JPH025861A - 新規好熱菌セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は好熱菌バシルス・ステアロサーモフィラスの新
規なセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、該セ
リンヒドロキシメチルトランスフェラーゼをコードする
ＤＮＡ、該ＤＮＡを組み込んだ組み換えベクター　及び
該組み換えベクターを含有する形質転換細菌に関する。

（従来の技術） Ｌ−セリンは医薬品、化粧品、化学品原料等に利用され
るアミノ酸であり、近年、セリンヒドロキシメチルトラ
ンスフェラーゼ産生能を有する大腸菌やクレブシェラ属
細菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）を酵素源とする酵素反応
によりし一セリンを選択的に製造する方法が注目をあび
ている（特開昭６２−１９０９２、特開昭６２−１７２
２９３、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄＢｉｏｅ
ｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｖｏｌ、ＸＸ用１５１０　（１
９８６）等）。このセリンヒドロキシメチルトランスフ
ェラーゼはテトラヒドロ葉酸及びピリドキサルリン酸を
補酵素として、グリシンとホルムアルデヒドからＬ−セ
リンを、グリシンとアセトアルデヒドからＬ−スレオニ
ンを合成し、また、可逆性を持っていることが知られて
いる。

一方、好熱菌バシルス・ステアロサーモフィラスは、比
較的高い温度で生育することが知られており、同一の反
応に関与していても非好熱菌の酵素に比べて熱安定性の
よい酵素、例えばβ−ガラクトシダーゼが単離されてい
る（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　
　ＸＭ１９−１４　（１９８４）；　Ｊｏｕｒｎａｌ　
ｏｆＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　　１ｆ３Ｌ　　？２２
−７２７　（１９８６））。しかし、好熱菌バシルス・
ステアロサーモフィラスのセリンヒドロキシメチルトラ
ンスフェラーゼは単離されておらず、その酵素の熱安定
性等の性質の解析、その酵素に関与する遺伝情報の解析
もなされていなかった。

（本発明が解決しようとする課題） そこで本発明者らは、かかる従来技術の下で好熱菌バシ
ルス・ステアロサーモフィラスからセリンヒドロキシメ
チルトランスフェラーゼ遺伝子を担うＤＮＡを単離すべ
く鋭意検討の結果、セリンヒドロキシメチルトランスフ
ェラーゼ遺伝子の単離に成功し、そのＤＮＡを組み込ん
だ組み換えベクターによって形質転換された細菌中で遺
伝子が発現され、耐熱性で、基質のひとつであるホルム
アルデヒドにも耐性を持つセリンヒドロキシメチルトラ
ンスフェラーゼが産生されることを見出し、本発明を完
成するに到った。

（課題を解決するための手段） かくして本発明によれば、第一の発明として、新規好熱
、菌セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼが提供
され、第二の発明として、該セリンヒドロキシメチルト
ランスフェラーゼをコードする塩基配列またはそれと実
質的に同一の機能を持つ塩基配列を有するＤＮＡが提供
され、第三の発明として、該ＤＮＡを組み込んだ組み換
えベクターが提供され、第四の発明として、該組み換え
ベクターにより形質転換された細菌が提供される。

好熱菌バシルス・ステアロサーモフィラスからセリンヒ
ドロキシメチルトランスフェラーゼ遺伝子を担うＤＮＡ
を単離する方法については特に限定された方法を用いる
必要はなく、例えば好熱筒バシルス・ステアロサーモフ
ィラスＩＦＯ１２５５０から常法により全ＤＮＡを単離
精製し、制限酵素または超音波処理により切断した後、
該制限酵素と同じ接着末端をＤＮＡに生じさせうる制限
酵素で切断したベクターまたは制限酵素Ｓｍａ　Ｉ等で
切断したベクターと酵素的に結合させ、得られた組み換
えベクターを用いてＬ−セリンからグリシン生合成能を
欠失したグリシン要求性変異株を形質転換し、得られた
形質転換株の中からグリシン非要求性変異株を選択すれ
ばよい。なお、該ＤＮＡには実質的に同一の機能を有す
るＤＮＡ、即ち塩基配列の一部が置換され、挿入され、
または欠失したものでも同一の機能を有するものも当然
台まれる。

組み換えベクターを構築するに際しては、プラスミドベ
クター　λｇｔ系ファージベクター等が使用されるが、
必要に応じてプロモーターを同時に組み込むことにより
形質転換または形質導入された細菌のセリンヒドロキシ
メチルトランスフェラーゼ産生能を向上させることがで
きる。

グリシン要求性変異株としては、好熱菌バシルス・ステ
アロサーモフィラスの遺伝情報を担うＤＮＡが該菌体内
で発現可能な菌株であればいずれでもよい。そのような
変異株は、通常の微生物突然変異誘発法、例えば紫外線
、Ｘ線、γ線照射等の物理的処理やニトロソグアニジン
などの薬剤による化学的処理（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　　９ｊ４１９３０　　（１
９６７））によって、容易に得ることができる。公知の
グリシン要求性変異株、例えば大腸菌ではＡＴＣＣ２３
８＋１．　ＭＥ５４２７等を用いることもてきる。

ＭＥ５４２７は、国立遺伝学研究所遺伝実験生物保存研
究センターで分譲されており、申請すれば容易に人手で
きる。

本発明において鞘み換えベクターを構築するためのベク
ターとしては、グリシン要求性変異株を形質転換（また
は形質導入）し得るものであればどのようなものでもよ
く、グリシン要求性の大腸菌を用いる場合、Ｅ　Ｋ系フ
ァージベクターではストリンゼント型のｐＢＲ３２２や
ｐＵｃ１８等、リラックス型のｐｓｃｌｏｌやｐＲＫ３
５３等、λ８を系ファージベクターではλｇｔ・λＣや
λｇｔ・λＢ等が用いられる。

これらのベクターのなかではプラスミドベクターが特に
賞用される。

形質転換の方法についてもなんら限定すべきものではな
く、例えばグリシン要求性の大腸菌を用いる場合、塩化
カルシウムで菌体を処理する方法（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏ
ｆ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　　５３　１
５４（１９７０））等が用いられる。かくして得られる
グリシン要求性変異株の形質転換体の中から、好熱菌ハ
シルス・ステアロサーモフィラス由来のセリンヒドロキ
シメチルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡが組み
込まれた組み換えベクターを有する菌体を選択するには
、例えば親株のグリシン要求性変異株が生育可能な培地
の組成からグリシンが実質的に除去された培地を用いて
、該形質転換株をスクリーニングし、該培地で生育可能
な菌株を選択すれは良い。

こうして得られる形質転換菌株からハイブリッドプラス
ミドｐＭｓＯ４６を得た。このｐＭｓＯ４６は、バシル
ス・ステアロサーモフィラス由来のＤＮＡ断片をプラス
ミドｐｔＪｃ１８に挿入したものであり、その制限酵素
地図を第１図に示す。

ｐＭｓＯ４６のＫｐｎ　ＩとＲａｍ）ｌ　Ｉの制限酵素
切断部位間に挿入されたバシルス・ステアロサーモフィ
ラス由来のＤＮＡ断片は約２ｋｂであった。　Ｋｐｎ　
ＩとＢａｍＨＩの制限酵素切断部位はρＵＣｌ３由来で
、実際のバシルス・ステアロサーモフィラス由来ＤＮＡ
断片は、　ｌ＜ｐｎＩとＢａｍＨＩの制限酵素切断部位
間の塩基配列の両端の数ベースを除いたものである。

このＫｐｎ　ＩとＢａｍＨＩの制限酵素切断部位間のＤ
ＮＡ断片の制限酵素地図を第２図に示す。

この約２ｋｂのＤＮＡ断片について配列分析を行った結
果、その塩基配列は第３図に示すとうりであることが判
明した。この塩基配列中１−１ｏ番目と１９８２〜１９
８９番目の配列はｐＵｃ　ｔ　ｓ由来の配列であり、１
１〜１９８１番目はバシルス・ステアロサーモフィラス
由来である。この塩基配列はＫｐｎ　Ｉ側の５”末端か
らＢａｍ）ｌ　Ｉ側の３′末端へ向かって一つの大きな
オーブンリーディングフレームを保有する。翻訳開始コ
ドンであるＡＴＧは、５゛末端から７２７〜７２９番目
に存在し、翻訳終始コドンＴＧＡが存在する１９３３〜
１９３５番目まで、　４０２のコドンがＡＴＧにつなが
っている。このＡＴＧの上流の７１３〜７１９番目にシ
ャイン・ダルガノ配列が存在する。

このＤＮＡ断片によってコードされるアミノ酸配列はそ
の塩基配列から第３図のごとく推定される。このような
アミノ酸配列を有するポリペプチドは４０２個のアミノ
酸から構成され、その分子量は約４４，０００ダルトン
と計算される。

これら宿主を形質転換（または形質導入）して耐熱性セ
リンヒドロキシメチルトランスフェラーゼを産生ずる形
質転換体を得るためには、宿主細菌中で複製可能である
ことが必要であることに加え、耐熱性セリンヒドロキシ
メチルトランスフェラーゼをコードしたＤＮＡが、宿主
細菌中で機能しうるブロモ−ターの支配下にあるように
組み込まれている必要がある。

本発明により形質転換された細菌の培養に用いられる培
地は、炭素源、窒素源、無機物を含有する合成培地、ま
たは天然培地のいずれであっても、使用可能である。宿
主細菌が大腸菌の場合は、培養は振盪培養あるいは通気
撹拌培養等の好気的条件下で行い、通常３５〜４０℃で
１２〜２４時間程度行われる。

培養終了後は通常の分離精製手段として、硫酸アンモニ
ウム等の塩析、有機溶媒沈澱法、イオン交換または吸着
樹脂等によるクロマトグラフィー法、蛋白沈澱剤による
沈澱法、等電点法または電気透析法等を適用して精製し
、高純度のセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ
を得ることができる。

さらに耐熱性の酵素である長所を利用して、熱処理法に
よる精製が特に有効である。

酵素活性の定量は、常法（Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ　１ｓｔｒ
ｙ　　［５３４３（１９７７））に従い、フェニルセリ
ンを基質として生成するベンズアルデヒドの波長２７９
ｎｍにおける吸光度の増大を測定することによって行う
ことができる。

このようにして得られた新規好熱菌セリンヒドロキシメ
チルトランスフェラーゼは以下のような理化学的性質を
持っている。

■作用　：　テトラヒドロ葉酸及びピリドキサルリン酸
を補酵素とし、グリシンにヒドロキシメチル基を付加し
し一セリンを産生ずる。

■至適ｐＨ：　　ｐｌ７．５付近でＬ−セリンの産生が
最大となる。

■至適温度　＝ＩＩＨ７，５において、７０℃付近にあ
る。

■温度安定性　：　　ｐＨ７，５において、７５℃１０
分処理で５０％以上の残存活性がある。

［５］ＵＶ及び可視吸収　：　　　２７８　ｎ　ｍ及び
４２７ｎｍに吸収極大があり、その比はＡ２７８／Ａ４
２７＝６．９である。

■等電点　：　等電点電気泳動によればｐｌは約６．１
である。

■分子ｆｉ：ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法
によれば、約４４　、０００である。

■補酵素　二　本酵素は補酵素として、テトラヒドロ葉
酸及びピリドキサルリン酸を要求する。

■発現　：　好熱菌バシルス・ステアロサーモフィラス
の染色体ＤＮＡに存在するセリンヒドロキシメチルトラ
ンスフェラーゼ生産性ＤＮＡ断片を組み込んだ組み換え
ベクターによる。

また、この酵素は大腸菌由来のセリンヒドロキシメチル
トランスフェラーゼに比べ、基質のひとつであるホルム
アルデヒドに対する耐性を持っている。

さらに、得られた上記の理化学的性質を持つ新規好熱菌
セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼは、分子量
が前述の第３図に示すアミノ酸配列から計算された分子
量とよく一致し、またアミノ酸配列分析の結果、Ｎ末端
からのアミノ酸配列が第３図に示すアミノ酸配列と一致
し、第３図のアミノ酸配列を持つ酵素と同一であること
が示された。

かくして得られる本発明の好熱菌セリンヒドロキシメチ
ルトランスフェラーゼは、新規な酵素であり、アミノ酸
の製造において有用である。

（発明の効果） かくして本発明によれば、好熱筒バシルス・ステアロサ
ーモフィラスの新規なセリンヒドロキシメチルトランス
フェラーゼ、該セリンヒドロキシメチルトランスフェラ
ーゼをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを組み込んだ組み換
えベクター　及び該組み換えベクターを含有する形質転
換細菌が提供される。この新規なセリンヒドロキシメチ
ルトランスフェラーゼは、耐熱性に優れており、本発明
のセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼを用いた
Ｌ−セリンの製造においては、反応速度を高めるために
反応温度を上げることが可能となる。

また、本発明セリンヒドロキシメチルトランスフェラー
ゼはホルムアルデヒドに対する耐性にも優れており、Ｌ
−セリンの製造において、反応速度を高めるために基質
であるホルムアルデヒドの濃度を高めることが可能とな
る。これらの理由により、本発明のセリンヒドロキシメ
チルトランスフェラーゼを用いることにより、効率よく
Ｌ−セリンを製造することができる。

（実施例） 以下に実施例をあげて本発明をさらに具体的に説明する
。

実施例　１ （１）　全ＤＮＡ断片の調製 好熱菌バシルス・ステアロサーモフィラス　ＩＦＯ１２
５５０を、ＬＢ培地（ＩＱ当りバクトドリブトン１０．
０ｇ、イーストエキストラクト　５．Ｏｇ、　Ｎａα５
、ＯｇをＮａＯＨでｐｌ’ｌ　７．２に調整したもの）
中、５５℃で１０時間震盪培養し、対数増殖後期の菌体
を集菌後、染色体ＤＮＡを抽出した。得られた染色体Ｄ
ＮＡを超音波処理し、次いで反応物をアガロースゲル電
気泳動にかけ、約２ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。

（２）　ベクターｐＵｃ１Ｂの切断 アンピシリン耐性をマーカーとしてもつｐＵｃ１８（宝
酒造製）を制限酵素Ｓｍａ　Ｉで完全分解せしめた後、
アルカリホスファターゼで処理した。

（３）　再結合反応 （１）で調製したＤＮＡ断片および（２）で調製した開
裂されたｐＵｃ１８をｌｏｍＭ　　ＭｇＣＱ＋　　１ｍ
Ｍ　ＡＴＰ及び１０ｍＭ　ＤＴＴを含むｐＨ７，４の５
０ｍＭ　）リスー塩酸緩衝液中応させることによってＤ
ＮＡ断片をｐＵｃ１８に組み込んだハイブリッドプラス
ミドを得た。

（４）　ハイブリッドプラスミドのグリシン要求性大腸
菌への導入 エシェリヒア・コリＭＥ５４２７　（国立遺伝学研究所
遺伝実験生物保存研究センターより分譲）を１００ｍＱ
のＬＢ培地中３７℃で約２時間半振盪培養し、対数増殖
期に菌体を遠心分離により集めた。この菌体を５０ｍＭ
　　Ｃａα２５０ｍ１ｉ！に懸濁し、　０℃で１５分間
静置した。集菌後、５０ｍＭ　Ｃａα２，１５％グリセ
リン　ｌＯｍＱに懸濁し許容（コンピテント）細胞とし
た。

０次いて、　（３）で得たハイブリッドプラスミドＤＮ
Ａを０．２μｇずつ上記許容細胞懸濁液０．２ｍ１ｌｌ
に加えて０℃で１５分間静置した。４２℃で１分間保っ
たのち、ＬＢ培地０．８−を加えて３７℃で１時間培養
した後、この培養液を０．２−ずつ３０μｇ／ｍ１ｌｌ
アシピシリンを含むＬＢ培地の１．５％寒天培地に塗ま
つし、３７℃にて一晩培養した。

出現したコロニー約１６，０００個をビロード布を用い
てグリシンを含まない最少培地（ＩＲ当たりに２ＨＰＯ
ａ　　ｌｏｇ、　Ｎａ１ｌＮＨａＰＯ４・４Ｈ２０３，
５ｇ、クエン酸２ｇ、　Ｍｇ５Ｏａ・７Ｈ２００，２ｇ
、グルコース　４ｇ、塩酸チアミン　１６．９ｍｇ、ア
デニン　６７．５ｍｇ、グアニン４５．５ｍｇ、アルギ
ニン１２６．５ｍｇ、イソロイシン３９．５ｍｇ、ヒス
チジン　１５．５ｍｇ、プロリン２３０ｍｇ。

バリン３５ｍｇ、　　）リブトファン　２０．５ｍｇ）
の１．５％寒天培地にレプリカし、３７℃にて二晩培養
した。

生じた１つのコロニーはアンピシリン耐性、グリシン非
要求性であり、かくして目的とする好熱菌バシルス・ス
テアロサーモフィラスのセリンヒドロキシメチルトラン
スフェラーゼ遺伝子ＤＮＡを組み込んだハイブリッドプ
ラスミドによる形質転換株１株を得た。

（５）　ハイブリッドプラスミドの解析得られた形質転
換株１株を３０μ８／艷アンピシリンを含むＬＢ培地で
一晩Ｒ１！１培養し集菌後、ビルンボイム（Ｂｉｒｎｈ
ｏｉｍ）とドーリ−（Ｄｏｌｙ）の方法（Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ　　Ａｃ１ｄ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　　　ヱ　　１５
１３　　　（１９７９））　　ζこよりプラスミドＤＮ
Ａを抽出した。

得られたハイブリッドプラスミドＤＮＡは、全長約４．
６ｋｂであり約２ｋｂのＤＮＡ断片が挿入されていた。

このハイブリッドプラスミドＤＮＡをｐＭｓＯ４Ｇと命
名し、その制限酵素地図を第１図に示す。

次に９ＭＳＯ４６ブラスミドＤＮＡに挿入されているＤ
ＮＡ断片がバシルス・ステアロサーモフィラスＩＦＯ１
２５５０由来のＤＮＡ断片であることを証明するために
、サザン・ハイブリダイゼーションを行った。まず、　
（１）で抽出、精製した全ＤＮＡを制限酵素Ｈｉｎｄｌ
ｌＩで完全分解せしめた後、生成物をアガロースゲル電
気泳動にかけ、サザン（５ｏｕｔｈｅｒｎ）の方法（Ｊ
ｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇ
ｙ　　凹５０３　　（１９７５））によりナイロンメン
ブレンフィルターに移行した。これとは別にプラスミＦ
　ｐＭｓＯ４６から挿入ＤＮＡ断片を制限酵素１ｃｐｎ
ｌ及びＢａｍＨＩによる切断によって切り出し、ＤＮＡ
断片０．２μｇを３２ｐにより標識してプローブＤＮＡ
とした。調製はランダムプライムラベリングキット（ア
マジャム社製）を用いて行った。このプローブＤＮＡを
使用して、先に用意したナイロンメンブレンフィルター
に対して以下の手順に従いハイブリダイゼーションを行
った。まずフィルターをＳ　Ｓ　Ｃ（０，１５Ｍ　Ｎａ
Ｃｌ、　Ｏ，０１５Ｍクエン酸ナトリウム）の６倍濃縮
液とＤｅｎｈａｒｄｔ液（０，０２Ｎウシ血清アルブミ
ン、　０．０２％ポリビニールピロリドン、　０．０２
％フィコール）　２０ｍ１ｉ！に熱処理し、サケ精子Ｄ
ＮＡを２０ｐｇ／＋ｄとなるように加え、６５℃で４時
間予備ハイブリダイゼーションを行った。その後、ＳＳ
Ｃの６倍濃縮液とＤｅｎｈａｒｄｔ液、　０．５ｚＳＤ
Ｓからなるハイブリダイゼーションバッファー２０艷に
熱処理したサケ精子ＤＮＡを５０Ｍｇ／＋ｄとなるよう
に加えて６５℃で一部ハイブリダイゼーションした。次
いでフィルターをハイブリダイゼーションバッファーで
よく洗い、ざらにＳＳＣの６倍濃縮中６５℃で３０分間
洗い、ＳＳＣの２倍濃縮液中６５℃で３０分間３回洗い
、風乾後、オートラジオグラフィーを行った。

この結果、全ＤＮＡ中にこのプローブＤＮＡに対して反
応する断片があることが確認され、プラスミドｐＭｓＯ
４６中の約２ｋｂ挿入ＤＮＡ断片はバシルス・ステアロ
サーモフィラス　ＩＦＯ１２５５０のＤＮＡ断片である
ことが証明された。

（６）　形質転換の再現性の確認 プラスミドｐＭｓＯ４６Ｄ　Ｎ　Ａを用いて（４）で述
べた方法によりエシェリヒア・コリＭＥ５４２７を再度
形質転換したところ、ｐＭｓＯ４６をプラスミドとして
所有するエシェリヒア・コリＭＥ５４２７全てがアンピ
シリン耐性、グリシン非要求性となった。

これにより、プラスミドｐＭｓＯ４６はエシェリヒア・
コリＭＥ５４２７のＬ−セリンからグリシンへの生合成
能欠失を相補しうる遺伝情報を持ったバシルス・ステア
ロサーモフィラスＩＦＯ１２５５０のＤＮＡ断片を少な
くとも所有していることが判明した。

このプラスミドｐＭｓ０４６をプラスミドとして所有す
るエシェリヒア・コリＭＥ５４２７をエシェリヒア・コ
リＭＥ５４２７　（ｐＭｓＯ４６）と命名した。得られ
たハイブリッドプラスミド１３Ｍ５Ｏ４６中に含まれる
好熱菌バシルス・ステアロサーモフィラス　ＩＦＯ１２
５５０由来のＤＮＡ断片はＫｐｎ　ＩからＢａｍＨＩま
での約２ｋｂであり、その詳細な制限酵素地図は第２図
に示す通りである。

実施例２ 実施例１で得られた約２ｋｌ）のＤＮＡ断片をさらに調
査するためにＭ１３ファージを用いたメッシングらの方
法（ＧｅｎｅＬｎ　　２６９　　（１９８２）：　５ｃ
ｉｅｎｃｅ、Ｊ　　１２０５　（１９８１））により配
列分析を行った。その結果、得られた塩基配列は第３図
に示す。

実施例　３ （１）粗酵素の調整 実施例１で得られた形質転換体エシェリヒア・コリＭＥ
５４２７　（１）ＭＳＯ４６）を３０Ｍｇ／艷のアンピ
シリンを含むＬＢ培地に植菌し、３７℃１６時間培養し
、集菌した。１０倍溶の１％グリシン水溶液を加え、超
音波処理により菌体を破砕し遠心により上清を集め、粗
製バチルス・ステアロサーモフィラス由来セリンヒドロ
キシメチルトランスフェラーゼを調整した。比較のため
、常法により大腸菌のｇ＋ｙＡ遺伝子をクローニングし
、発現ベクターに組み込んで形質転換したＥ、ｃｏｌｉ
　Ｃ６００を用いて、粗製大腸菌由来セリンヒドロキシ
メチルトランスフェラーゼも同様に調整した。

（２）耐熱性の測定゛ 上清の一部を採取し、７５℃に加熱した後、セリンヒド
ロキシメチルトランスフェラーゼの活性を常法に従い、
　２７９ｎｍの吸収の増大によって測定した。大腸菌由
来の酵素では７５℃１０分間の加熱処理による残存活性
が１．４％であったのに対し、ＭＥ５４２７（ｐＭｓＯ
４６）由来の酵素では７５°ＣＩＯ分間の加熱処理で６
２％、７５℃２０分間で８．４％の残存活性であった。

このことから、本発明の酵素が耐熱性を持っていること
が示された。

（３）ホルムアルデヒド耐性の測定 （１）で得られた上清の一部を採取し、ホルムアルデヒ
ドを　１００ｍＭになるように加え、３７℃に加熱した
後、　（２）と同様にセリンヒドロキシメチルトランス
フェラーゼの活性を測定した。大腸菌由来の酵素では１
０分後に残存活性が４０％であったのに対し、ＭＥ５４
２７（９ＭＳＯ４６）由来の酵素では残存活性は６４％
であった。

このことから、本発明の酵素がホルムアルデヒドに対し
て耐性を持っていることが示された。

実施例　４ 実施例１で得られた形質転換体エシェリヒア・コリＭＥ
５４２７　（ｐＭｓＯ４６）を３０μｇ／ｄのアンピシ
リンを含むＬＢ培地に植菌し、３７℃で１６時間培養し
、集菌した。３倍溶の５０ｍＭリン酸緩衝液に懸濁し超
音波処理により苗・体を破砕し遠心により上清を集めた
。この上清に硫酸アンモニウムを６０％飽和となるよう
に加え、　４℃で１時間撹拌後遠心により沈澱を得た。

この沈澱を１％グリシン水溶液に溶解し、同法に対して
透析した。この透析物を７５℃で６分間熱処理した後、
遠心し不溶物を除去した。

上清に水酸化ナトリウムを加え、ｐ）ｌ　７．５に調整
した後、ＤＥＡＥトヨパール（東ソー製）に通じて徂精
製腰　さらにセファクリルＳ−３００（、ファルマシア
社製）に通じて精製し、好熱菌バシルス・ステアロサー
モフィラスのセリンヒドロキシメチルトランスフェラー
ゼを得た。

実施例　５ 実施例４において得られた好熱菌バシルス・ステアロサ
ーモフィラスのセリンヒドロキシメチルトランスフェラ
ーゼ１００μｇを用いて、エドマン法により、Ｎ末端か
らのアミノ酸配列分析を行った。

エドマン分解は、ベックマン社製プロティンシーケンサ
−８９０Ｍを用いて行い、生成したＰＴＨ−アミノ酸の
分析は、Ｄ、Ｈａｗｋｅらの方法（Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃ
ｌｌｅｍ、　　Ｌｍ３０２−３１１　（１９８２））に
従って、ＨＰＬＣによって行った。また、精製した好熱
菌バシルス・ステアロサーモフィラスのセリンヒドロキ
シメチルトランスフェラーゼを周知のＳＤＳポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動により、分子量を測定した。

アミノ酸配列分析の結果、Ｎ末端からの１ｏアミノ酸残
基分のアミノ酸配列が判明したが、それは、Ｈ２Ｎ−Ｍ
ｅｔ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｉ　ｎ−Ｇ
　Ｉｎ−Ｇ　Ｉｕ−Ｐｒｏ−Ｇ　Ｉｎであり、実施例２
で得られたＤＮＡ配列から推定したＮ末端からの１０ア
ミノ酸残基のアミノ酸配列と一致した。また、分子量は
約４４，０００と測定され、ＤＮＡ配列から推定した分
子量と一致した。これらのことから、一実施例２で得ら
れたＤＮＡ配列が好熱菌セリンヒドロキシメチルトラン
スフェラーゼをコードしていることが確認された。

【図面の簡単な説明】

第１図はプラスミドｌ）ＭＳ０４６の制限酵素地図を示
す。第２図は好熱菌バシルス・ステアロサーモフィラス
由来のＤＮＡ断片を含むプラスミドｐＭｓＯ４６に挿入
された約２ｋｂのり、ＮＡ断片の制限酵素地図を示し、
第３図はその塩基配列及びアミノ酸配列を示す。 第１図 特許出願人　　日本ゼオン株式会社 １０　　　　　　’　　　２０　　　　　　　　３０　
　　　　　　　４０　　　　　　　　５０ＣＴＣＧＧＴ
ＡＣＣＣＧＴＴＣＧＴＣＡＡＧ　　ＧＡＴＣＧＴＧＴＧ
Ｇ　　ＧＧＣＡＣＡＣＣＧＴ　　ＣＧＡＡＧＧＡＧＧ＾
５６０　　　　　　　５７０　　　　　　　５８０　　
　　　　　５９（＋　　　　　　　　６００ＣＴＧＧＣ
ＧＡＡＧＡ　　ＣＧＣＧＧＣＣＡＡＡ　　ＧＣＴＧＡＴ
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ＡＣＧ＾＾Ｔ＾ＴＴＣ＾Ｃ阿 ν ＾ ＾ ！ ε ＾ に 工 ■ ＾ ！ ＾ ν 門 ＾ ν 、し ε す ＾ ＾ ＾ ＾ 第３図（その１） 第３図（その２） 第３図（その３） 第３図（その４）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記の理化学的性質を有する新規好熱菌セリンヒド
   ロキシメチルトランスフェラーゼ。 ［１］作用：テトラヒドロ葉酸及びピリドキサルリン酸
   を補酵素とし、グリシンにヒドロキシメチル基を付加し
   Ｌ−セリンを産生する。 ［２］至適ｐＨ：ｐＨ７．５付近でＬ−セリンの産生が
   最大となる。 ［３］至適温度：ｐＨ７．５において、７０℃付近にあ
   る。 ［４］温度安定性：ｐＨ７．５において、７５℃１０分
   処理で５０％以上の残存活性がある。 ［５］ＵＶ及び可視吸収：２７８ｎｍ及び４２７ｎｍに
   吸収極大があり、その比はＡ＿２＿７＿８／Ａ＿４＿２
   ＿７＝６．９である。 ［６］等電点：等電点電気泳動によればｐｌは約６．１
   である。 ［７］分子量：ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動
   法によれば、約４４，０００である。 ［８］補酵素：本酵素は補酵素として、テトラヒドロ葉
   酸及びピリドキサルリン酸を要求する。 ［９］発現：好熱菌バシルス・ステアロサーモフィラス
   の染色体ＤＮＡに存在するセリンヒドロキシメチルトラ
   ンスフェラーゼ生産性ＤＮＡ断片を組み込んだ組み換え
   ベクターによる。 ２、第３図に示すアミノ酸配列またはそれと実質的に同
   一の機能を持つアミノ酸配列を有する新規好熱菌セリン
   ヒドロキシメチルトランスフェラーゼ。 ３、請求項２記載のセリンヒドロキシメチルトランスフ
   ェラーゼをコードする塩基配列またはそれと実質的に同
   一の機能を持つ塩基配列を有するＤＮＡ。 ４、請求項３記載のＤＮＡを組み込んだ組み換えベクタ
   ー。 ５、請求項４記載の組み換えベクターにより形質転換さ
   れた細菌。