FR2590592A1 - Fragment d'adn contenant un gene codant pour une enzyme catalysant une reaction dans le cycle tca et adn recombinant le contenant. - Google Patents

Abstract

L'invention concerne un fragment d'ADN dérivé d'une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique. Selon l'invention, il contient un gène codant pour une enzyme catalysant une réaction pour la synthèse de l'alpha-cétoglutarate à partir de l'oxaloacétate et de l'acétyl CoA dans le cycle TCA ; elle concerne également un ADN recombinant contenant le fragment d'ADN ainsi qu'un micro-organisme contenant l'ADN recombinant ; le dessin joint montre la carte de clivage par endonucléase de restriction d'un plasmide pAG401. L'invention s'applique notamment à la production d'acides aminés, d'acides nucléiques et analogues à un haut rendement. (CF DESSIN DANS BOPI)

Description

La présente invention se rapporte à un fragment d'ADN contenant un gène codant pour une enzyme catalysant une réaction dans le cycle de l'acide tricarboxylique (que l'on appellera souvent ci-après "cycle TCA"). Plus particulièrement, la présente invention concerne un fragment d'ADN dérivé d'une bactérie corynéforme productrice de l'acide glutamique, qui contient un gène codant pour une enzyme catalysant une réaction pour synthétiser 1' -cétoglutarate à partir d'oxaloacétate et d'acétyl
CoA dans le cycle TCA. La présente invention concerne également un ADN recombinant contenant le fragment d'ADN et un micro-organisme contenant l'ADN recombinant.

Dans la présente description, les endonucléases de restriction (souvent appelées ci-après simplement "enzyme de restriction") représentées par les abréviations suivantes sont celles obtenues par les micro-organismes suivants, respectivement.

Abréviation Micro-organisme
EcoRI : Escherichia coli RY13
HindIII : Haemophilus influenza Rd
PstI : Providencia stuartii 164
BamHI : Bacillus amyloliquefaciens H
XbaI : Xanthomonas badrii
BglII : Bacillus globigii
SalI : Streptomyces albus G
HaeIII : Haemophilus aegyptius
SacI : Streptomyces achromogenes
XhoI : Xanthomonas holcicola
KpnI : Klebsiella pneumoniae OK8
PvuII : Proteus vulgaris (ATCC 13315)
MluI : Micrococcus luteus (IF012992)
On sait qu'une bactérie corynéforme productrice de l'acide glutamique produit l'acide L-glutamique à un haut rendement et qu'un certain mutant ou variant de la bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique produit d'autres acides aminés comme la L-lysine et des purines nécléotides comme l'acide inosinique.Une telle bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique et son mutant ou variant ont été industriellement utilisés pour la production des acides aminés et des purines nucléotides comme on l'a mentionné ci-dessus.

Pour obtenir une bactérie corynéforme sous une telle forme capable de donner les produits souhaités de manière efficace à un haut rendement, on effectue usuellement une reproduction ou un élevage de la bactérie. En particulier, ces dernières années, on a tenté de reproduire une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique par technique d'ADN recombinant.Jusqu'à maintenant, dans la mise en pratique de la reproduction d'une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique par le moyen d'une technique d'ADN recombinant, les gènes suivants ont été clones
(1) un gène codant pour l'homosérine déshydrogénase dérivé de Brevibacterium lactofermentum [Ishida et autres, résumés des conférences données aux rencontres de la
Society of Fermentation Technology, Japon, page 284 (1983)3,
(2) un gène codant pour la phosphoénolpyruvate carboxylase dérivé de Brevibacterium lactofermentum
EItoh et autres, résumés des conférences données aux rencontres annuelles de la Agricultural Chemical Society au Japon, page 431 (1984)]
(3) un gène codant pour la résistance à la
S-(2-aminoéthyl)-cystéine dérivé de Corynebacterium glutamicum (ATCC 21543) et un gène codant pour l'anthranilate synthétase dérivé de Brevibacterium flavum (ATCC 14067) SKatsumata et autres, divulgation de la demande de brevet au Japon NO 58-126789/19831
-(4) un gène codant pour l'ATP-phosphoribosyltransférase dérivé de Corynebacterium glutamicum tMizugami et autres, résumés des conférences données aux rencontres annuelles de la Agricultural Chemical Society au Japon, page 249 (1984)2 ;;
(5) un gène codant pour l'anthranilate phosphoribosyltransférase dérivé de Brevibacterium lactofermentum (ATCC 13869) ÈMiwa et autres, publication de la demande de brevet au Japon NO 59-196098 (1984)
(6) un gène codant pour la méso-2,6-diaminopimélate carboxylase dérivé de Brevibacterium lactofermentum (ATCC 13869) LSano et autres, divulgation de la demande de brevet au Japon NO 59-210887 (1984) 3;
(7) un gène codant pour l'histidinol phosphatase dérivé de Brevibacterium lactofermentum LNakamori et autres, divulgation de la demande de brevet au Japon NO 60-62983 (1985) ;;
(8) un gène codant pour l'homosérine kinase dérivé de Brevibacterium lactofermentum rNakamori et autres, divulgation de la demande de brevet au Japon NO 60-62982 (1985)
(9) un gène codant pour la sous-unité P de la chorismate mutase dérivé de Brevibacterium lactofermentum pNakamori et autres, divulgations de demandes de brevets au Japon NOs 60-66984 (1985) et 60-70093 (1985)1 ; et autres.

La plupart des acides aminés, des acides nucléiques et autres, sont directement ou indirectement produits à partir d'intermédiaires formés dans le cycle TCA. Le cycle TCA est une séquence de réactions enzymatiques se produisant dans les cellules. Dans le cycle TCA, 1' A-cétoglutarate, l'un des intermédiaires du cycle TCA, est synthétisé de l'oxaloacétate et de l'acétyl CoA par les réactions enzymatiques. Les enzymes qui catalysent les réactions enzymatiques sont la citrate synthase (souvent appelée ci-après "CS"), l'aconitate hydratase (souvent appelée ci-après "AH") et l'isocitrate déshydrogénase (souvent appelée ci-après "ICDH").CS, AH et ICDH catalysent la première étape, la seconde étape et la troisième étape des réactions enzymatiques pour la synthèse de 1' l'.i-cétoglutarate à partir de l'oxaloacétate et de l'acétyl CoA dans le cycle TCA, respectivement.

Si les activités des enzymes ci-dessus mentionnées peuvent être accrues dans les cellules de la bactérie produisant l'acide glutamique ci-dessus mentionnée, les réactions enzymatiques du cycle TCA dans les cellules de la bactérie sont favorisées, permettant la production d'acides aminés,d'acides nucléiques et autres, à un haut rendement par fermentation en utilisant la bactérie.

Cependant, jusqu maintenant, aucun moyen efficace n'a été proposé pour augmenter les activités des enzymes dans les cellules d'une bactérie. Par conséquent, le rendement des acides aminés et des acides nucléiques, et autres, obtenus par mise en culture d'une bactérie,n'est pas encore satisfaisant.

Les présents inventeurs ont fait des études intensives pour surmonter les problèmes ci-dessus mentionnés. Par suite, ils ont réussi à isoler un fragment d'ADN, dérivé d'une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique, contenant un gène codant pour une enzyme qui catalyse une réaction pour la synthèse de l'O(-céto- glutarate à partir de l'oxaloacétate et de l'acétyl CoA et ont réussi à cloner le fragment d'ADN. De même, on a trouvé que lorsqu'un tel fragment d'ADN est inséré à un vecteur pour obtenir un ADN recombinant et qu'une cellule d'un micro-organisme est alors transformée par le recombinant obtenu, l'activité de l'enzyme dans la cellule du micro-organisme transformé peut être accrue. Ainsi, la présente invention a été accomplie.

Par conséquent, la présente invention a pour objet un fragment d'ADN contenant un gène codant pour l'enzyme ci-dessus mentionnée, qui est utile pour la production d'acides aminés, d'acides nucléiques, et autres, à un haut rendement.

La présente invention a pour autre objet un ADN recombinant contenant le fragment d'ADN ci-dessus mentionné.

La présente invention a pour autre objet un microorganisme contenant l'ADN recombinant ci-dessus mentionné.

L'invention sera mieux comprise, et d'autres buts, caractéristiques, détails et avantages de celle-ci apparaîtront plus clairement au cours de la description explicative qui va suivre faite en référence aux dessins schématiques annexés donnés uniquement à titre d'exemple illustrant plusieurs modes de réalisation de l'invention et dans lesquels
- la figure 1 illustre la carte de scission par endonucléase de restriction d'un plasmide pAG401 de la présente invention;
- la figure 2 illustre la carte de scission par endonucléase de restriction d'un plasmide pAGSO1 de la présente invention;
- la figure 3 illustre la carte de scission par endonucléase de restriction d'un plasmide pAG302 de la présente invention;;
- la figure 4 illustre la carte de scission par endonucléase de restriction d'un plasmide pAG303 de la présente invention;
- la figure 5 illustre la carte de scission par endonucléase de restriction d'un plasmide pAG311 de la présente invention;
- la figure 6 illustre la carte de scission par endonucléase de restriction d'un plasmide pAG1 utilisé dans la présente invention;
- la figure 7 illustre la carte de scission par endonucléase de restriction d'un plasmide pAG3 utilisé dans la présente invention;
- la figure 8 illustre la carte de scission par endonucléase de restriction d'un plasmide pAG14 utilisé dans la présente invention;
- la figure 9 illustre la carte de scission par endonucléase de restriction d'un plasmide pAGSO utilisé dans la présente invention;;
- la figure 10 illustre la carte de scission par endonucléase de restriction d'un plasmide pAG40ûl de la présente invention;
- la figure 11 illustre la carte de scission par endonucléase de restriction d'un plasmide pAG4002 de la présente invention;
- la figure 12 illustre la carte de scission par endonucléase de restriction d'un plasmide pAG4003 de la présente invention;
- la figure 13 illustre la carte de scission par endonucléase de restriction d'un plasmide pAG5QO1 de la présente invention; et
- la figure 14 illustre la carte de scission par endonucléase de restriction d'un plasmide pAG3001 de la présente invention.

Sur les figures 1 à 14, les positions sur la carte des divers sites de restriction sont données en coordonnées de kilobases (ci-après, kilobase sera appelée"kb") relativement au site de restriction de XbaI à 0,0/10,9 kb sur la figure 1, au site de restriction de XbaI à 0,0/8,8 kb sur la figure 2, au site de restriction de EcoRI à 0,0/11,1 kb sur la figure 3, au site de restriction de
EcoRI à 0,0/7,5 kb sur la figure 4, au site de restriction de SalI à 0,0/9,4 kb sur la figure 5, au site de restriction de XbaI à 0,0/20,4 kb sur la figure 6, au site de restriction de HindIII à 0,0/4,5 kb sur la figure 7, au site de restriction de XbaI à 0,0/10,6 kb sur la figure 8, au site de restriction de BamHI à 0,0/7,6 kb sur la figure 9, au site de restriction de XbaI à 0,0/12,5 kb sur la figure 10, au site de restriction de BamHI à 0,0/10,8 kb sur la figure 11, au site de restriction de BamHI à 0,0/10,4 kb sur la figure 12, au site de restriction de
XbaI à 0,0/12,3 kb sur la figure 13 et au site de restriction de SalI à 0,0/11,0 kb sur la figure 14. Sur la figure 9, ADN-(a) est un fragment d'ADN dérivé du plasmide pAG1, dont la longueur moléculaire est d'environ 3,1 kb et qui contient un gène pour la résistance à la tétracycline.

Essentiellement, selon la présente invention, on prévoit un fragment d'ADN, dérivé d'une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique, contenant un gène codant pour une enzyme qui catalyse une réaction pour la synthèse de l' -cétoglutarate à partir de l'oxaloacétate et de l'acétyl CoA dans le cycle TCA.

Par ailleurs, selon la présente invention, on prévoit un-ADN recombinant comprenant un premier fragment d'ADN, dérivé d'une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique, contenant un gène codant pour une enzyme qui catalyse une réaction pour la synthèse de 1' Of-cétoglutarate à partir de l'oxaloacétate e-t de l'acétyl
CoA dans le cycle TCA et un second fragment d'ADN contenant un gène pour la- réplication dans une cellule d'une bactérie, ledit premier fragment d'ADN étant directement ou indirectement lié audit second fragment d'ADN.

Par ailleurs, selon la présente invention, on prévoit un micro-organisme qui comprend une bactérie et l'ADN recombinant ci-dessus mentionné, ledit ADN recombinant étant contenu dans ladite bactérie.

La bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique est une bactérie non mobile et aérobie, à
Gram-positif , qui ne forme pas de spore et nécessite de la biotine pour sa croissance, et qui produit l'acide
L-glutamique à un haut rendement dans un milieu contenant de la biotine en une quantité limitée ou dans un milieu additionné d'un surfactant contenant de la biotine en une forte quantité. Pour cette bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique, on peut mentionner les bactéries appartenant au genre Corynebacterium, Brevibacterium ou
Microbacterium. Le fragment d'ADN de la présente invention est dérivé de la bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique ci-dessus.

Le fragment d'ADN de la présente invention contient un gène codant pour une enzyme qui catalyse une réaction pour la synthèse de 1' -cétoglutarate à partir d'oxaloacétate et d'acétyl CoA dans le cycle TCA. Pour cette enzyme catalysant la réaction ci-dessus mentionnée, on peut mentionner la citrate synthase (CS), l'aconitate hydratase (AH) et l'isocitrate déshydrogénase (ICDH),
Lorsque le gène codant pour l'enzyme ci-dessus mentionnée est exprimé dans une cellule d'un micro-organisme, CS,
AH ou ICDH est produite dans la cellule.

Le fragment d'ADN contenant un gène codant pour l'enzyme ci-dessus mentionnée peut être isolé de la bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique par clonage du gène dans un système hôte-vecteur habituel.

Pour l'hôte, on peut employer, par exemple, Escherichia coli (que l'on appellera souvent ci-après "E. coli").

Pour E. coli , on peut employer la souche K12 de E. coli et ses variantes. Comme vecteur utilisé dans un système hôte-vecteur où l'on utilise, pour l'hôte,- E. coli ou sa variante, on peut mentionner des plasmides habituellement employés pour transformer E. coli et ses variantes. Par ailleurs, pour l'hôte, on peut également employer
Bacillus subtilis (souvent appelé ci-après "B. subtilis").

Pour B. subtilis , on peut employer la souche 168 de
B. subtilis et ses variantes. Pour le vecteur utilisé dans un système hôte-vecteur où l'on utilise B. subtilis ou ses variantes comme hôte, on peut mentionner des plasmides habituellement employés pour la transformation de B.

subtilis et ses variantes. Par ailleurs, on peut également employer un système hôte-vecteur dans lequel on utilise une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique pour l'hôte et un plasmide habituel compatible avec la bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique est utilisé comme vecteur.

Le fragment d'ADN contenant un gène codant pour l'enzyme ci-dessus mentionnée, c'est-à-dire CS, AH ou ICDH, peut être isolé de la bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique par la méthode suivante.

(1) La totalité de l'ADN est extraite d'une cellule d'une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique et est partiellement scindée par diverses enzymes de restriction pour obtenir des fragments d'ADN.

L'extraction de 1'ADN de la bactérie corynéforme peut être accomplie par une méthode habituelle dans laquelle on effectue le traitement au lysozyme-SDS et le traitement au phénol-chloroforme. Comme enzymes de restriction à employer pour scinder la totalité de l'ADN de la bactérie corynéforme ci-dessus mentionnée, on peut employer toutes les enzymes de restriction tant qu'elles sont capables de scinder non seulement l'ADN de la bactérie corynéforme ci-dessus mentionnée mais également l'ADN du vecteur ci-dessous mentionné d'un système hôte-vecteur à utiliser pour cloner le fragment d'ADN de la présente invention.

Les fragments ainsi obtenus d'ADN comprennent un fragment d'ADN contenant un gène codant pour CS, AH ou ICDH.

(2) Un ADN du vecteur est complètement scindé par au moins l'une des enzymes appropriées de restriction ci-dessus mentionnées pour obtenir un ADN du vecteur scindé.

Pour le vecteur, on doit utiliser ceux qui sont compatibles avec un hôte à transformer ainsi. I1 est nécessaire de confirmer, à l'avance, que le vecteur n'est pas digéré par la bactérie qui est destinée à être utilisée comme hôte.

(3) Les fragments respectifs d'ADN obtenus à l'étape (1) ci-dessus sont séparément insérés dans le site de clivage de l'ADN du vecteur scindé obtenu à l'étape (2) ci-dessus selon toutes méthodes habituelles, par exemple , la méthode de Maniatis et autres (T. Maniatis,
E.F. Fritsch, J. Sambrook: Molecular Cloning A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Laboratory-, Cold Spring Harbour
New York 1982). Ainsi, on obtient des ADN recombinants circulaires qui contiennent un ADN recombinant ayant un fragment d'ADN contenant un gène codant pour CS, AH ou
ICDH.

(4) Les ADN recombinants respectifs sont séparément transférés dans une cellule d'une bactérie pour former des transformants.

La transformation peut être effectuée par une méthode habituelle , par exemple, la méthode de Mandel et autres L Mandel, M., Higa, A.: J. Mol. Biol., 53, 159-162 (1970) i, la méthode de Chang et Cohen Chang, S.,
Cohen, S.N.: Mol. Gen. Gent., 168, 111-115 (1979)3 , et autres.

Comme bactérie à utiliser pour la transformation, on peut mentionner une souche mutante d'une bactérie telle que E. coli , B. subtilis et une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique, laquelle souche est déficiente en l'enzyme catalysant une réaction pour la synthèse de l'OC-cétoglutarate à partir de l'oxaloacétate et de l'acétyl CoA dans le cycle TCA, comme CS, AH ou
ICDH. La raison en est la suivante. La souche mutante nécessite l'acide glutamique pour sa croissance dans le milieu et par conséquent ne peut croître dans un milieu ne contenant pas d'acide glutamique. Cependant, lorsque la souche mutante est transformée par un ADN recombinant contenant un gène codant pour CS, AH ou ICDH, la souche mutante ne nécessite plus l'acide glutamique pour sa croissance et peut croître dans le milieu ne contenant pas d'acide glutamique.Par ailleurs, même si la souche mutante est transformée par un ADN recombinant ne contenant pas de gène codant pour CS, AH ou ICDH, la souche nécessite toujours l'acide glutamique pour sa croissance et ne peut croître dans le milieu ne contenant pas d'acide glutamique. Par conséquent, lorsque les transformants ci-dessus mentionnés sont mis en culture dans un milieu ne contenant pas d'acide glutamique , seul le transformant qui retient un ADN recombinant contenant un gène codant pour CS, AH ou ICDH croît dans le milieu . En conséquence, le transformant souhaité peut facilement et efficacement être choisi et isolé en utilisant une souche mutante d'une bactérie comme on l'a mentionné ci-dessus.

Une telle souche mutante peut être obtenue par des méthodes habituelles. Par exemple, une telle souche mutante peut être obtenue comme suit. D'abord, des cellules de la bactérie ci-dessus mentionnée sont mutées en utilisant la N-méthyl-N'-nitro-N-nitroso guanidine pour obtenir des cellules mutantes. Des cellules mutantes, les cellules mutantes auxotrophes qui nécessitent l'acide glutamique sont choisies et isolées. Les cellules mutantes ainsi isolées sont soumises à des déterminations concernant l'activité de CS, AH et ICDH, et une cellule mutante ne présentant pas d'activité de CS, AH ou ICDH est choisie.

La cellule ainsi choisie est mise en culture pour obtenir une souche mutante déficiente en CS, AH ou ICDH. La mutation d'une bactérie peut également être effectuée par des techniques habituelles, par exemple irradiation aux ultraviolets, irradiation aux rayons X , traitement par divers mutagènes, traitement par des transposons, etc.

Alternativement, la souche connue déficiente en CS, AH ou ICDH peut être obtenue de dépôts publics ayant une telle souche.

(5) Des transformants obtenus à l'étape (4) cidessus, le transformant qui retient un ADN recombinant contenant un gène codant pour CS, AH ou ICDH est choisi et isolé par le critère de l'auxotrophie de l'acide glutamique. A titre d'exemple, les transformants sont mis en culture dans un milieu synthétique ne contenant pas d'acide glutamique à 20 à 370C selon une méthode habituelle.

Les cellules croissant dans le milieu de synthèse ne contenant pas d'acide glutamique sont isolées . Les cellules ainsi isolées sont mises séparément en culture dans le milieu pour obtenir des souches. Les cellules des souches respectives sont recueillies, avec ensuite extraction pour obtenir des extraits de cellules. Les extraits respectifs de cellules sont soumis à une mesure de l'activité de CS, AH et ICDH selon une méthode habituelle pour choisir une souche présentant une activité de CS, AH ou ICDH. La souche présentant l'activité de CS,
AH ou ICDH a un fragment d'ADN contenant un gène codant pour CS, AH ou ICDH. La souche est mise en culture pour cloner le fragment d'ADN. Le fragment d'ADN est isolé des cellules de la souche selon une méthode habituelle. Par exemple, le fragment d'ADN peut être isolé des cellules comme suit.D'abord, des cellules de la souche, l'ADN recombinant contenant le fragment d'ADN souhaité est isolé par une méthode habituelle et l'ADN recombin-ant isolé est digéré par une enzyme de restriction pour obtenir un mélange d'ADN d'un ADN de vecteur et d'un fragment d'ADN contenant un gène codant pour CS, AH ou
ICDH. Alors le mélange d'ADN est soumis à une electrophorèse sur gel agarose pour séparer le mélange d'ADN en ADN du vecteur et fragment d'ADN souhaité. Du gel agarose résultant, une portion qui contient le fragment d'ADN souhaité est découpée et dissoute dans une solution aqueuse comme un tampon, et est soumise à des extractions, successivement, au phénol, au phénol-chloroforme et au chloroforme.L'extrait ainsi obtenu est soumis à une précipitation dans ltéthanol, pour ainsi obtenir le fragment d'ADN souhaité contenant un gène codant pour CS, AH ou ICDH.

L'un des exemples spécifiques du fragment d'ADN de la présente invention est obtenu de la bactérie
Corynebacterium melassecola 801 déposée au Fermentation
Research Institute (appelé ci-après "FR1") sous le numéro d'accession FERM BP-558.

Dans le cas où l'enzyme qui est codée par le gène contenu dans le fragment d'ADN est CS, le fragment d'ADN obtenu de la bactérie ci-dessus mentionnée a les
caractéristiques suivantes
(1) Le fragment d'ADN a une longueur moléculairè
d'environ 4,9 kb.

(2) Le fragment d'ADN a ses deux bouts collants
formés par clivage par XabI.

(3) Le fragment d'ADN a les sites suivants de
clivage par endonucléase de restriction : un
premier site BamHI, un premier site XhoI, un site
SalI, un second site BamHI, un premier site HindIII,
un second site XhoI, un site PstI et un second
site HindIII,
ledit premier site XhoI, ledit site SalI, ledit
second site BamHI, ledit premier site HindIII, ledit
second site XhoI, ledit site PstI et ledit second
site HindIII étant respectivement placés à environ
1,5 kb, environ 3,2 kb, environ 3,2 kb, environ
3,5 kb, environ 3,8 kb, environ 3,8 kb et
environ 4,6 kb dudit premier site BamHI.

Les sites de clivage par endonucléase- de restriction (souvent appelés simplement ci-après "sites de restriction") du fragment d'ADN sont déterminés comme suit. D'abord, l'ADN recombinant contenant le fragment d'ADN est obtenu des cellules de la souche ci-dessus mentionnée par une méthode habituelle. Alors, le fragment d'ADN est obtenu de l'ADN recombinant en utilisant des enzymes de restriction. Le fragment d'ADN ainsi obtenu est complètement digéré en présence d'un excès d'une enzyme de restriction.

Alors, les produits digérés obtenus subissent une électrophorèse sur un gel agarose à 1% (poids/volume) puis sur un gel de polyacrylamide à 4% (poids/volume) selon la méthode de Maniatis et autres (T. Maniatis, E.F. Fritsch,
J. Sambrook: Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold
Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, pages 50-185, 1982). Après accomplissement de l'électrophorèse, le gène résultant est immergé dans une solution aqueuse à 1 pg/mQ de bromure d'éthidium pendant 30 minutes pour teinter le gel. Le gel résultant est irradié d'une lumière ultraviolette et le nombre de fragments résolvables est compté pour déterminer le nombre de sites de restriction. La longueur moléculaire de chacun des fragments scindés est déterminée comme suit.Dans le cas d'une électrophorèse sur gel agarose, des fragments qui sont obtenus par digestion de 1'ADN X phagique de E. coli par HindIII et dont les longueurs moléculaires sont respectivement de 23130 pb, 9419 pb, 6557 pb, 4371 pb, 2322 pb, 2028 pb, 564 pb et 125 pb dans l'ordre de plus grande longueur moléculaire, subissent une électrophorèse sur le même gel agarose pour former des motifs standards de migration des fragments. La longueur moléculaire de chacun des fragments obtenus par digestion du fragment d'ADN est déterminée par comparaison avec les motifs standards de migration.Dans le cas d'un gel de polyacrylamide, les fragments qui sont obtenus par digestion de l'ADN du -X174 phage de
E. coli par HaeIII et dont les longueurs moléculaires sont respectivement de 1353 pb, 1078 pb, 872 pb, 603 pb, 310 pb, 281 pb, 271 pb, 234 pb, 194 pb, 118 pb et 72 pb dans l'ordre de plus grande longueur moléculaire, subissent une électrophorèse sur le même gel de polyacrylamide, pour ainsi former des motifs standards de migration des fragments. La longueur moléculaire de chacun des fragments obtenus par digestion du fragment d'ADN est déterminée par comparaison avec les motifs standards de migration.

Pour déterminer la longueur moléculaire de chaque fragment, dans le cas où la longueur moléculaire du fragment est d'environ 0,1 kb à moins de 1,0 kb, on adopte les données obtenues par l'électrophorèse sur gel de polyacrylamide à 4% (poids/volume). Par ailleurs, dans le cas où la longueur moléculaire du fragment est supérieure à 1,0 kb, on adopte les données obtenues par électrophorèse sur gel agarose à 1% (poids/volume). La longueur moléculaire du fragment d'ADN est obtenue en additionnant les longueurs moléculaires des fragments obtenus par un clivage par enzyme de restriction.

Les sites de restriction du fragment d'ADN peuvent être déterminés par digestion complète du fragment d'ADN par diverses sortes d'enzymes de restriction , par électrophorèse des fragments résultants sur un gel agarose puis sur un gel de polyacrylamide et analyse des résultats obtenus.

Le fragment d'ADN peut être modifié tant.que cela ne nuit pas au gène codant pour CS. Par exemple, une partie du fragment d'ADN peut être éliminée tout en retenant le gène codant pour CS dans le fragment d'ADN pour obtenir un dérivé par délétion du fragment d'ADN.

La délétion partielle du fragment d'ADN peut être effectuée par digestion du fragment d'ADN par une ou plusieurs enzymes de restriction.

Comme exemples spécifiques d'un tel dérivé par délétion, on peut mentionner les fragments d'ADN suivants, par exemple.

(I) Un fragment d'ADN ayant
(1) une longueur moléculaire d'environ 3,2 kb;
(2) les deux bouts collants formés par BamHI; et
(3) les sites de restriction qui suivent
un site XhoI et un site SalI,
ledit site SalI étant placé à environ 1,7 kb
dudit site XhoI.

(II) Un fragment d'ADN ayant une structure telle que le
fragment d'ADN (I) ci-dessus mentionné soit digéré
par SalI, c'est-à-dire ayant
(1) un poids moléculaire d'environ 3,2 kb;
(2) un bout collant formé par clivage par BamHI
et l'autre bout collant formé par clivage par SalI;
et
(3) un site XhoI.

Dans le cas où l'enzyme qui est codée par le gène contenu dans le fragment d'ADN est AH, le fragment d'ADN obtenu du micro-organisme Corynebacterium melassecola 801 ci-dessus mentionné a les caractéristiques suivantes
(1) Le fragment d'ADN a une longueur molécu
laire d'environ 4,7 kb.

(2) Le fragment d'ADN a ses deux bouts collants
formés par clivage par XbaI
(3) Le fragment d'ADN a les sites de clivage
par endonucléase de restriction qui suivent
un premier site PvuII, un site BglII , un premier
site PstI, un second site PstI, un site EcoRI, un
second site PvuII, un troisième site PstI, un
premier site KpnI, un site Mlui, un site SalI, un
site XhoI, un second site KpnI, un quatrième site
PstI, un site SacI, un premier site HindIII et un
second site HindIII,
ledit site BglII,ledit premier site PstI,
ledit second site PstI, ledit site EcnRI, ledit
second site PvuII, ledit troisième site PstI,
ledit premier site KpnI, ledit site MluI, ledit
site SalI, ledit site XhoI, ledit second site KpnI,
ledit quatrième site PstI, ledit site SacI, ledit
premier site HindIII et ledit second site HindIII
étant respectivement placés à environ 0 kb (plus
particulièrement moins de 0,05 kb) mais plus de
O kb, environ 0,5 kb, environ 0,7 kb, environ D,7 kb,
environ 0,9 kb, environ 1,0 kb, environ 1,0 kb,
environ 1,1 kb, environ 1,6 kb, environ 2,1 kb,
environ 2,5 kb, environ 3,1 kb, environ 3,1 kb,
environ 4,0 kb et environ 4,4 kb dudit premier
site PvuII.

Les sites de restriction du fragment d'ADN ci-dessus peuvent être déterminés sensiblement de la même manière qu'on l'a précédemment mentionné.

Le fragment d'ADN peut être modifié tant que cela ne nuit pas au gène codant pour AH. Par exemple, une partie du fragment d'ADN peut être éliminée tout en retenant le gène codant pour AH dans le fragment d'ADN pour obtenir un dérivé par délétion du fragment d'ADN.

La délétion partielle du fragment d'ADN peut etre effectuée par digestion du fragment d'ADN par une ou plusieurs enzymes de restriction.

Dans le cas où l'enzyme qui est codée par le gène contenu dans le fragment d'ADN est-ICDH, le fragment d'ADN obtenu du micro-organisme Corynebacterium melassecola 801 ci-dessus mentionné a les caractéristiques suivantes
(1) Le fragment d'ADN a une longueur
moléculaire d'environ 5,1 kb.

(2) Le fragment d'ADN a ses deux bouts
collants formés par clivage par EcoRi.

(3) Le fragment d'ADN a les sites de clivage
par endonucléase de restriction qui suivent
un premier site HindIII, un premier site PstI, un
second site PstI, un second site HindIII, un site
XbaI, un troisième site HindIII, un troisième
site PstI, un premier site BamHI, un quatrième
site PstI, un cinquième site PstI, un site SalI,
un sixième site PstI, un septième site PstI et un
second site BamHI,
ledit premier site PstI, ledit second site
PstI, ledit second site HindIII, ledit site XbaI,
ledit troisième site Hindi, ledit troisième site
PstI, ledit premier site BamHI, ledit quatrième
site PstI, ledit cinquième site PstI, ledit site
SalI, ledit sixième site PstI, ledit septième site
PstI et ledit second site BamHI étant respectivement
placés à environ O kb (plus particulièrement moins
de 0,05 kb) mais plus de O kb, environ 0,2 kb,
environ 0,4 kb, environ 0,4 kb, environ 1,1 kb,
environ 1,1 kb, environ 1,1 kb, environ 1,7 kb,
environ 2,5 kb, environ 2,6 kb, environ 3,1 kb,
environ 3,6 kb et environ 3,9 kb dudit premier
site HindIII.

Le fragment d'ADN peut être modifié tant que cela ne nuit pas au gène codant pour ICDH. Par exemple, une partie du fragment d'ADN peut être éliminée tout en retenant le gène codant pour ICDH dans le fragment d'ADN pour obtenir un dérivé par délétion du fragment d'ADN.

La délétion partielle du fragment d'ADN peut être effectuée par digestion du fragment d'ADN par une ou plusieurs enzymes de restriction.

Comme exemple spécifique d'un tel dérivé par délétion, on peut mentionner , par exemple, un fragment d'ADN ayant les caractéristiques suivantes
(1) Le fragment d'ADN a une longueur
moléculaire d'environ 3,4 kb.

(2) Le fragment d'ADN a un bout collant
formé par clivage par EcoRI et l'autre bout collant
formé par clivage par SalI.

(3) Le fragment d'ADN a les sites de clivage
par endonucléase de restriction qui suivent
un premier site HindIII, un premier site PstI,
un second site PstI, un second site HindIII, un
site XbaI, un troisième site HindIII, un troisième
site PstI, un premier site BamHI, un quatrième
site PstI et un cinquième site PstI,
ledit premier site PstI, ledit second site
PstI, ledit second site HindIII, ledit site XbaI,
ledit troisième site HindIII, ledit-troisième site
PstI, ledit premier site BamHI, ledit quatrième
site PstI et ledit cinquième site PstI étant
respectivement placés à environ O kb (plus particu
lièrement moins de 0,05 kb) mais plus de O kb,
environ 0,2 kb, environ 0,4 kb, environ 0,4 kb,
environ 1,1 kb, environ 1,1 kb, environ 1,1 kb,
environ 1,7 kb et environ 2,5 kb dudit premier
site HindIII.

Le fragment d'ADN ci-dessus peut également être modifié tout en retenant le gène codant pour ICDH. La modification peut être accomplie en changeant la séquence des bases d'au moins un site de restriction du fragment d'ADN de manière que la séquence changée résultante des bases ne puisse plus être digérée ou puisse être digérée par une sorte différente de l'enzyme de restriction.

Par exemple, le fragment d'ADN ci-dessus mentionné ayant une longueur moléculaire d'environ 3,4 kb peut être modifié en changeant le bout collant formé par clivage par EcoRI en un bout collant formé par SalI, en utilisant un linker de SalI. Le fragment d'ADN ainsi obtenu a les caractéristiques suivantes
(1) Le fragment d'ADN a une longueur
moléculaire d'environ 3,4 kb.

(2) Le fragment d'ADN a ses deux bouts
collants formés par clivage par SalI.

(3) Le fragment d'ADN a les sites de clivage
par endonucléase de restriction qui suivent
un premier site HindIII, un premier site PstI, un
second site PstI, un second site HindIII, un site
XbaI, un troisième site HindIII, un troisième
site PstI, un premier site BamHI, un quatrième
site PstI et un cinquième site PstI,
ledit premier site PstI, ledit second site
PstI, ledit second site HindIII, ledit site XbaI,
ledit troisième site HindIII, ledit troisième site
PstI, ledit premier site BamHI , ledit quatrième
site PstI et ledit cinquième site PstI étant
respectivement placés à environ O kb (plus
particulierement moins de 0,05 kb) mais plus de
O kb, environ 0,2 kb, environ 0,4 kb, environ
0,4 kb, environ 1,1 kb, environ 1,1 kb, environ
1,1 kb, environ 1,7 kb et environ 2,5 kb dudit
premier site HindIII.

Les sites de clivage par endonucléase de restriction des fragments d'ADN ci-dessus peuvent être déterminés sensiblement de la même manière qu'on l'a mentionné précédemment.

Comme on l'a mentionné ci-dessus, le fragment d'ADN contenant un gène codant pour l'enzyme GS, AH ou ICDH peut être facilement modifié tout en retenant le gène codant pour l'enzyme. La modification peut être accomplie en changeant la séquence des bases d'au moins un site de restriction du fragment d'ADN de manière que la séquence changée résultante de bases ne puisse plus être digérée ou puisse être digérée par une sorte différente de l'enzyme de restriction. Le fragment d'-ADN peut également être changé au moins à son extrémité par rapport à la séquence des bases de manière que l'extrémité du fragment d'ADN puisse être adaptée à la séquence des bases d'une portion scindée d'un vecteur, laquelle portion scindée doit être liée à l'extrémité du fragment d'ADN.Par ailleurs, une partie du fragment d'ADN peut etre éliminée tout en retenant le gène codant pour l'enzyme ci-dessus mentionnée dans le fragment d'ADN pour obtenir un dérivé par délétion du fragment d'ADN. La délétion partielle du fragment d'ADN peut être effectuée par digestion du fragment d'ADN par une ou plusieurs enzymes de restriction. Le fragment d'ADN de la présente invention contient des fragments modifiés d'ADN tels que ceux ci-dessus mentionnés.

Comme on l'a précédemment décrit, la souche d'une bactérie ci-dessus mentionnée déficiente en CS, AH ou ICDH nécessite l'acide glutamique pour sa croissance et ne produit pas CS, AH ou ICDH. Cependant,lorsqu'un ADN recombinant qui comprend un fragment d'ADN contenant un gène codant pour CS, AH ou ICDH est incorporé dans la souche ci-dessus mentionnée, celle-ci est forcée à ne pas nécessiter d'acide glutamique pour sa croissance et à produire CS, AH ou ICDH.Par conséquent, la présence d'un gène codant pour CS, AH ou ICDH dans le fragment d'ADN de la présente invention peut être confirmée par le fait que lorsque le fragment d'ADN de la présente invention est inséré dans un vecteur pour former un ADN recombinant puis que l'ADN recombinant est transféré dans des cellules de la souche ci-dessus mentionnée, les cellules croissent dans un milieu ne contenant pas d'acide glutamique et y produisent CS, AH ou ICDH.

L'ADN recombinant de la présente invention comprend un premier fragment d'ADN, dérivé d'une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique, contenant un gène codant pour une enzyme qui catalyse une réaction pour la synthèse de 1' -cétoglutarate à partir d'oxaloacétate et d'acétyl CoA dans le cycle TCA et un second fragment d'ADN contenant un gène pour la réplication dans une cellule d'une bactérie. Le premier fragment d'ADN est directement ou indirectement lié audit second fragment d'ADN.

Pour le premier fragment d'ADN , on utilise le fragment d'ADN ci-dessus mentionné de la présente invention
Pour le second fragment d'ADN, on peut mentionner tous les fragments d'ADN dérivés d'un plasmide habituellement employé en technique d'ADN recombinant. Pour ce fragment d'ADN, on peut mentionner , par exemple, des fragments d'ADN dérivés de plasmides employés dans un système hôte-vecteur connu où l'on utilise, comme hôte, E. coli,
Bacillus subtilis , une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique et analogues. Par exemple, pour les plasmides employés dans un système hôte-vecteur où l'on utilise E. coli comme hôte, on peut mentionner le plasmide pBR325 et les plasmides qui en sont dérivés.Comme plasmides employés dans un système hôte-vecteur où l'on utilise Bacillus subtilis comme hôte, on peut mentionner le plasmide pUB110 et les plasmides qui en sont dérivés.

Comme plasmides employés dans un système hôte-vecteur où l'on utilise comme hôte une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique, on peut mentionner les plasmides pAG1, pAG3, pAG14 et pAG50 et les plasmides qui en sont dérivés.

Pour préparer l'ADN recombinant de la présente invention, on peut employer divers systèmes hôte-vecteur tels que les systèmes hôte-vecteur ci-dessus mentionnés où l'on utilise , comme hôte, E. coli, Bacillus subtilis, une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique et analogues.

Pour l'ADN recombinant de la présente invention comprenant le premier fragment d'ADN et le second fragment d'ADN, on peut mentionner, par exemple, pAG302, pAG303, pAG311, pAG3001, pAG401, pAG4001, pAG4002, pAG4003, pAGSO1, pAG5001, etc.

Chacun des ADN recombinants pAG302, pAG303 et pAG311 comprend, comme premier fragment d'ADN, le fragment d'ADN ci-dessus mentionné contenant un gène codant pour ICDH et, comme second fragment d'ADN, un plasmide pBR325 scindé par EcoRI ou un plasmide qui en est dérivé. L'ADN recombinant pAG3001 comprend, comme premier fragment d'ADN, le fragment d'ADN ci-dessus mentionné contenant un gène codant pour ICDH et, comme second fragment d'ADN, le plasmide pAG50 dérivé d'une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique.

L'ADN recombinant pAG4O1 comprend , comme premier fragment d'ADN, le fragment d'ADN ci-dessus mentionné contenant un gène codant pour CS et,comme second fragment d'ADN, un plasmide dérivé d'un plasmide pBR325 scindé par EcoRi. Les ADN recombinantspAG4001, pAG4002 et pAG4003 comprennent, comme premier fragment d'ADN, le fragment d'ADN ci-dessus mentionné contenant un gène codant pour (:S et, comme se.cond fragment d'ADN, le plasmide pAG50 ou un plasmide qui en est dérivé. Le plasmide pAG50 peut être préparé par la méthode expliquée ultérieurement.

L'ADN recombinant pAGSO1 comprend, comme premier fragment d'ADN, le fragment d'ADN ci-dessus mentionné contenant un gène codant pour AHet,comme second fragment d'ADN, un plasmide dérivé du plasmide pUB110 dérivé de
Bacillus subtilis. L'ADN recombinant pAG5001 comprend, comme premier fragment d'ADN , le fragment d'ADN ci-dessus mentionné contenant un gène codant pour AH et, comme second fragment d'ADN, le plasmide pAG5O.

L'ADN recombinant ci-dessus mentionné de la présente invention peut être modifié tout en retenant le gène codant pour CS, AH ou ICDH et le gène pour la réplication. La modification peut être accomplie en changeant la séquence des bases d'au moins un site de restriction de l'ADN recombinant de manière que la séquence résultante changée des bases ne puisse plus être digérée ou puisse être digérée par une sorte différente d'enzyme de restriction.

Le micro-organisme de la présente invention comprend une bactérie et un ADN recombinant contenant un gène codant pour CS, AH ou ICDH qui y est contenu.

Comme ADN recombinant devant être contenu dans la bactérie, on peut mentionner l'ADN recombinant ci-dessus mentionné de la présente invention.

Comme bactérie, on peut mentionner, par exemple, des souches connues de Escherichia coli, Bacillus subtilis et les bactéries corynéformes produisant l'acide glutamique ci-dessus mentionnées.

Le micro-organisme de la présente invention est préparé en tarnsformant la bactérie par l'ADN recombinant par le moyen d'une technique habituelle d'ADN recombinant.

Comme micro-organisme de la présente invention dans le cas où la bactérie est Escherichia coli, on peut mentionner, par exemple, la souche EB106 de E. coli K12 (pAG302), la souche EB106 de E. coli K12 (pAG303), la souche EB106 de E. coli K12 (pAG311), la souche W620 de
E. coli K12 (pAG401) et analogues.

Pour le micro-organisme de la présente invention dans le cas où la bactérie est Bacillus subtilis , on peut mentionner, par exemple, la souche 168 MA3 (pAGSO1) de
Bacillus subtilis et analogues.

Comme micro-organisme de la présente invention dans le cas où la bactérie est la bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique ci-dessus mentionnée, on peut mentionner, par exemple, Corynebacterium melassecola 801 (pAG3001), Corynebacterium melassecola 801 (pAG4001),
Corynebacterium melassecola 801 (pAG4002), Corynebacterium melassecola 801 (pAG4003), Corynebacterium melassecola 801 (pAG5001) et analogues. Corynebacterium melassecola 801 a été récemment isolé du sol et a été déposé au Fermentation Research Institute sous le numéro d'accession FERM
BP-558 et est disponible au Fermentation Research
Institut.

Le fragment d'ADN ci-dessus mentionné de la présente invention contenant un gene codant pour CS, AH ou ICDH peut être isolé de l'ADN recombinant ci-dessus mentionné par une méthode habituelle comme suit. D'abord, l'ADN recombinant contenant le fragment d'ADN est traité par une enzyme de restriction pour scinder l'ADN recombinan-t pour obtenir un mélange d'un ADN du vecteur et d'un fragment d'ADN contenant un gène codant pour CS, AH ou
ICDH. Le mélange résultant est alors soumis à une électrophorèse sur gel agarose. Selon la nécessité, on utilise un certain nombre de sortes d'enzymes de restriction pour traiter l'ADN recombinant.Subséquemment, une portion du gel agarose où l'on trouve le fragment d'ADN souhaité est découpée, dissoute dans un tampon et soumise à des extractions en succession au phénol, au phénol-chloroforme puis au chloroforme pour obtenir un extrait. Alors, de l'extrait, on obtient , par méthode de précipitation dans l'éthanol, le fragment d'ADN souhaité contenant un gène codant pour CS, AH ou ICDH.

Le fragment d'ADN de la présente invention présente les avantages suivants.

Lorsque le fragment d'ADN de la présente invention est inséré dans un vecteur pour former un ADN recombinant et que l'ADN recombinant est transféré dans un microorganisme, la capacité du micro-organisme à produire une enzyme qui catalyse une réaction pour la synthèse de 1' t-cétoglutarate à partir d'oxaloacétate et d'acétyl CoA dans le cycle TCA est améliorée, et le micro-organisme peut y produire l'enzyme à un haut rendement. Comme on l'a précédemment mentionné, les réactions dans le cycle TCA sont alors favorisées par l'action de l'enzyme pour former 1'4-cétoglutarate à partir d'oxaloacétate et d'acétyl CoA.

L'-cétoglutarate ainsi formé est utilisé dans le cycle TCA pour former des acides organiques comme intermédiaires. Des intermédiaires ainsi formés, on produit divers acides aminés , acides nucléiques souhaités et autres. Par conséquent, par mise en culture du microorganisme ayant une capacité améliorée pour produire l'enzyme ci-dessus mentionnée, de tels acides aminés, acides nucléiques, et autres, peuvent être produits à un haut rendement. En effet, le fragment d'ADN de la présente invention est utile pour obtenir un micro-organisme qui est capable de produire des acides aminés, des acides nucléiques, etc., à un fort rendement.

L'ADN recombinant de la présente invention peut être avantageusement employé pour la transformation d'une bactérie afin d'obtenir le micro-organisme ci-dessus mentionné ayant une excellente capacité de production d'un acide aminé, acide nucléique souhaité, etc.

Le micro-organisme de la présente invention est utile pour la production de divers acides aminés, acides nucléiques, etc.,à un haut rendement.

La présente invention sera illustrée en plus de détail en se référant aux Exemples suivants, qui ne doivent en aucun cas en limiter le cadre.

EXEMPLE 1
Dans cet exemple, on a utilisé Corynebacterium melassecola 801 (déposé au Fermentation Research Institute sous le numéro d'accession FERM BP-558) comme donneur d'ADN pour effectuer le clonage d'un gène codant pour CS (citrate synthase) . Le gène codant pour CS a été cloné en utilisant le système hôte-vecteur où l'on a utilisé la souche W620 de Escherichia coli K12 comme hôte et le plasmide pBR325 comme vecteur. La souche W620 de
Escherichia coli K12 est une souche déficiente en CS et a été obtenue du Docteur J. R. Guest Herbert et Guest,
J. Gen. Microbiol. 53, 363 (1968)] . La souche peut être obtenue du Docteur Barbara J. Bachmann de E. coli Genetic
Stock Center, Département de Génétique Humaine , Université de Value, Ecole de Médecine, 333 Ceder Street, P.O.Box 3333,
New Haven, Connecticut, 06510 E.U.A. La souche W620 de
Escherichia coli K12 est publiquement disponible au
E. coli Genetic Stock Center. Le plasmide pBR325 a été acheté aux Bethesda- Research Laboratories, E.U.A.

Etape 1 tExtraction de l'ADN de Corynebacterium
melassecola 801 (FERM BP-558) et son clivage
Le micro-organisme Corynebacterium melassecola 801 (FERM BP-558) a été inoculé dans 100 mt d'un milieu de mélasse (préparé en dissolvant 80 g de mélasse de ligule noire de la betterave, 0,5 g de MgS04-7H20, 8 g d'urée et 1,5 g d'acide p.hosphorique dans l'eau de manière que le volume total soit de 1 litre, en ajustant le pH à 6,2 et en stérilisant la solution à 120 C pendant 15 minutes) et mis en culture à 32 C pendant une nuit tout en agitant, pour ainsi obtenir une culture du micro-organisme.

De la culture, des cellules du micro-organisme ont été recueillies , lavées puis mises en suspension dans 8 mt d'un tampon contenant Tris-HCl 10 mM (pH 8,0) et
EDTA 1 mM. A la suspension,on a ajouté un lysozyme en une quantité telle que le mélange résultant ait une concentration en lysozyme de 5 mg/mL. On a laissé le mélange résultant reposer à 37 C pendant 4 heures pour avancer la réaction. Alors, au mélange, on a ajouté
Pronase E (fabriquée et vendue par Sigma Chemical Company,
EUA) en une quantité telle que le mélange résultant ait une concentration en Pronase E de 200 pg/mi-. On a laissé le mélange résultant reposer à la température ambiante pendant 15 minutes pour faire avancer une réaction.Alors, au mélange,on a ajouté du dodécylsulfate de sodium en une quantité telle que le mélange résultant ait une concentration en dodécylsulfate de sodium de 1% (poids/ volume). On a laissé le mélange reposer à 37ac pendant 1 heure pour avancer une réaction. Ensuite, on a ajouté, au mélange ci-dessus obtenu, un volume égal de phénol saturé d'une solution d'un tampon TNE (contenant Tris-HCl 50 mM, EDTA 5 mM et NaCl 100 mM; pH 8,0) . Alors, le mélange résultant a été soumis à centrifugation à 10.000 t/mn (11.000 g) à 40C pendant 10 minutes et une phase aqueuse a été récupérée. A la phase aqueuse, on a ajouté un volume égal de phénol-chloroforme (1:1, volume/ volume) avec ensuite mélange. Alors, le mélange résultant a été soumis à une centrifugation à 10.000 t/mn (11.000 g) à 4 C pendant 10 minutes et l'on a récupéré une phase aqueuse. A la phase aqueuse, on a encore ajouté un volume égal de chloroforme, avec ensuite mélange. Alors, le mélange résultant a été soumis à une centrifugation à 10.000 t/mn (11.000 g) à 4 C pendant 10 minutes et l'on a récupéré une phase aqueuse. A la phase aqueuse on a ajouté de la ribonucléase A (fabriquée et vendue par
Sigma Chemical Company, EUA) en une quantité telle que le mélange résultant ait une concentration en ribonucléase A de 40 pg/mt . On a laissé le mélange reposer à 37 C pendant 1 heure pour avancer une réaction. Ensuite, on a ajouté, au mélange, 1/5 volume d'une solution aqueuse contenant NaC1 5 M et 1/4 volume d'une solution aqueuse contenant 50% (poids/poids) de polyéthylène glycol 6000, avec ensuite mélange.On a laissé le mélange résultant reposer à 4 C pendant 4 heures. Alors, le mélange a été soumis à centrifugation à 5.000 t/mn (2.700 g) à 4 C pendant 20 minutes pour obtenir des précipités et un produit surnageant. Les précipités ont été recueillis et dissous dans 4 mt d'un tampon TE (pH 7,5) contenant Tris-HCl 10 mM et EDTA 1 mM. A la solution ainsi obtenue, on a ajouté de l'acétate de sodium en une quantité telle que le mélange résultant ait une concentration en acétate de sodium de 300 mM. Subséquemment, on a ajouté, au mélange, un volume double d'éthanol.Le mélange ainsi obtenu a été soumis à agitation, on l'a laissé reposer à -30 C pendant 3 heures et on l'a soumis à centrifugation à 10.000 t/mn
(11.000 g) à 4 C pendant 20 minutes pour obtenir un produit surnageant et des précipités. Les précipités ont été recueillis, séchés à pression réduite et dissous dans 2 mk d'un tampon TE, pour ainsi obtenir une solution d'ADN contenant 0,85 mgjme d'ADN.

L'ADN dans la solution d'ADN a été scindé comme suit. 13 unités de l'enzyme de restriction XbaI (fabriquée et vendue par Nippon Gene Co., Ltd., Japon) ont été ajoutées à 128/ug de l'ADN et le mélange résultant a été mélangé à 200 t d'un tampon contenant Tris-HCl 50 mM
(pH 7,4), MUS04 10 mM et NaC1 100 mM et on a laissé reposer à 37 C pendant 2 heures de manière que la réaction se passe. Alors, le mélange réactionnel a été chauffé à 70 C pendant 10 minutes pour- arrêter la réaction, et ainsi obtenir l'échantillon I d'ADN.

Etape 2 (Préparation du plasmide pBR325 et
son clivage)
La souche W620 de Escherichia coli K12 a été inoculée dans 50 mi d'un bouillon L (contenant 10 gel de polypeptone, 5 9/t d'extrait de levure et 5 g/ de NaCl; pH 7,2) et mise en culture à 37 C jusqu'à ce que la concentration en cellules atteigne 5 x 108 cellules/mi
Les cellules ont été recueillies de la culture par centrifugation à 2 C. Les cellules ont été mises en suspension dans 50 mi d'une solution aqueuse de MgC12 100 mM tout en refroidissant avec de la glace.De la suspension, les cellules ont été recueillies et mises en suspension dans 25 mi d'une solution aqueuse de CaCl2 100 mM tout en refroidissant avec de la glace. On a laissé la suspension ainsi obtenue reposer dans la glace pendant 30 minutes. De la suspension, les cellules ont été recueillies et mises en suspension dans 5 mt d'une solution aqueuse de CaC12 100 mM tout en refroidissant avec de la glace. On a laissé la solution ainsi obtenue reposer dans la glace pendant 1 heure. A 200 pt de la suspension, on a ajouté 0,1 yg de l'ADN de pBR325 (fabriqué et vendu par Bethesda Research Laboratories, EUA) et on a laissé le mélange résultant reposer dans la glace pendant 1 heure.Subséquemment, on a laissé le mélange reposer à 42 C pendant 2 minutes et ensuite on a ajouté, au mélange, 5 mi d'un bouillon L. Le mélange résultant a été incubé stationnairement à 370C pendant 90 minutes.

Alors, le mélange a été dilué avec une solution aqueuse de CaCl2 100 mM et étendu sur un milieu d'agar L (milieu obtenu en ajoutant 15 g d'agar à un bouillon L de manière que le volume total soit de 1 litre) contenant 10 de tétracycline, avec ensuite incubation pendant une nuit à 37 C pour obtenir Escherichia coli transformé par le plasmide pBR325.

La souche W620 de Escherichia coli K12 transformée par le plasmide pBR325 a été inoculée dans 100 mQ d'un bouillon L contenant 10 pg/me de tétracycline et on a mis en culture pendant une nuit à 370C.

De la culture, des cellules ont été recueillies par centrifugation et lavées avec un tampon TE. Les cellules ont été mises en suspension dans 2 mt d'une solution aqueuse contenant 15% (poids/volume) de saccharose, Tris-HCl 50 mM (pH 8,5), EDTA 50 mM et 2 mg/mlQ de lysozyme (fabriqué et vendu par Sigma Chemical (:ompany,
EUA) et on a laissé reposer à température ambiante pendant 30 minutes pour avancer une réaction.A la suspension résultante, on a ajouté 2 mt d'une solution de Triton t 0,1% (poids/volume) de Triton X-100 (fabriqué par Rohm et Haas Co., EUA, et vendu par Wako Pure Chemical
Industries, Ltd, Japon), Tris-HCl 50 mM et EDTA 50 mM; pH 8,5 et on a laissé reposer à 37 C pendant 30 minutes.

La solution ainsi obtenue a été soumise à centrifugation à 30.000 t/mn (64.000 g) à 5 C pendant 1 heure pour obtenir un produit surnageant. Au produit surnageant, on a ajouté un tampon TE en une quantité telle que le mélange résultant ait un volume de 18 mi . On a doucement dissous 1,2 m l d'une solution aqueuse à 10 mg/mi de bromure d'éthidium et 18,64 g de chlorure de césium, dans le mélange ci-dessus obtenu, avec ensuite centrifugation à 40.000 t/mn (100.000 g) à 15 C pendant 48 heures. Après accomplissement de la centrifugation, deux bandes ont été visualisées sous lumière ultraviolette. La bande inférieure a été retirée du tube de centrifugeuse par le côté du tube en utilisant une seringue pour obtenir une fraction du plasmide pBR325.La fraction ainsi obtenue a été soumise à une extraction quatre fois avec un volume égal d'alcool isopropylique pour obtenir un extrait. De l'extrait, le bromura d'éthidium a été enlevé et la solution résultante a été dialysée avec le tampon TE pour obtenir 1 mk d'un dialysat contenant le plasmide pBR325 et ayant une concentration en ADN de 190
A une aliquote du dialysat contenant 5 ug de 1'ADN du plasmide pBR325 obtenu, on a ajouté 20 unités de l'enzyme de restriction EcoRi. Le mélange résultant a été ajouté à 50 Xut d'une solution tampon contenant tris-HCl 50 mM (pH 7,4), MES 10 mM et NaC1 100 mM, avec ensuite incubation à 37 C pendant 2 heures pour faire avancer une réaction.

Ensuite, le mélange a été chauffé à 70 C pendant 10 minutes pour arrêter la réaction. Au mélange réactionnel, on a ajouté de l'acétate de sodium en une quantité telle que le mélange résultant contienne de l'acétate de sodium à une concentration de 300 mM. Au mélange, on a ajouté un volume double d'éthanol et on a laissé le mélange obtenu reposer à -300C pendant 3 heures. Alors, le mélange a été soumis à centrifugation à 12.000 t/mn (8.900 g) à température ambiante pendant 10 minutes pour obtenir un produit surnageant et des précipités. Les précipités ont été recueillis et séchés sous pression réduite, pour ainsi obtenir un échantillon II d'ADN.

L'échantillon II d'ADN ainsi obtenu et 3 unités d'ADN polymérase T4 (fabriquée et vendue par Takara Shuzo
Co., Ltd., Japon) ont été ajoutés à 44 pi d'un mélange réactionnel aqueux contenant Tris-CH3COOH 33 mM (pH 7,9),
CH3COOK 66 mM, (CH3COO)2Mg 10 mM, du dithiothréitol 0,5 mM, de l'albumine de sérum bovin à 0,1 mg/mt (BSA; fabriquée et vendue par Bethesda Research Laboratories, EUA), 2'-désoxyadénosine 5'-triphosphate 0,1 mM (fabriqué et vendu par Sigma Chemical (::ompany, EUA), 2'-désoxycytidine 5'-triphosphate 0,1 mM (fabriqué et vendu par Sigma
Chemical 6ompany, EUA), 2'-désoxy-guanosine 5'-triphosphate 0,1 mM (fabriqué et vendu par Sigma Chemical Company, EUA) et thymidine 5'-triphosphate 0,1 mM (fabriqué et vendu par Sigma Chemical Company, EUA). On a laissé le mélange ainsi obtenu reposer à 300C pendant 20 minutes pour faire avancer une réaction. Au mélange, on a ajouté de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale en acétate de 300 mM. Alors, on a ajouté un volume double d'éthanol, dans le mélange, et on a laissé le mélange reposer à -30 C pendant 3 heures. Subséquemment, le mélange a été soumis à centrifugation à 12.000 t/mn (8.900 g) à température ambiante pendant 10 minutes pour obtenir un produit surnageant et des précipités.Les précipités ont été recueillis et séchés sous pression réduite, pour ainsi obtenir l'échantillon iii d'ADN.

On a ajouté 1,5 ug d'un linker XbaI (fabriqué et vendu par Takara Shuzo Co., Ltd., Japon) et 2,5 unités
de polynucléotide kinase T4 (fabriquée et vendue par
Takara Shuzo Co., Ltd., Japon) à 10 pt d'une solution
aqueuse contenant Tris-HCl 66 mM (pH 7,6), ATP 1 mM, MgC12 10 mM, spermidine 1 mM, dithiothréitol 15 mM et 0,2 mg/mb de BSA. Alors, on a laissé le mélange obtenu reposer à 37 C pendant 1 heure pour faire avancer une réaction, et obtenir ainsi l'échantillon IV d'ADN.

La moitié de l'échantillon III d'ADN et la totalité de l'échantillon IV d'ADN ont été ajoutées, en même temps
que 6 unités d'ADN ligase T4 phagique (fabriquée et vendue
par Takara Shuzo Co., Ltd., Japon) à 22 d'un mélange réactionnel aqueux contenant tris-HCl 66 mM (pH 7,6),
ATP 1 mM, MgCl2 10 mM, spermidine 1 mM, dithiothréitol 15 mM et 0,2 mg/me de BSA. Alors, on a laissé le mélange obtenu reposer à 22 C pendant 4 heures pour faire avancer une réaction. Au mélange réactionnel, on a ajouté un volume égal d'un mélange de phénol-chloroforme (1:1, volume/ volume) avec ensuite mélange.Le mélange résultant a été soumis à centrifugation à 12.000 t/mn (8.900 g) à température ambiante pendant 10 minutes et l'on a récupéré une phase aqueuse. Alors, on a ajouté, à cette phase aqueuse, tout en agitant, un volume égal de chloroforme, et on a soumis à centrifugation à 12.000 t/mn (8.900 g) à température ambiante pendant 10 minutes pour récupérer une phase aqueuse. A la phase aqueuse ainsi obtenue, on a ajouté de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 300 mM puis un volume double d'éthanol tout en agitant.

On a laissé le mélange résultant reposer à -30 C pendant 3 heures. Subséquemment, le mélange a été soumis à centrifugation à 12.000 t/mn (8.900 g) à température ambiante pendant 10 minutes pour obtenir des précipités d'ADN. Les précipités d'ADN ont été séchés sous pression réduite pour ainsi obtenir l'échantillon V d'ADN.

La totalité de l'échantillon V d'ADN et 15 unités de l'enzyme de restriction XbaI ont été ajoutées à 50 d'un tampon contenant 50 mM de Tris-HCl (pH 7,4), 10 mM de MgSO4 et 100 mM de NaC1. Alors, on a laissé le mélange obtenu reposer à 37 C pendant 2 heures pour faire avancer une réaction. Les produits ainsi obtenus de digestion ont été soumis à une électrophorèse sur gel agarose à 1% (poids/volume) selon la méthode mentionnée précédemment.

L'électrophorèse a été entreprise à 4 C en utilisant l'agarose LMP acheté aux Bethesda Research Laboratories, EUA.

Après accomplissement de l'électrophorèse, le gel a été teinté au bromure d'éthidium. Alors, le gène teinté a été irradié d'une lumière ultraviolette pour confirmer la présence de fragments d'ADN ayant une longueur moléculaire de 6,0 kb. Du gel, la portion dans laquelle de tels fragments d'ADN ont été trouvés a été découpée . Au gel découpé on a ajouté le tampon TE en une quantité égale à trois fois le poids du gel découpé, avec ensuite chauffage à 65 C pendant 10 minutes pour dissoudre complètement le gel dans le tampon. A la solution, on a ajouté un volume égal de phénol, avec ensuite mélange. A la solution résultante, on a ajouté un volume égal de phénol et on a soumis à agitation, avec ensuite récupération d'une phase aqueuse.A la phase aqueuse, on a ajouté un volume égal d'un mélange à 1:1 (volume/volume) de phénol et de chloroforme et on a soumis à agitation, avec ensuite récupération d'une phase aqueuse. A la phase aqueuse, on a ajouté un volume égal de chloroforme et on a soumis à agitation, avec ensuite récupération d'une phase aqueuse.

A la phase aqueuse, on a ajouté de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 300 mM puis un volume double d'éthanol, et on a soumis à agitation. Alors, le mélange a été maintenu au repos à -300C pendant 3 heures, et soumis à centrifugation à 10.000 t/mn (9.000 g) à température ambiante pendant 10 minutes pour obtenir une boulette d'ADN. La boulette ainsi obtenue d'ADN a été séchée sous vide, pour ainsi obtenir l'échantillon VI d'ADN.

Etape 3 (Recombinaison de l'ADN)
On a ajouté 2 ssug de l'échantillon I d'ADN et la totalité de l'échantillon VI d'ADN, avec 3 unités d'ADN ligase T4 phagique (fabriquée et vendue par Nippon Gene Co.,
Ltd., Japon) à 40 l d'un tampon contenant Tris-HCl 50 mM (pH 7,4), MgCl2 10 mM, dithiothréitol 10 mM, spermidine lmM,
ATP 1 mM et 0,1 mg/mt de BSA. On a laissé le mélange résultant reposer à 15 C pendant 1 nuit pour faire avancer une réaction. Le mélange réactionnel ainsi obtenu a été chauffé à 70 C pendant 10 minutes pour arrêter la réaction.

Etape 4 (Transfert du plasmide recombinant dans
Escherichia coli)
Une suspens ion de cellules-compétentes de
Escherichia coli K12 souche W620 a été préparée sensiblement de la même manière qu'à l'étape 2 de l'Exemple 1.

On a mélangé 400 l de la suspension de cellules compétentes et 40 l du mélange réactionnel obtenu à l'étape 3 de l'Exemple 1, et on a laissé reposer dans la glace pendant 1 heure.

Ensuite, le mélange a été chauffé à 42 C pendant 2 minutes puis on a ajouté, au mélange, 5 mt du bouillon L. Le mélange résultant a été incubé stationnairement à 37 C pendant 90 minutes . Alors, du mélange, les cellules ont été recueillies et mises en suspension dans de l'eau stérile pour obtenir une suspension de cellules.

La suspension ainsi obtenue de cellules a été appliquée à un milieu d'agar de synthèse additionné de tétracycline à 10 pg/mk (contenant 0,2 9/t de MgSO4 7H2O, 2g/l d'acide citrique.1H20 , 10 g/Q de K2HPO4 .anh ydre, 3,5 g/l de NaHNH4 4H 20 , 1 9/t de glucose, 1,5 g/Q d'agar, 5 mg/t de chlorhydrate de thiamine et 35 mg/t d'uracil), et on a incubé.

Etape 5 Sélection et Isolement de E. coli ayant
un gène codant pour CS dérivé d'un micro-organisme
Corynebacterium melassecola 801 (FERM BP-558)3
Les cellules obtenues à l'étape 4 de l'Exemple 1 ont été mises en culture sur le milieu d'agar de synthèse ci-dessus mentionné contenant de l'ampicilline (30 g/ml ) et de la tétracycline (10 pg/mt ). Les cellules croissant sur le milieu d'agar de synthèse contenant l'ampicilline et la tétracycline ont été choisies et isolées. Les cellules ainsi isolées étaient résistantes à l'ampicilline et à la tétracycline et ne nécessitaient pas d'acide glutamique pour leur croissance. Les cellules ainsi isolées ont été désignées par souche W620 de Escherichia coli K12 (pAG401) qui avait le gène souhaité codant pour CS.

E. coli isolé a été mis en culture pour cloner le gène codant pour CS.

L'activité de CS de E. coli isolé a été déterminée par la méthode suivante pour confirmer que le gène cloné était le gène codant pour CS. La souche W620 de Escherichia coli K12 (pAG401) a été inoculée à 50 mt- d'un milieu liquide de synthèse (contenant 0,2 g/Q de MgS04 7H20, 2 g/Q d'acide citrique.H20, 10 g/Q de K2HP04 anhydre, 3,5 g/e de NaHNH4P04'4H20, 1 g/R de glucose, 5 mg/t de chlorhydrate de thiamine et 35 mg/t d'uracil, et on a incubé à 370C pendant un jour tout en secouant.De la culture ainsi obtenue, on a recueilli des cellules de
E. coli, que l'on a lavées avec 10 ml d'une solution aqueuse à 0,8% de NaCl et mises en suspension dans 2 d'un tampon ME-S contenant l'acide 2-(N-morpholino)éthane sulfonique (MES) 50 mM, MnSO4 10 mM et EDTA 10 mM; pH 7,9 3 pour obtenir une suspension. la suspension a été soumise à ultrasonication puis à centrifugation à 14.000 t/mn (20.000 g) pendant 20 minutes pour obtenir un extrait de cellules (solution d'enzymes brutes). Par ailleurs, la souche W620 de Escherichia coli K12 et la souche W620 de Escherichia coli K12 (pBR325) ont été mises en culture dans le milieu liquide de synthèse ci-dessus mentionné contenant 0,5 9/4 de glutamate monosodique (MSG).

La souche W-620 de Escherichia coli K12 (pAG401) et la souche W-620 de Escherichia coli K12 (pBR325) ont été mises en culture dans le milieu liquide de synthèse ci-dessus mentionné contenant 10 Cugimt de tétracycline.

L'activité de CS a été déterminée en mesurant l'augmentation de l'absorbance à 412 nm de 3,0 mt d'une solution réactionnelle d'enzymes C contenant Tris-HCl 95 mM (pH 8,0), acide oxaloacétique 0,2 mM, 5,5'-dithiobis (acide 2-nitrobenzoSque) (DTNB) 0,1 mM, acétyl CoA 0,16 mM et 10 ,ut de l'extrait de cellules 3 en utilisant un spectrophotomètre modèle 228 (fabriqué et vendu par
Hitachi Ltd., Japon).

Par ailleurs, la concentration en protéine dans l'extrait de cellules a été mesurée par la méthode de
Lowry et autres. O.H. Lowry, N.J. Rowebrough, R.J. Randall,
J. Biol. Chem. 193, 265 (1951) . Pour la mesure de la concentration en protéine, de l'albumine de sérum bovin (fabriquée et vendue par Wako Pure Chemical Industries Ltd,
Japon) a été utilisée comme protéine standard pour la détermination ci-dessus mentionnée.

Les résultats sont montrés au Tableau 1.

Tableau 1

<tb> <SEP> Souche <SEP> Activité <SEP> spécifique <SEP> de <SEP> GS <SEP> 1 <SEP>
<tb> W620*2 <SEP> 0,02
<tb> W620(pBR325) <SEP> 0,02
<tb> <SEP> W620(pAG4ûl) <SEP> 0,16
<tb>
Notes: *1) exprimée en termes de la quantité (micro
moles) de l'acide citrique produit par 1 mg
de la protéine dans la solution réactionnelle
pendant 1 minute. Comme la quantité de l'acide
citrique produit ne peut être déterminée
directement, la quantité d'acide citrique est
indirectement déterminée comme suit. En effet,
la quantité de la coenzyme A qui est produite
concurremment avec la production d'acide
citrique est mesurée en utilisant un réactif
déterminant le groupe SH (DTNB). En se basant
sur la quantité de coenzyme A produite, on
détermine la quantité d'acide citrique.

*2) une souche de Escherichia coli K12 déficiente
en CS, obtenue du Docteur J.R. Guest tHerbert
et Guest, J. Gen. Microbiol. 53, 363 (1968)1.

Comme cela est apparent par les résultats montrés au Tableau 1, la souche W620 de Escherichia coli K12 (pAG401) avait une activité spécifique de CS extrêmement élevée.

Etape 6 (Isolement d'un plasmide hybride pAG401
et son analyse)
Un ADN du plasmide pAG401 a été isolé de la souche W620 de E. coli K12 (pAG401) et purifié sensiblement de la même manière qu'à l'étape 2 de l'Exemple 1. On a ainsi obtenu 160 jjg de l'ADN du plasmide pAG401. De l'ADN ainsi isolé, on a préparé des échantillons de 0,3 9 et on les a digérés par les enzymes de restriction suivantes dans 20 ut d'un tampon approprié à 37 C pendant 2 heures.

Comme enzymes de restriction, on a utilisé EcoRi, BamHI,
HindIII, SalI, XhoI et XbaI (chacune fabriquée et vendue par Nippon Gene Co., Ltd, Japon) et PstI (fabriquée et vendue par Bethesda Research Laboratories, EUA). Chacune des enzymes de restriction a été utilisée en une quantité de 10 unités. Les digestions ont été entreprises en utilisant les enzymes de restriction seules et en combinaison . Les produits de digestion ainsi obtenus ont été soumis à une électrophorèse sur gel agarose à 1% (poids/ volume) et une électrophorèse sur gel de polyacrylamide à 4% (poids/volume) selon la méthode de Maniatis et autres tT. Maniatis, E.F. Fritsch, J. Sambrook; Molecular (:loning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory,
Cold Spring Harbor New York pages 150-185, 1982i .Après accomplissement de l'électrophorèse, le gel a été immergé dans une solution de bromure d'éthidium contenant -1 ug/mt de bromure d'éthidium pendant 30 minutes pour teinter le gel. Alors, le gel a été irradié d'une lumière ultraviolette pour déterminer le nombre de bandes correspondant au nombre de fragments d'ADN obtenus. Les longueurs moléculaires respectives des fragments d'ADN ont été déterminées par la comparaison des distances respectives de migration des fragments dans une électrophorèse à celles de fragments d'ADN ayant respectivement des longueurs moléculaires connues. La longueur moléculaire du plasmide pAG401 a été calculée en ajoutant les longueurs moléculaires des fragments respectifs d'ADN.

Par ailleurs, en se basant sur les résultats obtenus dans l'analyse ci-dessus, on a déterminé les sites de clivage par endonucléase de restriction du plasmide pAG401.

Les longueurs moléculaires respectives des fragments d'ADN ont été déterminées par la comparaison des distances respectives de migration des fragments dans une électrophorèse à celles des fragments d'ADN ayant respectivement des longueurs moléculaires connues. Dans ladétermination des longueurs moléculaires de 1,0 kb ou plus, on a employé une électrophorèse sur gel agarose à 1% (poids/volume) et dans la détermination de celles d'environ 0,1 kb à moins de 1,0 kb, on a employé une électrophorèse sur gel de polyacrylamide à 4% (poids/volume).Comme fragment d'ADN ayant une longueur moléculaire connue, on a utilisé des fragments d'ADN obtenus par digestion par HindIII d'un
ADN X phagique (fabriqué et vendu par Nippon Gene Co.,
Ltd., Japon) dans le cas de l'électrophorèse sur gel agarose et des fragments d'ADN obtenus par digestion par
HaeIII de l'ADN X174 phagique (fabriqué et vendu par
Bethesda Research Laboratories, EUA) dans le cas de l'électrophorèse sur gel de polyacrylamide.

Par suite, on a trouvé que le plasmide pAG401 avait une structure illustrée par la carte de scission par endonucléase de restriction montrée à la figure 1. Le plasmide pAG401 se composait d'un ADN de vecteur obtenu par insertion d'un linker XbaI au plasmide pBR325 à son site EcoRI et, inséré à son site XbaI,d'un fragment XbaI étranger contenant un gène produisant CS ayant une longueur moléculaire d'environ 4,9 kb. Le fragment XbaI est un fragment d'ADN contenant un gène codant pour CS dérivé de Corynebacterium melassecola 801 (déposé au FRI sous le numéro d'accession FERM BP-558).

Les cellules de la souche W620 de E. coli K12 ont été transformées par 1'ADN du plasmide pAG401 ci-dessus obtenu sensiblement de la même manière qu'à l'étape 2 de l'Exemple 1 à l'exception que l'on a utilisé 1'ADN du plasmide pAG401 au lieu de pBR325 pour obtenir des transformants. Les transformants résultants ont été examinés en ce qui concerne la résistance aux médicaments et l'auxotrophie. Tous les transformants examinés se sont révélés être résistants à la tétracycline et à l'ampicilline, ne nécessitant pas d'acide glutamique
Par ailleurs, la carte de clivage par l'endonucléase de restriction du plasmide retenu dans le transformant s'est révélée être la même que celle du plasmide employé dans la transformation ci-dessus.

Etape 7 (Isolement d'un fragment d'ADN contenant
un gène codant pour CS et ayant une longueur
moléculaire d'environ 4,9 kb)
A 20 jig de 1'ADN du plasmide pAG401 obtenu à l'étape 6 de l'Exemple 1, on a ajouté 60 unités de l'enzyme de restriction XbaI. On a laissé le mélange résultant réagir dans 100 pt d'un tampon contenant Tris-HCl 50 mM (pH 7,4), MgSO4 10 mM et NaCl 100 mM à 37 C pendant 2 heures. Le plasmide digéré a été soumis à une électrophorèse en utilisant un gel agarose à 1% sensiblement de la même manière qu'à l'étape 6 de l'Exemple 1, à l'exception que l'on a utilisé un gel agarose à 1% préparé à partir d'agarose LMP (dénomination commerciale d'un produit fabriqué et vendu par Bethesda Research
Laboratories, EUA), et que l'électrophorèse a été effectuée à 4 C. Le gel agarose a été teinté de bromure d'éthidium et exposé à un rayonnement UV de manière à observer visuellement un fragment d'ADN contenant un gène codant pour CS et ayant une longueur moléculaire d'environ 4,9 kb. Une portion du gel où l'on a trouvé un tel fragment d'ADN a été découpée.Au gel découpé, on a ajouté un tampon TE en une quantité égale à trois fois le poids du gel, et on a chauffé à 65 C pendant 10 minutes pour dissoudre complètement le gel agarose dans le tampon. A la solution résultante, on a ajouté un volume égal de phénol et on a soumis à agitation, avec ensuite récupération d'une phase aqueuse. A la phase aqueuse on a ajouté un volume égal d'un mélange à 1:1 (volume/volume) de phénol et de chloroforme et on a soumis à agitation, avec ensuite récupération d'une phase aqueuse. A la phase aqueuse,on a ajouté un volume égal de chloroforme et on a soumis à agitation, avec ensuite récupération d'une phase aqueuse. A la phase aqueuse,on a ajouté de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 300 mM puis un volume double d'éthanol, et on a soumis à agitation.Alors, le mélange a été maintenu au repos à -30 C pendant 3 heures et soumis à centrifugation à 10.000 t/mn (9.000 g) à température ambiante pendant 10 minutes pour obtenir une boulette d'ADN. La boulette ainsi obtenue d'ADN a été séchée sous vide puis dissoute dans 20 ,ut d'un tampon TE.

On a ainsi obtenu une solution contenant environ 3 d'un fragment d'ADN contenant un gène codant pour CS et ayant une longueur moléculaire d'environ 4,9 kb.

EXEMPLE 2
Dans cet exemple, on a utilisé Corynebacterium melassecola 801 (FERM BP-558) comme donneur d'ADN pour effectuer le clonage d'un gène codant pour AH (aconitate hydratase). Le gène codant pour AH a été cloné en utilisant le système hôte-vecteur où l'on a utilisé Bacillus subtilis comme hôte et le plasmide pUB110 comme vecteur.

Bacillus subtilis 168 NO 60871 a été obtenu du Docteur
E. Freese du National Institute of Health, EUA. Bacillus subtilis 168 Milî3 a eté obtenu du Professeur Shuichi Aiba,
Faculty of Engineering, Osaka University ìmanaka et autres,
J. Bacteriol., 146, 1091-1097, (1981)3
Etape 1 (Mise en culture d'un hôte déficient
en AH et capacité de restriction)
(1) Préparation d'un ADN chromosomique à partir
d'une souche déficiente en AH.

Bacillus subtilis 168 NO 60871 a été inoculé dans 100 m t d'un bouillon L (contenant 10 g/Q de polypeptone, 5 9/2 d'extrait de levure et 10 9/t de NaC1, et ajusté à pH 7,2) et mis en culture à 37 C pendant une nuit tout en secouant pour ainsi obtenir une culture du microorganisme.

De la culture, des cellules du micro-organisme ont été recueillies, lavées puis mises en suspension dans 8 d'un tampon contenant Tris-HCl 10 mM (pH 8,0) et EDTA 1 mM.

A la suspension, on a ajouté un lysozyme en une quantité telle que le mélange résultant ait une concentration en lysozyme de 5 mg/me . On a laissé le mélange résultant reposer à 37 C pendant 1 heure. Alors, au mélange, on a ajouté de la Pronase E (fabriquée et vendue par Sigma
Chemical (:ompany, EUA) en une quantité telle que le mélange résultant ait une concentration en Pronase E de 200
On a laissé le mélange résultant reposer à température ambiante pendant 15 minutes. Alors, au mélange, on a ajouté du dodécylsulfate de sodium en une quantité telle que le mélange résultant ait la concentration en dodécylsulfate de sodium de 1% (poids/volume). On a laissé le mélange reposer à 37 C pendant 1 heure.Ensuite, on a ajouté, au mélange ci-dessus obtenu, un volume égal de phénol saturé d'un tampon TNE (contenant Tris-HCl 50 mM, EDTA 5 mM et NaC1 100 mM et ajusté à pH 8,0). Alors, le mélange résultant a été soumis à centrifugation à 10.000 t/mn (11.000 g) à 4 C pendant 10 minutes et l'on a recueilli une phase aqueuse. A la phase aqueuse, on a ajouté un volume égal d'un mélange à 1:1 (volume/volume) de phénol et de chloroforme, avec ensuite mélange. Alors, le mélange résultant a été soumis à centrifugation à 10.000 t/mn (11.000 g) à 4 C pendant 10 minutes et l'on a récupéré une phase aqueuse . A la phase aqueuse, on a de plus ajouté un volume égal de chloroforme, avec ensuite mélange.Alors, le mélange résultant a été soumis à centrifugation à 10.000 t/mn (11.000 g) à 4 C pendant 10 minutes et l'on a récupéré une phase aqueuse. A la phase aqueuse, on a ajouté de la ribonucléase A (fabriquée et vendue par
Sigma Chemical (:ompany, EUA) en une quantité telle que le mélange résultant ait une concentration en ribonucléase A de 40 ,ug/mt . On a laissé le mélange reposer à 37 C pendant 1 heure. Ensuite, on a ajouté , au mélange, 1/5 volume d'une solution aqueuse contenant NaC1 5 M et 1/4 volume d'une solution aqueuse contenant 50% (poids/poids)de polyéthylène glycol 6000 et on a ensuite mélangé. On a laissé le mélange résultant reposer à 4 C pendant 4 heures.

Alors, le mélange a été soumis à centrifugation à 5.000 t/mn (2.700 g) à 4 C pendant 20 minutes pour obtenir des précipités et un produit surnageant. Les précipités ont été recueillis et dissous dans 4 mQ d'un tampon TE (contenant Tris-HCl 10 mM et EDTA 1 mM, et ajusté à pH 7,5).

A la solution ainsi obtenue, on a ajouté de l'acétate de sodium en une quantité telle que le mélange résultant ait une concentration en acétate de sodium de 300 mM. Subséquemment, on a ajouté, au mélange, un volume double d'éthanol. Le mélange ainsi obtenu a été soumis à agitation, on l'a laissé reposer à -30 C pendant 3 heures et on l'a soumis à centrifugation à 10.000 t/mn (11.000 g) à 4 C pendant 20 minutes pour obtenir un produit surnageant et des précipités. Les précipités ont été recueillis, séchés sous pression réduite et dissous dans 5 m2- d'un tampon TE, pour ainsi obtenir une solution d'ADN contenant 0,35 mg/me d'ADN (échantillon VII d'ADN).

(2) Transformation d'une souche déficiente en
capacité de restriction
On a inoculé Bacillus subtilis 168 MI113 (nécessitant l'arginine et le tryptophane, et déficient en capacité de restriction) dans 5 mt d'un bouillon L et on a mis en culture à 37 C pendant une nuit.On a transplanté 2 me de la culture dans 40 ml d'un milieu contenant 14 g/l de
K2HP04, 6 9/t de KH2PO4 , 2 g/l de sulfate d'ammonium, 1 g/l de citrate de sodium , 5 9/t de glucose, 0,2 g/l de MgS04 7H20, 0,2 g/l d'acide casamino (fabriqué et vendu par Difco Laboratories, EUA), 50 mg/4 de L-arginine et 50 mg/ de L-tryptophane et on a mis en culture à 37 C pendant 4 heures tout en secouant.Alors, on a transplanté 4 mi de la culture dans 36 me d'un milieu contenant 14 g/ de K2HPO4, 6 g/l de KH2P04, 2 g/l de sulfate d'ammonium, 1g/l de citrate de sodium, 5 g/l de glucose, 0,2 g/l de MgS04 7H20 , 0,1 g,e d'acide casamino, 5 mg/t de L-arginine et 5 mg/l de L-tryptophane et on a mis en culture à 37 C pendant 90 minutes tout en secouant.

A 1 mQ de la culture résultante, on a ajouté 100 t de l'échantillon VII d'ADN obtenu à la sous-étape (1) de l'étape 1 de l'Exemple 2 et le mélange résultant a été mis en culture à 37 C pendant 30 minutes tout en secouant vigoureusement.Alors, la culture résultante a été enduite sur un milieu minimum d'agar de Spizizen contenant 50 mg/t- de L-tryptophane et 1 g/Q de L-glutamate de sodium et on a mis en culture à 37 C pendant 2 jours Le milieu d'agar minimum de Spizizen avait été préparé à partir de 14 g/ de K2HP04, 6 g/Q de KH2P04, 2 gt de sulfate d'ammonium, 1 g/k de citrate de sodium, 5 g/ de glucose, 0,2 g/l de MgS04 .7H20 et 15 g/l d'agar (fabriqué et vendu par Difco Laboratories, EUA)[voir J. Spizizen, Proceedings of National Academy of Science, EUA, 44, 1072-1078 (1958).

La colonie résultante ne nécessitant pas d'arginine a été transplantée en utilisant un cure-dent sur un milieu minimum d'agar (A) de Spizizen contenant 50 mg/l de
L-triptophane et 19/t de L-glutamate de sodium et sur un milieu minimum d'agar (B) de Spizizen contenant 50 mg/l de L-tryptophane seul. Alors, la colonie croissant sur le milieu d'agar minimum (A) mais ne pouvant croître sur le milieu d'agar minimum (B) a été séparée en tant que souche déficiente en AH et capacité de restriction et la souche ainsi obtenue a été désignée par Bacillus subtilis 168 MA3. Cette souche a été déposée au Fermentation
Research Institute sous le numéro d'accession FERM BP-1042.

Etape 2 Clivage de l'.ADN de Corynebacterium
melassecola 801 (FERM BP-558)
L'ADN de Corynebacterium melassecola 801 dans la solution d'ADN obtenue à l'étape 1 de l'Exemple 1 a été scindé comme suit. On a ajouté 13 unités d'une enzyme de restriction XbaI (fabriquée et vendue par TOYOBO Co., Ltd.,
Japon) à 128 g de l'ADN et le mélange résultant a été mélangé à 200 ut d'un tampon contenant Tris-HCl 50 mM (pH 7,4), MgSO4 10 mM et NaC1 100 mM et on a laissé le mélange résultant reposer à 370(: pendant 2 heures de manière que la réaction puisse se passer.Alors, le mélange réactionnel a été chauffé à 700C pendant 10 minutes pour arrêter la réaction (échantillon VIII d'ADN).

Etape 3 Préparation du plasmide pUB110
En premier lieu, le plasmide pUB110 a été inséré dans Bacillus subtilis 168 MA3 et, du transformant ainsi obtenu, on a préparé pUB110. A titre d'exemple, Bacillus subtilis 168 MA3 (FERM BP-1042) a été inoculé dans 50 mQ d'un bouillon L et mis en culture. la densité optique (DO) de la culture ainsi obtenue à 660 nm a été contrôlée en utilisant un spectrophotomètre modèle 228 fabriqué et vendu par Hitachi, Ltd, Japon. Au moment où la valeur de
DO est devenue de 0,5, les cellules en culture ont été recueillies de la culture .Les cellules ainsi obtenues ont été lavées avec 5 mt d'un tampon SMM (contenant du saccharose 0,5 M, l'acide maléique 0,02 M et MgC12 0,02 M et ajusté à pH 6,5) puis de nouveau mises en suspension dans 5 m d'un tampon SMM. A 4,5 m de la suspension résultante de cellules, on a ajouté 0,5 me d'un tampon
SMM (stérilisé en utilisant un filtre Millipore) contenant un lysozyme à une concentration de 10 mgtmt et on a laissé le mélange résultant reposer à 42 C pendant 1 heure pour ainsi former desprotoplastes des cellules. Alors, le mélange a été soumis à centrifugation à 7.000 t/mn (4.500 g) à 5 C pendant 7 minutes pour récupérer les protoplastes.Les protoplastes ont été mis en suspension dans 5 mk d'un tampon SMM. La même opération de centrifugation que celle ci-dessus mentionnée a été répétée et les protoplastes ont été récupérés. Les protoplastes résultants ont été mis en suspension dans 5 m d'un tampon SMM pour obtenir une solution de protoplastes de
Bacillus subtilis 168 MA3.

Le plasmide pUB110 (fabriqué et vendu par Bethesda
Research Laboratories, EUA) a été dissous dans un tampon TE (contenant Tris-H(:l 10 mM (pH 7,0) et EDTA 1 mM) en une quantité telle que la concentration du plasmide pUB110 atteigne 100 pg/mi . On a mélangé 50 ut de la solution résultante d'ADN à 50 wu de 2 x SMM contenant du saccharose 1,0 M, de l'acide maléique 0,04 M et MgC12 0,04 M et on a ajusté à pH 6,5. Le mélange résultant a été ajouté à 0,5 mQ de la solution de protoplastes ci-dessus mentionnée.Alors, au mélange résultant on a encore ajouté 1,5 mt d'une solution PEG préparée en dissolvant du polyéthylène glycol 6000 dans un tampon SMM à une concentration de 40% (poids/volume)3 . Le mélange résultant a été soumis à une légère agitation puis on l'a laissé reposer à température ambiante pendant 2 minutes.Ensuite, au mélange on a ajouté 5 me d'un milieu SMML-PVP
(préparé en mélangeant des volumes égaux d'un bouillon L et d'un tampon à 2 x SMM contenant du saccharose 1,0 M, l'acide maléique 0,04 M et MgCl2 0,04 M et ajusté à pH 6,5 et en dissolvant de la polyvinyl pyrrolidone (PVP) dans le mélange résultant en une quantité telle que la concentration de PVP soit de 40 g/' ) avec ensuite centrifugation à 4.000 t/mn (1.800 g) à 4 C pendant 10 minutes pour former un produit surnageant et des précipités. Le produit surnageant a été enlevé. Aux protoplastes précipités, on a ajouté 0,5 mi d'un milieu SMML-PVP, et le mélange a été soumis à une légère agitation pour former une suspension des protoplastes. La suspension a été soumise à incubation à 30 C pendant 2 heures tout en la secouant doucement. Une quantité prédéterminée de la culture résultante a été inoculée à un milieu régénérant contenant 700 Hg/m l de kanamycine. Le milieu régénérant était un milieu d'agar en couche double comprenant une couche inférieure d'un milieu d'agar obtenue en ajoutant 15 g/l d'agar à un milieu DMS contenant 5 g/l de glucose, 5 g/ d'acide casamino, 3,5 g/l de K2HPO4 , 1,5 g/Q de
KH2P04 , 30 g/t de PVP, 0,4 9/t de MgCl2 et 135 9/t de succinate disodique, et superposée sur la couche inférieure, une couche supérieure de milieu d'agar obtenue en ajoutant 6 g/l d'agar au milieu DMS ci-dessus mentionné et l'inoculation de la suspension diluée ci-dessus mentionnée a été effectuée par son mélange avec 3 mi de la couche supérieure d'agar fondu avant de former la couche double. Le milieu régérant résultant a été incubé à 32 C pendant 5 jours pour obtenir des transformants résistants à la kanamycine.Les transformants résistants à la kanamycine ainsi obtenus ont été transplantés à un milieu d'agar L (préparé en ajoutant 15 g/ d'agar à un bouillon L) contenant 4 pg/mss de kanamycine et on a mis en culture pour obtenir un transformant retenant le plasmide pUB110. Le transformant est désigné par Bacillus subtilis 168 MA3 (pUB110).

Bacillus subtilis 168 MA3 (pUB110) a été inoculé dans 200 mt d'un bouillon L contenant 4 Hg/mi de kanamycine et on a laissé le mélange résultant reposer à 37 C pendant une nuit. De la culture résultante, on a recueilli des cellules du micro-organisme. Les cellules ont été mises en suspension dans 2 mss d'une solution aqueuse contenant 15% de saccharose, Tris-HCl 50 mM (pH 8,5), EDTA 50 mM et 5 mg/mQ de lysozyme (fabriqué et vendu par Sigma Chemical (:ompany, EUA) et on a laissé le mélange résultant reposer à 37 C pendant 30 minutes.

Alors, au mélange, on a ajouté 2 mi d'une solution de
Triton (contenant 0,1% (volume/volume) de Triton X-100, Tris-HCl 50 mM et EDTA 50 mM et ajusté à pH 8,5) et le mélange résultant a été maintenu à 37 C pendant 30 minutes.

Alors, la solution a été soumise à centrifugation à 30.000 t/mn (64.000 g) à 5 C pendant 1 heure pour obtenir un produit surnageant . Le produit surnageant a été récupéré et au produit surnageant récupéré, on a ajouté un tampon TE pour produire une solution de 18 me . A la solution résultante, on a doucement ajouté 1,2 mt d'une solution aqueuse à 10 mg/mt de bromure d'éthidium et 18,64 g de chlorure de césium et on les a dissous, avec ensuite centrifugation à 40.000 t/mn (100.000 g) à 15 C pendant 48 heures. Après accomplissement de la centrifugation, deux bandes ont été visualisées à la lumière ultraviolette.La bande inférieure a été enlevée du tube de centrifugeuse à travers la paroi latérale du tube en utilisant une seringue pour obtenir une fraction contenant le plasmide pUB110. La fraction ainsi obtenue du plasmide a été soumise à une extraction avec un volume égal d'alcool isopropylique,quatre fois, pour obtenir un extrait. De l'extrait, le bromure d'éthidium a été enlevé et la solution résultante a été dialysée avec le tampon TE pour obtenir 1 me d'un dialysat contenant un plasmide pUB110 à une concentration en ADN de 100 pg/mt
Etape 4 (Préparation du plasmide pUX2)
A 5 trg de l'ADN du plasmide pUB110 préparé à l'étape 3 ci-dessus de l'Exemple 2, on a ajouté 20 unités de l'enzyme de restriction BamHI (fabriquée et vendue par
TOYOBO Co., Ltd., Japon).On a laissé réagir le mélange résultant dans 50 gu-Q d'un tampon contenant Tris-H(:l 10 mM (pH 7,4), MgS04 10 mM, NaCl 50 mM et dithiothréitol (DTT) 1 mM à 37 C pendant 2 heures. Au mélange réactionnel, on a ajouté un volume égal d'un mélange à 1:1 (volume/volume) de phénol et de chloroforme avec ensuite agitation et récupération d'une phase aqueuse. A la phase aqueuse, on a ajouté un volume égal de chloroforme, avec ensuite agitant tion et récupération d'une phase aqueuse. A la phase aqueuse on a ajouté de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 0,3 M et on y a ajouté un volume double d'éthanol.On a laissé le mélange résultant reposer à -800C pendant 30 minutes avec ensuite centrifugation à 12.000 t/mn (8.900 g) à température ambiante pendant 10 minutes pour former un produit surnageant et une boulette d'ADN. La boulette d'ADN a été recueillie et séchée sous vide (échantillon IX d'ADN).

L'échantillon IX d'ADN ainsi obtenu et 3 unités d'ADN polymérase T4 (fabriquée et vendue par Takara Shuzo
Co., Ltd., Japon) ont mélangés et on a laissé réagir à 300C pendant 10 minutes dans 44 iut d'un mélange de Tris-CH3COOH 33 mM (pH 7,9), CH3COOK 66 mM, (CH3C002)Mg 10 mM, dithiothréitol 0,5 mM, 0,1 mg/mt d'albumine de sérum bovin (BSA) (fabriquée et vendue par Bethesda
Research Laboratories, EUA), Z'-dioxyadénosine 5'triphosphate 0,1 mM (fabriqué et vendu par Sigma Chemical
Company, EUA), 2'-dioxycytidine 5'-triphosphate 0,1 mM (fabriqué et vendu par Sigma Chemical (:ompany, EUA), 2'-dioxyguanosine 5'-triphosphate 0,1 mM (fabriqué et vendu par Sigma Chemical (::oepany, EUA) et thymidine 5' triphosphate O,1 cM (fabriqué et vendu par Sigma Chemical
Company, EUA). Au mélange résultant, on a ajouté de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 300 mM et on y a ajouté un volume double d'éthanol. On a laissé le mélange résultant reposer à -80 C pendant 3 heures avec ensuite centrifugation à 12.000 t/mn (8.900 g) à température ambiante pendant 10 minutes pour former un produit surnageant et une boulette d'ADN. La boulette d'ADN a été recueillie et séchée sous vide (échantillon X d'ADN).

On a mélangé 1,5 pg d'un linker XbaI (fabriqué et vendu par Takara Shuzo Co., Ltd., Japon) et 2,5 unités de polynucléotide kinase T4 (fabriquée et vendue par Takara
Shuzo Co., Ltd., Japon) et on a laissé réagir à 37 C pendant 1 heure dans 10 ZJQ d'un mélange de Tris-HCl 66 mM (pH 7,6), ATP 1 m, MgC12 10 mM, spermidine 1 mM, dithiothréitol 15 mM et 0,2 mg/mi de BSA (échantillon XI d' ADN).

On a laissé la totalité de l'échantillon X d'ADN, la totalité de l'échantillon XI d'ADN et 6 unités d'ADN ligase T4 phagique (fabriquée et vendue par Takara Shuzo,
Co., Ltd., Japon), réagir à 22 C pendant 4 heures dans 22 u.c d'une solution aqueuse contenant Tris-HCl 66 mM (pH 7,6), ATP 1 mM, MgC12 10 mM, spermidine 1 mM, dithiothréitol 15 mM et 0,2 mg/mi de BSA. Au mélange réactionnel on a ajouté un tampon TE pour former une solution de 100 pt , et on y a ajouté un volume égal d'un mélange à 1:1 (volume/volume) de phénol et de chloroforme, avec ensuite agitation et récupération d'une phase aqueuse.

A la phase aqueuse, on a ajouté un volume égal de chloroforme, avec ensuite agitation et récupération d'une phase aqueuse. A la phase aqueuse, on a ajouté de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 300 mM puis un volume double d'éthanol. On a laissé le mélange résultant reposer à -800C pendant 30 minutes avec ensuite centrifugation à 12.000 t/mn (8.900 g) à température ambiante pendant 10 minutes pour former un produit surnageant et une boulette d'ADN. La boulette d'ADN a été recueillie et séchée sous vide (échantillon XII d'ADN).

On a ajouté, à la totalité de la quantité de l'échantillon XII d'ADN, 15 unités d'une enzyme de rstric- tion XbaI et on les a laissés réagir à 37 C pendant 4 heures dans 50 jut d'un tampon contenant Tris-HCl 50 mM (pH 7,4), MgS04 10 mM et NaCI 100 mM. L'ADN digéré a été soumis à une électrophorèse en utilisant un gel agarose à 1% sensiblement de la même manière qu'à l'étape 6 de l'Exemple 1 à l'exception que l'on a utilisé un gel agarose à 1% préparé à partir d'Agarose LMP (dénomination commerciale d'un produit fabriqué et vendu par Bethesda Research
Laboratories, EUA) et que l'électrophorèse a été effectuée à 4 C .Le gel agarose a été teinté au bromure d'éthidium et exposé à des rayons ultraviolets de manière à observer visuellement des fragments d'ADN ayant une longueur moléculaire d'environ 4,1 kb. Une portion du gel où l'on a trouvé de tels fragments d'ADN a été découpée. Au gel découpé,on a ajouté un tampon TE en une quantité égale à trois fois le poids du gel et on a chauffé à 65 C pendant 10 minutes pour dissoudre complètement le gel agarose dans le tampon. A la solution résultante, on a ajouté un volume égal de phénol et on a soumis à agitation, avec ensuite récupération d'une phase aqueuse. A la phase aqueuse, on a ajouté un volume égal d'un mélange à 1:1 (volume/volume) de phénol et de chloroforme et on a soumis à agitation, avec ensuite récupération d'une phase aqueuse.A la phase aqueuse, on a ajouté un volume égal de chloroforme et on a soumis à agitation, avec ensuite récupération d'une phase aqueuse. A la phase aqueuse, on a ajouté de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 300 mM puis un volume double d'éthanol, et on a soumis à agitation.

Alors, le mélange a été maintenu au repos à -30 C pendant 30 minutes et soumis à centrifugation à 10.000 t/mn (9.000 g) à température ambiante pendant 10 minutes pour obtenir une boulette d'ADN. La boulette d'ADN ainsi obtenue a été séchée sous vide puis dissoute dans 50 d'un tampon contenant Tris-HCl 50 mM (pH 7,4), MgC12 10 mM, dithiothréitol 10 mM, spermidine 1 mM, ATP 1 mM et O,lmg/mQ de BSA. A la solution résultante on a ajouté 3 unités d'ADN ligase T4 phagique et on a forcé le mélange résultant à réagir à 15 C pendant une nuit. En utilisant la totalité de la quantité du mélange réactionnel, les protoplastes de Bacillus subtilis 168 MA3 (FERM BP-1042) ont été transformés de la même manière qu'à l'étape 3 de l'Exemple 2 pour obtenir Bacillus subtilis 168 MA3 (pUX2).

Du Bacillus subtilis 168 MA3 (pUX2), on a préparé le plasmide pUX2 de la même manière qu'à l'étape 3 de l'Exemple 2 et on a obtenu 1,6 mt d'un tampon TE contenant 90 pg/mt du plasmide pUX2.

On a fait réagir 5 9 du plasmide pUX2 avec 20 unités d'une enzyme de restriction XbaI dans 50 d'un tampon contenant Tris-HCl 50 mM (pH 7,4), MgS04 10 mM et NaC1 10 mM à 37 C pendant 2 heures. Au mélange réactionnel,on a ajouté un volume égal d'un mélange à 1:1 (volume/volume) de phénol et de chloroforme et on a soumis à agitation. Alors, on a récupéré une phase aqueuse. A la phase aqueuse on a ajouté un volume égal de chloroforme et on a soumis à agitation, puis on a récupéré une phase aqueuse. A la phase aqueuse,on a ajouté de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 0,3 M puis on a ajouté un volume double d'éthanol.Le mélange résultant a été maintenu au repos à -80 C pendant 30 minutes avec ensuite centrifugation à 12.000 t/mn (8.900 g) à température ambiante pendant 10 minutes pour obtenir une boulette d'ADN. La boulette ainsi obtenue d'ADN a été séchée sous pression réduite (échantillon XIV d'ADN).

Etape 5 (Préparation d'un plasmide recombinant et
insertion du plasmide dans Bacillus subtilis)
On a fait réagir 2 ug de l'échantillon VIII d'ADN et 1 jig de l'échantillon XIV d'ADN avec 3 unités d'ADN ligase T4 phagique dans 50 t d'un tampon contenant
Tris-HCl 50 mM (pH 7,4), MgCl2 10 mM, dithiothréitol 10 mM, spermidine 1 mM, ATP 1 mM et 0,1 mg/mi de BSA à 150C pendant une nuit. La température a été élevée à 700C et maintenue à cette valeur pendant 10 minutes pour terminer la réaction et ainsi former des plasmides recombinants.

En utilisant la totalité de la quantité du mélange réactionnel résultant, des cellules de Bacillus subtilis 168 MA3 (FERM BP-1042) sont transformées par les plasmides recombinants sensiblement de la même manière qu'à l'étape 3 de l'Exemple 2 pour obtenir des transformants résistants à la kanamycine.

Etape 6 Séparation de Bacillus subtilis contenant
un gène codant pour AH dérivé de Corynebacterium
melassecola 801 (FERM BP-558)
Les transformants obtenus à l'étape 5 de l'Exemple 2 ont été mis en culture dans un milieu d'agar minimum de
Spizizen contenant 50 mg/t de tryptophane et 4 jug/mX de kanamycine. On a ainsi obtenu une souche qui était résistante à la kanamycine et ne nécessitait pas d'acide glutamique pour sa croissance et la souche a été désignée par Bacillus -subtilis 168 MA3 (pAG5O1). La souche contenait un gène codant pour AH.

L'activité de AH de la souche a été déterminée par la méthode suivante afin de confirmer que la souche avait un gène cloné codant pour AH.

On a mis séparément en culture,dans 200 mt de bouillon L, tout en secouant, Bacillus subtilis 168 MI113,
Bacillus subtilis 168 MA3, Bacillus subtilis 168 MA3 (pUX2) et Bacillus subtilis 168 MA3 (pAGSO1). Lorsque lton a dû mettre en culture une souche résistante à la kanamycine, on a ajouté, à un bouillon L, 4 yg/mt de kanamycine.

Séparément de chacune des cultures résultantes, des cellules ont été recueillies par centrifugation, lavées avec une solution aqueuse à 0,8% (poids/volume) de NaC1 puis mises en suspensions dans 12 m d'un tampon MES
contenant l'acide 2-(N-morpholinoéthanesulfonique (MES) 50 mM, MnS04 10 mM et EDTA 10 mM et ajusté à pH 7,0
La suspension résultante a été homogénéisée en utilisant un homogénéiseur de cellules MSK modèle 853021 (fabriqué et vendu par Braun Inc., Allemagne de l'Ouest) puis soumise à centrifugation à 14.000 t/mn (20.000 g) pendant 20 minutes pour obtenir un extrait de cellules (solution d'enzymes brutes).

L'activité de AH a été déterminée en mesurant la diminution de l'absorbance à 240 nm de 2,6 m.Z d'une solution de réaction d'enzymes t contenant Tris-HCl 77 mM (pH 7,2), NaCl 115 mM , acide cis-aconitique 0,115 mM et 50 lIJt de l'extrait de cellules en utilisant un spectrophotomètre modèle 228 (fabriqué et vendu par Hitachi, Ltd.

Japon).

Par ailleurs, la concentration de la protéine dans l'extrait de cellules a été mesurée sensiblement de la même manière que celle employée à l'étape 5 de l'Exemple 1.

Les résultats sont montrés au Tableau 2. Comme cela est apparent par les résultats montrés au Tableau 2, l'activité de AH de la souche de B. subtilis 168 MA3 a été récupérée par transformation de la souche par le plasmide pAGSO1.

Tableau 2

<tb> Souche <SEP> Activité <SEP> spécifique <SEP> de <SEP> AH <SEP> *1)
<tb> MI113 <SEP> *2) <SEP> 5,26
<tb> MA3 <SEP> *3) <SEP> 0,000
<tb> MA3 <SEP> (pUX2) <SEP> 0,000
<tb> MA3 <SEP> (pAGSO1) <SEP> 0,018
<tb>
Notes: *1) exprimée en termes de la quantité (micro
moles) de l'acide cis-aconitique consommée
pour 1 mg de la protéine dans la solution
réactionnelle pendant 1 minute.

*2) Une souche sauvage de Bacillus subtilis 168
ayant un gène codant pour AH
*3) Bacillus subtilis 168 qui est déficient en
un gene codant pour AH.

Etape 7 (Isolement et analyse du plasmide pAGSO1)
De Bacillus subtilis 168 MA3 (pAGSO1), on a isolé 120jJg du plasmide pAGSO1 de la même manière qu'à l'étape 3 de l'Exemple 2 puis on a purifié. De l'ADN ainsi isolé, on a préparé un échantillon de 0,3 rg et on les a digérés par les enzymes de restriction suivantes dans 20 d'un tampon approprié à 37 C pendant 2 heures. Comme enzymes de restriction, on a utilisé EcoRi, BamHI, BglII,
HindIII, KpnI (chacune étant fabriquée et vendue par
TOYOBO Co., Ltd., Japon), Mlui (fabriquée et vendue par
Takara Shuzo Co., Ltd., Japon), PstI, PvuII, SacI, SalI,
XbaI et XhoI (chacune fabriquée et vendue par TOYOBO Co.

Ltd., Japon). Chacune des enzymes de restriction a été
utilisée en une quantité de 10 unités. Les digestions ont
été entreprises en utilisant les enzymes de restriction
seules et en combinaison. Les produits ainsi obtenus de
digestion ont été soumis à une analyse selon la méthode
de l'étape 6 de l'Exemple 1 pour obtenir la longueur moléculaire du plasmide pAGSO1 et ses sites de clivage par endonucléase de restriction.

Par suite, on a trouvé que le plasmide pAGSO1 avait une structure illustrée par la carte de clivage par endonucléase de restriction montrée à la figure 3 et se composait du vecteur pUX2 et, inséré au site qui avait été scindé par l'enzyme de restriction XbaI, un fragment étranger de XbaI contenant un gène codant pour AH ayant une longueur moléculaire d'environ 4,7 kb. Le fragment de
XbaI était un fragment d'ADN contenant un gène codant pour AH dérivé de Corynebacterium melassecola 801 (FERM BP-558).

Des cellules de Bacillus subtilis 168 MA3 ont été transformées par l'ADN du plasmide pAG50 ci-dessus mentionné sensiblement de la même manière qu'à l'étape 3 de l'Exemple 2, à l'exception que l'on a utilisé l'ADN du plasmide pAGSO1 au lieu de pUB110, pour obtenir des transformants. Les transformants résultants ont été examinés pour leur résistance aux médicaments et leur auxotrophie. Tous les transformants examinés se sont révélés être résistants à la kanamycine et ne pas nécessiter d'acide glutamique pour leur croissance. Par ailleurs, la carte de clivage par endonucléase de restriction du plasmide retenu dans le transformant s'est révélée être la même que celle du plasmide employé dans la transformation ci-dessus.

Etape 8 (Isolement d'un fragment d'ADN contenant
un gène codant pour AH et ayant une longueur
moléculaire d'environ 4,7 kb)
A 20 ,ug de 1'ADN du plasmide pAGSO1 obtenu à l'étape 7 de l'Exemple 2, on a ajouté 60 unités de l'enzyme de restriction XbaI. On a laissé le mélange résultant réagir dans 100 pt d'un tampon contenant Tris HCl 50 mM (pH 7,4), MUS04 10 mM et NaC1 100 mM à 37 C pendant 2 heures.Le plasmide digéré a été soumis à électrophorese sensiblement de la même manière qu'à l'étape 7 de l'Exemple 1 et l'on a observé visuellement des fragments d'ADN contenant un gène codant pour AH et ayant une longueur moléculaire d'environ 4,7 kb. Une portion du gel dans laquelle on a trouvé de tels fragments d'ADN a été découpée. Le gel découpé a été soumis au même traitement qu'à l'étape 7 de l'Exemple 1 pour obtenir environ 6 ug de fragments d'ADN contenant un gène codant pour AH et ayant une longueur moléculaire d'environ 4,7 kb.

EXEMPLE 3
Dans cet exemple, on a utilisé Corynebacterium melassecola 801 (FERM BP-558) comme donneur d'ADN pour effectuer le clonage d'un gène codant pour ICDH (isocitrate déshydrogénase). Le gène codant pour ICDH a été cloné en utilisant le système hôte-vecteur où l'on a utilisé la souche EB106 de Escherichia coli K12 comme hôte et le plasmide pBR325 comme vecteur. La souche EB106 de
Escherichia coli K12 a été obtenue du Docteur Barbara
J. Bachmann de E. coli Genetic Stock Center, Department of Human Genetics, Université de Yale, Ecole de Médecine, 333 Ceder Street P.O. Box 3333 New Haven, Connecticut 06510 , EUA. Toute personne peut obtenir la souche au centre ci-dessus mentionné. Le plasmide pBR325 a été acheté aux Bethesda Research Laboratories , EUA.

Etape 1 clivage de la totalité de l'ADN de
Corynebacterium melassecola 801 (FERM BP-558)7
On a répété sensiblement les mêmes processus qu'à l'étape 1 de l'Exemple 1 pour obtenir 1'ADN de Corynebacterium melassecola 801. On a ajouté 160 unités de l'enzyme de restriction EcoRI (fabriquée et vendue par
Nippon Gene Co., Ltd., Japon) à 40 jjg de l'AON obtenu, et l'on a mélangé le mélange résultant à 70 lut d'un tampon contenant Tris-HCl 50 mM (pH 7,4), MgS04 10 mM et
NaC1 100 mM et on a laissé reposer à 37 C pendant 30 minutes pour ainsi faire avancer une réaction.Alors, on a chauffé le mélange réactionnel à 700C pendant 10 minutes pour arrêter la réaction.

Etape 2 (Préparation du plasmide pBR325 et
son clivage)
Le plasmide pBR325 a été introduit par transformation dans la souche EB106 de Escherichia coli K12 et, du transformant ainsi obtenu, on a obtenu pBR325 comme suit.

A titre d'exemple, sensiblement de la même manière qu'à l'étape 2 de l'Exemple 1, on a préparé une solution dans laquelle des cellules compétentes de la souche EB106 de
Escherichia coli K12 ont été mises en suspension. A 200 de la suspension des cellules compétentes, on a ajouté 0,1 yg d'ADN de pBR325 et on a laissé le mélange résultant reposer dans l'eau glacée pendant 1 heure. Subséquemment, on a laissé le mélange reposer à 42 G pendant 2 minutes et alors, on ajouté , au mélange, 5 mL d'un bouillon L.

Le mélange résultant a été incubé stationnairement à 37 C pendant 90 minutes. Alors,- on a dilué le mélange avec une eau stérilisée et on l'a enduit sur un milieu d'agar L (milieu obtenu en ajoutant 15 g d'agar à un bouillon L de manière que le volume total soit de 1 litre) contenant 30 ,ug/mi d'ampicilline avec ensuite incubation pendant une nuit à 37 C pour obtenir la souche EB106 de
Escherichia coli K12 transformée par le plasmide pBR325.

De la souche ainsi obtenue de Escherichia coli transformée par le plasmide pBR325, on a obtenu 1 mt d'un dialysat contenant le plasmide pBR325 et ayant une concentration en ADN de 180 lug/mt sensiblement de la même manière qu'à l'étape 2 de l'Exemple 1 à l'exception que l'on a mis la souche EB106 de Escherichia coli K12 contenant le plasmide pBR325 en culture sur un bouillon L contenant 30 ug/mt d'ampicilline.

A une aliquote du dialysat contenant 15 9 de l'ADN du plasmide pBR325 obtenu, on a ajouté 45 unités de l'enzyme de restriction EcoRi. On a ajouté le mélange résultant à 150 t d'une solution d'un tampon contenant Tris-HCl 50 mM (pH 7,4), MgS04 10 mM et NaCl 100 mM, avec ensuite incubation à 370C pendant 2 heures pour faire avancer une réaction.

Ensuite, le mélange a été chauffé à 70 C pendant 10 minutes pour arrêter la réaction. Au mélange réactionnel, on a ajouté de l'acétate de sodium en une quantité telle que le mélange résultant contienne de l'acétate de sodium à une concentration de 300 mM. Au mélange, on a ajouté un volume double d'éthanol et l'on a laissé reposer le mélange obtenu à -30 C pendant 3 heures. Alors, le mélange a été soumis à centrifugation à 12.000 t/mn (8.900 g) à température ambiante pendant 10 minutes pour obtenir un produit surnageant et des précipités. Les précipités ont été recueillis et séchés sous pression réduite. Les précipités ainsi obtenus ont été dissous dans 200 lut d'un tampon BATP (Tris-HC1 50 mM, pH 8,4).A la solution ainsi obtenue, on a ajouté 1 unité de phosphatase alcaline bactérienne (fabriquée et vendue par Takara Shuzo Co., Ltd., Japon) avec ensuite incubation à 65 C pendant 30 minutes. Alors, on a ajouté, à la solution résultante, 1 unité de phosphatase alcaline bactérienne avec ensuite incubation à 65 C pendant 30 minutes. Ensuite, on a ajouté un volume équivalent de phénol saturé de tampon TNE dans la solution, avec ensuite mélange. Le mélange résultant a été soumis à centrifugation à 12.000 t/mn (8.900 g) à température ambiante pendant 10 minutes et l'on a récupéré une phase aqueuse. A la phase aqueuse ainsi obtenue, on a ajouté un volume égal de phénol saturé de tampon TNE, avec ensuite mélange. Le mélangerésultant a été soumis à centrifugation à 12.000 t/mn (8.900 g) à température ambiante pendant 10 minutes et l'on a récupéré une phase aqueuse. Alors, on a ajouté, à la phase aqueuse, un volume égal d'un mélange de phénol-chloroforme (1:1, volume/volume) avec ensuite mélange. Le mélange résultant a été soumis à centrifugation à 12.000 t/mn (8.900 g) à température ambiante pendant 10 minutes et l'on a récupéré une phase aqueuse. Alors, on a ajouté un volume égal de chloroforme à la phase aqueuse tout en agitant et on a soumis à centrifugation à 12.000 t/mn (8.900 g) à température ambiante pendant 10 minutes et l'on a récupéré une phase
aqueuse.A la phase aqueuse ainsi obtenue, on a ajouté de
l'acétate de sodium en une quantité telle que le mélange
résultant contienne de l'acétate de sodium à une concentration
de 300 mM, et au mélange résultant, on a ajouté un volume
double d'éthanol tout en agitant. On a laissé le mélange
résultant reposer à -30 C pendant 3 heures. Subséquemment,
le mélange a été soumis à centrifugation à 12.000 t/mn
(8.900 g) à température ambiante pendant 10 minutes pour
obtenir des précipités d'ADN. Les précipités d'ADN ont
été séchés sous pression réduite et dissous dans 30
de la solution du tampon TE.

Etape 3 (Recombinaison de 1'ADN)
On a ajouté 4 9 de 1'ADN obtenu à l'étape 1 de
l'Exemple 3 et 2 yg de 1'ADN obtenu à l'étape 2 de l'Exemple 3
et 3 unités d'ADN ligase T4 phagique (fabriquée et
vendue par Nippon Gene Co., Ltd., Japon), à 100 ,ut d'un
tampon contenant Tris-HCl 50 mM (pH 7,4), égal2 10 mM,
dithiothréitol 10 mM, spermidine 1 mM, ATP 1 mM et 0,1 mg/mt
de BSA (albumine de sérum bovin) (fabriquée et vendue par
Bethesda Research Laboratories, EUA). On a laissé le
mélange résultant reposer pour avancer une réaction à 15 C
pendant une nuit.Le mélange réactionnel ainsi obtenu a
été chauffé à 700C pendant 10 minutes pour arrêter la
réaction.

Etape 4 (Transfert du plasmide recombinant dans
Escherichia coli)
Une suspension de cellules compétentes de la souche
EB106 de Escherichia coli K12 a été préparée sensiblement
de la même manière qu'à l'étape 2 de l'Exemple 3. On a
mélangé 400 pt de la suspension de cellules compétentes
et 40 lut du mélange réactionnel obtenu à l'étape 3 de
l'Exemple 3 et on a laissé reposer dans la glace pendant
1 heure.

Ensuite, on a chauffé le mélange à 42.OC pendant
2 minutes et ensuite on a ajouté, au mélange, 5 mQ du
bouillon L. Le mélange résultant a été incubé stationnaire
ment à 37 C pendant 90 minutes. Alors, du mélange, des cellules ont été recueillies et mises en suspénsion dans de l'eau stérile pour obtenir une suspension de cellules.

La suspension ainsi obtenue de cellules a été appliquée à un milieu d'agar de synthèse (contenant 6 gj de
Na2HP04 , 3 9/t de KH2PO4, 0,5 g/l de NaCl, 1 9/t de
NH4Cl , MgS04 1 mM, Ca(:l2 0,1 mM, 2 g/l de glucose, 15 g/Q d'agar et L-tryptophane 0,1 mM) et on a incubé.

Etape 5 Sélection et isolement de E. coli ayant
un gène codant pour ICDH dérivé d'un micro-organisme
Corynebacterium melassecola 801 (FERMBP-558)
Les cellules obtenues à l'étape 4 de l'Exemple 3 ont été mises en culture séparément sur le milieu d'agas de synthèse ci-dessus mentionné contenant du-chloramphénicol (20 ,ug/mt) et de la tétracycline (10 Fug/m2) et sur le milieu d'agar de synthèse ci-dessus mentionné contenant de la tétracycline (10 pg/mt) seule. Les cellules ne croissant pas sur le milieu d'agar de synthèse contenant le chloramphénicol et la tétracycline mais croissant sur le milieu d'agar de synthèse contenant la tétracycline ont été sélectionnées et isolées.Les cellules ainsi isolées étaient sensibles au chloramphénicol mais résistantes à la tétracycline et ne nécessitaient pas d'acide glutamique pour leur croissance. Les cellules ainsi isolées ont été désignées par la souche EB106 de Escherichia coli K12 (pAG302) qui avait le gène souhaité codant pour ICDH.

E. coli isolé a été mis en culture pour cloner le gène codant pour ICDH.

L'activité de. ICDH de E. coli isolé a été déterminée par la méthode suivante pour confirmer que le gène cloné était le gène codant pour ICDH. On a inoculé la souche EB106 de Escherichia coli K12 (pAG302) dans 50 mt du bouillon L et on l'a mise en culture à 320C pendant un jour tout en agitant. De la culture ainsi obtenue, on a recueilli des cellules de E. coli et on les a mises en suspension dans 2 mt d'un tampon MES [ acide 2-(N-morpholino)éthanesulfonique 50 mM, MnS04 10 mM, EDTA 10 mM , pH 7,0j pour obtenir une suspension.La suspension a été soumise à ultrasonication puis à centrifugation à 14.000 t/mn (20.000 g) à 4 C pendant 20 minutes pour obtenir un extrait de cellules (solution d'enzymes brutes). Par ailleurs, on a mis en culture la souche EB106 de Escherichia coli K12
(pBR325) et la souche EB106 de Escherichia coli K12 (pAG302) dans le bouillon L ci-dessus mentionné où l'on avait ajouté de la tétracycline à une concentration de 10 pg/m t. La soucheEB106 de Escherichia coli K12 (pAG303) a été mise en culture dans un bouillon L auquel on avait ajouté de l'ampicilline à une concentration de 30
La souche EB106 de Escherichia coli K12 (pAG311) a été mise en culture dans un bouillon L auquel on avait ajouté du chloramphénicol à une concentration de 20 pg/mt . La souche EB106 de Escherichia coli K12 et la sou-che EB106 de Escherichia coli K12 (pBR325) ont été mises en culture dans un bouillon L auquel on avait ajouté du glutamate monosodique (souvent appelé ci-après MSG") à une concentration de 2 g/
L'activité de ICDH a été déterminée en mesurant l'augmentation de l'absorbance à 340 nm de 2,9 mss d'une solution réactionnelle d'enzymes (contenant Tris-HCl 103 mM (pH 7,4), isocitrate 1 mM, Mn(: :l2 1 mM, nicotinamide adénine dinucléotide 0,5 mM, forme oxydée (que l'on appellera ci-après "NADP") et 40 lut de l'extrait de cellules) en utilisant un spectrophotomètre modèle 228 (fabriqué et vendu par Hitachi, Ltd., Japon) . Par ailleurs, la concentration en protéine dans l'extrait de cellules a été mesurée par la méthode décrite à l'étape 5 de l'Exemple 1.

Les résultats sont montrés au Tableau 3 donné à l'étape 8 que l'on décrira ultérieurement.

Comme cela est apparent par les résultats montrés au Tableau 3, l'activité de ICDH de la souche EB106 de
E. coli K12 a été récupérée de manière marquée par transformation de la souche par le plasmide pAG3O2.

Etape 6 (Isolement d'un plasmide hybride pAG302
et son analyse)
Un ADN du plasmide pAG302 a été isolé de la souche EB106 de E. coli K12 (pAG302) et purifié sensiblement de la même manière qu'à l'étape 2 de l'Exemple 1, à l'exception que lton a utilisé la soucheEB106 de E. coli
K12 (pAG302) au lieu de la souche W620 de E. coli K12 transformée par pBR325.Ainsi, l'on a obtenu 160 ug de l'ADN du plasmide pAG302. De l'ADN ainsi isolé, des échantillons de 0,3 9 ont été préparés, et on les a digérés par les enzymes de restriction qui suivent dans 20 Zut d'un tampon approprié à 37 C pendant 2 heures.

Comme enzymes de restriction, on a utilisé EcoRi, BamHI,
HindIII, Sali et XbaI (chacune fabriquée et vendue par
Nippon Gene, Co., Ltd., Japon) et PstI (fabriquée et vendue par Bethesda Research Laboratories, EUA). Chacune des enzymes de restriction a été utilisée en une quantité de 10 unités. Les digestions ont été entreprises en utilisant les enzymes de restriction seules et en combinaison.

Les produits ainsi obtenus de degestion ont été analysés selon la méthode décrite à l'étape 6 de l'Exemple 1 pour déterminer la longueur moléculaire du plasmide pAG302 ainsi que les sites de restriction du plasmide.

Par suite, on a trouvé que le plasmide pAG302 avait une structure illustrée par la carte de clivage par endonucléase de restriction montrée à la figure 3 et se composait du plasmide pBR325 et, inséré au site scindé par l'enzyme de restriction EcoRi, un fragment étranger de EcoRI dont la longueur moléculaire est d'environ 5,1 kb.

Le fragment de EcoRI était un fragment d'ADN contenant un gène codant pour ICDH dérivé de Corynebacterium melassecola 801 (FERM BP-558).

Les cellules de la souche EB106 de E. coli-K12 ont été transformées par le plasmide pAG302 ci-dessus obtenu sensiblement de la même manière qu'à l'étape 2 de l'Exemple 1,à l'exception que l'on a utilisé le plasmide pAG302 au lieu de pBR325, pour obtenir des transformants.

Les transformants résultants ont été examinés pour la résistance aux médicaments et l'auxotrophie. Tous les transformants examinés se sont révélés être résistants à la tétracycline et à l'ampicilline mais sensibles au chloramphénicol et ne pas nécessiter d'acide glutamique pour leur croissance. Par ailleurs, la carte de clivage par endonucléase de restriction du plasmide retenu dans le transformant s'est révélée être la même que celle du plasmide employé dans la transformation ci-dessus.

Etape 7 (Délétion partielle d'un fragment d'ADN
contenant un gène codant pour ICDH et ayant une
longueur moléculaire d'environ 5,1 kb)
A 3 p9 de l'ADN du plasmide pAG302 obtenu à l'étape 6 de l'Exemple 3, on a ajouté 20 unités de l'enzyme de restriction SalI. On a laissé le mélange résultant réagir dans 50 lut d'un tampon contenant Tris-HCl 50 mM (pH 7,4), MgS04 10 mM et NaCl 100 mM à 37 C pendant 2 heures. Au mélange réactionnel résultant, on a ajouté un volume égal d'un mélange à 1:1 (volume/volume) de phénol et de chloroforme et on a soumis à agitation, avec ensuite récupération d'une phase aqueuse. A la phase aqueuse on a ajouté un volume égal de chloroforme et on a soumis à agitation, avec ensuite récupération d'une phase aqueuse.A la phase aqueuse , on a ajouté de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 300 mM puis un volume double d'éthanol, et on a agité.

Alors, le mélange a été maintenu au repos à -30 C pendant 3 heures et soumis à centrifugation à 12.000 t/mn (8.900 g) à température ambiante pendant 10 minutes pour obtenir une boulette d'ADN. La boulette ainsi obtenue d'ADN a été séchée sous vide pour obtenir l'échantillon XV d'ADN.

A toute la quantité de l'échantillon XV d'ADN, on a ajouté 3 unités d'ADN ligase T4 phagique. On a laissé le mélange résultant réagir dans 50 ,ut d'un tampon contenant Tris-HCl 50 mM (pH 7,4), MgC12 10 mM, dithio thréitol 10 mM, spermidine 1 mM, ATP 1 mM et 0,1 mg-/mi de BSA à 15 C pendant une nuit. La réaction a été terminée en chauffant le mélange à 700C pendant 10 minutes.

En utilisant le mélange réactionnel de ligase ainsi obtenu, on a transformé la souche EB106 de Escherichia coli K12 sensiblement de la même manière qu'on l'a décrit à l'étape 2 de l'Exemple 3, pour ainsi obtenir des transformants qui étaient résistants à l'ampicilline mais sensibles au chloramphénicol et à la tétracycline et ne nécessitaient pas d'acide glutamique pour leur croissance.

Les plasmides retenus dans les transformants ont été isolés et analysés sensiblement de la même manière qu'on l'a décrit à l'étape 6 de l'Exemple 3. Les plasmides ainsi isolés ont été désignés par plasmide pAG303. Le transformant retenant le plasmide pAG303 a été désigné par la souche EB106 de Escherichia coli K12 (pAG303).

L'activité de ICDH de la souche EB106 de Escherichia coli K12 (pu303) a été déterminée sensiblement de la même manière qu'à l'étape 5 de l'Exemple 3. Les résultats sont donnés au Tableau 3 donné à l'étape 8 qui sera décrite ciaprès. Comme cela est apparent par les résultats montrés au Tableau 3, l'activité de ICDH de la souche EB106 de
E. coli K12 a été récupérée de manière marquée par transformation de la souche par le plasmide pAG303. Le plasmide pAG303 avait une structure illustrée dans la carte de clivage par endonucléase de restriction montrée à la figure 4, et se composait du fragment EcoRI-SalI dérivé du vecteur pBR325 et, inséré aux sites de restriction
EcoRI et SalI, un fragment étranger de EcoRI-SalI ayant une longueur moléculaire d'environ 3,4 kb. Le fragment étranger de EcoRI-SalI était un fragment d'ADN contenant un gène codant pour ICDH dérivé de Corynebacterium melassecola 801 (FERM BP-558).

Des cellules de la souche EB106 de E. coli K12 ont été transformées par le plasmide pAG303 ci-dessus mentionné sensiblement de la même manière qu'à l'étape 2 de l'Exemple 3 à l'exception que l'on a utilisé le plasmide pAG303 au lieu de pBR325, pour obtenir des transformants. Les transformants résultants ont été examinés pour leur résistance aux médicaments et l'auxotrophie. Tous les transformants examinés se sont révélés être résistants à l'ampicilline mais sensibles au chloramphénicol et à la tétracycline et ne pas nécessiter d'acide glutamique pour leur croissance. Par ailleurs, la carte de clivage par endonucléase de restriction d plasmide retenu dans le transformant s'est révélée etre la même que celle du plasmide employé dans la transformation ci-dessus.

Etape 8 (Conversion de l'extrémité EcoRI du
fragment EcoRI-SalI contenant un gène codant pour
ICDH et ayant une longueur moléculaire d'environ
3,4 kb en extrémité SalI)
A 5 ,ug de l'ADN du plasmide pAG302 obtenu à l'étape I de l'Exemple 3, on a ajouté 20 unités de l'enzyme de restriction EcoRi. On a laissé le mélange résultant réagir dans 100 jut d'un tampon contenant Tris-HCl 50 mM (pH 7,4), MES 10 mM et NaC1 100 mM à 37 C pendant 2 heures.

Ensuite, on a chauffé le mélange à 700C pendant 10 minutes pour arrêter la réaction. Au mélange réactionnel, on a ajouté de l'acétate de sodium en une quantité telle que le mélange résultant contienne de l'acétate de sodium à une concentration de 300 mM. Au mélange, on a ajouté un volume double d'éthanol et on a laissé le mélange obtenu reposer à -30 C pendant 3 heures. Alors, le mélange a été soumis à centrifugation à 12.000 t/mn (8.900 g) à température ambiante pendant 10 minutes pour obtenir un produit surnageant et des précipités. Les précipités ont été recueillis et séchés sous pression réduite, pour ainsi obtenir l'échantillon XVI d'ADN.

L'échantillon XVI d'ADN ainsi obtenu et 3 unités d'ADN polymérase T4 (fabriquée et vendue par Takara Shuzo
Co., Ltd., Japon) ont été ajoutés à 4 l d'un mélange aqueux contenant Tris-CH3COOH 33 mM (pH 7,9), CH3COOK 66 mM, (CH3C00)2Mg 10 mM, dithiothréitol 0,5 mM, 0,1 mg/cf de BSA, 2'-désoxyedénosine 5'-triphosphate 0,1 mM (fabriqué et vendu par Sigma Chemical Company, EUA) , 2'-désoxycytidine 5'-triphosphate 0,1 mM (fabriqué et vendu par Sigma
Chemical (:ompany, EUA), 2'-désoxyguanosine 5'-triphosphate 0,1 mM (fabriqué et vendu par Sigma Chemical Company, EUA) et thymidine 5'-triphosphate 0,1 mM (fabriqué et vendu par
Sigma Chemical (:ocpany, EUA).On a laissé le mélange ainsi obtenu reposer à 30 C pendant 20 minutes pour faire avancer une réaction. Au mélange, on a ajouté de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 300 mM. Alors, on a ajouté, au mélange, un volume double d'éthanol et on a laissé le mélange reposer à 30 C pendant 3 heures.

Subséquemment, le mélange a été soumis à centrifugation à 12.000 t/mn (8.900 g) à température ambiante pendant 10 minutes pour obtenir un produit surnageant et des précipités. Les précipités ont été recueillis et séchés sous pression réduite, pour ainsi obtenir un échantillon XVII d 'ADN.

On a ajouté 1,5 yg du linker SalI (fabriqué et vendu par Takara Shuzo Co., Ltd., Japon) et 2,5 unités de polynucléotide kinase T4 (fabriquée et vendue par Takara
Shuzo Co., Ltd., Japon) à 10 t d'un mélange aqueux contenant Tris-HCl 66 mM (pH 7,6), ATP 1 mM, MgCl2 10 mM, spermidine 1 mM, dithiothréitol 15 mM et 0,2 mg/me de BSA.

Alors, on a laissé le mélange obtenu reposer à 37 C pendant 1 heure pour avancer une réaction et ainsi obtenir un échantillon XVIII d'ADN.

La moitié de la quantité de l'échantillon XVII d'ADN et la totalité de la quantité de l'échantillon XVIII d'ADN , avec 6 unités d'ADN ligase T4 phagique,ont été ajoutées à 22 ,uQ d'un mélange aqueux contenant Tris-HCl 66 mM (pH 7,6), ATP 1 mM , MgC12 10 mM, spermidine 1 mM, dithiothréitol 15 mM et 0,2 mg/m-2 de BSA. Alors, on a laissé le mélange obtenu reposer à 22OC pendant 4 heures pour faire avancer une réaction. Au mélange réactionnel,on a ajouté un volume égal d'un mélange à 1:1 < volume/volume) de phénol et de chloroforme avec ensuite agitation. Le mélange résultant a été soumis à centrifugation à 12.000 t/mn (8.900 g) à température ambiante pendant 10 minutes et on a récupéré une phase aqueuse .Alors, on a ajouté un volume égal de chloroforme,à la phase aqueuse, on a soumis à agitation et on a soumis à centrifugation à 12.000 t/mn
(8.900 g) à température ambiante pendant 10 minutes pour récupérer une phase aqueuse. A la phase aqueuse ainsi obtenue, on a ajouté de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 300 mM, puis un volume double d'éthanol tout en agitant. On a laissé le mélange résultant reposer à -300C pendant 3 heures. Subséquemment, le mélange a été soumis à centrifugation à 12.000 t/mn (8.900 g) à température ambiante pendant 10 minutes pour obtenir des précipités d'ADN. Les précipités d'ADN ont été séchés sous pression réduite, pour ainsi obtenir l'échantillon XIX d'ADN.

A la totalité de la quantité de l'échantillon XIX d'ADN,on a ajouté 15 unités de l'enzyme de restriction SalI.

On a laissé le mélange réagir dans 50 jut d'un tampon contenant Tris-HCl 50 cM (pH 7,4), MES 10 mM et NaC1 10 mM à 37 C pendant 2 heures. Le produit ainsi obtenu de digestion a été soumis à une électrophorèse sur gel agarose sensiblement de la même manière qu'à l'étape 7 de l'Exemple 1 pour confirmer la présence d'un fragment d'ADN ayant une longueur moléculaire d'environ 3,4 kb. Une portion où lton avait trouvé le fragment d'ADN a été découpée du gel agarose. Du gel découpé, on a obtenu un
ADN sensiblement de la même manière qu'à l'étape 7 de l'Exemple 1 (échantillon XX d'ADN).

A 4 ug du plasmide pBR325 obtenu à l'étape 2 de l'Exemple 3, on a ajouté 20 unités de l'enzyme de rectriction SalI. On a laissé le mélange résultant réagir dans 50 {ut d'un tampon contenant Tris-HCl 50 mM (pH 7,4),
MgS04 10 mM et NaCl 100 mM à 37 C pendant 2 heures. Au mélange réactionnel résultant, on a ajouté un volume égal d'un mélange à 1:1 (volume/volume) de phénol et de chloroforme et on a soumis à agitation avec ensuite récupération d'une phase aqueuse. A la phase aqueuse on a ajouté un volume égal de chloroforme et on a soumis à agitation avec ensuite récupération d'une phase aqueuse. A la phase aqueuse résultante on a ajouté de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 300 mM puis un volume double d'éthanol.Alors, le mélange a été maintenu au repos à -30 C pendant 3 heures et soumis à centrifugation à 12.000 t/mn (8.900 g) à température ambiante pendant 10 minutes pour obtenir une boulette d'ADN. La boulette ainsi obtenue d'ADN a été séchée sous vide, pour ainsi obtenir l'échantillon XXI d'ADN.

On a fait réagir la totalité de la quantité de l'échantillon XX d'ADN et la totalité de la quantité de l'échantillon XXI d'ADN avec 3 unités d'ADN ligase T4 phagique dans 100 t d'un tampon contenant Tris-HCl 50 mM (pH 7,4), MgCl2 10 mM, dithiothréitol 10 mM, spermidine 1 mM,
ATP 1 mM et 0,1 mg/m de BSA à 15DC pendant une nuit.

Ensuite, on a chauffé le mélange réactionnel résultant à 7O0C pendant 10 minutes pour terminer la réaction.

En utilisant 40 ,uQ du mélange réactionnel de ligase ci-dessus obtenu, la transformation des cellules de la souche EB106 de E. coli K12 a été effectuée sensiblement de la même manière qu'à l'étape 4 de l'Exemple 3 pour obtenir des transformants. Les transformants ainsi obtenus ont été séparément mis en culture sur le milieu d'agar de synthèse ci-dessus mentionné contenant du chloramphénicol (20 pg/m2) et de la tétracycline (10 Vg/m2) et sur le milieu d'agar de synthèse ci-dessus mentionné contenant du chloramphénicol (20 pg/me). Les cellules qui ne croissaient pas sur le milieu d'agar de synthèse contenant du chloramphénicol et de la tétracycline mais qui croissaient sur le milieu d'agar de synthèse contenant le chloramphénicol seul ont été sélectionnées et isolées.Les cellules ainsi isolées étaient sensibles à la tétracycline mais résistantes au chloramphénicol et ne nécessitaient pas d'acide glutamique pour leur croissanc-e.

Le plasmide retenu dans les cellules isolées a été séparé et purifié sensiblement de la même manière qu'à l'étape 2 de l'Exemple 3. Le plasmide hybride ainsi obtenu a été désigné par pAG311.

Par suite d'une étude de la structure de l'ADN plasmidique selon la méthode mentionnée à l'étape 6 de l'Exemple 3, on a trouvé que le plasmide pAG311 avait la structure illustrée par la carte de clivage par endonucléase de restriction montrée à la figure 5 et que le plasmide se composait du vecteur pBR325 et, inséré au site scindé par l'enzyme de restriction SalI, un fragment étranger de SalI ayant une longueur moléculaire d'environ 3,4 kb.

Le fragment de SalI était un fragment d'ADN contenant un gène codant pour ICDH dérivé de Corynebacterium melassecola 801 (FERM BP-558), avait une structure telle que l'extra- mité EcoRI du fragment EcoRI-SalI comme on l'a mentionné à l'étape 7 de l'Exemple 3 soit convertie en une extrémité
SalI. Les cellules de la souche EB106 de E. coli K12 ont été transformées par le plasmide pAG311 obtenu ci-dessus sensiblement de la même manière qu'à l'étape 2 de l'Exemple 3 à l'exception que l'on a utilisé le plasmide pAG311 au lieu de pBR325 pour obtenir des transformants.

Les transformants ainsi obtenus sont désignés par la souche EB106 de Escherichia coli K12 (pAG311j. L'activité de ICDH du transformant souche EB106 de Escherichia coli K12 (pAG311) retenant le plasmide pAG311 a été déterminée sensiblement de la même manière qu'à l'étape 5 de l'Exemple 3. Les résultats sont montrés au Tableau 3 donné ci-dessous. Comme cela est apparent par les résultats montrés au Tableau 3, l'activité de ICDH de la souche
EB106 de E. coli K12 a été récupérée de manière marquée par transformation de la souche Ex106 par le plasmide pAG311.

Les transformants ont été examinés pour leur résistance aux médicaments et l'auxotrophie. Tous les transformants examinés se sont révélés être résistants au chloramphénicol et à l'ampicilline mais sensibles à la tétracycline et ne pas nécessiter d'acide glutamique pour leur croissance.

Par ailleurs, la carte de clivage- par endonucléase de restriction du plasmide retenu dans le transformant s'est révélée être la même que celle du plasmide employé dans la transformation ci-dessus.

Tableau 3

<tb> Souche <SEP> Activité <SEP> spécifique <SEP> de
<tb> <SEP> ICDH <SEP> *1)
<tb> EB106 <SEP> *2) <SEP> 0,00
<tb> EB106 <SEP> (pBR325) <SEP> 0,01
<tb> EB106 <SEP> (pAG302) <SEP> 4,07 <SEP>
<tb> EB106 <SEP> (pAG303) <SEP> 2,38
<tb> EB106 <SEP> (pAG311) <SEP> 0,21
<tb>
Notes: *1) exprimée en termes de la quantité (micro
moles) de NADPH (/s-nicotinamide adénine dinucléotide
phosphate, forme réduite) forcée à être oxydée par
1 mg de la protéine dans le mélange réactionnel
pendant une période de 1 minute.

*2) variante de la souche de Escherichia coli K12
obtenue du Docteur Barbara J. Bachmann de E. coli
Genetic Stock Center, Département de Génétique
Humaine , Université de Yale, Ecole de Médecine,
333 Ceder Street P.O. Box 3333 New Haven,
Connecticut 06510 E.U.A. Cette souche est une
souche déficiente en ICDH. Par ailleurs, toute
personne peut obtenir la variante au centre.

Etape 9 (Séparation, du plasmide pAG302, d'un
fragment d'ADN contenant un gène codant pour ICDH
et ayant une longueur moléculaire d'environ 5,1 kb)
A 20 fjg de l'ADN du plasmide pAG302 obtenu à l'étape 6 de l'Exemple 3, on a ajouté 60 unités de chacune des enzymes de restriction EcoRI et XbaI. On a laissé le mélange résultant réagir dans 100 l d'un d1un tampon contenant Tris-HCl 50 mM (pH 7,4), MgS04 10 mM et NaC1 100 mM à 37 C pendant 2 heures.Le produit de digestion ainsi obtenu a été soumis à une électrophorèse sur gel agarose sensiblement de la même manière qu'à l'étape 7 de l'Exemple 1 pour confirmer la présence de deux fragments d'ADN qui avaient respectivement un longueur moléculaire d'environ 3,9 kb et d'environ 1,2 kb et qui, dans l'ensemble, contenaient un gène codant pour ICDH. On a découpé séparément, du gel agarose, deux portions où l'on a trouvé de tels fragments d'ADN. Les gels découpés ont été traités sensiblement de la même manière qu'à l'étape 7 de l'Exemple 1 pour obtenir deux fragments, c'est-à-dire un fragment EcoRI-XbaI d'environ 3,9 kb de longueur moléculaire et un fragment
XbaI-EcoRI d'environ 1,2 kb de longueur moléculaire.Ces deux fragments correspondent à un fragment EcoRI d'environ 5,1 kb de longueur moléculaire contenant un gène codant pour ICDH dérivé de la bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique. Les productions du fragment EcoRI-XbaI et du fragment XbaI-EcoRI étaient respectivement d'environ 4 pg et d'environ 1 pg
Etape 10 (Séparation, du plasmide pAG303, d'un
fragment EcoRI-SalI contenant un gène codant pour
ICDH et ayant une longueur moléculaire d'environ
3,4 kb)
A 20 ,ug du plasmide pAG303 obtenu à l'étape 7 de l'Exemple 3, on a ajouté 60 unités de chacune des enzymes de restriction EcoRI, SalI et XbaI.On a laissé le mélange résultant réagir dans 100 ssue d'un tampon contenant Tris-HCl 50 mM (pH 7,4), MgS04 10 mM et NaC1 100 mM à 37 C pendant 2 heures. Le produit ainsi obtenu de digestion a été traité sensiblement de la même manière qu'à l'étape 7 de l'Exemple 1 pour confirmer la présence de deux fragments d'ADN qui avaient respectivement une longueur moléculaire d'environ 2,2 kb et environ 1,2 kb et qui, ensemble, contenaient un gène codant pour ICDH. Des portions où l'on a trouvé de tels fragments d'ADN ont été séparément découpées du gel agarose.Les gels découpés ont été soumis à une extraction du fragment d'ADN sensiblement de la même manière qu'à l'étape 7 de l'Exemple 1 pour obtenir deux fragments, c'est-à-dire le fragment SalI-XbaI d'environ 2,2 kb de longueur moléculaire et le fragment XbaI-EcoRI d'environ 1,2 kb de longueur moléculaire. Ces deux fragments correspondent à un fragment EcoRI-SalI d'environ 3,4 kb de longueur moléculaire contenant un gène codant pour ICDH dérivé de la bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique. Les productions du fragment EcoRI-XbaI et du fragment XbaI-EcoRI étaient d'environ 3 9 et environ 1 ug, respectivement.

Etape 11 (Séparation, du plasmide pAG311, d'un
fragment SalI contenant un gène codant pour ICDH
et ayant une longueur moléculaire d'environ 3,4 kb)
A 20 ;jg de l'ADN du plasmide pAG311 obtenu à l'étape 8 de l'Exemple 3, on a ajouté 60 unités d'une enzyme de restriction SalI. On a laissé le mélange résultant réagir dans 100 lut d'un tampon contenant Tris-HCl 50 mM (pH 7,4), MgS04 10 mM et NaCl 100 mM à 37 C pendant 2 heures . Le produit ainsi obtenu de digestion a été soumis à une électrophorèse sur gel agarose sensiblement de la même manière qu'à l'étape 7 de l'Exemple 1 pour confirmer la présence d'un fragment -d'ADN ayant une longueur moléculaire d'environ 3,4 kb et contenant un gène codant pour ICDH.On a découpé, du gel agarose, une portion où l'on a trouvé un tel fragment d'ADN. L'extraction du fragment d'ADN du gel découpé a été effectuée sensiblement de la même manière qu'à l'étape 7 de l'Exemple 1 pour obtenir environ 4 p9 d'un fragment d'ADN contenant un gène codant pour ICDH dérivé de la bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique et ayant une longueur moléculaire d'environ 3,4 kb. Le fragment d'ADN ainsi obtenu avait une structure telle que l'extrémité formée par clivage de EcoRI du fragment EcoRI-SalI obtenu à l'étape 10 de l'Exemple 3 était convertie en extrémité formée par clivage de SalI.

EXEMPLE 4
Dans cet exemple, on a inséré un fragment d'ADN, dérivé d'une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique, contenant un gène codant pour CS (citrate synthase) , dans un vecteur dérivé de la bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique pour préparer un ADN recombinant pour la production de CS. Un transformant capable de former CS en une grande quantité a alors été préparé en utilisant l'AON recombinant. Le fragment XbaI obtenu à l'étape 7 de l'Exemple 1, c'est-à-dire un fragment
XbaI contenant un gène codant pour CS et ayant une longueur moléculaire d'environ 4,9 kb, a été utilisé comme fragment d'ADN, dérivé d'une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique , contenant un gène codant pour CS.

On a utilisé le plasmide pAG50 comme vecteur dérivé d'une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique. Le plasmide pAG50 était un plasmide du vecteur qui avait été préparé à partir de plasmides pAG1 et pAG3 dérivés de la bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique par la méthode qui sera mentionnée ci-dessous. Le plasmide pAG1 est un plasmide résistant à la tétracycline qui a été isolé de Corynebacterium melassecola 22243 dépose au FR1 sous le numéro d'accession FERM BP-560. Le plasmide pAG3 est un plasmide cryptique isolé de Corynebacterium melassecola 22220 déposé au FRI sous le numéro d'accession
FERM BP-559.

Etape 1 L Préparation du plasmide pAG50 et son
isolement de Corynebacterium melassecola 801
(pAG5O) retenant le plasmide pAG50 3 (1) Isolement d'un plasmide pAG1 de Corynebacterium
melassecola 22243 (FERM BP-560)
Le micro-organisme Corynebacterium melassecola 22243 a été mis en culture dans un milieu semi-synthétique milieu préparé en dissolvant 10 g de (NH4)2S04, 3 g d'urée, 1 g de K2HP04 , 50 mg de NaC1, 400 mg de MgS047H20, 2 mg de MnS044-6H20, 2 mg de FeS044-6H20, 20 g de glucose, 50 ,ug de biotine, 200 p9 de chlorhydrate de thiamine et 1 g d'extrait de levure dans de l'éau dont les ions étaient échangés et distillée de manière que le volume total soit de 1 litre, et en ajustant la valeur du pH du mélange à 7,2 3 à 320C pendant une nuit tout en secouant. On a inoculé 8 m-l. de la culture ainsi obtenue dans 200 et du même milieu semi-synthétique, avec ensuite mise en culture à 32 C pendant 5 heures tout en secouant pour obtenir une culture du-micro-organisme.

De la culture, des cellules du micro-organisme ont été recueillies et mises en suspension dans 10 mt d'une solution de lysozyme (pH 8,0) contenant du glucose 50 mM,
EDTA 10 mM, Tris 25 mM et 10 mg/mt de lysozyme (fabriqué et vendu par Sigma Chemical Company, EUA) avec ensuite incubation à 42 C pendant 1 heure. A la suspension, on a ajouté 20 mt d'une solution alcali-SDS contenant NaOH à 0,2 N et 1% (poids/volume) de dodécylsulfate- de sodium (souvent appelé ci-après SDS"). Le mélange a été soumis à agitation puis on l'a laissé reposer dans la glace pendant 5 minutes.Alors, au mélange on a ajouté 15 mi d'une solution d'acétate de potassium refroidie à la glace (mélange de 60 me d'acétate de potassium 5 M, 11,5 mt d'acide acétique et 28,5 mL d'eau échangée en ions et distillée). Le mélange a été soumis à agitation et on la laissé reposer dans la glace pendant 10 minutes pour obtenir un lysat. La totalité du lysat a été transférée à un tube de centrifugeuse et soumise à une centrifugation à 12.000 t/mn (13.000 g) à 4 C pendant 5 minutes, pour ainsi obtenir un produit surnageant . Le produit surnageant a été soumis à une extraction avec un volume égal de phénol-chloroforme (1:1) et l'on a recueilli une phase aqueuse.A la phase aqueuse , on a ajouté un volume double d'éthanol et le mélange résultant a été soumis à agitation et on l'a laissé reposer à température ambiante pendant 5 minutes. Alors, le mélange a été soumis à centrifugation à 10.000 t/mn (11.000 g) à 200C pendant 10 minutes pour ainsi obtenir une boulette. La boulette a été lavée avec 70% (volume/volume) d'éthanol, séchée sous pression réduite et dissoute dans 20 mt d'un tampon TE (pH 7,5) contenant Tris 10 mM et EDTA 1 mM dans un tube de centrifugeuse. A la solution résultante, on a ajouté doucement 1,2 m e d'une solution aqueuse à 10 mg/me de bromure d'éthidium et 23,6 g de chlorure de césium et on a dissous, avec ensuite centrifugation à 40.000 t/mn (100.000 g) à 15 C pendant 48 heures.Après accomplissement de la centrifugation, deux bandes ont été visualisées sous lumière ultraviolette. La bande inférieure a été sortie du tube de centrifugeuse à travers la paroi latérale du tube en utilisant une seringue pour obtenir un plasmide pAG1. La fraction ainsi obtenue de plasmide a été soumise à une extraction avec un volume égal d'alcool isopropylique, quatre fois , pour obtenir un extrait. De l'extrait, le bromure d'éthidium a été enlevé et la solution résultante a été dialysée avec le tampon TE pour obtenir 1 me d'un dialysat contenant un plasmide pAG1 à une concentration de 50 jJglme . La carte de clivage par endonucléase de restriction du plasmide pAG1 ainsi obtenu est illustrée à la figure 1.

(2) Recombinaison in vitro du plasmide pAG1
A 0,5 9 du plasmide pAG1 préparé à la sous-étape (1) ci-dessus de l'étape 1 de l'Exemple 4, on a ajouté 10 unités d'une enzyme de restriction EcoRI. On a laissé le mélange résultant réagir dans 40 pt d'un tampon contenant Tris-HCl 50 mM (pH 7,4), MES 10 mM et NaC1 100 mM à 370C pendant 2 heures. Alors, la température a été élevée à 70 C et maintenue à cette valeur pendant 10 minutes pour terminer la réaction.On a fait réagir 20 u du mélange réactionnel ainsi obtenu avec 3 unités d'ADN ligase T4 phagique (fabriquée et vendue par Nippon
Gene Co., Ltd., Japon) dans 50 t d'un tampon contenant
Tris-HCl 50 mM (pH 7,4), MgC12 10 mM, dithiothréitol 10 mM, spermidine 1 mM, ATP 1 mM et 0,1 mg/m de BSA (albumine de sérum bovin) (fabriquée et vendue par Bethesda Research
Laboratories , EUA) à 15 C pendant une nuit.

(3) Isolement du plasmide pAG14
(Curage du plasmide)
Une boucle de Corynebacterium melassecola 22243
(FERM BP-560) a été inoculée dans 5 mi d'un milieu LG
(milieu préparé en dissolvant 10 g de Trypton, 5g d'extrait de levure, 5 g de NaC1 et 2 g de glucose, dans de l'eau échangée en ions et distillée de façon que le volume total soit de 1 litre, et en ajustant la valeur du pH du mélange à 7,2) et mise en culture à 37 C pendant une nuit tout en agitant. La culture ainsi obtenue a été diluée avec une eau stérilisée. La culture diluée a alors été étendue sur un milieu d'agar LG (milieu préparé en ajoutant de l'agar au milieu LB de manière que la concentration en agar du milieu résultant soit de 1,5% en poids), avec ensuite mise en culture à 320C pendant 2 jours pour former des colonies.

100 colonies ainsi formées ont été transférées, par réplique-placage, sur une plaque d'agar LG contenant 10 ug/me de tétracycline, avec ensuite mise en culture à 320C pendant 2 jours. Alors, on a choisi deux cellules sensibles à la tétracycline. Pour les deux cellules ainsi choisies, l'existence du plasmide pAG1 dans les cellules a été déterminée par la méthode d'isolement du plasmide décrite précédemment. Par suite, on a trouvé que les deux cellules ne contenaient pas de plasmide , c'est-à-dire que les cellules étaient une souche curée de plasmide.

L'une des cellules a été utilisée comme hôte à l'étape suivante.

(Transformation)
La cellule curée de plasmide préparée à l'étape ci-dessus a été mise en culture dans le milieu semisynthétique mentionné ci-dessus à 32OC pendant 12 heures tout en secouant. On a inoculé 0,5 mt de la culture ainsi obtenue dans 50 m du même milieu semi-synthétique et mis en culture à 320C tout en secouant. La densité optique (DO) de la culture à 660 nm a été surveillée en utilisant un spectrophotomètre modèle 228 (fabriqué et vendu par Hitachi, Ltd., Japon). Au moment où la valeur de
OD est devenue de 0,2, de la pénicilline G a été ajoutée à la culture de manière que la concentration en pénicilline soit de 0,3 unité/mt . La culture résultante a été incubée à 32 C pendant 1,5 heures. De la culture ainsi obtenue, des cellules ont été recueillies et mises en suspension dans 5 m4 d'un milieu R Milieu préparé en dissolvant 5 g de glucose, 10 g d'acide casamino, 10 g d'extrait de levure, 0,35 g de K2HPû4 , 0,15 g de KH2P04, 137 g de saccharose, 5,73 g d'acide N-tris-(hydroxyméthyl)méthyl- 2-aminoéthanesulfonique (appelé ci-après "TES"), 0,95 g de MgC12 et 1,11 g de CaC12 dans de l'eau dont les ions étaient échangés et distillée de manière que le volume total soit de 1 litre, et en ajustant à pH -7,2 avec NaOH pour obtenir une suspension de cellules.A 4,5 m l de la suspension de cellules, on a ajouté 0,5 mi du milieu R contenant 3 mg/mf de lysozyme (stérilisé en utilisant un filtre Millipore) avec ensuite incubation à 35 C pendant 5 heures pour ainsi former des protoplastes. La culture résultante a été soumise à centrifugation à 7.000 t/mn (4.500 g) à SOC pendant 7 minutes pour obtenir les protoplastes. Les protoplastes ainsi obtenus ont été mis en suspension dans 5 mt du milieu R. La suspension des protoplastes a été soumise à centrifugation dans les mêmes conditions que celles mentionnées ci-dessus pour obtenir des protoplastes. Les protoplastes ont été mis en suspension dans 5 me du milieu R pour obtenir un suspension de protoplastes.

A 0,5 mi de la suspension de protoplastes, on a ajouté un mélange de 50 8 du mélange réactionnel de ligase obtenu à la sous-étape (2) de l'étape 1 de l'Exemple 4 et 50 r2 d'une solution 2 x TSMC (TSMC est une solution aqueuse contenant TES 25 mM, saccharose 0,4 M, MgCl2 10 mM et CaCl2 30 mM et ajustée à pH 7,2 en utilisant
NaOH). Alors, au mélange résultant, on a doucement ajouté 1,5 mi d'une solution de PEG Solution préparée en dissolvant un polyéthylène glycol ayant un poids moléculaire de 6000 dans la solution TSMC, jusqu'à une concentration finale de 40% (poids/volume) 3 , et on a laissé reposer à température ambiante pendant 2 minutes.Alors, au mélange, on a ajouté 5 ml d'une solution R-PVP t solution préparée en dissolvant de la polyvinyl pyrrolidone (appelée ci-après "PVP" ) dans le milieu R à une concentration de 40 g/Q 1 avec ensuite centrifugation à 4.000 t/mn (1.800 g) à température ambiante pendant 10 minutes pour former un produit surnageant et des précipités. Le produit surnageant a été enlevé. Aux précipités,on a ajouté 5 mt de la solution R-PVP, avec ensuite centrifugation dans les mêmes conditions que celles mentionnées ci-dessus pour obtenir des protoplastes comme précipités. Les protoplastes ainsi obtenus ont été doucement mis en suspension dans 0,5 me de la solution R-PVP.La suspension a été incubée à 30 C pendant 3 heures et diluée avec la solution R-PVP pour obtenir une suspension diluée. La suspension diluée a été inoculée dans un milieu régénérant contenant 10 yg/mt de tétracycline. Le milieu régénérant était un milieu d'agar en couche double comprenant une couche inférieure du milieu d'agar obtenue en ajoutant PVP et de l'agar à des concentrations respectives de 40 9/t et 15 g/ au milieu R et, superposée sur la couche inférieure, une couche supérieure du milieu d'agar obtenue en ajoutant
PVP et de l'agar aux concentrations respectives de 40 g/4 et 6 g/e au milieu R, et l'inoculation de la suspension diluée ci-dessus mentionnée a été effectuée par son mélange avec 3 me de la couche supérieure fondue du milieu d'agar avant de former la couche double du milieu d'agar.

Le milieu régénérant résultant a été incubé à 32OC pendant 4 jours pour former des souches résistantes à la tétracycline.

Des souches résistantes à la tétracycline ainsi formées, on a choisi au hasard 10 souches et on les a fait croître sous une forme biologiquement pure sur le milieu d'agar LG contenant 10 ,ug/mt de tétracycline.

De chacune des souches, un plasmide a été isolé sensiblement de la même manière qutà la sous-étape (7) de l'étape 1 de l'Exemple 4. Les sites de restriction et la longueur moléculaire du plasmide ainsi isolé ont été déterminés en utilisant 0,5 ug du plasmide et les enzymes de restriction EcoRI, HindIII, PstI, BamHI, BglII (fabriqués et vendus par Nippon Gene Co., Ltd., Japon) et XbaI, sensiblement de la meme manière qu'à l'étape 6 de l'Exemple 1 pour ainsi obtenir un plasmide pAG14.

En utilisant l'ADN du plasmide ainsi obtenu, on a transformé des cellules de la souche curée de plasmide de
Corynebacterium melassecola 22243 (déposé au Fermentation
Research Institute sous le numéro d'accession FERMBP-560), sensiblement de la même manière qu'on l'a mentionné cidessus pour obtenir un transformant résistant à la tétracycline. Du transformant ainsi obtenu, on a séparé un plasmide avec ensuite analyse sensiblement de la même manière qu'on l'a mentionné ci-dessus. Par suite, on a trouvé que le plasmide séparé avait la même carte de clivage par endonucléase de restriction que celle du plasmide pAG14.

(4) Isolement,du plasmide pAG14, d'un fragment d'ADN
contenant un gène pour la résistance à la
tétracycline
A 20 p9 du plasmide pAG14 obtenu à la sous-étape (3) de l'étape 1 de l'Exemple 4, on a ajouté 100 unités de chacune des enzymes de restriction BamHI et BglII. On a laissé le mélange résultant réagir dans 100 mi d'un tampon contenant Tris-HC1 10 mM (pH 7,4), MgSO4 10 mM, NaCl 50 mM et dithiothréitol 1 mM à une température de 37 C pendant 2 heures. Le plasmide digéré a été soumis à une électrophorèse sensiblement de la même manière qu'à l'étape 7 de l'Exemple 1. Le gel agarose a été teinté de bromure d'éthidium et exposé à une irradiation à une lumière ultraviolette de manière à observer, visuellement, un fragment d'ADN contenant un gène pour la résistance à la tétracycline et ayant une longueur moléculaire d'environ 3,1 kb. Une partie du gel où l'on avait trouvé un tel fragment d'ADN a été découpée. Le gel découpé a été soumis à l'extraction du fragment d'ADN sensiblement de la même manière qu'à l'retape 7 de l'Exemple 1 pour obtenir un fragment d'ADN contenant un gène pour la résistance à la tétracycline et ayant une longueur moléculaire d'environ 3,1 kb.

(5) Préparation du plasmide pAG3 et son traitement
par l'enzyme de restriction BamHI
On a ajouté 20 unités de l'enzyme de restriction
BamHI à 4 pg de l'ADN du plasmide pAG3 obtenu de
Corynebacterium melassecola 22220 (déposé au Fermentation
Research Institute sous le numéro d'accession FERM BP-559) et on a purifié sensiblement de la même manière qu'à la sous-étape (1) de l'étape 1 de l'Exemple 4. On a laissé le mélange résultant réagir dans 100 m e d'un tampon contenant Tris-HCl 10 mM (pH 7,4), MgS04 10 mM, NaCl 50 mM et dithiothréitol lmM à une température de 37 C pendant 2 heures. Alors, on a ajouté, au mélange, un volume égal d'un mélange à 1:1 (volume/volume) de phénol et de chloroforme et on a soumis à agitation avec ensuite récupération d'une phase aqueuse.A la phase aqueuse, on a ajouté un volume égal de chloroforme et on a soumis à agitation, avec ensuite récupération d'une phase aqueuse.

A la phase aqueuse, on a ajouté de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 300 mM puis un volume double d'éthanol. Alors, le mélange a été maintenu au repos à 300C pendant 3 heures et soumis à centrifugation à 12.000 t/mn (8.900 g) à température ambiante pendant 10 minutes pour obtenir une boulette d'ADN. La boulette ainsi obtenue d'ADN a été séchée sous pression réduite.

(6) Isolement du plasmide pAG50
On a fait réagir la totalité de la quantité de chacun des ADN obtenus aux sous-étapes (4) et (5) de l'étape 1 de l'Exemple 4 avec 3 unités d'ADN ligase T4 phagique dans 50 t d'un tampon contenant Tris-HCl 50 mM (pH 7,4), MgCl2 10 mM, dithiothréitol 10 mM , spermidine 1 mM, ATP 1 mM et 0,1 mg/m de BSA à une température de 150C pendant une nuit. La température a été élevée à 700C et maintenue à 70 C pendant 10 minutes pour terminer la réaction.

En utilisant 50du mélange réactionnel de ligase, on a obtenu un transformant résistant à la tétracycline de Corynebacterium melassecola 801 (FERM BP-558) selon la même technique de transformation que celle employée à la sous-étape (3) de l'étape 1 de l'Exemple 4, à l'exception que l'incubation dans le milieu régénérant a été entreprise pendant 7 jours. On a ainsi obtenu un transformant résistant à la tétracycline. Un plasmide retenu dans le transformant résistant à la tétracycline obtenu ci-dessus a été séparé du transformant sensiblement de la même manière qu'à la sous-étape (1) de l'étape 1 de l'Exemple 4.Alors, le plasmide ainsi obtenu a été soumis à une analyse en utilisant les enzymes de restriction
EcoRI, HindîlI , PstI, BamHI, SalI et XbaI sensiblement de la même manière qu'à l'étape 6 de l'Exemple 1. Le plasmide ainsi obtenu a été désigné par pAG5O.

Des cellules de Corynebacterium melassecola 801 (FERM BP-558) ont été transformées sensiblement de la même manière qu'on l'a mentionné ci-dessus, en utilisant le plasmide obtenu ci-dessus pour obtenir un transformant résistant à la tétracycline . Le transformant retenant le plasmide pAG50 a été désigné par Corynebacterium melassecola 801 (pAG5O). Du transformant, on a isolé un plasmide sensiblement de la même manière qu'à la sousétape (1) de l'étape 1 de l'Exemple 4, avec ensuite analyse en utilisant des enzymes de restriction sensiblement de la même manière qu'à l'étape 6 de l'Exemple 1.

La carte de clivage par endonucléase de restriction du plasmide retenu dans le transformant s'est révélée être la même que celle du plasmide pAG50.

Etape 2 (Insertion d'un fragment d'ADN contenant
un gène codant pour CS dans le plasmide pAG50)
A 5 9 de l'ADN du plasmide pAG50 préparé à la sous-étape (6) de l'étape 1 de l'Exemple 2, on a ajouté 15 unités de l'enzyme de restriction XbaI. On a laissé le mélange résultant réagir dans 60 pt d'un tampon contenant
Tris-HCl 50 mM (pH 7,4), MgSO4 10 mM et NaC1 100 mM à 37 C pendant 2 heures. Alors, la température a été élevée à 700C et maintenue à 700C pendant 10 minutes pour terminer la réaction. Au mélange, on a ajouté de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 300 mM puis un volume double d'éthanol.On a laissé le mélange résultant reposer à -3û C pendant 3 heures et on l'a soumis à centrifugation à 12.000 t/mn (8.900 g) à température ambiante pendant 10 minutes pour obtenir une boulette d'ADN. La boulette ainsi obtenue a été séchée sous pression réduite. Alors, la boulette a été dissoute dans 200 yg d'un tampon BAPT contenant Tris-HCl 50 mM (pH 8,4). A la solution résultante, on a ajouté 1 unité de phosphatase alcaline bactérienne (fabriquée et vendue par Takara Shuzo Co., Ltd., Japon).

On a laissé le mélange résultant réagir à 65 C pendant 30 minutes. Alors, on a ajouté, de plus, 1 unité de la phosphatase alcaline bactérienne, dans le mélange réactionnel. On a laissé le mélange résultant réagir à 65 C pendant 3 heures. Au mélange réactionnel ainsi obtenu, on a ajouté un volume égal de phénol saturé du tampon TNE et on a soumis à agitation. Alors, le mélange a été soumis à centrifugation à 12.000 t/mn (8.900 g) à température ambiante pendant 10 minutes avec ensuite récupération d'une phase aqueuse. A la phase aqueuse, on a ajouté un volume égal de phénol saturé du tampon TNE et on a soumis à agitation. Le mélange a été soumis à centrifugation dans les mêmes conditions que celles mentionnées ci-dessus pour obtenir une phase aqueuse. A la phase aqueuse, on a ajouté un volume égal d'un mélange à 1:1 (volume/volume) de phénol et de chloroforme et le mélange résultant a été soumis à agitation et à centrifugation à 12.000 t/mn (8.900 g) à température ambiante pendant 10 minutes avec ensuite récupération d'une phase aqueuse. A la phase aqueuse, on a ajouté un volume égal de chloroforme et le mélange résultant a été soumis à agitation et à centrifugation à 12.000 t/mn (8.900 g) à température ambiante pendant 10 minutes avec ensuite récupération d'une phase aqueuse. A la phase aqueuse, on a ajouté de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 300 mM puis un volume double d'éthanol, et on l'a soumise à agitati-on.

Alors, on a laissé le mélange reposer à -300C pendant 3 heures et on l'a soumis à centrifugation à 12.000 t/mn (8.900 g) à température ambiante pendant 10 minutes pour obtenir une boulette d'ADN. La boulette ainsi obtenue d'ADN a été séchée sous pression réduite.

On a fait réagir la totalité de la quantité de 1'ADN ainsi obtenu et 1 yg des fragments d'ADN contenant un gène codantpour CSque l'on avait préparés à étape 7 de l'Exemple 1, avec 3 unités d'ADN ligase T4 phagique (fabriquée et vendue par Nippon Gene Co. Ltd., Japon) dans 50d'un tampon contenant Tris-HC1 50 mM (pH 7,4), MgCl2 10 mM, dithiothréitol 10 mM, spermidine 1 mM, ATP 1 mM et 0,1 mg/mt de BSA (fabriquée et vendue par Bethesda Research Laboratories, EUA) à une température de 15 C pendant une nuit.

La température a été élevée à 70 C et maintenue à cette valeur pendant 10 minutes pour terminer la réaction.

Etape 3 (Isolement d'un plasmide hybride pAG4001
contenant un gène codant pour CS)
En utilisant l'ADN recombinant préparé à l'étape 2 de l'Exemple 4, on a transformé Corynebacterium melassecola 801 (FERM BP-558), sensiblement de la même manière qu'à la sous-étape (3) de l'étape 1 de l'Exemple 4 à l'exception que le milieu régénérant a été incubé pendant 7 jours.

On a fait croitre les cellules résistantes à la tétracycline ainsi formées sous une forme biologiquement pure sur le milieu d'agar LG (milieu préparé en ajoutant 5 gt de glucose au milieu d'agar L) contenant 10 lug/m de tétracycline. De chacune des cellules, on a isolé un plasmide sensiblement de la même manière qu'à la sousétape (1) de l'étape 1 de l'Exemple 4, avec ensuite analyse en utilisant les enzymes de restriction EcoRI, HindIII,
PstI, BamHI, SalI et XbaI sensiblement de la même manière qu'à l'étape 6 de l'Exemple 1. Le plasmide ainsi obtenu a été désigné par pAG4001. La carte de clivage par endonucléase de restriction du plasmide pAG4ûO1 est montrée à la figure 10.Comme cela est apparent sur la figure 10, le plasmide pAG4ûO1 est un plasmide hybride comprenant le plasmide pAG50 et, inséré au site scindé par l'enzyme de restriction XbaI, un fragment étranger de XbaI, dérivé d'une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique, contenant un gène codant pour CS et ayant une longueur moléculaire d'environ 4,9 kb. Le transformant retenant le plasmide pAG4001 a été désigné par Corynebacterium melassecola 801 (pAG4001).

Etape 4 (Mesure de l'activité de CS d'un
transformant retenant le plasmide pAG4ûO1)
La cellule de Corynebacterium melassecola 801 (pAG4001) a été mise en culture à 320C pendant une nuit tout en secouant dans 50 mQ du milieu de mélasse ci-dessus mentionné contenant 10 ug/m de tétracycline. En même temps, les cellules de Corynebacterium melassecola 801 (pAGSO) ont été séparément mises en culture dans les mêmes conditions que celles ci-dessus mentionnées. De même, la cellule de Corynebacterium melassecola 801 ne retenant pas le plasmide pAG4001 a été séparément mise en culture sensiblement dans les mêmes conditions que celles ci-dessus ment-ionnées, à l'exception que le milieu de mélasse ne contenait pas de tétracycline.Séparément de chaque culture ainsi obtenue, on a recueilli des cellules, on les a lavées deux fois avec 20 mt d'une solution aqueuse à 0,8% de NaCl et on les a mises en suspension dans 10 me du tampon MES comme on l'a mentionné ci-dessus. La suspension a été homogénéisée en utilisant un homogénéiseur de cellules (homogénéiseur de cellules MSK modèle 853021 fabriqué et vendu par Braun Inc., Allemagne de l'Ouest) avec ensuite centrifugation à 14.000 t/mn (20.000 g) à 4 C pendant 20 minutes pour obtenir un extrait de cellules (solution d'enzymes brutes).

En utilisant l'extrait de cellules ainsi obtenu, on a mesuré l'activité de CS sensiblement de la même manière qu'à l'étape 5 de l'Exemple 1. Les résultats sont montrés au Tableau 4 donné à l'étape 6 que l'on mentionnera ciaprès. Comme cella est apparent au Tableau 4, Corynebacterium melassecola 801 (pAG4001) retenant le plasmide pAG4001 a présenté une forte activité de CS en comparaison à
Corynebacterium melassecola 801 (pAG5O) retenant le plasmide pAG50 ou Corynebacterium melassecola 801 ne retenant pas de plasmide.

Etape 5 (Délétion partielle d'un fragment d'ADN
contenant un gène codant pour CS et ayant une
longueur moléculaire d'environ 4,9 kb)
On a fait réagir 5 ug de l'ADN du plasmide pAG4001 préparé à l'étape 3 de l'Exemple 4 avec 15 unités d'une enzyme de restriction BamHI dans 50 yt d'un tampon contenant Tris-HCI 10 mM (pH 7,4), MgSO4 10 mM, NaC1 50 mM et dithiothréitol 1 mM à une température de 37 C pendant 2 heures. Au mélange réactionnel,on a ajouté un volume égal d'un mélange à 1:1 (volume/volume) de phénol et de chloroforme et on a soumis à agitation avec ensuite récupération d'une phase aqueuse.A la phase aqueuse, on a ajouté un volume égal de chloroforme et on a soumis à agitation,avec ensuite récupération d'une phase aqueuse.

A la phase aqueuse a ajouté de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 300 mM puis un volume double d'éthanol et on a laissé reposer à -30 5 pendant 3 heures. Ensuite, le mélange a été soumis à centrifugation à 12.000 t/mn (8.900 g) à température ambiante pendant 10 minutes pour obtenir une boulette d'ADN. L'ADN ainsi obtenu a été séché sous pression réduite pour obtenir l'échantillon A d'ADN.

A 5 9 de 1'ADN du plasmide pAG50 préparé à la sous-étape (6) de l'étape 1 de l'Exemple 4, on a ajouté 15 unités d'une enzyme de restriction BamHI. On a laissé le mélange résultant réagir dans 50 ,ut d'un tampon contenant Tris-HCl 10 mM (pH 7,4), MgS04 10 mM, NaCl 50 mM et dithiothréitol 1 mM à une température de 37 C pendant 2 heures. Ensuite, le mélange réactionnel a été soumis à des traitements en succession avec de la phosphatase alcaline bactérienne et un mélange de phénol et de chloroforme puis a été soumis à une précipitation dans l'éthanol sensiblement de la même manière qu'à l'étape 2 de l'Exemple 4 pour obtenir l'échantillon B d'ADN.

On a fait réagir la totalité de la quantité du mélange des échantillons A et B d'ADN avec 3 unités d'ADN ligase T4 phagique dans 50 -2 d'un tampon contenant Tris-HCl 50 mM (pH 7,4), MgC12 10 mM, dithiothréitol 10 mM, spermidine 1 mM , ATP 1 cM et 0,1 mg/mt de BSA (albumine de sérum bovin) à une température de 150C pendant une nuit. La température a été élevée à 70 C et maintenu à cette valeur pendant 10 minutes pour terminer la réaction.

En utilisant le mélange réactionnel de ligase obtenu ci-dessus, des cellules de Corynebacterium melassecola 801 (FERM BP-558) ont été transformées sensiblement de la même manière qu'à l'étape 3 de l'Exemple 4 pour obtenir des transformants résistants à la tétracycline.

On a fait croître les transformants résistants à la tétracycline ainsi formés sous une forme biologiquement pure sur un milieu d'agar LG contenant 10 jug/mi de tétracycline.

Un plasmide a été isolé de chacun des transformants sensiblement de la même manière qu'à la sous-étape (1) de l'étape 1 de l'Exemple 4, avec ensuite analyse en utilisant les enzymes de restriction EcoRI, Hindîli, PstI, BamHI,
SalI et XbaI sensiblement de la même manière qu'à l'étape 6 de l'Exemple 1. On a ainsi obtenu un plasmide.

Le plasmide obtenu a été désigné par pAG4002. La carte de clivage par endonucléase de restriction du plasmide pAG4002 est montrée à la figure 11. Comme cela est apparent sur la figure 11, le plasmide pAG40û2 est un plasmide hybride comprenant le plasmide pAG50 et, inséré au site scindé par une enzyme de restriction BamHI, un fragment étranger de BamHI ayant une longueur moléculaire d'environ 3,2 kb qui correspond à un fragment partiel contenu dans un fragment d'ADN, dérivé d'une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique , contenant un gène codant pour CS et ayant une longueur moléculaire d'environ 4,9 kb. Le transformant retenant le plasmide pAG4002 a été désigné par Corynebacterium melassecola 801 (pAG4002).

L'activité de CS de Corynebacterium melassecola 801 (pAG4OO2) a été déterminée sensiblement de la même manière qu'à l'étape 4 de l'Exemple 4. Le résultat est montré au
Tableau 4 donné à l'étape 6 que l'on mentionnera ci-après.

Comme cela est apparent du Tableau 4, les cellules retenant le plasmide pAG4002 avaient une forte activité spécifique de CS.

Etape 6 (Délétion partielle d'un fragment d'ADN
contenant un gène codant pour CS et ayant une
longueur moléculaire d'environ 3,2 kb)
On a fait réagir 5 pg de l'ADN du plasmide pAG4002 préparé à l'étape 5 de l'Exemple 4 avec 20 unités d'une enzyme de restriction SalI dans 50 Sui d'un tampon contenant Tris-HCl 50 mM (pH 7,4), MgSO4 10 mM et NaC1 100 mM à une température de 37 C pendant 2 heures. Au mélange réactionnel , on a ajouté un volume égal d'un mélange à 1:1 (volume/volume) de phénol et de chloroforme, et on a soumis à agitation avec ensuite récupération d'une phase aqueuse.A la phase,aqueuse on a ajouté un volume égal de chloroforme et on a soumis à agitation, avec ensuite récupération d'une phase aqueuse. A la phase aqueuse, on a ajouté de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 300 mM puis un volume double d'éthanol et on a laissé reposer à -30 C pendant 3 heures. Ensuite, le mélange a été soumis à centrifugation à 12.000 t/mn (8.900 g) à température ambiante pendant 10 minutes pour obtenir une boulette d'ADN. L'ADN ainsi obtenu a été séché sous pression réduite.On a fait réagir la totalité de la quantité de l'ADN séché avec 3 unités d'ADN ligase T4 phagique dans 50 sut d'un tampon contenant Tris-HCl 50 mM (pH 7,4), MgCl2 10 mM, dithiothréitol 10 mM, spermidine lmM,
ATP 1 mM et 0,1 mgSmt de BSA (albumine de sérum bovin) à une température de 15 C pendant une nuit . La température a été élevée à 700C et maintenue à cette valeur pendant 10 minutes pour terminer la réaction.

En utilisant le mélange réactionnel de ligase obtenu ci-dessus, on a transformé des cellules de
Corynebacterium melassecola 801 (FERM BP-558) sensiblement de la même manière qu'à l'étape 3 de l'Exemple 4 pour obtenir des transformants résistants à la tétracycline.

On a fait croître les transformants résistants à la tétracycline ainsi formés sous une forme biologiquement pure sur un milieu d'agar LG contenant 10 Mg/me de tétracycline.

Un plasmide a été isolé de chacun des transformants sensiblement de la même manière qu'à la sous-étape (1) de l'étape 1 de l'Exemple 4 avec ensuite analyse en utilisant les enzymes de restriction EcoRI, HindIII, PstI, BamHI,
SalI et XbaI sensiblement de la même manière qu'à l'étape 6 de l'Exemple 1. On a ainsi obtenu un plasmide.

Le plasmide obtenu a été désigné par pAG4003. La carte de clivage par endonucléase de restriction du plasmide pAG4003 est montrée à la figure 12. Comme cela est apparent sur la figure 12, le plasmide pAG4003 a une structure telle qu'un fragment SalI ayant une longueur moléculaire d'environ 0,7 kb a été éliminé du plasmide pAG4002. Le transformant retenant le plasmide pAG4003 a été désigné par Corynebacterium melassecola 801 (pAG4003).

L'activité de CS de Corynebacterium melassecola 801 (pAG 4003) a été déterminée sensiblement de la même manière qu'à l'étape 4 de l'Exemple 4. Le résultat est montré au Tableau 4 donné ci-dessous ainsi que les données obtenues aux étapes 4 et 5 de l'Exemple 4, en comparaison avec les données concernant les cellules retenant le plasmide pAG50 et les cellules ne retenant pas de plasmide.

Tableau 4

<tb> Souche <SEP> Activité <SEP> spécifique <SEP> de <SEP> CS <SEP> *1)
<tb> 801 <SEP> *2) <SEP> 0,50
<tb> 801 <SEP> (pAG5O) <SEP> 0,52
<tb> 801 <SEP> (pAG4001) <SEP> 2,06
<tb> 801 <SEP> (pAG4002) <SEP> 2,07
<tb> 801 <SEP> (pAG4003) <SEP> 2,10
<tb>
Notes: *1) comme mentionné à la Note *1) du Tableau 1
*2) Corynebacterium melassecola 801 déposé au
Fermentation Research Institute sous le
numéro d'accession FERM BP-558.

Comme cela est apparent du Tableau 4, les cellules retenant le plasmide pAG4001, les cellules retenant le plasmide pAG4002 et les cellules retenant le plasmide pAG4003 avaient une forte activité spécifique de CS en comparaison aux cellules retenant le plasmide pAG50 et aux cellules ne retenant pas de plasmide.

Etape 7 (Isolement d'un fragment BamHI contenant
un gène codant pour CS et ayant une longueur
moléculaire d'environ 3,2 kb)
A 10 ug de 1'ADN du plasmide pAG4002 obtenu à l'étape 5 de l'Exemple 4, on a ajouté 30 unités d'une enzyme de restriction BamHI. On a laissé le mélange resultant réagir dans 100 lut d'un tampon contenant Tris-HCl 10 mM (pH 7,4), MUS04 10 mM, NaCl 50 mM et dithiothréitol 1 mM à une température de 37 C pendant 2 heures. Le plasmide digéré a été soumis à une électrophorèse sur gel agarose sensiblement de la même manière qu'à l'étape-7 de l'Exemple 1.Le gel agarose a été teinté de bromure d'éthidium et exposé à une irradiation de lumière ultraviolette de manière à observer visuellement un fragment d'ADN contenant un gène codant pour CS et ayant une longueur moléculaire d'environ 3,2 kb. Une portion du gel où l'on a trouvé un tel fragment d'ADN a été découpée.

Du gel découpé, on a isolé environ 1 jjg d'un fragment
BamHI contenant un gène codant pour CS et ayant une longueur moléculaire d'environ 3,2 kb, sensiblement de la même manière qu'à l'étape 7 de l'Exemple 1.

Etape 8 (Isolement d'un fragment BamHI-SalI
contenant un gène codant pour CS et ayant une
longueur moléculaire d'environ 3,2 kb)
A 20 tjg de l'ADN du plasmide pAG4003 obtenu à l'étape 6 de l'Exemple 4, on a ajouté 60 unités d'une enzyme de restriction BamHI. On a laissé le mélange résultant réagir dans 100 t d'un tampon contenant Tris-HCl 10 mM (pH 7,4), MES 10 mM, NaCl 50 mM et dithiothréitol 1 mM à une température de 37 C pendant 2 heures.Au mélange réactionnel, on a ajouté de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 300 mM puis un volume double d'éthanol, on a soumis à agitation et on a laissé reposer à -300C pendant 3 heures Ensuite, le mélange a été soumis à centrifugation à 10.000 t/mn (9.000 g) à température ambiante pendant 10 minutes pour obtenir une boulette d'ADN. Alors, 1'ADN ainsi obtenu a été séché sous pression réduite. A 1'ADN séché on a ajouté 60 unités d'une enzyme de restriction SalI. On a laissé le mélange résultant réagir dans 100 t d'un tampon contenant Tris-HCl 50 mM (pH 7,4), MgS04 10 mM et NaC1 100 mM à une température de 37 C pendant 2 heures.

Le plasmide digéré a été soumis à une électrophorèse sur gel agarose sensiblement de la même manière qu'à l'étape 7 de l'Exemple 1. Le gel agarose a été teinté de bromure d'éthidium et exposé à une lumière ultraviolette de manière à observer visuellement un fragment d'ADN contenant un gène codant pour CS et ayant une longueur moléculaire d'environ 3,2 kb. Une portion du gel où l'on a trouvé un tel fragment d'ADN a été découpée . Du gel découpé, on a isolé environ 1 yg d'un fragment BamHI-SalI contenant un gène codant pour CS et ayant une longueur moléculaire d'environ 3,2 kb, sensiblement de la même manière qu'à l'étape 7 de l'Exemple 1.

EXEMPLE 5
Dans cet exemple, un fragment d'ADN, dérivé d'une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique, contenant un gène codant pour AH (aconitate hydratase) a été inséré dans un vecteur dérivé de la bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique pour préparer un ADN recombinant pour produire AH. Un transformant capable de former AH en une grande quantité a alors été préparé en utilisant l'ADN recombinant. Le fragment XbaI obtenu à l'étape 8 de l'Exemple 2, c'est-à-dire un fragment XbaI contenant un gène codant pour AH et ayant une longueur moléculaire d'environ 4,7 kb, a été utilisé comme fragment d'ADN, dérivé d'une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique, contenant un gène codant pour AH. Un plasmide pAG50 a été utilisé comme vecteur dérivé d'une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique.

Etape 1 (Insertion d'un fragment d'ADN contenant
un gène codant pour AH dans un plasmide pAG5O)
A 5 yg de l'ADN du plasmide pAG50 préparé à la sous-étape (6) de l'étape 1 de l'Exemple 4, on a ajouté 15 unités de l'enzyme de restriction XbaI. On a laissé le mélange résultant réagir dans 60 Jui d'un tampon contenant Tris-HCl 50 mM (pH 7,4), MgS04 10 mM et NaC1 100 mM à 37 C pendant 2 heures. La température a alors été élevée à 700C et maintenue à cette valeur pendant 10 minutes pour terminer la réaction. Au mélange,on a ajouté de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 300 mM, puis un volume double d'éthanol. On a laissé le mélange résultant reposer à -30 C pendant 3 heures puis on l'a soumis à centrifugation à 12.000 t/mn (8.900 g) à température ambiante pendant 10 minutes pour obtenir une boulette d'ADN.

La boulette ainsi obtenue a été séchée sous pression réduite. La boulette séchée a été soumise à des traitements avecdelaphosphatase alcaline bactérienne et un mélange à 1:1 (volume/volume) de phénol et de chloroforme et précipitation dans l'éthanol sensiblement de la même manière qu'à l'étape 2 de l'Exemple 4 pour obtenir une boulette d'ADN. La boulette ainsi obtenue a été séchée sous pression réduite.

On a fait réagir la totalité de l'ADN ainsi obtenu et 1 9 du fragment d'ADN contenant un gène codant pour AH, préparé à l'étape 8 de l'Exemple 2, avec 3 unités d'ADN ligase T4 phagique (fabriquée et vendue par Nippon Gene Co.,
Ltd., Japon) dans 50 pt d'un tampon contenant Tris-HCl 50 mM (pH 7,4), égal2 10 mM, dithiothréitol 10 mM, spermidine 1 mM, ATP 1 mM et 0,1 mg/me de BSA (fabriquée et vendue par Bethesda Research Laboratories , EUA) à une température de 15 C pendant une nuit. La température a été élevée à 700C et maintenue à cette valeur pendant 10 minutes pour terminer la réaction.

Etape 2 (Isolement d'un plasmide hybride pAG5001
contenant un gène codant pour AH)
En utilisant l'ADN recombinant préparé à l'étape 1 de l'Exemple 5, Corynebacterium melassecola 801 (FERM
BP-558) a été transformé sensiblement de la même manière qu'à l'étape 3 de l'Exemple 4 pour obtenir des transformants résistants à la tétracycline.

On a fait croître les transformants résistants à la tétracycline ainsi obtenus sous une forme biologiquement pure sur un milieu d'agar LG (milieu obtenu en ajoutant 5 9/2 de glucose à un milieu d'agar L),contenant 10 gug/mt de tétracycline . De chacun des transformants, on a isolé un plasmide sensiblement de la même manière qu'à la sousétape (1) de l'étape 1 de l'Exemple 4, avec ensuite analyse sensiblement de la même manière qu'à l'étape 7 de l'Exemple 2. Le plasmide ainsi obtenu a été désigné par pAG5001.

La carte de clivage par endonucléase de restriction du plasmide pAG5001 est montrée à la figure 13. Comme cela est apparent sur le figure 13, le plasmide pAG5001 est un plasmide hybride comprenant le plasmide pAG50 et, inséré au site scindé par l'enzyme de restriction XbaI, un fragment étranger de XbaI, dérivé d'une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique, contenant un gène codant pour AH et ayant une longueur moléculaire d'environ 4,7 kb.

Le transformant retenant le plasmide pAG5001 a été désigné par Corynebacterium melassecola 801 (pAG5001).

Etape 4 (Mesure de l'activité de AH d'un
transformant retenant le plasmide pAG5001)
Les cellules de Corynebacterium melassecola 801 (pAG50ûl) ont été mises en culture à 32 C pendant une nuit tout en secouant dans 50 m du milieu de mélasse ci-dessus mentionné contenant 10 lug/me de tétracycline.

Séparément, on a mis en culture, sensiblement de la même manière qu'à l'étape 4 de l'Exemple 4, Corynebacterium melassecola 801 (pAG5O) et Corynebacterium melassecola 801 ne retenant pas de plasmide.

Les cellules ont été recueillies séparément de chaque culture ainsi obtenue, lavées deux fois avec 20 mt d'une solution aqueuse à 0,8% de NaC1 et mises en suspension dans 10 mt du tampon MES comme on l'a mentionné cidessus. La suspension a été homogénéisée en utilisant un homogénéiseur de cellules (homogénéiseur de cellules MSK modèle 853021 fabriqué et vendu par Braun Inc., Allemagne de l'Ouest) avec ensuite centrifugation à 14.000 t/mn (20.000 g) à 4 C pendant 20 minutes pour obtenir un extrait de cellules (solution d'enzymes brutes).

En utilisant l'extrait de cellules ainsi obtenu, on a mesuré l'activité de AH sensiblement de la même manière qu'à l'étape 6 de l'Exemple 2. Le résultat est montré au
Tableau 5 donné ci-dessous.

Comme cela est apparent sur le Tableau 5, la cellule retenant le plasmide pAG5001 a une grande activité spécifique de AH en comparaison aux cellules retenant le plasmide pAG50 et aux cellules ne retenant pas de plasmide et par conséquent, il est apparent que le fragment XbaI, contenu dans le plasmide pAG5001, ayant une longueur moléculaire d'environ 4,7 kb, contient un gène, dérivé d'une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique, codant pour AH.

Tableau 5

<tb> Souche <SEP> Activité <SEP> spécifique <SEP> de <SEP> AH <SEP> tl) <SEP>
<tb> 801 <SEP> *2) <SEP> 0,213
<tb> 801 <SEP> (pAG50) <SEP> 0,109 <SEP>
<tb> 801 <SEP> (pAG5001) <SEP> 3,95
<tb>
Notes : *1) comme mentionné à la Note *1) du Tableau 2
*2) Corynebacterium melassecola 801 déposé au
Fermentation Research Institute sous le
numéro d'accession FERM BP-558.

EXEMPLE 6
Dans cet exemple, un fragment d'ADN, dérivé d'une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique, contenant un gène codant pour ICDH (isocitrate déshydrogénase) a été inséré dans un vecteur dérivé de la bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique pour préparer un ADN recombinant pour la production de ICDH. Un transformant capable de former ICDH en une grande quantité a alors été préparé en utilisant l'ADN recombinant. Le fragment de
SalI obtenu à l'étape 11 de l'Exemple 3, c'est-à-dire un fragment de SalI contenant un gène codant pour ICDH et ayant une longueur moléculaire d'environ 3,4 kb, a été utilisé comme fragment d'ADN, dérivé d'une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique, contenant un gène codant pour AH. On a utilisé un plasmide pAG50 comme vecteur dérivé d'une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique.

Etape 1 (Insertion d'un fragment d'ADN contenant
un gène codant pour ICDH dans le plasmide pAG5O)
A 5 ug de l'ADN du plasmide pAG50 préparé à la sous-étape (6) de l'étape 1 de l'Exemple 4, on a ajouté 15 unités de l'enzyme de restriction SalI. On a laissé le mélange résultant réagir dans 60.,u-t d'un tampon contenant Tris-HCl 50 mM (pH 7,4), MgS04 10 mM et NaC1 100 mM à 37 C pendant 2 heures. Au mélange réactionnel, on a ajouté de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 300 mM puis un volume double d'éthanol.On a laissé le mélange résultant reposer à -30 C pendant 3 heures puis on l'a soumis à centrifugation à 12.000 t/mn (8.900 g) à température ambiante pendant 10 minutes pour obtenir une boulette d'ADN. La boulette ainsi obtenue a été séchée sous pression réduite . La boulette séchée a été soumise à des traitements en succession avec la phosphatase alcaline bactérienne et un mélange à 1:1 (volume/volume) de phénol et de chloroforme puis soumise à une précipitation dans l'éthanol sensiblement de la même manière qu'à l'étape 2 de l'Exemple 4 pour obtenir une boulette d'ADN. La boulette ainsi obtenue a été séchée sous pression réduite.

On a fait réagir la totalité de la quantité de l'ADN ainsi obtenu et 1 9 du fragment d'ADN contenant un gène codant pour ICDH, préparé à l'étape 11 de l'Exemple 3, avec 3 unités d'ADN ligase T4 phagique (fabriquée et vendue par
Nippon Gene Co., Ltd. Japon) dans 50 uQ d'un tampon contenant Tris-HCl 50 mM (pH 7,4), égal2 10 mM, dithiothréitol 10 mM, spermidine 1 mM, ATP 1 mM et 0,1 mg/mt de BSA (fabriquée et vendue par Bethesda Research Laboratories, EUA) à une température de 15 C pendant une nuit. La température a été élevée à 700C et maintenue à cette valeur pendant 10 minutes pour terminer la réaction.

Etape 2 (Isolement d'un plasmide hybride pAG3001
contenant un gène codant pour ICDH)
En utilisant l'ADN recombinant ainsi obtenu préparé à l'étape 1 de l'Exemple 6, Corynebacterium melassecola 801 (FERM BP-558) a été transformé sensiblement de la même manière qu'à l'étape 3 de l'Exemple 4 pour obtenir des transformants résistants à la tétracycline.

On a fait croître les transformants résistants à la tétracycline ainsi obtenus sous une forme biologiquement pure sur un milieu d'agar LG (milieu obtenu en ajoutant 5 g/-e de glucose au milieu d'agar L) contenant 10 de tétracycline. Un plasmide a été isolé de chacun des transformants , sensiblement de la même manière qu'à la sous-étape (1) de l'étape 1 de l'Exemple 4, avec ensuite analyse en utilisant les enzymes de restriction EcoRI, HindIII, PstI, BamHI, SalI et XbaI sensiblement de la même manière qu'à l'étape 6 de l'Exemple 1. Le plasmide ainsi obtenu a été désigné par pAG3001. La carte de clivage par endonucléase de restriction du plasmide pAG3001 est montrée à la figure 14.Comme cela est apparent sur la figure 14, le plasmide pAG3001 est un plasmide hybride comprenant le plasmide pAG50 et, inséré au site scindé par l'enzyme de restriction SalI, un fragment étranger de SalI, dérivé d'une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique, contenant un gène codant pour ICDH et ayant une longueur moléculaire d'environ 3,4 kb. Le transformant retenant le plasmide pAG3001 a été désigné par Corynebacterium melassecola 801 (pAG3001).

Etape 3 (Mesure de l'activité de ICDH d'un
transformant retenant le plasmide pAG3001).

Les cellules de Corynebacterium melassecola 801 (pAG3001) ont été mises en culture à 32 C pendant une nuit tout en secouant dans 50 mi d'un milieu d'acide phosphorique
LG (milieu préparé en ajoutant 2 g/ de glucose, 0,7 g/ de K2HPO4 et 0,3 g/-e de KH2P04 à un bouillon L et en ajustant le pH à 7,2) contenant 10 ,ug/mi de tétracycline.

Séparément, on a mis en culture Corynebacterium melassecola 801 (pAG5O) et Corynebacterium melassecola 801 ne retenant pas de plasmide, sensiblement de la même manière qu'à l'étape 4 de l'Exemple 4.

De chaque culture ainsi obtenue, on a séparément recueilli des cellules, que l'on a lavées deux fois avec 20 mi d'une solution aqueuse à 0,8% de NaCl et on les a mises en suspension dans 10 mt du tampon MES. La suspension a été homogénéisée en utilisant un homogénéiseur de cellules (homogénéiseur de cellules MSK modèle 853021 fabriqué et vendu par Braun Inc., Allemagne de l'Ouest), avec ensuite centrifugation à 14.000 t/mn (20.000 g) à température ambiante pendant 20 minutes pour obtenir un extrait de cellules (solution d'enzymes brutes).

En utilisant l'extrait de cellules ainsi obtenu, on a mesuré l'activité de ICDH sensiblement de la même manière qu'à l'étape 5 de l'Exemple 3. Le résultat est montré au Tableau 6 donné ci-dessous.

Comme cela est apparent par le Tableau 6, les cellules retenant le plasmide pAG3001 avaient une grande activité spécifique de ICDH en comparaison aux cellules retenant le plasmide pAGSO et aux cellules ne retenant pas de plasmide.

Tableau 6

Souche <SEP> Activité <SEP> spécifique <SEP> de <SEP> ICDH <SEP> *1)
<tb> 801 <SEP> *2) <SEP> 0,51
<tb> 801 <SEP> (pAG50) <SEP> 0,59
<tb> 801 <SEP> (pAG3001) <SEP> 3,59
<tb>
Notes : *1) comme mentionné à la Note *1) du Tableau 3
*2) Corynebacterium melassecola 801 déposé
au Fermentation Research Institute sous le
numéro d'accession FERM BP-558.

Claims (53)

REVENDICATIONS

1.- Fragment d'ADN, dérivé d'une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique, catactérisé en ce qu'il contient un gène codant pour une enzyme qui catalyse une réaction pour la synthèse de l' A-cétoglutarate à partir d'oxaloacétate et d'acétyl CoA dans le cycle TCA.

2.- Fragment d'ADN selon la revendication 1, caractérisé en ce que la bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique précitée est une bactérie appartenant au genre Corynebacterium.

3.- Fragment d'ADN selon la revendication 2, caractérisé en ce que la bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique précitée est le micro-organisme

Corynebacterium melassecola 801 déposé au Fermentation

Research Institute sous le numéro d'accession FERM SP-558.

4.- Fragment d'ADN selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'enzyme précitée est citrate synthase.

5.- FRagment d'ADN selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'enzyme précitée est aconitate hydratase.

6.- Fragment d'ADN selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'enzyme précitée est isocitrate déshydrogénase.

7.- Fragment d'ADN selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il a les sites de restriction qui suivent

un premier site BamHI, un premier site XhoI, un

site SalI, un second site BamHI, un premier site

HindIII, un second site XhoI, un site PstI et un

second site HindIII,

ledit premier site XhoI, ledit site SalI, ledit

second site BamHI, ledit premier site HindIII, ledit

second site XhoI, ledit site PstI et ledit second

site HindIII étant respectivement placés à environ

1,5 kb, environ 3,2 kb, environ 3,2 kb, environ

3,5 kb, environ 3,8 kb, environ 3,8 kb et

environ 4,6 kb dudit premier site BamHI.

8.- Fragment d'ADN selon le revendication 4, caractérisé en ce qu'il a les sites de restriction qui suivent

un site XhoI et un site SalI,

ledit site SalI étant placé à environ 1,7 kb

dudit site XhoI.

9.- Fragment d'ADN selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il a une structure telle que le fragment d'ADN de la revendication 8 est digéré par une enzyme de restriction SalI, et qui a comme site de restriction, un site XhoI.

lû.- Fragment d'ADN selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il a les sites de restriction qui suivent

un premier site PvuII, un site BglII, un premier

site PstI, un second site PstI, un site EcoRI, un

second site PvuII, un troisième site PstI, un

premier site KpnI, un site MluI, un site SalI, un

site XhoI, un second site KpnI, un quatrième site

PstI, un site SacI, un premier site HindîlI et un

second site HindîlI,

ledit site BglII, ledit premier site PstI,

ledit second site PstI, ledit site Ecorî, ledit

second site PvuII, ledit troisième site PstI,

ledit premier site KpnI, ledit site MluI, ledit

site SalI, ledit site XhoI, ledit second site KpnI,

ledit quatrième site PstI, ledit site SacI, ledit

premier site HindîlI et ledit second site HindîlI

étant respectivement placés à environ O kb mais plus

de O kb, environ 0,5 kb, environ û,7 kb, environ

0,7 kb, environ 0,9 kb, environ 1,0 kb, environ

1,0 kb, environ 1,1 kb, environ 1,6 kb, environ

2,1 kb, environ 2,5 kb, environ 3,1 kb, environ

3,1 kb, environ 4,0 kb et environ 4,4 kb dudit

premier site PvuII.

11.- Fragment d'ADN selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il a les sites de restriction qui suivent

un premier site HindlII, un premier site PstI, un

second site PstI, un second site HindIII, un site

XbaI, un troisième site HindIII, un troisième

site PstI, un premier site BamHI, un quatrième

site PstI, un cinqu-ième site PstI, un site SalI,

un sixième site PstI, un septième site PstI et un

second site BamHI,

ledit premier site PstI, ledit second site

PstI, ledit second site HindIII, ledit site XbaI1

ledit troisième site HindIII, ledit troisième site

PstI, ledit premier site BamHI, ledit quatrième

site PstI, ledit cinquième site PstI, ledit site

SalI, ledit sixième site PstI,.ledit septième site

PstI et ledit second site BamHI étant respectivement

placés à environ O kb mais plus de O kb, environ

0,2 kb, environ 0,4 kb, environ 0,4 kb, environ

1,1 kb, environ 1,1 kb, environ 1,1 kb, environ

1,7 kb, environ 2,5 kb, environ 2,6 kb, environ

3,1 kb, environ 3,6 kb et environ 3,9 kb dudit

premier site HindIII.

12.- Fragment d'ADN selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il a les sites de restriction qui suivent

un premier site HindIII, un premier site PstI,

un second site PstI, un second site HindIII, un

site XbaI, un troisième site HindIII, un troisième

site PstI, un premier site BamHI, un quatrième

site PstI et un cinquième site PstI,

ledit premier site PstI, ledit second site

PstI, ledit second site HindIII, ledit site XbaI,

ledit troisième site HindIII, ledit troisième site

PstI, ledit premier site BamHI, ledit quatrième

site PstI et ledit cinquième site PstI étant

respectivement placés à environ O kb mais plus de

O kb, environ 0,2 kb, environ 0,4 kb, environ 0,4 kb,

environ 1,1 kb, environ 1,1 kb, environ 1,1 kb,

environ 1,7 kb et environ 2,5 kb dudit premier

site HindIII.

13.- ADN recombinant caractérisé en ce qu'il comprend un premier fragment d'ADN selon la revendication 1 et un second fragment d'ADN contenant un gène pour la réplication dans une cellule d'une bactérie, ledit premier fragment d'ADN étant directement ou indirectement lié audit second fragment d'ADN.

14.- ADN recombinant selon la revendication 13, caractérisé en ce que la bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique précitée est une bactérie appartenant au genre Corynebacterium.

15.- ADN recombinant selon la revendication 14, caractérisé en ce que la bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique précitée est le micro-organisme

Corynebacterium melassecola 801 déposé au Fermentation

Research Institute sous le numéro d'accession FERM BP-558.

16.- ADN recombinant selon la revendication 13, caractérisé en ce que l'enzyme précitée est citrate synthase.

17.- ADN recombinant selon la revendication 13, caractérisé en ce que l'enzyme précitée est aconitate hydratase.

18.- ADN recombinant selon la revendication 13, caractérisé en ce que l'enzyme précitée est isocitrate déshydrogénase.

19.- ADN recombinant selon la revendication 16, caractérisé en ce que le premier fragment d'ADN précité est le fragment d'ADN selon l'une quelconque des revendications 7 à 9.

20.- ADN recombinant selon la revendication 17, caractérisé en ce que le premier fragment d'ADN précité est le fragment d'ADN selon la revendication 10.

21.- ADN recombinant selon la revendication 18, caractérisé en ce que le premier fragment d'ADN précité est le fragment d'ADN selon l'une quelconque des revendications 11 ou 12.

22.- ADN recombinant selon l'une quelconque des revendications 13 à 21, caractérisé en ce que le second fragment d'ADN précité est un fragment d'ADN contenant un vecteur utilisé dans un système hôte-vecteur où l'on utilise Escherichia coli comme hôte.

23.- ADN recombinant selon la revendication 22, caractérisé en ce que le vecteur précité est un élément choisi dans le groupe consistant en plasmide pBR325 et ses dérivés.

24.- ADN recombinant selon l'une quelconque des revendications 13 à 21, caractérisé en ce que le second fragment d'ADN précité est un fragment d'ADN contenant un vecteur utilisé dans un système hôte-vecteur où lton utilise Bacillus subtilis comme hôte.

25.- ADN recombinant selon la revendication 24, caractérisé en ce que le vecteur précité est un élément choisi dans le groupe consistant en plasmide pUBIlO et ses dérivés.

26.- ADN recombinant selon l'une quelconque des revendications 13 à 21, où le second fragment d'ADN précité est un fragment d'ADN contenant un vecteur utilisé dans un système hôte-vecteur où l'on utilise , comme hôte, une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique.

27.- ADN recombinant selon la revendication 26, caractérisé en ce que le vecteur précité est un élément choisi dans le groupe consistant en plasmide pAG1, plasmide pAG3, plamide pAG14, plasmide pAG50 et leurs dérivés.

28.- ADN recombinant selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'il a une longueur moléculaire d'environ 10,9 kb et présente une carte de clivage par endonucléase de restriction représentée à la-figure 1 et qui est appelé pAG4Oî.

29.- ADN recombinant selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'il a une longueur moléculaire d'environ 8,8 kb et présente une carte de clivage par endonucléase de restriction représentée à la figure 2, et qui est appelé pAGSO1.

30.- ADN recombinant selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'il a une longueur moléculaire d'environ 11,1 kb et présente une carte de clivage par endonucléase de restriction représentée à la figure 3, et qui est appelé pAG302.

31.- ADN recombinant selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'il a une longueur moléculaire d'environ 7,5 kb et présente une carte de clivage par endonucléase de restriction représentée à la figure 4, et qui est appelé pAG303.

32.- ADN recombinant selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'il a une longueur moléculaire d'environ 9,4 kb et présente une carte de clivage par endonucléase de restriction représentée à la figure 5, et qui est appelé pAG311.

33.- ADN recombinant selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'il a une longueur moléculaire d'environ 12,5 kb et présente une carte de clivage par endonucléase de restriction représentée à la figure 10, et qui est appelé pAG4001.

34.- ADN recombinant selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'il a une longueur moléculaire d'environ 10,8 kb et présente une carte de clivage par endonucléase de restriction représentée à la figure 11, et qui est appelé pAG4002.

35.- ADN recombinant selon la revendication 13, caractérisé an ce qu'il a une longueur moléculaire d'environ 10,4 kb et présente une carte de clivage par endonucléase de restriction représentée à la figure 12, et qui est appelé pAG4003.

36.- ADN recombinant selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'il a une longueur moléculaire d'environ 12,3 kb et présente une carte de clivage par endonucléase de restriction représentée à la figure 13, et qui est appelé pAG5001.

37.- ADN recomhinant selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'il a une longueur moléculaire d'environ 11,0 kb et présente une carte de clivage par endonucléase de restriction représentée à la figure 14, et qui est appelé pAG3001.

38.- Micro-organisme caractérisé en ce qu'il comprend une bactérie et l'ADN recombinant selon l'une quelconque des revendications 13 à 37, ledit ADN recombinant étant contenu dans ladite bactérie.

39.- Micro-organisme selon la revendication 38, caractérisé en ce que la bactérie précitée est une bactérie appartenant au genre Escherichia.

40.- Micro-organisme selon la revendication 39, caractérisé en ce que la bactérie précitée appartenant au genre Escherichia est Escherichia coli.

41.- Micro-organisme selon la revendication 38, caractérisé en ce que la bactérie précitée est une bactérie appartenant au genre Bacillus.

42.- Micro-organisme selon la revendication 41, caractérisé en ce que la bactérie précitée appartenant au genre Bacillus est Bacillus subtilis.

43.- Micro-organisme selon la revendication 38, caractérisé en ce que la bactérie précitée est une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique.

44.- Micro-organisme selon la revendication 43, caractérisé en ce que la bactérie corynéforme précitée est une bactérie appartenant au genre Corynebacterium.

45.- Micro-organisme selon la revendication 44, caractérisé en ce que la bactérie appartenant au genre

Corynebacterium précitée est Corynebacterium melassecola.

46.- Micro-organisme selon la revendication 38, caractérisé en ce que la bactérie précitée est la souche

W620 de Escherichia coli K12 et l'ADN recombinant précité est le plasmide pAG401 selon la revendication 28, que l'on appelle la souche W620 de Escherichia coli K12 (pAG401)

47.- Micro-organisme selon la revendication 38, caractérisé en ce que la bactérie précitée est Bacillus subtilis 168 MA3 et l'ADN recombinant précité est le plasmide pAGSO1 de la revendication 29 et que l'on appelle Bacillus subtilis 168 MA3 (pAGSO1).

48.- Micro-organisme selon la revendication 38, caractérisé en ce que la bactérie précitée est la souche EB106 de Escherichia coli K12 et l'ADN recombinant précité est le plasmide pAG302 de la revendication 30, que l'on appelle la souche EBlû6 de Escherichia coli K12 (pAG3o2).

49.- Micro-organisme selon la revendication 38, caractérisé en ce que la bactérie précitée est la souche EB106 de Escherichia coli K12 et l'ADN recombinant précité est le plasmide pAG303 de la revendication 31, que l'on appelle la souche Ex106 de Escherichia coli K12 (pAG303).

50.- Micro-organisme selon la- revendication 38, caractérisé en ce que la bactérie précitée est la souche EB106 de Escherichia coli K12 et l'ADN recombinant précité est le plasmide pAG311 de la revendication 32, que l'on appelle la souche EB106 de Escherichia coli K12 (paG311).

51.- Micro-organisme selon la revendication 38, caractérisé en ce que la bactérie précitée est Corynebacterium melassecola 801 et 1'ADN recombinant précité est le plasmide pAG4001 de la revendication 33, que l'on appelle Corynebacterium melassecola 801 (pAG4001).

52.- Micro-organisme selon la revendication 38, caractérisé en ce que la bactérie précitée est Corynebacterium melassecola 801 et l'ADN recombinant précité est le plasmide pAG4002 de la revendication 34, que l'on appelle Corynebacterium melassecola 801 (pAG4002).

53.- Micro-organisme selon la revendication 38, caractérisé en ce que la bactérie précitée est Corynebacterium melassecola 801 et l'ADN recombinant précité est le plasmide pAG4003 de la revendication 35, que l'on appelle Corynebacterium melassecola 801 (pAG4003).

54.- Micro-organisme selon la revendication 38, caractérisé en ce que la bactérie précitée est

Corynebacterium melassecola 801 et l'ADN recombinant précité est le plasmide pAG5001 de la revendication 36, que l'on appelle Corynebacterium melassecola 801 (pAG5001).

55.- Micro-organisme selon la revendication 38, caractérisé en ce que la bactérie précitée est

Corynebacterium melassecola 801 et 1'ADN recombinant précité est le plasmide pAG3001 de la revendication 37, que l'on appelle Corynebacterium melassecola 801 (pAG3001).-