JPH01502555A - キサンタンガムの組換ｄｎａによる製造 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 キサンタンガムの組換Ｄ）ｉＡ　Ｋよる製造発明の背景 この出願は１９８６年３Ａ２６日に出願された米国特許出願ＡＢ４４，３２２の 一部継続出願である。 キサンタンガムは、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｅｎａｓ）＠＆Ｗ１ｐ・− ｔｒｉｓ）８ｉ４２）微生物によシ天然に生産される。 キナノタンガ五社その異常な管理的性質、すなわちその非常に高い比粘度及びそ の疑似塑性のため、Ｓ−の用途において広範に使用されている。２つの特定の用 途において、キサンタンガムは食品中に増粘剤として使用され、油回収の増強に おいて移鮎変駒節及び！ロフイール修正剤として使用される。さらに、キサンタ ンガムは石油掘削流体の形成のために有用である。 化学的には、キサンタンガムは陰イオン性へテロポリナラカライドである。この ポリマーの返復単位は５個の糖成分、具体的には２個のグルコース、１個のグル クロン酸及び２個のマンノース成分から成るペンタマーである。この糖残基社、 グルコース成分がぼりマー龜の主知を栴成しそしてマンノース−グルクロン酸− マンノース残基のｇｌＡ鎖がおよそ交互のグルコース成分から延びているように 配置されている０例えばＪａｍｓｏｎ、ＥｓＰ＊等、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒ＠ｓ＠ａｒｅｋ４５：２７５−２８２（１９７５）（引用によシこの明細書に 組み入れる）Ｋよシ記載されているように１通常、この基本１＄！造は特異的に アセチル化及びビルビル化されている。 今日、キサントモナス・カンペストリス及び関連キサントモナス秩のみがキサン タンガムの製造のために使用することができる起源である。しかしながら、これ らの生物は低いｉ＆適温度（２７Ｃ〜３０℃）、及び遅い増殖速夏を有し、そし て偏性好気性であシ、これらのすべてが発酵コスＦを上昇させる。キサンタンの 生産が極度に発ｗｐ液の粘度を上昇せしめ、従って酸素移動速度を低下せしめ、 所望の生成物濃度を達成するために高価な通気、冷却及び攪拌！！量の使用を必 要なものとする。 本発明者等は、キサンタンの生産に必要な遺伝子クラスターをコードするポータ プルＤＮＡ配列を発見し、そしてこれらのが−タツル配列をプラスミドベクター 上にり四−ン化した。適当な宿主、特に脱窒赴１において使用される場合、これ らのプラスミドベクターは、紅済的且つ商業的に実行可能な態株でこの発明の方 法に従うキチンタンガムの生産をもたらすであろう、この技法はまた、キサンタ ンガムの変形体をに造するために用いることもできよう、ζの様な変形１９ｔツ カツイドは、キサンタン生産を担轟する遺伝子クラスターの染色体コピー内に変 異を含有するＸ、カンペストリスの変異株によシ生産されることが知られている 。これらの変形ガムの例は１９８５年８月６日に出願された１ムＰｏｔ声ｅｈａ ｒｌｈＰｏｌｙｍｅｒ　Ｍａｄｅ　ｂｙ　Ｘａｍｔｈｅｍｏｍａａ　’と迅する Ｖａｄｅｒｓｌｌｅ＊’等の米国出！５に７６２，８７８、及び１９８６年３月 ２６日に出願された”　Ｆａｍｌｌｙ　ｏｆ　Ｘａｎｔｋａｎ　−Ｂａ５ｅｄＰ ｏｌｙｓａｅｅｈａｒｌｄ＠Ｐｏｌｙｍｅｒｓ　ＩｍｅｌｔＩｄｌｍｇ　Ｗｏｎ −ムｃｅｔｙ−１ａｔ＠ｄ　ａｎｄ／　ｏｒ　Ｎｅｗ　−Ｐｙｒｕｖｙｌａｔ＠ ｄ　Ｇｕｍ　ａｎｄムｅ＊ｔｙ−１ａｔ＠ｄ　ａｍｄ　Ｎｅｍ−ムｅ＠ｔｙｌａ ｔｔｄ　Ｐｏｌｙｔｅｔｒａｍｅｒ　Ｇｌｌ！！Ｉ　−と勉するＤ・に＠ｒｔｙ 等の未開出顯ム８４４，４３　Ｓ中に３示されている。これらの特許出願の両者 を引用によりこの明ＭＩＫ組み入れる。この様な変異をプラスζドベクター上に 含有する一一タツ！ＤＮＡ１Ｃ列のｆナスミドベクターへのクロー二ンダ、及び これに続く。 この組換体プラスｉドの過当な紀舊への移行が、この変異をその染色体中に担持 する変異したＸ、カバストリス株によシ生産される特定のキサンタンガム変形体 Ｉｖ？ツカライドと同勢なｉ’）ｔｙカライドの前記細１１による合成をもたら すであろう。 発明ｏｓｒｔ資 この発明の１つの目的は、キサンタンガムの製造方法を提供することであシ、こ の方法においては３０℃よシ高い温度において発酵を行うことができ。 モして／又はこの方法は嫌気的条件下で行うことが・で會る。この発明の他の目 的は、ａＶｔツカライドを生産することができそして好ましくは３０Ｃ以上でセ して／又は嫌気的条件下で増殖することかできる微生物を用いる、キサンタンガ ムの製造のための組換ＤＮＮムシ提供することである。この方法によ〕製造され たキサンタンガムはキサントモナス・カンペストリスによ〕生産されたそれと化 学的に同等である。ａＸ身の生合成遺伝子中の変異によ）もたらされる他のポリ サッカ２イドも代替宿主において生産され得る。 これらの４リナツカツイドの組換ＤＮム合成を容易にするため、ポリナラカライ ドの生産を指令することができる一一タツルＤＮＡ配列を提供することがこの発 明の他の目的である。これらの４−一ツル配列を含有するベクターを提供するこ ともこの発明の目的である。これらのベクターを、商業的に有用な量のキサンタ ンガム及び他の４リナツカライドを得るために組換系において使用することがで きる。 このＲｑ！１の他の目的及び利点は−ｓ社以下の記載において示され、そして一 部は以下の記載から自明でら〕、又祉この発明の実施から知られるであろう。 とれらの目的及び利点は、添付された請求の範Ｂにおいて特に指摘された手段及 び組み合わせによシ実現されそして達成されるであろう。 これらの目的を達成するために、そして本発明の目的に従りて、キサンタンガム のａ進方法が記載され、この方法は好ましくは３０℃以上において、そして／又 社雑気的条件下でポリナラカライドを生産することができる微生物を用いる。こ れらの方法によ〉製されたポリサッカ２イドは、１つの１ｉＡ株においてはキサ ントそナス・カンペストリスによシ生産されるそれと化学的に同勢であシ、そし て他のＷ様においてａＶａｎｄｅｒｓｌｉ＊ｅ等（前掲）、及びＤｅｂｅｒｔｙ 等（前掲）Ｋよシ開示された変形体ガムと化学的に同等である。 一一一′ｆｋ配列は合成配列で８うてもよく又は制限断片（１天然’　ＤＮム配 列）でありてもよい、好ましい態様において社、／−タツｋＤＮム配列は、Ｘ。 カンペストリスのライブラリーから単離され、そして代替宿主に移行した場合、 キサントモナス・カンペストリスによシ生産されたそれと化学的に同等のキサン タンガムの生産を指令することができる。 他方、前記の目的を達成するため、そして本発明の目的に従うて、前記のＩ−タ ツルＤＮム配列を用いてキサンタンガム及び他の一９９ツカ２イｒｏ彼生物的製 造をもたらす組換ＤＮＮムシ純水される。この組換ＤＮＮムシ。 ａ）Ｘｓカッペストリスにより生産されるポリナラカライドと化学的に同等のポ リナラカライド又は構造的にキサンタンと関連する新規な−リナッカツイドのい ずれかを生産するように代替宿主微生物を指令することができる一一タツルＤＮ ム配列を用意し；１１）宿主微生物中に移行することができそしてその中で複製 することかできるベクターで６うて、前記ポータツｘＤＮム配列によシコードさ れたガム生合成酵素の発現のための要素を含有するベクターに、該Ｉ−タツルＤ ＮＡ配列をクロー二ンダし；Ｃ）好ましくは１６−合成速度で、上昇した温度で そして／又は嫌気的条件下で前記−一タツルＤＮム配列の指令のもとＫｆポリナ ラカライド生産するととができる宿主微生物中に、諌４−タツルＤＮム配列を含 有する前記ベクターを移行せしめ； ｄ）前記ベクターの維持及び前記Ｉリペプチドの合成のために適当な条件下で前 記宿主微生物を培養し；そして。 ・）　前記Ｉツナツカ２イｒを採取する；ことを含んで成る。 この発明の好ましい急＆においては、Ｉ−タツルＤＮム配列は１次の酵素、すな わち）２ノスフ、ラーヤ！、トランス７エラーヤ璽、ト２ンスフ、ツーヤ１、） ２ノス７８ツー−に’ｌ／、）ツンス７エツーゼＶ％アセチラーゼ、カタラーセ 、及びポリメツーヤの生産を指令するととができるＤＮム配列を含んで構成され る。キサンタンガムの生合成において使用されるこれらの酵葉は第１図に示され 、そしてこの後さらに詳ｆｏＫ記載される。 さらに、前記の目的を達成するため、そして本発明の目的に従って、上記の４− タｆｋＤＮム配列の少なくとも１つをそれぞれが含有する一連のクローニングベ クターが提供される。％に、プラスミドＰＲＫ２９Ｇ−Ｈ３３６、及びｐＸ　２ ０９がｈ示される。 ｆ９ｘｉＷｐＸ２０９を担持すルＥ、　：ｔ　９　（Ｉｓ　ｅｅｌｉ）Ｌ１３Ｇ ：２（ＴＸ２（１）＆、及びゲラスミＰ　ｐＲＫ２９Ｇ−１１３６６を担持する Ｅ、コ９ＬＩ３９２（）ＲＫ２９０−１１３６６）株は、ｊｋｍｅｒｌｅａｍ　 Ｔｙｐ＠ＣｓＣ５１ｔ＠（’ｅｌｌｅｅｔｉｅｍ（ムＴＣＣ）、Ｒｅｅｋｖｉｌ ｌｅ　、　Ｍａｒｙｌａｎｄに、それぞれ受託番号１６７０５１及び１６７０４ ９として１９８６年３月２１ＢＫ寄託された。 前記の一般的記載及び下記の詳細な記載は単に例示的且つｍ羽的なものであうで 、請求の範囲のととくこの発明を限定する亀のではないと理解すべきである。添 付された図面は、この明細書に組み込まれそしてその一部を成し％この発明の種 々の態様を例示し、そしてこの羽顔書の記載と相俟９てこの発明の詳細な説明す るのに役立つ。 ムの生合成経路を示す。 第２図は、λ６５　Ｓ（＋）Ｃ）１３＠地図である。 第３図は、２７０８（→の制限地固である。 第４図は、ガム遺伝子り２スターを含有するＸ。 カンペストリスのｒツムの領域０Ｂａｎ　ＨＸ　ｆｇ、２１地図である。数値は 断片の分子ナイノ（キロペース；ｈｂ）第５ａ図は、クローニングベクターｐｋ ｎｌ　７９の一般構造及び＠遅凱限エンドヌクレアーーＶ開裂部位をよる種々の λ組換体の部分消化又は完全消化からＯＰＭＷ７９のＩｌａｍＨＩ部位にクロー ン化されたガム遺伝子ＤＮムのセグメントの代表的な偽を示す、但しこれがすべ てではない。 第６図は、ガム遺伝子クラスターの近傍のＸ、カンペストリｘＤＮムのｌａｍＨ ＩＩｊｌｉｊａ１図と関連付けて示された。２個の組換体ｌアアージ（２７０ｇ （２）及びＪ　６５５＠）の部分的制限地図を示す、４個の組換ｆ５Ｘｔ　Ｔ’ （ｐＸ２０Ｇ　、ｐｘｚｏｙ　、ｐＸ２０８．及びｐＸ２０９）中に担持された ガム遺伝子ＤＮムのり一一ン化されたセグメントも示されている。ｓ！単にする ため、これらのプラスミドの１Ｍｗ７９ベクタ−Ｅ列は示されていないが、これ らの造成の詳細拡例６に記載する。 制限地図内での２２個の挿入変異（１ｍｓ拳ｒｔｌ・胞Ｔ・、ｒ断片のインビト 四で生じた挿入を示し、他方黒円はイヒビＩで誘導されたＴｍ挿入を示す０例２ に示すように、これらの挿入を担持する変異体のｌｉｃ現型分類が後に示される 。 ＩＥ８Ｈ１は、ｔム遺伝子りツスター中の６個のセッシの代表的変異のＢａａ　 ＨＩ　９ｐｌ限地図内の位置を示す。 １９２Ｓ　、Ｘ９２ｇ　、Ｘ９７５　、Ｘ１００８及び１６５５株は示された位 置に、Ｔｍ１１０の挿入変異又方には、前記の変異株の袖先実験において使用さ れる代表的なゲラスミＰが示されている。簡単にするため、クローン化工。カン ペストリス配列のみが示されてお〕、ベクターｐＭｒＷ　７９配列は省略されて いる。 ツツス記号（ト）はｆ９ス＜　ＰＫよる変異の好結果の補完を示し、他方マイナ ス記号０は補完の失敗を示す。 実数及びｔ！！明の詳ｍ社例８に記載する。゛第９図は、例１ＯＫＩＰＭＫ記載 するような、グツＪｔＰｐＲＩＣ２９Ｇ、及び組換体λ６５５（Ｌ’）からｐＲ Ｋ２９００Ｂｇｌｌｓ位にクローン化されるＤＮムの程々の断片の部分的制限地 図を示す。 第１０図は、キサンタンの生合成を指令する遺伝子クラスターを含有するキサン トモナス・カンペストリスＤＮムの１６，０８Ｇ塩基対セグメントのヌクレオチ ド配列から成る。 子の構成及び＃Ｉｉ造のａ振を示す、回申の最上の線はＢａｍ　ＨＩ　＠ｗ＆地 図を示し、そして配列中の各ＢａｍＨＩ制限部位の位置を示す、７レ一五分析曲 線の上に引かれた線は単離されそして特徴付けられた変異の幾つかのおよその位 置を示す、示されているフレーム分析曲線は、第１（青１ｍ）、第２（赤線）及 び第３ＣＪｌｔ線）ヌクレオチド位置におけるｃ−４−ｃ含量の分布を示す、な お、第３ヌクレオチド位置におけるＧ＋Ｃ含愈の分布は全配列にわたりて非−ラ ンＩムであ）、このＤＮムの実質上すべてが蛋白質生成物をコードしていること が示される。各蛋白質のリーディング７レームは非−之ンダムＧ＋Ｃ分゛布の各 領域内の９間値を有するヌクレオチド位置によシ定義される。３つのヌクレオチ ド位置においてＧ＋Ｃ分布が変化する点が１つの遺伝子の始ｔル又は終〕、ある いは１つの遺伝子の終〕でら〉且つ次の遺伝子の始ま〉である点を示す、各場合 において％これらの点は該当するリーチングフレーム中の動始コドン又は終止コ ドンの存在と関連することが見出された。 フレー五分析曲！ＩＯ下方の分離された矢印は配列中の各遺伝子の位置及びね囲 を示すために描かれる。 便宜上、我々は１文字によ〉各遺伝子を命名し、そして＠、、＃を前に付したそ の文字を用いてその蛋白質生成物命名する。各矢印の上に−１−Ｏ蛋白質生成物 の分子量がｋＤで示される。各欠設の下に、各遺伝子生成物の名称が文字名称、 並びに遺伝子の機能が変異体表現型に由来する場合のためのその後簡約名称とし て示される。 第１３図は、ＤＮム配列内の位ｍ９０Ｇ、：１４００及び１２，４００近傍に同 定される仮想の転写ターζキーターの可能性ある二次構造を示す。 第１４図は、　ＤＮム配列中位１１ｉ７３２−８０８から同定されるｆａリンｔ ＲＮムの折）たたまれた二次構造を示す。 第１５ａ図は、組換体ツｔＸｔ　ＦＰＢＫ２９Ｇ−Ｈ３３６中に担持されるクロ ーン化され九Ｘ、カンペストリスＤＮム内の種々のＴｎＫ　ｌ／Ｃ挿入変異の位 置を示す。 第１５ｂ図は、一連の欠失変異体においてＸ、カンペストリス染色体から除去さ れたＤＮムの範后を示す。 インビトロで形成され九Ｋａｍ’挿入及び欠失変異の位置を示す。 第１６ｂ図は、！ラスミドｐＲＫ２９Ｇ−１ｉ３３６内の、７＠のインビト四で 形成され九Ｋａｍ’挿入変異の位置本発明者等はキサントモナス・カンペストリ スにおけるキサンタンガムの生合成がＮ１図に示された経路を介して進行すると 信する。この図は、イソ！レノイドｍｉ＠キャリヤー１分子にりンクし九キサン タンガムのベンタナツカライド（５個の糖）反復単位の集成を示す、このペンタ サオカッイドの集成は、ベンタナツカライド反復単位中に存在する５個の個々の 糖成分の特定の且つ定められた類序での逐次的付加によシ進行することが示され る。各固有の楯付加はその特定の段階に特異的な特定の＃素話性によシ触媒され る。ａは特定の槌ヌクレオチドによシ提供される。この＃素話性をこの明細書中 では１トランス７エ２−ゼ２と称するａ＠ｈｏＷｉ素活性はさらに、各トランス フ、ラーゼ活性が触媒する逐次的に服序付けられた椙付加における段階を示す謬 −マ数文Ｉ〜ＶＫよシ命名される。 底熟キサンタン中及びインタテツカライド前駆体中に存在する２Ｉｃのマンノー ス糖成分は修飾されることが知られる。トランス７エラーーｖｌの活性によシ段 Ｎ３で付加されるマンノース成分はアセチル化されることが知られる。成熟キナ ンタｙ中にアセチル化された形で存在するこの成分の割合は可変的である。この 明細書においてアセテラーゼと称する酵素活性はマンノースへのアセチル基の付 加を触媒するが、アセチｊ−４’が機能する生合成経路の配列中の正確な位置は 現在知られてｈない、同ａＫ１段階５Ｋ＞いてトランスフ、ツー−ｖｖの活性に よシ付加されるマンノース糖成分はビルビル化されることが知うれる。この明細 書Ｋ＞いてケタラーゼと称する酵素活性はピルビン酸基の付加を触媒する。ヤは シ、成熟キサンタンガム中でビルビル化されることが観察されるこれらのマンノ ース成分の割合は可変的であシ、そしてケタ２−ゼが作用する生合成経路中の点 は現在知られていない。 ペンタナツカライＰ前駆体ユニットは、この明細書において＠１９メ２−ヤ１と 称する活性によ）触媒されるその後の酵素反応において重合される。このＩ９メ ッーゼ活性は、それが結合しているイソゾレノイド脂質キャリヤー分子からの（ ンタナッカライドナツ為エッＦの遊離、これに伴うその−ｅンタナ、力２イドの 、リビドに連結された（ンタｔ、力２゜イド、デカナラカライド又は基本ペンタ サツカライド反復のよ！１１１ｉ＋次の配列への付加を触媒し、受容体初期キサ ンタンガムの重合度の増加をもたらす。 Ｖａｍｄ＠ｒｓｌｉｅｅ等及びＤｅｈｅｒｔｙ等（前掲）の係属中の米国特許用 １１（両者を引用によシこの明細書に組み入れる）Ｋ示されるように、他のＩリ ナッカツイドが発見されておシ、これをキサンタンの１変形体等の１ポリトライ マー”（そのアセチル化基及び非−アセチル化形の両者、並びにＤ・ｈ＠ｒｔｙ 等の′ｔリテトラマー２（アセチル化形及び非−アセチル化）、及び非−７竜チ ル化、非−ビルビル化、又は非−アセチル且り非−ビルモル化ペンタマーキナン タンキサを包含する。キナンタン経路中に発見された酵素の前記の記載から、及 び新しく発見された変異体生物の下記の記載から、これらの変形体ガムの組換Ｄ Ｎム法による製造のために必要な材料がこの明細書中に本質的に記載されること が明らかである０例えば、Ｉリテトラマーは、非−アセチル化ポリテトラマー合 成ｆクスｔＰがトランス７８ラーヤＶを；−ドする遺伝子及びアセテラーゼをコ ー゛ドする遺伝子の両者を欠すている、）２ノスフ、ツーせＶｔコードするＤＮ ム配列を有しない組換−ＤＮム系において合成されるであろう。 トランス７エラーーｖｙｏ活性を特異的に不活性化したキをント七ナス・カンベ スト９スの変異が同定されている。この変異を有する菌株ｘ６５５がＶａｍｄ＠ ｒｓｌｌ＊・等によシ記載されておシ、そしてムｍ＊ｒｉｅａｎ　ＴＦＰ＠　Ｄ ｗｌｔｍｒ＊　Ｃｅ１ｌ＊ｖｔｉｅｍ　（ム丁ｃｃ）、’ＲｏｅｋｖｌｌｌｅＭ ａｒｙｌａｎｄ　Ｋ受託番号ｊＫ５３１９５として寄託されている。このＸ、カ ンペストリス変異株ｘ６５５中のその特定の欠損の同定が、１６５５株中の変異 の部位が位置する染色体の領域からのＸ。 カンペストリス染色体ＤＮＡ配列のクローニングを導いた。ｆｉｌ、２及び７に 後記するようにして変異誘発及び分析技法を用いてｘ６５５変異の部位の近傍の ＤＮム配列中の変異を誘導しそして表現型形質を分析した。この発明の基礎とし て、他のトランス７８ラー餐活性を；−ドする遺伝子が、トランス７エラーーｖ ｙの活性の必要成分を；−ドするものとして１６５５株中に同定される遺伝子の 近傍にクラスターとなうているものと信じられる。なぜなら、顔曹において、代 紋経路のクラスター化が存在することが知られているからである。 １６５５株中のト２ンスアｘ　９−４”　Ｗ欠損の知識損を惹起する変異Ｏｉｉ 位を含むＸ、カンペストリス染色体ＤＮＡの大七ダメン）　（３５ｋｂ　）をク ローニングし、そして遺伝的及び物理的に分析した。このＤＮＡ内の多数の変異 を誘導し、そして特徴付けた。これらの変異の遺伝的位置及びこれらの変異を担 持する変異株の表現ＭＯ分析によシ％Ｘ、力ンペスＦリス染色体中の、及び移行 可能なプラスミドベクター上のＩ−タツｋＤＮムセグメントとしてのこのＤＮム 配列がトランス７エ２−ゼ１，１．ＩＩ及び■、ア七テラーぜ、差びにケタラー ゼの活性のために必要な蛋白質をコードする遺伝子を含有することの直接証明が 与えられた。これらのデーターから、グラス２ドＰＲＥ２９０−Ｈ３３６及びｐ ｘｚｏｓ中にクローン化された一一タツｋＤＮムセダメンＦがト２ンス７エツー ヤ夏〜Ｖ、アセチツーセ、ケタラーゼ、？リメンーせ、及びおそらく、キサンタ ンの生合成に必要な又はこれＫ１ｇ！連する未だ特徴ずけられていない他の活性 のために必要な蛋白質をＷ−Ｐする遺伝子を含有すると−う結論が導かれる。キ サンタンの生合成のためのこの１遺伝子り２スター１をポータツＪ−ＤＮム配列 として含有するｆラスζドベクターの、キサン）モナス・カンペストリス以外の 細菌への移行を用いて。 発酵条件を変えるととＫよ〕中サンタンガムの製造クストを下りることかで・き よう。 今日まで、キナントモナス会カンペストリス及び関連のキナシト峰ナス程のみが 中サンタンガムの製造に用いることができる微生物源である。しかしながら、こ れらの生管は低い最適温度（２７℃〜３０℃）、及び低い増殖速度を有し、そし て偏性好気性菌でら〉、これらのすべて７ｆｉ発酵Ｏコスシを上昇せしめる。さ もに、既存の好気的発酵技法は１発１ｙｎｉが高い酸素移動速度を有するように 低い粘度の発酵液を必要とする。しかしながら、キサンタンはエキソポリナッカ ライｒであるから、キナノメンの生成が発酵液の粘度を極ｔＩｈＫ上昇せしめ、 このため酸素移動速度が低下し、そして所望の生成物論度を達成するために高価 な通気、１に拌、及び冷却装置の使用が必要となる。 よ〉高い最適温度及びよシ速い増動速度を有し。 そして過当なｉｉｔ素源が供給された場合に嫌気的に増殖する能力を有するであ ろう脱窒細筒を、中サンタンガムの生産を指令することができゐポータツルＤＮ Ａ配列によりて形質転換することができることが本発明者等によシ提案された。 これらの生物におけるキナンーノの製造社、使用されている現在の糧の場合よ〉 安価であろう、さらに１本発勇者等は、キナνタンの生産を担尚する遺伝子クツ スターを＝−ドするポータツ＃ＤＮム配列を発見しておシ、そしてこれらのＩ− タツル配列を含有するｆラスｔＰベクターを持りている。適当な宿主、特に脱窒 却曹中で使用される場合、これらＯｆクラスドは％経済的な且つ商業的に実現可 能な態様でこの発明の方法に従う中サンタンガムの製造をもたらすでちろう、さ らに、提案された利点のいくつかＯみを有する縞Ｉｉ宿主が代替生産宿主として 期待される。 との発明の追加の態様は、この明細書に記載されるポータツｋＤＮム配列の１又 は複敷を含有する既知の又は現在知られていないベクターを几いる場合に予想さ れる。特に、これらのベクターが次の性質。 すなわち（１）所望の宿主中で安定であること、（２）所望の宿主中に適切なコ ピー数で存在することができること、（３）！Ｆ＋％可能なｆロモーターを有す ること、及びＧ４）１−タツルＤＮム配列が挿入されるであろう部位以外の部位 上に存在する選択可能な形質をコードする少なくとも１個のＤＮム配列を有する こと、を有することが好ましい。 起重宿主及びｆクスミドベクターの下記の非限定的リスト社、上記の基準に合致 するように容易に変えることができそしてそれ故にこの発明において使用するた めに好ましい組合せを示していると信じられる（第１表）、このような変更社１ 手入可能な文献及びこの明細書中に含まれる教示に基いて当業者によシ容易に行 われる。 第　１　表 宿主　ベクター　注　釈 ｐｓａ７２７　１１の広宿主域におい て有用 ガム生合成遺伝子の大クラスターが、すべての既知ガム生合成遺伝子を欠失した Ｘ、カンペストリス及びＸ、力ンペスＦリス１１１０７株を包含する広範囲の種 類のグラム陰性細ｋｉａに移行しそして維持され得る広宿主域ＤＮＡ複製斃始点 を含有する！ラスミド上にクローン化された。！ラスζドｐＲＫ２９０−Ｈ３３ ６は補完によシＸ１１０７をキサンタン生産株に転換する。 ｐＲＫ２９０−１３３６のごときｆラスζドを代替宿主に入れる場合、キサンタ ンの生合成が起ζるためＫは多くの段階が適切に行なわれなけれはならない。 まず、生金ａ：酵素をコードする遺伝子が転写されそして翻訳されて適切なレベ ル″ｅ機能的生合成酵素が与えられなけれはならない、第二に、生合成酵素が前 駆体をキナンタンガ五に１合せしめることができるように、代替宿主社ア竜チル −Ｃ・ム、ホスホエノ−にピルビン酸、ＵＤ？−ダｊ＆＃ブース、　ｔＩＤＰ− ダルク田ン酸及びＧＤＰ−マンノースのための十分な合成能力を含んでいなけれ は゛なら１にい、第三に、多数蛋白質複合体が有効な生合成ユニ、）である場合 には。 クツ裏ターによりコードされた生合成ＩＩＦ業は凝集しなけれはならない＝゛第 四、キサンタンが培地に分泌されるよしＩＣ，その複合体（又は＠ｋｔ）Ｗ素） の輪造物は有向性（マ・ｅｔ＊ｒｉｍｌ）　Ｉｔリナッカツイｒを提供しな秒れ ばならない。 遺伝学１分子生物学、化化学１発酵工学、微生物生理学、及び組換ＤＮム技法の 当業者による実施はおそらく、キサンーン□生合成遺伝子をＩＡ現しそして細胞 外キサンタンガムを生産すｉことができる代讐宿この例は、キサシタンガムの欠 損を有する変簀株な生じさせるために用いられた変異誘発及びスクリーニン！方 法を示す。 １１４５９８４Ｌを米国農務省のＮ＊ｒｔｈ＠ｒｍ　Ｒｅｇｌ＊ｍｌＲ＠ｓ＠ａ ｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得た。辷れはスＦレットマイシンに対す る染色体耐性によ〉遺伝的に標識−ａｔして＞）、そして７’ｊｘ（ドア１！１ ｃ２０１３：：ＴｍｌＯを含有する１、コ９　ＩＪ　３９２との接合における受 容体として使用された。　Ｆｌｇｍｒｓｋｌ　、ＤｍＨ＊及びＨ６１１ｍ５ｋｌ 。 Ｄ、凰ｅ　、　Ｐｔ＠電、Ｎａｔｌ　１１ムｅａ礁ｅ８ｅｉ、ｔ１８ム、７６： １６４ｇ−１６５２（１９７９）（引用によりこの明細書に組み入れ’ｂ＞＃／ ｃよシ記載されているように、ｆラスｔＰ７１１１２０１３はカナマイシン耐性 を＝ｙ−）ＰするＴｍ　９０３を含有する。このプラスンＰＲ１，カン（ス）リ ス中で＊ｍすることができない、ト２ンスポゾν？ｍｌＧはテトラナイフリンに 対する耐性をコードする。ス）ｖ７’）マイ・タン及びテトラナイフリン、又紘 スＦレナトマイシン及びテトラナイフ９シに対して耐性を有するトランスコンジ 、ガン）　（ｔｒａｍｓ＠ｅｍｊｍｇａｍｔ）で生じ、そしておそら（ＴｍｌＯ のシランスージシ嘗ンによう士起こる。後者は、受容体蟲〕約３Ｘ１Ｇ’の頻度 で起こ〉Ｊそしておそらくキナント七ナス・カンペストリスのｒツムへのＴｍｌ Ｏのトランスポジションから起ζる。 これらのＦフンスコンジ＆ガントの牛から栄養要求株が約２１ＣＩＭ度で見出さ れた。これらの要求は。 種々の栄養要求の間に広く分布していた。このことは、これらのトツンスーゾン ー：６ｔＸ、力ンベスシリス中の挿入のための特に好ましい座を有しないことを 示す、栄養要求株の鳳栄養復帰株が選択され、そしてほとんどが薬剤感受性であ ることが見出された。このことは、栄養要求性が）ランスポノン挿入によ）生じ たことを示唆する。 二重耐性トランスコンゾ、ガツト関で中テンーンガ＾欠損変異株についてスクリ ーニングするため、キナンタンガム生１１：ｔＷ＝−と非生産コＷ二との閏の魅 態的区別を増強するコンブ−レッ゛ｒ色素（２００４リー）を固体培地に加えた 。３Ｇ’ＣＫて７日間及び１２日間のインキ。ページ、ンの後り四ニー形態を試 験した。キナノタンガ五欠損変異株が約１０−４の頻度で見出された。以後、イ ンビがてキサンメンを生産しない株をＧｕ−株と称し、そしてや社ｊ　Ｇｓｘｓ −株であフて↑ｍｌＯの挿入によ）生じたものをさらにｇｗｍ　：　：　？ｍ　 １Ｇ変異株と称することができる。 この例はＧｅｍ″″変異株の生化学的表現型、及び表現型の評価に使用した方法 をａ明する。 キサンタンガムの生合成経路の検討のための無細ｍ系Ｏ侵ＦＡＫ関する基本的な 方法は！・ｌｐｉ、Ｌ。 Ｃｅａｓｅ、ＩＬ、Ｏｓ　及びＢａｍｋｅｒｔ、Ｍ、ム、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅ ｒｓ書に組み入れる）によ〕記載されている。この明細書に記載するＧｌｌｍ− 単離体を分析するためにこの方法の変法を使用することができることが見出され た。 この新規な方法のため、一般に、適当な緩衝液、好ましくはＥＤＴムを含むＩＩ ＫＩＩｉ液の存在下で微生物、好マシくはキナシＦモナス・コンペストリスの絹 胞ヲ溶解し、そして外部から添加され九基質を地理することができる過当な生合 成酵素を得ることにようてインビ）田無細胞系をｗ４１ｔする。細胞溶解の別の 方法は、ｔｙえと音波地理、洗剤処理、Ｔ＃素麩理及びこれらの胆合わせを使用 することができるが、これらに隔意されない。 一般に、　Ｇｕｍ″″変異株の生合成経路中の欠損段階を決定するため、この微 生物の細胞溶屏物を、ＵＤＰ−グルコース、ＧＤＰ７マンノース、　ＵＤＰ−グ ルクｐン′ｔＲ，アセチル−Ｃ・ム及びホスホエノ−にピルビン酸を含む適当な 基質と共にインキ、ベートした。基質の選択は１分析しようとする段階に依存す る。生合成過程は、１つの態様においてＦｉ、＃リマーユニ。 トへの放射性標識基質の導入によりてモニターすることができる。生合成中間体 の同定を可能にするために％轟業者に知られている他の方法を使用することもで きる。　４１ＦＫ、　＆質キャリヤーからの加水分解ｖｋＫオリｔナッカライド 中間体を分離しそして同定するための発色法が８灸されている。これらｋは薄層 り賞マトダ’）７４−（ＴＬＣ）及び高速液体り賞マトダラア４−（ＨＰＬＣ） が含まれる。 キサンメンの無細胞生合成は、３ｓ＠すべての特定のａｉヌクレオチドの添加に 依存する時開依存的逐次過程であることが見出された。標識された基質の非咎異 的導入のΔツクダｙｆ）ンドは最小でｔｊ３１、そしてキナンタンー特異的中関 体又はガム画分中のキナンーノポリ！−の検出を妨けない。 ｍ＊中中ソリヤーＩＩＩＫＣ５５イソプレノイドピロ本スフ、−）の関与が＠’ ：）かのｆリナッカツイｒ生金＃！経路にお−で示された。さらに、キサンメン の生合成Ｋ＞けるビ四ホスホリｋが連結された脂質キャリヤーの関与が示され、 セしてｉｉｍされた。従うて、少なくとも碩ンタナッカツイドまでのキサンメン 生合成中間体がこれらのキャツヤー脂質を含む有機可溶画分中Ｋ１１収され得る ことが見出された。 中間体生成物の回収のためのこの１１１１ＩＦＩ畳に記載されて−る方法を用い て、インビト四条件下で変異株Ｘ、カンペストリスの溶無物が、正常なキサンメ ンの生合成のために必！！なすべての基質の存在下でさえ、蓄積された中間体及 びキをンタンガムの新規なトランク−Ｆ形を失意することが見出された。４１定 Ｃ）ｆ−、クーイン）Ｋよシどの特定の酵ＩＩ活性が欠けているかが示される。 　Ｇｕｍ″″株を分析し、そして生化学的表現型をｆＩｈＩ４せしめた。これら の生化学的表現型が、変異株の遺伝子盟の決定を可能にする０例えにインビト田 で脂質キャリヤー上にセービオースを蓄積する変異株は）ツンスフ、ツーゼｌの 遺伝子に欠損を有すると言われる。 すべての基質が供給された場合ｉｃ　Ｇｖａｍ″″変異株の細胞溶解＠が正常な キナンタンｆムを生産する場合。 生合成経路中のすべての酵素が正常であると結論される。すなわち、インピＩ″ ｅガムを生産することができないＯ拡必要な基質の１つが存在しない結果である 。基質が提供された場合にインビトｐでのみガムを生産することができるＧｕｍ ″″変異株のり２スが見出された。これらのＧ＋ｏａ−変異株は％１９８６年３ 月。 ２４日に出願された＠Ｐｒｏｃｅｓｓ　ｆｏｒ　＊ｂ＠５ｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆ 　Ｓｕｇａｒ　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　Ｕｓｌｍｇ　Ｒ＊ｅｅｍｂｉｍａｍｔ −ＤＮムＭ・ｔｈ＠櫨ｓ１と勉するＩｌ＠ｔｌａｅｋ等の米国出願ム８４３．３ ４９に一層十分に検討されている。これらすべての変異株がガムり２スターから ！、ｆされた。 これらの無細胞研究の具体的な方法がこの明細書に記載される＠　Ｊ＠ａｎ＠ｓ 　、ム・等、　Ｕ　＊　８　ｅ　Ｄｅｐａｒ　ｔｗｅｅｔｏｆ　Ａｇｒｌｅｔ＋ １ｔｗｒｅ　、ムＲ８−ＮＣ−５１，１４頁（１９７６）（引用によシこの明細 書に組み入れる）によシ記載されているようにして、　Ｇ１１ｌＫ１１″″誘導 体を２％（ｖ／マ）ダルー−スを補充されたＹＭ（＠：母−マルト培地）中で増 殖せしめた。培養物を３０℃、３００ｒｐｍにて後期対数期まで増殖せしめた０ Ｍ！！８を７Ｍ＋２−（−／マ）ダにコースグレート上で検定した。ｍ胞を遠心 分離によりて集め、そして冷Ｔｒｌｓ−ＨＣＡ　（７０ｍＷ　＊　Ｆ”　８．２ 　）によ〕洗浄した。洗浄され九軸胞を１０　ｍＭ　ＩＨＤ？ムを含有するτｒ １ｇ　−１１ＣＬ　（７０ｍＭ　。 μ＆２）中＜ＷａＳし、そしてＧａ　ｒ　＊　ｋ　ａ　ｅ　ＩＬ　ｍ　Ｃａ等。 Ｅｕｒ＠ｐｅａｎ　ＪｅｗＩｒｍａｌ　ａｔ　Ｂｉｅｅｈｅｍｌｓｔｒｙ　４３ 　：　９３−１０５（１９７５）（引用によ）このＩ！Ａｋ書に組み入れる）Ｋ 類似する方法によ〉３１凍結−解凍を行りた。２：の方法によ）細ｊ＠が破砕さ れ、このむとはこの処理の後の恩濁液の粘度の上昇及び生存細胞の完全な喪失（ １７１Ｇ’の生存細胞）Ｋよ〕証明され丸、凍結−解冷によるｉ＆胞溶Ｗ＃物を 小分けして一８０’Ｃで凍結した。　ＢＩＯＲＡＤアッ竜イ（１１１０ＲＡＤ　 Ｌａｂｅｒａ−１ｅｒｌ・−１す、チモンド、カリホリニア）にょシ蛋白質濃度 を決定し、細胞溶解物１ｗｌ１当〕５〜７ダの細胞蛋白質であることを見出した 。 Ｉ＠ＩＰｌ　、Ｌ＊　、Ｃａｕｓｅ　、　Ｒｅｄｓ及びＤａｍｋ＠ｒｔ　、）Ｌ ム・（前掲）Ｋ記載されているようにして、凍結−解凍され九起胞溶解物の７リ コート（３００〜番００ｐｌｏ＊白質Ｋａａ’ｔル）　、　ＤＮＡ７−ｖ　Ｉ　 （１０ｓｌ廓）　、及びＭｇＣ４（８ｍＭ　）を２０℃にで４０分間開レインキ 、ベートした。所望の放射性ｈａ糖ヌクレオチド（ＵＤＰ−グｊ＆−：２−ス及 びＧＤＰ−マンノース）を含み、そしてＵＤＰ−ダルクロン酸を含むか又は含ま ない同容量の７０　ｍＭ　Ｔｒｌｓ−１１ｃＡ　（１！ｉａ　２　）を加え、そ して２０℃にてインキ、ペーＦした。Ｓ種の時点で、ＥＤＴムを４　ｍＭとなる ように添加することによシ反応を停止した。ナングｋを遠心し、ペレッＦをＩＩ ｔ価液によシ２回洗浄した。ガム画分の分析を可能にするため、上清を一緒にし 、キャリヤーキチンクン（１００ｊＩｇ　）を添加し、そしてキナンタン十合成 されたがリマーをエタノール（６０％）−ＫＣＬ　（（Ｌ　８　Ｓ　）　Ｋよル 沈澱せしめた。沈澱したＩリマーを水中に再慇濁し、モしてさらに２回再沈澱し て取シ込まれなかりた極論を除去した。ガム画分く取シ込まれた放射能を液体シ ンチレーションカウンターで決定し、そしてデーターを処理して取シ込みをピコ モルとして得た。 脂質キャリヤーに連結された中間体の分析を可能にするため、洗浄されたペレッ トを、クロロホルム：メタノール：水（１：２：Ｑ、３）Ｋよシ２回抽出した。 に和な酸分鱗（ｐＨ２、９０℃、２０分間）及びアルカリ性ホスファターゼ処珈 （ウシアルカリ性ホスファターゼ、・５０　ｍＭ　ＭｇＣ４、及び１０　ｍＭグ リシｙ緩偏液、　％９．８　、３７℃、−［）Ｋよ）ｍ５ｉｔＫ連結された生合 成中間体を遊離オリ！ナッカライドに転換した。ナンｆルをクロロホルム：メタ ノール（２：１）Ｋよシ逆抽出し、そして遠心分離した。 水相を取ル出し、そして真空中で容−ｆｌｉｆｔ減少させて。 薄層クロマトグラフィーによる分析を行った。 ツタノール＝ｙオキサン：水（３５：５０：２Ｇ）Ｋよる３回展島を用いてシリ カゲル（Ｂａｋ＠ｒ　２　Ｓ　Ｇμ郷、前形成レーン）上で薄層クロマトグラフ ィーを行った。炭素−１４によシ放射能標識された化合物を、＠準現像のＫｏｄ ｍｋ　Ｘ−らａｔガムフィルムを用いる一８０℃でのオートラジオグラフィーに よシ検出した。糖標準はアニリン−ジフェニルアミン（シグマ・ケミカル社から 得られる酸性化されたアセトン中Ｌ８’ｌＧアニリン及びＬ８チジフ、ニルアミ ン）によシ可視化した。キサンタン生合成中間体の移動罠な糖標準の移動民と比 較した。二重標臓オリｆｆツカライｒの放射能分析の丸め、妨害スプレーによシ 処理されていないシリカゲルをか書ｊｅｔ、溶出し。 そしてオーシクエンチ（ａｍｔｅｑ−・ｍｅｈ　）補償を用いるぺ、クマンＬ８ −７５００シンチレーシ、ンカウンター中でグラスチックバイアル中Ｂｕｄｇｅ ｔ　−ｇ＠ｌマ・ムｑｍ−ｅｏｗｓ　Ｃｅｍｍｔｌｍｇ　Ｃｅ＊ｋｔａｌｌ　（ ＲＰＩ　）を用いて計数した。 シンテレーシ、ンデーターを処理して（’Ｈ）−標識物質及び（Ｑｃ）−標Ｐｊ ＆ＩＩＥ質の肥対量を得、化合物中の糖のモル比を計算することを可能にした。 インビトロで分析されたＧ暑！Ｉｌ″″株を幾つかの方法で測定した：（１）グ ルコース又はセ勘ビオースによるキャリヤー脂質の負荷を評価するため放射性標 識されりＵＤＰ−グルコースの−）、（２）グルコースとマンノースとのモル比 を決定するため非−標ｗＲＵＤＰ−グルクｐｙ酸並びに二１放射性檄＠　ＵＤＰ −グルコース及びＧＤＰ−マンノース、そして（３）中間体及びガム画分中のマ ンノースとダルクロン酸との分子比を比較するため非−標識ＵＤＰ−グルコース 並びに二重放射性標識ＧＤＰ−マンノース及びＵＤＰ−グルク謬ン翫、ア七チル 化又はビルビル化に欠損を有することが疑われる変異株を、　Ｉ＊１ｐ１等、　 Ｂ１ｅｅｋ＠ｍ　＊　Ｂｉ・）ｈｙｓ　＊　Ｒａｍ　＠法によ〕、放射性標識さ れたアセテルーＣ・ム及びホスホエノールピルビン酸を取〕込むそれらの能力に りいてチェックした。 菌株は２つの主たる技現ｆ！ＩＫ属した。１つのグルーｆ社インビが及びインビ トレでのガムの合成に欠けていた。これらの変異株はいずれ４ガムＤＮムり２ス ターに変異的挿入を有していた。他のグループは、インビがではＩリナッカライ Ｐを合成することができなかりたが、基質が提供された場合にインビトロでキサ ンタンガムを合成することができた。これらの変異株はいずれも、ガムクラスタ ーにリンクしないＤＮＡ中に変異的挿入を有していた。これらの変異株を糖ヌク レオチドの存在にりいて試験し、そして糖ヌクレオチドの生合成の５身の段階に 欠損を有することが見出された。 ガムの生合成経路中Ｋｆロックを有する変異株に幾つかのタイプがあることが見 出された。可能性ある生化学的表現型及び本発明者等の観察をこのｑｍ書及び第 ７図に示す、これらの特定の表現温を与える幾つかの変異の地図位飯が示されて いる。 トランスフ、２−セＩ及び未知の欠損 多くの変異株ａｍ溶解智が有機画分への放射性標識の貧弱な取）込みを示し、少 量のグルコースがΔツクグツ９フ１以上に検出された唯一の糖であうた。 ガム画分中にぼりマー物質は検出されなかった。この少量のグルコースがＴＬＣ 及び／又はＨＰＬＣＫよシ示された。この表ｍ型にりいて幾つかの説明が可能で ある。とのクラスにおいて見られるグルコースのｙ−ｔルミ、８４−Ｌについて ３種°類すべての糖ヌクレオチドが存在する場合に見られる非−キサンタン特異 的な又は１追跡不能の（ｖｓｎｅｈａｓ・ａｉｓｌｅ　）　’グルコースＫ１１ ｊ似している。この表現型は、グルコースによる脂質キャリヤーの負荷を許容し ないトランス７８ラーセ夏の欠損の結果であろう、他方、これは生合成の開始に 影智を与える他の遺伝子中の欠損に基き、トランスフ８ツーゼ■の発現に直接又 は閤＊に影響を与えるのかもしれない。 トツンスツェクーゼ鳳 脂質キャリヤー上でのグルコースの有意な蓄積を示す２つの変異株細ＪＩ！溶飾 物が観察された。ダル；−スは脂質中ヤリキー上のセルビオースに重合しなかう た。これらのａ胞溶解物ｄ　ＧＤＰ−マンノース及びＵＤＰ−グルクロン酸の存 在によル影響を受けなかうた。ガム画分に放射性標識された物質は見出されなか りた。この欠損はトランス７８ラー−４＃Ｉの遺伝子内ＦＣあると考えられる。 トランス７ユラーゼ鳳 幾つかのｇ胞溶解匍からの無細胞生合成反応混合物の放射能分析は、ＵＰＤ（１ ４Ｃ）グルコースの存在下で有機画分がよく負荷する（８４−Ｌレベルの３７チ ）ことを示した。３種類すべての糖ヌクレオチドの存在下で、ダル；−スによる 負荷は同じ高レベルてらったが、しかしマンノース又はダルクａ　ｙＷｔｏＩＩ ！ｉＬシ込み社存在しなかった。ガム画分は４９マー物質（セ５ｅａ−ス）が合 成されなかう九ことを示した。 有＆画分からの遊離した糖を’Ｉ’ＬＣＫよ〕分析し、セしてこれらの変異株が 非常に効率的にセービオースを合成することが示された。セＩビオースは有１／ Ｉｋｉｊ分に蓄積した。　ＧＤＰ−マンノース又はｔｌＤＰ−グルクロン酸の存 在は竜ロビオースの蓄積に影響を与えずセ■ビオースがさらに２１工されるよう には見えなか９た。？−れらのデーターは、これらの変異株をトツンスフ、ツー ーｖＩＫ欠損を有することを示している。 トランスフェラーゼｙ 幾つかの変異株細胞溶解−（ｘｓｓｓ（ムＴＣＣＡ５３１９５）からの＃ｉｉｌ 胞溶解物を含む〕は、有機画分中に％ダルコースとマンノースとのモルＪｔ、２ ：ｉヲ有する。　ｋＷｔｌｌｃ連結されたトライマー中間体（Ｗａｎｄ・ｒｓｌ ｌ＊・等（前掲）の米国特許出鳳中に記載されている〕の蓄積を示す、このグル ープの各細胞ＳＳ物のガム画分は放射性標識されたがり）２イマーＩムを含有す る。これらのＲＪ！は、ダルクｇｙ＆ｔを脂質に連結されたオ９ｆナッカライド 前駆体に移行せしめるダ９″：Ｉシルトランス７８ラーセであるトランスフ工ｙ −−ｖｙｏａ伝子に存在する。 トランス７８２−ゼＶ このメイツの変Ａ株はｉｉ　ｊｔ　”？　ヤリャー上にテトラマーオリプサツカ ツイｒを蓄積し、そしておそらく末端マンノース及びピルビン酸を欠く変形され た一すナッカライドを生産するであろう。 ４９メツ−髪 ４リメラーセの欠損を伴う変異株は鮨５！ｔＫ連結されたインクマー組立ｆ−ツ タを蓄積し、セしてこれらを重合せしめることができない、この衣現型は観！！ Ｉされなかりた・Ｉリマツーせのための欠損遺伝子社、負荷無し、又は生物体に 対する致死的表ｖＬ型のごとき異る生化学的表現囚をもたらす′Ｃあろう、Ｉ！ ＃現型を示すかもしれない。 これらの欠損はＧｕｍ＋株中に見出された。増殖の後。 １２．０００ｘｉ、１０Ｃ〜２０Ｃにて３０分〜ＩＲ閲にわたる培養液の遠心に よシｆリナッヵライｒを収得した。上清から沈澱したガムを加水分解の後にＨＰ ＬＣＫよシ分析した。加水分解されたガムの１！ＰＬＣ分析が示すところによれ ば、幾つかの変異株をピルビン酸を伴わないキサンタンガムを生産し、そして幾 つかの変異株は２１：１のモル比でダルコース／マンノース／グルクロン酸を含 みアセテートを伴わないキサンタンガムを生産する。インビトロデーターによ〕 これらの結果がａｉｉ！された。これらの変異株は、それぞれケタ２−ゼ又はア セチ２−ヤを欠いている。 例３ Ｎ３Ｆｉ、λ１０５９中Ｘ、カンペストリスの全ｒツムＤＮムのライブラリーの 調製を記載する。 Ａクテリオファージλ１０５９は、ＫａｒｌＩ等、　Ｐｒｅ　＊Ｎａ１ｌ　ｍム ｓａｄ　＊　８ｅｉ　、υ、Ｓ、ム、７７：５１７２−５１７６（１９８０）（ 引用によシこの明細）ＩＩＫ組み入れる）によシ造成された飯換りｐ−二ンダベ クターである。 このファージの染色体は２ｇ１ｈのＢａｎ　１１１　地位によシ境堺が定められ る１　４　ｋｋの中央領域を含む、この中央ＢａｍＨ１断片（以後、スタッファ −（５ｔｓｆｆｅｒ　）断片と称する）は７アージの増殖のために必要な遺伝的 機能を含有せず、そしてそれ故に除去しそして外来ＤＮムと飯き換えることがで きる。ベクターの２りのアームはλの１１［製及び成熟のためのすべての必須の 遺伝的機能を含有する。ベクターＤＮＡの左アームと右アームとの間に６　ｋｂ 〜２４ｋｂＣ）サイズのＤＮム断片を連結することによシ生存可能な７ア一ジ粒 子が生成される。左アームと右アームとの相互連結は生存可能な７ア一ジ粒子を もたらさない、ｒツムのサイズが、７フージヘ、ドに適切にノッキングされるた めには小さ過ぎるからである。 λ１０５９Ｃ）−スタッフ丁−１断片は左側のプロモーター（ｐＬ）の制御のも とにλｒ＊ｄ　（エキソ及びＩ遺伝子）及びｒを担持する。これらの遺伝子はベ クターＫＳｐｌ＋表現型を付与する。すなわち、７アージはｔｏｅム一　株で増 殖することができるが、しかしバクテリア７アージ１’２に対して河原性である 株では増殖することができない、ＰＬも１スタツフ７一−Ｗｔ片上に位皺するた め、８１表表現型発現はベクターの左アームと右アームとの間の１スタッファ− １の方向によって影替を受けない。 ＤＮムの屍５／！が、高分子量ＤＮム断片のおよそ２ノメム特表千１−５０２５ ５５　（ｌｊ） な集ｄを生じさせるために９ｔＪ来的な方法である。なぜなら、ζＯ酵素による 勤裂のための！！歇部位は平均して２５６　ｂｐ毎に１’Ｊｂ存在するからであ る。外来ＤＮムの挿入部を含有する生存可能な７ア一ノ粒子は５ｐｓ−表現型を 発現し、そしてそれ故ＫＰ２河原株で増殖するが、しかしｒ＠ｃムー株ては増殖 しないであろう。 高分子量（１ｏ　ｏ　ｋｂよシ大）ｒツムＤＮムを２Ｌのみ入れＡ）ＧＣ記載さ れているような５ａｌｔ・及びＭｍｒｌａＫよシ記載された方法を用いて単驕し た。高分子量のＸ、力ンペスＦリスのｒツムＤＮムを、主トシて１５〜２０ｋｂ Ｃ）サイズを有する断片の集合を生じ３ム消化によル生成した断片を１０−４０ ％シ、−クロース！ツゾエント上で十分に分画して１５〜２４ｋｂのサイズとし た。小アリコートを（Ｌ４−アガ四−スｒル上で泳動することによりＤＮムのサ イズをｉｉｇした。 Ｃ５ＣＡ勾配中での平衡遠心によシ精製された７ア一ジ粒子からファージλＤＮ ムを雄隘した。λ１０５９化によシ、左アーム及び右アームが１スタッファ−” 断片から分離される＠　Ｓａｌ　Ｚ消化によ）１スタ、７アー１がさらに開裂さ れ、そしてこれｋようて連結中でのクローニングベクターの再構成が１ｆ［ｉｌ ａされる。 裂によシ生成した１５〜２４　ｋｂ断片０．６ｆｉｌ　と混合し、そして〒４リ ガーセによ〉連結する。ペーリンガー・マンハイムから得られるλパッケージン グミックスを用いて、連結されたＤＮムをインビト！２パ。 Δ、ケージされたＤＮムの稀釈物を用いて３ａ類の異るＥ、コリ株、すなわち、 非制限株に！１１３９２゜２２２ニア７８−７８２（１９８３）（引用によシこ の明細書に組み入れる）によシ記載されている。１Ｍ３９２の感染はＩ　Ｘ　１ ０’のタイター管与え、他方ｘＢＯ及びＱ　３　Ｓ　９Ｄ感染はそれぞれ６　Ｘ 　１０’及びり、２Ｘ１Ｇ’Ｃ）タイターを与えた。１Ｍ３９２でのタイターは 全生存ファージの日数である。　ＫＲＯでのタイターはＸ、カンペストヲスＤＮ ムの挿入部を有しない７１−ジＯ数を示し、他方Ｑ３５９でのタイターはＸ、カ ンペストリスＤＮムの挿入部を含有するファージの数を示す。 ＢａｍＨＩ及びＳ＆ＩＩＫよるベクターＤＮＡの二重消化によル、再連結現象に よる２１０５９粒子の有意な数の形成が回避されているはずであるから、ｘ、カ ンペストリスＤＮムの挿入部を含有しない生存７アージの数が比較的大であった ことは驚くべきことであった。 さらｉ（、ＫＲＯでのタイターと９３５９でのタイターを加えることによシ決定 された生存７アージの合計数が１Ｍ３９２の感染から決定された全生存ファージ のおよそ５分の１であったことが注目される。これらの結果の１つの説明は、挿 入ＤＮＡを有する又は有しないファージのプレート効率が、１Ｍ３９２での場合 に比べてＫＲＯ及びＱ３５９の両者での場合約５分の１であることである。言い 換えれば、ｘ、カンイストリスＤＮムの挿入部含有するか又は有しない７アージ の数は実際には、　ＫＲＯ及びｑ３５９の合計タイターよシも５倍大である。 殖する）１−ジの比率を決定することによシ試鎗した。 １Ｍ３９２に増殖する単離されたｆシーｌ４８個中に存在するファージを楊枝に よシ１ｍの無菌緩衝液に移し、そして次に、　Ｑ３５９ｆｉｉｌ！、ＫＲＯ細胞 及びＫＭ３９２Ｍ胞（ＤＩ−）（ｌａｙｍ　）上Ｋｆリントした。 単離ファージのすべてが１Ｍ３’！！上で増殖し、６２−が９３５９上で増殖し たがＫＲＯ上では増殖せず、そして３８チがｘＲＯ上で増殖したがＱ３５９上で は増殖しなかりた。すなわち、ｘ、力ｙ４スＦリスＤＮムの挿入部を担持する、 ＫＭ３９２上で増殖する７アージの数は６２−でありた、この値はｌｌｉ　６　 ％　（Ｌ５Ｘ１０’／Ｌ８Ｘ１Ｇ’）の予想値とよく一致し、そして挿入ＤＮＡ を含有する生存ファージの実鼻の数は６×ｌＯであることを示している。 Ｘ、カンペストリス染色体が好！１１ＩｋＫり藁−ン化された゛ことを示す追加 のに拠は、１Ｍ３９２及びＱ３５９上では増殖するがＫＲＯ上では増殖しない６ 缶の独立のり一一ン中に存在するＤＮムを琴線することＫよシ得られた。各単離 された７ア一ジ粂色体のナイノはλ１０５９の染色体のナイノよ）わずかに大ｔ −ことが見出され、各クローン中に存在する挿入部が１４ｋｂ　ｏ−スタ、７ア ー′断片よ）大きいことが示されの制隈−声一ンを有することを示した。 ｉ４ この例は％　ＸＩ）力ンペス）リスＤＮムのクイックリーのスクリーニングを記 載し、そしてキサンタンの生合成に関与する遺伝子のｂつかがり２スターを形成 している（群がっている）ことを示す。 キサンタンガムを生産しな％／％Ｘ、カンペストリスの変異株を丁ｍｌＯ変異誘 発を用いて単離した。Ｔ凰１０によシコードされているテトラサイクリン耐性を 用いて、３５個のｇｕｍ：：’Ｔｍ１ＯＴｍ１ＧＯ？丁ｍｌＯ及び染色体ＤＮＡ を含有する制限工ンドヌクレアーヤ断片をクローニングした。τｍＩＯ挿入部位 を挾むこれらの染色体配列は、λゲノム２イツ２リー中にクローン化された野性 型Ｘ、カンペストリスＤＮム配列を同定するため、及びｇｕｍ：：丁ｍｉｏ変異 の物理的マツプを調製するために使用されるハイツリ〆イゼーシ。 ンｆローブを提供した。 例３に記載したようＫして、ｇｕｍ：：ＴｎｌＧから染色体ＤＮムを抽出し、そ して精製した。このＤＮムを制この酵素はＴｍ１ＯＰ３をＲ裂しない、従りて、 １つの染色体Ｐｓｉ　Ｉ断片社、挿入部に瞬接するＸ、カンペストリス染色体Ｄ ＮＡ　Ｋ融合した無傷のＴｍ１Ｏ蚤ｇを含有するであろう、消化されたＤＮムを Ｐｓｔ　Ｉ″ｔ’ｆｆｉ化されたプラスミド１ｉａＦ　１０１Ｇに、次の＆にし て連結した。 反応物の７９−一トをアガ■−スｌ”ｈ−上で泳動せしめることによシ消化をモ ニターした。典星的な連結反応において杜、約８　ＪＩＪＦのｆｙスミド及び約 ５Ｊａｉｌ　Ｏ染色体Ｄ）ｉｆムを合計容量ｔ　ＯＯｐＬ中で浪合した。約２０ ユニツトのＴ４ＤＮムツガー−ｖ（品、−・インダタンド・パイオラツス）を加 え、そして１２ｃＫて約１６時間インキ、ベートした。形質転換の前に反応物の ７リコートをアｊｗ−スグル電気泳動するととｋよ）、連結の１ｉｊｉを橢定し た。 連結住成物を使用してＥ、コツＬＩ３９！を形質転換し、ストレグトマイシνに 対する耐性（Ｒ８ＦＩＯＩＯに担持されている）又はテトラナイフリンに対する 耐性についてスクリーニングした０次に、全連結反応物を用いてＥ、コリＬＥ３ ９２を形質転換した。 テ・ｔｒ形質転換体についての返択社、１８Ｆ１０１００大Ｐｓｔ　Ｉ断片（こ れは複製機能を提供する）及び〒１１０を含有する染色体ＤＮムのＰｓｉ　Ｉ断 片（これはテトラサイクリン耐性を提供する）Ｏ両者を含有する組換プラスミド に′）いて選択するはずである。形質転換方法については、連結混合＊ｔエタノ ール沈澱せしめ、５０ｓＬのに衝液に再Ｂ濁し、そして約３Ｘ１０’／−の＃１ ｋＦｔｏ細胞（Ｃ畠ｃｔ、処理によりて形質転換−＝ンビテンＦにされたもの） α２〜ＬＯｓＪＫ加える。 この混合倫を氷上で４５分間インキ、ベートし、４３℃にて２分関し−Ｆシ、、 ｙりにかけ、ルリア（Ｌｍｒｉａ　）培地で５倍に稀釈し、３７℃にて６０分間 インキ、ペートシ、そして最後ＫＩｌｉｌＬ、そして適切な薬剤を含有する培地 上Ｋｆシレーする。 Ｔａ１ｅを含有する染色体ＤＮムとのナベての遅結吻が、り費−ン化された’ｒ ｍ　１０　Ｄ）ガムをｍ持する組！１１！乏スミドを含有する幾つかのテＦラナ イクリン耐性形質転換体をもたらした。Ｒ８Ｆ１１０のみによシ、ＤＮムを用い ないで、そして最も有意義には、Ｔｍ１Ｏを担持しなｈ８４−Ｌ　５ｔｙ−１０ １から抽出された染色体ＤＮムを用いる連結混合物による対照形質転換からはテ トラナイタリン耐性形質転換体は得られなかりた。しかしながらこの対照連ＩＭ Ｋおけるストレプトマイシン耐性形質転換体の頻度は他の連結から得られるスト レグト！イシνに性形質転換体の頻度と同等であうた。 テト２ｔイク９ノ耐性形質転換体を、〒１１１０を担持する組換プラスミドの存 在について分析した。コシ＝を拾い、そして１０　＃／−テトラナイクνノを含 有するＬＢ中で一夜増殖せしめた＠　Ｃ１＋Ｉｖ・１１及び（１９６９）（引用 によルこの明細書に組み入れる）によル記載されたｔｓ準的透明紙胞溶解物技法 を用いてプラスミＰＤＮムを調製した。適切′＆翫隈エンドヌクレアーゼを用い る消化によ〕ｆラスミドを分析した。ｆラスミド上のＴｍ１ＧＯ？）在を試駆す るため。 １５　ｋｋの２つの内部１１１１ｍｄ　ｌ断片を含有する。従りξ、ドはこれら ２つの断片を生ずるべきである。さらＲ８Ｆ１０１０に由来する＆１ｋｋ断片＋ ９．３　ｋｂよシ大であるべき第二のより大きな断片をもたらすべきである。こ れは、それ自体９．３ｋｋの長さを有する、Ｔｍ　１０を含有する染色体ＤＮム のＰｅｔ　ｌ断片である。 試験された捻とんどすべてのプラスミドがこれらの基＊によれｉｆ　Ｔｍ　１　 Ｇを含有しているようでありた。 １余分”の断片は多ｌ！遅結現象の結果でらろう、こして使用すれは、注目の遺 伝子からの配列を含有すグが起とるであろうから、これらの余分の断片は望まし くない。 余分のＰｓｔ　ｌ断片を除去するため、次Ｋ　Ｔｍ　１０含有断片を１再り四− ン化”した、　Ｃ５ＣＬ勾配によシ精製されたｆ２スミドを騎製し、そしてＰｅ ｔ　ｌで完全消化した。消化生ｇ智を低ＤＮＡ撫尻（約１０　ｓｌ、乙−）にお いて連語した。この比較的ｔい濃度にシいて、はとんどの連結現象が線状断片を 濃化せしめるはずである０時としてグイマー環が形成され、セしてよシ高次のマ ルチマーはまれである。 反応浪合物のアリコー＞ｏｒＡ−電気法！ａＫよシ連結の程度を一定した。一般 に、マルチマーの形成はほとんど観察されなかりた。連結反応物を用いてＥ。 コＩＦＬＦ：３９２を形質転換し、そしてテトラナイタリン耐性形質＠換体を選 択した０次に、これらの形質転換体中区存在するｆ２スξドを分析した。これら はほとんど常に所望の組換体構造を有することが見出された。すなわち、これら Ｆｌ、２（Ｅの、そして２偽のみの、Ｐｅｔ　ｌ断片を含有しておシ、１つ社羽 １１０１Ｇ由米４Ｄ＆１ｈｂｗｉＴ片？６）そして第２はＴｎｌＧと隣接ｒツム ＤＮムとを含有するＸ、カンイストリス染色体断片である。９．３ｋｂよシ大き い断片でありた。 とれらの得られる組換体ｆラスミドをｐＴＸ＊−一と命名した。ここで、ｉはテ トラサイクリン耐性を２１ＬＩｔ：し、そしてＸｍｍｍ　は、そこからテトラサ イクリン耐性がクローン化されたｇｌｓ論：：Ｔ富１０Ｃ）＆書号である０例え と、ｆラスミ）”ｐ”ｒＸ６５５＊、［１１１ｍ　：：　Ｔｍ１Ｏ変異株ｘ６５ ５からのテトラナイフリンｂ性沫定基をりｐ−ユングするととによ）ｓｌ導され た。 ｘ６５５と称するＧｗ論″″変異株は、正常なインタマー構造ではなくトライ！ −′ｌ＃＃造のサツユ”ｙトを有するＩｖｔツカライドを生産する。仁の変異株 はＶａｍｄｅｒｓｌｉ＊＊等（前ｔＲ，＞ＦＩＣより一層十分に記載されている 。との変異によ）定義されるガム生合成遺伝子は、ガムの生合成を行うように同 等に発現されそして制御される遺伝子のクツスターの部分のようである。との可 能性を試験するため、プラスミドｐ’ｒｘｓｓｓとハイツリメイズするＸ、カン ペスト９スＤＮムを担持するλ１０５９り■−ノし以後、λ６５５（ト）と称す る〕２６個のセットをＪＩＬ離し、そして精製した。遺伝子バンクは増偏されて いないので、各り冨−ンは独立の連Ｍ３Ａ象に由来するＸ、カンペスト９スＤＮ ムを含有して−た。この効果ａ、Ｘ６５５変ＪＩＫよシ定義されるガム遺伝子を 担持するゲノムのへ域内で染色体にそりて１歩く２ことである。各クローン化断 片は約１５　ｋｂであるから、この１歩み′は約３０　ｋｋをカバーする。 次に、２６ｆｍの７アージク四−ンの竜、トを、今度は３５個のｇｏｗｎ　：： 　Ｔｍ　１　Ｇのそれぞれからのクローン化ｆローツＤＮムとハイツリメイズせ しめた。 ３５ｓのプクスミＰｆ′ｃ１−ツの内２４＠が、このセット中の２０個の７アー ジクローンのすべて又は畿りかとハイツリメイズすることが見出された。これら の結果は、ガム遺伝子の少なくとも幾つかは、ｘ６５５変異によ）定義されるガ ム生合成遺伝子、トランスフェラーゼ■を含有するＸ、カンペストリスのゲノム の同じ領域中でクラスターを形成していることを示している。 クレーン化されたＰｓｔ　１断片の周辺に集中し先約３０　ｋｂのＸ、カンペス トリス染色体ＤＮムを、ｊｋ団として含有する。これらのファージに対して他の ３４個のｐＴＸｆラスミドをハイツリメイズせしめることによ）、他のＧｍｍ″ ″変異株のいずれがこの３０　ｋｋセグメント内Ｋ　Ｔｍ　３０挿入を有するか が決定された。 ３５像のｐＴＸｆラスミドのすべてをニック）フンスレーシ、ンによシ放射性１ １１ｋＬ、そして負対照として役立つλ１０５９りｐ−二ングベクターＤＮム、 並びにフィルターに結合したλ６５５（へ）７アージＤＮＡＫハイツリダイズせ しめた。 ニツクトツンスレーシ、ンは％５０　ｍＭ　Ｔｒｌ霞−Ｈｃｔ（−７，５）、　 １０ｉＫＤ？ム、１　ｍＭ　ＤＴｉ、及び５０ｓｌ／ｍｌのＢ８ム（シグマ・イ ンタックス、フックシ曹ンＶ）中で行うた。典温的な反応容量は３０　ｐＬで１ ３１、そして一般にα４μＩのＤＮムを加えた。コールドｄＮＴＰはそれぞれ２ ０　ｉａＭ存在し、そして５２Ｐ−律ｊｌ　４）ｉｆＰはそれぞれ３Ｌ３μＭ存 在した。各ホラ）　ｄＮＴＰと共に合計８０７Ｃ１のＢ１１が添加された。 この反応混合物をＤＮムアヤＩ　（１ｓｔの（ＬＸ月ｌ−溶液）Ｋよ）３７℃に てｌ￥ｆ間インキ、ベートした。 次に、この反応混合物Ｋ　１７４　ＯＢ、　：２９　ＤＮＡＩＩＪ／クー−ｖ　 ｌ　［Ｒ１＊ｂａｒｄｔｅａ等（１９６番）Ｋよシ定義される場合５エニツト］ を加えた。３７℃にて３０分間のインキ、ページ、ンの後１反応混合物をキャリ ヤーＤＮＡと共にエタノール沈澱した。ベレットな７０チエタノールで洗浄し、 真臣乾繰し、そして２００ｉｔ１　４０１　０　ａｍ　Ｔｒｌｓ　−ＨＣＬ　（ Ｆ’　８、Ｏ）、　ＬＯ！ＥＩＭＥＤＴム中に再繍濁した。 次の方法によりハイツリダイゼーシ、ンヲ行、た。 Ｄ１マ量寥等（１９８０）の方法を用いてニトロセにロースフィルターに結合し た２　ＤＮＡを胸胸した。これらのフィルターを、５Ｘ８ｇＰ１ｅ、５Ｘデン＾ −ト溶液（Ｍａｍｌａｔｉｓ等、Ｓ掲）、ｏ、ｘｓｓｎｓ及び５ｏｓｏ＊ルムア ｔｌ’（Ｚｏｏμυ−のｆ４！Ｈされ音波処理されたクシ胸腺ＤＮＡを含有する ）中で、揺〕器上で。 ４２℃にて４〜１６時＠ｆレハイツリダイズせしめた。ハイツリメイセーシ、ｙ 反応自体は２　ｘ　５ＳＰ１ｅ。 ｌ×デン＾−ト湛液、５０チホルムアミド（１００ムレ−の変性され音波処理さ れたクシ胸腺ＤＮＡを含有する）中で行った。放射性標緻された　Ｐ　ｆ　Ｗ　 −ツＤＮムをαｌ　Ｎ　ＮａＯＨ中で変性せしめ、セして１／１０金物ｄ当ｊ） 　１０’　ｅｐｍ　の導入された　Ｐを添加した。 ハイツリダイセージ、ン混合物を４２℃にて１２〜２０時間％揺）器上でインキ 、ベートした０次に。 ７４ルターを室温にて、２　ｘ　５ＳＰＫ中で１回、そして次にα１　ｘ　ｓｓ ｐΣ中で１回洗浄した。フィルターをプツトマン３ＭＭペーパー上にツ四ットし 、そして空気乾燥した０次に、フィルターを＝メックＸ−０Ｍム〒ム′ＩＬフィ ルム上Ｋｍき、そして４〜１６時間−７０℃にてあ％Ｌ（、七不゛ン、二Ｊし） −７フ２弓纂蔑λ７ンーンＬデ已すし１２゜３５１！のｆラスミド中２５個が２ ６５５（ト）７アージＤＮムの幾つか又鉱すべてにハイツリメイズすることが見 出された。すなわち、ｇｕｍ　：：　Ｔｍ　１　Ｇ変異のかなシ大きな部分（約 ６０−）がこのクローン化３０ｋｂ＠域内に位置していたが、有意の数のものが このＤＮＡ断片外に位置した。 ハイツリメイゼーシ、ンｆ−夕は、どのブー−１がハイツリメイズし、そしてど れがハイツリメイズしないかに基いてα６５５（ト）７アージの分類を可能にす る。これらのハイツリメイゼーシ、ンｄターンは各７１−ジ中にクローン化され たＤＮＡセグメントを反扶する。りｐ−ン化されたＤＮＡ断片のそれぞれはＸ、 カンイストリス染色体の連続する単一片であるから、グツふ中の変異の順序がハ イツリダイセージ。 ンのクラスから推定された。特定のＤＮＡ　ＷＲ片の存在又は不存在は特定のｆ ｗ−ツへのハイツリダイセーシ璽ンの成否とよく相胸する。 餉＠地図及びハイツηダイヤーシ、ンデーターは。 変異Ｘ７０８ｔＩＸＸ、＊ｙ４ｘ）９ｘＤ）ｆＡｏ／＊−ｙ化３０ｋｂ−にダメ νＦの一端の非常に近くに位置することを示した。従うて、ｐｔｘｙｏｓプ２ス ミドに＾イツ号／イオする組換ラム／７アージを単離することによりて、ｘ、カ ンペストリスの染色体は１歩かれた（　ｖａｌｋｅ纏）’、２６＠のこのような 組換体を拾い。 そして上記の制限マツピングによ）分析した。このセットの７アージがクローン 化領域を約８　ｋｂ延長した。 次に、３Ｇ１１すへ”Ｃ０ｐＴＸｆ’）ｙ、　ＲＰ７”ｏ−ｆを、λ６５５に） ７アージとのハイツリダイセーシ曹ンにおいて用いられたのと同じ方法を用いて 、このセラ）の組換７アージとハイツリメイズせしめた。Ｍじ２５＠のシテＸｆ ｌ−ツがλ７０８（支）７アージの幾つか又はすべてにアニールし、そしてλ６ ５５（イ）７アージにハイツリメイズしない同じセットのｔ賞−ツは２７０８→ ７アージのいずれに％ハイツリメイズしなか＊＊＊　再Ｕ、２７０８（ｅ７ｙ− ’）Ｏ１Ａ’ｌｌ地図は、特定のＤＮＡ断片の存在又は不存在と特定のプラスミ ドｆ！−１へのハイツリダイセーシ、ンとの相ｇｉ１ｍ係を許容した。従りて、 ！！約すると、これらのハイツリダイ４１−シ＠　７から、２５の変ＪＩ７！Ｉ ｈ）２ノスフ８ツ一ヤｙ″″株ｘ６５５中に担持された変異の近傍のＤＮＡ領域 にり２スターを成している（ＩＦがっている）ことが見出され九、１Ｂ個の変異 はこのＤＮＡ領域に位置しなか９た。これらの変異の幾つかは上に記載されてか ）、そしてｌ１ｅｔｌａｅｂ等＜＊掲）Ｋよ〉記載されている。 この例はクラスターを形成したガム住金成遺伝子を担持するクローン化ＤＮＡ　 Ｏ餉１ｉ＆地図の作成を記載する。 Ｔｍ　１０挿入変異の集合によ〉定勉される多数のガム遺伝７ｆ−″ｂｈＸ６ｓ ５変異の位置の周辺にり２スターを形成していることが見出されたので、これら の遺伝子を担持する！、＊ｙ４ストリスの領域を％Ｉｌｌ限酵素地図の作成によ ）さらに！Ｆ＃徴付けた。これは、ガム遺伝子クツスターを担持するオーバーラ ツプする断片のセットを構成する２６ｆ１の７フージクローンのそれぞれ中に存 在するクローン化ＤＮＡのｔ！Ａ＠＃ａ地図を作成することによシ達成された。 ファージクローンのそれぞれはり田−ン化された１、カンペストリスＤＮＡのは かにα１０５９Ｄ）ガムを含有するため、ｘ、カンペストリスＤＮＡからのλＤ Ｎムの識別を容易ＫＭＩ能にする１！ｌＩＩ限酵素を用いて餉隈酵素分析を行り た。一つのむのような酵素はＢａｍＨＩ″′ＣあるλＤＮムはｔＫ２つのバンド 中に存在する。２０ｋｋと同じか又はこれよシ大きい１つは左アームからのαＤ ＮＡを含有し、９ｋｂと同じか又はとれよシ大きい他方は右アームからのλＤＮ ムを含有する。 ２６個の７フージクｐ−ンのそれぞれから単離さ片のナイノは２０　ｋｂよシ大 きなものから（Ｌ　５　ｋｋよ）小さなものまでちるので、消化物を低チアｆ１ ：１−スｒル（大断片を分離するため）上でそして高電圧において（最小の断片 の拡散を減少せしめるため）泳動せしめた。グルはしばしばα４−のアｆｖｘ− ス議度を用い、そして１００Ｖにおいて約５時間泳動を（ナイノ標準として使用 するため）、及びλ１０５９ＤＮムノＢａｎ　ＩＩ　Ｉ消化物（サンプル消化物 中のベクターＤＮＡの位置を示すため）を含有した。をン！Ａ−消化ケ中の各制 限断片が泳動した距離を扼定し、そして野性型λＤＮムの消化物から調製した標 準曲線を用いて分子ナイノに換算した。 るＤＮＡのＢａｍＨＫ消化物によ、シ生じた！Ｆｉ隈ノターンを分析することに よ）、７アージクレーンのそれぞれ中のオーパーラ、ｆするＤＮＡの領域を決定 した。 オーΔ−ツッグのｄターンから％＠消化物中の制限断片の順序を決定し九（第２ ｖＡ）。 ！７０８変異の位置がり謬−ン化ＤＮムの１ｍＫ非ｔＫ近いため、ハイｆ９ダイ ズしなかりた１０個のｐ　ＴＸ　ｆｖｓ　−ｆ　ＤＮＡ　Ｏ１つ又はｗ数は＃− ／’−ｔｙグする７アーノクローンのセット中に含まれるＤＮＡの領域のすぐ外 １１に位置する可能性がある。遺伝子パンクからのＦＴ！７０８とハイ１リダイ ズする１セツトの２クローンを単離するととくより、この可能性を試象した。ζ うして、ガム遺伝子クラスターに近接するＸ、力ンイスト９スＯｒツムの領域を １７０８中に存在するＧｗｍ−変異の位置を運えて延長した。これらのり四−ン 中に含まれるＤＮＡについてＢｍｍＨＩｔｌ＆ｌ縄地図を作成した（第３図）。 α４−アｆｖｘ−スグル上で検出されなかりた非常るか否かを決定するため、全 りｐ−ノ化領域に白米するＤＮＡを含有する選択された７アージクローンなりｍ ｍ１ｉｌで消化し、そして５％／リアクリルアミドｒル上で泳動せしめた。この グルｈ３０ｂｐという小さい断片を分離することができる。この実蝕により。 ３００　ｈｐ及び１９０　ｈｐのナイノを有する。今まで検出されなかりた２個 のＢａｍＨＩ断片の存在が示された。 これらのデーターの他の分析によＪｌ、３００ｂｙ断片はＬ　Ｏ５ｋｂ断片とＬ ４ｋｋ断片との間に位置し。 そして１９０ｂν断片は＆８ｋｋ断片と１．０５ｋｋ断片との間に位置すること が示された。　Ｉｌａｍ　ＨＩ　ＩＩｉ限地図データー及びグローブハイ２９／ イゼーシ、ンデータ一のすべてを組み合わせて、キサンタンガムの生合成Ｋ１１ ｌｌ与する遺伝子のクラスターを担持するＸ。 力ンイスト９スの染色体の領域の物理的及び遺伝的地図を作成した（１！４図） 。 例６ 例６はλ１０５９ライブラリーからのガム遺伝子クラスターＤＮＡの広宿主域ベ クター）ＭＹ　７９へのナラクロ一二ングを記載する。 ベクターｐｋＫＷ　７９は、Ｗ・・ｄ等ｔ　Ｊ　＊　Ｂｈ　ｅ　ｔ　ａ　１４　 ”１４４Ｂ−１４５１（１９８１）（引用によシこの明細書に組み入れる）によ シ詳細に記載されている。要約すれは、これは、広宿主域Ｉｎｃ−ＱゲラスミＰ Ｒ８ＦＩＯＩＯ及び古典的なＥ、＝ｒす・クローニングベクター）Ｂ１３２２を 含んで成るキメラｆ２スミｒである（第５ａ図を参照のむと）　＊　ｐｋＫ９／ 　７９は広範囲のｓａのグラム隙性細ＭＫ＃行し、そしてその中で増加するとと ができ、そしてＰ１１１１３２２中に存在する有用なりレー二ング部位の多くを 維持している。このゲラスミＰ（ＤｐＢ’１Ｌ３２２ＷＡ分中のり四−ユング部 位を主として使用し、そして特に％テトーｙ？イク９）耐性遺伝子中に存在する 部位を使用した。 ２１０５９７アージクローン６５５（わけ本発明者等のＴ＊　１０変異によシ定 義されるｊＡ遺伝子を担持するＸ、カンペストリスのｒツムの完全１に領域を含 有する。７アージクローン！中のＸ、カンベスト９スＤＮＡをｆラスミドクロー ニングベクター）ＭＷ　７９　Ｉ’ｍ　ｔブクロー二ンダした。 λりシーン６５５中から単離したＤＮＡの部分ＢａｍＥＩｔｌＩＩ化物をＰＢＲ ３２２及びｐｋｌＮ　７９０Ｂ−ａ−Ｉ限定消化物と連結した。連結されたＤＮ Ａを用いて区Ｍ３９２を形質転換し％ＡｍＰ？形質転換体を選択した。 合計１２００ａ！のＡｍｐｒ形質転換体をテトラナイフリンを含有する寒天グレ ーシ上にプリンシしてどの形質転換体がテ・Ｂ８であシ、そしてそれ故ｐｃ　ｐ ＭｒＷ　７９の丁・を遺伝子中に位置する：５−＝−りＢａｎ　１１　Ｉ部位に 挿入部を含有するらしいかを決定した。６０＠のＡｍｐ’Ｔ＠ｔ″形質転換体を 阜離し、そしてストリークーチアガロースｒｋ上で泳動せしめるととによシＩ。 カンペスＦ９スＤＮムＯ存在及び範囲をｉｉ認した。 単離されたプラスξｒの大部分が挿入ＤＮムを含有していなかうた。しかしなが ら、１９個が挿入部を含有することが見出された。１９個の内９個が単断片挿入 部を含有しており、他方１０６は２個以上の断片の複合され九挿入部を含有して いた。クローン化Ｄ）ｉム中に２個以上のＢｍｍＨＩ断片が存在する１０便すべ ての場合において、これらの断片はλクロー０ＩＩＡ序が正しいことの独立の証 拠を提供する。右端のＬＯｋｋ断片を除き、λクローン６５５α）中に存在する キナントモナスＤＮムのナベてがナックローン誘導体の１又はＩｌｌ空中示され る・ Ｌ　８　ｋｂ断片又はＩＬ５ｋｋ断片（これらは２りｐ−ｙ６５５（Ｉ）中には ｔまれない）を含有するｐｋｎｉ７９のクローンを３１　ｋ　ＣＪ呆腋において 、ｌクローン６５５てｌ＊擬した。こうしてｐｌｎＦ　７９中にクローン化され たＸ、力ンベス）リスＤＮＡＩｔ片の代表例をｊＩｓｂへにｂｂ　）セグメンＦ をＰＭＷ７９　Ｋ・クローン化した。このクロー二ンダにおいて行われた方法は 次の過〉でありた、７アージλりｐ−ン６５５＠（ｊｌ！２図）ＤＭＡ異る配列 を切断するがしかし同一の付着末端を生じすることができる。２！結生成物を用 いてＥ、コリを形質転換し、　ｐＭＷ　７９によルコードされているアンピシリ ン耐性にりいてスクリーニングした。８８ｍの−ｐｒ形質転換体をテ）２ナイク シン耐性にりいてスクリーニングし、そして７５個の丁・−単離体な見出した。 　）ＭＷ　７９０ｍｍｍＨＩ−Ｈ１ｍ４ｍ領域へのクロ一二ンダがテトラナイフ リン耐性の不活性化をもたらすｅ　Ｈｉｎｄ　ｍ及び！ｌａｍＨＩ末遍は一層に 連結されてグラスｔＦを再シールすることができず、再種化ＯためＫはＤＮム断 片の挿入が必要であるので％　Ｙ＠ｔ’形質転換体が高極度で生ずる。６個ＯＴ ・−形質転換体のｆラスミドを分析した。不規＠Ｉｋ明細胞溶Ｓ物をＩＩ　！Ｉ Ｉ　Ｌ　、　Ｂａａ　ＨＩ　″ｅ消化し、　そして７ｆｔｘ−Ｘｒｋ上で泳動せ しめた。２個の形質転換体が所望の断片を担持するｆラスミドを有することが証 明された。 １つの単一体を多量ｆ２スミド調製のために増殖せしめた。このプラスンドＤＮ ムをＣ５ｃＬ＠度勾配遣心により精製し、そして種々の餉隈エンドヌクレアーゼ 消化によ）再分析した。このｆツスｔｒｃ今ｐＸ２０Ｇと称する）は、これらの Ｉｍ＠エンドヌクレアーその切断ｄターンによ）ｉＥ男する場合、第６図に示す ように期待された構造を有していた。 断片をり田−エンダすることを試みた。１１！製した混合物を用いてＥ、コリを 形質転換し、中は！Ｐムｐ１について選択し大、１６６偏のＡｍｐｒ形質転換体 をテトラナイフリンに対する耐性にりいて試験し、そして４９１１Ｏ？＊ｔ”早 離体を見出した。これらの内１８個からの！ツスｔＦ’ＤＮムを単離し、そして 注目のＢｇｌｊｌｆｒ片を担持すると思われる１つの組換７＃ラスｔＰを見出し た。この株から大量の透明１ｋｌ！Ａ胞溶解物を講良し、そしてＣｍＣＬ勾配に よ）！ラスミｒｍ仏をＩＩＩＩした。その後の分析によシ、このｆラスミドは注 目の断片を有するが、しかし第二の余分のＢｇｌ冨断片を同様に含有しているこ とが示された曇この思いがけない組換体０＊＊が一層有用なナックローンを造成 する機会を提供した。偶然にも、ζＣ１ｍ　ｌ及びＢｇｌ　ｌによシ消化しそし て次に、ｆム遺伝中に連結する機会を提供した。この造成によシ、グｌ）Ｘミド 中に存在するり謬−ン化Ｄ）ｉムはＢｇｌ　１部位を越えて２　ｋｂだけ延長さ れ、この余分ＯＤＮムは遺伝子置換実験を促進するのに有用でありた。さらに、 この造成物はクローン化されたキナントモナスｍ偽内に３−二−りＨｉｎｄ璽及 びＢｇｌ　１部位を有していた。 ｐＸ２０７と称するこのｆ２ス電ドの構造を第６図に片をｐｘｚｏｙＫ挿入し、 ｐＸ２Ｇ７０小（２ｋｂ　’）ドｐｘ　２０７をこれらの両酵素によシ消化し、 そしてよる二重消化によ）形質転換体中の組換グラスミドが選択される。なぜな ら、Ｂｇｌ　ｌ末端はｅｌｍ　ｌ末端に連結されることができず、そしてそれ故 にＰＸ２Ｇ７社第二〇Ｂｇｌ　Ｉ　−Ｃ１ａ　Ｉ断片がそれに連結されない＠） 再衰化することができないからでちる。確かに％試験された１２＠の形質転換体 のすべてが組換ｆ２スミドを含有してシシ、そしてそれらの内の１個が目的の組 換体であることが証明され九、このグラスｔ）’ｐ１２０８を３１６図に示す、 とのｆツＪｔＦは、ｐＸ　２０９と称する目的の大ナデク四−ンを生成せしめた 。 ｐＸ　２０８プラス？）’ＤＮＡを用１で消化して線状化した。欠けている本５ 　ｋｂ　Ｂｔｌ　＊断片を分取用アガロースゲルからの電気溶出によシ精製し、 セしてを用いてＥ、コリを形質転換し、そしてアンビシラン　〜耐性形質転換体 を得た。この連結において、組換体の選択は存在せず、そして簡単なスクリーニ ング方法は存在しない、：２掌二−ハイツリメイセーシ璽ン技法（Ｍａｍｉａｔ ｉｓ等、前掲）により、組換グラスきドにりいて形質転換体をスクリーニングし た。この方法は、注目のＤＮムセグメントについてλり四−ンをスクリーニング するために使用されるグラーク・ハイツリダイゼーシ、ン法に類似する。形質転 換体を。 楊枝によシ１マスター＃プレート上に順序付けられた列として移す０次に、この マスターグレートを用いてニドｐセルロースフィルター上のコピーを作る。 このフィルターコピーな録天グレート上でインキ。 ペートシ、該寒天から皺フィルターを通して拡散する栄養によシ皺フィルターの 表面上Ｋｍ曹を増殖せしめる０次に、フィルター上のｌａｍをその場て溶解し、 そしてＤＮムを不可逆的にフィルターＫｇ！！合せしめる。放射性１ｍ識したＤ ）ｉムを用いてこのフィルターをｆｖｓ−１することができる。この場合、放射 性標識された４５ｋｋｌ１ｇｌｌ断片を使用する。この断片を得た組換体のみが プ田−ツと＾イ１すメイズした。 はとんどの形質転換体が再猿化されたプラスｔＰ）１２０８のみを含有し、そし てハイブリダイズしなかった。５７６ｍの形質転換体を、ニックトランスレージ 、ン法によりてａｌｐ　Ｋよ）１６１１された４５ｋｂＢｇｌ　ｌ　ＤＮムを１ ＠いてスクリーニングした。これらの内、このｆローット＾イツ亨ダイズする２ ０個の形質転換体が見出された。これらの形質転換体の内の幾つかからＯｆラス ミｌ’ＤＮムを分析して４．５ｋｂ断片の存在及びその方向をｉ１誌した。１２ 個のむのような仮定の形質転換体を、アｔＩ２−スグル電気泳動を用いて分析し た。これらの内１１ｍが予想した％ｌ　ｌ覗５　ｋｋ断片を含有してシ〕、そし てこの１１優の内８像が正しい方向で断片を担持していた。 とれもの８個の内１＠を拾９てさらに分析した。 ｐＸ２０Ｇと称するこのグラスミドを第６図に示す。 この例は、ｐＭｉＦ　７９上に担持されたクローン化ガム遺伝子ＤＮムセグメン トの、インビｆ及びインビＦａでの領域特異的（ｒ拳ｇｉ＊ｍａｌｌｙ−＋ａｉ ｒｅｅｔ＊ｄ　）変異誘発のための方法を記載する。 領域特異的変異誘発を％グラスミドｐＭＷ　７９中に担持されたガムＤＮムのナ ックレーン化部分に対して行りた。とれらのクローン化ＤＮムセグメントをＦラ ンスＩシンによルインビがで、セして組換ＤＮム技法を用いてインビトｐで変異 誘発せしめるととくよシ、クローン化Ｘ、カンペストリスＤＮム内に挿入、欠失 、及び置換変異を生成せしめた。これらの変異によ〉付与される表現型を検討す るため％変異を担持するグラスミドをＸ、カンペストリスに４どし、モして次に プクスミＴ’に担持された変異した遺伝子が相同性組換によ）染色体に挿入され ている組換体を同定した。７ｍ１ＯＫよ）コードされているテトラナイフ９ノ耐 性が、グラスミドから染色体への変異の移行についての便利な選択系を提供する 。 ゲラスミＰＫ担持されたＸ、力ｌペストリスＤＮムとＸ、カンペスト９ス染色体 との間の組換を検討するために設計された予備実鋏において、モデル系としてプ ツスミ）”　ｐＴＸ　６５５を使用した。この！ラスミドは、！ラスミドＲ８Ｐ １０１Ｇ中にクローン化された７ｍ　１０挿入部を担持する。この笑納は、ｆＪ ｊｌＸｉｆｐＲｌ：２０１３を用いてｐＴ１６ｓｓを可動化（ｍｍｂｉｌｉｓ＊ ）して、丁ｍ１ＯＫよ〕；−ドされているテトラナイフリン耐性の移行について 選択することによシ、それをΣ、＝９からＸ、力ンペス）リスに移行せしめるこ とである。このメイティング（ｍｍｔｌｍｇ　）の最初の結果は変剤的であシ、 そして７ｍ　１０紘グラスミド上に担持されている場合にはＸ、カンベスト９ス 中て効率的にテトラナイクリンｊｔ性を発樵しないこと、しかしＴｍ　１　Ｇが Ｘ、カンペストリスの染色体中に担持されている場合にＦｉ薬剤耐性がよシ効峯 的に発現されることを示した。この現象はＥ、コリ中の７ｍ１ＯＫ′）いても記 載された。そこでは、染色体中に挿入された１個のＴｍ　１０のコピーを担持す る株は多コピーｆ２スミド上Ｋ　Ｔｍ　１０を担持する株よシも、有意に高い無 灰のテトラナイフリンに対して耐性であることが示された。上記のメイティンダ からのＴｏ　ｔ　’　ＯＸ　＠カンペストリスの選択は、テＦラサイク９ノ上で 非ｔＫ貧弱に増殖する（すなわち、小さく水りばいコロニー０み）子孫を高＃Ｊ 度（受容体当ＪＩＱ、５）でもたらした、長期間のインキ、ページ、ンの後、大 きな割合（２５％）のコｃｔ＝−がより激しく一増殖する１ｆｉｉ胞のセクター を生既した。これらのセクターの５０ｓよシ多くが形態的Ｋ　Ｇｖａｗｍ−のよ うでらりた、これらはおそらく、！ラスミドに担持された〒ｍｌＯ挿入を含有す るＤＮＡと野性型染色体ＤＮＡとの間の組！７１＆によシ生ずるであろう、？ｎ ｉＯが染色体中に組み換えられる場合、高レベルの丁ｅｔｒが得られ、そして激 しく増殖するベクターが観察される。これらのＧｍｍ−Ｙｅｔ”竜りターを拾い 、そしてテトラナイタリン上に再ストリークした場合、これら祉よく増殖し、そ して特徴的Ｇ■一形態を示した。このことは、もとのｘ６５５変異が、ｆラスミ ドＫａ持された７ｍ　１　Ｇ挿入の染色体への組換により再構成されたことを強 く主張して（引用によシこの明細書に距み入れる）によル記載されているように 、λ１７３を用いてＸ、カン（ストリスＤＮＡを含有するｆ２スミド中Ｋ　Ｔｍ 　１０を導入した。このバクテリオファージは溶ｍ機能の温度感受性νグレッサ ー及びＴｍ　ｌ　Ｏ挿入を非必須遺伝子中に含有する。このファージのアリコー トを使用して。 注目の組換ｆ２スミドを担持するλ−感受性Ｅ、コ９を、（ＬＸの感染倍率にて ３０′ｃで感染せしめた。 ４５分間開４ｋＣアアージの黴着、ＤＮムの注入、及びテトラサイクリン耐性の 発現を可能にすゐため＞、ｍする０次に、！ａＪ＠をにリア（Ｌｍｒｉｍ　）　 培地に再懸濁特表平１−５０２５５５　（１８） し、そして１０”個の細胞を含有するアリコートを、２０　Ｊｌｌ、〆一のテト 之ナイクリン、１００μｂ−のアンピシリン及び２−５１１１Ｍビロリン酸す） リクムを含有するルリアグレート上Ｋｆレートした。テ）２ナイクリンはＴｍ１ ＯＫついて選択を行い、他方ビロリン散虐は！グネシクムをキレート化して二次 ７デージ感染を最少にする。ｆレートを４２℃てインキ。 ベートすることによシ溶Ｊｌｌｉの生成を最少にする。 Ｙｅｔ’生存株が１０″″′〜ｌＯ″″′の頻度で庄する。！２スミド変異誘発 の目的でデデインされ九尖験においテ、　１０”ｉｉノｉｌｉヲｌ　Ｏ’個０７ ７−／”ｅＪｌｌ−ｔＬめ、１０”プレートを拡ける。２４時間のインキ、ペー ジ璽ンの後、各グレートからのコレニーを４−のルリア培地に懸濁し、そして氷 上にプールした。遠心分離の後、９ゾテーふ一トリトン透明化！ｉ：ｊＩ！ｓ解 法を用いてｆｉ＋＆からゲラスミｒを抽出し、そして次ＫｆラスミドＤＮムを臭 化エテジウ五−塩化七シクム密度勾配遠心によ）和製する。さらに１’ｉ＆した 後。 このｆラスミドを使用してＥ、コ１）Ｘ、Ｂ５９２を形質転換し、Ａｎｙ’　、 　Ｔｉｔ’　Ｋりいて選択する０次に、ｄ＆形質転換体からグ２スミドＤＮムを 抽出し、そして１１ａｍＨＩで切断してＸ、カンイストリスＤＮＡ又はベクター ＤＮＡへの挿入を位置付ける０次に、！、カンペストｖＸ配列中に挿入されたＴ ｍ　１０を有するゲラスミｒをＧ＊ｍ＋Ｘ　ｅ力ンペス）リスに移行せしめる。 このメイティンダからのテトラナイフリン耐性Ｘ、カンペストリスの選択はしｄ しば、前記のととく、相同性組換を介しての、ｆクスミＰＫ担持されたＴｍ　１ Ｇ挿入部のＸ、カンイストリス染色体への移動をもたらす。 次に、これらの染色体挿入を有するＸ、力ンペス）リスの９３Ｊ型特性を分析す ることができる。 テｍ１ｏｏインｖｆ挿入を単離するための第二の方策も用いた。この方策はＴｍ 　１　Ｇ源としてｆＩｉＩＫ記載したプツｘｉ　Ｐ）１１２０１３：：Ｔｍ１０ ’を用いた。 Ａｍｐ’　ＰＭＷ　７９　ｙプｌｊ　：２　ン（ｐＸｌ　１３Ｏ）と）ＩＲＬ！ ０１３をＩＬｌｆ’　１．　ｗ　９　（ｐｌｉｌｃ２０１３　：：〒ｍｌ　Ｏ） と交配してＲ１ｆ’Ａａｐ’Ｔ・ｔｒを選択する。ｆラスミド不適合性を用ｈ　 ルＡｍｐ’？＠ｔ’　ノ選択は、　ｐＸ　１１３へＯＴｍ　Ｉ　Ｇｏ　）ランス ４ジシ、ンを指示する細ｍに有利である。数十個のコレニーのプールからグ２ス ミドＤＮムをＮｕｌｌ、そして次に１１１Ｉ限工ンドヌクレアー４ｆ８ｍｍｌに よシ兄全に４Ａ＠した。ｆラスミド）ＲＩＣ！０１３：：Ｔｍ　１　Ｇはプを用 いて自然の（ｎａｔｉｖｅ）Ｅ、＝ｒ９をＡａｐ’丁―ｔｒに形質転換した。ｐ Ｘ１１３：：Ｔｍ１ｅ７’ラスミドのみが形質転換の閘にこの表現型を提供する はずである。これらの幾りか状り田−ン化されたキサントモナス・カン（スト９ ス配列内ＫＴ＊１０の挿入部を含有していた。このようなｆ乏スミＦＫ担持され た挿入変異は、前記の遺伝子置換を介してＸ、カンペスト９ス染色体に導入する ことができた。 Ｔｍ１１０テトクナイタリン耐性決定基の有用な性質を利用するために、イにビ ト璽変異誘発実験も計画された＊Ｔｍ１Ｏから２−８　ｋｂＢｇｌ　ｍ断片をａ ｌｌした。 先行研究によ夕、この断片はテトラサイクリン耐性を付与する蛋白質をコードす る遺伝子及び該耐性遺伝子のＩＡ現を制御する蛋白質をコードする制御遺伝子を 無傷のまま含有することが示されている。８゜コ９においては、少なくとも、こ の制御遺伝子が。 ｆＪｙＸ電ドに担持されたテトラサイクリン耐性と染色体に位置するテトラサイ クリン耐性との間の観察される差異のためＫｔｉｋ能的でなければならない、ｒ ル片からのＤＮＡの電気法ｍ溶出によシ分取用アｆロースグルから注目のＤＮＡ 　Ｍ片を和製した（Ｍａｍｌｍｔｌｍ等、１ｓｓｚ）、溶出されたＤＮＡをフェ ノールで２回抽出し、エタノール沈澱せしめ、７０チエタノールで洗浄し、真空 乾燥し、そして適当な゛Ｗｉ衝液に再社濁した。 次に％このＤＮＡ断片を、ａ々のｐＭＷ　７９誘導体に担持されたクローン化ガ ム遺伝子ＤＮム内に存在する化されたＤＮムの付着末端と同一であ〕、それ故に Ｂｇｌ　Ｉで切断されたＤＮムをＢａｍＨ１部位に連結することができることを 利用した。！ラスミドＤＮムを２θ〜８０　ｐｉ／−の臭化エチジウムの存在下 でＢａｍ１ｉｌによシ消化した。エチジウムの存在下ではとの制＠酵素の活性が 投置される。その結果、この消化はわずかに切断された線状生成物を高比重でも たらす、ＷＬ感的に％切断されるｌｌａｍ：Ｈ１部位は幾分不規則Ｋｍ択される と予想され、そしておよそその過シである。精製されたＢｇｌ　ＩＩ丁・ｔ１断 片を線状断片のこの集団に！ｍすゐことができる。連結生成物を用いてＥ、コリ を形質転換し、そしてテトラナイフリン耐性形質転換体を選択した。これらの形 質転換体からグラスミドを抽出し、そして劉限工ンドヌクレ（ｍａｉｌｍｇ　） 　％そして染色体Ｔｅｔ’ｌｉ２素とグラスミド−特表千１−５０２５５５（１ ９） この技法をわずかに変更して、欠失変異も造成した。 臭化エチジウムの存在下で消化されたｆ２ス之ドＤＮムがＩＩａｍＨＩによる２ 個以上ＯＲ裂を受けた場合、２個の開裂された部位に挾まれたセグメントが失わ 子に連結した場合、生ずる組換体はガム遺伝子蕩ムのセグメントＯ欠失を含んで いた。さらに、ガム遺伝子ＤＮＡの非Ｉｌ＋グメントを一緒に連結することによ ってガム遺伝子の欠失を含むグラスミドを故ｆｉに造成した。２つのこの様なり ローン化された非隣接ガム遺伝予力２スターＤＮムセグメントへの連結点にτ・ ｔ’　Ｂｇｌ　ｇ断片が存在すれは、遺伝子筺換を介して非常に大きな欠失をキ サントモナス・カン（ストリス染色体中に導入するととかしはしに可能でありた 。 例えば、ガム遺伝子クツスターから１５ｋｂＯＤＮムが欠失した欠失株Ｘ１１０ ７をこの技法によシ造成した。 ガム遺伝子ＤＮムの多くのフックローン化されたセグメントにインビー及びイン ビトロ領域特典的変異＠発を適用することによシ多数のグラスさドに担持された 挿入が得られ、これらは次に％遺伝子置換実験においてテトラナイフリン耐性Ｘ 、カンペストリス誘導体を生じさせた。これらの挿入変異の幾つかの物理的地ｌ を第７−に示す。これらの遺伝子１ｍ株の染色体ＤＮムのナデンハイプリメイヤ ーシ、ン分析を行うことによシ、染色体挿入の位置がそれらが由来するｆ２スミ ドー担持挿入の位＆に対応することを１ｉｌｌた。これらＯ実験のため、前記の 各仮定の遺伝子１ｍ株から全染色体ＤＮムを調製した。精製されたＤＮムを診断 的ｌｌ１ｌＷ＆工ンド工クレアーセ１通５ａＤＮム消化物を７ｙｗ−スｆｈ上で 泳動せしめ、ニド四セ、ＩＩ／ｗ−スフイルターに移し、そして放射性標識され た！ツスミドＤＮムによシフ”Ｅｌ−ツした。オートツジオダツフがハイｆＴ） メイセーシ、ンΔターンを示し、これを野性型対照と比較してＴｅ　１０又は第 ７図に示される挿入のすべてが純粋な遺伝子ｆＩＬ換株であることが見出された 。すなわち、ハイツリメイゼーシ、ンによ）７＃ラスミｒ配列は検出されず。 そして染色体ＤＮムは示された挿入ＲＪ！によシ、そして他の明らかな現象によ らな−で、野性型から変化していた。これらすべての挿入変異の表現型を例２に 記載したインビト四及び／又はインビが法によ〉試験した。ζうして同定された 表現型を第７図に示す。 例８ この例は、グラスミドベクター上に担持されたり田−ン化ガム生合成遺伝子のＸ 、カン（スＦリスにおける発現を示す補完１！歇において使用される方法を記載 する。 ガム遺伝子ＤＮムのセグメント、及びガム遺伝子り２スター内にＧｌｌ！！１″ ″挿入変異を有するグラスきドを用いて補完実験を行つた。これらの実験の結果 をｔｓＢ図に費約する。これらＯ実数にシいて、プラスミドをＸ、カンペストリ ス受容株に交配（ｍａｔｌｌｓｇ　）　Ｌ、そしてストレプトマイシン耐性の選 択を用いてそこに保持した。各受容株からｆツスミドＤＮムを訪製し、そしてこ のｆ２スミドＤＮムを制限エンドヌクレアーゼ消化及びアガｐ−スＪｆＡ−電気 泳ＴｈＫよシ分析することによってグラスミドの存在を確認した。グラスミドの 喪失が補完された１株におけるＧ１１ｍ”　！！３Ｊ型の喪失と相胸することを 証明するため、ｆ２スミドキ轟アー＠（ｃｕｔｉｍｇ　）　’実験を行った。一 般に、変異株は変異挿入部位にわたるグ２スミドＤＮムによシ補完された。例え ば、ｆｉｘミＩ’ｐＸ１１０ｉｉＸ９２５゜Ｘ９２８．Ｘ９７５、及びＸ６５５ を補完したが、しかし欠失変異株ｘ９７４を補完しなかりた。プラスミドＰＸＩ ＩＯによシ担持されるガム遺伝子ＤＮムは、すべてＯＷＡ児された変異の挿入部 位を有ｚＫ越えて延びる、しかしながら、第８図に見られるように％ｘ９７４中 の欠失変ｊ１はｐＸ　１１０中に担持されるクローン化ガムＤＮＡの右ｌＩ終点 まで右に延びる。従りて。 ｐＸ　ｌ　１０　＃ｉ！９７４株中の欠失により除去された遺伝子の無傷のコピ ーを担持していない可能性がある。 笑顔に、ｐＸｌｌｏによシＸ９７４の補完が得られないことはこれがこの場合Ｋ Ｍることを主張している。 鳶〈べき結果は、ｐＸ　２０６がＸ９７４を補完しなかりたことである。このグ ラスミドはまたＸ９７５も補完しないが、しかしクローン化されたセグメントは ｘ９７５挿入の部位を越えてＬＯｋｂだけ延びる。Ｘ９７５において変異してい る遺伝子の発現のために必豪とされる幾つかの１！素（例えば、プロモーター） がｐｘ　２０６中のクローン化セグメントの外−に位置するのがもつともらしい 、Ｐｍ２Ｏ３がＸ９７４を補完しないことは一層当感させることである。なぜな ら、クローン化ガム遺伝子ＤＮＡは変異部位ｔ−Ｓえて両方向に４〜５ｋｂ延び るからである。しかしながら、この脣足の交配（ｍａｔｉｌｌｌ　）がＪｌ常に 低い頻度のグラスミドの移行をもたらした点において、これＦｉユニークであり た。この頻度は、こ０５７１＆験における他のすべての交配においてｉｉＩｔＭ されたものよシ３オーダー低かつた。４ｓのすべての交配においては、グラスミ ドｐｘｚｏｓＦｉよＪ）１４いＳ度で移行し、そして受容体特表平１−５０２５ ５５　（２０） としてＸ９７４を用ｂ２１他のすべての交配において一層高い移行頻度がｆＩｉ 祭され元。従りて、その特定の染色体変異とその脣定のクローン化ＤＮＡセグメ ントの組合わせから来る負の影響があるのかもしれなり。 補完結果のほとんどが簡単に説明され得る。グラスミドに担持されたがム遺伝子 は少なくともＸ、カン（ストリスにおいては発現され得る。 偽９ この例は、ｆム生合成遺伝子りラス一一からのＤＮＡの配列決定を説明する。 ガム遺伝子クラスターを含有するＤＮＡのクローン化セグメントのヌクレオチド 配列は、Ｓ鳳ｎｇ会ｒ等。 Ｐｒｅｅ、　Ｎａ１１．　Ａｅａｄ、　Ｓｅｉ、　ＵＳＡ、　７４　：　５４６ ３−５４６８（１９７７）（引用によ夕この＃４細書Ｋｉｌみ入れる）により記 値されたジデオキシ・チェイン・ターミネーシ、ン法を用いて決定される。ｆＡ 遺伝子り２スター中に含まれるＢａｎ　ＨＩ　ＩＦＦ片のそれぞれ１ｋｋＥＢク ローニンｒぺｐターＭＰ　１８　又ｄＭＰ　１９にクローン化した０次に、各ク ローン化所片ｆ　、　Ｈ＊ｍ１に＋ｏｆｆ、Ｇ＊ｍａ２８：３５１−３５９（１ ９８４）（引用に！Ｄ　この＠＃ａ８Ｋｉｌみ入れる）Ｋよシ紀献され九方法を 用いてサグクローニングした。オーバー２１グするサックローン中に含まれるＤ ＮＡ　ｔ−配列決定することによシ、完全ナクローン化Ｂａｎ　ＨＩ断片のヌク レオチド配列を祷ることかできる。これまで、０．３　＋　１．４１１．５及び ２．２ｋｂμｚｍ　ＨＩ断片について２本ＯＤＮＡ鎖のそれぞれの完全配列が次 の様に決定された。 人ＧＣＧＴＣＴＧＴＴ　ＣＧＡＣＧＡＡＧＴＣＧＧＣＣＴＧＡＡＣＡ　ＡＧＣＧ ＴＧＡＧＧＣＧＡＡＧＧ入入ＴＴＣＧＴＣＧＡＣＧＣＧＴＴＴＴＴＣＧｋＴＧＴ 　ＧＣＴＧＣＣＧＡＴＧ　ＣＡＣＴＧＧＡＧＣＡ　ＧＧＧＣＣＧＴＧｃＡ　ＧＧ ＴＧＡＡＧＴ？Ｇ　’ｒｃＧＧＧｃＴsＧｃ ＣＧ入入ＣＴＴＣＧｋ　ＴＣＴＧＣＧＧＣ匝入入Ｇ入入ＣＣ入入Ｃα℃Ｃα６Ｔ ＣＧ　Ｃ晶ＴＣＣＣ晶ＧλＣＣＧＧＴ　ＧＡ　ＧＧ３１０　．３２０　３３０　 ３４０　３５０　３６０ＣＧＧＧ’ｌ’ＧＧＡＧＧ　ＣＴＴＴ入ＴＧＣＴＧ　Ｇ ＡＴＣＣＧＧＧＣＡ　ＧＴＡＡＴＣＧＣＧ八　０ＣＴＡＣＣＧＣＣＧ　ＡＴＴＣ ＣＧfＣＣ入 ＡＧＣＧＣＴＡＣＴＴ　ＣＡＣＣＡＴＣ（ｉＧＴ　ＧＡＧＧＴＧＡＧＣＧ　ＡＧ Ｃ’ｒＧＴＧＣＧＡ　ＣＧＴＣＡＡＧＣＣＧ　ＣＡＣＧＴＧbＴＧＣ 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ＡＣＡＧＣＧＴ　ＧＣ入へ人ＣＡＴＴＧ　Ｇ（”ＧＣ’ｌ’fＣＡＧＧ ＣＣＡＡＴＧＣＧＧＡ　ＴＴＴＣＧＡＴＧＣＧ　ＣＧＣＣＧＣＡＣＧＧ　ＣＧ入 ＣＣ入ＴＧＧＣＧＴＡＴＧＴＧＧＣＧ　ＣＧＣＴＡＣＧＡＣs １８１０　１８２０　１８３０　１Ｂ４０　１８５０　１８６０ＧＧＣＧＧＣＡ ＣＧ？　ＧＧＴＧＧＧＧＣＧＴ　”、ＡＴＡＴＣＧＡＣＧ　ＡＧＴＡＣＣＡＣＧ Ｔ　ＧＣＧＣＴＧＧＧＡＡ　ＣＡＣＣＡＣＧsＡＣ １８７０１Ｂ８０　１８９０　１９００　１９１０　１９２０ＧＣＡＧＧＡＧＧ ＣＣＧＴＧＣＧ八ＴＧＡへ　ＣＧＣＧＴＣＴＧＣＴ　ＴＣＧＣＴＧＣＣＡＧ　Ｔ ＧＡＣＧＣＧＴＧＣ’２”ＧＣＴＧＣＧＧbＧ ＣＣＣＣＧＧＡＴＣ入　ＣＧＧＴＧＣＴＧＴＴ　ＣＴＣＣＡＣＣＧ八八　入ＡＧ Ｃへへ入へＣＧ　ＣＣＡＡＣＡＣＣＡＡ　ＣＣＣＧＴＡＴＣsＣ 人ＣＣＣＡＧＣＴＣＴ　λＣＧ入ＴＣＧＣＴＧ　ＣＣＧＧ入ＧＣＧＧＴ　ＧＣ入 入ＣＣＧＣＧＣＴＴＣＴＴＴＴＣＧＡ　ＴＧＣＧＣＧ入ＧＧb ＧＴＴＧＴＴＧＴＣＧ　ＣＧＣτ入ＣＧＡ（Ｇ　ＴＧＣＴＧＣＡＴＣＴ　ＧＣＡ ＣＴＧＧＣＣＧ　Ｇへ人ＴＡＴＣＴＧＣＴＧＣＧＣＣｋＴＣb ２１７０２１ＪＯ２１９０，２２００２２１０２２２０ＧＣＴＧ入ＣＣＧＧＣＡ ＣＧＣＣＧＧＴＧＧ　ＴＡＣＧＣＡＣＣＴＴ　ＧＣＡＣＡＡＣＣＴＧ　ＧＣＧＣ ＣＧＣ入ＴＧ　入ＡＧ入ＣＣＧＣＧf キサントモナスＤＮＡのＧ＋Ｃ含量は比較的高いＶｏｌ、　Ｌ　１９８４１Ｗｉ ｌｌｉａｍ及びＷｉｌｋｉｎｓ　、パルチモア。 メリーランド、には６５〜７０％として報告されている）。この高いＧ＋Ｃ含量 のため、配列決定グル上でのバンドの圧縮が比較的高頻度で起こる。この問題は ２つの方法によシ解決された。（１）　ＤＮＡの開鎖からヌクレオ配列を導き、 その結果すべての配列を鎖の相補性によシ確認することができる。（２）デオキ ことによシ、バンドの圧縮が大きな問題となる領域の配列を得た。誤差を避ける ためのこれらの方法にもかかわらず、ＤＮＡの高Ｇ＋Ｃ含量から来る技術的困難 のために、示された配列にはわずかな不確実性が存在する。 例１０゜ この例は、ガム生合成遺伝子をコードすることが知られているＤＮＡのすべてを 含有するＸ、カンペストガム遺伝子り２スターをＸ、カンペストリスから代替生 産生物に動車的に移行せしめるため、ガム遺伝子クツスターを、Ｔｉｔｔａ等、 Ｐｒｏｅ、Ｎａｔｌｅ人ｅｎｄ、　Ｓｅｌ。 ＵＳＡ−乙７ニア３４７−７３５１（１９８Ｇ）（引用にょｐこの明細薔に組み 入れる）Ｋよシ記載されているｆ２Ｘ　ｉ　Ｙ　ｐＲＫ　２９０　Ｋクローン化 した。このｆ２ス建ドベクターは低コピー数、広宿主域を有し、セしてＥ。 コリから広範囲の１１！類のグラム慇性細菌に接合によシ移行され得る。制＠ｆ ＃素Ｄｒａ　Ｉは、ガム遺伝領域のクローン化Ｘ、カンペストリスＤＮムのどこ も切断しないが、しかしながらＸ、カンペストリス遺伝子パンク造成において使 用されたλタロー二ンダベクター内を数ケ所切断することが見出された。従りて 、Ｄｒ凰ｌによるＭ換バクテリオファージＤＮ人の断片により幾つかのＤＮＡ　 ｒＪｆｒ片が生じ、その１つが完全なＸ。 カンイストリスの弾入部及びその両端に融合した比較的少量のλＤＮＡ　（約３ 　ｋｂ　）を含有する。従って。 ガム遺伝子を含有すると信じられるナベてのＸ、カンペストリスＤＮＡを含有す るλ組換体を選択し、多量のその７アージＤＮＡ　’ｉ槽製し、ｄＤＮＡをＤｒ ｈ　ｌによシ消化し、セしてＸ、カンペストリス挿入部ＤＮＡを含有する制限断 片を楕製し１次にクローン化することが決定された。 ｆＡ遺伝子ＤＮＡを担持する各λファージの単離の債、各ファージについてＢａ ｎ　ＨＩ　ＩＩＩ限地図を作成した。 Ｒ異分析の結果として、クローン化ＤＮＡのセグメントがガム遺伝子を担持して いる様子が現われた０例２に示したλ６５５　（Ｌ’）が無傷のガム遺伝子クラ スターを含有することが示された。従りて、最初のクローン化努力のためにこの ７アージが適訳された。標準的技法を用いて、λ６５５　（Ｌ’）の大規模（１ り細胞溶解物を調製した。この溶解物は合計的８ＸＩＯ１′の７ア一ジ粒子ｔ− 提供した。どの７ア一ジ粒子をＩリエチタングリコール沈波及びＣ烏Ｃ１蜜度遠 心によシｎ製した。このピリオンから７アージＤＮＡを抽出し、そして約２２５ μＩの収１ｋを得た。 おヨソ半分ｏｎｍλ６５５　（Ｌ’）　ＤＮＡ　（１２０ａｊｌｌ　）　’ＩＥ ｇｏ　Ｔ！Ｌｌメチ２−ゼ及びＢａｎ　Ｈｌメチ２−ゼで処理した。これらの酵 素は、対応するＩＩＩＩＩ限エンドヌクレアーゼによりＩＩ！鑓されそして間髪 されるヌクレオチド配列を１置し、そして修飾、例えばメチル化する。 メチル化により、配列はそのエンドヌクレアーゼによる開裂に対して耐性となる 。メチル化は、平滑末端ｔ−有しそしてそれ故に連結反応における貧弱な基質で るるＤｒａ　ａｉｆｒ片の末端におけるＢａ！！Ｉｋｉｌ又はＥｃ。 ＲＩオリブスクレオチドリンカーの使用を可能にする。 メチル化反応の成功は、Ｅｅｅ　ＲＩ及びＢａｎ　Ｈｌによる開裂に対するλ６ ５５　（Ｌ’）　ＤＮＡの耐性を分析することによ多モニターされる。メチル化 されたＤＮＡは、約２０倍過剰量の各＃素による２時間の消化において検知でき る程開裂されなかりた。 完全消化し、そして次に約８０μｌのこのＤＮＡを８ｂｐＢａｎ　ＨＩオリゴヌ クレオチドリンカーと連結反応せしめた。このリンカ−は小二本鎖平滑末３１！ ＤＮＡであって、このＤＮＡは高濃度のＤＮＡ及びＤｒａ　ｌλ６５５（Ｉ、’ ）断片に対して約１００モル過剰の該リンカー所片をクローニングのために適当 な付着末端を生じさせることができる。しかしながら、Ｂｕｎ　ＨＥ消化に先立 って、　ＤＮＡをシェークロース勾配を通して沈降せしめることによシ分画する 。この分画の目的は２つある。 第一に、シュークロース勾配沈降の分嘔性は２０　ｋｂ断片の他のＤｒａｌＥｆ ｒ片からの絶対的な謂ｊ１を提供するわけではないが、２０　ｋｂ所片の大きな ′ａ縮が達成される。第二に、禾連結のＢＩＬ！！Ｉ　ＨＩリンｐ−分子を除去 することができる。これらの小ＤＮムセグメントは笑質的に勾配に入らないから である。従りて、２０ｋｂ　Ｄｒａ　ｌ　ｌＦｒ片を含有する勾配画分は、実際 的な目的のためには、リンカ−ＤＮＡを全く含有し表いでるろう、このことは重 責なことである。なぜなら、リンカ−ＤＮＡは次の消化及び／又は厘緒段噛を潜 在的に妨害することができるからである。５ｍの５％−２０１シ島−クロース勾 配を通してＤｒａ　１消化物を遠心した、−分（約２５０　ｔｔｌずつ）を集め 、そして各画分の７リコートをアｆＩ２−スｒル上で泳動せしめることによシ分 析した。　２０ｋｂ　Ｄｒａ　ｌ　Ｆｒ片を含有する画分をプールし、エタノー ル沈澱せしめ、緩衝液に再Ｊｌ！！濁し、そしてさらに使用するために貯蔵した 。 次に、２０　ｋｂのＤｒａ　ｌ　断片ｔ−Ｂｕｎ　Ｈｌで消化して付加され九リ ンカー分子を開裂せしめ、そしてクローニングのために適当な単鎖ＤＮＡ末端を 生じさせた。・Ｂａ！！ＩＨＩ天潟と同じ単鎖ＤＮＡ末端を生じさせるＢｇｌ　 Ｉによりｆ２スミドｐＲＫ　２９０を消化した＊　５０ｍＭＴｒｉａ−Ｈｃｔ　 （ｐＨ７，９）、１０　ｍＭ　ＭＪＣＬ、　、　２０　ｍＭジチオスレイトール 及び１．ＯｍＭ　ＡＴＰ中で連結反応を行った。 たもの）を含有する２０μノの反応混合物をＴＡ　ＤＮＡりが一ゼ（５Ｗｅ　ｉ 　ｍ　ｍユニット）によシ触縄した０反応を１２℃にて一伏（約１８時間）進行 せしめた。 次に、この連結反応の生成遣を用いてＥ、コリを形ｖＬ＆換した。テトラサイク リンｍａ形質転換体を適訳し、そして次にクローン化がム遺伝子クラスターを含 有する組換プラスミドの存在くついてスクリーニングした。このスクリーニング は、個々のナト２サイクリン耐性形質転換体を、Ｇｕｍ−変異を（ガム遺伝子り ２スター内に）含有するＸ、カンベスト９スと交配（ｍａｔｉｎｇ　）せしめ、 テト２？イクリン耐性のＸ。 カンペストリスへのコンジ＆ガル・トランスファー（ｃｏｎｊｕｇａｌ　ｔｒａ ｎｓｆｏｒ　）を適訳し、そして生ずるガム嵌現型を視覚的にアッセイすること によシ達成された。はとんどの交配（ｗａｔｔ！ｓｆ　）がＧｔ＋ｍ−Ｔｅｌ’ 　ｘ。 カンペストリスを生じさせ九が、少数は非常に粘稠な状態の’ｒ＠ｔ’コロニー をもたらした。これらの交配においてＥ、コリによシ担持されたゲラスミＰの分 析は、ｐＲＫ　２９０及び挿入されたガム遺伝子クラスターＤＮＡ　ｔ−含んで 成る組換プラスミドの存在を示した。 ！５１−〇組換グ２スミＩ’を分析した。ｎ製さｎたグラスばドをＣ５ＣＬ＠度 勾配遠心によシＤ４Ｍし、そして■部位にクローン化された）、セしてλ６５５ 　（Ｌ’）　７アージはクロン化Ｘ、カンペストリスＤＮＡの外側にＢａｎ　Ｈ Ｉ部位を含有しない。従りて、ＢａｍＨＩは同じセットのＸ、カンペストリスＤ ＮＡ　ｍ片を生成すべきである、しかしながら、わずか２個のｐＲＫ　２９０　 ＃導体（Ｈ６２７及びＨ８ｏｇ　）が２６５５　（Ｌ’）中に存在する＠呆する サラセットを含有していた。これらの切除された部分を臀するクローンについて の最も可能性ル化されず、そしてそのために、付加されたリンカ消化に対して保 護されなかったのである０例えば、さｎ、そしてｐＲＫ　２９０中にクローン化 され得る切除さｆＬ九断片の−ｔ＃ヲ生じさせるであろう、ｊｌ初の反しなかつ たのでろろう、おそらく上記のようにして不完全なりローンが生じたのであろう 、ともかく、５個のクローンのＩｔ！ｉｎ島９！１１に示す。 この９Ｉｌは、免疫−足を用いることにより、ガム生合成りクスターによシコー ドさｎた＃巣がＸ、カン（ストリス中に少量のみ存在したことを示す。 蛋白質は、二次元電気泳動法によシ示した。野性型Ｘ、カンペストリスを、椙ヌ クレオチド前駆体を合成することができないがしかしインビトロツキサンタンを 合成することができるＸ、カンイスＦリスと比較した。 これら２ｅ＆はガム生合成酵素を含有する。　［ＪＤＰ−グルーコースデヒドロ ゲナーゼとして提案される蛋白質は蕗二の株のΔターンにおいて欠けていた。完 全ながム住合成カラスターについて欠失を有するＸ、カンイストリス株も分析し た。＆りかの蛋白質が欠失株の抽出物から欠けていた。ガム生合成＃素に相当す ると俤案さｎるスＩットの！ｉ１度は非常に低かった。 追加のデーターが与えらｎる＊　２．２ｋｂ　Ｂｉｍ　ＨＩ断片の中央部の押入 変異は、トランス７エ２−ゼ■活性を欠（Ｇｕｍ−変異をもたらす。この押入は ｓ　２．２　ｋｂ　ＢａｎＨＸ断片のＤＮＡ配列中のおよそ１１３２位に存在す る。 ＤＮＡ配列は、配列のこの＠城に大リーディング７レーム（ｏａｒ　）が存在す ることを示す、トランス７エラーーｖＩ活１！Ｅを有する仮定の蛋白質生成物は およそ７３８位のＡ＋Ｇ［始コドンから始まる。この開始；トンか８項基対上訛 はり？ノーム頑合部位（ムＧＧＡＧＡ）ｆＳＡ、ＯＲＦ＃ｉ、）ランスフ工２− ゼ川活性を規足する挿入ｆ典が位置するＢｇｌ　１部位を越えて明らかに十分延 びる。 当業界において知られてシシ、そしてＨｏｐｐ　及びＷｏｏｄｓにより開発され そして−Ｐｒ会ｄ１ｅｔｉａｎ　ｏｆ　Ｐｒｏｔ＊１ｍムｎｔｉｇ＠ｍ１ｃ　Ｄ ｎｔ＠ｒｍｉｎａｔ１ｏｍｓ　ｆｒｏｍ　Ａｍ１ｎｅ　ＡｅｆｄＳ＊ｑｕｅ＋ａ ｃｅ＠’と題してＦｒｅｅｓ　Ｎａｔｌ、　Ａｃ１ｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ。 Ｖｏｌ−７Ｌ　Ａ　６−３８２４−３８２８頁、　１９８１年６月（引用によシ この明細書に組み入れる）に記載されている製水性２１２ットにより、予定され る蛋白質配列の幾つかの領域に対応するペプチドを、それらの予想さｎる免疫系 性のために選択した。Ｊ択されたを第２表に示す。 Ｎ　２　表 抗血清のｍ！のために２．２　ｋｂ　Ｂａｎ　ＨＩ　１ｌｉＴ片から選択された ペプチド ８０７　ム、　Ｖａｌ　Ａｉｍ　Ａｒｇ　Ｇｒａｍ　Ｈｌｍ　Ｇｌｍ　ＡｌｍＡ ｓＩＩＳｉｒ　Ａｌｅ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｖａ１９３０　Ｂ、　Ａｒｔ　Ｉｌｅ 　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　５ｕｒＳａｒ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　 １１＊　Ａ１ｍ１０４１　Ｃｍ　Ｌｏｗ　Ａｌａ　Ｌａｗ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｐ ｒ＠　Ｌ’５Ｈ１ｓ　Ｇｌｙ　Ｌｙｅ　Ｐｒｏ　Ｍ＠ｔ　Ｍａ１１６３２　Ｄ、 　Ａｓｐ　ＩＩ＠Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｈ＠Ｍａｌ　ＡｒｇＬ＠ｕ　Ａｌａ　Ｔｈ ｒ　Ｇｉｎ　Ｓ＠ｒ　Ｇｌｙ１６７７　Ｅ、　Ｖａｌ　ＩＩｓ　ＶＩＬＩ　Ａ＠ ！Ｉ　Ａｒｇ　Ａｌ）Ｉ　ＡｒｇＩＩＩ　Ｇｌ！Ｉ　ＡＩＪＬ　Ａｌｍ　Ａｌａ 　Ａｍｐ１７４０　Ｆ、　Ａｌｍ　Ａｍｍ　Ａｌａ　ムｍｐ　Ｐｈｓ　＾−ｐ　 ＡｌａＡｒｇ　Ａｒｇ　Ｔｂｒ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｍｅｔ面相ペプチド合成によ りペプチドを合成し、クシ血清アルラミンに接合せしめモしてラビッ）を免疫疫 血清が免疫感作用ペプチドに対して特異的な抗体のかなりの力価を含有している ことが、Ｅマａ　Ｅｎｒｖａｌｌ。 Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ＥｎｚｙｍｏｌｏｓｒＦ＊　Ｖｏｌ　７（Ｌ　４１９− ４３９頁、　１９８Ｇ−Ｅｎｚｙｍｅ　Ｉｍｍｕｎｅ　Ａｓ５ａｙ　ＥＩＪＳＡ 　ａｎｄ　ＥＭＩ丁”に記載されてシシ、そして当業界において広く使用されて いるＥＬＩＳＡ　（工ンデイムーリンクド・イムノソルベントアッセイ）によシ 見出さｎｑ。 コレらＯｔ＃ａ的抗体はまた。Ｔｏｖｂｉｎ、Ｈ，Ｓｔ鼻＊ｈ＠ｌｉｎ＊Ｔ、及 びＧｏｒｄｏｎ、　Ｊ＋によ？）　”Ｅ１ｅｅｔｒｏｐｈｏｖ＊ｔｉｃ　Ｔｒａ ｎｓｆｅｒｏｆ　Ｐｒｏｔ＠ｌｎａ　ｆｒｏｍ　Ｐｏｌｙａｅｒｙ１ｍｍｉｄ＊ 　Ｇｅ１ｓ　ｔ。 Ｎ１ｔｒｏｅｅｌｌｔｉｌｏｓｅ　５ｈｅｅｔｓ　：　Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ　ａ ｎｄ　ＳｏｍｅＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”と題してＮａｔｌ、　Ａｃａｄｓ　 Ｓｅ１．　ＵＳＡ。 ７６：４３５０−４３５４（１９７９）　（引用によりこの明細書ＫＪｉ１み入 ｎる）Ｋ記載されているクエスタンイムノさｎている、Ｘ、カンペストリス８４ −Ｌのａ胞溶解物の４０ｋｄ蛋白質とも反応した。この蛋白質に、ガムク２スメ ーＤＮＡが欠損している株であるＸ１１０７、又は２．２　ｋｂ　Ｂａｎ　）Ｉ Ｉ　１１１片中に変異挿入を有する株でらるＸ９２８の細ＩＩ＆溶解物中に＃ｉ 存在しなかりた。この４０　ｋｂ蛋白質は８１．−４にお−て、クマツシー１ル ーによるグル中の蛋白質の直接染色法（感度が低い）によシ可視化さｎず、従り てガム生合成蛋白質は全細胞蛋白質に対して非常に小割合に過ぎない、ｆム生特 表平１−５０２５５５　（２５） 合成蛋白質の低い発現は、Ｓ４−ＬＫおけるキサンタンガム生産の九めに十分で あると思われる。 例１２゜ この例は、インヒｄ　ｆ　Ｇｓｍ″″であるＸ、カン（ストリスの種々の株、及 び代替宿主として期待される細菌において同足さｎる特定の楯ヌクレオチドゾー ルを検討する。 幾つかのＧｕｍ″″株は、楯ヌクレオチドＵＤＰ−グルコース、ＧＤＰ−マンノ ース及ヒＵＤＰ−グルクロン酸が供給された場合にインビトロでキサンタンを生 産することができた。これらのｆ異′！！Ｒは、キサンタン自体の生合成にでは なく塘ヌクレオチドの合成に欠損を有していた０次に、とｎらの変Ｓ株は色素ト ルイジンブルーに対して感受性であることが見出された。 トルイジンツルー感受性について他のＧｕｍ″″株をスクリーニングすることに よシ追加のヌクレオチド変異株が得らｎた。 インビトロでＧｕ♂であるがしかしイヒビーでＧｔ＋ｍ−である株における特定 の糖ヌクレオチド欠損を同定するために次の方法を用いた。各棟からの単寵され たコロニーを拾い、そして１２５１１Ｌｔのエルレンマイヤー７−ｙス；中、２ ％のグルコースを含有するｌＯｄの１培地Ｃ１ｊ中酵母エキス３ｊ、ｗシトエキ ス３９、及び（デトン５％）に接種した。培養物を３０℃、２５０　ｒｐｒｔ＊ にて２４ｆｒｆ間、又は濁るまてインキ為ベートした。　ＹＭＧ培地から５％の 接種物を、炭素源としてグルコースを含有するＩＮ憬虐培地に移し、そして３０ ℃にで２４ｗ＃間増殖せしめた。培養物を遠心分縮によシ回収し、項で２回洗浄 し、そして６００ｍｍにて１００のｒＩ＆光を与えるのに十分な容量に再Ｓ濁し た。１５−のサングルを、２Ｇ−の製置になるのに十分なグルコースを収容し九 エルレンマイヤーフラスコに入れた。各サングルを４００　ｒｐｒｍにて３０℃ の水浴中で１０分間インキ為ベートし、次に１ｍｔ−取り出し、そしてエツイン ドル７遠心管中０．１−の１１ＮＩＩ［！に加えた。チ為−ｆＶＣキャップ。 をし、内容物を５秒間滑動ζキサ−上で混合し、次にチ為−ツをドライフイスー アルコール浴に入れた。 すべてのサンプルを処理した後、チ２−ブをドライアイス浴から取り出し％壁温 で解凍し、そして５分間遠心してＩ！ａ處破片をペレットにした。上滑を予備冷 却しｆｃｌ　５ｄのコニカル遠心チ為−ツに入ｎ、そしてドライアイス−アルコ ール浴中でａ［結した。凍結したサングルをａｕｉｉ乾燥機に入ｎ、そしてａ［ 蒔した。各チ島−ツの内容物を０．２ｊｌｊｏ？ＬＣ緩衝液すなワチトリエチル アミン（プルドリツチ）Ｋより−６５Ｋｇ４製さｎた４０ｍＭリン酸に溶解した 。サングルを０．４５μ！！Ｉフイルターを通して濾過してミクロサングルバイ アルに入ｎ、そして４．６　ｍＸ　２５０　ｗｃ１８逆相イ逆相イオン人力２ム し、４０℃、９．８ｄ／分の流速で分析した。保持時間を同じ条件下で泳動し九 城中に溶出する化合物のスペクトルｔ−ｆ：Ｍすることによシ、橋ヌクレオチド を同定し九。 Ｘ、カンペストリスの糟ヌクレオチド変異株の４つのクラスを次の方法によシ同 定した。 （１）　ＵＤＰ−グルコース及びＵＤＰ−グルクロン酸を合成することができな い９１４株： （２）　ＧＤＰ−マンノースを合成することができない９１４株； （３）　ＵＤＰ−グルコースを合成することができるが、しかしＵＤＰ−グルク ロン酸を合成することができない変異株；及び （４）　ＵＤＰ−グルコースを合成することができない変異株。 Ｘ、カン（ストリス濱性型採からの抽出物はキサンタン合成に必要とさｎる槽ヌ クレオチドのすべてを有してい九、キサンタン生合成経路自体に欠損を有するＧ ｕｍ″″株は野性型細施よりも高濃夏の前駆休場ヌクレオチドを有していた。こ ｎらのデーターは、野注型株におけるキサンタン合成の速度が前駆体糖ヌクレオ チドの供給により制限さｎるであろうことを示している。 １７５８８　）　、　及ヒシ為−ドモナス・／＃−７エクトマリナ　（Ｐｓ＠ｔ ＋ｄｏｍｏｎａｍ　ｐ＊ｒｆｅｅｔｏｍａｒ１ｍｍ　）　（人ＴＣＣ１４４０５ ）中の樽ヌクレオチド′に、ｘ、カンペストリスのために開発された方法を用い て分析した。すべての生物をＤＥＮＩＴＥ培地、すなわち炭素源どして２％のグ ルコースを含有する焦憬塩培地中で１２時間増殖せしめた。 細胞を集め、洗浄し、そして６００　ａｒｍにて１００の吸装置になるように衿 懸濁した。細胞ペレットは、嫌気的増廻の九めに蚤求さｎるチトクローム合成が 抑制された脱１１＃ａｍＫＪ１！的なピンク色を有していた（増殖中の酸素の制 限に対して典型的な反厄）。 次に、追加の電子受容体として２５　ｍＭ　８１４　！ｌ　ｔＩｋをインキ為イ ーシ、ン混合物に含めた。細Ｓ腫浦液を、硝酸塩を伴つて、及び伴わないで、２ ０−グルー−スと共に５分間インキ島ペートシ、次に蟻虚によシ抽出した。ａｌ ｌ出金凍績乾燥し、Ｔムーリン酸緩衝液に浴解し、そして？ＬＣによシ分析した 。注目の領域におけるピークのスペクトルによ〕確認した場合、／＃り；ツカス ・デニトリフィカンスはＵＤＰ−グルコース及びＧＤＰ−マンノースを有してい たが、ＵＤＰ−グルクロン酸検出不能でありた。同様に、シ為−ド峰ナス・／々 −７エクトマリナ及びシ為−ドモナス・スラッチエリはＵＤＰ−グルコース及ヒ ＧＤＰ−マンノースを有していた。　ＵＤＰ−グルクロン酸はいずれの生物から の抽出物中にも検出されなかりた。 例１３ この例ａ、ａつかのガム生合成＠累が代替宿主Ｅ。 ；す中で発現されたことを示す。 多くのｔムクラスターＤＮＡ断片を、プラスミドｐＫｏ−１から１ＩｌｌＪｌさ れた発現ベクターｐｐ３中にクローン化した。このプラスミドはＫｅ　Ｍｅｋ争 ！Ｉ！ＬＦ等、Ｇ＊！Ｉ・ＡｍｐＨｆｉｅａｔｌｅｍ　ａｎｄ　Ａｎａｌｙｓｉ ｓ、　Ｖｅｊｌｌ、エルゼビール。 北オランダ、３８１頁、１９８１年（引用によルこの明細薔に組み入れる）Ｋよ シ記載されている。 トランスフェラーゼｌをコードするガムクラスターの２−２ｋｂとＨ１断片をｐ ｐｓにクローン化してｐＪＰｌを得た。ｐＪＰＩＫよシ形質転換されたＥ、コリ ハ１１０５を富培尾中で培養し、ＩＰＴＧ（１０−”Ｍ）によ）誘導し、そして ３７ｃにて３時間の後、遠心分離にょシ収得した。プレンチプレスを１８，００ ０　ｐｓｉにて２回通すことによシ＋ｍＪ＠溶解物を−委し、そして１０％５Ｏ ８−アクリルアミドグル上で泳動せしめるととによｐ分子量によって蛋白質を分 離した。これらの蛋白ＪＲを、トランスフェラーゼｌに対して特異的な抗体を用 いてクエスタン争イムノプロット法によりｆシーツし次、　２Ｍ１０５（ｐＪＰ ｌンのＩｉ！ｉｌ胞溶解物は４０　ｋｄ蛋白質のｇＡＷＩｋなバンドを示した。 挿入部を含有しないＰＰ３によシ向様に処理されたＥ、　ｓりの細胞溶解物を４ ０ｋｓｌｉｆ白質を有しなかつた一ＩＰＴＧによシ鰐導された２Ｍ１０５（ｐＪ Ｐｌ）細胞においてさえ、Ｘ、ｔＪ７４ストリスのクローン化ＤＮムからの４０ 　ｋｄ蛋白質はりマツシーツルー染色によシ可視化されず、そしてそれ故に金融 ７！！蛋白質に対して小比率であった。Ｅ、コリＪＭ１０５（ｐＪＰｌ）の電気 −プロットをマフイニティー精製された抗体によジグロープした場合、この抗体 はトランスフェラーゼ厘とのみ反応した。このＩム生合成遺伝子はＥ、コリＪＭ １０５中で明＠に発現された。 Ｂ−リＦＤＩＯ９８（Ｆ’　１ｍ・！９）を形ｊ［転換するために使用されたｐ ｐｓにクローン化されたガム生合成りＮＡクラスターの断片０発５Ａｋより他の 証拠が与えられる。　ＦＤ１０９８は、不対称細胞分裂によシ、染色体ＤＮＡを 含有しな−がしかしｐｐ３白米のプラスミドの；ビーを含有するミニセルを主じ させる株でるる、遺伝子発現の分析のためのミニセルの使用はＪ、Ｅ、　Ｃ１ａ ｒｋ−Ｃｕｒｔｉａｓ及びＲ，Ｃｕｒｔｉｓｓｍによｌ）　Ｍ＠ｔｈｏｄｓ　ｉ ｍＥｎｓｙｍｏｌｅｇＦ　１０１　：３４７−３６２（１９８３）（引用によ） この明ｉａ１！Ｆに組み入れる）Ｋよシ記載されている。 一連のシ為−クロース勾配ｔ−通しての遠心分ｍＫよシ全体細胞からミニセ〃が 分離されｆｃ後、ミニセルをＩＰＴＧＫよシミ導し、セしてＰＰ３由釆のｆ−） スミドによシ；−ドされた蛋白質の発現の間それらを放射！Ｅラベルする。ミニ セルを収得し、１０％５ＤＳ−アクリルア〉トグル上で泳動せしめ、そして発現 された蛋白質をオートラジオグラフィーによシ可視化する。 ガム生合成りＮＡに、このｙ５法によシ可視化される幾つかの蛋白質を明！ＩＮ Ｋコードしていた＊４０ｋｄの蛋白質はＥ、コリにおいて再び見られ、そしてこ れはλ２　ｋｂ　Ｂａｎ　ＨＩ断片の存在に依存した。分子歓４７ｋｄＣ）蛋白 質は３Ｌ　５　ｋｂ　Ｂａａ　ＨＥ断片にょシフローン化さレテｈ７’ｊ、　２ ７　ｋｄｏ蛋Ｅ［ハ３．５　ｋｄ及ヒ１，３５ｋｄｏシｉｎ　ＩＩ断片を含むＸ 、カンベストＩｌｌ　Ｊ　ＤＮＡ　Ｋよシコードされている。Ｅ、コリのミニセ ルにおける他のｊム生合成蛋白質についての証拠は不確実である。 ガムクラスターＤＮＡの発現は、んカンペストリスにおいてそうでろるように１ 代讐宿王Ｅ、コリにおいて低かった。 例１４ この例は１代替宿主における遺伝子４Ａ現の２１成の生合成遺伝子のガムクラス ターは、代書宿主に導入された場合、転写されないか又は翻訳されないことが予 想される。生合成遺伝子のすべてではないが幾つかが発現されることも予想され る。仮数グロー！、及びガムクラスターによシコードされ次蛋白質に対して向け られた抗体を用いて、クラスター円のすべての遺伝子の転写及び翻訳が測定さｎ よう。 遺伝子の幾つか又はすべてが転写されない場合には、クラスターの適当な位１ｔ Ｋ制御可絽なｆロモーターが付加されよう、グラム陰性種及びグラム陽性棟から のＲＮＡ　／リメラーゼを包含する細胞のＲＮＡ　／リメラーゼは非常にあシふ れている。転写の開始を可能にするＤＮＡ配列は当東＠に十分理解されておシ、 そのような７’ｏ％−一一を容易に導入することができる。 同様に、グラム湯性及びグラム陰性の両省のリボゾームＭ全部位（Ｃれは翻訳の 開始〈使用される）は、転写された任意のｍｌ■ムの翻訳を達成するために十分 に理解されている０部位特異的変異銹発の標準的方法を用匹て、野性ａｉＸ、カ ンペストリスにおける発現に対比して不適ｇＪに発現されるガムクラスターＳ素 は、代書宿主における正しい生産のためにｖ４豊されよう。 例１５ この例は、ガム生合成＃素の上昇した熱安定性を記載する。 この発明に、可能性ある代替宿主として３０℃よシ高温で増層する生物の使用を もくろんでいる。キサンタンの生合成は、Ｌカンペストリスにおいて２７℃と３ ０℃の間Ｏ温屓においてｊｉ［Ｋ行われる。 ガムの主合成に関与する酵素が３０℃よシ高温においてはよく機能しないがしか し発現はされるのであれば、その＃素は、１９８３年９月１６日に出願された米 国特許出ａム５３λ７６５の継続出−をして１９８５年ｌＯ月２８日に出−され た米国特許出庭（引用によりこの８１！細薔に組み入れる）　Ｌｌａｅ等＠Ｍｅ ｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｔｈ＠Ｇ＠ｎ＊ｒａｔｌｏｎ　ａｎｄ　Ｄ＠ｔｅｅｔｌｏｎ 　ｏｆＥｔ＋ｓｙｍ＊　Ｖａｒｉａｎｔｓ　ｗｉｔｈ　Ｅｎｈａｎｅｅｄ　Ｔｈ ｅｒｍｓ＋ｖｔａｂｉ１１ｔｙａｎｄ　Ａｅｔｌマｉｔ７”中に記載されている ように、熱安定変形体に変えられよう、＊白質やの１個の７ミノ駿ｔＰ！！が、 ＃累が機能する最高温匿を１００以上も上昇せしめることができる。このＢＡ＃ ａ＋沓中に記載される遺伝子配列はこのような置換を容易に可能にする。 例１に の例は、代Ｖ宿王が４リサツカライドを合成することを可能にするでらろう追加 の改良を記載する。 ガム生合成遺伝子を含有し、そしてそれらの遺伝子の転写及び翻訳を行うことが できる代替宿主が全く又は有意な速度で４リサツカ２イドを主−産しない場合が あろう。 最初の実験は、もしそれが起こるとすれば、塘ヌクレオチドｗＩＪ鉱体（ＵＤＰ 　−／ル：ｘ−ｙ、、ＵＤＰ　−／　Ａ−クロン酸及びＧＤＰ−マンノース）の 富化及び可能性ある合成速度に向けられよう、１１ヌクレオチド経路のキー＃累 のコード遺伝子は、Ｂ＊ｔｌａｅｈ等（ＷＮ掲）によシ記載され九万ａｔ−用い てＸ、カンペストリスから得ることができる。特足の楯ヌクレオチドプールが適 切なポリサッカライドの生産のために低すぎる場合、適切なんカンペストリス遺 伝子が代替宿主に付加されよう０次に１代替宿王唸逼当なＩリサッ力２イドをも たらすか、又は速度が低いままであろう。 ／　ｖ？ツカライド合成の速度が低いままでめｎば、Ｉリサッカライドを生産す るようにガム遺伝子クラスター及び必要であれば糖ヌクレオチド経路が機能する こと七可削にする＃素について、Ｘ、カンイストリスのゲノムの他のすべての領 域を接置するととくよシ、第二の改良が拭みられるであろう０例３において造成 された約２０．０００垣基対の長さのんカンペストリスのゲノム断片のライｆラ リ−がｓ　Ｔｉｔｔａ等によシ記載されたＳ準的技汗によ多接合的に、すべての ガムクラスター遺伝子及び楯ヌクレオチド遺伝子を有するがなおポリサッカライ ドを生産しない代書宿主に加えられるであろう、このライブ２り一の受答体は、 ペトリ皿グレート上で粘質コロニーにつめて観察されよう、Ｉリサッカライドを 生産するコロニーはそれを行わないものから容易に識別される。密集していても １０　個のａｌｌ：！ロニーを含むペトリ皿グレートが容易に観察される。ｘ、 力ンペストぼりサッカライ？Ｃ）生産のために要求される欠損した遺伝子生成物 を提供するか否かを見るため、少数の受容体のみが俵祭されなければならない（ １０’未満）。 特表千１−５０２５５５　（２Ｂ） この実験がポリサ生産株イド生童株を得るのに失・敗すれば、受容体代替宿主の 全集合（今、よく発現されるガム生合成遺伝子、欠損した糖ヌクレオチド酵素、 必要であればさらにＸ、カンペストリスからの２０．０００塩基対のＤＮＡ断片 の無作為集合を含む）が、塩基対置換を生じさせる化学物質（例えば、ニトロソ ツァニジン、２−アｔ／′！リン又社エチルメタン、但しこれらに限定されない ）により変異処理されよう、粘質コロニーを観察するために、変異処理された細 菌が寒天培地上にプレートされるであろう、粘質コロニーはＸ、カンペストリス の幾りかのトランスＩジシ、ンで誘導され九〇ｕｍ−変異の非常Ｋまれに復帰株 として見出された。与えられた代替宿主の１０＠よ抄多くの変異処理されたコロ ニーが４リサツカクイドの生産についてスリリーニングされるであろう。 代替宿主の選択は少数の最良の候補に限定される必要はない。！ラスξドｐＲＫ ２９０−Ｈ３３６ｕ広宿主域を有し、そして多数の可能性ある代替生産株に接合 により移動させることができる。！！ヌクレオチド生合成酵素を担持する類似の 造成吻を作に、多くの代替宿主を試みることができる。今まで、ｐＲＫ２９Ｇ− Ｈ３３６は可能性ある生産株シュードそナス・ブチトスｖフイカンス（！’ｓ＠ ｕｄａｍｏｎａｓ　ｄ＊ｎ１ｔｒｌｆｔｃｍｍｓ）、シ、−代替宿主の選択のた めの１つの選択は、細胞外４リサ、カライド生合成を行うととができることが知 られているａＩＩを選択することであろう、これらの株は、ｐＲＫ２９０−Ｈ３ ３６が該株に導入される前に本来的Ｉリサ、カライド生合成ができないように容 易に変異され得る。この様な株は、Ｉリサッカライドの合成及び分泌を促進する ためＫＸ、カンペストリスのガム生合成酵素及び／又は生合成中間体と相互作用 しなければならない重要な遺伝子置物を含有することができよう、プラスミド移 行実験はこのように簡単であるから、ガムを生産する広く多様な能力を有する宿 主が試みられよう。 この提案されている発明は、生合成酵素のガム遺伝子クラスター、適切な槍ヌク レオチドの生合成をもたらす遺伝子及び無作為Ｘ、カンイストリスＤＮム断片を その内に有する、Ｉリサッカライド生童性の代替宿主をもくろみる。さらに１ｍ 株は菌株改良の最終段階からの多数の塩基対置換変異を含有することができる０ 代替宿主から標準的方法により無作為Ｘ。 カン（ストリスＤＮＡ断片及び糖ヌクレオチド生合成遺伝子が好結果に除去され よう、ポリサッカライド生産が変化しないままであれば、これらのＤＮＡ断片は 代替宿主生ｔ＊において使用されないであろう。 最後に、好結果の代替宿主が、変形体／９サツカライドの合成を惹起するガム生 合成りラスター中の変異と組合わせて使用されよう、従りて、代替宿主は、代謝 速度、増殖湿度及び嫌気的代謝からの利点の組合わせを伴りて、キサンタンガム 、　Ｖｍｎｄ＠ｒｓｌｉｅ・等及びＤｏｈ＠ｒｔｙ等のキサンタン変形体、及び 他の任意のエキソＩリサ、カライドの製造のために使用さとの例は、キサンタン ガム生合成に関与する遺伝子のクラスターを含有するキサントモナスのゲノムＤ ＮＡの１６ｋｂの範囲についてのヌクレオチド配列の誘導体化を記載する。ここ に示されるＤＮム配列の部分（すなわち、０．３．１．４．１．５及び２．２ｋ ｂのシ＋ｍＨＩ断片の配列は、１９８６年３月２６日に出願されたＣｍｐａｇｅ 　吟の−Ｒｅｅｏｍｂｌｎａｎ”　−ＤＮＡ　ＭｅｄｉａｔｅｄＰｒｏｄｔ＋ｅ ｔｌｏｎ　ｏｆ　Ｘａｎｔｈａｎ　Ｇｔ＋ｍ　’と題する特許出顔にすでに試さ れている。先行の配列は、配列決定グル上のノぐンドの圧縮の領域を分離するた めにデオキシイノシンを使用した配列決定反応から導かれた一層最近の結果によ 抄修正された。この例はまた、ＤＮＡ配列の適切な分析がガム遺伝子の構造及び 構成をいかに表わすかを示す。 ＤＮＡの全１６ｋｂセグメントの完全なヌクレオチド配列が、第１０図中の二本 鎖ホーマットにおいて示制限地図の左から右の方向において５′から３′に！ｌ ！ｌ！まれる。　Ｂｉｂｂ等、Ｇｅｍ５３０：１５７−１６６（１９８４）（引 用によりこの明細書に組み入れる）により記載されているコンビ、−ター法を用 いて、各方向に、配列の３つの可能なリーディング７レームを定義する３つのヌ クレオチド位置のそれぞれにおけるＧ＋Ｃ分布を決定した。これらのフレーム分 析の結果は、このＤＮＡのすべてが左から右の方向に転写されることを示した。 従うて、第１０図に示す配列の玉鎖がコード差配列（すなわち、Ｔとυとが置き 換えられたｍｌ頃ムの配列である。配列により定義される遺伝子の正確な位置は 第３表中に示すデーターから得ることができる。 ＤＮＡの１６ｋｂセグメント中に含まれる遺伝子の方向及び構造の概観を第１１ 図に示す０図中の上級は図中、フレーム分析曲線上に引かれ丸線は、単離されそ して特徴付けられた（例１．２．７．１９．２０）変異の幾つかのおよその位置 を示す、第１１図に示されるフレーム分析曲線は、第１（實線）、第２（赤線） 及び第３（黒線）ヌクレオチド位置におけるＧ＋Ｃ含量の分布を示す、なお、３ つのヌクレオチド位置のＧ＋Ｃ含量の分布は全配列のほとんどにわたって非−ラ ンダムであり、このＤＮＡの実質的にすべてが蛋白質生成物をコードしているこ とが示される。配列にそう非−ランダムＧ　＋　Ｃ分布の各領域が蛋白質生成物 をコードするＤＮＡの領域を示す、各蛋白質のリーディングフレームが、非−ラ ンダムＧ＋Ｃ分布の各領域内の中間値を有するヌクレオチド位置により定義され る。３つのヌクレオチド位置においてＧ＋Ｃ分布が変化する点が、１つの遺伝子 の始まりもしくは終り、又は１つの遺伝子の終りでありて次の遺伝子の始まりを 示す、各場合において、これらの点は適切なリーディングフレーム内の開始又は 終止コドンの存在と関連することが見出された。 ７レ一五分析曲線の下方に、配列中の各遺伝子の位置及び範囲を示すために、分 離された矢印が描かれている０便宜上、各遺伝子は１文字で示されており、”ｔ ｐ−を前に付した文字がその蛋白質生成物を示すために使用される。各矢印の上 Ｋ、蛋白質生成物の分子量がｋＤで示しである。各矢印の下に、各遺伝子生成物 の名称が、遺伝子機能が変異体表現型に由来する各場合について、その文字名称 及び機能名称として示されている。 フレーム分析曲線は、３つのヌクレオチド位置のそれぞれにおけるＧ＋Ｃ含量が ランダムな分布を示す配列の３つの領域（塩基番号９００．３４００及び１２４ ００に中心を有する）が存在することを示す。 従って、ＤＮＡのこれら３つの領域は蛋白質生成物をコードすることが予想され なかった。これらの領域の３つのすべてが、ステムールーグ二次構造を形成する ＧＣ−９，チ領域によ秒先行されるＴ′の並びを含む配列の領域により規定され る転写停止シグナルを含有する。これらのターミネータ−の二次構造を第１３図 に示す、転写ターミネータ−の位置に基いて、１６ｋｂセグメントのＤＮＡは３ つの転写ユニット中へ限界を定めない、第１１図の下方の矢印は転写ユニ、）１ ，１．及びｍと称される３つのユニットのそれぞれの転写の範囲、位置、及び方 向を示す。 各転写ユニット内の第一遺伝子の始まりと各ターミネーターとの間のＤＮＡ配列 は転写開始の点を特定する配列（プロモーター）を含有すべきである０文献に報 告された結果が示すところによれば少なくとも幾つかのシュートモナス・プロモ ーターの配列はＥ、コリ・プロモーターの配列に類似するから、３つの転写ユニ ットのそれぞれ中のＤＮＡ配列の逼切な領域を、−１０（７’リプロウ・ゴ、ク ス）及び−３５の位置の両者におけるＥ、コリプロモーターの共通配列への相同 性について試験した。転写を開始するためのＤＮＡへのＲＮ人ポリメラーゼの給 金の特定においてこれらの２つの配列の内命も重要ガものがグリプノウ・が、ク スの配列であると一般に信じられる。 グリプノウ・が、クス及び−３５ヘキサマーの共通配列はそれぞれＴＡｔｄｍＴ 及びＴＴＧＡｅａ　（大文字は各ヘキサマーの高度に保有されたヌクレオチドを 示す）である、従って、仮定のプロモーターを定義するための最小の規準は配列 ＴＡＮＮＮＴ（“Ｎ”は任意のヌクレオチドである）を有するヘキサマーの配列 である。 転写ユニｙ　）　Ｉ及び！ｌＩは、最小の規準、すなわちプリプノウ・が、クス の第一、第二及び第六ヌクレオチドとの相同性、のみを満たす仮定のプロモータ ー（それぞれ１１９９位及び１２６６４位における）を含有することが見出され た。すなわち、これら２つの転写ユニットのための仮定のプロモーターの位置は 非常に仮説的である。転写ユニｙ　）　ＩＩは、Ｅ、コリプロモーターの共通配 列に強い相同性を有する配列を有する仮定の７″口そ一ター（およそ３５８０位 ）を含有していた。グレプノウ・が、クスの配列は６個のヌクレオチド中４個と の相同性を示し、その３個が高度に保存されていることが示される。−３５ヘキ サマーの配列は６個のヌクレオチド中５個との相同性を示し、その４個が高度に 保存されていることが示される。２個のヘキサマー間の距離は１６塩基対であり 、１６〜１９塩基対の共通（ｅｏｎｍｓｎｓｕｍ　）距離と完全に一致する。す なわち、配列決定データーのみからプロモーターを明確に同定することは不可能 であるが、転写ユニット■の仮定のプロモーターが正しい可能性が非常に高い。 ＩＥＩＯ，１１，及び１２図、並びに第３表に示されるデーター（−緒に考慮し て）はガム遺伝子の構造及び構成の統一された様子を示し、そして容易に受け入 れられる特定の情報系を提供する０例えば。 第１１図は、非−アセチル化ガムを生産するキサントモナス細胞を生じさせる挿 入変異が４．７　ｋｂ　Ｂａｆｆ１ＨＩ断片中に存在することを示している。変 異は、３９．９ｋＤの分子量を有する蛋白質生成物（ｇｐＦ　）を規定する７レ ーム２０ＲＰ’を含有する領域中のＤＮＡ配列の７０００位附近に位置する。　 ＤＮＡ配列内の遺伝子の正確な位置を第３表＆Ｃ示す。この情報を用いてＩＥＩ Ｏ図中の遺伝子のＤＮＡ配列を位置付けることができる。 第１１図は、遺伝子がトランスクリプシ、ンユニ。 ト■内に位置し、そしておそらくアセチラーゼ酵素として機能することを示す、 アセチラーゼ酵素の予想されるアミノ酸配列を第１２図に、蛋白質配列にわたり て分布する疎水性アミノ酸残基の高い比率を酵素が含有することを示す追加のデ ーターと共に示す、従って、アセチラーゼ酵素はおそらく細菌膜中レオチドで始 まり、そして８００位附近の転写ターミネータ−に延びるＤＮＡ配列の頒緘は、 ガムの生合成に関与する遺伝子を含有するキサントモナス染色体の領域の外側に 存在するらしいＤＮＡである。この在することを示す。ＯＲＦは２４．４ｋＤの 分子量を有する蛋白質生成物（ｉｐ人）を規定する。遺伝子内に位置するＢ＆！ ！ｌ　Ｈ１部位への挿入はＧｕ♂表現型を有するキサントモナス細厖をもたらす 。従って、ｆＰＡは、ガム生合成に関与する遺伝子を含有するキサントモナス染 色体の領域中の０．３　ｋｂ　Ｂａｍ　ＨＩ断片の左へのどこかで＃３まる転写 ユニット中の量後の遺伝子であろう・ １２人の末端と転写ターミネータ−との間のＤＮＡ配列の領域はグロリンｔ　Ｒ ＮＡ遺伝子を含有することが見出された。このｔ　ＲＮＡ転写物の折したたまれ た二次構造を第１４図に示す、アンチ；トンループの上のＧ及びＣヌクレオチド （第１４図中円で囲んで示す）はおそらく転写におけるこのｔＲＮ人の機能を訪 たげるであろう、このｔＲＮＲＮＡ遺伝子全ガム遺伝子クラスターを完全に除去 する染色体欠失並びにアンチコドンループへの挿入は、欠失の場合には生存する がしかしＧｔ＋ｍ−であり、そして挿入の場合には０口”であるキサントそナス 細胞を生じさせる。従って、このプロリンｔＲＮＡ遺伝子は生存又はガムの生合 成のために必須ではない。 転写ユニット１内に含まれるＤＮＡ配列の領域についてのフレーム分析−＃（第 １１図）は、キサントモナス束体のこの領域が大フレーム１０　ＰＪ’を含有す ることを示す、開始及び終止コドンの位置（算３表）は、ＯＲＦがそれぞれ２３ ．３及び４２．８　ｋＤの分子量を有する２個蛋白質（ｇｐＢ及びｔｐｃ　）を 含むことを示す、１．４及び１．５　ｋｂ　Ｂ為ｍｉ’ｉＩ断片内にＴｎｌＯ挿 入を含むキサントモナス変異株を特徴付けるために行われた研究からの最初の結 果は、これらの蛋白質はいずれも”チャージャー無しく　ｎｏ　ｃｈａｒｇ＠ｒ 　）　”変異表現型を示すことを示した。しかしながら、変異株からの染色体Ｄ ＮＡのサザンブロ、トはＤＮＡが転移（ｒ＠ａｒｒ龜ｎｇ・ｗｅｎｔ　）を受け ることを明瞭に示したから、これらの結果は不確かである。補完実験からのさら に最近の結果は、１．５　ｋｂ　Ｂｍｍ　ＦＢＩ断片の欠失がキサントモナス細 ＪＩにおいて致死的であることを示した。 キサントモナス変異株Ｘ１２３１はＤＮＡの完全な１６ｋｂセグメント（１，５ ｋｂ　Ｂａｒ！ＩＩＩ断片を含有する）の欠失を含有し、そしてこの株はＧｕｍ −であるが、十分に生存し続ける。従って、ｇＰＣもしくはｇｐＩＩ又はその両 者が、機能的なガム遺伝子経路を含有するキサン）そナスｉ８！！において生存 のために必須である。 転写ｚ＝、）ｌを規定するＤＮＡ　（第１１図）は９ｋｂよ抄長く、そして７つ の遺伝子生成物をコードしている４１　ｇＰＪを規定するＤＮＡの領域への挿入 の効果はまだ明らかでない。予備的な結果は、この領域での挿入がおそらく致死 的であることを示唆する。 ｒｐｃを規定するＯＲＦ内の幾つかの位置での挿入により、ガムの量は幾分少な いが正常らしいガムを生産する粘質コロニーを形成するキサントモナス細胞が得 られるｅ　ｒｐｃ中に含有されるアミノ酸の疎水性（第１２図）は、この遺伝子 生成物がおそらく膜蛋白質であることを示す、我々は、挿入変異誘発からの不都 合な効果がなんら存在しないらしいことを説明することができない。転写ユニ、 ト１中の２個の遺伝子（ｇｐＦ及びｇｐＨ）はガムの生合成において自明の役割 を演する。これら２つの遺伝子の変異表現型は、ｇｐＦがアセチラーゼでちし、 そしてｇＴｊＨがトランスフェラーゼｍであることを示す、２つの遺伝子すｐＤ 及びｔｐｒは１チャージャー無しく　ｎｏ　ｅｈａｒｇｅｒ　）　−の変異表現 型を示す。この表現型は、トランスフェラーゼ■を規定する遺伝子並びにガム遺 伝子の転写及び／又は需訳の制御に関与する遺伝子生成物について予想されよう 、この表現型はまた。ガムの生合成のために必要な￥Ｓ素複合体保持するために 構造的役割を演する遺伝子生成物について予想されよう。 トランクフェラーゼ酵素を規定する予想される５個の遺伝子の３個はこれらの変 異表現型から明らかに同定された。これらは、それぞれトランスフェラーゼｍ、 ｙ、及び■であるｇｐＨ、ｇｐＫ　、−及びｒｐＭである（第１１図を参照のこ と）。これらの遺伝子の３個すべてが比較的低い疎水性プロフィールを有するア ミノ諌から成り（第１２図）、そしてガム遺伝子り之スターの右側のＤＮＡ中に 位置する。これらの性５ｔカキサントモナスのトランクフェラーゼ酵素の一般的 ％徴であれば、ｇｐＩ）をガムの生合成のために必要な仮定の制御又は構造蛋白 質として残して、ｇｐＤはトランスフェラーゼ■としての最良の候補である。 ｆＰＥにより占められるＤＮＡの領域への挿入は正常なガム遺伝子経路を含有す るキサントモナスａ胞において致死的であるｅ　１．５　ｋｂ　Ｂａｎ　ＨＩ断 片中に位置する遺伝子の場合にもそうであるように（前記）、ｔＰＥ自体はａｍ の生存のために必須の蛋白質ではない、なぜなら、ｇｐｘを、含む染色体の領域 を失った欠失様はＧｔ＋ｍ−ではあるがしかし生存するからである。 ｇｐｘ並びにｆＰｃ及び／又はｇｐＢは、生成物がｇｐｇ　。 ｔｐｃ　、及び／又はＫＰＨの酵素活性によりさらに代謝されなければ、毒性で ある生成物（ガム遺伝子の機能、により生産される）の蓄積を防止するのに必要 な蛋白質でなければならない。従って、これらの蛋白質は細胞からのキサンタン がムの重合及び輪において機能するらしい。 １２５７０位の転写ターミネータ−に続きそして１、０　ｋｂ断片の右１１Ｂｍ ｍＥＩ部位をせえて（す々わち。 配列決定されたＤＮＡの末端を越えて）延びるＤＮＡは、第三転写ユニ、）であ ると我々が信じるものを規定する。なお、転写ユニ、）ＩＩの末端を規定する転 写ターミネータ−は、わずか−４，４にカロリー／！！＋０１・の自由エネル、 ギー強さくＧ）を有するむしろ短いヘアーーンを有する。ヘアピンの強さが転写 停止の効率に関連するのであれば、この領域で連写の読み数秒の通過が生じる可 能性がある。転写ユニ、）Ｉは明らかに、蛋白質生成物がトランスフェラーゼ■ （ｇｐＫ　）、ケタラーゼ（ｇｐＬ　）　、及びトランスフェラーゼＩＩ　（ｇ ｐＭ　）であることを示す変異表現型により定義される少なくとも３つの遺伝子 を含有する。 トランスフェラーゼ■遺伝子は、１．　Ｏｋｂ　Ｂｍｍ　ＩＩ断片の左＠Ｂａｒ ｎ　ＨＩ部位から２２７塩基対中）する１５２８４位で終る。この点を越えて配 列決定されたＤＮＡの末端に右側に延びて、フレーム分析曲線は、蛋白質生成物 をコードするＤＮＡ　Ｋ特徴的な、３つのヌクレオチド位置における非−ランダ ムＧ＋Ｃ分布を示す。我々はこの領域におけるＯＲＦの位置、範囲、又は数を明 確に規定することはできなかりたが、フレーム分析デーフィールが明らかに示す ところによれば、このＤＮＡは、少なくとも１個の遺伝子、又はおそらく１個の 遺伝子と箕二の遺伝子の小部分を含み、これはまだ配列決定されてい々いＤＮＡ 　Ｋ延びる位の右側におよそ３００塩基対に位置する１、０ｋｂｌ！ｑ片内の挿 入はいずれもＧｕｍ”　ｆｆＥＪ型をもたらす。 一般に、膜蛋白質は高い比率の疎水性アミノ酸（すなわち、Ｐｈ・、Ｔｒｐ　、 　Ｔｙｒ　、　ＩＩｓ　、　Ｌ＠ｔ＋　、　Ｍ＠ｔ　。 及びＶａｔ）を含有する。ガム遺伝子蛋白質のどれが細菌膜中に位置するらしい かを決定するため、コンピューターを使用して各蛋白質配列内の疎水性アミノ冨 の比率及び疎水性領域の分布を決定した。これらのデーターは第１２図中に示さ れ、そして蛋白質ｇｐＩ）、　ｇｐｌｉ：％ｇｐｒ、ｇｐａ、及びｔｐｘが比較 的高北本で疎水性アミノ酸残基（４０チより多い）を含有し。 これらが各アミノ配列にわたりて分布していることを示している。従りて、これ らの蛋白質はおそらく膜蛋白質である。 例１８ この例は、ガム生合成りラスターによりコードされる酵素が異る属の幾つかの代 替宿主株中で発現されることを示す。 トランスフェラーゼ■を認識する抗体をアフィニティークロマトグラフィーによ 抄精製し、そしてウェスタンイムノプロットにおいてトランスフェラーゼ■を検 出するために使用した。トランスフェラーゼ璽として同定される４０ｋｂ蛋白質 に対して特異的な抗ベグチド抗体を含有する血清の製造を＠１１に記載する。こ れらの血清の１つを、カルがジイミドを介してＣＢ−七７アロースに接合した免 疫感作用ペグチドから成るペグチドアフイニティーカラムに吸着せしめた。特異 的抗ベグテド抗体をアフィニティーカラムからグリシン−ＨＣＬ　（０，２Ｍ、 Ｐ（２，６）により溶出し、そしてＴｒｉｍにより中和した。精製された血清は ウェスタンイムノプロット（前記）上でトランスフェラーゼ璽を特異的に認識し た。 アフィニティーＩｆｆ製された抗イグチド抗血清を用いて、ガムクラスターＤＮ Ａ　（例１６）を含有するグラスミド（ｐＫＲ２９０−Ｈ２Ｓｅ　’）又はそれ を含有し危いプラスミド（ＰＲＫ２９０−Ｈｌｌ　）を含有する代替宿主の細胞 溶解物中のトランスフェラーゼ■の存在又は不存在を検出した。試験した株を第 ４表に示す、ウェスタンイムノプロット上でのトランスフェラーゼ誼の存在は、 ガムクラスターＤＮＡが代替宿主株中で発現されることを示した。トランスフェ ラーゼ■はｐＲＫ２９０−Ｈ２Ｓｅを有するシュートモナス・デニトリフィカン ス、シュートモナス・スツ、チェ１）、及Ｕシュードモナス・プチダにおいて発 現された。シュードモナス拳スツ、チェリでの発現レベルはキサントモナス・カ ンイストリスそれ自体におけるそれとほとんど同等であった。これらの代替宿主 でのｐＲＫ２９０−Ｈ２Ｓｅからのトランスフェラーゼｍの発現はおそらく、４ ．７　ｋｂ　Ｂａｎ　ＨＩ断片の左端に位置する本来のＸ、カンイストリスのブ ロモ−ター配列において開始されるメツセンジャーＲＮＡ　Ｉ：ｒ）翻訳に蒼く てあろう０例１７に示したガム遺伝子クラスターのＤＮＡ配列は、トランスフェ ラーゼ■とベクターｐＲＫ　２９０　のグラスミドＤＮＡとの間の仮定の２個の 強力な転写ターミネータ−を同定する１位［８１４−８４４，及び３４５７−３ ４９３に存在するこれらのターミネータ−配列は、該ターミネータ−の上流の転 写を開始するＲＮＡポリメラーゼ分子による、トランスフェラーゼｌ及び他の下 流遺伝子の転写をおそらく防止するであろう、従って、トランスフェラーゼ■遺 伝子を含有する転写物はガム遺伝子ＤＮＡ内で生じなければならず、そしておそ らく３５８０位附近の４．７　ｋｂ　Ｂａｎ　ＨＩ断片中に位置する仮定のブロ モ−ター配列から生ずる。このことは、ガム遺伝子クラスター中に存在し、セし てＸ、カンペストリスにより通常使用される転写シグナルがまた。これらの代替 宿主中でａｍされそして使用されることを主張するものである。このことは、　 ｐＲＫ２９０−Ｈ２Ｓｅにより担持されている多くの又はすべてのガム遺伝子が 代替宿主中で写紙され、そしておそらく翻訳されることを意味している。 試験されたＥ、コリ株においては、このプラスミド造成物から＃喜素は発現され なかった。明らかに、Ｅ、コリでのキサントモナスＤＮＡの発現のためには、Ｅ 、コリのための適切な発現シグナルが存在しなければなら々い０例１３は、適切 なＥ、コリ発現シグナルを有するグラスミドであるｐｐ３からのトランスフェラ ーゼ道の発現を示した。ガム生合成りラスターによりコードされた他の蛋白質− Ｓ種にの代替宿主株において発現され得ることが予想される。 第　４　衣 代替宿主におけるトランスフェラーゼｍの発現キサントモナス・カンペストリス Ｘ９２８（ＩＩＩ−）　−シュードモナス・プチダ（ｐＲＫ２９０−１１３３６ ）　土シュードモナス・フルオレセンヌ（Ｈ２Ｓｅ）　＋シュードモナス・スラ ッチエリ（Ｈ２Ｓｅ）　＋＋シュードモナヌ・デニトリフィカンス（Ｈ２Ｓｅ） 　＋シュートモナス・セパシア（Ｈ２Ｓｅ）　−エンテロバクタ−・クロアカニ （Ｒ３３６）　−ニジエリシャ・コリＬＥ３９２（ｉｉ３３６）　−ニジエリシ ャ・コリ５Ｍ３２（Ｈｌｌ）　−ニジエリシャー＝９ＳｋＢ２（Ｒ３３６）　− この例は、組換プラスミドｐＲＫ２９０−Ｈ３３６及びｐＲＫ２９０−ｉＬ＆３ 　Ｋより担持されたクローン化ガム遺伝子ＤＮＡ　Ｏ領域特定変異誘発のための 方法を記載する・例１０に記載されているプラスミドｐＲＫ２９０−Ｈ３３６に 担持されたガム遺伝子ＤＮＡ（１１１３３６）％及びｐＲＫ２９０−１１Ａ３に 担持されたガム遺伝子り隨℃仏３）に対して領域特定変異誘発を行った。これら のクローン化ＤＮＡセグメントｔインビトロでトランスポゾン変異誘発にかけ、 セして組換ＤＮム技法の使用によってインビトロで変異誘発せしめて、クローン 化Ｘ、カンペ、Ｘ）リスＤＮム内に挿入及び欠失変異を生じさせた。この様な変 異を有するプラスミドを、Ｒ３３６によシ担持されるガム遺伝子ＤＮＡのすべて 又はほとんどすべてを欠く欠失変異株を包含するＸ、力ンベス）ＩＪス受容株に 移した０次に、変異体プラスミドを担持する生ずる受容体株は、プラスミドの変 異から生ずるガム表現型ｔ−直接示す、この方法は、今まで使用された（例７） 遺伝子置換段階の必要性を排除する。 トランスポゾン変異誘発は、Ｋ１５ｅｋｎ・ｒ等％Ｇｅｍ・３２：３６９−３７ ９（１９８４）によシ記載されセして“因子１２”と称されておシ、そしてこの ＭＡｌａ書においてＴｎＫ１２　（Ｋｌ＠ｃｋ＋ａ＊ｒの因子１２）と称される トランス／シンを用いた。このトランス／シンは、丁ｎ５のカラマイシン耐性決 定基を含有するＤＮＡセグメントを担持する。さらに、このＤＮＡセグメントは また、ストレプトマイシンに対する耐ａを；−ドする遺伝子を担持する。この遺 伝子はＥ、コリ中では機能しないが、しかし他のグラム陰性ｌａ菌中では活性で あることが示された。すでに、我々はこの遺伝子がキサントモナスにおいて活性 であシ、そしてグラスミド上でキサントモナスに導入された場合にストレプトマ イシン耐性表現呈を与えることを示した。 従りて、キサントモナスへの丁ｎＫＩ　２の移行はカナマイシン及びストレプト マイシンに対する同時耐性を同様に付与し、従ってＴｎＫ１２挿入を担持するプ ラスミドについての強力な選択を提供するのが当然である。 ！ラスミド移行夷験においてＸ、カンペストリス受容味の選択のために我々がし ばしば使用しなけれはならない薬剤であるリファンピシンに対する耐性を有する Ｅ、コリ株ＫＫ７１３３の染色体にＴｎＫ１２は担持されている。従って、我々 は、我々の最初のＴｔ＋に１２トランスポジシ、ン冥験において受容味として欠 失ａＸ１１０７（第１５図）のクロラムフェニ；−ル耐性（Ｃａｎｅ’）誘導体 を単離し、そして使用した。最初の実験は次のようにして行われた。ｆラスミド ｐＲＫ２９０−Ｒ３３６を、精製されたグラスミドＤＮＡを用いる形質転換によ シＮＫ７１３３株に導入した８次に我々は、供与体としてＮＫ７１３３（ｐＲＫ ２９０−Ｒ３３６）、動員体（ｍｏｂｉｌｉｚ＠ｒ）としテＬＥ３９２（ｐＲＫ ２０１３）、そして受容体としてＸＸｌ１０７Ｃａ’ｉ−用いて三！（ｔｒｉｐ ａｒ＠ｍｔａｌ）交配（ｍａｔｉｕｒ）’を行った。これらの株の新鮮な一夜冶 養物をＬＢ中で１回洗浄し、セして３−ずつの親を一緒に混合し、そして０．４ ５μｍフィルターを通して濾過した０次に、フィルターｉＬＢプレート上で３０ ℃にて４時間インキ、ベートした０次に、細胞をフィルターから３−０１ａｊ　 （合計）のＹＭ培地に再懸濁した。アリ；−トｔ、クロラムフェニコール、カナ マイシン及ヒストレプトマイシン、又はストレプトマイシンのみを含有するｎ唖 プレート上にプレートした。各タイプの培地１５プレートずつのそれぞれＫ　（ Ｌ　１−の再懸濁された交配混合物を拡げた。プレー？’ｉ３０℃にて６〜１２ 日間インキ、ベートし、そして計数した。 この実験から本発明者等は最終的に１００個のＫｍｎｒＳｔｒ’　：Ｉロニーを 得た。これらのほとんどがＧｕ♂であシ、そして外観的に野性型でらりた。７個 がＧｔ＋ｍ−であシ、そして５個のコロニーが明瞭に粘質であったが、しかし野 性型Ｇｕｍと社形態的に異るようであった。　Ｘ１１０７のこれらのＫａｍ　Ｓ ｔｒ　誘導体の１５個を、Ｅコリ１ＩＢ１０１及びＸ、カンペストリス５４Ｌｒ ｉｆ−１０１（Ｒ６８，４５ｔ＠ｔ　：：　Ｔｔ＋７　）との三親交雑によシ交 配させた。ｆラスミドＲ６８−４５１＠ｔ　：　：　Ｔａ２は接合活性ツラスミ ドＲ６８，４５のテトラブイゾリン感受性誘導体である。この交配において、こ のプラスミドは、Ｅ、コリへのｐＲＫ２９Ｇ−［３３６：　：　Ｔ！１幻２ｇ！ 導体の移行を指令する動員体として役立つ、テトラサイクリン耐ｖＥヲコードす るプラスミド遺伝子は不活性化される（　Ｔ！１７の挿入によシ）から、ｌＯμ ｓ　／ＨＡのテトラサイクリン上での３７℃における増殖による選択によるＴｅ ｔ’Ｅ、コリについての選択は、１ｉＢ１０１へのｐｌ’ＬＫ２９０−Ｒ３３６ Ｂ導体の移行について特異的な選択をもたらす、これらのグラスミドの物理的構 造の分析はキサントモナスにおけるよシＥ、＝すにおいて技術的に容易である。 １４回の交配のすべてが、受容体当シ１０５〜１０’の頻度で五ＢＩＯＩの丁・ ｔｒ誘導体をもたらした。 これらの株からプラスミドＤＮＡ　’ｋ　ｍ製し、そして１１１１限エンドヌク レアーゼ消化、及びアガロースゲル電気泳動によシ分析した。％定のｓＩ限断片 の分子量の分子ｔｔ−１断片の移動度と既知分子量を有するＤＮム断片標準の電 気泳動移動度とを比較することによシ決定した。Ｉ＃定の酵素によシ生成されｆ ｃ　Ｉｆｊ限断片のパターンは、丁！１に１２挿大の位置を決定することを可能 にし穴、これらを第１５図に示す、　ｐＲＫ２９０−Ｈ３３６のクローン化ガム 遺伝子ＤＮＡ　Ｗｒ片中に１１個の挿入が存在することが見出された。これらの 挿中のすべてが、特定の８８体プラスミドがＸ１１０７甲に存在する場合に粘質 表現屋又ｔｉＧｕｍ−をもたらした。２個ＯＧｍｍ＋グラスミドが分子のｐＲＫ ２９０位置中にＴｎＫ１２挿入部を含むことが見出された。これはＧｕｍ表現表 現一致する。１つの挿入がベクター中であるがしかしガム遺伝子ＤＮＡの比較的 近くに存在した。　Ｘ１１０７（ｐＲＫ２９０−Ｈ３３６，１３）株は多量のガ ムを生産するが、この挿入がわずかに異るＧｕｍ表現表現−態的に）をもたらし た、このプラスミド変異誘発系がクローン化ガム遺伝子ＤＮＡ内の変異を効幕的 に単離しそして検出することを可能にした。幾つかの小さい変更を伴りてこの方 法を用いて、本発明者等はｐＲＬ！９Ｏ−Ｈ３３６中の一組のＴ！ｌＫ１２挿入 変異を単離し、そしてＩ＃　ｆＫ　ｆｒけた。幾つかの実験において、異る１つ のＸ、カンペストリスＧｔ＋ｍ−欠損株を用いて、この欠損株Ｘ１２３１（第１ ５回を参照のこと）はｐＲＫ２９０−Ｈ３３６によシ担持され九ガム遺伝子ＤＮ Ａ’のすべてについて欠損している。幾つかの実験はまた、異る選択方法を用い た。 例えば、幾つかの場合、丁！ｌＫ１２の）ｉ：、＝すからＸ。 カンペストリスへの移行を選択するために、カナマイシン＋ストレプトマイシン 、又はストレグトマイシンのみを用いた。最終的に、　ｐＲＫ２９０−Ｈ３３６ への？ｎＫ１２の挿入４５個を単離し、そして分析した。これらの雌とんどはガ ム遺伝と共に存在することが見出され、そしてほとんどが単純挿入であったが、 幾つかは二次的ＤＮＡ転移の証拠を示した。 挿入及び欠失変異をさらに、トランヌポゾンＴｎ９０３のＬ３ｋｂｌｔｌ限断片 を用い６インビトロ変異誘発によシ、ｐＲＫ２９０−五３３６及びｐＲＫ−ＥＡ ３において単離によシブラスミド（ｐＵＣ４−Ｋ）から切シ出すことができらし 、この末ｍはＤＮＡ−リンカ−２分子の付加によって変形して他の制限部位に連 結され得るＤＮＡ床端を生じさせることができる。 一般に、この断片による挿入変異誘発の方法は、例７に記載し次ようにプラスミ ドｐＭＭ７９中に担持されたクローン化ガム遺伝子ＤＮＡ内での挿入及び欠失変 異を単離するために使用された方法に類似する。 プラスミドｐＵＣ４−Ｋ　’！１−適切な制限エンドヌクレアーゼにより消化し 、そして次Ｋ　Ｋ３　ｋｂ　Ｋａｎ’断片を、グル片からの電気溶出によシ分取 用アガロースゲルから精製した。　Ｋａｍ’断片の末端にＤＮＡリンカ−分子を 付加する必要がある場合、ｐＵＣ４−にのＨ１ｎｅｌ消化物を所望のリンカ−分 子に連結した後、分権電気泳動の段階を実施したｅ　Ｋ＆！ｌ’　ＤＮＡ断片の これに続く精製により未連結のリンカ−分子を除去した０次に、精製されたＬ　 Ｂ　ｋｂ　Ｋａｎ’断片をインビトロ変異誘発実験に用いた。これらの実験にお いては、反応に加える制限酵素の量ｔ−ｍ限することによシ、精製されたプラス ミドＤＮＡに対して部分的制限エンドヌクレアーゼ消化上行りた。適当な量の所 定のＦ＃素を反応に加えることによシ、わずかに切断されｆｃ線状分子を高比重 で得た。各特定の酵素の適当な址は実験的に決定した０次に、精製されｆｃ　Ｋ １　ｍ　’断片を部分消化されたゲラスミ）ＤＮムに連結する。この連結反応の 生成物を用いてＥ、；すを形質転換し、そしてカナマイシン耐性形質転換体の選 択によシブラスミド中のある制限部位に挿入されたｍａｎ’　ＤＮＡ断片を含有 する組換グラスミド分子を選択する＊　Ｋａｍ’形質転換体からのプラスミドＤ ＮＡｔ−分析して特定の挿入変異の位ｔｔ同定スる。ｍ限エンドヌクレアーゼに よシ２回以上切断されたプラスミド分子にＫａｍ　ＤＮＡ断片が連結された場合 、欠失変異が得られた。プラスミドＨ３３６及びＨＡ３中に形性された挿入及び 欠失変異を第１５図に示す。 インビ〆及びインビトロで生じた挿入変異の表現型を分析するため、変異体プラ スミド′＠：接合によシＸ、カンペストリスＧｗｕｏ−欠失変異に移した。ｐＲ Ｋ２９０−Ｈ３３６の変異誘導体を、プラスミドによシ担持された挿入変異の影 響がガム表現型が反映するであろう欠失変異株Ｘ１２３１に移した。多くの変異 の表現型を例２に記載した方法によジインビトロ及び／又はインピダで分析した 。ある挿入度Ａを担持するプラスミドは欠失株Ｘ１２３１に移行することができ なかりた。 これらの挿入変異が致死的であるか、又はＸ、力ンペス）ＩＪスにおいて非常に 不都合である可能性が最も強い、これらの変異及び他の致死変異を例２０に記載 する。 例２０ この例は、ガム遺伝子クラスター内の致死変異の証明を記載し、そしてこれらの 致死変異によシネ活性化された蛋白質の可能性ある機能について検討する。 例１９に記載したように、ｐＲＫ２９０’Ｂ５３６に担持されたクローン化ガム 遺伝子ＤＮＡへのＬ３ｋｂＫ為１ｒ断片のインピトｒ：ｚ挿入によシ変異をガム 遺伝子ＤＮＡ中に単離した。これらの挿入変異プラスミドｔ−１，＝ｒす中で造 成しそして分析した。これらの変異株のＧ＊ｗｍ表現型を評価するため、本発明 者等は次に、変異体プラスミドｔ−Ｇｔ＋ｓｍ−欠失株Ｘ１２３１　Ｋ接合にょ シ移すこと’を試みた。はとんどの変異体プラスミドが標準的三栽交配によル効 皐的ＫＸ１２３１に移行した。しかしながら、少数の変異体プラスミドはＸ１２ ３１　Ｋ移行せず、又は低頻度で移行した。 １つのこの様なプラスミドはｐＲＬ２９０−ＩＨ３３６，ＫＨ２（ＫＨ２）であ りた、このグラスミドはガム遺伝子クラスターのＤＮＡセグメント内の６０８９ 位のＥｃｏＲ１部位への挿入を含み、そして例１７に記載したような・　ｇｐＥ をコードするオーブンリーディングフレー五を中断する・これは、この遺伝子を 中断する、今まで得られた唯一の挿入である。この挿入変異体デラスミ）’　ｐ ＲＫ２９Ｇ−Ｘ３３６．ＫＨ２’ｉ　Ｘ１２３１移すための本発明者等の最初の 試みは失敗し、との実験を反復した場合も同様でｈ−）た、この結果は、ＫＲ９ 挿入がＸ、カンペストリスにおける致死変異である可能性を示唆した・次に１本 発明者等はＫＨ２ｔ−他のＸ、カンペストリス株に移すことを試みた。受容様Ｘ １２３１及びＸ７７との間でガムＤＮＡ　ｉ欠（Ｇｔ＋ｍ″″欠失株を用いて交 配を行つた。この株は４．７　ｋｂ　ＢｓｍＨｌ　断片の無傷のコピ。 −を有し、そしてそれ故に挿入ＫＲ９によシネ活性化され次遺伝子の無傷のコピ ーを有する。この実験において％Ｋｌ！９　’ＩＨ再びＸ１２３１に移した。し かしながら、プラスミドは容易にＸ７７及びＸ１２０５に移った。　Ｘ１２０５ 株においては、プラスミドは１ガム状″表現型をもたらした。このことは、Ｘ１ ２０５の染色体欠失によシ失われた遺伝子の機能がプラスミド上のクローン化ガ ム遺伝子ＤＮＡの対応するセグメントによシ補完されたことを示す、これらの結 果は、ＫＲ９挿入が致死変異であるとする見解と一致する。しかしながら、ＫＲ ９変異によシネ活性化された遺伝子は必須遺伝子自体ではあシ得ない、なぜなら 、この遺伝子は多数の大きな欠失味、例えばＸ１２３１％Ｘ１１０７、及びＸ１ １０６において除去されておシ、これらは生存可能であるからである。従りて、 ガム生合成経路の残ルが機能可能なままである場合にのみＫＲ９変異が致死的で あるようである。 配列内の１１，７１６位のＳｐ＠１部に挿入変異を担持する２つの挿入変異体プ ラスミドについて同等の結果が観察された。これらの変異体プラスミドｐＲＫ２ ９Ｇ−Ｈ３３６，ＫＳｐ１２（ｉｃｓｐ１２）及びｐＲＫ２９０−Ｘ３３６．に ８ｐ１３（Ｋ８ｐ１３）は挿入されたＫａｎ’ＤＮＡ断片の方向のみを典にする 。一連のＸ、カンイストリス受容株を用いる標準的二親交配において、両プラス ミドはＧｗ＋論受容株Ｘ１２２９に、及びその染色体中に３．５　ｋｂ　Ｂａｍ ＨＩ　ｌＦＦ片の野性型コピーそしてそれ故Ｋ　ｇｐＪをコードする遺伝子の野 性型コピーを担持するＧｕｍ−受容体Ｘ１２１７に効率的に移行した。これら２ つのプラスミドのＧｍｍ″″受容株Ｘ１２０５への移行はおよそ３オーダー低く 、そしてＧｔｕａ−株Ｘ１２３１への移行はさらに低い、　Ｘ１２０５での欠失 鉱λ５　ｋｂ　ＢａｍＨＩ断片を除去するが、しかしその他の点では）Ｑ２１７ と同じである。　Ｘ１２３１は量大のガム遺伝子欠失であシ、そしてｐＲＫ２９ ０−Ｘ３３６並びにその挿入誘導体例えばＫＳｐ１２及びＫＳｐ１３によシ担持 されたクローン化ガム遺伝子開ムのすべてを除去する。これらの結果は、ＫＦ； ｐ１２及びＫＳｐ１３の挿入がＸ、カンベスト９スにおいて有害であるか又は致 死的であシ得ることを示している。 やや異る実験方法を用いて、本発明者等社好運にも、ガム遺伝子クラスターの残 りが無傷である場合Ｋ　Ｌ　５　ｋｂ　Ｂａｎ　Ｈ１断片の欠失致死的であるこ とを見出した。第１Ｏ図に示すようにグラスミドｐＲＬ！９Ｏ−ＨＡ３（ＩＬＡ ３）は１．４ｋｂ及び１．５ｋｂＢ賎Ｈ１断片以外のすべてのガム遺伝子クラス ター開ムを含有する。Ｌ５及び４７　ｋｂ　Ｂａａ　ｍｌセグメントを画するＢ ａａ　Ｈｌ　にオケルガムクラスーーの破壊の効果を決定するため、本発明者等 はＨＡ３　プラスミドを担持する欠失味Ｘ１１０６の表現Ｗｌを決定することに 興味をもりた。従りて、巳３のベクタ一部分内ＫＴ！ｌＫ１２挿入を担持するＨ Ａ３の誘導体（１１Ａ３．１　）を欠失Ｘ１１０６に移した。この株は粘質でち ることが見出され、これはガムの生合成にために必須の遺伝子はこのＢａ１！Ｉ 　Ｈ１部位を含有しないことｔ示した。さらに１これはＨＡ３．１のクローン化 ガム遺伝子が該プラスミドから層れて発現されることを示している。 しかしながら、本発明者等がＨＡ３．ｌを欠失Ｘ１１０７及びＸ１２３１に移す ことを試みた際、さらに興味深い観察が行われた０本発明者等は、１．５　ｋｂ 　Ｂａｇ　ｍｌセグメントの効果的な欠失（Ｘ１１０７中）並びにＬ５及びＬ　 ４　ｋｂ　Ｂａｎ　１１断片の両者の欠失（Ｘ１２９１中）から生ずる表現型を 分析することを望んだ０本発明者等が見出したことは、ＨＡ３．ｌがいずれの欠 失味にも移行し得ないことでらりた。この実＃ｋを反復し、そして結果を確かめ た。　ＨＡ３．１はＸ１１０６及びＸ７７（野性型）に容易に移行したが、しか し１１０７又はＸ１２３１には移行することができなかりた。従りて、はいずれ も致死変異であると結論する。しかしなが断片を欠きそして生存するので、との 欠失によシ除去された遺伝情報はそれ自体必須でないことが真実でな轢ればなら ない、再び、とのむとは、ガム遺伝子経路の残シが機能的である場合に１．５　 ｋｂ　Ｂａ！！１１１断片の欠失が致死的となることを示唆している。 本発明者等は、ガム遺伝子カラスター中の少なくとも３つの異る変異が致死表３ Ｊ屋を有する証拠を得た。この致死性は、ガム生合成経路の少なくともある部分 が活性のままである場合にのみ現われるようである。欠けｆｃ機能、こよ！ｌ１ 通常では代謝される毒性生成物の蓄積がこの致死性を説明することができるかも しれない、このようなモデルにおいて、他のある種の遺伝子機能が欠妙る場合に ガム生合成経路（又はそのある部分）の活性が致死性をもたらすのかも知れない ０例えば、このような遺伝子はポリメラーゼをコードしているかも知れない、Ｃ ５５脂質が増殖−細胞壁合成−のために必須の他の少なくとも１つのａｍ胞機能 において絶対的に必須であるから、ｃ５５ｍ質に結合したペンタサツカライドの 合成が致死的であるのかもしれない、す表わち、代謝されない形態へのＣｓｓ脂 質の引退が致死性を惹起するのかもしれ々い、あるいは、この様な遺伝子は細胞 からのポリマーの輸送に関与する蛋白質をフードしているのかも知れない、輸送 系の非存在下での！リマーＯ合成が細胞増殖に対する有害効果を有しそして致死 的であシ得るのかも知れない、“致死的°遺伝子がトランスフェラーゼをコード している可能性もある。トランスフェラーゼ遺伝子は今日まで同定されていない 、おそらく、トランスフェラーゼＶ欠損は致死的であシ得よう、このものは微生 物に対して毒性のポリマー（ポリテトラマー）の生合成をもたらすからである０ 例えば、ポリテトラマーはキサンタンを正常に分泌する輸送系によシ輸送される でちろう・ 経路中の早い段階におけるガム生合成の！ロッキングが致死性を抑生ずるという 仮説を試駆することができよう、この実験においては、大Ｇ１ｌｍ−欠失と珈ヌ クレオチド変異との間に二重変異を構成する。 ＵＰＤ−グルコース合成を久く株はキサンタン生合成を開始することができず、 そしてそのためにこの致死性に従わない、従って、致死的挿入変異を担持する！ ラスミドはこの様な二重変異体に容易に移行し、そしてそれによシ維持される。 これが正しいことが証明されれば、糖ヌクレオチドが外的に供給されるキサンタ ン生合成のインビトロ分析を通して、“致死遺伝子″によシコードされた機能を 同定することができよう、この発明の方法及び生成物において種程の変法及び変 形を行うことができることが当業者にとりて明らかであろう、従りて、この発明 の変法及び変形は、それらが、添付された請求の範囲及びその均等の範囲に入る 限シ、この発明はそれらを含むことが意図される。 浄書（内容に変更なし） 浄ｉＩ（内容に変更なし） λ１０５９クローンの江ＨＩ飢御地区 浄書（内容に変更なし） 浄ｌＦ（内容に変更なし） ：′（ケｌ内容に変更なし） ｒｌｆ”　／ハ乙ｎ −身＾　ＩＡＩＡ　１ ｒｔ以ｌυ（ｉ） ／　／Ｗ、／Ｖ１≦−Ｉ ＦＩＧ、１０（３） ８５０　８６０　１！７０　８ｇＱ　Ｂ！ＩＱ　９００９工０　９２０　９３０ 　９４０　９５０　５５０１０３０　１０４０　１０ｓ口　１０［０！０７０　 １ｃｓＯ１０９０）Ｗｏｏ　１１１０　１１２０　１１３０　１１４０１ユ５０ 　ユ１６０　１１フ０　１１８り　１Ｌ９０　１２０ロ１２ユ０　ユ２２０　ユ ２３０　ユ２４０　１２！Ｏユ２６０ＣＧＴ？ＣＧ？ＧＣ？　ＧＧＣｚニー、、 Ｇ）＝Ｇ　ＣＣＧＧ７ＴＧｋＡＴ　ＧＣＴＧＣＧＣＧＡＧ　Ｇ”：ＣＣＴｃ℃Ｃ ＣＡＣＣ（Ｊ−ＡbＡＧＡ ＧＣＡＡ（ｔｃＡｃＧＡ　ＣＣＧＣにＧＡＣ〕ＣＣＣごＣ入ＡＣ？フＡ　ＣＧ入 ＣＧＣＧＣτＣＣＡＧＧＡＣＡＧＧＧ　？（ｒＧｗ−−ＧＴbτ ＦＩＧ、１０（４〕 ＦＩＧ、　１０（５） ｃＡＧＣＴＧ）Ｊ＊ＣＴ　ＡＣＣ？ＧＡ？ＧＡＣＣＧＣＧＣＧＧＧＡＣＣｋＧＡ ＧＣＧＴＣＧ　ＡＧＡＣＣＧＡＣＴＡ　ＧＴＡＧＧＡＣ？Ａf ＦＩＧ、１０（６） ２１１０　２）２０　２１３０　２１４０　２Ｌ５０　２１６０２２３０　２２ ４０　２２５０　２２６０　２２フ０　２２８０２２９０　２３０ロ　２３）０ 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（２）図面の翻訳文（第１図〜４図、７図、１１図〜１４図） （３）委任状 ７、補正の内容 （１）＜３）　別紙の通り （２）図面の翻訳文の浄書（内容に変更なし）８、添付書類の目録 第１項の規定による書面　１通 （２）図面の翻訳文（第１図〜４図。 ７図、１１図〜１４図）　１通 （３）委任状及びその翻訳文　各１這 国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ポリサッカライドの製造のための組換ＤＮＡ法でわって、 （ａ）ポリサッカライドを生産するように代着宿主徴生物を指令することができ る少なくとも１個のポータブルＤＮＡ配列を調製し； （め）宿主微生物に移行することができそしてその中に複製することがてきる少 なくとも１種類のベクターであって、前記ポータブルＤＮＡ配列によりコードさ れた生合成酵素の発現のための要素を含有するベクターに、該ポータブルＤＮＡ 配列をクローン化し；（ｃ）前記ポータブルＤＮＡ配列含有するベクターを、該 ポータブル配列の指令のもとでポリサッカライドを生産することができる宿主微 生物に移行せしめ； （ｄ）前記ベクターの維持及び前記ポリサッカライドの台数のために適当な条件 下て前記宿主徴生物を培養し；そして （ｅ）前記ポリサッカライドを採取する；ことを含んで成る方法。 ２製造されるべき前記ポリサッカライドがキサンタンガムである、請求の範囲第 １項に記載の方法。 ３．製造されるべき前記ポリサッカライドがポリトリマーである、請求の範囲第 １項に記数の方法。 ４．製造されるべき前記ポリマーが非アセチル化ポリトリマーである、請求の範 囲第１項に記載の方法。 ５．製造されるべき前記ポリサッカライドがポリテトラマーである、請求の範囲 第１項に記載の方法。 ６．製造されるべき前記ポリサッカライドが非アセチル化ポリテトラマーである 、請求の範囲第１項に記載の方法。 ７．製造されるべき前記ポリサッカライドが非ピルビル化キサンタンガムである 、請求の範囲第１項に記載の方法。 ８．製造されるべき前記ポリサッカライドが非アセチル化キサンタンガムである 、請求の範囲第１項に記載の方法。 ９．製造されるべき前記ポリサッカライドが非アセシル化且つ非ピルビル化キサ ンタンガムである、請求の範囲第１項に記載の方法。 １０．少なくとも１種類のそれぞれが、トランスフエラーゼＩ、トランスフエラ ーゼＩＩ、トランスフエラーゼＩＩＩ、トランスフエラーゼＩＶ、トランスフエ ラーゼＶ、アセチラーゼ、ケタラーゼ、及びポリサッカラーゼから成る群から選 まれた酵素をコードする１又は複数のポータブルＤＮＡ配列を含有する、特許の 範囲第１項に記載の方法。 １１．前記少なくとも１種類のベクターがｐＫＲ２９０−Ｈ３３６及びｐＸ２０ ９から成る群から選ばれたベクターを含んで成る、請求の範囲第１項に記載の方 法。 １２．前記少なくとも１種類のベクターがさらに糖ヌクレオチドの合成を指令す る酸素をコードする少なくとも１つのポータブルＤＮＡ配列を含んで成り、該糖 ヌクレオチドがＶＤＰ−ダルコース、ＶＤＰ−ダルクロン酸及びＣＤＰ−マンノ ースから成る群から選択されたものである、請求の範囲第１０項に記載の方法。 １３．前記宿主が高い合成速度で前記ポリサッカライドを生産することができる 、請求の範囲第１項に記載の方法。 １４．前記宿主が上異した温度において前記ポリサッカライドを生産することが できる、請求の範囲第１項に記載の方法。 １５．前記宿主が３０℃より高温において前記ポリサッカライドを生産すること ができる、請求の範囲第１４項に記載の方法。 １６．前記宿主が嫌気的条件下で前記ポリサッカライドを生産することができる 、請求の範囲第１項に記載の方法。 １７．前記宿主が脱窒細菌である、請求の範囲第１項に記載の方法。 １８．前記宿主がクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｎｍ）の細菌から選択 される、請求の範囲第１６項に記載の方法。 １９．前記宿主が、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｎｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄ ａ）、シードモナス・セパシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｃｅｐａｅｉａ）、シ ュードモナス．デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｄｅｎｉｔｒｉｆ ｉｃａｎｓ）、シュードモナス・フルオレセンス（Ｐａｅｎｄｏｍｏｎａｓｆｌ ｕｏｒｅｓｃｏｎｓ）、シュードモナス・スツッチェリ（Ｐａｅｎｄｏｍｏｎａ ｓａｔｕｔｚｅｒｉ）、エシェリシャ・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ）、及びエンテロバクター・クロアカエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｃｌｏａｃ ａｅ）から成る群から選択される、請求の範囲第１項に記載の方法。 ２０．トランスフェラーゼＩ、トランスフェラーゼＩＩ、トランスフェラーゼＩ ＩＩ、トランスフェラーゼＩＶ、トランスフェラーゼＶ、アセチラーゼ、ケタラ ーゼ及びポリメラーゼから成る群から選択された少なくとも１種類の酵素を合成 するように微生物細胞を指令することができるＩ又は複数のプラスミドを含んで 成る製造物品。 ２１．プラスミドｐＸ２０９。 ２２．プラスミドｐＲＫ２９０−Ｈ３３６。 ２３．Ｅ・コリＬＥ３９２（ｐＲＫ２９０−Ｈ３３６）株の微生物。 ２４．Ｅ・コリＬＥ３９２（ｐＸ２０９）株の微生物。