位に対応するアミノ酸はSと異なり、328位に対応するアミノ酸はVと異なり、384位に対応するアミノ酸はYと異なり、389位に対応するアミノ酸はIと異なり、391位に対応するアミノ酸はDと異なり、396位に対応するアミノ酸はKと異なり、410位に対応するアミノ酸はHと異なり、414位に対応するアミノ酸はPと異なり、46位に対応するアミノ酸はTと異なり、60位に対応するアミノ酸はCと異なり、185位に対応するアミノ酸はCと異なり、186位に対応するアミノ酸はCと異なり、195位に対応するアミノ酸はSと異なり、205位に対応するアミノ酸はYと異なり、252位に対応するアミノ酸はVと異なり、268位に対応するアミノ酸はSと異なり、409位に対応するアミノ酸はRと異なり、436位に対応するアミノ酸はAと異なる、タンパク質;
25位に対応するアミノ酸はFと異なり、64位に対応するアミノ酸はLと異なり、88位に対応するアミノ酸はTと異なり、157位に対応するアミノ酸はTと異なり、165位に対応するアミノ酸はRと異なり、169位に対応するアミノ酸はVと異なり、174位に対応するアミノ酸はEと異なり、187位に対応するアミノ酸はSと異なり、197位のアミノ酸はTと異なり、239位に対応するアミノ酸はSと異なり、327位に対応するアミノ酸はSと異なり、328位に対応するアミノ酸はVと異なり、384位に対応するアミノ酸はYと異なり、389位に対応するアミノ酸はIと異なり、391位に対応するアミノ酸はDと異なり、396位に対応するアミノ酸はKと異なり、410位に対応するアミノ酸はHと異なり、414位に対応するアミノ酸はPと異なり、46位に対応するアミノ酸はTと異なり、60位に対応するアミノ酸はCと異なり、185位に対応するアミノ酸はCと異なり、186位に対応するアミノ酸はCと異なり、195位に対応するアミノ酸はSと異なり、205位に対応するアミノ酸はYと異なり、252位に対応するアミノ酸はVと異なり、268位に対応するアミノ酸はSと異なり、409位に対応するアミノ酸はRと異なり、436位に対応するアミノ酸はAと異なる、タンパク質;
j) e)(配列番号15に示す1~476位のアミノ酸配列)における、少なくとも60%、好ましくは70%、より好ましくは80%、さらにより好ましくは90%、よりさらに好ましくは95%、よりさらに特に好ましくは96%、特に好ましくは97%、最も好ましくは98%又は特定に好ましくは99%同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質であって、
25に対応するアミノ酸はFと異なり、64に対応するアミノ酸はLと異なり、88に対応するアミノ酸はTと異なり、157位に対応するアミノ酸はTと異なり、165位に対応するアミノ酸はRと異なり、169位に対応するアミノ酸はVと異なり、174位に対応するアミノ酸はEと異なり、187位のアミノ酸はSと異なり、197位のアミノ酸はMと異なり、239位に対応するアミノ酸はSと異なり、327位に対応するアミノ酸はSと異なり、328位に対応するアミノ酸はVと異なり、384位に対応するアミノ酸はYと異なり、389位に対応するアミノ酸はIと異なり、391位に対応するアミノ酸はDと異なり、396位に対応するアミノ酸はKと異なり、410位に対応するアミノ酸はHと異なり、414位に対応するアミノ酸はPと異なり、48位のアミノ酸はDと異なり、164位のアミノ酸はYと異なり、242位のアミノ酸はAと異なり、245位のアミノ酸はAと異なり、255位のアミノ酸はFと異なり、424位のアミノ酸はKと異なる、タンパク質。
25に対応するアミノ酸はFと異なり、64に対応するアミノ酸はLと異なり、88に対応するアミノ酸はTと異なり、157位に対応するアミノ酸はTと異なり、165位に対応するアミノ酸はRと異なり、169位に対応するアミノ酸はVと異なり、174位に対応するアミノ酸はEと異なり、187位のアミノ酸はSと異なり、197位のアミノ酸はMと異なり、239位に対応するアミノ酸はSと異なり、327位に対応するアミノ酸はSと異なり、328位に対応するアミノ酸はVと異なり、384位に対応するアミノ酸はYと異なり、389位に対応するアミノ酸はIと異なり、391位に対応するアミノ酸はDと異なり、396位に対応するアミノ酸はKと異なり、410位に対応するアミノ酸はHと異なり、414位に対応するアミノ酸はPと異なり、48位のアミノ酸はDと異なり、164位のアミノ酸はYと異なり、242位のアミノ酸はAと異なり、245位のアミノ酸はAと異なり、255位のアミノ酸はFと異なり、424位のアミノ酸はKと異なる、タンパク質。
配列番号18の1~476位は、配列番号3(1~477位)、配列番号6(1~479位)、配列番号9(1~476位)、配列番号12(1~476位)および配列番号15(1~476位)の各アミノ酸配列と比較して、上記のすべてのアミノ酸変異体を含むω-TA変異体タンパク質のアミノ酸配列を表す。
表1は、野生型ω-TAの各アミノ酸配列(配列番号3の1~477位または配列番号6の1~479位または配列番号9の1~476位または配列番号15の1~476位)と比較して、ならびにArthrobacter sp.由来の修飾ω-TA(配列番号12の1~476位)と比較して、本発明(配列番号18の1~476位)のω-TA変異タンパク質のアミノ酸配列に存在する修飾に存在する修飾を、要約する。
表1の「末端」は、それぞれ既知(野生型)配列のアミノ酸配列中に存在する最後のアミノ酸の後の位置を示す。
従って、本発明の好ましい実施形態は、以下からなる群から選択されるω-TA活性を有する本発明に係るタンパク質に関する:
a) 配列番号18に示される1~476位までのアミノ酸配列を含むタンパク質;
b) 配列番号18に示される1~476位のアミノ酸配列と少なくとも60%、好ましくは70%、より好ましくは80%、さらにより好ましくは90%、よりさらに好ましくは95%、よりさらに特に好ましくは96%、特に好ましくは97%、最も好ましくは98%又は特定に好ましくは99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であり、但し、配列番号18における25、64、88、157、165、169、174、187、197、239、327、328、384、389、391、396、410および414位に対応するアミノ酸が、配列番号18に示されるアミノ酸配列のそれぞれの位置に示されるアミノ酸を表す;
c) 配列番号18に示される1~476位のアミノ酸配列と少なくとも60%、好ましくは70%、より好ましくは80%、さらにより好ましくは90%、よりさらに好ましくは95%、よりさらに特に好ましくは96%、特に好ましくは97%、最も好ましくは98%又は特定に好ましくは99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であり、但し、配列番号18における2、25、46、48、60、64、69、88、90、157、164、165、169、174、185、186、187、195、197、202、205、239、242、245、252、255、268、311、318、322、327、328、353、359、384、389、391、396、409、410、414、424、436、452、475および476位に対応するアミノ酸が、配列番号18に示されるアミノ酸配列のそれぞれの位置に示されるアミノ酸を表す。
a) 配列番号18に示される1~476位までのアミノ酸配列を含むタンパク質;
b) 配列番号18に示される1~476位のアミノ酸配列と少なくとも60%、好ましくは70%、より好ましくは80%、さらにより好ましくは90%、よりさらに好ましくは95%、よりさらに特に好ましくは96%、特に好ましくは97%、最も好ましくは98%又は特定に好ましくは99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であり、但し、配列番号18における25、64、88、157、165、169、174、187、197、239、327、328、384、389、391、396、410および414位に対応するアミノ酸が、配列番号18に示されるアミノ酸配列のそれぞれの位置に示されるアミノ酸を表す;
c) 配列番号18に示される1~476位のアミノ酸配列と少なくとも60%、好ましくは70%、より好ましくは80%、さらにより好ましくは90%、よりさらに好ましくは95%、よりさらに特に好ましくは96%、特に好ましくは97%、最も好ましくは98%又は特定に好ましくは99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であり、但し、配列番号18における2、25、46、48、60、64、69、88、90、157、164、165、169、174、185、186、187、195、197、202、205、239、242、245、252、255、268、311、318、322、327、328、353、359、384、389、391、396、409、410、414、424、436、452、475および476位に対応するアミノ酸が、配列番号18に示されるアミノ酸配列のそれぞれの位置に示されるアミノ酸を表す。
最も好ましい実施形態において、ω-TAをコードする本発明によるタンパク質は、配列番号18に示される1~476位のアミノ酸配列を含むタンパク質である。
本明細書中でこれまでに記載されているタンパク質は、本発明によるω-TA変異体またはタンパク質変異体として本明細書中で一般的に言及される。
本発明によるタンパク質変異体へのさらなるアミノ酸改変の導入は、ω-TA変異体の活性を、特にその基質特異性に関してさらに改善することが見出され、これは、これらのさらなる改変ω-TA変異体が、本明細書中上記のω-TA変異体と比較して、エナンチオマー的に富化された、またはほぼ純粋な生成物を生成するためにより良好に適合されることを意味する。さらなる修飾を含むω-TAは、本発明によるタンパク質として本明細書中に上記したω-TA変異体と比較してさらに修飾される。さらなる改変を含むω-TA変異体は、特に、エナンチオマー的に富化された、またはエナンチオマー的にほぼ純粋なホスホ-アミノ酸を生成するのに適しており、本明細書では、さらなるアミノ酸改変を含む、または、さらなるアミノ酸改変を含む本発明によるタンパク質を含む、ω-TA変異体と称される。
さらなるアミノ酸改変を有するω-TA変異体に関して、あるタンパク質がω-TA活性を有することを示すために好ましい方法は、例えば、WO2017/151573に記載されており、さらなるアミノ酸改変を有するω-TA変異体を示すための特定の好ましい方法は、本明細書中で「一般的方法」項目7に記載されている。
「エナンチオマー富化」とは、本明細書において、2つのエナンチオマーの1つが他のエナンチオマーよりも多量に組成中に存在し、好ましくは1つのエナンチオマーの少なくとも60%が組成中に存在し、より好ましくは1つのエナンチオマーの少なくとも65%が組成中に存在し、より好ましくは1つのエナンチオマーの少なくとも70%が組成中に存在し、より好ましくは1つのエナンチオマーの少なくとも75%が組成中に存在し、さらにより好ましくは1つのエナンチオマーの少なくとも80%が組成中に存在し、好ましくは1つのエナンチオマーの少なくとも85%が組成中に存在し、最も好ましくは1つのエナンチオマーの少なくとも90%が組成中に存在するか、または特に好ましくは1つのエナンチオマーの少なくとも94%が組成中に存在する。
「エナンチオマーがほぼ純粋である」とは、本明細書では、2つのエナンチオマーのうちの1つが少なくとも95.0%、好ましくは2つのエナンチオマーのうちの1つが少なくとも95.5%の量で組成物中に存在し、より好ましくは2つのエナンチオマーのうちの1つが少なくとも96.0%の量で組成物中に存在し、さらに好ましくは2つのエナンチオマーのうちの1つが少なくとも96.5%の量で組成物中に存在し、さらにより好ましくは2つのエナンチオマーのうちの1つが少なくとも97.0%の量で組成物中に存在し、さらにより好ましくは2つのエナンチオマーのうちの1つが少なくとも98.0%の量で組成物中に存在し、特に好ましくは2つのエナンチオマーのうちの1つが少なくとも98.5%の量で組成物中に存在し、最も好ましくは2つのエナンチオマーのうちの1つが少なくとも99.0%の量で組成物中に存在し、または特に好ましくは2つのエナンチオマーのうちの1つが少なくとも99.5%の量で組成物中に存在する。
したがって、本発明による別の実施形態は、ω-TA変異体の活性を有する本発明によるタンパク質変異体に関し、ここで、本発明によるアミノ酸配列は、本発明によるタンパク質と比較して、さらなるアミノ酸改変を含む。
好ましくは、さらなるアミノ酸改変を含む本発明のω-TA活性を有するタンパク質(ω-TA変異体)のアミノ酸配列に関する本発明の別の実施態様は、それゆえ、以下よりなる群から選択されるω-TA活性を有する本発明に係るタンパク質である;
a) 166位のアミノ酸がGであり、327位のアミノ酸がQであることを定める発明のタンパク質;
b) 327位のアミノ酸がQであり、384位のアミノ酸がSであることを定める発明のタンパク質;
c) 326位のアミノ酸がQであり、327位のアミノ酸がQであることを定める発明のタンパク質;
d) 327位のアミノ酸がQであることを定める発明のタンパク質;
e) 326位のアミノ酸がFであり、327位のアミノ酸がQであることを定める発明のタンパク質;
f) 327位のアミノ酸がCであることを定める発明のタンパク質;
g) 327位のアミノ酸がIであることを定める発明のタンパク質;
h) 327位のアミノ酸がMであることを定める発明のタンパク質;
i) 164位のアミノ酸がYであることを定める発明のタンパク質;
j) 164位のアミノ酸がSであることを定める発明のタンパク質;
k) 327位のアミノ酸がVであることを定める発明のタンパク質;
l) 409位のアミノ酸がRであることを定める発明のタンパク質;
m) 327位のアミノ酸がSであることを定める発明のタンパク質;
n) 271位のアミノ酸がIであることを定める発明のタンパク質;
o) 329位のアミノ酸がGであることを定める発明のタンパク質;
p) 409位のアミノ酸がPであることを定める発明のタンパク質;
q) 414位のアミノ酸がMであることを定める発明のタンパク質;
r) 165位のアミノ酸がKであることを定める発明のタンパク質;
s) 414位のアミノ酸がRであることを定める発明のタンパク質;
t) 414位のアミノ酸がHであることを定める発明のタンパク質;
u) 165位のアミノ酸がCであることを定める発明のタンパク質;
v) 327位のアミノ酸がVであることを定める発明のタンパク質;
w) 164位のアミノ酸がCであることを定める発明のタンパク質;
x) 409位のアミノ酸がKであることを定める発明のタンパク質。
a) 166位のアミノ酸がGであり、327位のアミノ酸がQであることを定める発明のタンパク質;
b) 327位のアミノ酸がQであり、384位のアミノ酸がSであることを定める発明のタンパク質;
c) 326位のアミノ酸がQであり、327位のアミノ酸がQであることを定める発明のタンパク質;
d) 327位のアミノ酸がQであることを定める発明のタンパク質;
e) 326位のアミノ酸がFであり、327位のアミノ酸がQであることを定める発明のタンパク質;
f) 327位のアミノ酸がCであることを定める発明のタンパク質;
g) 327位のアミノ酸がIであることを定める発明のタンパク質;
h) 327位のアミノ酸がMであることを定める発明のタンパク質;
i) 164位のアミノ酸がYであることを定める発明のタンパク質;
j) 164位のアミノ酸がSであることを定める発明のタンパク質;
k) 327位のアミノ酸がVであることを定める発明のタンパク質;
l) 409位のアミノ酸がRであることを定める発明のタンパク質;
m) 327位のアミノ酸がSであることを定める発明のタンパク質;
n) 271位のアミノ酸がIであることを定める発明のタンパク質;
o) 329位のアミノ酸がGであることを定める発明のタンパク質;
p) 409位のアミノ酸がPであることを定める発明のタンパク質;
q) 414位のアミノ酸がMであることを定める発明のタンパク質;
r) 165位のアミノ酸がKであることを定める発明のタンパク質;
s) 414位のアミノ酸がRであることを定める発明のタンパク質;
t) 414位のアミノ酸がHであることを定める発明のタンパク質;
u) 165位のアミノ酸がCであることを定める発明のタンパク質;
v) 327位のアミノ酸がVであることを定める発明のタンパク質;
w) 164位のアミノ酸がCであることを定める発明のタンパク質;
x) 409位のアミノ酸がKであることを定める発明のタンパク質。
さらなるアミノ酸改変を含むω-TA活性を有するタンパク質のアミノ酸配列に関して本発明のより好ましい実施形態は、以下からなる群から選択されるω-TA活性を有するタンパク質に関し;
a) 配列番号18の166位のアミノ酸SがGで置換され、配列番号18の327位のアミノ酸TがQで置換されていること以外は、配列番号18に示すアミノ酸配列の1~476位のアミノ酸配列を有するタンパク質;
b)配列番号18の327位のアミノ酸TがQで置換され、配列番号18の384位のアミノ酸CがSで置換されていること以外は、配列番号18に示すアミノ酸配列の1~476位のアミノ酸配列を有するタンパク質;
c) 配列番号18の326位のアミノ酸EがQで置換され、配列番号18の327位のアミノ酸TがQで置換されている以外は、配列番号18に示すアミノ酸配列の1~476位のアミノ酸配列を有するタンパク質;
d) 配列番号18の327位のアミノ酸TがQで置換されている以外は、 配列番号18に示すアミノ酸配列の1~476位のアミノ酸配列を有するタンパク質;
e) 配列番号18の326位のアミノ酸EがFで置換され、配列番号18の327位のアミノ酸TがQで置換されている以外は、配列番号18に示すアミノ酸配列の1~476位のアミノ酸配列を有するタンパク質;
f) 配列番号18の327位のアミノ酸TがCで置換されている以外は、 配列番号18に示すアミノ酸配列の1~476位のアミノ酸配列を有するタンパク質;
g) 配列番号18の327位のアミノ酸TがIで置換されている以外は、 配列番号18に示すアミノ酸配列の1~476位のアミノ酸配列を有するタンパク質;
h) 配列番号18の327位のアミノ酸TがMで置換されている以外は、 配列番号18に示すアミノ酸配列の1~476位のアミノ酸配列を有するタンパク質;
i) 配列番号18の164位のアミノ酸FがYで置換されている以外は、 配列番号18に示すアミノ酸配列の1~476位のアミノ酸配列を有するタンパク質;
j) 配列番号18の164位のアミノ酸FがSで置換されている以外は、 配列番号18に示すアミノ酸配列の1~476位のアミノ酸配列を有するタンパク質;
k) 配列番号18の327位のアミノ酸TがVで置換されている以外は、 配列番号18に示すアミノ酸配列の1~476位のアミノ酸配列を有するタンパク質;
l) 配列番号18の409位のアミノ酸TがRで置換されている以外は、 配列番号18に示すアミノ酸配列の1~476位のアミノ酸配列を有するタンパク質;
m) 配列番号18の327位のアミノ酸TがSで置換されている以外は、 配列番号18に示すアミノ酸配列の1~476位のアミノ酸配列を有するタンパク質;
n) 配列番号18の271位のアミノ酸VがIで置換されている以外は、 配列番号18に示すアミノ酸配列の1~476位のアミノ酸配列を有するタンパク質;
o) 配列番号18の329位のアミノ酸SがGで置換されている以外は、 配列番号18に示すアミノ酸配列の1~476位のアミノ酸配列を有するタンパク質;
p) 配列番号18の409位のアミノ酸TがPで置換されている以外は、 配列番号18に示すアミノ酸配列の1~476位のアミノ酸配列を有するタンパク質;
q) 配列番号18の414位のアミノ酸LがMで置換されている以外は、 配列番号18に示すアミノ酸配列の1~476位のアミノ酸配列を有するタンパク質;
r) 配列番号18の165位のアミノ酸QがKで置換されている以外は、 配列番号18に示すアミノ酸配列の1~476位のアミノ酸配列を有するタンパク質;
s) 配列番号18の414位のアミノ酸LがRで置換されている以外は、 配列番号18に示すアミノ酸配列の1~476位のアミノ酸配列を有するタンパク質;
t) 配列番号18の414位のアミノ酸LがHで置換されている以外は、 配列番号18に示すアミノ酸配列の1~476位のアミノ酸配列を有するタンパク質;
u) 配列番号18の165位のアミノ酸QがCで置換されている以外は、配列番号18に示すアミノ酸配列の1~476位のアミノ酸配列を有するタンパク質;
v) 配列番号18の327位のアミノ酸TがVで置換されている以外は、 配列番号18に示すアミノ酸配列の1~476位のアミノ酸配列を有するタンパク質;
w) 配列番号18の164位のアミノ酸FがCで置換されている以外は、 配列番号18に示すアミノ酸配列の1~476位のアミノ酸配列を有するタンパク質;
x) 配列番号18の409位のアミノ酸TがKで置換されている以外は、 配列番号18に示すアミノ酸配列の1~476位のアミノ酸配列を有するタンパク質;
y) a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)、i)、j)、k)、l)、m)、n)、o)、p)、q)、r)、s)、t)、u)、v)、w)又はx)のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも60%、好ましくは70%、より好ましくは80%、さらにより好ましくは90%、よりさらに好ましくは95%、よりさらに特に好ましくは96%、特に好ましくは97%、最も好ましくは98%又は特定に好ましくは99%同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であって、
a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)、i)、j)、k)、l)、m)、n)、o)、p)、q)、r)、s)、t)、u)、v)、w)又はx)のそれぞれで規定されるアミノ酸配列位置が、a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)、i)、j)、k)、l)、m)、n)、o)、p)、q)、r)、s)、t)、u)、v)、w)又はx)のそれぞれで規定されるいずれかのアミノ酸配列と少なくとも60%、好ましくは70%、より好ましくは80%、さらにより好ましくは90%、よりさらに好ましくは95%、よりさらに特に好ましくは96%、特に好ましくは97%、最も好ましくは98%又は特定に好ましくは99%同一性を有するタンパク質配列のアミノ酸配列中の対応するアミノ酸位置にも存在する、タンパク質。
a) 配列番号18の166位のアミノ酸SがGで置換され、配列番号18の327位のアミノ酸TがQで置換されていること以外は、配列番号18に示すアミノ酸配列の1~476位のアミノ酸配列を有するタンパク質;
b)配列番号18の327位のアミノ酸TがQで置換され、配列番号18の384位のアミノ酸CがSで置換されていること以外は、配列番号18に示すアミノ酸配列の1~476位のアミノ酸配列を有するタンパク質;
c) 配列番号18の326位のアミノ酸EがQで置換され、配列番号18の327位のアミノ酸TがQで置換されている以外は、配列番号18に示すアミノ酸配列の1~476位のアミノ酸配列を有するタンパク質;
d) 配列番号18の327位のアミノ酸TがQで置換されている以外は、 配列番号18に示すアミノ酸配列の1~476位のアミノ酸配列を有するタンパク質;
e) 配列番号18の326位のアミノ酸EがFで置換され、配列番号18の327位のアミノ酸TがQで置換されている以外は、配列番号18に示すアミノ酸配列の1~476位のアミノ酸配列を有するタンパク質;
f) 配列番号18の327位のアミノ酸TがCで置換されている以外は、 配列番号18に示すアミノ酸配列の1~476位のアミノ酸配列を有するタンパク質;
g) 配列番号18の327位のアミノ酸TがIで置換されている以外は、 配列番号18に示すアミノ酸配列の1~476位のアミノ酸配列を有するタンパク質;
h) 配列番号18の327位のアミノ酸TがMで置換されている以外は、 配列番号18に示すアミノ酸配列の1~476位のアミノ酸配列を有するタンパク質;
i) 配列番号18の164位のアミノ酸FがYで置換されている以外は、 配列番号18に示すアミノ酸配列の1~476位のアミノ酸配列を有するタンパク質;
j) 配列番号18の164位のアミノ酸FがSで置換されている以外は、 配列番号18に示すアミノ酸配列の1~476位のアミノ酸配列を有するタンパク質;
k) 配列番号18の327位のアミノ酸TがVで置換されている以外は、 配列番号18に示すアミノ酸配列の1~476位のアミノ酸配列を有するタンパク質;
l) 配列番号18の409位のアミノ酸TがRで置換されている以外は、 配列番号18に示すアミノ酸配列の1~476位のアミノ酸配列を有するタンパク質;
m) 配列番号18の327位のアミノ酸TがSで置換されている以外は、 配列番号18に示すアミノ酸配列の1~476位のアミノ酸配列を有するタンパク質;
n) 配列番号18の271位のアミノ酸VがIで置換されている以外は、 配列番号18に示すアミノ酸配列の1~476位のアミノ酸配列を有するタンパク質;
o) 配列番号18の329位のアミノ酸SがGで置換されている以外は、 配列番号18に示すアミノ酸配列の1~476位のアミノ酸配列を有するタンパク質;
p) 配列番号18の409位のアミノ酸TがPで置換されている以外は、 配列番号18に示すアミノ酸配列の1~476位のアミノ酸配列を有するタンパク質;
q) 配列番号18の414位のアミノ酸LがMで置換されている以外は、 配列番号18に示すアミノ酸配列の1~476位のアミノ酸配列を有するタンパク質;
r) 配列番号18の165位のアミノ酸QがKで置換されている以外は、 配列番号18に示すアミノ酸配列の1~476位のアミノ酸配列を有するタンパク質;
s) 配列番号18の414位のアミノ酸LがRで置換されている以外は、 配列番号18に示すアミノ酸配列の1~476位のアミノ酸配列を有するタンパク質;
t) 配列番号18の414位のアミノ酸LがHで置換されている以外は、 配列番号18に示すアミノ酸配列の1~476位のアミノ酸配列を有するタンパク質;
u) 配列番号18の165位のアミノ酸QがCで置換されている以外は、配列番号18に示すアミノ酸配列の1~476位のアミノ酸配列を有するタンパク質;
v) 配列番号18の327位のアミノ酸TがVで置換されている以外は、 配列番号18に示すアミノ酸配列の1~476位のアミノ酸配列を有するタンパク質;
w) 配列番号18の164位のアミノ酸FがCで置換されている以外は、 配列番号18に示すアミノ酸配列の1~476位のアミノ酸配列を有するタンパク質;
x) 配列番号18の409位のアミノ酸TがKで置換されている以外は、 配列番号18に示すアミノ酸配列の1~476位のアミノ酸配列を有するタンパク質;
y) a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)、i)、j)、k)、l)、m)、n)、o)、p)、q)、r)、s)、t)、u)、v)、w)又はx)のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも60%、好ましくは70%、より好ましくは80%、さらにより好ましくは90%、よりさらに好ましくは95%、よりさらに特に好ましくは96%、特に好ましくは97%、最も好ましくは98%又は特定に好ましくは99%同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であって、
a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)、i)、j)、k)、l)、m)、n)、o)、p)、q)、r)、s)、t)、u)、v)、w)又はx)のそれぞれで規定されるアミノ酸配列位置が、a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)、i)、j)、k)、l)、m)、n)、o)、p)、q)、r)、s)、t)、u)、v)、w)又はx)のそれぞれで規定されるいずれかのアミノ酸配列と少なくとも60%、好ましくは70%、より好ましくは80%、さらにより好ましくは90%、よりさらに好ましくは95%、よりさらに特に好ましくは96%、特に好ましくは97%、最も好ましくは98%又は特定に好ましくは99%同一性を有するタンパク質配列のアミノ酸配列中の対応するアミノ酸位置にも存在する、タンパク質。
本発明の実施形態として、さらなるアミノ酸改変を含むω-TA変異体の活性を有する好ましいタンパク質は、項目a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)、i)、j)、k)、l)、m)、n)、o)およびp)に定義されるタンパク質であり、上記に定義されるタンパク質は、より好ましくは、項目a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)およびh)に定義されるタンパク質であり、最も好ましいのは、上記に定義される項目a)、b)およびc)に定義されるタンパク質である。
表2は、配列番号18に示されるアミノ酸配列(1~476位まで)と比較して、さらなるアミノ酸改変を含むω-TAのアミノ酸配列中に存在するさらなるアミノ酸改変を要約する。
本発明の1つのさらなる実施形態は、本発明によるタンパク質をコードする核酸分子に関する。
本発明による核酸分子は、核酸が本発明によるタンパク質をコードする限り、任意の種類の核酸でよい。核酸は、リボ核酸分子(例えば、RNA、mRNA)またはデオキシリボ核酸分子(イントロンおよびコードDNAを含み得るかもしれないゲノムDNAを含む)であり得る。
本発明にとって特に興味深いのは、配列番号18の1~476位に示されるアミノ酸配列を含むω-TA活性を有するタンパク質をコードする核酸分子である。
したがって、本発明はまた、以下からなる群から選択されるω-TA活性を有するタンパク質をコードする核酸分子に関し;
a) 配列番号17に示される核酸配列の1~1428位の核酸配列を含む核酸分子;
b) 配列番号18に示されるアミノ酸配列の1~476位のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸分子;
c) 配列番号17に示される核酸配列の1~1428位の核酸配列と少なくとも60%、好ましくは70%、より好ましくは80%、さらにより好ましくは90%、よりさらに好ましくは95%、よりさらに特に好ましくは96%、特に好ましくは97%、最も好ましくは98%又は特定に好ましくは99%同一性を有する核酸分子であって、
配列番号17のヌクレオチド位置73~75に対応するコドンは、ヌクレオチド配列mgnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置190~192に対応するコドンは、ヌクレオチド配列athを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置262~264に対応するコドンは、ヌクレオチド配列gcnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置469~471に対応するコドンは、ヌクレオチド配列gcnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置493~495に対応するコドンは、配列番号17のヌクレオチド配列mgnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置505~507に対応するコドンは、配列番号17のヌクレオチド配列gcnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置520~522に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ggnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置589~591に対応するコドンは、ヌクレオチド配列gcnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置559~561に対応するコドンは、ヌクレオチド配列aayを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置715~717に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ccnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置979~981に対応するコドンは、ヌクレオチド配列acnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置982~984に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ggnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1150~1152に対応するコドンは、ヌクレオチド配列tgyを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1165~1167に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ytnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1171~1173に対応するコドンは、ヌクレオチド配列garを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1186~1188に対応するコドンは、ヌクレオチド配列garを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1228~1230に対応するコドンは、ヌクレオチド配列mgnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1240~1242に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ytnを有する;
a) 配列番号17に示される核酸配列の1~1428位の核酸配列を含む核酸分子;
b) 配列番号18に示されるアミノ酸配列の1~476位のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸分子;
c) 配列番号17に示される核酸配列の1~1428位の核酸配列と少なくとも60%、好ましくは70%、より好ましくは80%、さらにより好ましくは90%、よりさらに好ましくは95%、よりさらに特に好ましくは96%、特に好ましくは97%、最も好ましくは98%又は特定に好ましくは99%同一性を有する核酸分子であって、
配列番号17のヌクレオチド位置73~75に対応するコドンは、ヌクレオチド配列mgnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置190~192に対応するコドンは、ヌクレオチド配列athを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置262~264に対応するコドンは、ヌクレオチド配列gcnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置469~471に対応するコドンは、ヌクレオチド配列gcnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置493~495に対応するコドンは、配列番号17のヌクレオチド配列mgnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置505~507に対応するコドンは、配列番号17のヌクレオチド配列gcnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置520~522に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ggnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置589~591に対応するコドンは、ヌクレオチド配列gcnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置559~561に対応するコドンは、ヌクレオチド配列aayを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置715~717に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ccnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置979~981に対応するコドンは、ヌクレオチド配列acnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置982~984に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ggnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1150~1152に対応するコドンは、ヌクレオチド配列tgyを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1165~1167に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ytnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1171~1173に対応するコドンは、ヌクレオチド配列garを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1186~1188に対応するコドンは、ヌクレオチド配列garを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1228~1230に対応するコドンは、ヌクレオチド配列mgnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1240~1242に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ytnを有する;
d) 配列番号17に示される核酸配列の1~1428位の核酸配列と少なくとも60%、好ましくは70%、より好ましくは80%、さらにより好ましくは90%、よりさらに好ましくは95%、よりさらに特に好ましくは96%、特に好ましくは97%、最も好ましくは98%又は特定に好ましくは99%同一性を有する核酸分子であって、
配列番号17のヌクレオチド位置4~6に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ggnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置73~75に対応するコドンは、ヌクレオチド配列mgnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置136~138に対応するコドンは、ヌクレオチド配列atgを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置142~144に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ggnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置178~180に対応するコドンは、ヌクレオチド配列tayを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置190~192に対応するコドンは、ヌクレオチド配列athを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置205~207に対応するコドンは、ヌクレオチド配列carを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置262~264に対応するコドンは、ヌクレオチド配列gcnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置268~270に対応するコドンは、ヌクレオチド配列gcnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置469~471に対応するコドンは、ヌクレオチド配列gcnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置490~492に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ttyを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置493~495に対応するコドンは、ヌクレオチド配列carを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置505~507に対応するコドンは、ヌクレオチド配列gcnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置520~522に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ggnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置553~555に対応するコドンは、ヌクレオチド配列tayを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置556~558に対応するコドンは、ヌクレオチド配列aayを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置559~561に対応するコドンは、ヌクレオチド配列aayを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置583~585に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ccnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置589~591に対応するコドンは、ヌクレオチド配列gcnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置604~606に対応するコドンは、ヌクレオチド配列aayを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置613~615に対応するコドンは、ヌクレオチド配列tgyを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置715~717に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ccnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置724~726に対応するコドンは、ヌクレオチド配列gtnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置733~735に対応するコドンは、ヌクレオチド配列acnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置754~756に対応するコドンは、ヌクレオチド配列athを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置763~765に対応するコドンは、ヌクレオチド配列athを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置802~804に対応するコドンは、ヌクレオチド配列aayを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置931~933に対応するコドンは、ヌクレオチド配列gtnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置952~954に対応するコドンは、ヌクレオチド配列gcnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置964~966に対応するコドンは、ヌクレオチド配列aarを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置979~981に対応するコドンは、ヌクレオチド配列acnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置982~984に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ggnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1057~1059に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ytnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1075~1077に対応するコドンは、ヌクレオチド配列aayを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1150~1152に対応するコドンは、ヌクレオチド配列tayを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1165~1167に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ytnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1171~1173に対応するコドンは、ヌクレオチド配列garを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1186~1188に対応するコドンは、ヌクレオチド配列garを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1225~1227に対応するコドンは、ヌクレオチド配列acnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1228~1230に対応するコドンは、ヌクレオチド配列mgnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1240~1242に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ytnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1270~1272に対応するコドンは、ヌクレオチド配列garを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1306~1308に対応するコドンは、ヌクレオチド配列gtnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1354~1356に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ggnを有する;
配列番号17のヌクレオチド位置4~6に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ggnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置73~75に対応するコドンは、ヌクレオチド配列mgnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置136~138に対応するコドンは、ヌクレオチド配列atgを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置142~144に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ggnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置178~180に対応するコドンは、ヌクレオチド配列tayを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置190~192に対応するコドンは、ヌクレオチド配列athを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置205~207に対応するコドンは、ヌクレオチド配列carを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置262~264に対応するコドンは、ヌクレオチド配列gcnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置268~270に対応するコドンは、ヌクレオチド配列gcnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置469~471に対応するコドンは、ヌクレオチド配列gcnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置490~492に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ttyを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置493~495に対応するコドンは、ヌクレオチド配列carを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置505~507に対応するコドンは、ヌクレオチド配列gcnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置520~522に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ggnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置553~555に対応するコドンは、ヌクレオチド配列tayを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置556~558に対応するコドンは、ヌクレオチド配列aayを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置559~561に対応するコドンは、ヌクレオチド配列aayを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置583~585に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ccnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置589~591に対応するコドンは、ヌクレオチド配列gcnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置604~606に対応するコドンは、ヌクレオチド配列aayを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置613~615に対応するコドンは、ヌクレオチド配列tgyを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置715~717に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ccnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置724~726に対応するコドンは、ヌクレオチド配列gtnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置733~735に対応するコドンは、ヌクレオチド配列acnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置754~756に対応するコドンは、ヌクレオチド配列athを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置763~765に対応するコドンは、ヌクレオチド配列athを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置802~804に対応するコドンは、ヌクレオチド配列aayを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置931~933に対応するコドンは、ヌクレオチド配列gtnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置952~954に対応するコドンは、ヌクレオチド配列gcnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置964~966に対応するコドンは、ヌクレオチド配列aarを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置979~981に対応するコドンは、ヌクレオチド配列acnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置982~984に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ggnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1057~1059に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ytnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1075~1077に対応するコドンは、ヌクレオチド配列aayを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1150~1152に対応するコドンは、ヌクレオチド配列tayを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1165~1167に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ytnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1171~1173に対応するコドンは、ヌクレオチド配列garを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1186~1188に対応するコドンは、ヌクレオチド配列garを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1225~1227に対応するコドンは、ヌクレオチド配列acnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1228~1230に対応するコドンは、ヌクレオチド配列mgnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1240~1242に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ytnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1270~1272に対応するコドンは、ヌクレオチド配列garを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1306~1308に対応するコドンは、ヌクレオチド配列gtnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1354~1356に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ggnを有する;
e) a)、b)、c)またはd)で定義される核酸分子の相補鎖とハイブリダイズする核酸分子であり、
配列番号17におけるヌクレオチド位置73~75に対応するコドンは、ヌクレオチド配列mgnを有し、
配列番号17におけるヌクレオチド位置190~192に対応するコドンは、ヌクレオチド配列athを有し、
配列番号17におけるヌクレオチド位置262~264に対応するコドンは、ヌクレオチド配列gcnを有し、
配列番号17におけるヌクレオチド位置469~471に対応するコドンは、ヌクレオチド配列gcnを有し、
配列番号17におけるヌクレオチド位置493~495に対応するコドンは、ヌクレオチド配列mgnを有し、
配列番号17におけるヌクレオチド位置505~507に対応するコドンは、ヌクレオチド配列gcnを有し、
配列番号17におけるヌクレオチド位置520~522に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ggnを有し、
配列番号17におけるヌクレオチド位置559~561に対応するコドンは、ヌクレオチド配列aayを有し、
配列番号17におけるヌクレオチド位置715~717に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ccnを有し、
配列番号17におけるヌクレオチド位置979~981に対応するコドンは、ヌクレオチド配列acnを有し、
配列番号17におけるヌクレオチド位置982~984に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ggnを有し、
配列番号17におけるヌクレオチド位置1150~1152に対応するコドンは、ヌクレオチド配列tgyを有し、
配列番号17におけるヌクレオチド位置1165~1167に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ytnを有し、
配列番号17におけるヌクレオチド位置1171~1173に対応するコドンは、ヌクレオチド配列garを有し、
配列番号17におけるヌクレオチド位置1186~1188に対応するコドンは、ヌクレオチド配列garを有し、
配列番号17におけるヌクレオチド位置1228~1230に対応するコドンは、ヌクレオチド配列mgnを有し、
配列番号17におけるヌクレオチド位置1240~1242に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ytnを有する;
配列番号17におけるヌクレオチド位置73~75に対応するコドンは、ヌクレオチド配列mgnを有し、
配列番号17におけるヌクレオチド位置190~192に対応するコドンは、ヌクレオチド配列athを有し、
配列番号17におけるヌクレオチド位置262~264に対応するコドンは、ヌクレオチド配列gcnを有し、
配列番号17におけるヌクレオチド位置469~471に対応するコドンは、ヌクレオチド配列gcnを有し、
配列番号17におけるヌクレオチド位置493~495に対応するコドンは、ヌクレオチド配列mgnを有し、
配列番号17におけるヌクレオチド位置505~507に対応するコドンは、ヌクレオチド配列gcnを有し、
配列番号17におけるヌクレオチド位置520~522に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ggnを有し、
配列番号17におけるヌクレオチド位置559~561に対応するコドンは、ヌクレオチド配列aayを有し、
配列番号17におけるヌクレオチド位置715~717に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ccnを有し、
配列番号17におけるヌクレオチド位置979~981に対応するコドンは、ヌクレオチド配列acnを有し、
配列番号17におけるヌクレオチド位置982~984に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ggnを有し、
配列番号17におけるヌクレオチド位置1150~1152に対応するコドンは、ヌクレオチド配列tgyを有し、
配列番号17におけるヌクレオチド位置1165~1167に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ytnを有し、
配列番号17におけるヌクレオチド位置1171~1173に対応するコドンは、ヌクレオチド配列garを有し、
配列番号17におけるヌクレオチド位置1186~1188に対応するコドンは、ヌクレオチド配列garを有し、
配列番号17におけるヌクレオチド位置1228~1230に対応するコドンは、ヌクレオチド配列mgnを有し、
配列番号17におけるヌクレオチド位置1240~1242に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ytnを有する;
f) a)、b)、c)またはd)で定義される核酸分子の相補鎖とハイブリダイズする核酸分子であり、
配列番号17のヌクレオチド位置4~6に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ggnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置73~75に対応するコドンは、ヌクレオチド配列mgnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置136~138に対応するコドンは、ヌクレオチド配列atgを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置142~144に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ggnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置178~180に対応するコドンは、ヌクレオチド配列tayを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置190~192に対応するコドンは、ヌクレオチド配列athを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置205~207に対応するコドンは、ヌクレオチド配列carを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置262~264に対応するコドンは、ヌクレオチド配列gcnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置268~270に対応するコドンは、ヌクレオチド配列gcnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置469~471に対応するコドンは、ヌクレオチド配列gcnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置490~492に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ttyを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置493~495に対応するコドンは、ヌクレオチド配列carを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置505~507に対応するコドンは、ヌクレオチド配列gcnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置520~522に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ggnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置553~555に対応するコドンは、ヌクレオチド配列tayを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置556~558に対応するコドンは、ヌクレオチド配列aayを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置559~561に対応するコドンは、ヌクレオチド配列aayを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置583~585に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ccnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置589~591に対応するコドンは、ヌクレオチド配列gcnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置604~606に対応するコドンは、ヌクレオチド配列aayを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置613~615に対応するコドンは、ヌクレオチド配列tgyを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置715~717に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ccnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置724~726に対応するコドンは、ヌクレオチド配列gtnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置733~735に対するコドンは、ヌクレオチド配列acnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置754~756に対するコドンは、ヌクレオチド配列athを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置763~765に対するコドンは、ヌクレオチド配列athを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置802~804に対するコドンは、ヌクレオチド配列aayを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置931~933に対するコドンは、ヌクレオチド配列gtnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置952~954に対するコドンは、ヌクレオチド配列gcnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置964~966に対するコドンは、ヌクレオチド配列aarを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置979~981に対するコドンは、ヌクレオチド配列acnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置982~984に対するコドンは、ヌクレオチド配列ggnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1057~1059に対するコドンは、ヌクレオチド配列ytnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1075~1077に対するコドンは、ヌクレオチド配列aayを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1150~1152に対するコドンは、ヌクレオチド配列tayを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1165~1167に対するコドンは、ヌクレオチド配列ytnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1171~1173に対するコドンは、ヌクレオチド配列garを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1186~1188に対するコドンは、ヌクレオチド配列garを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1225~1227に対するコドンは、ヌクレオチド配列acnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1228~1230に対するコドンは、ヌクレオチド配列mgnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1240~1242に対するコドンは、ヌクレオチド配列ytnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1270~1272に対するコドンは、ヌクレオチド配列garを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1306~1308に対するコドンは、ヌクレオチド配列gtnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1354~1356に対するコドンは、ヌクレオチド配列ggnを有する;
配列番号17のヌクレオチド位置4~6に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ggnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置73~75に対応するコドンは、ヌクレオチド配列mgnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置136~138に対応するコドンは、ヌクレオチド配列atgを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置142~144に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ggnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置178~180に対応するコドンは、ヌクレオチド配列tayを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置190~192に対応するコドンは、ヌクレオチド配列athを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置205~207に対応するコドンは、ヌクレオチド配列carを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置262~264に対応するコドンは、ヌクレオチド配列gcnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置268~270に対応するコドンは、ヌクレオチド配列gcnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置469~471に対応するコドンは、ヌクレオチド配列gcnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置490~492に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ttyを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置493~495に対応するコドンは、ヌクレオチド配列carを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置505~507に対応するコドンは、ヌクレオチド配列gcnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置520~522に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ggnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置553~555に対応するコドンは、ヌクレオチド配列tayを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置556~558に対応するコドンは、ヌクレオチド配列aayを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置559~561に対応するコドンは、ヌクレオチド配列aayを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置583~585に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ccnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置589~591に対応するコドンは、ヌクレオチド配列gcnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置604~606に対応するコドンは、ヌクレオチド配列aayを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置613~615に対応するコドンは、ヌクレオチド配列tgyを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置715~717に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ccnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置724~726に対応するコドンは、ヌクレオチド配列gtnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置733~735に対するコドンは、ヌクレオチド配列acnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置754~756に対するコドンは、ヌクレオチド配列athを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置763~765に対するコドンは、ヌクレオチド配列athを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置802~804に対するコドンは、ヌクレオチド配列aayを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置931~933に対するコドンは、ヌクレオチド配列gtnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置952~954に対するコドンは、ヌクレオチド配列gcnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置964~966に対するコドンは、ヌクレオチド配列aarを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置979~981に対するコドンは、ヌクレオチド配列acnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置982~984に対するコドンは、ヌクレオチド配列ggnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1057~1059に対するコドンは、ヌクレオチド配列ytnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1075~1077に対するコドンは、ヌクレオチド配列aayを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1150~1152に対するコドンは、ヌクレオチド配列tayを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1165~1167に対するコドンは、ヌクレオチド配列ytnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1171~1173に対するコドンは、ヌクレオチド配列garを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1186~1188に対するコドンは、ヌクレオチド配列garを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1225~1227に対するコドンは、ヌクレオチド配列acnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1228~1230に対するコドンは、ヌクレオチド配列mgnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1240~1242に対するコドンは、ヌクレオチド配列ytnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1270~1272に対するコドンは、ヌクレオチド配列garを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1306~1308に対するコドンは、ヌクレオチド配列gtnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1354~1356に対するコドンは、ヌクレオチド配列ggnを有する;
g) 遺伝子コードの縮重により、a)、b)、c)、d)、e)又はf)で定義される核酸分子から逸脱した核酸分子;
h) 配列番号18に示される1~476位のアミノ酸配列と少なくとも少なくとも60%、好ましくは70%、より好ましくは80%、さらにより好ましくは90%、よりさらに好ましくは95%、よりさらに特に好ましくは96%、特に好ましくは97%、最も好ましくは98%又は特定に好ましくは99%同一性を有するタンパク質をコードする核酸分子であり、配列番号18の25、64、88、157、165、169、174、187、239、327、328、384、389、391、396、410および414位に対応するアミノ酸が、配列番号18に示されるアミノ酸配列のそれぞれの位置に示されるアミノ酸を表す、核酸分子;
i) 配列番号18に示される1~476位のアミノ酸配列と少なくとも60%、好ましくは70%、より好ましくは80%、さらにより好ましくは90%、よりさらに好ましくは95%、よりさらに特に好ましくは96%、特に好ましくは97%、最も好ましくは98%又は特定に好ましくは99%同一性を有するタンパク質をコードする核酸分子であり、配列番号18の2、25、46、48、60、64、69、88、90、157、164、165、169、174、185、186、187、195、197、202、205、239、242、245、252、255、268、311、318、322、327、328、353、359、384、389、391、396、409、410、414、424、436、452、475および476位に対応するアミノ酸が、配列番号18に示されるアミノ酸配列のそれぞれの位置に示されるアミノ酸を表す、核酸分子;
j) 配列番号16に示される核酸配列の1~1428位の核酸配列を含む核酸分子。
配列番号16は、配列番号18に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の逆翻訳によって得られたヌクレオチド配列を示し、ここで、遺伝コードの縮重が反映される。
配列番号17は、配列番号16の遺伝コード柔軟性ヌクレオチドの特定のヌクレオチドによる縮重のために、その置換によって得られる合成核酸分子である。
配列番号16および配列番号17はいずれも、配列番号18に示すアミノ酸配列を有するω-TA活性を有するタンパク質をコードしている。
本発明の文脈において、用語「ハイブリダイゼーション」は、好ましくは厳密な条件下で、従来のハイブリダイゼーション条件下でのハイブリダイゼーションを意味し、例えばSambrookら(分子クローニング、A研究所マニュアル、第3版(2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press、NY.ISBN:0879695773)またはAusubelら(Short Protocols in Molecular Biology、John Wiley&Sons;第5版(2002)、ISBN:0471250929)において記載されている。特に好ましい場合、「ハイブリダイゼーション」とは、以下の条件下でのハイブリダイゼーションを意味する:
ハイブリダイゼーションバッファー:
10xDenhardt溶液(Fikoll 400+PEG+BSA;比1:1:1);0.1%SDS;5mM EDTA;50mM Na2HPO4;250μg/mlのニシン精子DNA;50μg/mlのtRNA;
または
25Mリン酸ナトリウム緩衝液pH7.2、1mM EDTA、7%SDS
ハイブリダイゼーション温度:T=65~68℃
洗浄バッファー:0.1xSSC;0.1%SDS
洗浄温度:T=65~68℃
ハイブリダイゼーションバッファー:
10xDenhardt溶液(Fikoll 400+PEG+BSA;比1:1:1);0.1%SDS;5mM EDTA;50mM Na2HPO4;250μg/mlのニシン精子DNA;50μg/mlのtRNA;
または
25Mリン酸ナトリウム緩衝液pH7.2、1mM EDTA、7%SDS
ハイブリダイゼーション温度:T=65~68℃
洗浄バッファー:0.1xSSC;0.1%SDS
洗浄温度:T=65~68℃
ω-TA活性を有するタンパク質をコードする核酸分子とハイブリダイズする核酸分子は、任意の生物に由来し得る;したがって、それらは、細菌、真菌、動物、ヒト、植物またはウイルスに由来し得る。
ω-TA活性を有するタンパク質をコードする核酸分子とハイブリダイズする核酸分子は、好ましくは真菌または細菌に由来し、最も好ましくは細菌に由来する。
前記分子とハイブリダイズする核酸分子は、例えば、ゲノムライブラリーまたはcDNAライブラリーから単離することができる。このような核酸分子は、本明細書に記載されている核酸分子の一部、またはこれらの分子の逆相補体を用いて同定および単離することができ、例えば、標準的な方法によるハイブリダイゼーション(例えば、Sambrookら、分子クローニング、A研究室マニュアル、第3版(2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY.ISBN: 0879695773;Ausubelら、Short Protocols in Molecular Biology、John Wiley&Sons;第5版(2002)、ISBN:0471250929)である。
ω-TA活性を有するタンパク質をコードする核酸配列を単離するためのハイブリダイゼーション試料として、例えば、配列番号2に記載された1~1431位までの核酸配列、または本質的に配列番号5に記載された1~1437位までの核酸配列、または本質的に配列番号8に記載された核酸配列、または本質的に配列番号11に記載された核酸配列、または本質的に配列番号14に記載された核酸配列、または本質的に配列番号17に記載された核酸配列、またはこれらの核酸配列の断片を用いることができる。
ハイブリダイゼーションサンプルとして使用されるフラグメントはまた、慣用の合成技術を使用して調製される合成フラグメントまたはオリゴヌクレオチドであってもよく、その配列は、本発明の文脈において記載される核酸分子と本質的に同一である。本発明の文脈において記載された核酸配列とハイブリダイズする遺伝子が一旦同定され単離されると、その配列を決定し、この配列によってコードされるタンパク質の特性を分析して、ω-TA活性を有するタンパク質であるかどうかを決定すべきである。あるタンパク質がω-TA活性を有するタンパク質の活性を有するかどうかを決定する方法は当業者に公知であり、ここで言及した。
本発明の文脈において記載される核酸分子とハイブリダイズする分子は、特に、言及される核酸分子のフラグメント、誘導体および対立遺伝子変異体を含む。本発明の文脈において、用語「誘導体」は、これらの分子の配列が、上記の核酸分子の配列と1つ以上の位置で異なり、これらの配列と高度に同一であることを意味する。上述の核酸分子に対する相違は、例えば、欠失、付加、置換、挿入または組換えによるものであり得る。
さらなるアミノ酸改変を含むω-TA活性を有するタンパク質をコードする核酸分子に関する本発明の別の実施形態は、以下からなる群から選択されるω-TA活性を有するタンパク質をコードする本発明による核酸分子に関し;
a) 配列番号16または配列番号17のヌクレオチド位置496~498のコドンがヌクレオチド配列ggnを有し、配列番号16または配列番号17のヌクレオチド位置979~981のコドンがヌクレオチド配列carを有すること以外は、配列番号16または配列番号17に示される核酸配列の1~1428位の核酸配列を含む核酸分子;
b) 配列番号16または配列番号17のヌクレオチド位置979~981のコドンがヌクレオチド配列carを有し、配列番号16または配列番号17のヌクレオチド位置1150~1152のコドンがヌクレオチド配列wsnを有すること以外は、配列番号16または配列番号17に示される核酸配列の1~1428位の核酸配列を含む核酸分子;
c) 配列番号16または配列番号17のヌクレオチド位置976~978のコドンがヌクレオチド配列carを有し、配列番号16または配列番号17のヌクレオチド位置979~981のコドンがヌクレオチド配列carを有すること以外は、配列番号16または配列番号17に示される核酸配列の1~1428位の核酸配列を含む核酸分子;
d) 配列番号16または配列番号17のヌクレオチド位置979~981のコドンがヌクレオチド配列carを有すること以外は、配列番号16または配列番号17に示される核酸配列の1~1428位の核酸配列を含む核酸分子;
e) 配列番号16または配列番号17のヌクレオチド位置976~978のコドンがヌクレオチド配列ttyを有し、配列番号16または配列番号17のヌクレオチド位置979~981のコドンがヌクレオチド配列carを有すること以外は、配列番号16または配列番号17に示される核酸配列の1~1428位の核酸配列を含む核酸分子;
f) 配列番号16または配列番号17のヌクレオチド位置979~981のコドンがヌクレオチド配列carを有すること以外は、配列番号16または配列番号17に示される核酸配列の1~1428位の核酸配列を含む核酸分子;
g) 配列番号16または配列番号17のヌクレオチド位置979~981のコドンがヌクレオチド配列athを有すること以外は、配列番号16または配列番号17に示される核酸配列の1~1428位の核酸配列を含む核酸分子;
h) 配列番号16または配列番号17のヌクレオチド位置979~981のコドンがヌクレオチド配列atgを有すること以外は、配列番号16または配列番号17に示される核酸配列の1~1428位の核酸配列を含む核酸分子;
i) 配列番号16または配列番号17のヌクレオチド位置490~492のコドンがヌクレオチド配列tayを有すること以外は、配列番号16または配列番号17に示される核酸配列の1~1428位の核酸配列を含む核酸分子;
j) 配列番号16または配列番号17のヌクレオチド位置490~492のコドンがヌクレオチド配列wsnを有すること以外は、配列番号16または配列番号17に示される核酸配列の1~1428位の核酸配列を含む核酸分子;
k) 配列番号16または配列番号17のヌクレオチド位置979~981のコドンがヌクレオチド配列gtnを有すること以外は、配列番号16または配列番号17に示される核酸配列の1~1428位の核酸配列を含む核酸分子;
l) 配列番号16または配列番号17のヌクレオチド位置1225~1227のコドンがヌクレオチド配列mgnを有すること以外は、配列番号16または配列番号17に示される核酸配列の1~1428位の核酸配列を含む核酸分子;
m) 配列番号16または配列番号17のヌクレオチド位置979~981のコドンがヌクレオチド配列wsnを有すること以外は、配列番号16または配列番号17に示される核酸配列の1~1428位の核酸配列を含む核酸分子;
n) 配列番号16または配列番号17のヌクレオチド位置811~813のコドンがヌクレオチド配列athを有すること以外は、配列番号16または配列番号17に示される核酸配列の1~1428位の核酸配列を含む核酸分子;
o) 配列番号16または配列番号17のヌクレオチド位置985~987のコドンがヌクレオチド配列ggnを有すること以外は、配列番号16または配列番号17に示される核酸配列の1~1428位の核酸配列を含む核酸分子;
p) 配列番号16または配列番号17のヌクレオチド位置1225~1227のコドンがヌクレオチド配列ccnを有すること以外は、配列番号16または配列番号17に示される核酸配列の1~1428位の核酸配列を含む核酸分子;
q) 配列番号16または配列番号17のヌクレオチド位置1240~1242のコドンがヌクレオチド配列atgを有すること以外は、配列番号16または配列番号17に示される核酸配列の1~1428位の核酸配列を含む核酸分子;
r) 配列番号16または配列番号17のヌクレオチド位置493~495のコドンがヌクレオチド配列aarを有すること以外は、配列番号16または配列番号17に示される核酸配列の1~1428位の核酸配列を含む核酸分子;
s) 配列番号16または配列番号17のヌクレオチド位置1240~1242のコドンがヌクレオチド配列mgnを有すること以外は、配列番号16または配列番号17に示される核酸配列の1~1428位の核酸配列を含む核酸分子;
t) 配列番号16または配列番号17のヌクレオチド位置1240~1242のコドンがヌクレオチド配列cayを有すること以外は、配列番号16または配列番号17に示される核酸配列の1~1428位の核酸配列を含む核酸分子;
u) 配列番号16または配列番号17のヌクレオチド位置493~495のコドンがヌクレオチド配列tgyを有すること以外は、配列番号16または配列番号17に示される核酸配列の1~1428位の核酸配列を含む核酸分子;
v) 配列番号16または配列番号17のヌクレオチド位置979~981のコドンがヌクレオチド配列gtnを有すること以外は、配列番号16または配列番号17に示される核酸配列の1~1428位の核酸配列を含む核酸分子;
w) 配列番号16または配列番号17のヌクレオチド位置490~492のコドンがヌクレオチド配列tgyを有すること以外は、配列番号16または配列番号17に示される核酸配列の1~1428位の核酸配列を含む核酸分子;
x) 配列番号16または配列番号17のヌクレオチド位置1225~1227のコドンがヌクレオチド配列aarを有すること以外は、配列番号16または配列番号17に示される核酸配列の1~1428位の核酸配列を含む核酸分子;
y) a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)、i)、j)、k)、l)、m)、n)、o)、p)、q)、r)、s)、t)、u)、v)、w)又はx)のいずれかの核酸配列と少なくとも60%、好ましくは70%、より好ましくは80%、さらにより好ましくは90%、よりさらに好ましくは95%、よりさらに特に好ましくは96%、特に好ましくは97%、最も好ましくは98%又は特定に好ましくは99%同一性を有する核酸配列を有する核酸分子であって、
a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)、i)、j)、k)、l)、m)、n)、o)、p)、q)、r)、s)、t)、u)、v)、w)又はx)のそれぞれで規定されるコドン核酸配列が、a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)、i)、j)、k)、l)、m)、n)、o)、p)、q)、r)、s)、t)、u)、v)、w)又はx)で規定されるいずれかの核酸配列と少なくとも60%、好ましくは70%、より好ましくは80%、さらにより好ましくは90%、よりさらに好ましくは95%、よりさらに特に好ましくは96%、特に好ましくは97%、最も好ましくは98%又は特定に好ましくは99%同一性を有する核酸配列において、対応するコドン核酸位置に存在する、核酸分子。
a) 配列番号16または配列番号17のヌクレオチド位置496~498のコドンがヌクレオチド配列ggnを有し、配列番号16または配列番号17のヌクレオチド位置979~981のコドンがヌクレオチド配列carを有すること以外は、配列番号16または配列番号17に示される核酸配列の1~1428位の核酸配列を含む核酸分子;
b) 配列番号16または配列番号17のヌクレオチド位置979~981のコドンがヌクレオチド配列carを有し、配列番号16または配列番号17のヌクレオチド位置1150~1152のコドンがヌクレオチド配列wsnを有すること以外は、配列番号16または配列番号17に示される核酸配列の1~1428位の核酸配列を含む核酸分子;
c) 配列番号16または配列番号17のヌクレオチド位置976~978のコドンがヌクレオチド配列carを有し、配列番号16または配列番号17のヌクレオチド位置979~981のコドンがヌクレオチド配列carを有すること以外は、配列番号16または配列番号17に示される核酸配列の1~1428位の核酸配列を含む核酸分子;
d) 配列番号16または配列番号17のヌクレオチド位置979~981のコドンがヌクレオチド配列carを有すること以外は、配列番号16または配列番号17に示される核酸配列の1~1428位の核酸配列を含む核酸分子;
e) 配列番号16または配列番号17のヌクレオチド位置976~978のコドンがヌクレオチド配列ttyを有し、配列番号16または配列番号17のヌクレオチド位置979~981のコドンがヌクレオチド配列carを有すること以外は、配列番号16または配列番号17に示される核酸配列の1~1428位の核酸配列を含む核酸分子;
f) 配列番号16または配列番号17のヌクレオチド位置979~981のコドンがヌクレオチド配列carを有すること以外は、配列番号16または配列番号17に示される核酸配列の1~1428位の核酸配列を含む核酸分子;
g) 配列番号16または配列番号17のヌクレオチド位置979~981のコドンがヌクレオチド配列athを有すること以外は、配列番号16または配列番号17に示される核酸配列の1~1428位の核酸配列を含む核酸分子;
h) 配列番号16または配列番号17のヌクレオチド位置979~981のコドンがヌクレオチド配列atgを有すること以外は、配列番号16または配列番号17に示される核酸配列の1~1428位の核酸配列を含む核酸分子;
i) 配列番号16または配列番号17のヌクレオチド位置490~492のコドンがヌクレオチド配列tayを有すること以外は、配列番号16または配列番号17に示される核酸配列の1~1428位の核酸配列を含む核酸分子;
j) 配列番号16または配列番号17のヌクレオチド位置490~492のコドンがヌクレオチド配列wsnを有すること以外は、配列番号16または配列番号17に示される核酸配列の1~1428位の核酸配列を含む核酸分子;
k) 配列番号16または配列番号17のヌクレオチド位置979~981のコドンがヌクレオチド配列gtnを有すること以外は、配列番号16または配列番号17に示される核酸配列の1~1428位の核酸配列を含む核酸分子;
l) 配列番号16または配列番号17のヌクレオチド位置1225~1227のコドンがヌクレオチド配列mgnを有すること以外は、配列番号16または配列番号17に示される核酸配列の1~1428位の核酸配列を含む核酸分子;
m) 配列番号16または配列番号17のヌクレオチド位置979~981のコドンがヌクレオチド配列wsnを有すること以外は、配列番号16または配列番号17に示される核酸配列の1~1428位の核酸配列を含む核酸分子;
n) 配列番号16または配列番号17のヌクレオチド位置811~813のコドンがヌクレオチド配列athを有すること以外は、配列番号16または配列番号17に示される核酸配列の1~1428位の核酸配列を含む核酸分子;
o) 配列番号16または配列番号17のヌクレオチド位置985~987のコドンがヌクレオチド配列ggnを有すること以外は、配列番号16または配列番号17に示される核酸配列の1~1428位の核酸配列を含む核酸分子;
p) 配列番号16または配列番号17のヌクレオチド位置1225~1227のコドンがヌクレオチド配列ccnを有すること以外は、配列番号16または配列番号17に示される核酸配列の1~1428位の核酸配列を含む核酸分子;
q) 配列番号16または配列番号17のヌクレオチド位置1240~1242のコドンがヌクレオチド配列atgを有すること以外は、配列番号16または配列番号17に示される核酸配列の1~1428位の核酸配列を含む核酸分子;
r) 配列番号16または配列番号17のヌクレオチド位置493~495のコドンがヌクレオチド配列aarを有すること以外は、配列番号16または配列番号17に示される核酸配列の1~1428位の核酸配列を含む核酸分子;
s) 配列番号16または配列番号17のヌクレオチド位置1240~1242のコドンがヌクレオチド配列mgnを有すること以外は、配列番号16または配列番号17に示される核酸配列の1~1428位の核酸配列を含む核酸分子;
t) 配列番号16または配列番号17のヌクレオチド位置1240~1242のコドンがヌクレオチド配列cayを有すること以外は、配列番号16または配列番号17に示される核酸配列の1~1428位の核酸配列を含む核酸分子;
u) 配列番号16または配列番号17のヌクレオチド位置493~495のコドンがヌクレオチド配列tgyを有すること以外は、配列番号16または配列番号17に示される核酸配列の1~1428位の核酸配列を含む核酸分子;
v) 配列番号16または配列番号17のヌクレオチド位置979~981のコドンがヌクレオチド配列gtnを有すること以外は、配列番号16または配列番号17に示される核酸配列の1~1428位の核酸配列を含む核酸分子;
w) 配列番号16または配列番号17のヌクレオチド位置490~492のコドンがヌクレオチド配列tgyを有すること以外は、配列番号16または配列番号17に示される核酸配列の1~1428位の核酸配列を含む核酸分子;
x) 配列番号16または配列番号17のヌクレオチド位置1225~1227のコドンがヌクレオチド配列aarを有すること以外は、配列番号16または配列番号17に示される核酸配列の1~1428位の核酸配列を含む核酸分子;
y) a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)、i)、j)、k)、l)、m)、n)、o)、p)、q)、r)、s)、t)、u)、v)、w)又はx)のいずれかの核酸配列と少なくとも60%、好ましくは70%、より好ましくは80%、さらにより好ましくは90%、よりさらに好ましくは95%、よりさらに特に好ましくは96%、特に好ましくは97%、最も好ましくは98%又は特定に好ましくは99%同一性を有する核酸配列を有する核酸分子であって、
a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)、i)、j)、k)、l)、m)、n)、o)、p)、q)、r)、s)、t)、u)、v)、w)又はx)のそれぞれで規定されるコドン核酸配列が、a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)、i)、j)、k)、l)、m)、n)、o)、p)、q)、r)、s)、t)、u)、v)、w)又はx)で規定されるいずれかの核酸配列と少なくとも60%、好ましくは70%、より好ましくは80%、さらにより好ましくは90%、よりさらに好ましくは95%、よりさらに特に好ましくは96%、特に好ましくは97%、最も好ましくは98%又は特定に好ましくは99%同一性を有する核酸配列において、対応するコドン核酸位置に存在する、核酸分子。
本発明に係る好ましい核酸分子は、a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)、i)、j)、k)、l)、m)、n)、o)およびp)で前記に規定される核酸分子であり、より好ましくは、a)~k)の項目で前記に定義される核酸分子であり、さらに好ましいものは、a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)およびh)の項目で前記に定義される核酸分子であり、最も好ましいものは、a)、b)およびc)の項目で前記に定義される核酸分子である。
ヌクレオチドの略語a、c、g、tの意味、および縮重ヌクレオチドr、y、s、w、k、m、b、d、h、v、nの略語の意味は、以下の表3の「シーケンスの説明」というサブタイトルの段落から導き出すことができる。どのアミノ酸が縮重ヌクレオチドを含むコドンによってコードされているかは、以下の表5の「配列の説明」という副題の段落から導き出すことができる。
さらに、本発明は、本発明による核酸分子を含む組換え核酸分子に関する。
本発明に関連して、「組換え核酸分子」という用語は、本発明による組換え核酸においてそれらが生じる組み合わせにおいて天然に存在しない、本発明による核酸分子に加えて追加の配列を含有する核酸分子を意味すると理解されるべきである。ここで言及された追加の配列は、好ましくは、任意の機能的又は調節配列(プロモーター、終止シグナル、エンハンサー、リボソーム結合部位(rb)、転写、翻訳又はRNA安定性を増強するリーダー配列、細胞内標的配列等)であり、特に微生物中で活性のある機能的又は調節配列であり、特に真菌、特に酵母又は細菌中で活性のある調節配列であることが好ましい。本発明による組換え核酸分子の創製方法は、当業者に公知であり、連結、遺伝子組換え、または核酸分子の新たな合成によって核酸分子を結合させるような遺伝学的方法を含む。これらの方法は、例えば、Sambrokら(Molecular Cloning、A Laboratory Manual、第3版(2001)、コールドスプリングハーバー研究所プレス、Cold Spring Harbour、NY.ISBN:0879695773)、またはAusubelら(Short Protocols in Molecular Biology、John Wiley&Sons;第5版(2002)、ISBN:0471250929)に記載されている。
さらなる実施態様において、本発明による組換え核酸分子は、調節配列と連結される本発明による核酸分子を含み、それは原核細胞または真核細胞において転写を開始する。
細胞において転写を開始する調節配列は、プロモーターとしても知られている。
調節配列およびプラスミドに関する情報は、当業者に周知であり、例えば、国際遺伝子工学機械(iGEM)財団(One Kendall Square、スーツB6104、ケンブリッジ、MA 02139、米国)によって支援された標準生物学的部分の登録によって、世界中のウェブ(http://parts.igem.org/Catalog))に記載されている。
調節配列において記載され、真核生物において、例えば、大腸菌、特に酵母におけるそのような発現については、例えば、文献に十分に記載されており、サッカロミセス セレビジア(Saccharomyces cerevisiae)である。種々の宿主生物におけるタンパク質の発現のための種々の系の概要は、例えば、Methods in Enzymology 153(1987)、383-516およびBitterら(Methods in Enzymology 153(1987)、516-544)またはGomesら(2016,Advances in Animal and Veterinary Sciences,4(4),346)およびBaghbanら(2018,Current Pharmaceutical Biotechnology,19(6)にある。一般的な酵母プロモーターは、pAOX1、pHIS4、pGAL、pScADH2である(Baghbanら、2018年、前述参照)。一般的な細菌プロモーターは、Marschallら(2017、Appl Microbiol Biotechnol 101、501-512)およびTegelら(2011、FEBSジャーナル278、729-739)によって記載されているように、T5、T7、ラムノース誘導性、アラビノース誘導性、PhoA、人工trc(trp-lac)プロモーターである。
本発明の組換え核酸分子のさらなる実施形態は、本発明による核酸分子を含むベクターまたはプラスミドである。
「ベクター」は、分子生物学の分野において、および本明細書において、遺伝物質(DNAまたはRNA)を標的細胞に移入するために使用される核酸配列または核酸配列を含むビヒクルを表すことが一般的に理解されている。ベクターは、プラスミド、例えば、トランスジェニック植物を作製するためのT-DNAまたはバイナリーベクター、宿主細胞における核酸配列の発現のための発現ベクター、異なる宿主で増殖するのに適格なシャトルベクターであるか、または、ベクターは、宿主に外来性遺伝物質を送達するために改変されたウイルス粒子またはバクテリオファージであり得る。
「プラスミド」は、分子生物学の分野において一般的に理解され、本明細書中では、染色体DNAから分離された宿主細胞中に存在する場合にしばしば自律的に自己複製する環状のDNA分子を表す。
本発明による核酸分子、本発明による組換え核酸分子、本発明によるベクターまたはプラスミドは、例えば本発明による核酸分子を宿主細胞に発現させることにより、本発明によるタンパク質の生産に用いることができる。
本発明の別の実施形態は、本発明に従う核酸分子を含む、または本発明に従うタンパク質を含む、または本発明に従う組換え核酸分子を含む、または本発明に従うベクターを含む、または本発明に従うプラスミドを含む、宿主または宿主細胞に関する。
ω-TA活性を有するタンパク質をコードする本発明に従う核酸分子は、例えば、それらの増殖のために、または本発明に従うタンパク質の産生のために、宿主細胞で発現させることができる。宿主細胞内での発現のために、本発明による核酸分子は、ベクターまたはプラスミド上に含まれ得るか、またはそれぞれの宿主細胞のゲノム中に安定に組み込まれ得る。本発明による核酸分子は、宿主細胞への導入を支持するベクターからもなり得る。
本発明のさらなる実施形態は、本発明による核酸分子を含む、または本発明による組換え核酸分子を含む、または本発明によるベクターを含む、または本発明によるプラスミドを含む、本発明による宿主または宿主細胞に関し、それぞれの場合で本発明のタンパク質を含む。
本発明の別の実施形態は、本発明による核酸分子を含む、または本発明による組換え核酸分子を含む、または本発明によるベクターを含む、または本発明によるプラスミドを含む本発明による宿主または宿主細胞に関し、それぞれの場合で本発明のタンパク質を発現する。
本発明の別の実施形態は、本発明に従う核酸分子を含む、または本発明に従う組換え核酸分子を含む、または本発明に従うベクターを含む、または本発明に従うプラスミドを含む本発明による宿主または宿主細胞に関し、各場合において、タンパク質を発現し、タンパク質がω-トランスアミナーゼの活性を有する。
「核酸分子を発現させること」とは、本明細書において、核酸分子がRNAまたはmRNAである場合には、核酸分子がタンパク質に翻訳され、好ましくはω-TA活性を有するタンパク質に翻訳されるか、または核酸分子がDNAまたはcDNAである場合には、mRNAに転写され(およびイントロンを含むゲノムDNAの場合には、プロセシングされる)、好ましくはω-TA活性を有するタンパク質をコードするmRNAに転写され、次いで、タンパク質に翻訳され、好ましくはω-TA活性を有するタンパク質に翻訳されることを意味する。
宿主における所定の核酸分子の転写は、例えば、ノーザンブロット分析またはRT-PCRによる外来核酸分子の特異的転写物(mRNA)の検出によって、当業者に公知の方法によって実証することができる。
宿主または宿主細胞が所与のタンパク質を含むか否か、または核酸分子の発現に由来するタンパク質を含むか否かは、例えば、ウェスタンブロット分析、ELISA(酵素結合免疫吸着アッセイ)またはRIA(ラジオイムノアッセイ)のような免疫学的方法によって、当業者に公知の方法によって決定することができる。当業者は、特定のタンパク質と特異的に反応する抗体、すなわち、特定のタンパク質に特異的に結合する抗体を調製するための方法に精通している(例えば、LottspeichおよびZorbas(編集),1998,Bioanalytik,Spektrum akad,Verlag,ハイデルベルク,Berlin,ISBN3-8274-0041-4参照)。一部の企業(Thermo Fisher Scientific,168 Third Avenue,Waltham,MA USA245;GenScript,60 Centennial Ave.,Piscataway,NJ08854,USA)は、オーダーサービスとしてこのような抗体の調製を提供している。
さらに、当業者は、宿主または宿主細胞がそれぞれの宿主細胞においてω-TA活性を有するタンパク質の(追加の)活性を検出することによって、本発明によるタンパク質を含むかどうかを試験することができる。好ましくは、それぞれの宿主細胞中でω-TAのさらなる活性を有するタンパク質の活性は、本発明による宿主細胞のω-TA活性と、本発明によるタンパク質を含まない宿主細胞のそれぞれの活性とを比較することによって検出される。
あるタンパク質がω-TA活性を有するか否かの試験は、上述のようにして行うことができる。
本発明による宿主または宿主細胞は、生物を遺伝的に改変または形質転換するための公知の方法により、当業者によって産生することができる。
したがって、本発明のさらなる主題は、本発明による宿主または宿主細胞、特に、原核生物または真核生物宿主または宿主細胞であり、これは、本発明による核酸分子、または本発明による組換え核酸分子、または本発明によるベクターまたは本発明によるプラスミドで遺伝子改変(または形質転換)される。本発明による遺伝子組換え(形質転換)宿主または宿主細胞は、ω-トランスアミナーゼの活性を有するタンパク質を発現し、より好ましくは、本発明による遺伝子組換え(形質転換)宿主または宿主細胞は、本発明によるタンパク質を発現する。
「核酸分子で遺伝子組換え」または「核酸分子で形質転換」は、本明細書中で、核酸分子が、分子生物学、バイオテクノロジーまたは遺伝子改変の分野における技術的方法によって、技術的および/または非自然発生的な手段によって宿主または宿主細胞に導入されるか、または導入されたことを意味すると理解される。
本発明による宿主または宿主細胞の子孫(descendant)、子(offspring)または子孫(progeny)もまた、本発明の実施形態であり、好ましくは、これらの子孫(descendant)、子(offspring)または子孫(progeny)は、本発明による核酸分子を含み、または本発明による組換え核酸分子を含み、または本発明によるベクターを含み、または本発明によるプラスミドを含み、または本発明によるタンパク質を含み、より好ましくは、これらの子孫(descendant)、子(offspring)または子孫(progeny)は、本発明による核酸分子を含むか、または本発明による組換え核酸分子を含むか、本発明または本発明によるベクターを含むか、または本発明によるプラスミドを含み、それぞれの場合にタンパク質を発現し、ここで、これらのタンパク質は、ω-TA活性を有し、さらに好ましくは、これらの子孫(descendant)、子(offspring)または子孫(progeny)は、本発明による核酸分子を含み、本発明による組換え核酸分子を含み、または本発明によるベクターを含み、または本発明によるプラスミドを含み、それぞれの場合にタンパク質を発現し、ここで、これらのタンパク質は、ω-TA活性を有する。
本発明による宿主または宿主細胞は、任意の原核生物または真核生物由来の宿主または宿主細胞であり得る。宿主または宿主細胞は、細菌または細胞(例えば、大腸菌、バシラス属の細菌、特にバシラス・サチリス(Bacillus subtilis)、アグロバクテリウム、特にアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)またはアグロバクテリウム・リゾゲネス(Agrobacterium rhizogenes)、シュードモナス、特にシュードモナス フルオレセンス(Pseudomonas fluorescens)、ストレプトミセス属、ロドコッカス属、特にロドコッカス・ロドクロウス(Rhodococcus rhodochrous)、ビブリオ・ナトリゲネス(Vibrio natrigens)、コリネバクテリウム、特にコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)または真菌または真菌細胞(例えば、アガリスク、特にアガリクス・ビスポルス(Agaricus bisporus)、アスペルギルス、トリコデルマまたは酵母、特に、S.セレビジア(S. cerevisiae)、Pichia ssp.様P.pastoris)、ならびに、植物若しくは植物細胞であり、または、それらは、動物または動物細胞であり得る。
本発明による好ましい宿主細胞は、微生物の細胞である。本特許出願の枠組みの中で、これは、例えば、Schlegel“General Microbiology”(Georg Thieme Publishing House (1985)、1-2)に定義されているように、全ての細菌および全ての原生生物(例えば、真菌、特に酵母および藻類)を含むと理解される。
微生物に関して、本発明による宿主または宿主細胞は、好ましくは細菌/細菌細胞または酵母/酵母細胞であり、最も好ましくは細菌/細菌細胞である。細菌/細菌細胞に関して、本発明による宿主または宿主細胞は、好ましくはBacillus種/Bacillus種細胞または大腸菌(Escherichia coli)/大腸菌細胞であり、最も好ましくは大腸菌/大腸菌細胞である。
或いは、シュードモナス、特にシュードモナス フルオレセンス(Pseudomonas fluorescens)、ストレプトマイセス属、ロドコッカス属、特にロドコッカス・ロドクロウス(Rhodococcus rhodochrous)、ビブリオ属、特にビブリオ・ナトリゲネス(Vibrio natrigens)、コリネバクテリウム、特にコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)またはその他は、本発明による宿主または宿主細胞であり得る。
本発明の好ましい実施形態は、本発明による核酸分子を含む本発明による宿主または宿主細胞に関し、ここで、本発明による核酸分子は、それぞれ宿主または宿主細胞のコドンの使用頻度に適応するように、前記核酸分子のコドンが変化することを特徴とする。
本発明による宿主細胞は、本発明によるタンパク質の生産に用いることができる。本発明によるタンパク質は、アミン(供与体)の存在下でカルボニル(受容体)からエナンチオマー的に富化されたまたはほぼエナンチオマー的に純粋なアミンを製造するための方法において使用され得る。
本発明によるタンパク質によるエナンチオマー的に富化されたまたはほぼエナンチオマー的に純粋なアミンの製造方法において触媒される反応は、一般式(I)によって本明細書において正式に上記に記載され得る。
したがって本発明の別の実施形態は、以下の工程を含むアミンの製造方法に関する;
a) アミン受容体分子を提供し;
b) アミン供与体分子を提供し;
c) 工程a)で提供されるアミン受容体分子および工程b)で提供されるアミン供与体分子を、本発明に記載のタンパク質と接触させ;
d)任意に、アミンを得る。
a) アミン受容体分子を提供し;
b) アミン供与体分子を提供し;
c) 工程a)で提供されるアミン受容体分子および工程b)で提供されるアミン供与体分子を、本発明に記載のタンパク質と接触させ;
d)任意に、アミンを得る。
アミンの製造のための本発明の好ましい実施形態は、脂肪族アミン(直鎖、分枝鎖または環状のアルカンアミン、アルケンアミン、アルキンアミンを含むが、これらに限定されない)の製造方法であるか、またはアリールアミンの製造方法であるか、またはアミノ酸の製造方法であり、より好ましくはα-アミノ酸の製造方法であり、さらに好ましくは、分枝鎖α-アミノ酸、芳香族α-アミノ酸または置換フェニル基を含む芳香族α-アミノ酸の製造方法であり、最も好ましくは、アミノ酸ノルバリン、ロイシン、フェニルアラニンまたはチロシンの製造方法である。
更にアミノ酸改変体を含む本発明に係るω-TA変異体に関して、アミンを製造するための本発明は、好ましくは、脂肪族アミン(直鎖、分枝鎖または環状のアルカンアミン、アルケンアミン、アルキンアミンを含むリンを含むが、これらに限定されない)を含むリンを製造する方法であるか、またはアリールアミンを含むリンを製造する方法であるか、または、アミノ酸を含むリンを製造する方法であり、より好ましくは、α-アミノ酸を含むリンを製造する方法、さらにより好ましくは分枝鎖α-アミノ酸を含むリン、芳香族α-アミノ酸を含むリンまたは置換フェニル基を有する芳香族α-アミノ酸を含むリンを製造する方法であり、より好ましくは、α-アミノ酸を含むリンを製造する方法、よりさらに好ましくは、メチル置換リンを含むα-アミノ酸を製造する方法、最もより好ましくは、グルホシネートを製造する方法である。
アミンの製造のための本発明方法の工程a)におけるアミン受容体分子は、アミン供与体分子からアミノ基を受容する分子を含むカルボニル基であり、それによって受容体分子のカルボニル基がアミンになる。
好ましくは、アミンの製造のための本発明の方法の段階a)のアミン受容体分子は、脂肪族ケトン(直鎖、分枝鎖または環状アルカノン、アルケノン、アルキノンを含むが、これらに限定されない)であるか、またはアリールケトンまたはケト酸であり、より好ましくはケト酸であり、よりさらに好ましくはα-ケト酸であり、最も好ましくは、アミン受容体分子は、2-オキソ吉草酸、4-メチル-2-オキソ吉草酸、フェニルピルビン酸または4-ヒドロキシフェニルピルビン酸からなる群から選択される。
さらなるアミノ酸改変体を含む本発明のタンパク質ω-TA変異体に関しては、アミンの生産のための本発明の方法の段階a)におけるアミン受容体分子は、好ましくは、脂肪族ケトン(直鎖、分枝鎖または環状アルカノン、アルケノン、アルキノン)を含むリンまたはアリールケトンを含むリンまたはケト酸を含むリンを含み、より好ましくは、アミン受容体分子は、ケト酸を含むリンを含み、さらに好ましくは、アミン受容体分子はα-ケト酸を含むリンを含み、よりさらに好ましくはα-ケト酸を含むメチル置換リンを含み、最も好ましくは、段階a)におけるアミン受容体分子は、4-[ヒドロキシ(メチル)ホスホリル]-2-オキソブタン酸である。
好ましくは、アミンの製造のための本発明の方法の工程a)におけるアミン受容体分子は、30g/l(グラム/リットル)~300g/l、より好ましくは30g/l~250g/l、さらにより好ましくは40g/l~250g/l、さらにより好ましくは50g/l~250g/lの量で提供される。
アミンの製造方法の本発明の工程b)におけるアミン供与体分子は、アミン基をアミン受容体分子に供与し、それによってアミン供与体分子のアミン基がカルボニル基となる分子を含むアミン基である。
アミンの製造のための本発明の工程b)におけるアミン供与体分子は、キラルな、プロキラルな、または非キラルなアミンであり得、好ましくは、アミン供与体分子は、キラルな、プロキラルな、または非キラルな、それぞれアルキル-またはアリールまたはアリール-アルキルアミンであり、より好ましくは、アミン供与体分子は、アミノ酸またはアルキル-アミンである。
アルキル-またはアリールアミンに関して、本発明によるアミンの製造方法の工程b)で使用されるべきアミノ供与体分子は、β-アラニン、1-プロピルアミン、(ラセミ体)2-ブチルアミン、6-アミノヘキサン酸、イソプロピルアミン、ベンジルアミン、メチルベンジルアミン、1-アミノインダン、1-メチル-3-フェニルプロピルアミンである。
アミノ供与体が非キラルアミノ酸である場合、グリシンは、本発明によるアミンの製造方法の工程b)において提供される好ましいアミノ供与体分子である。本発明に係るアミンの製造方法の工程b)におけるアミノ供与体がキラルなアミノ酸である場合、そのアミノ酸は、その(S)-エナンチオマーで表されることが好ましい。本発明によるアミンの製造方法の工程b)で提供されるべき好ましい(S)-配置を有するアミノ酸供与体分子は、(S)-メチルベンジルアミン、(S)-1-アミノインダン、(S)-1-メチル-3-フェニルプロピルアミン、(S)-アスパラギン酸、(S)-アスパラギン、(S)-アラニン、(S)-グルタミン、(S)-グルタミン酸、(S)-オルニチン、(S)-ホスホセリン、(S)-フェニルアラニン、(S)-ロイシン、(S)-チロシン、(S)-ノルバリンである。
本発明によるアミンの製造方法の工程b)において提供される最も好ましいアミノ供与体分子は、イソプロピルアミンである。
本発明による方法においてアミノ供与体分子として使用される場合、イソプロピルアミンは、ω-TAの作用によってアセトンへ変換される。アセトンは比較的低温で蒸発するという利点をもたらす揮発性化合物である。これは、反応が起こっている間に反応混合物からω-TAによって生成されたアセトンを除去することを可能にし、反応の平衡が、本発明によるアミンの製造方法によって生成されたアミンに向かってシフトされるという有利な効果をもたらす。これにより、ω-TAによって触媒される逆反応が、1つの反応パートナーが欠けているために減少するので、所望のアミンを大量に得ることができる。
好ましくは、アミンの製造のための本発明による方法の工程b)におけるアミン供与体分子は、10g/l(グラム/リットル)~250g/l、より好ましくは15g/l~200g/l、さらに好ましくは17g/l~180g/lの量で提供される。
本発明によるアミンの製造方法の工程c)において、工程a)で提供されるアミン受容体分子および工程b)で提供されるアミン供与体分子を、好ましくは溶液中で本発明によるタンパク質と接触させる。この溶液は、水のみを含む水溶液であり得るが、水及び有機溶媒を含む溶液でもあり得る。本発明によるアミンの製造方法の工程c)において、有機溶媒を含む水溶液中で、工程a)で提供されるアミン受容体分子および工程b)で提供されるアミン供与体分子と本発明によるタンパク質を接触させる場合、有機溶媒は、好ましくは、DMSO(ジ-メチルスルホキシド)、DMAc(ジメチルアセトアミド)、DMF(ジメチルホルムアミド)、アセトニトリル、トルエン、tert-ブチルメチルエーテル、ヘキサン、ヘプタンから選択される。最も好ましいのは、DMSO、DMAcおよびトルエンである。
好ましくは、有機溶媒を含む水溶液は、最大10%、より好ましくは最大20%、さらに好ましくは最大30%、さらにより好ましくは最大40%、最も好ましくは最大50%の量の有機溶媒を含む。
有機溶媒を含む水溶液を使用することは、本発明によるアミンの製造方法の工程a)で提供されるアミン受容体分子および/または工程b)で提供されるアミン供与体分子が低い溶解度を有し、それらのそれぞれの溶解度が改善され得、ω-TAについて利用可能な基質のより高い量をもたらすので、有機溶媒を含む水溶液を使用することは利点を有する。これはより高い反応速度につながり、目的のアミンをより少ない容量でおよびより短い時間でより多く生産することを意味し、したがって、空間-時間収率を改善する。
本発明によるタンパク質を本発明によるアミンの製造方法の工程c)において、工程a)で提供されるアミン受容体分子および水溶液中の工程b)で提供されるアミン供与体分子と接触させる場合、溶液は、好ましくは、pHを調整するための緩衝系を含む。好ましい緩衝系は、トリス-HCl、MOPS、HEPES、トリス、ビシン(Bicine)を含むものである。
好ましくは、本発明に係るタンパク質を、本発明に係るアミンの製造方法の工程c)において、工程a)で提供されるアミン受容体分子と工程b)で提供されるアミン供与体分子とを接触させる水溶液のpHは、pH4~pH11の間の値、より好ましくはpH5~pH10の間の値、さらに好ましくはpH6~pH10の間の値、さらにより好ましくはpH7~pH10の間の値、さらにより好ましくはpH8~pH10の間の値、最も好ましくはpH8.5~pH9.5の間の値に調整する。
好ましくは、アミンの製造のための本発明の方法の工程c)において、工程a)で提供されるアミン受容体分子と工程b)で提供されるアミン供与体分子と本発明のタンパク質との接触は、10℃~60℃、より好ましくは20℃~60℃、さらに好ましくは25℃~55℃、さらにより好ましくは30℃~50℃、よりさらに好ましくは30℃~45℃、最も好ましくは34℃~42℃の温度で行われる。
工程a)で提供されるアミン受容体分子および工程b)で提供されるアミン供与体分子を、本発明によるアミンの製造方法の工程c)において、本発明によるタンパク質と十分な時間接触させて、アミンを製造する。
工程a)で提供されるアミン受容体分子および工程b)で提供されるアミン供与体分子は、本発明によるアミンの製造方法の工程c)で本発明のタンパク質と、5時間~48時間、より好ましくは5時間~36時間、より好ましくは5時間~30時間、さらに好ましくは5時間~24時間、さらに好ましくは5時間~18時間、最も好ましくは5時間~14時間、特に好ましくは5時間~13時間接触させる。
工程c)における本発明のタンパク質と、工程a)で提供されるアミン受容体分子と、工程b)で提供されるアミン供与体分子との接触において、該タンパク質は、異なる形態のアミン受容体分子およびアミン供与体分子と接触させることができ、好ましくは、タンパク質を、部分精製された形態でアミン受容体分子およびアミン供与体分子と接触させるか、またはタンパク質を精製された形態でアミン受容体分子およびアミン供与体分子と接触させるか、または、アミン受容体分子およびアミン供与体分子と接触させるとき、該タンパク質は粗細胞抽出物中に存在するか、または生きているまたは生きていない宿主細胞の成分として存在する場合、タンパク質はアミン受容体分子およびアミン供与体分子と接触させる。
本発明の方法の工程c)において、アミン受容体分子およびアミン供与体分子を宿主細胞の構成成分としてタンパク質と接触させる場合、宿主細胞は、宿主細胞を培養するために使用された培地を含むものを用いることができ、または宿主細胞は、宿主細胞が培養される培地を含まず、または宿主細胞が(さらなる)処理され、好ましくは宿主細胞が培養される培地がほとんど無くなり、より好ましくは、宿主細胞が(さらなる)処理され、より好ましくは、宿主細胞は(さらなる)処理され、さらに好ましくは、宿主細胞は培養される培地がほぼ無くなり、そして宿主細胞が(さらに)処理されたものである。
「粗細胞抽出物」とは、本明細書中で、細胞中に存在する全てまたは実質的に全ての無機物質または有機物質(さらなるタンパク質および/または核酸分子を含む)を含む生細胞の破壊によって得られる抽出物を意味する。
「部分精製」とは、本明細書中で、タンパク質を発現する生細胞中に存在する全無機物質または有機物質(さらなるタンパク質および/または核酸分子を含む)の一部を含む組成物を含むタンパク質を意味する。
部分的に精製された抽出物は、例えば、遠心分離、濾過、任意の種類のクロマトグラフィー分離、透析のような一般的に公知の手段によって、粗細胞抽出物から有機物または無機物を分画することによって得ることができる。粗細胞抽出物の分画は、同じまたは異なる分画方法を使用して繰り返し行うことができ、沈殿工程を含むことができる。
「精製された」とは、比活性(乾物量中に存在するタンパク質の活性を材料の総量で除した値、特に乾物量中の他のタンパク質の活性)が、それ以上の分画又は精製工程によって増大することができないタンパク質をいう。
「精製された」と言う用語について上記に一般に認められている定義から「精製された」は自明であるが、ほとんどの場合、それ以上の無機及び/又は有機化合物がまったく含まれないタンパク質を意味しない。好ましくは「精製された」とは、本明細書において、本発明によるタンパク質が、タンパク質を含む乾燥重量材料の総量の少なくとも95%、より好ましくは少なくとも96%、さらに好ましくは少なくとも97%、さらにより好ましくは少なくとも98%、さらにより好ましくは少なくとも99%、最も好ましくは少なくとも99.5%存在することを意味する。
用語「生きている細胞」とは、本明細書中で増殖および/または増殖可能な細胞を意味する。
用語「生きていない細胞」とは、ここでは、成長および/または生殖することができない細胞を意味する。しかしながら、生きていない細胞はそれ以上繁殖および/または増殖することはできないが、本発明の用途に関して酵素活性を示し、特にω-TA活性を有する本発明によるタンパク質の活性を依然として示す。
本明細書で使用する用語「培地を含まない」(free from the culture medium)とは、培養に使用される培地が、例えば遠心分離および/または濾過によって除去されたことを意味する。
この用語は、「培地を含まない」という用語に関して上記に一般的に認められている理解から自明であるが、ほとんどの場合、培地中に存在した無機および/または有機化合物が必ずしも細胞中にまったく存在しないことを意味するわけではない。好ましくは、本明細書で、精製されたとは、本発明による細胞が、培養培地を含まない細胞を含む乾燥重量材料の総量の少なくとも95%、より好ましくは少なくとも96%、さらに好ましくは少なくとも97%、さらにより好ましくは少なくとも98%、さらにより好ましくは少なくとも99%、最も好ましくは少なくとも99.5%存在することを意味するものとする。
「宿主細胞が(さらに)処理された」という用語は、本明細書において、本発明に従うタンパク質を含む宿主細胞が、本発明に従うアミンの製造方法の工程c)において、アミン受容体分子およびアミン供与体分子と接触される前に、物理的および/または化学的手段で処理されていることを意味し、好ましくは、それらは物理的手段で処理されていること、より好ましくは、乾燥されていること、さらに好ましくは、凍結乾燥または噴霧乾燥されていること、最も好ましくは、噴霧乾燥されていることを意味する。
乾燥プロセス、特に細胞の凍結乾燥およびスプレー乾燥プロセスは、当業者にとって公知である。好ましくは、本発明によるタンパク質を含む宿主細胞は、凍結乾燥または噴霧乾燥されており、最も好ましくは、「一般的方法」項目9に記載の方法による本発明によるアミンの製造方法の工程c)で接触させる前に噴霧乾燥されている。
ω-TA活性を有するタンパク質は、ピリドキサールリン酸(PLP)依存性酵素であることが当業者に知られている。好ましい実施形態において、タンパク質は、本発明によるアミンの製造方法の工程c)において、工程a)で提供されるアミン受容体分子および工程b)で提供されるアミン供与体分子と、PLPの存在下で接触させられ、より好ましくは、PLPは、0.05g/l~2.0g/lの間の量で、さらに好ましくは0.05g/l~1.5g/lの間の量で、さらにより好ましくは0.05g/l~1.0g/lの間の量で、さらにより好ましくは0.075g/l~0.75g/lの間の量で、最も好ましくは0.1g/l~0.5g/lの間の量で存在する。
アミンの取得方法における必須工程d)においてアミンを得ることは、アミンが、生成されたアミンのさらなる精製なしに工程d)の組成物中に存在することを意味することができ、またはそれは生成されたアミンがさらに精製されることを意味することができる。アミンの精製は、当業者に公知の方法により行うことができる。このようなアミンの精製方法には、クロマトグラフィー、蒸留、抽出、吸着またはろ過を含む方法を含むが、これらに限定されない。
本発明によるアミンの製造方法の好ましい実施形態は、(S)-アミンを、その(それぞれの)(R)-アミンよりもエナンチオマー過剰で含む組成物の製造方法であり、該方法は、
a) アミン受容体分子を提供し;
b) アミン供与体分子を提供し;
c) 工程a)で提供されるアミン受容体分子および工程b)で提供されるアミン供与体分子と本発明のタンパク質とを接触させ;
d) 任意に、(S)-アミンを、(それぞれの)(R)-アミンよりもエナンチオマー過剰で含む組成物を得る、工程を含む。
a) アミン受容体分子を提供し;
b) アミン供与体分子を提供し;
c) 工程a)で提供されるアミン受容体分子および工程b)で提供されるアミン供与体分子と本発明のタンパク質とを接触させ;
d) 任意に、(S)-アミンを、(それぞれの)(R)-アミンよりもエナンチオマー過剰で含む組成物を得る、工程を含む。
本明細書中で使用される「エナンチオマー」という用語は、化学の技術分野において一般に理解されているように、重ね合わせできない相互の構造的鏡イメージである2つの立体異性体の1つの分子であるという意味を有し、「エナンチオマー」という用語は、一般に「光学異性体」としても知られている。
「エナンチオマー過剰(通称、「ee」と略す)」という用語は、化学の技術分野において一般的に理解され、ここでは、各エナンチオマーのモル分画間の絶対差として定義されるそれぞれのエナンチオマーに対して組成中の一方のエナンチオマーの過剰を明記するために使用される。エナンチオマー過剰率は、当該技術分野では%エナンチオマー過剰率で表されることが多い。例として、(S)-エナンチオマーの70%と(R)-エナンチオマーの30%を含む組成物は、(S)-エナンチオマーに関してee=40%(純度(S)-エナンチオマー40%+ラセミ体60%(=30%(S)+30%(R))である。結論として、ラセミ体エナンチオマー混合物はee=0%であり、純粋な(S)-または(R)-エナンチオマーは、ee=100%である。
(S)-アミンエナンチオマー過剰における組成物の製造のための本発明の方法の好ましい実施形態は、エナンチオマー過剰における脂肪族(S)-アミン(直鎖、分枝鎖または環状のアルカンアミン、アルケンアミン、アルキンアミンを含むがこれらに限定されない)を生成するための方法であるか、またはエナンチオマー過剰におけるアリール(S)-アミンの生成方法であるか、またはエナンチオマー過剰における(S)-アミノ酸の生成方法であり、より好ましくは、エナンチオマー過剰における(S)-α-アミノ酸の生成方法であり、よりさらに好ましくは、エナンチオマー過剰における分枝鎖(S)-α-アミノ酸または芳香族(S)-α-アミノ酸または置換フェニル基を含む芳香族(S)-α-アミノ酸の生成方法であり、最も好ましくは、エナンチオマー過剰におけるアミノ酸(S)-ノルバリン、(S)-ロイシン、(S)-フェニルアラニンまたは(S)-チロシンの生成方法である。
更なるアミノ酸改変体を含む本発明のω-TA変異体に関して、エナンチオマー過剰の(S)-アミンを含む組成物の製造方法は、好ましくは、エナンチオマー過剰の(S)-アミン(直鎖、分枝鎖または環状の(S)-アルカンアミン、アルケン(S)-アミン、アルキン(S)-アミンを含むリンを含むがこれに限定されない)を含むリンの製造のための方法であるか、またはエナンチオマー過剰のアリール(S)-アミンを含むリンの製造のための方法であるか、または、エナンチオマー過剰の(S)-アミノ酸を含むリンの製造のための方法であり、より好ましくは、エナンチオマー過剰の(S)-α-アミノ酸を含むリンの製造のための方法であり、さらに好ましくは、エナンチオマー過剰の分枝鎖の(S)-α-アミノ酸を含むリン、芳香族(S)-α-アミノ酸を含むリン、または置換フェニル基を含む芳香族(S)-α-アミノ酸を含むリンの製造のための方法であり、さらにより好ましくは、エナンチオマー過剰の(S)-α-アミノ酸を含むリンの製造方法、さらにより好ましくは、エナンチオマー過剰のメチル置換リンを含む(S)-α-アミノ酸の製造方法、最も好ましくは、エナンチオマー過剰の(S)-グルホシネートの製造方法である。
エナンチオマー過剰の(S)-アミンを含む組成物の製造のための本発明の別の好ましい実施形態は、少なくとも20%、より好ましくは少なくとも40%、より好ましくは少なくとも60%、さらにより好ましくは少なくとも80%、さらにより好ましくは少なくとも90%、特に好ましくは少なくとも94%、最も好ましくは少なくとも96%または特に好ましくは少なくとも98%のエナンチオマー過剰(ee)の(S)-アミンを含む組成物の製造方法である。
提供されるアミン受容体分子の好ましい実施態様、及び、a)提供されるアミン供与体分子の好ましい実施態様と、b)アミンの製造のための本発明の工程で提供されるべきアミン供与体分子の好ましい実施態様と、b)で提供されるべき量の好ましい実施態様に関して本明細書で定義されていることは、それぞれ、(S)-アミンがその(R)-アミンよりもエナンチオマー過剰で含む組成物の製造方法において、段階a)のアミン受容体分子とb)のアミン供与体分子に相応に適用可能である。しかしながら、工程b)において、その(それぞれの)(R)-アミンよりもエナンチオ過剰の(S)-アミンを含む組成物の製造方法において提供されるアミン供与体分子がキラル分子である場合、少なくとも、アミン供与体の(S)-立体異性体を含むエナンチオマー混合物が提供され、好ましくは、アミン供与体のラセミ混合物が提供されることは自明である。経済的コストの観点から入手可能かつ実行可能であれば、キラルアミン供与体は、(S)-立体異性体がエナンチオマー過剰である混合物で提供することができ、より好ましくは、アミン供与体は、高いエナンチオマー過剰で(S)-立体異性体を含む組成物として提供することができ、その場合、高いエナンチオマー過剰は、少なくとも30%、より好ましくは少なくとも40%、さらにより好ましくは少なくとも60%、さらにより好ましくは少なくとも80%、さらに好ましくは少なくとも90%、特に好ましくは少なくとも94%、最も好ましくは少なくとも96%または特に好ましくは少なくとも98%のエナンチオマー過剰を意味する。
アミンの生産のための本発明の工程c)に関連する、溶液、水溶液、有機溶媒を含む水溶液、緩衝系、pH値および/または温度、タンパク質の形態(粗細胞抽出物、部分精製タンパク質、精製タンパク質、生きているまたは生きていない宿主細胞の成分として存在するタンパク質、(さらなる)処理された宿主細胞、宿主細胞のスプレー乾燥)、タンパク質の量およびPLPの存在および量について好ましい実施形態として本明細書で記載されていることは、本発明の工程c)に従って、(S)-アミンをその(それぞれの)(R)-アミンよりもエナンチオマー過剰で含む組成物の製造方法に適用可能である。
アミンの製造のための本発明による方法の工程d)の好ましい実施形態に関して上記で定義されたことは、その(それぞれの)(R)-アミンよりもエナンチオマー過剰の(S)-アミンを含む組成物の製造方法の工程d)に適用可能である。
アミンの製造のための本発明の方法の工程d)に関して定義されたことに加えて、好ましくは、(S)-アミンを、少なくとも40%、より好ましくは少なくとも70%、さらに好ましくは少なくとも80%、さらにより好ましくは少なくとも90%、さらに好ましくは少なくとも95%、特に好ましくは少なくとも97%、最も好ましくは少なくとも98%または特に好ましくは少なくとも99%のエナンチオマー過剰量で含む組成物が、(S)-アミンをその(R)-アミンよりもエナンチオマー過剰量で含む組成物の製造方法の工程d)において得られる。
本発明のタンパク質はまた、(R)-および(S)-アミン立体異性体を含む組成物から立体異性体を減少または除去する方法に用いることができる。(R)-および(S)-アミン異性体を含む組成物から立体異性体を減少または除去するときに、本発明のタンパク質によって触媒される反応は、一般式(Ia)に従う。アミンの合成反応((式(I)参照)と比較して、アミノ供与体とアミノ受容体は、(R)-および(S)-アミンを含む組成物から立体異性体を減少または除去する反応において相互に交換され得ることがわかる(式(Ia)参照)。式(Ia)による反応は、特定の立体異性体が、異なる立体異性体を含む組成物に富み、言い換えれば、特定の立体異性体が組成物から除去され得るという利点を有し、ときにはエナンチオマー混合物を分割するものとしても当技術分野で指摘されている。これらの方法は、化合物がラセミ体の混合物を一般的にもたらす化学合成によって生産される場合に特に重要である。そのような化合物の化学合成は、プロセス経済または他の理由の観点から、望まれる製造工程であり得る。しかし、化学的に生成されたエナンチオマーの分離は、困難であり、高価であり、また不可能でさえあるかもしれない。本発明によるタンパク質は、このような化学的に製造されたラセミ混合物から立体異性体を選択的に除去するために使用することができる。
したがって、本発明のさらなる実施形態は、(R)-アミンおよび(S)-アミンを含む組成物中のアミンエナンチオマーの量を減少させるための方法を含み、該方法は、以下の工程を含む;
a) (R)-アミンおよび(S)-アミンエナンチオマーを含む組成物を提供し;
b) アミン受容体分子を提供し;
c) 工程a)で提供される組成物および工程b)で提供されるアミン受容体と本発明のタンパク質とを接触し;
d) 任意に、工程a)で提供される組成物中に存在する量と比較してアミンエナンチオマーの量が減少する組成物を得る。
a) (R)-アミンおよび(S)-アミンエナンチオマーを含む組成物を提供し;
b) アミン受容体分子を提供し;
c) 工程a)で提供される組成物および工程b)で提供されるアミン受容体と本発明のタンパク質とを接触し;
d) 任意に、工程a)で提供される組成物中に存在する量と比較してアミンエナンチオマーの量が減少する組成物を得る。
(R)-アミン及び(S)-アミンを含む組成物中のアミンエナンチオマーの量を減少させる方法において、少なくとも1つの(S)-アミン及び1つの(R)-アミン分子が存在する限り、これらの方法の各々の工程a)で提供される組成物中に、構造的に何個の異なる(R)-アミン及び(S)-アミン分子が存在するかは決定的ではない。
(R)-および(S)-アミンを含む組成物中のアミンエナンチオマーの量を減少させるための方法の段階a)で提供される(R)-および(S)-アミンを含む組成物は、少なくとも1つの(R)-アミンおよび少なくとも1つの(S)-アミンを含み、ここで、少なくとも1つの(R)-アミンおよび少なくとも1つの(S)-アミンは同じ分子の立体異性体であり得、または、少なくとも1つの(R)-アミンおよび少なくとも1つの(S)-アミンは、構造的に異なる分子からの立体異性体であり得る。
(R)-アミンおよび(S)-アミンを含む組成物中のアミンエナンチオマーの量を減少させる方法の好ましい実施形態は、脂肪族アミン(直鎖、分枝鎖または環状アルカンアミン、アルケンアミン、アルキンアミンを含むがこれらに限定されない)のエナンチオマーの量を減少させる方法であるか、またはアリールアミンのエナンチオマーの量を減少させる方法であるか、またはアミノ酸のエナンチオマーの量を減少させる方法であり、より好ましくは、α-アミノ酸のエナンチオマーの量を減少させる方法であり、さらにより好ましくは、分岐鎖α-アミノ酸のエナンチオマー、芳香族α-アミノ酸のエナンチオマーまたは置換フェニル基を含む芳香族α-アミノ酸のエナンチオマーの量を減少させる方法であり、最も好ましくは、ノルバリン、ロイシン、フェニルアラニンまたはチロシンから選択されるアミノ酸のエナンチオマーの量を減少させる方法である。
本発明によるさらなるアミノ酸改変を含むω-TA変異体に関して、(R)-アミンおよび(S)-アミンを含む組成物中のアミンエナンチオマーの量を減少させるための本発明による方法は、好ましくは、脂肪族アミン(直鎖、分枝鎖または環状のアルカンアミン、アルケンアミン、アルキンアミンを含むリンを含むがこれらに限定されない)を含むリンのエナンチオマーの量を減少させるための方法であるか、または、アリールアミンを含むリンのエナンチオマーの量を減少させるための方法であるか、または、アミノ酸を含むリンのエナンチオマーの量を減少させるための方法であり、より好ましくは、α-アミノ酸を含むリンのエナンチオマーの量を減少させるための方法であり、さらに好ましくは、分枝鎖α-アミノ酸を含むリンのエナンチオマー、芳香族α-アミノ酸を含むリンのエナンチオマーまたは置換フェニル基を含む芳香族α-アミノ酸を含むリンのエナンチオマー量を減少させるための方法であり、よりさらに好ましくは、α-アミノ酸を含むリンのエナンチオマーの量を減少させる方法であり、よりさらにもっと好ましくは、メチル置換リンを含むα-アミノ酸のエナンチオマーの量を減少させる方法であり、最も好ましくはグルホシネートのエナンチオマーの量を減少させる方法である。
アミンの生産のための本発明の工程c)に関連する、溶液、水溶液、有機溶媒を含む水溶液、緩衝系、pH値および/または温度、タンパク質の形態(粗細胞抽出物、部分精製タンパク質、精製タンパク質、生きているまたは生きていない宿主細胞の成分として存在するタンパク質、(さらなる)処理された宿主細胞、宿主細胞のスプレー乾燥)、タンパク質の量およびPLPの存在および量について好ましい実施形態として本明細書で定義されていることは、本方法の工程c)に従って、(R)-アミンおよび(S)-アミンを含む組成物中のアミンエナンチオマーの量を減少させる方法に適用できる。
アミンの製造のための本発明による方法の工程d)の好ましい実施形態に関して本明細書中で上記に定義されていることは、工程d)にしたがって、(R)-アミンおよび(S)-アミンを含む組成物中のアミンエナンチオマーの量を減少させるための方法に適用可能である。
本発明によるタンパク質は、特に、(R)-アミンおよび(S)-アミン立体異性体を含む組成物から(S)-エナンチオマーの量を、減少、または実質的またはほぼ完全に除去する方法に使用することができ、それにより、(R)-アミンがエナンチオマー過剰に存在する組成物を生成する。(S)-選択的ω-TAによるエナンチオマー的に富化された又はほぼエナンチオマー的に純粋なアミンの製造のための方法において触媒されるそれぞれの反応は、一般式(II)によって説明することができる。
生物活性を有する多くの化合物は、医薬のように、農業に使用される活性化合物、補助食品添加物、飼料添加物などがエナンチオマーとして存在する。大多数の場合、一方のエナンチオマーのみが所望の生物学的活性を示し、他方のエナンチオマーは不活性であるか、しばしば望ましくない副作用さえ示す。現在、生物学的活性を有し、医薬として使用されている多くの化合物、農業分野において補助的な食品または飼料添加物(例えば、アミノ酸)は、ラセミ体の混合物としてのみ入手可能であるという欠点を有する化学合成によってのみ、生産され得るか経済的に実行可能な条件下でのみ生産され得る。本発明によるタンパク質は、そのようなラセミ混合物から(S)-アミンの量を、部分的に、有意に、またはほぼ完全に除去することができるという利点を提供し、組成物が、生物学的活性エナンチオマーを含むか、または生物学的活性エナンチオマーの製造プロセスにおいて使用するための前駆体を含むか、または組成物中にその生物学的活性エナンチオマーまたは前駆体を含むが、不活性エナンチオマーをほとんど含まず得られるという利点を有する。これにより、医薬品、農業に使用される製品、または補助食品もしくは飼料添加物を含む製品における副作用が軽減される。
好ましい実施形態において、(R)-アミン及び(S)-アミンエナンチオマーを含む組成中のアミンエナンチオマーの量を減少させる方法は、(R)-アミン及び(S)-アミンを含む組成中の(S)-アミンエナンチオマーの量を減少させる方法であり、該方法は;
a) (R)-アミンおよび(S)-アミンを含む組成物を提供し;
b) アミン受容体分子を提供し;
c) 工程a)で提供される組成物および工程b)で提供されるアミン受容体分子と本発明によるタンパク質とを接触させ;
d) 任意に、(S)-アミンエナンチオマーの量が、工程a)で提供される組成物中に存在する量と比較して減少した組成物を得る、工程を含む。
a) (R)-アミンおよび(S)-アミンを含む組成物を提供し;
b) アミン受容体分子を提供し;
c) 工程a)で提供される組成物および工程b)で提供されるアミン受容体分子と本発明によるタンパク質とを接触させ;
d) 任意に、(S)-アミンエナンチオマーの量が、工程a)で提供される組成物中に存在する量と比較して減少した組成物を得る、工程を含む。
(R)-および(S)-アミンエナンチオマーを含む組成物中の(S)-アミンエナンチオマーの量を減少させる方法の好ましい実施形態は、脂肪族(S)-アミン(直鎖、分枝鎖または環状のアルカン(S)-アミン、アルケン(S)-アミン、アルキン(S)-アミン)の量を減少させる方法であるか、またはアリール(S)-アミンの量を減少させる方法であるかまたは(S)アミノ酸の量を減少させる方法であり、(S)-α-アミノ酸の量を減少させる方法がより好ましく、よりさらに好ましくは、分枝鎖(S)-α-アミノ酸、芳香族(S)-α-アミノ酸または置換フェニル基を含む芳香族(S)-α-アミノ酸の量を減少させる方法であり、最も好ましくは、(S)-ノルバリン、(S)-ロイシン、(S)-フェニルアラニン又は(S)-チロシンから選択されるアミノ酸の量を減少させる方法である。
本発明のさらなるアミノ酸改変体を含むω-TA変異体に関して、(R)-および(S)-アミンを含む組成物中の(S)-アミンエナンチオマーの量を減少させるための本発明の方法は、好ましくは、脂肪族(S)-アミン(直鎖、分枝鎖または環状のアルカン(S)-アミン、アルケン(S)-アミン、アルキン(S)-アミンを含むリンを含むがこれらに限定されない)を含むリンの量を減少させるための方法であり、または、アリール(S)-アミンを含むリンの量を減少させるための方法であるか、または、(S)-アミノ酸を含むリンの量を減少させるための方法であり、より好ましくは、(S)-α-アミノ酸を含むリンの量を減少させるための方法であり、さらに好ましくは、分枝鎖(S)-α-アミノ酸を含むリン、芳香族(S)-α-アミノ酸を含むリンまたは置換フェニル基を含む芳香族(S)-α-アミノ酸を含むリンのエナンチオマー量を減少させるための方法であり、
よりさらに好ましくは、(S)-α-アミノ酸を含む置換リンの量を減少させるための方法であり、よりさらにもっと好ましくはメチル置換リンを含む(S)-α-アミノ酸の量を減少させる方法であり、最も好ましくは(S)-グルホシネートの量を減少させる方法である。
よりさらに好ましくは、(S)-α-アミノ酸を含む置換リンの量を減少させるための方法であり、よりさらにもっと好ましくはメチル置換リンを含む(S)-α-アミノ酸の量を減少させる方法であり、最も好ましくは(S)-グルホシネートの量を減少させる方法である。
好ましくは、(R)-アミンおよび(S)-アミンを含む組成物中のアミンエナンチオマーの量を減少させるための方法、または(R)-アミンおよび(S)-アミンを含む組成物中の(S)-アミンエナンチオマーの量を減少させるための方法の各段階a)で提供される(R)-アミンおよび(S)-アミンを含む組成物は、脂肪族(R)-および(S)-アミン(直鎖、分枝鎖または環状のアルカン(R)-および(S)-アミン、アルケン(R)-および(S)-アミン、アルキン(R)-および(S)-アミンを含むがこれらに限定されない)、または、アリール(R)-および(S)-アミン、または(R)-および(S)-アミノ酸からなる群から選択される(R)-アミンおよび/または(S)-アミンを含み、より好ましくは、(R)-および(S)-α-アミノ酸であり、さらにより好ましくは、分枝鎖(R)-および(S)-α-アミノ酸、芳香族(R)-および(S)-α-アミノ酸または置換フェニル基を含む芳香族(R)-および(S)-α-アミノ酸であり、最も好ましくは、アミノ酸である(R)-および(S)-ノルバリン、(R)-および(S)-ロイシン、(R)-および(S)-フェニルアラニンまたは(R)-および(S)-チロシンである。
さらなるアミノ酸変異を含む本発明のω-TA変異体に関して、好ましくは(R)-アミンおよび(S)-アミンを含む組成物中のアミンエナンチオマーの量を減少させるための方法、または(R)-アミンおよび(S)-アミンを含む組成物中の(S)-アミンエナンチオマーの量を減少させるための方法のそれぞれ工程a)で提供される(R)-アミンおよび(S)-アミンを含む組成物は、脂肪族(R)および(S)-アミン(直鎖、分枝鎖または環状のアルカン(R)-および(S)-アミン、アルケン(R)-および(S)-アミン、アルキン(R)-および(S)-アミンを含むリンを含むがこれらに限定されない)を含むリン、または、アリール(R)および(S)-アミンを含むリン、または(R)-および(S)-アミノ酸を含むリンからなる群から選択される(R)-アミンおよび/または(S)-アミンを含み、より好ましくは、(R)-および(S)-α-アミノ酸を含むリンであり、さらにより好ましくは、分枝鎖(R)-および(S)-α-アミノ酸を含むリン、芳香族(R)-および(S)-α-アミノ酸を含むリンまたは置換フェニル基を含む芳香族(R)-および(S)-α-アミノ酸を含むリンであり、よりさらに好ましくは、(R)-および(S)-α-アミノ酸を含む置換リンであり、よりさらにもっと好ましくは、メチル置換リンを含む(R)-および(S)-α-アミノ酸であり、最も好ましくは(R)-および(S)-グルホシネートである。
より好ましくは、(R)-および(S)-アミンを含む組成物中のアミンエナンチオマーの量を減少させるための方法、または(R)-および(S)-アミンを含む組成物中の(S)-アミンエナンチオマーの量を減少させるための方法の各工程a)で提供される組成物は、
同じ分子の(R)-および(S)-アミンを含み、
より好ましくは、脂肪族(R)および(S)-アミン(直鎖、分枝鎖または環状のアルカン(R)-および(S)-アミン、アルケン(R)-および(S)-アミン、アルキン(R)-および(S)-アミンを含むがこれらに限定されない)、または、アリール(R)-および(S)-アミン、または(R)-および(S)-アミノ酸からなる群から選択される単一の化合物のエナンチオマーを表す(R)および(S)-アミンを含み、
より好ましくは、(R)-および(S)-α-アミノ酸、さらにより好ましくは分枝鎖(R)-および(S)-α-アミノ酸、芳香族(R)-および(S)-α-アミノ酸または置換フェニルを含む芳香族(R)-および(S)-α-アミノ酸であり、最も好ましくは、アミノ酸である(R)-および(S)-ノルバリン、(R)-および(S)-ロイシン、(R)-および(S)-フェニルアラニンまたは(R)-および(S)-チロシンである。
同じ分子の(R)-および(S)-アミンを含み、
より好ましくは、脂肪族(R)および(S)-アミン(直鎖、分枝鎖または環状のアルカン(R)-および(S)-アミン、アルケン(R)-および(S)-アミン、アルキン(R)-および(S)-アミンを含むがこれらに限定されない)、または、アリール(R)-および(S)-アミン、または(R)-および(S)-アミノ酸からなる群から選択される単一の化合物のエナンチオマーを表す(R)および(S)-アミンを含み、
より好ましくは、(R)-および(S)-α-アミノ酸、さらにより好ましくは分枝鎖(R)-および(S)-α-アミノ酸、芳香族(R)-および(S)-α-アミノ酸または置換フェニルを含む芳香族(R)-および(S)-α-アミノ酸であり、最も好ましくは、アミノ酸である(R)-および(S)-ノルバリン、(R)-および(S)-ロイシン、(R)-および(S)-フェニルアラニンまたは(R)-および(S)-チロシンである。
さらにアミノ酸変異を含む本発明のω-TA変異体に関して、好ましくは、(R)-および(S)-アミンを含む組成物中のアミンエナンチオマーの量を減少させるための方法、または(R)-および(S)-アミンを含む組成物中の(S)-アミンエナンチオマーの量を減少させるための方法の各工程a)において提供される(R)-および(S)-アミンを含む組成物は、同じ分子の(R)-および(S)-アミンを含み、
より好ましくは、脂肪族(R)-および(S)-アミンを含むリン(直鎖、分枝鎖または環状のアルカン(R)-および(S)-アミン、アルケン(R)-および(S)-アミン、アルキン(R)-および(S)-アミンを含むリンを含むがこれらに限定されない)、または、アリール(R)-および(S)-アミンを含むリン、または(R)-および(S)-アミノ酸を含むリンからなる群から選択される単一の化合物のエナンチオマーを表す(R)-および(S)-アミンを含み、より好ましくは、(R)-および(S)-α-アミノ酸を含むリン、さらにより好ましくは分枝鎖(R)-および(S)-α-アミノ酸を含むリン、芳香族(R)-および(S)-α-アミノ酸を含むリンまたは置換フェニル基を含む(R)-および(S)-α-アミノ酸を含むリンであり、よりさらに好ましくは、(R)-および(S)-α-アミノ酸を含む置換リンであり、よりさらにもっと好ましくはメチル置換リンを含む(R)-および(S)-α-アミノ酸、最も好ましくは(R)-および(S)-グルホシネートである。
より好ましくは、脂肪族(R)-および(S)-アミンを含むリン(直鎖、分枝鎖または環状のアルカン(R)-および(S)-アミン、アルケン(R)-および(S)-アミン、アルキン(R)-および(S)-アミンを含むリンを含むがこれらに限定されない)、または、アリール(R)-および(S)-アミンを含むリン、または(R)-および(S)-アミノ酸を含むリンからなる群から選択される単一の化合物のエナンチオマーを表す(R)-および(S)-アミンを含み、より好ましくは、(R)-および(S)-α-アミノ酸を含むリン、さらにより好ましくは分枝鎖(R)-および(S)-α-アミノ酸を含むリン、芳香族(R)-および(S)-α-アミノ酸を含むリンまたは置換フェニル基を含む(R)-および(S)-α-アミノ酸を含むリンであり、よりさらに好ましくは、(R)-および(S)-α-アミノ酸を含む置換リンであり、よりさらにもっと好ましくはメチル置換リンを含む(R)-および(S)-α-アミノ酸、最も好ましくは(R)-および(S)-グルホシネートである。
好ましくは、(R)-アミンおよび(S)-アミンを含む組成物中のアミンエナンチオマーの量を減少させるための各方法、または(R)-アミンおよび(S)-アミンを含む組成物中の(S)-アミンエナンチオマーの量を減少させるための方法の工程b)で提供されるアミン受容体分子は、アミン供与体としてのアミンの製造方法の上記各工程b)で提供されるアミン供与体分子として記載されている構造に対応する構造であり、但し、アミンの製造方法の工程b)で上記に提供されるアミノ供与体分子として記載される分子のようなアミノ基は、カルボニル基に置き換えられる。一例として、工程(b)で提供されるアミン供与体分子として記載されているイソプロピルアミンのアミノ基をカルボニル基に置き換えることは、(R)-アミンおよび(S)-アミンを含む組成物中のアミンエナンチオマーの量を減少させる方法、または(R)-アミンおよび(S)-アミンを含む組成物中の(S)-アミンエナンチオマーの量を減少させるそれぞれの方法の、工程b)で使用される対応するアミン受容体分子アセトンに導かれる。
(R)-アミンおよび(S)-アミンを含む組成物中のアミンエナンチオマーの量を減少させる方法、または(R)-アミンおよび(S)-アミンを含む組成物中の(S)-アミンエナンチオマーの量を減少させる方法の各々の工程b)で提供される最も好ましいアミン受容体分子は、アセトンである。
アミンの生産のための本発明の工程c)に関連して、溶液、水溶液、有機溶媒を含む水溶液、緩衝系、pH値および/または温度、タンパク質の形態(粗細胞抽出物、部分精製タンパク質、精製タンパク質、生きているまたは生きていない宿主細胞の成分として存在するタンパク質、(さらなる)処理された宿主細胞、宿主細胞のスプレー乾燥)、タンパク質の量およびPLPの存在および量について好ましい実施形態として本明細書で定義されていることは、本方法の工程c)に応じて、(R)-アミンおよび(S)-アミンを含む組成物中の(S)-アミンエナンチオマーの量を減少させる方法に適用できる。
アミンの製造のための本発明による方法の工程d)の好ましい実施形態に関して本明細書中で上記に定義されたことは、本方法の工程d)に応じて、(R)-アミンおよび(S)-アミンを含む組成物中の(S)-アミンエナンチオマーの量を減少させるための方法に適用可能である。
本発明のさらなる実施態様は、アミンの製造、好ましくは(S)-アミンの製造のための本発明によるタンパク質の使用である。
アミンの量、好ましくはエナンチオマー混合物中の(S)-アミンの量を減少させるための本発明によるタンパク質の使用もまた、本発明の実施形態である。
本発明による宿主細胞において本発明によるタンパク質を発現させるための本発明による核酸分子の使用もまた、本発明の実施形態である。
本発明の別の実施形態は、本発明による核酸分子、本発明による組換え核酸分子、本発明によるプラスミド、または本発明によるベクターの使用、本発明による宿主細胞の形質転換もしくは遺伝的改変、または本発明によるタンパク質の生産に関する。
アミンの製造のため、またはアミンの量、好ましくはエナンチオマー混合物中の(S)-アミンの量を減少させるための本発明による宿主細胞の使用もまた、本発明の実施形態である。
配列の説明
本出願を通じて、以下のIUPACコードに従って、ヌクレオチド及びアミノ酸の略号を使用する:
本出願を通じて、以下のIUPACコードに従って、ヌクレオチド及びアミノ酸の略号を使用する:
アミノ酸とヌクレオチドの識別のために、上表に示した大文字のヌクレオチドコード略号を、ここでは小文字で記す。
コドンの使用は、以下の表に従って、いわゆる「一般的遺伝コード」に従う。ここで、「t」はリボ核酸(RNA)配列中の「u」によって置換されるべきである。「TLC」はアミノ酸の3文字コードおよび「SLC」はアミノ酸の単一文字コードのための「SLC」を表す。
配列番号1:配列番号3に示されるアミノ酸配列の逆翻訳によって得られるBacillus megaterium由来のω-トランスアミナーゼ(ω-TA)をコードする核酸配列であって、逆翻訳は一般的な遺伝コードの縮重による翻訳の原理に従う。6個のHisアミノ酸をコードする1432~1449位のヌクレオチドを、1450~1452位に位置する終止コドンの前のBacillus megaterium由来の配列に挿入した。
配列番号2:配列番号3に示すアミノ酸配列を有するBacillus megaterium由来のω-TAをコードする核酸配列。6個のHisアミノ酸をコードする1432位から1449位のヌクレオチドを、1450~1452位に位置する停止コドンの前のBacillus megaterium由来の配列に挿入した。
配列番号3:受託番号5G09_Aの下のGenPept(PDB)に由来するBacillus megaterium由来ω-TAのアミノ酸配列。示されるアミノ酸は、配列番号1および2に示されている核酸配列によってコードされている。478~483位の6個のHisアミノ酸を、配列修飾によりBacillus megaterium由来の配列に挿入した。
配列番号4:配列番号6に示されるアミノ酸配列の逆翻訳によって得られるArthrobacter sp.由来のω-TAをコードする核酸配列であって、逆翻訳は、一般的な遺伝コードの縮重による翻訳の原理に従う。
配列番号5:配列番号6に示すアミノ酸配列を有するArthrobacter sp.由来のω-TAをコードする核酸配列。6個のHisアミノ酸をコードする1438~1455位のヌクレオチドを、1456~1458位に位置する終止コドンの前のArthrobacter sp.由来の配列に挿入した。
配列番号6:受託番号5G2P_Aの下のGenPept(PDB)に由来するArthrobacter sp.由来ω-TAのアミノ酸配列。示されているアミノ酸は、配列番号4および5に示されているように、核酸配列によってコードされている。480~485位の6個のHisアミノ酸を、配列改変によりArthrobacter sp.由来の配列に挿入した。
配列番号7:配列番号9に示されるアミノ酸配列の逆翻訳により得られるBacillus sp.(土壌76801D1)由来のω-TAをコードする核酸配列であり、ここで、逆翻訳は、一般的な遺伝コードの縮重による翻訳の原理に従う。
配列番号8:Bacillus sp.(GenBankアクセス番号LMTA01000079.1から派生可能な土壌76801D1)由来のω-TAをコードする核酸配列。
配列番号9:Bacillus sp.(Bacillus No.KRF52528.1のもとでGenPept(PDB)から派生した土壌76801D1から導出される)からのω-TAのアミノ酸配列。示されるアミノ酸は、上述の配列番号7および8に示される核酸配列によってコードされている。
配列番号10:配列番号12に示されるアミノ酸配列の逆翻訳によって得られる、Arthrobacter sp.由来の変異ω-TAをコードする核酸配列であって、逆翻訳は、一般的な遺伝コードの縮重による翻訳の原理に従う。
配列番号11:配列番号12に示されるアミノ酸配列を有するArthrobacter sp.由来の変異ω-TA変異体をコードする核酸配列。配列は、WO2006/063336A2の配列番号15から導き出される。
配列番号12:WO2006/06336A2の配列番号16に由来するArthrobacter sp.由来の変異ω-TAのアミノ酸配列。示されるアミノ酸は、上述の配列番号11および12に示される核酸配列によってコードされている。
配列番号13:配列番号15に示されるアミノ酸配列の逆翻訳によって得られる、Arthrobacter sp.由来の野生型ω-TAをコードする核酸配列であり、逆翻訳は、一般的な遺伝コードの縮重による翻訳の原理に従う。
配列番号14:配列番号15に示すアミノ酸配列を有するArthrobacter sp.由来の野生型ω-TAをコードする核酸配列。配列は、WO2006/063336A2の配列番号1から導き出される。
配列番号15:WO2006/06336A2の配列番号2に由来するArthrobacter sp.由来の野生型ω-TAのアミノ酸配列。示されるアミノ酸は、上述の配列番号13および14に示される核酸配列によってコードされている。
配列番号16:配列番号18に示されるアミノ酸配列の逆翻訳によって得られる改良されたω-TAをコードする核酸配列であり、逆翻訳は、一般的な遺伝コードの縮重による翻訳の原理に従う。
配列番号17:配列番号18に示すアミノ酸配列を有する改良されたω-TAをコードする核酸配列。
配列番号18:改良されたω-TAのアミノ酸配列であり、改良は、配列番号3および9に示されるBacillus megaterium由来のアミノ酸配列と比較して、および配列番号6、12および15に示されるArthrobacter sp.由来のアミノ酸配列と比較して、アミノ酸置換により得られる。
配列番号19:Rhodotorula toruloides(同義語:Rhodotorula gracilis)由来のD-アミノ酸オキシダーゼ(DAO1)遺伝子の核酸コード配列。
配列番号20:配列番号19に示されるコード配列から得られるD-アミノ酸オキシダーゼ(DAO1)の活性を有するタンパク質のアミノ酸配列。
配列番号21:Rhodotorula toruloides由来の核酸配列と比較して、160-162位のヌクレオチドにより同定されたコドン、および172-174位のヌクレオチドにより同定されたコドン、および637-639位のヌクレオチドにより同定されたコドンについて、ヌクレオチド置換(置換)を含む、Rhodotorula toruloides由来のD-アミノ酸オキシダーゼ(DAO1)遺伝子の変異体の核酸コード配列。
配列番号22:配列番号21に示されるコード配列から得られるD-アミノ酸オキシダーゼの活性を有するタンパク質のアミノ酸配列。アミノ酸配列は、Rhodotorula toruloides由来の核酸配列と比較して、54位、58位および213位にアミノ酸置換(置換)を含み、配列番号21に示されるアミノ酸配列と比較して、したがって、DAAO変異体(突然変異体)のアミノ酸配列である。
配列番号23:Listeria seeligeri由来のカタラーゼ遺伝子の核酸コード配列。
配列番号24:配列番号23に示すコード配列から得られるカタラーゼの活性を有するタンパク質のアミノ酸配列。
配列番号25:カタラーゼの活性を有する配列番号24に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸配列。
配列番号26:図1の「lacオペレーター」と名づけられた遺伝子要素の核酸配列。
配列番号27:図1の「Trcプロモーター」と名づけられた遺伝子要素の核酸配列。
配列番号28:図1の「rrnB」と名づけられた遺伝子要素の核酸配列。
配列番号29:図1の「シストロン」と名づけられた遺伝子要素の核酸配列。
配列番号30:図1の「rrnBターミネーター」と名づけられた遺伝子要素の核酸配列。
トリ-シストロン性RNAの転写と翻訳に関与する調節性遺伝子要素の略語への説明:
lacオペレーター:Ullmann,2001,Encyclopedia of Life Sciences,John Wiley&Sons,Ltd,ISBN:9780470015902;Ullmann,2009,Encyclopedia of Life Sciences(ELS),John Wiley&Sons,Ltd:Chichester.DOI:10.1002/9780470015902.a0000849.pub2;配列番号26に示される核酸配列からなる。
Trcプロモーター:E.coli trpおよびlacUV5プロモーターに由来する合成プロモーター(Brosiusら、1985、J Biol Chem 260、3539-3541);配列番号27に示される核酸配列からなる。
rrnB:RhoI非依存性転写終結シグナル(Pfeiffer&Hartmann,1997,J Mol Biol.265(4)385-393;Oroszら、1991,Eur J Biochem.201(3),653-659);配列番号28に示される核酸配列からなる。
t7エンハンサー:t7遺伝子からの転写増強配列。(使用した配列:ttaacttta)。
RBS1:リボソーム結合部位(配列:gaggt)。
シストロン:転写終結配列;配列番号29に示される核酸配列からなる。
RBS2:リボソーム結合部位(使用配列:aaggag)。
boxA:転写抗転写終結配列(使用配列:tgctctttaacaa)。
シストロン:配列番号29に示される核酸配列からなる合成シストロン。
rrnBターミネーター:転写終結シグナル;配列番号30に示される核酸配列からなる。
T2ターミネーター:翻訳終結シグナル(Oroszら、1991、Eur J Biochem.201(3)、653-659)。
lacオペレーター:Ullmann,2001,Encyclopedia of Life Sciences,John Wiley&Sons,Ltd,ISBN:9780470015902;Ullmann,2009,Encyclopedia of Life Sciences(ELS),John Wiley&Sons,Ltd:Chichester.DOI:10.1002/9780470015902.a0000849.pub2;配列番号26に示される核酸配列からなる。
Trcプロモーター:E.coli trpおよびlacUV5プロモーターに由来する合成プロモーター(Brosiusら、1985、J Biol Chem 260、3539-3541);配列番号27に示される核酸配列からなる。
rrnB:RhoI非依存性転写終結シグナル(Pfeiffer&Hartmann,1997,J Mol Biol.265(4)385-393;Oroszら、1991,Eur J Biochem.201(3),653-659);配列番号28に示される核酸配列からなる。
t7エンハンサー:t7遺伝子からの転写増強配列。(使用した配列:ttaacttta)。
RBS1:リボソーム結合部位(配列:gaggt)。
シストロン:転写終結配列;配列番号29に示される核酸配列からなる。
RBS2:リボソーム結合部位(使用配列:aaggag)。
boxA:転写抗転写終結配列(使用配列:tgctctttaacaa)。
シストロン:配列番号29に示される核酸配列からなる合成シストロン。
rrnBターミネーター:転写終結シグナル;配列番号30に示される核酸配列からなる。
T2ターミネーター:翻訳終結シグナル(Oroszら、1991、Eur J Biochem.201(3)、653-659)。
一般的方法
1. ω-TA変異体および更なるアミノ酸変異を有するω-TA変異体の産生
本明細書に記載されているω-TA活性を有するタンパク質をコードする本明細書に記載されている既知のヌクレオチド配列は、ユーロフィンゲノミクスGmbH(ユーロフィンゲノミクスGmbH、Anzinger Str.7a、85560エベルスベルグ、ドイツ)によるサービス提供者によって合成された。
1. ω-TA変異体および更なるアミノ酸変異を有するω-TA変異体の産生
本明細書に記載されているω-TA活性を有するタンパク質をコードする本明細書に記載されている既知のヌクレオチド配列は、ユーロフィンゲノミクスGmbH(ユーロフィンゲノミクスGmbH、Anzinger Str.7a、85560エベルスベルグ、ドイツ)によるサービス提供者によって合成された。
配列番号2、5、8、11、14の核酸配列に、核酸置換(置換)を導入した。置換は、核酸配列中のヌクレオチドを置換するのに適切な任意の手段によって、参照ポリペプチドをコードする核酸配列中で行うことができる。これらの方法は文献に広く記載されており、それぞれの配列において熟練者によく知られている。いくつかの分子生物学的方法を用いて、それぞれの核酸置換を達成することができる。本発明による変異核酸配列および対応するタンパク質を調製するための有用な方法は、予め選択された1つ以上のアミノ酸をコードするコドン上で部位特異的変異誘発を行うことを含み、それにより、異なるアミノ酸をコードする方法において選択されたコドンを変更する。これらの部位特異的変異を得る方法は、熟練者に周知であり、文献に広く記載されているか(特に:指向性突然変異誘発:A Practical Approach,1991,Edited by M.J.McPHERSON,IRL PRESS)、または市販キット(例えば、QiagenまたはStratagene由来のQUIKCHANGETM照明突然変異誘発キット)を使用することが可能である。部位特異的変異誘発後、核酸をMG1655において大腸菌スターチンに形質転換した。有利な生体内変換収量を有する変異ポリペプチドを含む細胞を、適切なスクリーニング法を用いて選択した。適切なスクリーニング方法は、ここでは「一般的方法」項目4および7に記載する。改良ポリペプチドをコードする変異核酸配列を配列検証した。配列検証の方法は熟練者によく知られており、文献に広く記載されている(Sambrook and Russell(2012) Molecular Cloning:A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY))。
2. ω-TA変異体の発現ベクター/宿主細胞
野生型ω-TA(配列番号2、5、8、14)または突然変異を含む既知ω-TA(配列番号11)または本明細書に記載のω-TA変異体をコードする核酸配列を、市販のpET22Bベクター(Merck KGaA、Frankfurter Str 250、64293 Darmstadt、ドイツ)にクローニングし、Escherichia coli株BL21DE3細胞で発現させた。
野生型ω-TA(配列番号2、5、8、14)または突然変異を含む既知ω-TA(配列番号11)または本明細書に記載のω-TA変異体をコードする核酸配列を、市販のpET22Bベクター(Merck KGaA、Frankfurter Str 250、64293 Darmstadt、ドイツ)にクローニングし、Escherichia coli株BL21DE3細胞で発現させた。
3. ω-TA変異体の発現
ω-TA変異体をコードするそれぞれの核酸配列を導入したpET22Bベクターを含むEscherichia coli株BL21DE3の前培養を、カルベニシリンを添加した20mlのLB-Mediumを含むフラスコで一夜180rpmの回転振盪機上37℃で増殖させた。ωTAタンパク質の発現は、カルベニシリンを添加した250mlのLB-Mediumを含むフラスコに前培養を移して行った。180rpmの回転振盪器上で37℃での増殖により0.6~0.8のOD(光学密度)に達した後、ω-TAタンパク質の発現を0.5mMのIPTG(最終濃度)の添加により誘導した。誘導細胞培養を、180rpm振盪で20時間20℃でインキュベートした。酵素の精製は、製造業者のプロトコールに従い、Ni-NTA Fast Start Kit of Qiagen(Qiagen GmbH、Qiagen Strasse 1、40724 Hilden)を用いて実施した。
ω-TA変異体をコードするそれぞれの核酸配列を導入したpET22Bベクターを含むEscherichia coli株BL21DE3の前培養を、カルベニシリンを添加した20mlのLB-Mediumを含むフラスコで一夜180rpmの回転振盪機上37℃で増殖させた。ωTAタンパク質の発現は、カルベニシリンを添加した250mlのLB-Mediumを含むフラスコに前培養を移して行った。180rpmの回転振盪器上で37℃での増殖により0.6~0.8のOD(光学密度)に達した後、ω-TAタンパク質の発現を0.5mMのIPTG(最終濃度)の添加により誘導した。誘導細胞培養を、180rpm振盪で20時間20℃でインキュベートした。酵素の精製は、製造業者のプロトコールに従い、Ni-NTA Fast Start Kit of Qiagen(Qiagen GmbH、Qiagen Strasse 1、40724 Hilden)を用いて実施した。
4. アミン受容体およびアミン供与体存在下におけるωTA変異体の活性試験
40μlのトリエタノールアミン緩衝液(脱イオン水中の200mM溶液、pH=9,0)に、10μlのピリドキサールリン酸塩(脱イオン水中の10mM溶液)および10μlのアミノ供与体(脱イオン水中の2M溶液、HCl水溶液の添加によってpH=9,0に調整)を室温で添加した。続いてアミノ受容体(脱イオン水中の100mM溶液)20μlを加えた(アミノ受容体が水に溶けない場合は、比例DMSOを加える)。最後に、20μlのトランスアミナーゼ酵素(1、5mg/ml)を室温で加え、混合物を回転振盪器上で40℃で800rpmで6~7時間インキュベートした。アミノ基転移反応は、反応中に種々の時間間隔で採取したアリコートのHPLC分析によりモニターした。
40μlのトリエタノールアミン緩衝液(脱イオン水中の200mM溶液、pH=9,0)に、10μlのピリドキサールリン酸塩(脱イオン水中の10mM溶液)および10μlのアミノ供与体(脱イオン水中の2M溶液、HCl水溶液の添加によってpH=9,0に調整)を室温で添加した。続いてアミノ受容体(脱イオン水中の100mM溶液)20μlを加えた(アミノ受容体が水に溶けない場合は、比例DMSOを加える)。最後に、20μlのトランスアミナーゼ酵素(1、5mg/ml)を室温で加え、混合物を回転振盪器上で40℃で800rpmで6~7時間インキュベートした。アミノ基転移反応は、反応中に種々の時間間隔で採取したアリコートのHPLC分析によりモニターした。
5. さらなるアミノ酸改変を有するω-TA変異体に使用される発現ベクター/宿主細胞
さらなるアミノ酸改変を有するω-TA変異体についての活性試験は、2つの反応工程を含む方法を使用することによって行った。
さらなるアミノ酸改変を有するω-TA変異体についての活性試験は、2つの反応工程を含む方法を使用することによって行った。
最初の反応段階(段階1)は、ω-TAsのアミン受容体を作成する。この段階は、D-アミノ酸オキシダーゼ(DAAOまたはDAO、EC 1.4.3.3)によって触媒される。DAAOはフラビンアデニンジヌクレオチド(FAD)を含むフラボタンパク質であり、次の一般式(III)に従い、D-アミノ酸の酸素による酸化的脱アミノ化を触媒して、過酸化水素およびアンモニアとともに対応する2-オキソ酸を生成する:
最初の反応段階においてα-2-オキソカルボン酸の生産に用いたDAAOの活性を有するタンパク質は、Rhodosporidium toruloides由来のDAO1タンパク質のDAAO変異体であった。Rhodosporidium toruloides由来の野生型DAO1タンパク質のコード核酸配列は、GenBank acc U6006.1号(配列番号19に示される)に由来し、そして、配列番号19に示される核酸配列によってコードされる対応するアミノ酸配列は、UniProt acc No.P80324(配列番号20に示す)に由来する。本明細書中で使用されるDAAO変異体は、WO2017/151573において、Mutant Ac305として開示されている(36ページ、表1)。配列番号20と比較して、変異体Ac305は、54位および58位および213位にアミノ酸置換(置換体)を含む。変異体Ac305において、配列番号20の54位のアミノ酸NはCで置換(置換)され、配列番号20の58位のアミノ酸FはHで置換(置換)され、配列番号20の213位のアミノ酸MはSで置換(置換)される。変異体Ac305のアミノ酸配列は、配列番号22に示される。配列番号22に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするそれぞれの核酸配列は、配列番号21に示される。工程1の反応は、配列番号22に示されるアミノ酸配列を有するDAAOの活性を有するタンパク質によって触媒された。
第2の反応工程(工程2)では、工程1のDAAOの活性を有するタンパク質によって産生されたα-2-オキソカルボン酸は、アミン供与体の存在下、一般式(I)に従ってω-TA活性を有するタンパク質によってアミノ酸に変換される。
一般式(III)による工程1の記述から明らかなように、DAAOの活性を有するタンパク質によって触媒されるD-アミノ酸のケト酸への転換は、過酸化水素(H2O2)を生成する。H2O2の除去が望まれるかもしれないが、すべての状況で必ずしも必要ではない。H2O2の除去は、本発明に関連して、カタラーゼの活動を有するタンパクを追加することによって達成された。
カタラーゼの活性を有するタンパク質(EC 1.11.1.6;過酸化水素:過酸化水素-酸化物還元酵素)は当該技術分野において公知であり、次の一般式(IV)に従って、過酸化水素(H2O2)の水(H2O)および酸素(O2)への変換を触媒する:
H2O2の除去に使用されるListeria seeligeri由来のカタラーゼの活性を有するタンパク質のアミノ酸配列を、配列番号24の下で示し、かつ、GenePept受託番号WP_012986600.1.の下で利用可能である。配列番号23(GenBank受託番号NC_013891.1に由来)は、配列番号24に示されるアミノ酸配列を有するカタラーゼタンパク質のためのListeria seeligeri由来の核酸コード配列を示す。配列番号25は、配列番号24に示されるアミノ酸配列を有するカタラーゼタンパク質もコードする核酸配列である。配列番号23に示される核酸配列と比較して、配列番号25に示される核酸配列のコドンは、Escherichia coliのコドン使用に適応されている。
DAAOの活性を有するタンパク質、ω-TA活性を有するタンパク質およびカタラーゼの活性を有するタンパク質を産生するために、それぞれの3つのタンパク質をコードする核酸配列を、すべての3つのタンパク質がtrc-プロモーター(trp-およびlacUV5-プロモーター由来の配列から構成されるハイブリッドプロモーター)からのトリシストロンRNAとして単一オペロンから転写されるように、大腸菌発現ベクターにクローニングした。プロモーターからの転写に関する遺伝子の順番は、DAAO(配列番号21)->さらなるアミノ酸改変を含むω-TA変異体をコードする核酸分子(上述の通り)->カタラーゼ(配列番号25)であった。配列番号21は、その5’末端において、アミノ酸配列MARIRLをコードする核酸配列と翻訳的に融合された。
使用される発現ベクターは、pSE420(Addgene,75 Sidney St,Suite550A,Cambridge,MA02139; https://www.addgene.org/vector-database/4064/、または、Thermo Fisher Scientific(Invitrogen)Thermo Fisher Scientific Inc.168 Third Avenue,Waltham,MA02451USA,https://www.thermofisher.com/search/results?query=pSE420&focusarea).)に基づいている。一般に知られている方法により、改変pSE420ベクターに遺伝的エレメントを導入した。使用した発現ベクター中に存在する関連する遺伝子要素を図1に示す。3つの酵素の発現のために、発現ベクターを大腸菌MG1655株細胞に移入した。
6. さらなるアミノ酸改変を含むω-TA変異体の発現
さらなるアミノ酸改変を含むω-TA変異体を、「一般的方法」の項目5に記載されたトリ-シストロン性発現ベクター中にクローン化し、大腸菌MG1655株細胞中で発現させた。このために、カナマイシンを添加したLB-Medium中の20mlの前培養液を、180rpmの回転振盪器上で37℃の振盪フラスコ中で一夜増殖させた。ωTAタンパク質の発現は、前培養物を、カナマイシンを補充した200mlのLB-培地を含有するフラスコに移すことによって行った。ωTAタンパク質の発現は、1mMのIPTG(最終濃度)の添加により0.6~0.8のODに達した後に誘導された。誘導細胞培養を180rpm振盪で20時間20℃でインキュベートした。採取のために、細胞培養物を8000gで4℃で15分間遠心分離し、得られた細胞ペレットを凍結乾燥または噴霧乾燥するまで-80℃で保存した。
さらなるアミノ酸改変を含むω-TA変異体を、「一般的方法」の項目5に記載されたトリ-シストロン性発現ベクター中にクローン化し、大腸菌MG1655株細胞中で発現させた。このために、カナマイシンを添加したLB-Medium中の20mlの前培養液を、180rpmの回転振盪器上で37℃の振盪フラスコ中で一夜増殖させた。ωTAタンパク質の発現は、前培養物を、カナマイシンを補充した200mlのLB-培地を含有するフラスコに移すことによって行った。ωTAタンパク質の発現は、1mMのIPTG(最終濃度)の添加により0.6~0.8のODに達した後に誘導された。誘導細胞培養を180rpm振盪で20時間20℃でインキュベートした。採取のために、細胞培養物を8000gで4℃で15分間遠心分離し、得られた細胞ペレットを凍結乾燥または噴霧乾燥するまで-80℃で保存した。
7. さらなるアミノ酸改変を有するω-TA変異体の活性試験
機械的撹拌器、O2ガス注入管およびpH制御投与ユニットを備えた1リットルの温度調節可能なガラスダブルジャケット付き反応器において、50w%ラセミ(R,S)-グルホシネートアンモニウム水溶液(ラセミ体グルホシネートアンモニウム160,8gに相当)268mlを添加した。pH制御された供給ユニットを介して、2Mイソプロピルアミン水溶液を、機械的撹拌下(250rpm)、pH=9,0に達するまで添加した。2Mイソプロピルアミン水溶液の制御添加により、全反応時間中、pHを一定に保つ。反応器を内温35℃に加熱する。
機械的撹拌器、O2ガス注入管およびpH制御投与ユニットを備えた1リットルの温度調節可能なガラスダブルジャケット付き反応器において、50w%ラセミ(R,S)-グルホシネートアンモニウム水溶液(ラセミ体グルホシネートアンモニウム160,8gに相当)268mlを添加した。pH制御された供給ユニットを介して、2Mイソプロピルアミン水溶液を、機械的撹拌下(250rpm)、pH=9,0に達するまで添加した。2Mイソプロピルアミン水溶液の制御添加により、全反応時間中、pHを一定に保つ。反応器を内温35℃に加熱する。
ビーカー中で、野生型ω-TAタンパク質およびさらなるアミノ酸改変を有するω-TA変異体を発現する図1に記載された発現ベクターを含む噴霧乾燥大腸菌MG1655株細胞8gを、200mgピリドキサールリン酸、2mlポリプロピレングリコール(P2000)および138mlの脱イオン水と混合した。この混合物を、撹拌下(250rpm)、35℃でガラス反応器に添加した。O2ガス注入管を介して、0,1l/分の流速で酸素ガスを気泡化した。混合物を24時間撹拌し、反応中に種々の時間間隔で採取したアリコートのHPLC分析を介して反応進行をモニターした。その後、酸素ガス供給ならびにイソプロピルアミン供給を停止し、反応混合物を、撹拌下(250rpm)、90℃で30分間変性した。残査混合物を室温まで冷却した。
8. ω-TAsにより産生されるアミンの検出
A) アミノ基転移生成物(S)-ノルバリン、(S)-ロイシン、(S)-チロシンおよび(S)-グルホシネートアンモニウムの分析
アミノ基転移反応の経過を、HPLC分析によりモニターした。本研究で使用したHPLC法は、Davankovら(1980,Chromatographia 13(11),677-685)の発表に基づいている。
A) アミノ基転移生成物(S)-ノルバリン、(S)-ロイシン、(S)-チロシンおよび(S)-グルホシネートアンモニウムの分析
アミノ基転移反応の経過を、HPLC分析によりモニターした。本研究で使用したHPLC法は、Davankovら(1980,Chromatographia 13(11),677-685)の発表に基づいている。
カラム:Phenomenex Chirex 3126(D)-ペニシラミン150*4,6mm(Cat.:00F-3126-E0)
流速: 1ml/分
溶出液: A)脱イオン水+0,5g/L CuSO4(v/v)
B)メタノール
A:B=90:10(アイソクラティック)
検出器: DAD 230nm
オーブン: 30℃
ランタイム: 15分
流速: 1ml/分
溶出液: A)脱イオン水+0,5g/L CuSO4(v/v)
B)メタノール
A:B=90:10(アイソクラティック)
検出器: DAD 230nm
オーブン: 30℃
ランタイム: 15分
B) アミノ基転移生成物L-フェニルアラニンの分析:
アミノ基転移反応の経過をHPLC分析によりモニターした。具体的には、以下のHPLCパラメータを用いた:
アミノ基転移反応の経過をHPLC分析によりモニターした。具体的には、以下のHPLCパラメータを用いた:
カラム:Phenomenex Prodigy 3μmODS-3 100A 100*4mm(Cat.:00D-4222-D0)
流速: 2ml/分
溶出液: A)アセトニトリル
B)脱イオン水
7分以内のA:B=5:95からA:B=95:5
検出器: VWDV1 A、210nm
オーブン: 40℃
ランタイム: 9分
流速: 2ml/分
溶出液: A)アセトニトリル
B)脱イオン水
7分以内のA:B=5:95からA:B=95:5
検出器: VWDV1 A、210nm
オーブン: 40℃
ランタイム: 9分
9. 細胞の噴霧乾燥
噴霧乾燥実験は、実験室(ラボスケール)の噴霧乾燥機で行われ、最高温度入力は220℃であった。乾燥機は圧縮空気または窒素を5~8バール下で200~800l/時(リットル/時)使用する。最大風量は、35m3/h(メートル3/時)で到達できる。
噴霧乾燥実験は、実験室(ラボスケール)の噴霧乾燥機で行われ、最高温度入力は220℃であった。乾燥機は圧縮空気または窒素を5~8バール下で200~800l/時(リットル/時)使用する。最大風量は、35m3/h(メートル3/時)で到達できる。
フラスコ培養または発酵材料(すなわち、総容量1リットル)のいずれかから細菌細胞塊を乾燥させるために、遠心分離によって培地を10倍(10倍)濃縮し、遠心分離後に得られた培養上清中で最終容量100mlになるまで再懸濁した。得られた濃縮液はポンピングに適している必要があり、磁気撹拌器により常時混合されるべきである。この液体は、吸引器を100%に設定した500l/hの気流を用いて0.7mmのノズルに適用した。典型的な生成物流量は10ml/分であり、適用温度は、平均して注入口-145℃、排出口85℃であった。その後乾燥バイオマスの重量を測定し、g/lスケールで生物変換実験に用いた。
実施例
1. 2-オキソ吉草酸の(S)-ノルバリンへの変換
配列番号6に示されるアミノ酸配列を有するArthrobacter sp.由来の野生型ω-TAタンパク質、または配列番号3に示されるアミノ酸配列を有するBacillus megaterium由来の野生型ω-TAタンパク質、または配列番号18に示されるアミノ酸配列を有するω-TA変異体を、「一般的方法」項目3に記載されるように発現させ、精製した。
1. 2-オキソ吉草酸の(S)-ノルバリンへの変換
配列番号6に示されるアミノ酸配列を有するArthrobacter sp.由来の野生型ω-TAタンパク質、または配列番号3に示されるアミノ酸配列を有するBacillus megaterium由来の野生型ω-TAタンパク質、または配列番号18に示されるアミノ酸配列を有するω-TA変異体を、「一般的方法」項目3に記載されるように発現させ、精製した。
脱イオン水中の25μlのトリエタノールアミン緩衝液(脱イオン水中の200mM溶液、pH=9.0)に、脱イオン水中の10μlのピリドキサールリン酸塩(PLP)(脱イオン水中の10mM溶液)および脱イオン水中の10μlのイソプロピルアミン(脱イオン水中の2M溶液、HCl水溶液の添加によってpH=9.0に調整)を室温で添加した。続いて、20μlの2-オキソ吉草酸(脱イオン水中の100mM溶液)を加えた。最後に、1.5mg/mlのそれぞれのω-TAタンパク質を含む溶液35μlを室温で添加し、混合物を回転振盪機上で800rpmで6時間40℃でインキュベートした。アミノ基転移反応は、「一般的方法」項目8に記載されているように、反応中に異なる時間間隔で採取したアリコートのHPLC分析によってモニターした。
表6は、配列番号6に示されるアミノ酸配列を有するArthrobacter sp.由来の野生型タンパク質および配列番号3に示されるアミノ酸配列を有するBacillus megaterium由来の野生型タンパク質のものと比較して、配列番号18に示されるアミノ酸配列を有するω-TA変異体について得られた結果を示す。その結果を図2にも示した。
表6の説明:
時間(h)で測定される「時間」は、反応が開始されてからの経過時間を示す。
mAU*sは、ミリ(m)吸光度(A)単位(U)に、秒(s)を乗じた値の略であり、HPLCクロマトグラムにおけるピークの下の面積を表す標準単位である。ピークの下の面積が大きいほど、それぞれの生成物の量は高くなる。
時間(h)で測定される「時間」は、反応が開始されてからの経過時間を示す。
mAU*sは、ミリ(m)吸光度(A)単位(U)に、秒(s)を乗じた値の略であり、HPLCクロマトグラムにおけるピークの下の面積を表す標準単位である。ピークの下の面積が大きいほど、それぞれの生成物の量は高くなる。
表6と図2から導かれるのは、ω-TA変異体が触媒する反応では、2-オキソ吉草酸からの(S)-ノルバリンの生産は、Arthrobacter sp.とBacillus megateriumからの野生型タンパク質が触媒する反応よりも速く進むということである。さらに、ω-TA変異体によって触媒される反応中に生産される(S)-ノルバリンの最大量には、Arthrobacter sp.とBacillus megateriumからの野生型タンパク質によって触媒される反応に比べて、より早い段階で到着する。
2. 4-メチル-2-オキソ吉草酸の(S)-ロイシンへの変換
配列番号3に示されるアミノ酸配列を有するArthrobacter sp.由来の野生型ω-TAタンパク質、または配列番号6に示されるアミノ酸配列を有するBacillus megaterium由来の野生型ω-TAタンパク質、または配列番号18に示されるアミノ酸配列を有するω-TA変異体を、「一般的方法」項目3に記載されるように発現させ、精製した。
配列番号3に示されるアミノ酸配列を有するArthrobacter sp.由来の野生型ω-TAタンパク質、または配列番号6に示されるアミノ酸配列を有するBacillus megaterium由来の野生型ω-TAタンパク質、または配列番号18に示されるアミノ酸配列を有するω-TA変異体を、「一般的方法」項目3に記載されるように発現させ、精製した。
40μlのトリエタノールアミン緩衝液(脱イオン水中の200mM溶液、pH=9,0)に、10μlのピリドキサールリン酸塩(脱イオン水中の10mM溶液)および10μlのイソプロピルアミン(脱イオン水中の2M溶液、HCl水溶液の添加によってpH=9.0に調整)を室温で添加した。続いて、4-メチル-2-オキソ-吉草酸(脱イオン水中100mM溶液)20μlを加えた。最後に、1.5mg/mlのそれぞれのω-TAタンパク質を含む溶液20μlを室温で添加し、混合物を回転振盪機上で800rpmで6時間40℃でインキュベートした。アミノ基転移反応は、「一般的方法」項目8に記載されているように、反応中に異なる時間間隔で採取したアリコートのHPLC分析によってモニターした。
表7は、配列番号3に示されているアミノ酸配列を有するArthrobacter sp.由来の野生型タンパク質および配列番号6に示されているアミノ酸配列を有するBacillus megaterium由来の野生型タンパク質のものと比較して、配列番号18に示されているアミノ酸配列を有するω-TA変異体について得られた結果を示す。その結果を図3にも示した。
表7の説明:表6の説明を参照
表7および図3から、Arthrobacter sp.およびBacillus megaterium由来の野生型酵素は、4-メチル-2-オキソ-吉草酸のアミノ化によって(S)-ロイシンを産生しないが、ω-TA変異体は(S)-ロイシンをかなり効率的に産生することがわかる。
3. フェニルピルビン酸の(S)-フェニルアラニンへの変換
配列番号3に示されるアミノ酸配列を有するArthrobacter sp.由来の野生型ω-TAタンパク質、または配列番号6に示されるアミノ酸配列を有するBacillus megaterium由来の野生型ω-TAタンパク質、または配列番号18に示されるアミノ酸配列を有するω-TA変異体を、「一般的方法」項目3に記載されるように発現させ、精製した。
配列番号3に示されるアミノ酸配列を有するArthrobacter sp.由来の野生型ω-TAタンパク質、または配列番号6に示されるアミノ酸配列を有するBacillus megaterium由来の野生型ω-TAタンパク質、または配列番号18に示されるアミノ酸配列を有するω-TA変異体を、「一般的方法」項目3に記載されるように発現させ、精製した。
40μlのトリエタノールアミン緩衝液(脱イオン水中の200mM溶液、pH=9.0)に、10μlのピリドキサールリン酸塩(脱イオン水中の10mM溶液)および10μlのイソプロピルアミン(脱イオン水中の2M溶液、HCl水溶液の添加によってpH=9.0に調整)を室温で添加した。続いて、比1:1のDMSO/脱イオン水中のフェニルピルビン酸(100mMフェニルピルビン酸溶液)20μlを加えた。最後に、1.5mg/mlのそれぞれのω-TAタンパク質を含む溶液20μlを室温で添加し、混合物を回転振盪機上で800rpmで6時間40℃でインキュベートした。アミノ基転移反応は、「一般的方法」項目8に記載されているように、反応中に異なる時間間隔で採取したアリコートのHPLC分析によってモニターした。
表8は、配列番号18に示されているアミノ酸配列を有するω-TA変異体について得られた結果を、配列番号3に示されているアミノ酸配列を有するArthrobacter sp.および配列番号6に示されているアミノ酸配列を有するBacillus megaterium由来の野生型タンパク質の結果と比較したものである。その結果を図4にも示した。
表8の説明:表6の説明を参照
表8および図4から、Arthrobacter sp.由来の野生型酵素は、フェニルピルビン酸から(S)-フェニルアラニンを産生せず、Bacillus megaterium由来の野生型酵素は、ω-TA変異体によって産生される(S)-フェニルアラニンの量と比較して(S)-フェニルアラニンを非常にゆっくりとそして少量産生することがわかる。
4. p-ヒドロキシフェニルピルビン酸の(S)-チロシンへの変換:
配列番号3に示されるアミノ酸配列を有するArthrobacter sp.由来の野生型ω-TAタンパク質、または配列番号6に示されるアミノ酸配列を有するBacillus megaterium由来の野生型ω-TAタンパク質、または配列番号18に示されるアミノ酸配列を有するω-TA変異体を、「一般的方法」項目3に記載されるように発現させ、精製した。
配列番号3に示されるアミノ酸配列を有するArthrobacter sp.由来の野生型ω-TAタンパク質、または配列番号6に示されるアミノ酸配列を有するBacillus megaterium由来の野生型ω-TAタンパク質、または配列番号18に示されるアミノ酸配列を有するω-TA変異体を、「一般的方法」項目3に記載されるように発現させ、精製した。
40μlのトリエタノールアミン緩衝液(脱イオン水中の200mM溶液、pH=9,0)に、10μlのピリドキサールリン酸塩(脱イオン水中の10mM溶液)および10μlのイソプロピルアミン(脱イオン水中の2M溶液、HCl水溶液の添加によってpH=9.0に調整)を室温で添加した。続いて、比1:1のDMSO/脱イオン水中の20μlのp-ヒドロキシフェニルピルビン酸(100mMのp-ヒドロキシフェニルピルビン酸溶液)を加えた。最後に、1.5mg/mlのそれぞれのω-TAタンパク質を含む溶液20μlを室温で添加し、混合物を回転振盪機上で800rpmで6時間40℃でインキュベートした。アミノ基転移反応は、「一般的方法」項目8に記載されているように、反応中に異なる時間間隔で採取したアリコートのHPLC分析によってモニターした。
表9は、配列番号3に示されているアミノ酸配列を有するArthrobacter sp.由来の野生型タンパク質および配列番号6に示されているアミノ酸配列を有するBacillus megaterium由来の野生型タンパク質のものと比較して、配列番号18に示されているアミノ酸配列を有するω-TA変異体について得られた結果を示す。その結果を図5にも示した。
表9の説明:表6の説明を参照
表9および図5から、Arthrobacter sp.およびBacillus megaterium由来の野生型酵素は、アミノ化p-ヒドロキシフェニルピルビン酸によって(S)-チロシンを産生しないが、ω-TA変異体は、(S)-チロシンを非常に効率的に産生することがわかる。
5. さらなるアミノ酸改変を含むω-TA変異体による4-[ヒドロキシ(メチル)ホスホリル]-2-オキソブタン酸から(S)-グルホシネートの製造
配列番号18に示されるアミノ酸配列を有するω-TA変異体及び表2に記載された更なるアミノ酸改変を含むω-TA変異体を、「一般的方法」の第6項に記載されているように、DAAOの活性を有し、かつ、カタラーゼ活性を有するタンパク質(「一般的方法」の第5項を参照)とともに発現し、続いて「一般的方法」の第9項に記載されているスプレー乾燥を行った。DAAOは、(R)-グルホシネートの脱アミノ化により4-[ヒドロキシ(メチル)ホスホリル]-2-オキソブタン酸を生成する。4-[ヒドロキシ(メチル)ホスホリル]-2-オキソブタン酸は、その後、さらなるアミノ酸改変を有するω-TA変異体によってアミノ酸受容体として使用され、アミノ化反応において(S)-グルホシネートに変換される。配列番号18に示されるアミノ酸配列を有するω-TA変異体、及び本明細書中表2に記載されるさらなるアミノ酸改変を含むω-TA変異体の活性試験を、「一般的方法、項目7」に記載の試験に従って行った。アミノ基転移反応は、「一般的方法」の項目8に記載されているようにHPLC分析によってモニターし、反応開始5時間後に各反応で生成される(S)-グルホシネートの量を測定した。
配列番号18に示されるアミノ酸配列を有するω-TA変異体及び表2に記載された更なるアミノ酸改変を含むω-TA変異体を、「一般的方法」の第6項に記載されているように、DAAOの活性を有し、かつ、カタラーゼ活性を有するタンパク質(「一般的方法」の第5項を参照)とともに発現し、続いて「一般的方法」の第9項に記載されているスプレー乾燥を行った。DAAOは、(R)-グルホシネートの脱アミノ化により4-[ヒドロキシ(メチル)ホスホリル]-2-オキソブタン酸を生成する。4-[ヒドロキシ(メチル)ホスホリル]-2-オキソブタン酸は、その後、さらなるアミノ酸改変を有するω-TA変異体によってアミノ酸受容体として使用され、アミノ化反応において(S)-グルホシネートに変換される。配列番号18に示されるアミノ酸配列を有するω-TA変異体、及び本明細書中表2に記載されるさらなるアミノ酸改変を含むω-TA変異体の活性試験を、「一般的方法、項目7」に記載の試験に従って行った。アミノ基転移反応は、「一般的方法」の項目8に記載されているようにHPLC分析によってモニターし、反応開始5時間後に各反応で生成される(S)-グルホシネートの量を測定した。
表10は、さらなるアミノ酸改変を含むω-TA変異体の各々によって産生される(S)-グルホシネート(S-GA)の量、および、配列番号18に示されるアミノ酸配列を有するω-TA変異体によって産生される量を示す。
表10の説明:
アミノ酸変化の同定のために、カラム1の番号は、配列番号18に示されるアミノ酸配列中のアミノ酸位置を特定する。番号の前に現れる文字は、配列番号18に示されるアミノ酸配列中のそれぞれの位置に存在するアミノ酸を特定する。番号の後に現れる文字は、さらなるアミノ酸変異を含むω-TA変異体のアミノ酸配列中のそれぞれの位置に存在するアミノ酸を特定する。カラムの同列に与えられた2つの番号は、それぞれ、番号の前後に出現する文字であり、配列番号18に示されているアミノ酸配列と比較して、2つの同時のアミノ酸置換(置換)を特定する。
アミノ酸変化の同定のために、カラム1の番号は、配列番号18に示されるアミノ酸配列中のアミノ酸位置を特定する。番号の前に現れる文字は、配列番号18に示されるアミノ酸配列中のそれぞれの位置に存在するアミノ酸を特定する。番号の後に現れる文字は、さらなるアミノ酸変異を含むω-TA変異体のアミノ酸配列中のそれぞれの位置に存在するアミノ酸を特定する。カラムの同列に与えられた2つの番号は、それぞれ、番号の前後に出現する文字であり、配列番号18に示されているアミノ酸配列と比較して、2つの同時のアミノ酸置換(置換)を特定する。
表10から、さらなるアミノ酸変異を含むω-TA変異体は、配列番号18に示されているアミノ酸配列を有するω-TA変異体と比較してより多くの(S)-グルホシネートを産生することが導き出される。
Claims (11)
- 以下の群から選択される、ω-トランスアミナーゼ(ω-TA)の活性を有するタンパク質;
a) 配列番号18に示される1~476位のアミノ酸配列を含むタンパク質;
b) 配列番号18に示される1~476位のアミノ酸配列と少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であり、但し、配列番号18における25、64、88、157、165、169、174、187、197、239、327、328、384、389、391、396、410および414位に対応するアミノ酸が、配列番号18に示されるアミノ酸配列のそれぞれの位置に示されるアミノ酸を表す、タンパク質;
c) 配列番号18に示される1~476位のアミノ酸配列と少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であり、但し、配列番号18における2、25、46、48、60、64、69、88、90、157、164、165、169、174、187、195、197、202、205、239、242、245、252、255、268、311、318、322、327、328、353、359、384、389、391、396、409、410、414、424、436、452、475、476および477位に対応するアミノ酸が、配列番号18に示されるアミノ酸配列のそれぞれの位置に示されるアミノ酸を表す、タンパク質。 - 以下よりなる群より選択される請求項1記載のタンパク質;
a) 166位のアミノ酸がGであり、327位のアミノ酸がQであることを定める請求項1記載のタンパク質;
b) 327位のアミノ酸がQであり、384位のアミノ酸がSであることを定める請求項1記載のタンパク質;
c) 326位のアミノ酸がQであり、327位のアミノ酸がQであることを定める請求項1記載のタンパク質;
d) 327位のアミノ酸がQであることを定める請求項1記載のタンパク質;
e) 326位のアミノ酸がFであり、327位のアミノ酸がQであることを定める請求項1記載のタンパク質;
f) 327位のアミノ酸がCであることを定める請求項1記載のタンパク質;
g) 327位のアミノ酸がIであることを定める請求項1記載のタンパク質;
h) 327位のアミノ酸がMであることを定める請求項1記載のタンパク質;
i) 164位のアミノ酸がYであることを定める請求項1記載のタンパク質;
j) 164位のアミノ酸がSであることを定める請求項1記載のタンパク質;
k) 327位のアミノ酸がVであることを定める請求項1記載のタンパク質;
l) 409位のアミノ酸がRであることを定める請求項1記載のタンパク質;
m) 327位のアミノ酸がSであることを定める請求項1記載のタンパク質;
n) 271位のアミノ酸がIであることを定める請求項1記載のタンパク質;
o) 329位のアミノ酸がGであることを定める請求項1記載のタンパク質;
p) 409位のアミノ酸がPであることを定める請求項1記載のタンパク質;
q) 414位のアミノ酸がMであることを定める請求項1記載のタンパク質;
r) 165位のアミノ酸がKであることを定める請求項1記載のタンパク質;
s) 414位のアミノ酸がRであることを定める請求項1記載のタンパク質;
t) 414位のアミノ酸がHであることを定める請求項1記載のタンパク質;
u) 165位のアミノ酸がCであることを定める請求項1記載のタンパク質;
v) 327位のアミノ酸がVであることを定める請求項1記載のタンパク質;
w) 164位のアミノ酸がCであることを定める請求項1記載のタンパク質;
x) 409位のアミノ酸がKであることを定める、請求項1記載のタンパク質。 - 以下からなる群より選択される請求項1または2に記載のタンパク質:
a) 配列番号18の166位のアミノ酸SがGで置換され、配列番号18の327位のアミノ酸TがQで置換されていること以外は、配列番号18に示すアミノ酸配列の1~476位のアミノ酸配列を有するタンパク質;
b)配列番号18の327位のアミノ酸TがQで置換され、配列番号18の384位のアミノ酸CがSで置換されていること以外は、配列番号18に示すアミノ酸配列の1~476位のアミノ酸配列を有するタンパク質;
c) 配列番号18の326位のアミノ酸EがQで置換され、配列番号18の327位のアミノ酸TがQで置換されている以外は、配列番号18に示すアミノ酸配列の1~476位のアミノ酸配列を有するタンパク質;
d) 配列番号18の327位のアミノ酸TがQで置換されている以外は、配列番号18に示すアミノ酸配列の1~476位のアミノ酸配列を有するタンパク質;
e) 配列番号18の326位のアミノ酸EがFで置換され、配列番号18の327位のアミノ酸TがQで置換されている以外は、配列番号18に示すアミノ酸配列の1~476位のアミノ酸配列を有するタンパク質;
f) 配列番号18の327位のアミノ酸TがCで置換されている以外は、配列番号18に示すアミノ酸配列の1~476位のアミノ酸配列を有するタンパク質;
g) 配列番号18の327位のアミノ酸TがIで置換されている以外は、配列番号18に示すアミノ酸配列の1~476位のアミノ酸配列を有するタンパク質;
h) 配列番号18の327位のアミノ酸TがMで置換されている以外は、配列番号18に示すアミノ酸配列の1~476位のアミノ酸配列を有するタンパク質;
i) 配列番号18の164位のアミノ酸FがYで置換されている以外は、配列番号18に示すアミノ酸配列の1~476位のアミノ酸配列を有するタンパク質;
j) 配列番号18の164位のアミノ酸FがSで置換されている以外は、配列番号18に示すアミノ酸配列の1~476位のアミノ酸配列を有するタンパク質;
k) 配列番号18の327位のアミノ酸TがVで置換されている以外は、配列番号18に示すアミノ酸配列の1~476位のアミノ酸配列を有するタンパク質;
l) 配列番号18の409位のアミノ酸TがRで置換されている以外は、配列番号18に示すアミノ酸配列の1~476位のアミノ酸配列を有するタンパク質;
m) 配列番号18の327位のアミノ酸TがSで置換されている以外は、配列番号18に示すアミノ酸配列の1~476位のアミノ酸配列を有するタンパク質;
n) 配列番号18の271位のアミノ酸VがIで置換されている以外は、配列番号18に示すアミノ酸配列の1~476位のアミノ酸配列を有するタンパク質;
o) 配列番号18の329位のアミノ酸SがGで置換されている以外は、配列番号18に示すアミノ酸配列の1~476位のアミノ酸配列を有するタンパク質;
p) 配列番号18の409位のアミノ酸TがPで置換されている以外は、配列番号18に示すアミノ酸配列の1~476位のアミノ酸配列を有するタンパク質;
q) 配列番号18の414位のアミノ酸LがMで置換されている以外は、配列番号18に示すアミノ酸配列の1~476位のアミノ酸配列を有するタンパク質;
r) 配列番号18の165位のアミノ酸QがKで置換されている以外は、配列番号18に示すアミノ酸配列の1~476位のアミノ酸配列を有するタンパク質;
s) 配列番号18の414位のアミノ酸LがRで置換されている以外は、配列番号18に示すアミノ酸配列の1~476位のアミノ酸配列を有するタンパク質;
t) 配列番号18の414位のアミノ酸LがHで置換されている以外は、配列番号18に示すアミノ酸配列の1~476位のアミノ酸配列を有するタンパク質;
u) 配列番号18の165位のアミノ酸QがCで置換されている以外は、配列番号18に示すアミノ酸配列の1~476位のアミノ酸配列を有するタンパク質;
v) 配列番号18の327位のアミノ酸TがVで置換されている以外は、配列番号18に示すアミノ酸配列の1~476位のアミノ酸配列を有するタンパク質;
w) 配列番号18の164位のアミノ酸FがCで置換されている以外は、配列番号18に示すアミノ酸配列の1~476位のアミノ酸配列を有するタンパク質;
x) 配列番号18の409位のアミノ酸TがKで置換されている以外は、配列番号18に示すアミノ酸配列の1~476位のアミノ酸配列を有するタンパク質;
y) a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)、i)、j)、k)、l)、m)、n)、o)、p)、q)、r)、s)、t)、u)、v)、w)又はx)のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であって、
a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)、i)、j)、k)、l)、m)、n)、o)、p)、q)、r)、s)、t)、u)、v)、w)又はx)のそれぞれで規定されるアミノ酸配列位置が、a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)、i)、j)、k)、l)、m)、n)、o)、p)、q)、r)、s)、t)、u)、v)、w)又はx)のそれぞれで規定されるいずれかのアミノ酸配列と少なくとも90%同一性を有するタンパク質配列のアミノ酸配列中の対応するアミノ酸位置にも存在する、タンパク質。 - 請求項1~3のいずれか一項記載のタンパク質をコードする核酸分子。
- 以下からなる群より選択されるω-TA活性を有するタンパク質をコードする、請求項4に記載の核酸分子:
a) 配列番号17に示される核酸配列の1~1428位の核酸配列を含む核酸分子;
b) 配列番号18に示されるアミノ酸配列の1~476位のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸分子;
c) 配列番号17に示される核酸配列の1~1428位の核酸配列と少なくとも90%の同一性を有する核酸分子であって、
配列番号17のヌクレオチド位置73~75に対応するコドンは、ヌクレオチド配列mgnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置190~192に対応するコドンは、ヌクレオチド配列athを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置262~264に対応するコドンは、ヌクレオチド配列gcnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置469~471に対応するコドンは、ヌクレオチド配列gcnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置493~495に対応するコドンは、配列番号17のヌクレオチド配列mgnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置505~507に対応するコドンは、配列番号17のヌクレオチド配列gcnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置520~522に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ggnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置589~591に対応するコドンは、ヌクレオチド配列gcnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置559~561に対応するコドンは、ヌクレオチド配列aayを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置715~717に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ccnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置979~981に対応するコドンは、ヌクレオチド配列acnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置982~984に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ggnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1150~1152に対応するコドンは、ヌクレオチド配列tgyを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1165~1167に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ytnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1171~1173に対応するコドンは、ヌクレオチド配列garを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1186~1188に対応するコドンは、ヌクレオチド配列garを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1228~1230に対応するコドンは、ヌクレオチド配列mgnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1240~1242に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ytnを有する;
d) 配列番号17に示される核酸配列の1~1428位の核酸配列と少なくとも90%の同一性を有する核酸分子であって、
配列番号17のヌクレオチド位置4~6に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ggnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置73~75に対応するコドンは、ヌクレオチド配列mgnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置136~138に対応するコドンは、ヌクレオチド配列atgを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置142~144に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ggnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置178~180に対応するコドンは、ヌクレオチド配列tayを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置190~192に対応するコドンは、ヌクレオチド配列athを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置205~207に対応するコドンは、ヌクレオチド配列carを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置262~264に対応するコドンは、ヌクレオチド配列gcnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置268~270に対応するコドンは、ヌクレオチド配列gcnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置469~471に対応するコドンは、ヌクレオチド配列gcnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置490~492に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ttyを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置493~495に対応するコドンは、ヌクレオチド配列carを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置505~507に対応するコドンは、ヌクレオチド配列gcnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置520~522に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ggnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置553~555に対応するコドンは、ヌクレオチド配列tayを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置556~558に対応するコドンは、ヌクレオチド配列aayを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置559~561に対応するコドンは、ヌクレオチド配列aayを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置583~585に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ccnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置589~591に対応するコドンは、ヌクレオチド配列gcnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置604~606に対応するコドンは、ヌクレオチド配列aayを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置613~615に対応するコドンは、ヌクレオチド配列tgyを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置715~717に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ccnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置724~726に対応するコドンは、ヌクレオチド配列gtnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置733~735に対応するコドンは、ヌクレオチド配列acnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置754~756に対応するコドンは、ヌクレオチド配列athを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置763~765に対応するコドンは、ヌクレオチド配列athを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置802~804に対応するコドンは、ヌクレオチド配列aayを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置931~933に対応するコドンは、ヌクレオチド配列gtnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置952~954に対応するコドンは、ヌクレオチド配列gcnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置964~966に対応するコドンは、ヌクレオチド配列aarを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置979~981に対応するコドンは、ヌクレオチド配列acnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置982~984に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ggnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1057~1059に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ytnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1075~1077に対応するコドンは、ヌクレオチド配列aayを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1150~1152に対応するコドンは、ヌクレオチド配列tayを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1165~1167に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ytnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1171~1173に対応するコドンは、ヌクレオチド配列garを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1186~1188に対応するコドンは、ヌクレオチド配列garを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1225~1227に対応するコドンは、ヌクレオチド配列acnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1228~1230に対応するコドンは、ヌクレオチド配列mgnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1240~1242に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ytnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1270~1272に対応するコドンは、ヌクレオチド配列garを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1306~1308に対応するコドンは、ヌクレオチド配列gtnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1354~1356に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ggnを有する;
e) a)、b)、c)またはd)で定義される核酸分子の相補鎖とハイブリダイズする核酸分子であり、
配列番号17におけるヌクレオチド位置73~75に対応するコドンは、ヌクレオチド配列mgnを有し、
配列番号17におけるヌクレオチド位置190~192に対応するコドンは、ヌクレオチド配列athを有し、
配列番号17におけるヌクレオチド位置262~264に対応するコドンは、ヌクレオチド配列gcnを有し、
配列番号17におけるヌクレオチド位置469~471に対応するコドンは、ヌクレオチド配列gcnを有し、
配列番号17におけるヌクレオチド位置493~495に対応するコドンは、ヌクレオチド配列mgnを有し、
配列番号17におけるヌクレオチド位置505~507に対応するコドンは、ヌクレオチド配列gcnを有し、
配列番号17におけるヌクレオチド位置520~522に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ggnを有し、
配列番号17におけるヌクレオチド位置559~561に対応するコドンは、ヌクレオチド配列aayを有し、
配列番号17におけるヌクレオチド位置715~717に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ccnを有し、
配列番号17におけるヌクレオチド位置979~981に対応するコドンは、ヌクレオチド配列acnを有し、
配列番号17におけるヌクレオチド位置982~984に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ggnを有し、
配列番号17におけるヌクレオチド位置1150~1152に対応するコドンは、ヌクレオチド配列tgyを有し、
配列番号17におけるヌクレオチド位置1165~1167に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ytnを有し、
配列番号17におけるヌクレオチド位置1171~1173に対応するコドンは、ヌクレオチド配列garを有し、
配列番号17におけるヌクレオチド位置1186~1188に対応するコドンは、ヌクレオチド配列garを有し、
配列番号17におけるヌクレオチド位置1228~1230に対応するコドンは、ヌクレオチド配列mgnを有し、
配列番号17におけるヌクレオチド位置1240~1242に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ytnを有する;
f) a)、b)、c)またはd)で定義される核酸分子の相補鎖とハイブリダイズする核酸分子であり、
配列番号17のヌクレオチド位置4~6に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ggnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置73~75に対応するコドンは、ヌクレオチド配列mgnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置136~138に対応するコドンは、ヌクレオチド配列atgを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置142~144に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ggnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置178~180に対応するコドンは、ヌクレオチド配列tayを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置190~192に対応するコドンは、ヌクレオチド配列athを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置205~207に対応するコドンは、ヌクレオチド配列carを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置262~264に対応するコドンは、ヌクレオチド配列gcnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置268~270に対応するコドンは、ヌクレオチド配列gcnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置469~471に対応するコドンは、ヌクレオチド配列gcnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置490~492に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ttyを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置493~495に対応するコドンは、ヌクレオチド配列carを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置505~507に対応するコドンは、ヌクレオチド配列gcnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置520~522に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ggnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置553~555に対応するコドンは、ヌクレオチド配列tayを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置556~558に対応するコドンは、ヌクレオチド配列aayを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置559~561に対応するコドンは、ヌクレオチド配列aayを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置583~585に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ccnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置589~591に対応するコドンは、ヌクレオチド配列gcnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置604~606に対応するコドンは、ヌクレオチド配列aayを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置613~615に対応するコドンは、ヌクレオチド配列tgyを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置715~717に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ccnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置724~726に対応するコドンは、ヌクレオチド配列gtnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置733~735に対するコドンは、ヌクレオチド配列acnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置754~756に対するコドンは、ヌクレオチド配列athを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置763~765に対するコドンは、ヌクレオチド配列athを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置802~804に対するコドンは、ヌクレオチド配列aayを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置931~933に対するコドンは、ヌクレオチド配列gtnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置952~954に対するコドンは、ヌクレオチド配列gcnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置964~966に対するコドンは、ヌクレオチド配列aarを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置979~981に対するコドンは、ヌクレオチド配列acnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置982~984に対するコドンは、ヌクレオチド配列ggnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1057~1059に対するコドンは、ヌクレオチド配列ytnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1075~1077に対するコドンは、ヌクレオチド配列aayを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1150~1152に対するコドンは、ヌクレオチド配列tayを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1165~1167に対するコドンは、ヌクレオチド配列ytnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1171~1173に対するコドンは、ヌクレオチド配列garを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1186~1188に対するコドンは、ヌクレオチド配列garを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1225~1227に対するコドンは、ヌクレオチド配列acnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1228~1230に対するコドンは、ヌクレオチド配列mgnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1240~1242に対するコドンは、ヌクレオチド配列ytnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1270~1272に対するコドンは、ヌクレオチド配列garを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1306~1308に対するコドンは、ヌクレオチド配列gtnを有し、
配列番号17のヌクレオチド位置1354~1356に対するコドンは、ヌクレオチド配列ggnを有する;
g) 遺伝コードの縮重により、a)、b)、c)、d)、e)又はf)で定義される核酸分子から逸脱した核酸分子;
h) 配列番号18に示される1~476位のアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するタンパク質をコードする核酸分子であり、配列番号18の25、64、88、157、165、169、174、187、239、327、328、384、389、391、396、410および414位に対応するアミノ酸が、配列番号18に示されるアミノ酸配列のそれぞれの位置に示されるアミノ酸を表す、核酸分子;
i) 配列番号18に示される1~476位のアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するタンパク質をコードする核酸分子であり、配列番号18の2、25、46、48、60、64、69、88、90、157、164、165、169、174、185、186、187、195、197、202、205、239、242、245、252、255、268、311、318、322、327、328、353、359、384、389、391、396、409、410、414、424、436、452、475および476位に対応するアミノ酸が、配列番号18に示されるアミノ酸配列のそれぞれの位置に示されるアミノ酸を表す、核酸分子;
j) 配列番号16に示される核酸配列の1~1428位の核酸配列を含む核酸分子。 - 以下からなる群より選択されるω-TA活性を有するタンパク質をコードする請求項4または5のいずれか一項に記載の核酸分子;
a) 配列番号16または配列番号17のヌクレオチド位置496~498のコドンがヌクレオチド配列ggnを有し、配列番号16または配列番号17のヌクレオチド位置979~981のコドンがヌクレオチド配列carを有すること以外は、配列番号16または配列番号17に示される核酸配列の1~1428位の核酸配列を含む核酸分子;
b) 配列番号16または配列番号17のヌクレオチド位置979~981のコドンがヌクレオチド配列carを有し、配列番号16または配列番号17のヌクレオチド位置1150~1152のコドンがヌクレオチド配列wsnを有すること以外は、配列番号16または配列番号17に示される核酸配列の1~1428位の核酸配列を含む核酸分子;
c) 配列番号16または配列番号17のヌクレオチド位置976~978のコドンがヌクレオチド配列carを有し、配列番号16または配列番号17のヌクレオチド位置979~981のコドンがヌクレオチド配列carを有すること以外は、配列番号16または配列番号17に示される核酸配列の1~1428位の核酸配列を含む核酸分子;
d) 配列番号16または配列番号17のヌクレオチド位置979~981のコドンがヌクレオチド配列carを有すること以外は、配列番号16または配列番号17に示される核酸配列の1~1428位の核酸配列を含む核酸分子;
e) 配列番号16または配列番号17のヌクレオチド位置976~978のコドンがヌクレオチド配列ttyを有し、配列番号16または配列番号17のヌクレオチド位置979~981のコドンがヌクレオチド配列carを有すること以外は、配列番号16または配列番号17に示される核酸配列の1~1428位の核酸配列を含む核酸分子;
f) 配列番号16または配列番号17のヌクレオチド位置979~981のコドンがヌクレオチド配列carを有すること以外は、配列番号16または配列番号17に示される核酸配列の1~1428位の核酸配列を含む核酸分子;
g) 配列番号16または配列番号17のヌクレオチド位置979~981のコドンがヌクレオチド配列athを有すること以外は、配列番号16または配列番号17に示される核酸配列の1~1428位の核酸配列を含む核酸分子;
h) 配列番号16または配列番号17のヌクレオチド位置979~981のコドンがヌクレオチド配列atgを有すること以外は、配列番号16または配列番号17に示される核酸配列の1~1428位の核酸配列を含む核酸分子;
i) 配列番号16または配列番号17のヌクレオチド位置490~492のコドンがヌクレオチド配列tayを有すること以外は、配列番号16または配列番号17に示される核酸配列の1~1428位の核酸配列を含む核酸分子;
j) 配列番号16または配列番号17のヌクレオチド位置490~492のコドンがヌクレオチド配列wsnを有すること以外は、配列番号16または配列番号17に示される核酸配列の1~1428位の核酸配列を含む核酸分子;
k) 配列番号16または配列番号17のヌクレオチド位置979~981のコドンがヌクレオチド配列gtnを有すること以外は、配列番号16または配列番号17に示される核酸配列の1~1428位の核酸配列を含む核酸分子;
l) 配列番号16または配列番号17のヌクレオチド位置1225~1227のコドンがヌクレオチド配列mgnを有すること以外は、配列番号16または配列番号17に示される核酸配列の1~1428位の核酸配列を含む核酸分子;
m) 配列番号16または配列番号17のヌクレオチド位置979~981のコドンがヌクレオチド配列wsnを有すること以外は、配列番号16または配列番号17に示される核酸配列の1~1428位の核酸配列を含む核酸分子;
n) 配列番号16または配列番号17のヌクレオチド位置811~813のコドンがヌクレオチド配列athを有すること以外は、配列番号16または配列番号17に示される核酸配列の1~1428位の核酸配列を含む核酸分子;
o) 配列番号16または配列番号17のヌクレオチド位置985~987のコドンがヌクレオチド配列ggnを有すること以外は、配列番号16または配列番号17に示される核酸配列の1~1428位の核酸配列を含む核酸分子;
p) 配列番号16または配列番号17のヌクレオチド位置1225~1227のコドンがヌクレオチド配列ccnを有すること以外は、配列番号16または配列番号17に示される核酸配列の1~1428位の核酸配列を含む核酸分子;
q) 配列番号16または配列番号17のヌクレオチド位置1240~1242のコドンがヌクレオチド配列atgを有すること以外は、配列番号16または配列番号17に示される核酸配列の1~1428位の核酸配列を含む核酸分子;
r) 配列番号16または配列番号17のヌクレオチド位置493~495のコドンがヌクレオチド配列aarを有すること以外は、配列番号16または配列番号17に示される核酸配列の1~1428位の核酸配列を含む核酸分子;
s) 配列番号16または配列番号17のヌクレオチド位置1240~1242のコドンがヌクレオチド配列mgnを有すること以外は、配列番号16または配列番号17に示される核酸配列の1~1428位の核酸配列を含む核酸分子;
t) 配列番号16または配列番号17のヌクレオチド位置1240~1242のコドンがヌクレオチド配列cayを有すること以外は、配列番号16または配列番号17に示される核酸配列の1~1428位の核酸配列を含む核酸分子;
u) 配列番号16または配列番号17のヌクレオチド位置493~495のコドンがヌクレオチド配列tgyを有すること以外は、配列番号16または配列番号17に示される核酸配列の1~1428位の核酸配列を含む核酸分子;
v) 配列番号16または配列番号17のヌクレオチド位置979~981のコドンがヌクレオチド配列gtnを有すること以外は、配列番号16または配列番号17に示される核酸配列の1~1428位の核酸配列を含む核酸分子;
w) 配列番号16または配列番号17のヌクレオチド位置490~492のコドンがヌクレオチド配列tgyを有すること以外は、配列番号16または配列番号17に示される核酸配列の1~1428位の核酸配列を含む核酸分子;
x) 配列番号16または配列番号17のヌクレオチド位置1225~1227のコドンがヌクレオチド配列aarを有すること以外は、配列番号16または配列番号17に示される核酸配列の1~1428位の核酸配列を含む核酸分子;
y) a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)、i)、j)、k)、l)、m)、n)、o)、p)、q)、r)、s)、t)、u)、v)、w)又はx)のいずれかの核酸配列と少なくとも90%の同一性を有する核酸配列を有する核酸分子であって、
a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)、i)、j)、k)、l)、m)、n)、o)、p)、q)、r)、s)、t)、u)、v)、w)又はx)のそれぞれで規定されるコドン核酸配列が、a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)、i)、j)、k)、l)、m)、n)、o)、p)、q)、r)、s)、t)、u)、v)、w)又はx)で規定されるいずれかの核酸配列と少なくとも90%の同一性を有する核酸配列において、対応するコドン核酸位置に存在する、核酸分子。 - 請求項4から6のいずれか一項に記載の核酸分子を含む組換え核酸分子。
- 組換え核酸分子がベクターまたはプラスミドである、請求項7に記載の組換え核酸分子。
- 請求項1または2に記載のタンパク質を含むか、または請求項4~6のいずれか一項に記載の核酸分子を含むか、または請求項7または8に記載の組換え核酸分子を含む宿主細胞。
- a) アミン受容体分子を提供し;
b) アミン供与体分子を提供し;
c) 工程a)で提供されるアミン受容体分子および工程b)で提供されるアミン供与体分子を、請求項1または2に記載のタンパク質と接触させる、
段階を含む、アミンの製造方法。 - a) (R)-及び(S)-アミンエナンチオマーを含む組成物を提供し;
b) アミン受容体分子を提供し;
c) 工程a)で提供される組成物および工程b)で提供されるアミン受容体分子を、請求項1または2に記載のタンパク質と接触させる、
段階を含む、(R)-及び(S)-アミンエナンチオマーを含む組成物中のアミンエナンチオマーの量を減少させる方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP18186729.2 | 2018-07-31 | ||
EP18186729 | 2018-07-31 | ||
PCT/EP2019/070431 WO2020025577A1 (en) | 2018-07-31 | 2019-07-30 | Nucleic acids encoding improved transaminase proteins |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2021532756A JP2021532756A (ja) | 2021-12-02 |
JP7496814B2 true JP7496814B2 (ja) | 2024-06-07 |
Family
ID=
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2008522627A (ja) | 2004-12-10 | 2008-07-03 | キャンブレックス ノース ブランズウィック インコーポレイテッド | 熱安定性ωアミノ基転移酵素 |
US20120041216A1 (en) | 2009-02-04 | 2012-02-16 | Evonik Degussa Gmbh | Method for producing multicyclical ring systems carrying amino groups |
WO2016198660A1 (en) | 2015-06-12 | 2016-12-15 | C-Lecta Gmbh | Transaminases |
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2008522627A (ja) | 2004-12-10 | 2008-07-03 | キャンブレックス ノース ブランズウィック インコーポレイテッド | 熱安定性ωアミノ基転移酵素 |
US20120041216A1 (en) | 2009-02-04 | 2012-02-16 | Evonik Degussa Gmbh | Method for producing multicyclical ring systems carrying amino groups |
WO2016198660A1 (en) | 2015-06-12 | 2016-12-15 | C-Lecta Gmbh | Transaminases |
WO2016198665A1 (en) | 2015-06-12 | 2016-12-15 | C-Lecta Gmbh | Transaminases |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20220220457A1 (en) | Nucleic acids encoding improved transaminase proteins | |
JP5999565B2 (ja) | (r)−選択的アミノ化 | |
Cho et al. | Asymmetric synthesis of l‐homophenylalanine by equilibrium‐shift using recombinant aromatic l‐amino acid transaminase | |
US20090209012A1 (en) | Method for producing l-amino acids | |
US8168412B2 (en) | Method for producing optically-active amine compound, recombinant vector, and transformant containing the vector | |
Song et al. | Biocatalytic derivatization of proteinogenic amino acids for fine chemicals | |
EP2479272A1 (en) | Method for producing monatin | |
JP7496814B2 (ja) | 改良されたトランスアミナーゼタンパク質をコードする核酸 | |
WO2003072770A1 (fr) | Nouvelle deshydrogenase et gene codant cette derniere | |
EP4105335A1 (en) | Enzymatic method for the production of l-glufosinate p-alkyl esters | |
US7282356B2 (en) | D-aminoacylase mutants | |
JPWO2011001889A1 (ja) | 光学活性α−アミノ酸のラセミ化方法 | |
JP4231709B2 (ja) | 新規デヒドロゲナーゼ及びそれをコードする遺伝子 | |
US8771997B2 (en) | Method for producing monatin using an L-amino acid aminotransferase | |
JP4402446B2 (ja) | D−アミノアシラーゼの変異体 | |
Zhang | Biocatalytic asymmetric hydroamination by native and engineered carbon-nitrogen lyases: new enzymes to prepare amino acid precursors to pharmaceuticals and food additives | |
JP2005509439A6 (ja) | エナンチオマーに富むα−アミノ酸の製造法 | |
JP2005509439A (ja) | エナンチオマーに富むα−アミノ酸の製造法 | |
JP2011024572A (ja) | 光学活性アミノ酸の製造法 | |
Frese | Structure, mechanism and engineering of pyridoxal phosphate-dependent racemases | |
EP4217474A1 (en) | Bacterial unspecific peroxygenases (bupo's) and methods and uses thereof | |
CA2769606A1 (en) | Method for producing monatin |