JP2845153B2 - アミノ交換反応によるｌ−第三ロイシンの製法 - Google Patents
アミノ交換反応によるｌ−第三ロイシンの製法Info
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】光学活性な、非タンパク性アミノ酸は知ら
れたかまたはありうる生物学的活性ゆえに大変重要であ
る。Ｌ−ジヒドロキシフェニルアラニン（Ｌ−ドーパ）
またはα−メチルドーパのような幾種かのものは医薬分
野に効果的に使用されるし、またはホスフィノスリシン
（phosphinothricine）のように植物保護に使用され
る。その他のものには医薬の前駆物質、例えば半合成ペ
リニシンであるアンピシリンおよびアモキシシリン製造
におけるＤ−フェニルグリシンまたはβ−ｐ−ヒドロキ
シフェニルグリシンがあげられる。これらはまた精製化
学薬品合成のための価値ある前駆物質でもありうる。ア
ミノ酸誘導体の不斉合成においては特に第三ロイシンも
採用されてきた（U. Schoellkopf氏の「Pure and Appl.
Chem.」 55, 1799〜1806(1983)）。 【０００２】非タンパク性の光学活性アミノ酸は化学的
経路でのみ製造されるのが好ましい。その場合立体選択
的に操作できず、最終生成物としてラセミ化合物が得ら
れるという欠点がある。これに対し酵素による方法は簡
単に調製できる中間体から酵素工程を用いることにより
キラール化合物が選択的に合成されうるという利点を非
常にしばしば有する。このことは２つの立体異性化合物
のうちの一方のみが生物学的に活性である場合に特に好
都合である。 【０００３】トランスアミナーゼを用いる生物学的変換
による天然の、いわゆるタンパク性アミノ酸の合成それ
自体は知られている。ヨーロッパ特許出願第１５２,２
７５号にはアミノトランスフェラーゼの過剰生産により
特徴づけられる遺伝子工学的に修飾された微生物を用い
るアミノ交換反応によるフェニルアラニンの製法が記載
されている。ヨーロッパ特許出願第１３５,８４６号で
はα−ケト酸をエシェリヒア・コリ（Escherichia col
i）から単離されるトランスアミナーゼの存在下にアミ
ノ基供与体としてのＬ−アスパラギン酸と反応させるこ
とにより天然のＬ−アミノ酸を製造している。それによ
りα−ケト酸に相当するＬ−アミノ酸、ならびにアスパ
ラギン酸から生成するオキサロアセテートが形成され
る。 【０００４】フェニルピルビン酸からより高収率にＬ−
フェニルアラニンを製造するためのエシェリヒア・コリ
（E. coli）、パラコッカス・デニトリフィカンス（Par
acoccus denitrificans）、トルラ（Torula）、ロドト
ルラ（Rhodotorula）およびストレプトミセス（Strepto
myces）の系列の微生物の選択および突然変異は西ドイ
ツ特許出願第３,４２３,９３６号に報告されている。 【０００５】天然には存在しない、いわゆる非タンパク
性アミノ酸はこれまで酵素による生物学的変換法によっ
ては製造されなかった。今、非タンパク性アミノ酸であ
るＬ−第三ロイシンがアミノ変換反応により非常に良好
な収率で合成されうることが見出された。種々の天然の
タンパク性アミノ酸がトランスアミナーゼを用いて合成
されうることは知られていたとしても、酵素の特異性ゆ
えに非タンパク性アミノ酸が天然に存在しないα−ケト
酸を前駆物質として用いてこの方法により同様に製造さ
れうることは驚くべきことである。それゆえ相当する前
駆物質が、天然のアミノ酸の前駆物質においてはこの形
態で存在しない疎水性残基を有するにも拘らずトランス
アミナーゼの活性中心によって受容されそして変換され
ることは驚くべきことである。 【０００６】従って本発明は３，３−ジメチル−２−オ
キソブタン酸またはその塩をアミノ基供与体としてのア
ミノ酸の存在下にエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ）属の微生物を用いてアミノ交換することからなるＬ
−第三ロイシンの製造法に関する。 【０００７】以下に本発明について詳細に説明する。多
数の生物体例えば微生物、植物および豚の心臓のような
動物器官から得られる酵素はα−ケト酸をアミノ交換反
応により天然のＬ−アミノ酸に変換させうる。これら生
物体またはそれらの酵素は本発明に使用されうる。しか
しながら、トランスアミナーゼを有する微生物、例えば
パラコッカス（Paracoccus）、アルカリゲネス（Alcali
genes）、リゾビウム（Rhizobium）、シュードモナス
（Pseudomonas）、セラチア（Serratia）、アグロバク
テリウム（Agrobacterium）およびストレプトミセス（S
treptomyces）属の微生物または腸内菌科の細菌を用い
て操作するのが好ましい。特に好ましい微生物はアルカ
リゲネス・フエカリス（Alcaligenes faecalis）ＤＳＭ
４１１５、アルカリゲネス・デニトリフィカンス（Alc
aligenes denitrificans）ＤＳＭ ４１１４、シュード
モナス・パウシモビリス（Pseudomonas paucimobilis）
ＤＳＭ ４１２０、シュードモナス種（Pseudomonas spe
c.）ＤＳＭ ４１１９、セラチア・プリムシカ（Serrati
a plymuthica）ＤＳＭ ４１１６、アグロバクテリウム
・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）、
エシェリヒア・コリ ＤＨ１、エシェリヒア・コリ ＡＴ
ＣＣ １１３０３、エンテロバクター・アグロメランス
（Enterobacter agglomerans）ＤＳＭ ４１２２、エン
テロバクター種（Enterobacter spec.）ＤＳＭ ４１２
１、パラコッカス・デニトリフィカンス（Paracoccus d
enitrificans）ＤＳＭ ６５、ストレプトミセス・ヒグ
ロスコピクス（Streptomyces hygroscopicus）およびス
トレプトミセス・ビリドクロモゲネス（Streptomyces v
iridochromogenes）ならびに３種の土壌単離物のロドコ
ッカス種（Rhodococcus sp.）ＤＳＭ ４１１３、ＤＳＭ
４１１７およびエンテロバクター・インターメジウム
（Enterobacter intermedium）ＤＳＭ ４１１８であ
る。 【０００８】これらの微生物はそれらが自由に入手でき
ないかまたは当業者が本発明を実施できる程度に記載さ
れていない場合は「ドイツ微生物寄託機関（Deutsche S
ammlung fuer Mikro organism（ＤＳＭと略記））」に
寄託されている。 【０００９】それ自体知られた方法で選択および突然変
異させることにより、培地中のより多量の３，３−ジメ
チル−２−オキソブタン酸、フェニルピルビン酸または
その塩に対し、α−ケト酸に対する適合性ゆえにアミノ
交換反応をより高収率に進行せしめる微生物を以後の操
作用に選択することができる。３，３−ジメチル−２−
オキソブタン酸またはその塩はトリメチル酢酸をチオニ
ルクロライドおよびＫＣＮの存在下に常法により鹸化す
ることにより容易に得られる（Ｈａｎｓ Ｂｅｙｅｒ氏
の「Ｌｅｈｒｂｕｃｈ ｄｅｒ ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅ
ｎ Ｃｈｅｍｉｅ（Ｔｅｘｂｏｏｋ ｏｆ Ｏｒｇａｎ
ｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、Ｓ．Ｈｉｒｚｅｌ出
版、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ）。 【００１０】遺伝子工学的に操作された微生物を本発明
方法に使用する場合も良好な収量が得られる。ｔｙｒＢ
遺伝子またはｉｌｖＥ遺伝子を含有するプラスミドで形
質転換されたエシェリヒア・コリ ＡＴＣＣ １１３０３
を用いるのが特に好ましく、ここでｔｙｒＢ遺伝子は芳
香族トランスアミナーゼをそしてｉｌｖＥ遺伝子は脂肪
族トランスアミナーゼをそれぞれコードする。かくの如
く操作された菌株は例えば西ドイツ特許出願Ｐ ３６ ３
１ ８２９.９号またはＰ ３６ ３６ ７２２.２号の記載
により調製されうる。 【００１１】アミノ交換反応は培養と同時に行われう
る。その場合、微生物はその生育に最適の培養基中で適
当な好ましい温度条件および通気条件下に培養溶液１リ
ットル当り乾燥重量約４〜６０ｇとなるまで培養するの
が好ましい。それぞれの微生物に最も好都合な条件は当
業者に知られているかまたは簡単な予備実験により判定
されうる。次に細胞を栄養溶液中に、または栄養溶液か
ら分離してα−ケト酸のアミノ化に使用する。アミノ交
換反応は細胞全体を用いてあるいは破壊した細胞を用い
ても実施でき、慣用の破壊法が用いられる。アミノ交換
反応は細胞抽出物、単離された総タンパク質または精製
トランスアミナーゼを用いても同様に実施できる。しか
しながら例えば価格などの実際的理由から、完全な細胞
全体を用いて操作するのが好ましい。しかしながらその
寿命が比較的長いことおよび反応をより良好に調節しう
ることのゆえにトランスアミナーゼを単離使用すること
も同様に好都合でありうる。さらに、微生物または酵素
を固定した形態で使用することも可能である。固定には
知られた方法、好都合には西ドイツ特許出願公開第３，
２３７，３４１号および同第３，２４３，５９１号記載
の方法が用いられる。 【００１２】微生物または単離された酵素系は好ましい
実施形態においては、α−ケト酸およびアミノ基供与体
の添加の下においてそのトランスアミナーゼ活性が著し
くマイナスの影響を受けることがないように生理的緩衝
液中に懸濁する。微生物の量に応じ、微生物の形態でか
または単離された酵素系の形態で反応混合物に添加され
る酵素活性は広範囲に変動しうる。好都合には活性は１
０〜２００００μモル／分・リットルである。反応混合
物は酵素活性１５００〜２０００μモル／分・リットル
に相当する細胞量を含有するのが好ましい。 【００１３】アミノ基供与体としてはアミノ酸が使用さ
れる。どのアミノ酸が用いられるのが好ましいかは実質
上微生物または単離された酵素系の如何によるものであ
るが、これは簡単な予備試験により判定されうる。例え
ばバリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、チロ
シンおよびフェニルアラニン、特にアスパラギン、アス
パラギン酸、グルタミン、グルタミン酸およびグリシン
が適当である。これらのアミノ酸は、Ｌ−形のみが本発
明に利用されるのでＬ−形における遊離の酸または適当
な塩（用いられる培地に相当して）として使用される。
Ｌ−第三ロイシンの製造にはα−ケト酸として３,３−
ジメチル−２−オキソブタン酸が使用される。その塩も
使用でき、その場合当然トランスアミナーゼ活性に著明
にマイナスに影響しないイオンが選択される。ナトリウ
ム、カリウムおよびアンモニウム塩が好ましい。アミノ
基供与体はα−ケト酸に対し等モル量または過剰に添加
される。１：１〜５：１好ましくは１：１〜２：１なる
割合が適当であることが判明した。 【００１４】反応混合物への反応体の添加は、水中にお
ける溶液としてまたは固形物質を添加することにより同
時に行われうる。しかしながら、反応混合物の重量に基
づき０.１〜４.５％特に０.２〜２％の量で１〜９０時
間好ましくは２〜４０時間にわたり段階的にまたは継続
的に添加するのが好ましい。pH５〜９、特にpH７〜８.
５で操作するのが好ましい。その他アミノ変換反応は１
０℃〜６５℃、特に２０〜５０℃の温度範囲で実施する
のが好都合である。これより温度が低いと酵素反応が遅
くなってゆき、一方これより温度が高いと酵素が不活化
されてゆく。 【００１５】最も好都合な操作法はそれぞれの微生物の
如何に応じたものであり、そして簡単な予備試験により
容易に決定されうる。微生物をアミノ交換反応期間前ま
たは期間中は浸透性となすことが特に好都合であると判
明した。これはトルエン、セチルトリメチルアンモニウ
ムブロマイド、ジメチルスルホキシド等のような適当な
薬剤をインキュベーション培地に添加することによりな
されうる。 【００１６】以下の例および実施例により本発明をより
詳細に説明する。％記載は別に断りなければ重量による
ものとする。 【００１７】例１ 微生物の培養と後処理 寄託されるかまたは自由に入手しうる前記細菌をＬＢ−
培地〔Luria-Bertani−培地：１リットル当り１０ｇバ
クト(Bacto)−トリプトン／５ｇパクト酵母抽出物／１
０ｇ ＮａＣｌ（pH７.５）〕またはＭ９−最少培地〔１
リットル当り６ｇ Ｎａ2ＨＰＯ4／３ｇ ＫＨ2ＰＯ4／
０.５ｇ ＮａＣｌ／１ｇ ＮＨ4Ｃｌ／２ml１Ｍ ＭｇＳ
Ｏ4＋１０ml ２０％グルコース＋０.１ml １Ｍ ＣａＣ
ｌ2＋１ml１％ビタミンＢ１（サイアミン）（pH７.
４）〕中の液体培養液４００ml中で３０℃（エシェリヒ
ア・コリ以外の全ての細菌）または３７℃（エシェリヒ
ア・コリ ＤＨ１）で一夜培養した。次に細菌を遠心分
離しそして細胞ペレットをpH７.０の洗浄緩衝液（１０m
M Ｎａ2ＨＰＯ7、１０mM ＮａＣｌ）中で数回洗いそし
て終りに細胞ペレット３ｇにつき洗浄緩衝液５ml中に懸
濁した。この細胞を１分間の超音波処理を５回行うこと
により崩壊させそして細胞断片を遠心分離した。かくし
て得られた溶解物上澄み液は−２０℃で数ケ月間保存さ
れうる。 【００１８】例２ タンパク質の単離 タンパク質を単離するには、溶解物上澄み液５mlずつに
洗浄緩衝液を加えてそれぞれ５０mlとなしそして硫酸ア
ンモニウムを６５％まで添加することによりタンパク質
を沈澱させた。１００００ｇで１５分間遠心分離したの
ちタンパク質ペレットを１０mM Ｎａ2ＨＰＯ4（pH７.
０）、１mM ＥＤＴＡ、２％グリセリンおよび１mMジチ
オトレイトール（ＤＴＴ）を含有する溶液５ml中にそれ
ぞれ再懸濁させた。これらの懸濁液も同じく−２０℃で
保存されうる。精製効果をより良くするためにタンパク
質の一部は硫酸アンモニウムで２回沈澱させた。 【００１９】タンパク質測定はビウレット法で行われ
た。前記した教示に従って行われた調製物中のタンパク
質含量は大抵の場合５〜１０mg／mlであった。アルカリ
ゲネス・フエカリス ＤＳＭ ４１１５およびロドコッカ
ス種 ＤＳＭ ４１１３から得られるトランスアミナーゼ
の部分精製を行うには、硫酸アンモニウムをそれぞれ１
０％刻みで２５％から７５％添加してタンパク質を分別
沈澱させそして個々のフラクションのトランスアミナー
ゼ活性について検査（下記参照）した。最大の比活性を
有するタンパク質フラクションをセファデックスＧ １
００を含有するゲル濾過カラムに適用しそして１０mMの
Ｎａ2ＨＰＯ4（pH７.０）を用いて溶離した。トランス
アミナーゼ比活性が最大である溶出液フラクションを硫
酸アンモニウムで反復沈澱させることにより濃縮しそし
て１０mM Ｎａ2ＨＰＯ4（pH７.０）、１mM ＥＤＴＡ、
２％グリセリンおよび１mM ＤＴＴを含有する溶液中に
５mg／mlとなるようにとった。（セファデックス(Sepha
dex)RＧ １００）ポリデキストランカラムフラクション
の分子量は標準分子量タンパク質との比較により測定し
た。単離されたトランスアミナーゼフラクションの純度
はタンパク質試料を１０％ＳＤＳ／ポリアクリルアミド
ゲル中で電気泳動することにより検査した。 【００２０】例３ 液体培養におけるホスフィノスリシン合成試験 唯一のＮ源として３ｇ／リットル（２０mM）のＬ−グル
タミン酸および２ｇ／リットル（１０mM）のナトリウム
−（３−カルボキシ−３−オキソ−プロピル）−メチル
ホスフィネートを含有するＬＢ培地中の各細菌菌株の５
ml培養物を３０℃で調製した。１日および２日後に１ml
の試料を採取しそして細菌細胞を９５℃に２０分間加熱
することにより殺した。遠心分離したのち上澄み液をと
り出しそしてアミノ酸分析器（ＡＡ−分析器）中でホス
フィノスリシン形成について検べた。アルカリゲネス・
フエカリスＤＳＭ ４１１５は２４時間後に基質を０.３
ｇ／リットルのＬ−ホスフィノスリシン（α−ケト酸に
基づき１５％の変換率）に変換した。４８時間後には５
ｇ／リットルのＬ−ホスフィノスリシン（２５％の変換
率）が得られた。 【００２１】例４ 細胞抽出物およびタンパク質単離物を用いるトランスア
ミナーゼ試験 細菌の溶解物上澄み液および単離された総タンパク質、
ならびにアルカリゲネス・フエカリス ＤＳＭ ４１１５
およびＤＳＭ ４１１３から得られた富化されたトラン
スアミナーゼフラクションを１０mM Ｎａ2ＨＰＯ4およ
び１０mM ＮａＣｌ（pH７.０）を含有する溶液を用いて
タンパク質含量２０〜６０mg／mlに調整しそしてＮＨ2
−供与体としての８０mM Ｌ−グルタミン酸および２０m
Mナトリウム−（３−カルボキシ−３−オキソ−プロピ
ル）−メチルホスフィネートを含有する標準バッチ中３
０℃でインキュベーションした。実験条件の如何に応じ
インキュベーション時間０〜２４時間で１００μｌの試
料を採取し、タンパク質を９５℃で１０分間変性させ、
遠心分離しそして反応上澄み液をＡＡ−分析器中でホス
フィノスリシンについて検査した。対照反応は何ら供与
体アミノ酸またはナトリウム−（３−カルボキシ−３−
オキソ−プロピル）−メチルホスフィネートを含有しな
いか、または熱不活化したタンパク質（９５℃、１０分
間）を用いて行われた。 【００２２】特異的なトランスアミナーゼ阻害剤として
１０mMのヒドロキシルアミンを添加することによりホス
フィノスリシン形成が完全に抑制された。ホスフィノス
リシン−トランスアミナーゼ比活性はタンパク質１mgに
つき１時間につき形成されたホスフィノスリシンのｎモ
ルで示され、アミノ交換の反応性はタンパク質１mg当り
または１リットル当り１分間で生成されるホスフィノス
リシンのμモル（Ｕ／タンパク質mgまたはＵ／リット
ル）で示される。１単位（Ｕ）はＬ−ホスフィノスリシ
ンへの変換毎分１μモルに相当する。 【００２３】ａ） 溶解物上澄み液（未精製）を用いる
Ｌ−ホスフィノスリシン（ＰＴＣ）合成 【表１】【００２４】ｂ） 単離された全タンパク質（(ＮＨ4)2
ＳＯ4で精製）を用いるＬ−ＰＴＣ合成 【表２】 【００２５】ｃ） 精製トランスアミナーゼ酵素を用い
るＬ−ＰＴＣ合成 【表３】 【００２６】例５ ホスフィノスリシン合成の立体選択性に関する試験 アミノ変換反応によるホスフィノスリシン生成に関する
立体特異性をＮ−アセチルトランスフェラーゼ反応によ
り検査した。この酵素は２〜３の土壌細菌で検出（例え
ば西ドイツ特許出願Ｐ ３６ ２８ ７４７.４）されそし
て知られた方法で単離されうる。このものはＬ−ホスフ
ィノスリシンとのみ立体特異的に反応してそれがアセチ
ル−ＣｏＡ−依存性反応により定量的に対応するＮ−ア
セチル誘導体に変換される。試験においては、アミノ交
換反応によりホスフィノスリシンが形成されている例４
で得られた反応上澄み液をアルビカンス・フエカリス
ＤＳＭ ４１１５から得られたタンパク質（１mg／ml）
および１０mMのアセチル ＣｏＡと３０℃で５時間イン
キュベーションした。反応上澄み液を次に再び未反応ホ
スフィノスリシンについてＡＡ−分析器で検査した。ア
ミノ交換反応により酵素的に形成されたホスフィノスリ
シンはそれぞれＮ−アセチルトランスフェラーゼ反応に
より完全に崩壊された。これはアミノ変換反応の立体選
択性を証明している。純粋なＬ−ホスフィノスリシンが
形成されている。 【００２７】例６ エシェリヒア・コリ ＡＴＣＣ １１３０３の選択 エシェリヒア・コリ ＡＴＣＣ １１３０３を常法により
培養しそしてE. Adelberg氏他の「Biochem. Biophys. R
es. Comm.」18, 788(1965)の記載によりＮ−メチル−Ｎ
−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン(ＭＮＧ)を用いて突
然変異させた。ＭＮＧで処理した細胞を下記組成を有す
る圧熱滅菌された寒天上に画線した。 フマル酸 ５ｇ／リットル 肉エキス ２０ｇ／リットル アスパラギン酸 ２０ｇ／リットル ＫＨ2ＰＯ4 ２ｇ／リットル ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０.５ｇ／リットル ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ０.１ｇ／リットル 寒天 ２０ｇ／リットル 水酸化ナトリウム溶液を用いてpH７.２に調整 【００２８】フェニルピルベートの滅菌濾過された溶液
をまだ熱い寒天溶液にフェニルピルベートの最終濃度が
２４ｇ／リットルとなるように注いだ。このプレートを
３７℃で４日間インキュベーションした。直径１mm以上
のコロニーを単離した。生育する菌株の２０％が出発菌
株に比較して高いトランスアミナーゼ活性を有してい
た。トランスアミナーゼ活性はSigmaテストキットＧ ０
３９０を用いて測定された。 【００２９】例７ ａ．エシェリヒア・コリからのコスミドｐＩＭＳ ６０
２６の単離および消化 トランスポゾンＴｎ ９０３のカナマイシン抵抗性が存
在する商業的に入手しうるＥｃｏＲＩ断片(Pharmacia社
製、Uppsala、スウェーデン）を、コスミドｐＬＡＦＲ
Ｉ（ＡＴＣＣ ３７１６７）の独特のＥｃｏＲＩ切断部
位中にクローニングすることによりコスミドｐＩＭＳ
６０２６を誘導する。ＢａｍＨＩでの消化そして続く再
連結により商業的に入手しうるＥｃｏＲＩ断片の大部分
が欠失されて、１個のＢａｍＨＩ切断部位が２個のＥｃ
ｏＲＩ切断部位により両側をはさまれた短いＤＮＡ片の
みが挿入物として残存する。エシェリヒア・コリ ＨＢ
１０１からコスミドｐＩＭＳ ６０２６を単離するにはH
umphreys氏他の方法〔Biochim. Biophys. Acta 383, 45
7〜63(1975)〕またはBirnboim氏他によるアルカリ分解
〔Nucleic Acids Res. 7, 1513(1979)〕のいずれかに従
い１０倍の規模で実施した。いずれの場合もプラスミド
ＤＮＡはＣｓＣｌ／ＥｔＢｒ密度勾配遠心分離により少
なくとも１回は精製した。 【００３０】このコスミドｐＩＭＳ ６０２６を製造者N
ew England Biolabsの教示に従い操作して制限酵素Ｂａ
ｍＨＩで完全に消化した。この消化が完結したかどうか
検査するには制限調製物の一部分を０.８％アガロース
ゲルに適用して電気泳動にかけた。エチジウムブロマイ
ドで着色しそして短波長ＵＶ光線（２５４nm）で照射し
て１本のバンドのみが見られる場合は完全な消化を示す
ものとされた。消化されたコスミドＤＮＡからフェノー
ル処理により制限酵素を除去し、ＤＮＡをエタノールで
沈澱させ、７０％エタノールで洗いそして真空下に乾燥
したのち適当量のＴＥ緩衝液（１０mMのトリスおよび１
mMのＥＤＴＡ、pH８.０）中にとった。選択により、製
造者Boehringer Mannheimの教示に従いアルカリホスフ
ァターゼでさらに処理した。１μｌのアルカリホスファ
ターゼ（ＣＩＰ）を添加したのち３７℃で３０分間イン
キュベーションし、フェノール処理により反応混合物か
ら酵素を除去し、そしてＤＮＡを前記したようにして精
製した。これを終りにＴＥ緩衝液中に再懸濁した。 【００３１】ｂ．エシェリヒア・コリ ＡＴＣＣ １１３
０３からのＤＮＡの部分消化 Marmur氏の「I. Mol. Biol.」53, 155〜162(1961)記載の
方法に従いエシェリヒア・コリ ＡＴＣＣ １１３０３か
ら全ＤＮＡを単離した。この単離された全ＤＮＡを制限
酵素Ｓａｕ３Ａを用いて部分消化すると主に２０〜３０
kbの寸法の断片が生成した。この目的には予備実験にお
いてこの反応に最適のＤＮＡ：酵素比ならびにＤＮＡに
及ぼす酵素の最適作用時間が判定された。適当な操作法
はＢＲＬ社から出されたパンフレット「Focus」7(2), 3
(1985)に記載されている。最適と定められた反応時間経
過後、酵素を６５℃に１０分間加熱することにより破壊
しそして所望の寸法範囲内のＤＮＡ断片が形成されたか
どうかをアガロースゲル電気泳動により適当なＤＮＡ−
マーカー例えばファージλのＥｃｏＲＩ消化されたＤＮ
Ａを用いて検査した。 【００３２】ｃ．制限部位の連結 エシェリヒア・コリ ＡＴＣＣ １１３０３から得られる
総ＤＮＡをＳａｕ３Ａで部分消化したものをＢａｍＨＩ
で完全に切断しそしてアルカリホスファターゼ処理した
ｐＩＭＳ ６０２６コスミドＤＮＡと約１：５なるモル
比で混合した。生成した混合物を、New England Biolab
sの教示に従い酵素Ｔ４−ＤＮＡリガーゼにとって最適
のイオン濃度を生ずるように数倍濃度の緩衝液で処理
し、そして酵素１μｌと一緒に１６℃で少なくとも１４
時間インキュベーションした。反応混合物の総量は５０
μｌであり、総ＤＮＡ濃度は２０μｇ／mlであった。 【００３３】ｄ．λ−ファージ中へのパッケージング リガーゼ反応が行われた後、例３で得られたＤＮＡをin
vitroでλ−ファージの頭部にパッケージングした。こ
の目的に必要な抽出物はB. Hohn氏「Recombinant DNA,
Methods in Enzymology」68, Academic Press, New Yor
k, 299〜309頁（1979)記載の方法により２種の異なる細
菌菌株から得ることができるし、またはBoshringer Man
nheim社またはAmersham Buchler, Brunswick社から得ら
れうる。例３で得られた混合物３μｌを直前に解凍され
たAmersham社の細菌抽出物と氷冷下に充分によく混合し
た。この混合物を２０℃で３０〜６０分間インキュベー
ションしそして次にＳＭ−緩衝液（１００mM ＮａＣ
ｌ、１０mM ＭｇＳＯ4、５０mMトリス−ＨＣｌ（pH７.
５）および０.０１％ゼラチン）２００μｌを加えた。
この混合物を直接形質導入反応にかけるかまたは１０μ
ｌのクロロホルムを添加したのち後程の使用時まで４℃
で保存した。 【００３４】ｅ．エシェリヒア・コリ ＤＧ ３０の形質
導入 １％Bacto−トリプトン、０.５％酵母エキスおよび０.
５％ＮａＣｌからなるＬ−ブイヨン５mlに０.４％のマ
ルトースを加えそして定常生長期にあるエシェリヒア・
コリ ＤＧ ３０の液体培養物５０μｌを接種した。早期
定常期に達するまでこの混合物を３７℃で１２時間イン
キュベーションした。細菌を遠心分離しそして１０ミリ
モルＭｇＣｌ2水溶液２.５ml中に注意深く再懸濁した。
例４記載の混合物１０μｌに濃細菌懸濁液２０μｌを加
えそして室温で５０分間インキュベーションした。次に
Ｌ−ブイヨン２００μｌをこれに加え、この混合物を時
々振盪しながら３７℃で１時間インキュベーションし
た。この調製物５０μｌずつを２０μｇ／mlのテトラサ
イクリンを含有するＬ−ブイヨン−寒天上に塗布した。
このプレートを３７℃で少なくとも１２時間インキュベ
ーションした。前記した操作法により、１つの調製物か
ら平均１０００個のコロニーを得ることができた。 【００３５】ｆ．ａｓｐＣ、ｉｌｖＥまたはｔｙｒＢ遺
伝子を有するエシェリヒア・コリ ＤＧ ３０の選択 ２０μｇ／mlのテトラサイクリンを含有するＬ−ブイヨ
ン−寒天上で前記した方法に従いエシェリヒア・コリ
ＤＧ ３０の形質導入により得られた約８００個のコロ
ニーを最少寒天上に「拾い移し」た。最少寒天はアミノ
酸イソロイシン、ロイシン、バリン、アスパラギン酸お
よびフェニルアラニンを補充された、グルコース含有Ｍ
９培地（Miller, 「Experiments in Molecular Genetic
s」, Cold Spring Harbor, 1972)からなる。しかしなが
ら菌株ＤＧ ３０が同じく最早や合成できないアミノ酸
チロシンは培地に添加されなかった。８００個の「拾い
移し」たコロニーのうち７個が最少培地上で生育でき
た。エシェリヒア・コリ ＤＧ ３０中の３種のありうる
遺伝子ａｓｐＣ、ｉｌｖＥおよびｔｙｒＢを区別するた
めにこれら７種のコロニーを、遺伝子の１つによりコー
ドされるトランスアミナーゼの１つに対して基質特異性
を示す１アミノ酸をそれぞれ除外して前記したアミノ酸
を補充した前記最少培地上に再び「拾い移し」た。その
結果を以下の表に示す。 【００３６】 【表４】 【００３７】ｇ．ｔｙｒＢ遺伝子の位置測定 Maniatis氏他、Cold Spring Harbor, 366〜370(1982)に
よるミニ分析を行うことにより、例６で得られたクロー
ン１〜７からコスミドＤＮＡが得られた。次にこのコス
ミドＤＮＡをエシェリヒア・コリ ＤＨ１（ＡＴＣＣ ３
３８４９）中に導入し、そこからこれらは良好な収率で
再び単離できた。本来エシェリヒア・コリ ＤＧ ３０
（例６参照）のクローン３から得られたプラスミドＤＮ
Ａを、このＤＮＡで形質転換された菌株エシェリヒア・
コリ ＤＨ１から単離しそして制限酵素ＳａｌＩおよび
ＳｍａＩを用い製造者New EnglandBiolaboの教示に従い
完全に消化した。ベクターｐＡＴ １５３もＣｌａＩを
用いて完全に消化し、これを次にアルカリホスファター
ゼでさらに処理した。２種のＤＮＡを一緒にし、例４記
載の方法に従い相互に連結しそして菌株エシェリヒア・
コリ ＡＴＣＣ １１３０３のコンピテントな細胞をリガ
ーゼ調製物の一部分、例えば１０μｌを用いて形質転換
した。５０μｇ／mlのアンピシリンを含有するＬ−ブイ
ヨンプレート上の抵抗性のコロニーを選択し、そして２
０μｇ／mlのテトラサイクリンを含有するＬ−ブイヨン
プレート上の「レプリカ培養」によりマーカー不活化お
よび従ってとり込みについて検査した。表現型ＡｐｒＴ
ｃｓを示すコロニーから、ミニ分析法によりプラスミド
ＤＮＡを単離しそして制限酵素ＣｌａＩを用いて完全に
消化することによりベクターｐＡＴ １５３中における
ＣｌａＩ断片の存在について検査した。 【００３８】ｈ．トランスアミナーゼ活性の検査 例７で得られたクローンをＡＰＰＡＴ試験（フェニルピ
ルベート−アミノトランスフェラーゼ分析装置、Sigma
−テストキットＧ０３９０、α−ケトグルタレートをフ
ェニルピルベートにより置換を用い芳香族トランスアミ
ナーゼ活性、すなわちｔｙｒＢの遺伝子産物について検
査した。形質転換されていない出発菌株エシェリヒア・
コリ ＡＴＣＣ １１３０３を比較用に用いた。ここで１
例においては出発菌株エシェリヒア・コリ ＡＴＣＣ １
１３０３に比較してｔｙｒＢ活性の著明な増加、すなわ
ち５〜１０倍の増加が測定された。適当なマーカーを使
用するアガロースゲル電気泳動により、約２.７ＭＤの
寸法のＣｌａＩ断片がとり込まれて含有されるｐＡＴ
１５３ベクターがｔｙｒＢ遺伝子活性の増大を示す菌株
中に含有されることを示すことができた。単離されたプ
ラスミドＤＮＡを用いて新たにプラスミド不含菌株エシ
ェリヒア・コリ ＡＴＣＣ １１３０３を形質転換した場
合、あらゆる場合にｔｙｒＢ遺伝子活性が約５〜１０倍
増加することが観察された。ｉｌｖＥ遺伝子を用いるエ
シェリヒア・コリ ＡＴＣＣ １１３０３の形質転換も同
様な方法で行われる。 【００３９】実施例１ Ｌ−第三ロイシンの調製 ａ．エシェリヒア・コリ ＡＴＣＣ １１３０３の例６
により選択された菌株を下記栄養溶液中で培養した。 フマル酸 １０ｇ／リッ
トル 肉エキス ２０ｇ／リッ
トル アスパラギン酸 ８ｇ／リッ
トル ＫＨ２ＰＯ４ ２ｇ／リッ
トル ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ／
リットル ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．１ｇ／
リットル ３，３−ジメチル−２−オキソブタン酸 ４ｇ／リッ
トル 水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨ７．４に調整 ３７℃で４８時間生育させた後、細胞を遠心分離した。
ＲＰＣ−８カラム上のＨＰＬＣ（移動相、１００ｍＭの
Ｎａ−アセテート（ｐＨ７．２）およびメタノールから
なるグラジエント）により上澄み液中に０．９ｇ／リッ
トルのＬ−２−アミノ−３，３−ジメチルブタン酸（第
三ロイシン）が測定された。 【００４０】ｂ．細胞物質を実施例１ａと同様にして培
養しそして１０ミリモル／リットルのトリス−ＨＣｌ緩
衝液（ｐＨ７．４）中の１０ｇ／リットルのアスパラギ
ン酸および４ｇ／リットルの３，３−ジメチル−２−オ
キソブタン酸からなる溶液中で振盪しながらインキュベ
ーションした。３７℃で２４時間後、ＨＰＬＣにより
１．９ｇ／リットルのＬ−２−アミノ−３，３−ジメチ
ルブタン酸が測定された。 【００４１】 【００４２】 【００４３】
れたかまたはありうる生物学的活性ゆえに大変重要であ
る。Ｌ−ジヒドロキシフェニルアラニン（Ｌ−ドーパ）
またはα−メチルドーパのような幾種かのものは医薬分
野に効果的に使用されるし、またはホスフィノスリシン
（phosphinothricine）のように植物保護に使用され
る。その他のものには医薬の前駆物質、例えば半合成ペ
リニシンであるアンピシリンおよびアモキシシリン製造
におけるＤ−フェニルグリシンまたはβ−ｐ−ヒドロキ
シフェニルグリシンがあげられる。これらはまた精製化
学薬品合成のための価値ある前駆物質でもありうる。ア
ミノ酸誘導体の不斉合成においては特に第三ロイシンも
採用されてきた（U. Schoellkopf氏の「Pure and Appl.
Chem.」 55, 1799〜1806(1983)）。 【０００２】非タンパク性の光学活性アミノ酸は化学的
経路でのみ製造されるのが好ましい。その場合立体選択
的に操作できず、最終生成物としてラセミ化合物が得ら
れるという欠点がある。これに対し酵素による方法は簡
単に調製できる中間体から酵素工程を用いることにより
キラール化合物が選択的に合成されうるという利点を非
常にしばしば有する。このことは２つの立体異性化合物
のうちの一方のみが生物学的に活性である場合に特に好
都合である。 【０００３】トランスアミナーゼを用いる生物学的変換
による天然の、いわゆるタンパク性アミノ酸の合成それ
自体は知られている。ヨーロッパ特許出願第１５２,２
７５号にはアミノトランスフェラーゼの過剰生産により
特徴づけられる遺伝子工学的に修飾された微生物を用い
るアミノ交換反応によるフェニルアラニンの製法が記載
されている。ヨーロッパ特許出願第１３５,８４６号で
はα−ケト酸をエシェリヒア・コリ（Escherichia col
i）から単離されるトランスアミナーゼの存在下にアミ
ノ基供与体としてのＬ−アスパラギン酸と反応させるこ
とにより天然のＬ−アミノ酸を製造している。それによ
りα−ケト酸に相当するＬ−アミノ酸、ならびにアスパ
ラギン酸から生成するオキサロアセテートが形成され
る。 【０００４】フェニルピルビン酸からより高収率にＬ−
フェニルアラニンを製造するためのエシェリヒア・コリ
（E. coli）、パラコッカス・デニトリフィカンス（Par
acoccus denitrificans）、トルラ（Torula）、ロドト
ルラ（Rhodotorula）およびストレプトミセス（Strepto
myces）の系列の微生物の選択および突然変異は西ドイ
ツ特許出願第３,４２３,９３６号に報告されている。 【０００５】天然には存在しない、いわゆる非タンパク
性アミノ酸はこれまで酵素による生物学的変換法によっ
ては製造されなかった。今、非タンパク性アミノ酸であ
るＬ−第三ロイシンがアミノ変換反応により非常に良好
な収率で合成されうることが見出された。種々の天然の
タンパク性アミノ酸がトランスアミナーゼを用いて合成
されうることは知られていたとしても、酵素の特異性ゆ
えに非タンパク性アミノ酸が天然に存在しないα−ケト
酸を前駆物質として用いてこの方法により同様に製造さ
れうることは驚くべきことである。それゆえ相当する前
駆物質が、天然のアミノ酸の前駆物質においてはこの形
態で存在しない疎水性残基を有するにも拘らずトランス
アミナーゼの活性中心によって受容されそして変換され
ることは驚くべきことである。 【０００６】従って本発明は３，３−ジメチル−２−オ
キソブタン酸またはその塩をアミノ基供与体としてのア
ミノ酸の存在下にエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ）属の微生物を用いてアミノ交換することからなるＬ
−第三ロイシンの製造法に関する。 【０００７】以下に本発明について詳細に説明する。多
数の生物体例えば微生物、植物および豚の心臓のような
動物器官から得られる酵素はα−ケト酸をアミノ交換反
応により天然のＬ−アミノ酸に変換させうる。これら生
物体またはそれらの酵素は本発明に使用されうる。しか
しながら、トランスアミナーゼを有する微生物、例えば
パラコッカス（Paracoccus）、アルカリゲネス（Alcali
genes）、リゾビウム（Rhizobium）、シュードモナス
（Pseudomonas）、セラチア（Serratia）、アグロバク
テリウム（Agrobacterium）およびストレプトミセス（S
treptomyces）属の微生物または腸内菌科の細菌を用い
て操作するのが好ましい。特に好ましい微生物はアルカ
リゲネス・フエカリス（Alcaligenes faecalis）ＤＳＭ
４１１５、アルカリゲネス・デニトリフィカンス（Alc
aligenes denitrificans）ＤＳＭ ４１１４、シュード
モナス・パウシモビリス（Pseudomonas paucimobilis）
ＤＳＭ ４１２０、シュードモナス種（Pseudomonas spe
c.）ＤＳＭ ４１１９、セラチア・プリムシカ（Serrati
a plymuthica）ＤＳＭ ４１１６、アグロバクテリウム
・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）、
エシェリヒア・コリ ＤＨ１、エシェリヒア・コリ ＡＴ
ＣＣ １１３０３、エンテロバクター・アグロメランス
（Enterobacter agglomerans）ＤＳＭ ４１２２、エン
テロバクター種（Enterobacter spec.）ＤＳＭ ４１２
１、パラコッカス・デニトリフィカンス（Paracoccus d
enitrificans）ＤＳＭ ６５、ストレプトミセス・ヒグ
ロスコピクス（Streptomyces hygroscopicus）およびス
トレプトミセス・ビリドクロモゲネス（Streptomyces v
iridochromogenes）ならびに３種の土壌単離物のロドコ
ッカス種（Rhodococcus sp.）ＤＳＭ ４１１３、ＤＳＭ
４１１７およびエンテロバクター・インターメジウム
（Enterobacter intermedium）ＤＳＭ ４１１８であ
る。 【０００８】これらの微生物はそれらが自由に入手でき
ないかまたは当業者が本発明を実施できる程度に記載さ
れていない場合は「ドイツ微生物寄託機関（Deutsche S
ammlung fuer Mikro organism（ＤＳＭと略記））」に
寄託されている。 【０００９】それ自体知られた方法で選択および突然変
異させることにより、培地中のより多量の３，３−ジメ
チル−２−オキソブタン酸、フェニルピルビン酸または
その塩に対し、α−ケト酸に対する適合性ゆえにアミノ
交換反応をより高収率に進行せしめる微生物を以後の操
作用に選択することができる。３，３−ジメチル−２−
オキソブタン酸またはその塩はトリメチル酢酸をチオニ
ルクロライドおよびＫＣＮの存在下に常法により鹸化す
ることにより容易に得られる（Ｈａｎｓ Ｂｅｙｅｒ氏
の「Ｌｅｈｒｂｕｃｈ ｄｅｒ ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅ
ｎ Ｃｈｅｍｉｅ（Ｔｅｘｂｏｏｋ ｏｆ Ｏｒｇａｎ
ｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、Ｓ．Ｈｉｒｚｅｌ出
版、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ）。 【００１０】遺伝子工学的に操作された微生物を本発明
方法に使用する場合も良好な収量が得られる。ｔｙｒＢ
遺伝子またはｉｌｖＥ遺伝子を含有するプラスミドで形
質転換されたエシェリヒア・コリ ＡＴＣＣ １１３０３
を用いるのが特に好ましく、ここでｔｙｒＢ遺伝子は芳
香族トランスアミナーゼをそしてｉｌｖＥ遺伝子は脂肪
族トランスアミナーゼをそれぞれコードする。かくの如
く操作された菌株は例えば西ドイツ特許出願Ｐ ３６ ３
１ ８２９.９号またはＰ ３６ ３６ ７２２.２号の記載
により調製されうる。 【００１１】アミノ交換反応は培養と同時に行われう
る。その場合、微生物はその生育に最適の培養基中で適
当な好ましい温度条件および通気条件下に培養溶液１リ
ットル当り乾燥重量約４〜６０ｇとなるまで培養するの
が好ましい。それぞれの微生物に最も好都合な条件は当
業者に知られているかまたは簡単な予備実験により判定
されうる。次に細胞を栄養溶液中に、または栄養溶液か
ら分離してα−ケト酸のアミノ化に使用する。アミノ交
換反応は細胞全体を用いてあるいは破壊した細胞を用い
ても実施でき、慣用の破壊法が用いられる。アミノ交換
反応は細胞抽出物、単離された総タンパク質または精製
トランスアミナーゼを用いても同様に実施できる。しか
しながら例えば価格などの実際的理由から、完全な細胞
全体を用いて操作するのが好ましい。しかしながらその
寿命が比較的長いことおよび反応をより良好に調節しう
ることのゆえにトランスアミナーゼを単離使用すること
も同様に好都合でありうる。さらに、微生物または酵素
を固定した形態で使用することも可能である。固定には
知られた方法、好都合には西ドイツ特許出願公開第３，
２３７，３４１号および同第３，２４３，５９１号記載
の方法が用いられる。 【００１２】微生物または単離された酵素系は好ましい
実施形態においては、α−ケト酸およびアミノ基供与体
の添加の下においてそのトランスアミナーゼ活性が著し
くマイナスの影響を受けることがないように生理的緩衝
液中に懸濁する。微生物の量に応じ、微生物の形態でか
または単離された酵素系の形態で反応混合物に添加され
る酵素活性は広範囲に変動しうる。好都合には活性は１
０〜２００００μモル／分・リットルである。反応混合
物は酵素活性１５００〜２０００μモル／分・リットル
に相当する細胞量を含有するのが好ましい。 【００１３】アミノ基供与体としてはアミノ酸が使用さ
れる。どのアミノ酸が用いられるのが好ましいかは実質
上微生物または単離された酵素系の如何によるものであ
るが、これは簡単な予備試験により判定されうる。例え
ばバリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、チロ
シンおよびフェニルアラニン、特にアスパラギン、アス
パラギン酸、グルタミン、グルタミン酸およびグリシン
が適当である。これらのアミノ酸は、Ｌ−形のみが本発
明に利用されるのでＬ−形における遊離の酸または適当
な塩（用いられる培地に相当して）として使用される。
Ｌ−第三ロイシンの製造にはα−ケト酸として３,３−
ジメチル−２−オキソブタン酸が使用される。その塩も
使用でき、その場合当然トランスアミナーゼ活性に著明
にマイナスに影響しないイオンが選択される。ナトリウ
ム、カリウムおよびアンモニウム塩が好ましい。アミノ
基供与体はα−ケト酸に対し等モル量または過剰に添加
される。１：１〜５：１好ましくは１：１〜２：１なる
割合が適当であることが判明した。 【００１４】反応混合物への反応体の添加は、水中にお
ける溶液としてまたは固形物質を添加することにより同
時に行われうる。しかしながら、反応混合物の重量に基
づき０.１〜４.５％特に０.２〜２％の量で１〜９０時
間好ましくは２〜４０時間にわたり段階的にまたは継続
的に添加するのが好ましい。pH５〜９、特にpH７〜８.
５で操作するのが好ましい。その他アミノ変換反応は１
０℃〜６５℃、特に２０〜５０℃の温度範囲で実施する
のが好都合である。これより温度が低いと酵素反応が遅
くなってゆき、一方これより温度が高いと酵素が不活化
されてゆく。 【００１５】最も好都合な操作法はそれぞれの微生物の
如何に応じたものであり、そして簡単な予備試験により
容易に決定されうる。微生物をアミノ交換反応期間前ま
たは期間中は浸透性となすことが特に好都合であると判
明した。これはトルエン、セチルトリメチルアンモニウ
ムブロマイド、ジメチルスルホキシド等のような適当な
薬剤をインキュベーション培地に添加することによりな
されうる。 【００１６】以下の例および実施例により本発明をより
詳細に説明する。％記載は別に断りなければ重量による
ものとする。 【００１７】例１ 微生物の培養と後処理 寄託されるかまたは自由に入手しうる前記細菌をＬＢ−
培地〔Luria-Bertani−培地：１リットル当り１０ｇバ
クト(Bacto)−トリプトン／５ｇパクト酵母抽出物／１
０ｇ ＮａＣｌ（pH７.５）〕またはＭ９−最少培地〔１
リットル当り６ｇ Ｎａ2ＨＰＯ4／３ｇ ＫＨ2ＰＯ4／
０.５ｇ ＮａＣｌ／１ｇ ＮＨ4Ｃｌ／２ml１Ｍ ＭｇＳ
Ｏ4＋１０ml ２０％グルコース＋０.１ml １Ｍ ＣａＣ
ｌ2＋１ml１％ビタミンＢ１（サイアミン）（pH７.
４）〕中の液体培養液４００ml中で３０℃（エシェリヒ
ア・コリ以外の全ての細菌）または３７℃（エシェリヒ
ア・コリ ＤＨ１）で一夜培養した。次に細菌を遠心分
離しそして細胞ペレットをpH７.０の洗浄緩衝液（１０m
M Ｎａ2ＨＰＯ7、１０mM ＮａＣｌ）中で数回洗いそし
て終りに細胞ペレット３ｇにつき洗浄緩衝液５ml中に懸
濁した。この細胞を１分間の超音波処理を５回行うこと
により崩壊させそして細胞断片を遠心分離した。かくし
て得られた溶解物上澄み液は−２０℃で数ケ月間保存さ
れうる。 【００１８】例２ タンパク質の単離 タンパク質を単離するには、溶解物上澄み液５mlずつに
洗浄緩衝液を加えてそれぞれ５０mlとなしそして硫酸ア
ンモニウムを６５％まで添加することによりタンパク質
を沈澱させた。１００００ｇで１５分間遠心分離したの
ちタンパク質ペレットを１０mM Ｎａ2ＨＰＯ4（pH７.
０）、１mM ＥＤＴＡ、２％グリセリンおよび１mMジチ
オトレイトール（ＤＴＴ）を含有する溶液５ml中にそれ
ぞれ再懸濁させた。これらの懸濁液も同じく−２０℃で
保存されうる。精製効果をより良くするためにタンパク
質の一部は硫酸アンモニウムで２回沈澱させた。 【００１９】タンパク質測定はビウレット法で行われ
た。前記した教示に従って行われた調製物中のタンパク
質含量は大抵の場合５〜１０mg／mlであった。アルカリ
ゲネス・フエカリス ＤＳＭ ４１１５およびロドコッカ
ス種 ＤＳＭ ４１１３から得られるトランスアミナーゼ
の部分精製を行うには、硫酸アンモニウムをそれぞれ１
０％刻みで２５％から７５％添加してタンパク質を分別
沈澱させそして個々のフラクションのトランスアミナー
ゼ活性について検査（下記参照）した。最大の比活性を
有するタンパク質フラクションをセファデックスＧ １
００を含有するゲル濾過カラムに適用しそして１０mMの
Ｎａ2ＨＰＯ4（pH７.０）を用いて溶離した。トランス
アミナーゼ比活性が最大である溶出液フラクションを硫
酸アンモニウムで反復沈澱させることにより濃縮しそし
て１０mM Ｎａ2ＨＰＯ4（pH７.０）、１mM ＥＤＴＡ、
２％グリセリンおよび１mM ＤＴＴを含有する溶液中に
５mg／mlとなるようにとった。（セファデックス(Sepha
dex)RＧ １００）ポリデキストランカラムフラクション
の分子量は標準分子量タンパク質との比較により測定し
た。単離されたトランスアミナーゼフラクションの純度
はタンパク質試料を１０％ＳＤＳ／ポリアクリルアミド
ゲル中で電気泳動することにより検査した。 【００２０】例３ 液体培養におけるホスフィノスリシン合成試験 唯一のＮ源として３ｇ／リットル（２０mM）のＬ−グル
タミン酸および２ｇ／リットル（１０mM）のナトリウム
−（３−カルボキシ−３−オキソ−プロピル）−メチル
ホスフィネートを含有するＬＢ培地中の各細菌菌株の５
ml培養物を３０℃で調製した。１日および２日後に１ml
の試料を採取しそして細菌細胞を９５℃に２０分間加熱
することにより殺した。遠心分離したのち上澄み液をと
り出しそしてアミノ酸分析器（ＡＡ−分析器）中でホス
フィノスリシン形成について検べた。アルカリゲネス・
フエカリスＤＳＭ ４１１５は２４時間後に基質を０.３
ｇ／リットルのＬ−ホスフィノスリシン（α−ケト酸に
基づき１５％の変換率）に変換した。４８時間後には５
ｇ／リットルのＬ−ホスフィノスリシン（２５％の変換
率）が得られた。 【００２１】例４ 細胞抽出物およびタンパク質単離物を用いるトランスア
ミナーゼ試験 細菌の溶解物上澄み液および単離された総タンパク質、
ならびにアルカリゲネス・フエカリス ＤＳＭ ４１１５
およびＤＳＭ ４１１３から得られた富化されたトラン
スアミナーゼフラクションを１０mM Ｎａ2ＨＰＯ4およ
び１０mM ＮａＣｌ（pH７.０）を含有する溶液を用いて
タンパク質含量２０〜６０mg／mlに調整しそしてＮＨ2
−供与体としての８０mM Ｌ−グルタミン酸および２０m
Mナトリウム−（３−カルボキシ−３−オキソ−プロピ
ル）−メチルホスフィネートを含有する標準バッチ中３
０℃でインキュベーションした。実験条件の如何に応じ
インキュベーション時間０〜２４時間で１００μｌの試
料を採取し、タンパク質を９５℃で１０分間変性させ、
遠心分離しそして反応上澄み液をＡＡ−分析器中でホス
フィノスリシンについて検査した。対照反応は何ら供与
体アミノ酸またはナトリウム−（３−カルボキシ−３−
オキソ−プロピル）−メチルホスフィネートを含有しな
いか、または熱不活化したタンパク質（９５℃、１０分
間）を用いて行われた。 【００２２】特異的なトランスアミナーゼ阻害剤として
１０mMのヒドロキシルアミンを添加することによりホス
フィノスリシン形成が完全に抑制された。ホスフィノス
リシン−トランスアミナーゼ比活性はタンパク質１mgに
つき１時間につき形成されたホスフィノスリシンのｎモ
ルで示され、アミノ交換の反応性はタンパク質１mg当り
または１リットル当り１分間で生成されるホスフィノス
リシンのμモル（Ｕ／タンパク質mgまたはＵ／リット
ル）で示される。１単位（Ｕ）はＬ−ホスフィノスリシ
ンへの変換毎分１μモルに相当する。 【００２３】ａ） 溶解物上澄み液（未精製）を用いる
Ｌ−ホスフィノスリシン（ＰＴＣ）合成 【表１】【００２４】ｂ） 単離された全タンパク質（(ＮＨ4)2
ＳＯ4で精製）を用いるＬ−ＰＴＣ合成 【表２】 【００２５】ｃ） 精製トランスアミナーゼ酵素を用い
るＬ−ＰＴＣ合成 【表３】 【００２６】例５ ホスフィノスリシン合成の立体選択性に関する試験 アミノ変換反応によるホスフィノスリシン生成に関する
立体特異性をＮ−アセチルトランスフェラーゼ反応によ
り検査した。この酵素は２〜３の土壌細菌で検出（例え
ば西ドイツ特許出願Ｐ ３６ ２８ ７４７.４）されそし
て知られた方法で単離されうる。このものはＬ−ホスフ
ィノスリシンとのみ立体特異的に反応してそれがアセチ
ル−ＣｏＡ−依存性反応により定量的に対応するＮ−ア
セチル誘導体に変換される。試験においては、アミノ交
換反応によりホスフィノスリシンが形成されている例４
で得られた反応上澄み液をアルビカンス・フエカリス
ＤＳＭ ４１１５から得られたタンパク質（１mg／ml）
および１０mMのアセチル ＣｏＡと３０℃で５時間イン
キュベーションした。反応上澄み液を次に再び未反応ホ
スフィノスリシンについてＡＡ−分析器で検査した。ア
ミノ交換反応により酵素的に形成されたホスフィノスリ
シンはそれぞれＮ−アセチルトランスフェラーゼ反応に
より完全に崩壊された。これはアミノ変換反応の立体選
択性を証明している。純粋なＬ−ホスフィノスリシンが
形成されている。 【００２７】例６ エシェリヒア・コリ ＡＴＣＣ １１３０３の選択 エシェリヒア・コリ ＡＴＣＣ １１３０３を常法により
培養しそしてE. Adelberg氏他の「Biochem. Biophys. R
es. Comm.」18, 788(1965)の記載によりＮ−メチル−Ｎ
−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン(ＭＮＧ)を用いて突
然変異させた。ＭＮＧで処理した細胞を下記組成を有す
る圧熱滅菌された寒天上に画線した。 フマル酸 ５ｇ／リットル 肉エキス ２０ｇ／リットル アスパラギン酸 ２０ｇ／リットル ＫＨ2ＰＯ4 ２ｇ／リットル ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０.５ｇ／リットル ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ０.１ｇ／リットル 寒天 ２０ｇ／リットル 水酸化ナトリウム溶液を用いてpH７.２に調整 【００２８】フェニルピルベートの滅菌濾過された溶液
をまだ熱い寒天溶液にフェニルピルベートの最終濃度が
２４ｇ／リットルとなるように注いだ。このプレートを
３７℃で４日間インキュベーションした。直径１mm以上
のコロニーを単離した。生育する菌株の２０％が出発菌
株に比較して高いトランスアミナーゼ活性を有してい
た。トランスアミナーゼ活性はSigmaテストキットＧ ０
３９０を用いて測定された。 【００２９】例７ ａ．エシェリヒア・コリからのコスミドｐＩＭＳ ６０
２６の単離および消化 トランスポゾンＴｎ ９０３のカナマイシン抵抗性が存
在する商業的に入手しうるＥｃｏＲＩ断片(Pharmacia社
製、Uppsala、スウェーデン）を、コスミドｐＬＡＦＲ
Ｉ（ＡＴＣＣ ３７１６７）の独特のＥｃｏＲＩ切断部
位中にクローニングすることによりコスミドｐＩＭＳ
６０２６を誘導する。ＢａｍＨＩでの消化そして続く再
連結により商業的に入手しうるＥｃｏＲＩ断片の大部分
が欠失されて、１個のＢａｍＨＩ切断部位が２個のＥｃ
ｏＲＩ切断部位により両側をはさまれた短いＤＮＡ片の
みが挿入物として残存する。エシェリヒア・コリ ＨＢ
１０１からコスミドｐＩＭＳ ６０２６を単離するにはH
umphreys氏他の方法〔Biochim. Biophys. Acta 383, 45
7〜63(1975)〕またはBirnboim氏他によるアルカリ分解
〔Nucleic Acids Res. 7, 1513(1979)〕のいずれかに従
い１０倍の規模で実施した。いずれの場合もプラスミド
ＤＮＡはＣｓＣｌ／ＥｔＢｒ密度勾配遠心分離により少
なくとも１回は精製した。 【００３０】このコスミドｐＩＭＳ ６０２６を製造者N
ew England Biolabsの教示に従い操作して制限酵素Ｂａ
ｍＨＩで完全に消化した。この消化が完結したかどうか
検査するには制限調製物の一部分を０.８％アガロース
ゲルに適用して電気泳動にかけた。エチジウムブロマイ
ドで着色しそして短波長ＵＶ光線（２５４nm）で照射し
て１本のバンドのみが見られる場合は完全な消化を示す
ものとされた。消化されたコスミドＤＮＡからフェノー
ル処理により制限酵素を除去し、ＤＮＡをエタノールで
沈澱させ、７０％エタノールで洗いそして真空下に乾燥
したのち適当量のＴＥ緩衝液（１０mMのトリスおよび１
mMのＥＤＴＡ、pH８.０）中にとった。選択により、製
造者Boehringer Mannheimの教示に従いアルカリホスフ
ァターゼでさらに処理した。１μｌのアルカリホスファ
ターゼ（ＣＩＰ）を添加したのち３７℃で３０分間イン
キュベーションし、フェノール処理により反応混合物か
ら酵素を除去し、そしてＤＮＡを前記したようにして精
製した。これを終りにＴＥ緩衝液中に再懸濁した。 【００３１】ｂ．エシェリヒア・コリ ＡＴＣＣ １１３
０３からのＤＮＡの部分消化 Marmur氏の「I. Mol. Biol.」53, 155〜162(1961)記載の
方法に従いエシェリヒア・コリ ＡＴＣＣ １１３０３か
ら全ＤＮＡを単離した。この単離された全ＤＮＡを制限
酵素Ｓａｕ３Ａを用いて部分消化すると主に２０〜３０
kbの寸法の断片が生成した。この目的には予備実験にお
いてこの反応に最適のＤＮＡ：酵素比ならびにＤＮＡに
及ぼす酵素の最適作用時間が判定された。適当な操作法
はＢＲＬ社から出されたパンフレット「Focus」7(2), 3
(1985)に記載されている。最適と定められた反応時間経
過後、酵素を６５℃に１０分間加熱することにより破壊
しそして所望の寸法範囲内のＤＮＡ断片が形成されたか
どうかをアガロースゲル電気泳動により適当なＤＮＡ−
マーカー例えばファージλのＥｃｏＲＩ消化されたＤＮ
Ａを用いて検査した。 【００３２】ｃ．制限部位の連結 エシェリヒア・コリ ＡＴＣＣ １１３０３から得られる
総ＤＮＡをＳａｕ３Ａで部分消化したものをＢａｍＨＩ
で完全に切断しそしてアルカリホスファターゼ処理した
ｐＩＭＳ ６０２６コスミドＤＮＡと約１：５なるモル
比で混合した。生成した混合物を、New England Biolab
sの教示に従い酵素Ｔ４−ＤＮＡリガーゼにとって最適
のイオン濃度を生ずるように数倍濃度の緩衝液で処理
し、そして酵素１μｌと一緒に１６℃で少なくとも１４
時間インキュベーションした。反応混合物の総量は５０
μｌであり、総ＤＮＡ濃度は２０μｇ／mlであった。 【００３３】ｄ．λ−ファージ中へのパッケージング リガーゼ反応が行われた後、例３で得られたＤＮＡをin
vitroでλ−ファージの頭部にパッケージングした。こ
の目的に必要な抽出物はB. Hohn氏「Recombinant DNA,
Methods in Enzymology」68, Academic Press, New Yor
k, 299〜309頁（1979)記載の方法により２種の異なる細
菌菌株から得ることができるし、またはBoshringer Man
nheim社またはAmersham Buchler, Brunswick社から得ら
れうる。例３で得られた混合物３μｌを直前に解凍され
たAmersham社の細菌抽出物と氷冷下に充分によく混合し
た。この混合物を２０℃で３０〜６０分間インキュベー
ションしそして次にＳＭ−緩衝液（１００mM ＮａＣ
ｌ、１０mM ＭｇＳＯ4、５０mMトリス−ＨＣｌ（pH７.
５）および０.０１％ゼラチン）２００μｌを加えた。
この混合物を直接形質導入反応にかけるかまたは１０μ
ｌのクロロホルムを添加したのち後程の使用時まで４℃
で保存した。 【００３４】ｅ．エシェリヒア・コリ ＤＧ ３０の形質
導入 １％Bacto−トリプトン、０.５％酵母エキスおよび０.
５％ＮａＣｌからなるＬ−ブイヨン５mlに０.４％のマ
ルトースを加えそして定常生長期にあるエシェリヒア・
コリ ＤＧ ３０の液体培養物５０μｌを接種した。早期
定常期に達するまでこの混合物を３７℃で１２時間イン
キュベーションした。細菌を遠心分離しそして１０ミリ
モルＭｇＣｌ2水溶液２.５ml中に注意深く再懸濁した。
例４記載の混合物１０μｌに濃細菌懸濁液２０μｌを加
えそして室温で５０分間インキュベーションした。次に
Ｌ−ブイヨン２００μｌをこれに加え、この混合物を時
々振盪しながら３７℃で１時間インキュベーションし
た。この調製物５０μｌずつを２０μｇ／mlのテトラサ
イクリンを含有するＬ−ブイヨン−寒天上に塗布した。
このプレートを３７℃で少なくとも１２時間インキュベ
ーションした。前記した操作法により、１つの調製物か
ら平均１０００個のコロニーを得ることができた。 【００３５】ｆ．ａｓｐＣ、ｉｌｖＥまたはｔｙｒＢ遺
伝子を有するエシェリヒア・コリ ＤＧ ３０の選択 ２０μｇ／mlのテトラサイクリンを含有するＬ−ブイヨ
ン−寒天上で前記した方法に従いエシェリヒア・コリ
ＤＧ ３０の形質導入により得られた約８００個のコロ
ニーを最少寒天上に「拾い移し」た。最少寒天はアミノ
酸イソロイシン、ロイシン、バリン、アスパラギン酸お
よびフェニルアラニンを補充された、グルコース含有Ｍ
９培地（Miller, 「Experiments in Molecular Genetic
s」, Cold Spring Harbor, 1972)からなる。しかしなが
ら菌株ＤＧ ３０が同じく最早や合成できないアミノ酸
チロシンは培地に添加されなかった。８００個の「拾い
移し」たコロニーのうち７個が最少培地上で生育でき
た。エシェリヒア・コリ ＤＧ ３０中の３種のありうる
遺伝子ａｓｐＣ、ｉｌｖＥおよびｔｙｒＢを区別するた
めにこれら７種のコロニーを、遺伝子の１つによりコー
ドされるトランスアミナーゼの１つに対して基質特異性
を示す１アミノ酸をそれぞれ除外して前記したアミノ酸
を補充した前記最少培地上に再び「拾い移し」た。その
結果を以下の表に示す。 【００３６】 【表４】 【００３７】ｇ．ｔｙｒＢ遺伝子の位置測定 Maniatis氏他、Cold Spring Harbor, 366〜370(1982)に
よるミニ分析を行うことにより、例６で得られたクロー
ン１〜７からコスミドＤＮＡが得られた。次にこのコス
ミドＤＮＡをエシェリヒア・コリ ＤＨ１（ＡＴＣＣ ３
３８４９）中に導入し、そこからこれらは良好な収率で
再び単離できた。本来エシェリヒア・コリ ＤＧ ３０
（例６参照）のクローン３から得られたプラスミドＤＮ
Ａを、このＤＮＡで形質転換された菌株エシェリヒア・
コリ ＤＨ１から単離しそして制限酵素ＳａｌＩおよび
ＳｍａＩを用い製造者New EnglandBiolaboの教示に従い
完全に消化した。ベクターｐＡＴ １５３もＣｌａＩを
用いて完全に消化し、これを次にアルカリホスファター
ゼでさらに処理した。２種のＤＮＡを一緒にし、例４記
載の方法に従い相互に連結しそして菌株エシェリヒア・
コリ ＡＴＣＣ １１３０３のコンピテントな細胞をリガ
ーゼ調製物の一部分、例えば１０μｌを用いて形質転換
した。５０μｇ／mlのアンピシリンを含有するＬ−ブイ
ヨンプレート上の抵抗性のコロニーを選択し、そして２
０μｇ／mlのテトラサイクリンを含有するＬ−ブイヨン
プレート上の「レプリカ培養」によりマーカー不活化お
よび従ってとり込みについて検査した。表現型ＡｐｒＴ
ｃｓを示すコロニーから、ミニ分析法によりプラスミド
ＤＮＡを単離しそして制限酵素ＣｌａＩを用いて完全に
消化することによりベクターｐＡＴ １５３中における
ＣｌａＩ断片の存在について検査した。 【００３８】ｈ．トランスアミナーゼ活性の検査 例７で得られたクローンをＡＰＰＡＴ試験（フェニルピ
ルベート−アミノトランスフェラーゼ分析装置、Sigma
−テストキットＧ０３９０、α−ケトグルタレートをフ
ェニルピルベートにより置換を用い芳香族トランスアミ
ナーゼ活性、すなわちｔｙｒＢの遺伝子産物について検
査した。形質転換されていない出発菌株エシェリヒア・
コリ ＡＴＣＣ １１３０３を比較用に用いた。ここで１
例においては出発菌株エシェリヒア・コリ ＡＴＣＣ １
１３０３に比較してｔｙｒＢ活性の著明な増加、すなわ
ち５〜１０倍の増加が測定された。適当なマーカーを使
用するアガロースゲル電気泳動により、約２.７ＭＤの
寸法のＣｌａＩ断片がとり込まれて含有されるｐＡＴ
１５３ベクターがｔｙｒＢ遺伝子活性の増大を示す菌株
中に含有されることを示すことができた。単離されたプ
ラスミドＤＮＡを用いて新たにプラスミド不含菌株エシ
ェリヒア・コリ ＡＴＣＣ １１３０３を形質転換した場
合、あらゆる場合にｔｙｒＢ遺伝子活性が約５〜１０倍
増加することが観察された。ｉｌｖＥ遺伝子を用いるエ
シェリヒア・コリ ＡＴＣＣ １１３０３の形質転換も同
様な方法で行われる。 【００３９】実施例１ Ｌ−第三ロイシンの調製 ａ．エシェリヒア・コリ ＡＴＣＣ １１３０３の例６
により選択された菌株を下記栄養溶液中で培養した。 フマル酸 １０ｇ／リッ
トル 肉エキス ２０ｇ／リッ
トル アスパラギン酸 ８ｇ／リッ
トル ＫＨ２ＰＯ４ ２ｇ／リッ
トル ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ／
リットル ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．１ｇ／
リットル ３，３−ジメチル−２−オキソブタン酸 ４ｇ／リッ
トル 水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨ７．４に調整 ３７℃で４８時間生育させた後、細胞を遠心分離した。
ＲＰＣ−８カラム上のＨＰＬＣ（移動相、１００ｍＭの
Ｎａ−アセテート（ｐＨ７．２）およびメタノールから
なるグラジエント）により上澄み液中に０．９ｇ／リッ
トルのＬ−２−アミノ−３，３−ジメチルブタン酸（第
三ロイシン）が測定された。 【００４０】ｂ．細胞物質を実施例１ａと同様にして培
養しそして１０ミリモル／リットルのトリス−ＨＣｌ緩
衝液（ｐＨ７．４）中の１０ｇ／リットルのアスパラギ
ン酸および４ｇ／リットルの３，３−ジメチル−２−オ
キソブタン酸からなる溶液中で振盪しながらインキュベ
ーションした。３７℃で２４時間後、ＨＰＬＣにより
１．９ｇ／リットルのＬ−２−アミノ−３，３−ジメチ
ルブタン酸が測定された。 【００４１】 【００４２】 【００４３】
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 ハンス−マテイーアス・デガー
ドイツ連邦共和国デー−6238ホフハイ
ム・アム・タウヌス．アム・ラインガウ
アーヴエーク８
(72)発明者 ズザネ・グラープライ
ドイツ連邦共和国デー−6240ケーニヒシ
ユタイン／タウヌス．ヘルダーリーンシ
ユトラーセ７
(72)発明者 リユーデイガー・マルクヴアルト
ドイツ連邦共和国デー−6000フランクフ
ルト・アム・マイン．ギユンタースブル
クアレー69
(56)参考文献 特開 昭60−91993（ＪＰ，Ａ)
特開 昭60−102194（ＪＰ，Ａ)
特開 昭61−21091（ＪＰ，Ａ)
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．３，３−ジメチル−２−オキソブタン酸またはその
塩をアミノ基供与体としてのアミノ酸の存在下にエシェ
リヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属の微生物を用いて
アミノ交換することからなるＬ−第三ロイシンの製法。 ２．微生物がエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ ｃｏｌｉ）ＡＴＣＣ １１３０３である請求項１
記載の方法。 ３．遺伝子操作をした微生物を用いてアミノ交換反応が
行われることからなる請求項１または２記載の方法。 ４．ｔｙｒＢ遺伝子またはｉｌｖＥ遺伝子を含有するプ
ラスミドで形質転換されたエシェリヒア・コリＡＴＣＣ
１１３０３を用いてアミノ交換反応が行われることか
らなる請求項３記載の方法。 ５．細胞抽出物、単離された総タンパク質または精製ト
ランスアミナーゼを用いてアミノ交換反応が行われるこ
とからなる請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。 ６．アミノ基供与体と３，３−ジメチル−２−オキソブ
タン酸とが１：１〜５：１の比率で用いられることから
なる請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。 ７．アミノ基供与体と３，３−ジメチル−２−オキソブ
タン酸とが１：１〜２：１の比率で用いられることから
なる請求項６記載の方法。 ８．アミノ交換反応がｐＨ５〜９で実施されることから
なる請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。 ９．アミノ交換反応がｐＨ７〜８．５で実施されること
からなる請求項８記載の方法。
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