CN1059761A - Dna及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及含有酰基氨基酸消旋酶编码基因的 DNA片段。利用该DNA片段，可在工业上以高效 率生产酰基氨基酸消旋酸。

Description

本发明涉及发酵生产酰基氨基酸消旋酶的方法和该方法中所使用的新型微生物以及用于产生该新型微生物的新的DNA片段。

酰基氨基酸消旋酶广泛分布于放线菌中。它是一种催化具有光学活性的N-酰基氨基酸的消旋作用而对具有光学活性的氨基酸则无作用的专一性酸，并且详细性质也已弄清（美国专利4，981，799;Abstracts  of  Papers  Pesented  at  the  1990  Annual  Nleeting  at  the  Japan  Society  For  Bioscience，Biotechnology，andAgrochemistry，Page  368，1990）。

如上所述，酰基氨基酸消旋酶是一种可用于生产光学活性氨基酸的酶。但是，迄今未找到一种令人满意的方法，能够以低成本、高效率生产该酶。因此，人们一直等待着一种更好方法的出现。

在这种情况下，本发明人进行了深入的研究并对由拟无枝菌酸属（AmycoLatopsis）TS-1-60产生的酰基氨基酸消旋酶进行了报道（Abstracts  of  PapersPresented  at  the  1990AnnualMeetiny  of  the  Japan  Societyfor  Bioscience，Biotechnology，and  Agrochemistry，page  368，1990）。而且，他们成功地克隆了编码所说的拟无枝菌酸属TS-1-60酰基氨基酸消旋酶的DNA，并且在进一步研究的基础上完成了本发明。

本发明提供了含有酰基氨基酸消旋酶编码基因的DNA片段、其中插入了该DNA片段的载体、被该载体转化且能够产生酰基氨基酸消旋酶的新的微生物以及使用该微生物生产酰基氨基酸消旋酶的方法。

图1显示了实施例3所测定的酰基氨基酸消旋酶编码基因的碱基序列;图2显示了实施例1所获得的含有酰基氨基酸消旋酶编码基因的DNA片段的限制性酶切图谱;图3显示了质粒pRA4的制备方法;图4显示了质粒pRA7的制备方法;图5显示了质粒pRA4A的制备方法;图6显示了质粒pRA7A的生产方法;图7显示了质粒pRA4N的生产方法;图8显示了质粒pRA4NB的生产方法;图9显示了质粒pET-3cN的生产方法。

本发明的含有酰基氨基酸消旋酶编码基因的DNA片段（以下偶尔也称作编码酰基氨基酸消旋酶的DNA或简单地称作酰基氨基酸消旋酶DNA）是由发明人首次发现，并可通过以下步骤产生：从产生酰基氨基酸消旋酶的放线菌例如链霉菌Y-53（IFO14596;FERM  P-9518）或拟无枝菌酸属TS-1-60（IFO15079;FERM  BP-3092）或其它菌株中分离相关的DNA，将读DNA插入噬菌体或质粒，用产生的重组噬菌体或质粒转化宿主，培养所获得的转化株，通过适当的方法（例如利用酰基氨基酸消旋酶抗体的免疫测定法或利用DNA探针的噬斑或菌落杂交法）从转化株体中分离含有所需DNA的噬菌体或质粒，从该噬菌体或质粒中切割出所需的克隆DNA并将该克隆DNA亚克隆至合适质粒中。可将如此获得的DNA插入质粒或噬菌体，然后将所产生的重组体用于转化宿主，例如大肠杆菌、放线菌或酵母。

以上所给出的IFO号代表大坂发酵研究所（IFO）的保藏号，FERM  P或FERM  BP号代表国际贸易和工业部工业科学技术厅发酵研究所（FRI）的保藏号。以下相同。

TS-1-60菌的典型菌学性质如下：

（a）形态

于280℃在液体营养培养基[如Trypticase  soy  Broth（Becton  Dickinsor）]振荡培养24-48小时后，基生菌丝体分裂成类似杆菌的小片段或分枝的短菌丝。

琼脂培养基中的基生菌丝体呈Z字形，气生菌噬体通常呈直形或曲折形。

在琼脂培养基ISP-2和ISP-7上观察到顶孢，孢子呈具有光滑表面的圆柱形（0.3-0.5X0.6-2.3μm）

（b）培养特征

表1显示了TS-1-60菌株在各种培养基上的培养特征，表1中所示的颜色是通过与“色谱手册”（“Color  Harmony  Manual”，4th  edition，Container  Corporation  of  America）中的色条比较而测定的。

（c）生理特征

黑色素形成  -

牛奶凝结  -

牛奶胨化  -

白明胶液化  -

淀粉水解  -

NaCl耐量（%）  5〈  〉7

生长温度范围（℃）  13-37

最佳生长温度（℃）  20-30

不生长温度（℃）  40

（d）碳源利用

能利用：L-阿拉伯糖，D-木糖，D-葡萄糖，D-果糖，肌醇，D-甘露醇。

不能利用：蔗糖，L-鼠李糖，棉子糖。

至于插入所说的DNA于其中所适合的质粒，此处可讲述的就有来源于大肠杆菌的pBR322[Gene，2，95（1977）]、pBR325[Gene，4，121（1978）]和puc13[Gene，19，259（1982）]。能够在宿主中复制和维持的任何其它质粒均可使用。至于插入所说的DNA于其中的噬菌体载体，此处所讲述的例如λgt11[Young，R和Davis，R，ProcNatl、Acad、Sci、U.S.A，80，1194（1983）]。能够在宿主中繁殖的其它噬菌体载体也可以使用。

作为将所说DNA插入到质粒中的方法，可以讲述的例如Maniatis，T.等，Molecular  Cloning，Cold  Spring  Harbor  Laboratory，page239（1982）中所述的方法。适用于将DNA插入噬菌体载体的方法，例如Hyanh，T.V.等在DNA  Cloning，a  practical  approach，1，49（1985）中所述的方法。由此产生的重组质粒或噬菌体载体被引入适宜宿主如大肠杆菌（E.coli）。

可以讲述的大肠杆菌的例子有：大肠杆菌K12，DH1（Proc、Natl、Acad、SciU.S.A，60，160（1968）]，JM103[Nacl  Acids  Res，9，309（1981）]，JA221[J.Mol  Bicl.，120，517（1978）]，HB101[J.Mol，Biol，41，459（1969）]和C600[Genetics，39，440（1954）]。

可以讲述的用质粒转化宿主的方法是Maniatis，等在Molecular  Cloning，Cold  Spring  Harbor  Laboratoyy，Page239（1982）中所述的氯化钙法或氯化钙/氯化铷法。可通过例如体外包装技术将噬菌载体引入培养的大肠杆菌中。

可通过以上所述的方法或其它类似方法得到含有酰基氨基酸消旋酶DNA的放线菌DNA库。

通过Huynh等的方法[DNA  Cloning，a  practical  approach，1，49（1985）]利用噬菌体载体λgt11和酰基氨基酸消旋酶抗体，或通过利用根据拟无枝菌酸属TS-1-60酰基氨基酸消旋酶氨基酸序列化学合成的核苷酸作为探针的菌落杂交或噬斑杂交方法[Maniatis，T等，Molecalar  Cloning，Cold  Spring  Harbor  Laboratory，（1982）]可由放线菌DNA文库中克隆出酰基氨基酸消旋酶DNA。

必要时或合宜时，可将所克隆的酰基氨基酸消旋酶DNA亚克隆至一质粒中，如pBR322，pUC12，pUC13，pUC18，pUC19，pUC118或pUC119。

通过Maxam-Gilbert法[Maxam，A.M.and  Gilbert，W.Proc.Natl.Acad.Sci  U.S.A.174，560（1977）]、双脱氧法[Messing，J等，Nucl.Acids  Res，9，309（1981）]或DeaZa法[Mizusawa，S等，Nucl，Acids  Des，14，1319（1986）]对所得DNA进行序列分析，并将其碱基序列与已知氨基酸序列相比较以证实酰基氨基酸消旋酶DNA的存在。当酰基氨基酸消旋酶编码区并未完全包括在内时，可使用DNA片段作为再克隆酰基氨基酸消旋酶的探针进行菌落杂交，从而填补缺失的部分。

按以上方式可获得编码酰基氨基酸消旋酶的DNA。

本发明的一个编码酰基氨基酸消旋酶的DNA的典型例子是以下所述实施例中所获得的编码酰基氨基酸消旋酶的DNA，其限制性酶切图谱示于图2。

按以上方式克隆的编码酰基氨基酸消旋酶的DNA可就此使用，或根据需要在用限制酶消化或定点诱变[Methods  in  Enzymology，100，468（1983）]以改进质粒后使用。

使用启动子，如lac启动子、tac启动子[de  Boytr，H.A，Camstock，L.J，Vasser，M.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，80，21（1981）]、T7启动子[Tabor，S.，Richardson，C.C.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82，1074（1985）]等，可在大肠杆菌中大量表达上面提到的编码N-酰基氨基酸消旋酶的克隆DNA。

培养被上述克隆DNA转化的微生物（如放线菌、大肠杆菌、酵母），从而可从培养基中回收所产生的酰基氨基酸消旋酶。

通过以上方法也可能改善酰基氨基酸消旋酶本身的某一或某些性质（如酶活性、稳定性）。

用于表达的宿主的例子有变铅青链霉菌TK64和大肠杆菌HB101。也可以使用其它放线菌、其它大肠杆菌、枯草芽孢杆菌以及酵母。

放线菌的转化本身是已知的，可按Hopwood，D.A.等在Genetic  Manipulation  of  Streptomyces，A  Laboratory  Manual中所述的方法进行。

大肠杆菌的转化也是已知的，可按Maniatis，T.等在Molecular  Cloning，Cold  Spring  Harbor  Laboratory，Page  239，1982中所述的氯化钙法或按氯化钙/氯化铷法进行。

按照本发明，这类转化体的一个典型例子是大肠杆菌ER-4（IFO15083;FERM  BP-3091）。

按照这里所述的同样方法，通过适当选择受体生物体，当然有可能很容易地产生各种转化体。

用已知方法培养所获得的转化体。在培养放线菌时，种子培养基如下：3%甘油、0.5%多聚胨、0.3%肉膏、0.05%N-酰基-DL-甲硫氨酸（PH7.2）;生产培养基为：1.7%胰酶处理酪蛋白、0.3%木瓜蛋白酶处理的脱脂黄豆粉、0.5%氯化钠、0.25%磷酸氢二钾、1%葡萄糖、0.05%N-酰基DL-甲硫氨酸（PH7.0）。通常在15-40℃（最好24-30℃）培养10-96小时（最好24-72小时）。必要时，可通气和/或搅拌。当培养大肠杆菌时，使用LB培养基（1%多聚胨、0.5%酵母浸膏、0.5%氯化钠）。培养通常在15-40℃（优选24-37℃）进行10-96小时（优选24-48小时），必要时可通气和/或搅拌。

培养完成后，将细胞与上清夜分离，用本领域通用的细胞破裂法，例如超声波处理、French压力机破裂、通过研磨机械破裂或用溶菌酶处理，提取出细胞中存留的酰基氨基酸消旋酶。将所得提取物用常规的蛋白质纯化方法处理，如盐析、等电沉降、凝胶过滤、离子交换层析、疏水层析或高压液相层析，可纯化所得提取物中含有的酰基氨基酸消旋酶，从而得到所需的酰基氨基酸消旋酶。

用已知方法（日本专利申请JP01-137973）测定所得酰基氨基酸消旋酶的活性。为此，将50-100ul酶溶液加到由25mMN-乙酰基-DL-甲硫氨酸、2mM氯化钴、2uL-酰基转移酶和50mM  Tris-盐酸缓冲液（PH7.5）组成的反应介质中，于30℃反应5分钟，然后通过煮沸3分钟终止反应。1单位（U）酶定义为每分钟形成1μmolL-甲硫氨酸所需酶量。

这里所用的碱基、氨基酸等的缩写和符号是IUPAC-IUB  Commission  on  Biochemical  Nomanclature所推荐的或本领域所通用的。其例子如下。对于存在有光学异构体的那些氨基酸，所用缩写符号除非另有说明均代表L异构体。

DNA脱氧核糖核苷酸

A腺嘌呤

C胞嘧啶

G鸟嘌呤

T胸腺嘧啶

Ala丙氨酸

Arg精氨酸

Asn天冬酰胺

Asp天冬氨酸

Cys半胱氨酸

Gln谷氨酰胺

Glu谷氨酸

Gly甘氨酸

His组氨酸

Ile异亮氨酸

Leu亮氨酸

Lys赖氨酸

Met甲硫氨酸

Phe苯丙氨酸

Pro脯氨酸

Ser丝氨酸

Thr苏氨酸

Trp色氨酸

TYr硌氨酸

Val缬氨酸

以下实施例进一步说明了本发明，但并不限定本发明的范围。

实施例1

分离拟无枝菌酸属TS-1-60染色体DNA

将拟无枝菌酸属TS-1-60菌株在装有20ml胰酶解酪蛋白大豆汤（Becton  Dickinson）的200ml锥形瓶中于28℃振荡培养42小时。所得湿细胞（4g）悬浮于20ml缓冲液A[0.3M蔗糖、25mMEDTA、25mMTris-HCL缓冲液（pH8）]中，向其中加蛋清溶菌酶达2mg/ml的浓度后，将悬浮液于37℃温和振荡1小时。然后向悬浮液中加入8ml2%SDS，轻轻涡旋2-3次。再加入5ml氯仿和5ml缓冲液A饱和的苯酚，离心整个混合物（3，000rpm，20分钟）以提取DNA。三次重复这一苯酚提取过程后，向DNA溶液中加入1/10体积的3M乙酸钾和2体积的冰冻乙醇以沉淀DNA。离心收集沉淀物DNA，用70%乙醇洗涤，真空干燥后保存。

实施例2

克隆酰基氨基酸消旋酶编码基因

（A）制备基因库

a）用限制酶HaeⅢ部分消化

用限制酶HaeⅢ（Takara  Shuzo）部分消化实施例1所分离的拟无枝菌酸属TS-1-60菌株染色体DNA。为此，将由10mM  Tris-HCL缓冲液（PH7.5）、7mM氯化镁、60mM氯化钠、7mM2-巯基乙醇、5ug供体DNA及10单位HaeⅢ组成的总体积为50ul反应系统在37℃反应2分钟。然后通过苯酚一氯仿处理使反应混合物脱去蛋白质。并加入2体积乙醇回收消化DNA。

b）甲基化酶反应

在ECORI位点的腺苷上使被HaeⅢ部分消化的DNA片段甲基化。为此，将5ug部分消化的DNA片段在由100mMTris-HCL缓冲液（PH8）、2mM二硫苏糖醇、10mM  EDTA、80uMS-腺苷甲硫氨酸和40单位甲基化酶（Takara  Shuzo）组成的总体积20ul的反应介质中于37℃处理60分钟。按上面相同的方式回收甲基化的DNA片段。

C）连接子连接

将EcoRI连接子连接至甲基化DNA片段的未端。所用EcoRI连接子为d（pGGAATTCC）（Takara  Shuzo）。为了连接子的连接而使用了连接盒（Takara  Shuzo）。在由5ug  DNA、2ul（2ug）EcoRI连接子、16ul溶液A及2ul溶液B组成的总体积20ul的混合物中，将该反应于160℃进行16小时。用氯仿/苯酚处理反应混合物，再通过乙醇沉淀回收DNA产物并干燥。

d）用限制酶EcoRI消化

于37℃用限制酶EcoRI消化5ug在c）中获得的DNA片段3小时。将所得DNA片段进行电泳，并回收大小为1-3kbp的DNA片段。该片段经苯酚-氯仿处理、乙醇沉淀及真空干燥后溶于20ulTNE缓冲液（10mM  Tris-HCL、1mM  EDTA、30Mm  NaCL、pH8.0）。

e）与载体（λgt11）连接和包装

用EcoRI和磷酸酶处理λgt11（Stratagenl  Cloning  Systems，U.S.A）并与DNA片段（1-3kbp）连接。用Gigapack  gold（Stratagene  Cloning  Systems，U.S.A.）包装连接反应混合物。

（B）制备探针

通过用赖氨酰肽链内切酶处理，将由拟无枝菌酸属TS-1-60菌株产生的酰基氨基酸消旋酶（纯化蛋白，4mg）切割成几个肽链。用逆相层析纯化肽链，并测定峰2肽的氨基酸序列。该序列为Lys Leu Gly Ala Val Gln Ile Val AsnIle Lys Pro Gly Arg Val Gly Gly Tyr。人工合成由划线肽部分推断出的以下寡核苷酸：5′-GAGATCCTR⁴AACATCAAGCC-3′（R⁴为G和C）。通过常规方法用32P标记该寡核苷酸的5′-末端将其用作探针。

（C）制备抗酰基氨基酸消旋酶抗体

用1mg来源于拟无枝菌属TS-1-60菌株的纯化酰基氨基酸消旋酶蛋白按4分分开的剂量（400、200、200和200ug）免疫注射给免。结果获得了含有多克隆抗体的血清，通过Ouchterlony法测得它的抗体滴度为16。

（D）用免疫检测法筛选

用来源于拟无枝菌属酸属TS-1-60菌株的λgt11  DNA库转染大肠杆菌Y1090，并从约200，000个噬斑中获得13个阳性噬菌斑。将其纯化和增殖后从中提取DNA并用EcoRI切割。然后电泳消化液。用³²P标记通过电泳分离的DNA片段，并用上述的探针进行Southern杂交。在13个重组噬菌体中有两个噬菌体（λ-8和λ-9）与探针杂交。然后利用λ-9的EcoRI片段部分制备约600bp的探针。利用该探针再次与从λgt11DNA库得到的约50，000个噬斑进行噬斑杂交。结果得到λ-44。通过仔细研究，发现它含有编码酰基氨基酸消旋酶的整个DNA。

实施例3

碱基序列测定（序列分析）

利用Messing等的方法[Nucl.Acids  Res，9，309（1981）]，和Deaza序列分析法[Mizusawa，S  et  al  Nucl  Acids  Res，14，1319（1986）]将从λ-44分离出的EcoRI片段（1.2kbp）插入到大肠杆菌噬菌体M13mp8和M13mp9。结果示于图1。从该碱基序列推断出的部分氨基酸序列与从拟无枝菌酸属TS-1-60菌株纯化的酰基氨基酸消旋酶的部分氨基酸序列一致。从而发现λ-44含有编码酰基氨基酸消旋酶的基因。

实施例4

利用放线菌转化体生产酰基氨基酸消旋酶

使用变铅青链霉菌TK64/pRA32。该菌株是通过从拟无枝菌酸属TS-1-60菌株的整个DNA中提取酰基氨基酸消旋酶基因、将其插入用于放线菌的质粒pIJ702中并用所产生的重组质粒转化变铅青链霉菌TK64而产生的。于28℃将该菌株在酵母浸膏一麦芽浸膏琼脂斜面培养基（ISP2培养基）上培养7天。将如此所形成的孢子，用1接种环的量接种至每个200ml的锥瓶中，其中装有20ml无菌种子培养基（3%甘油、0.5%多聚胨、0.3%肉膏、0.05%N-乙酰基-DL-甲硫氨酸pH7.2），然后在旋转摇床（200rpm）上于28℃培养48小时。将培养物按每份8ml分装至15ml小瓶中并于-80℃冷冻保存（冷冻原种培养物）。用1ml冷冻原料培养物接种于与前所述相同的种子培养基并在与前面所述相同的条件下进行培养而制备出第一代种子。再用20ml第一代种子培养物接种于每个2升的坂口烧瓶中的500ml灭菌种子培养基并于28℃培养72小时，就可制备出第二代种子，为了产生酶，将100升生产培养基（1.7%胰酶处理的酪蛋白、0.3%木瓜蛋白酶处理的脱脂黄豆粉、0.5%氯化钠、0.25%磷酸氢二钾、1%葡萄糖、0.05%N-乙酰基-DL-甲硫氨酸pH7.0）置于200升发酵罐中并灭菌，然后接种4升第二代种子培养物，并在通气（80VVm）和搅拌（160rpm）的条件下于28℃培养42小时。作为对照，按同样方式培养DNA供体拟无枝菌酸属TS-1-60菌株。对产生的酶进行比较后发现，转化株具有更高的产率。

实施例5

利用lac启动子在大肠杆菌中表达酰基氨基酸消旋酶基因

从重组噬菌体λ-44中分离出含有酰基氨基酸消旋酶结构基因的SmaI-XhoI片段，将该片段与lac启动子相同的方向插入大肠杆菌质粒puc118的多克隆位点（SmaI-SalI位点），产生质粒pRA4（图3）。用该质粒pRA4转化大肠杆菌JM105。

用竹棒挑起所形成的转化菌株ER-4（IFO15083;FERMBP-3091），接种于4ml含有氨苄青霉素（50ug/ml）的LB培养基（1%多肽胨、0.5%酵母浸膏、0.5%氯化钠），并于37℃震荡培养16小时。然后将培养物0.3ml的量接种至含有氨苄青霉素（50ug/ml）的30mlLB培养基中并于37℃震荡培养3小时，加入3ml0.1MIPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖甘）至终浓度1mM后继续培养4小时。收集细胞（3.000rpm，10分钟），将其悬浮于5ml  Tris-Hcl缓冲液（50mM，pH7.5）并进行超声处理（4分钟）。离心所产生的破细胞产物（15，000rpm，10分钟），用已知方法测定上清液中酰基氨基酸消旋酶活性。用宿主大肠杆菌JM105未观察到酰基氨基酸消旋酶活性能够被转化体ER-4所证实。酶产率为64u/升（培养基），它约为DNA供体拟无枝菌酸属TS-1-60菌株的3倍。

实施例6

利用tac启动子在大肠杆菌中表达酰基氨基酸消旋酶基因。

从实旋例5的lac表达质粒pRA4中切割出含有酰基氨基酸消旋酶结构基因SmaI-HindⅢ片段。将该片段插入到含有tac启动子的表达质粒载体pKK223-3[BrosiusJ  and  Holly  A，Proc  Natl  Acad  Sci  U.S.A，81，6929（1984）]的SmaⅠ-HindⅢ位点，产生质粒pRA7（图4）。用该质粒pRA7转化大肠杆菌JM1-105。

用实例5所述的方法培养所产生的转化菌株ER7，并用已知方法测定酰基氨基酸消旋酶活性，从而观察到所述酶活性，酶产率为34u/升（培养基），它约为DNA供体拟无枝酸属TS-1-60菌株的1.5倍。

实施例7

起始密码子由GTG转化为ATG

从重组噬菌体λ-44分离和回收含有起始密码子的EcoRI片段并将其插入到质粒载体puc118的EcoRI位点。用所产生的重组质粒转化大肠杆菌MV1184;再用Vieira等人的方法[Methads  in  Enzymology，100，3（1987）]从所获得的转化株中制备单链DNA。用在in  Vityro  Mutagenesis  System，Version  2.0（Amer  sham）中人工合成的含有突变点的寡核苷酸5′-GAGGAGCAATGAAACTC-3′进行定点诱变。从所产生的突变质粒pMA1中分离和回收含有突变位点SacI片段并将其连接到预先用SacI处理的表达质粒pRA4中，产生lac启动子表达质粒pRA4A，其起始密码子已转变为ATG（图5）。同样，从突变质粒pMA1中分离和回收含有突变位点的SmaI/SacI片段，并将其连接至预先用SmaI/SacI处理过的表达质粒pRA7中，产生tac启动子表达质粒pRA7A，其起始密码子已转变为ATG（图6）。用这些突变表达质粒转化大肠杆菌JM105。分别产生转化株ER4A（JM105/pRA4A）和ER7A（JM105/PRA7A;IFO15131，FERM  BP-3272）。在加入IPTG后按实例5所述方法将这些转化株培养9小时，用已知方法测定酰基氨基酸消酶活性。菌株ER4A和ER7A的酶产率分别为740u/升（培养基）和198u/升（培养基），且分别是DNA供体拟无枝酸属TS-1-60的约37倍和约10倍。

实施例8

利用T7启动子在大肠杆菌中表达酰基氨基酸消旋酶基因

为将酰基氨基酸消旋酶基因T7表达质粒pET-3C[Gene56，125（987）]亚克隆至NdeI/BamHI位点，使用定点诱变技术将NdeI位点（CATATG）加至起始密码子区，将BgtⅡ位点（AGATCT）加至终止密码子区。

A）引进NdeI位点

用表达质粒pRA4转化大肠杆菌MV1184。并利用Vieiva等人的方法从一个所获得的转化株中制备出单链DNA。利用该单链DNA以及含有NdeI位点（CATATG）的合成寡核苷酸（5′GAGTTTCATATGCTCCTCC-3′），进行定点诱变[in，vitro  Mategenesis  System，Version，2.0（Amersham）]，产生质粒pRA4N，其起始密码子区含有NdeI位点（图7）。

B）引入BglⅡ位点

由质粒PRA4N中分离出含有NdeⅠ位点的SmaⅠ/HindⅢ片段并将其连接到预先用SmaⅠ和HindⅢ处理过的质粒puc119中，用所产生的重组质粒转化大肠杆菌MV1184。按Vieira等人的方法从一个所获得的转化株中制备出单链DNA。使用该单链DNA以及含有BglⅡ位点（AGATCT）的合成寡核苷酸（5-GAGGTAGATCTGGTCGGAT-3′）按与A）相同的方法进行定点诱变，产生质粒pRA4NB，其终止密码子区中含有BglⅡ位点（图8）。

C）表达

从质粒pRA4NB中分离和收回含有NdeⅠ/BglⅡ片段的酶基因并将其插入到质粒PET-3C中的NdeⅠ位点和BamⅠ位点之间，产生出酰基氨基酸消旋酶表达质粒pET-3CN（图9）。用该质粒转化大肠杆菌MM294（DE3）。得到转化株MR-1（IFO  15132，FERM  BP-3273）。按实例7的方法培养该转化株并按已知方法测定酰基氨基酸消旋酶活性。酶产率为1，795μ/升（培养基），它约为DNA供体拟无枝菌酸属TS-1-60菌株的90倍。

D）转化株MR-1的发酵罐培养（20升）

将含有氨苄青霉素（50ug/ml）的LB培养基按每份400ml分装到1升的锥瓶中并灭菌。用1接环量接种菌株MR-1的细胞于每瓶培养基中。于37℃振荡培养（250rpm）20小时，将1升所获得的培养液接种至补充了多聚胨（1.5%）的20升M9培养基[Mamiatis，T等，Molecalar  Cloning，Cold  Spring  Harbor  Laboratory（1982）]中，并在通气（100VVM）和搅拌（450rpm）的条件下于28℃培养34小时。8小时后，加入IPTG至终浓度为0.01mM，并在连续加入（150ml/hour）8%葡萄糖和2%多聚胨混合溶液的情况下继续培养，培养完成后离心培养物（1，000rpm，20分钟），得到1，320g湿细胞。用已知方法测定酰基氨基酸消旋酶活性，酶产率为22，300u/升（培养基）。它约为DNA供体拟无枝菌酸属TS-1-60菌株的1，100倍。

实施例9

从大肠杆菌转化株纯化酶

将含有氨苄青霉素（50ug/ml）的LB培养基按每份40ml装至200ml的锥形瓶中并灭菌。向每瓶的培养基中接种菌株ER4A的细胞一菌环后于37℃震荡培养（300rpm）16小时。将每份4ml的所得培养液转移至各含有400ml灭菌LB培养基的1升锥瓶中，于30℃震荡培养（250rpm）30小时。约6小时后，向各锥瓶中加入4mlIPTG（0.1M）（终浓度1mM）。离心8升培养液（10，000rpm，20分钟）后产生141g湿细胞。

将这些细胞悬浮于Tris-Hcl缓冲液（50mM，pH7.5）至体积500ml，然后通过超声处理（5分钟X3）破细胞。加入同样缓冲液及硫酸镁（终浓度10mM）使破细胞产物液的体积为1升。经加热处理（60℃，30分钟）和离心（10，000rpm，20分钟）后产生940ml上清液。向该上清液中加入107.2g（20%饱和）的硫酸铵。所得溶液于0℃放置2小时后离心（10，000rpm，30分钟），并将所得上清液加至预先被含有20%饱和硫酸铵的Tris盐酸缓冲液平衡的BUTYL-Toyopearl柱（BUTYL-Toyopearl  650M，Tosoh，4.5×30cm）上。用2升含有20%饱和硫酸铵的同样缓冲液冲洗该柱，然后用硫酸铵由20%饱和度变为饱和度为0%的同样缓冲液洗脱。按每份20ml分级分离洗脱。在第34和第50分级中观察到酰基氨基酸消旋酶活性。合并活性级分，对同样缓冲液透析后加到预先用同样缓冲液平衡过的DEAE-Toyopearl柱（DEAE-Toyopearl650M，Tosoh，4.1×16cm）上。用1升同样缓冲液洗柱后，用1升氯化钠浓度由0变为0.5M的同样缓冲液洗脱。按每份10ml分级分离洗脱，在第48和53级分中观察到酰基氨基酸消旋酶活性。以上步聚产生1，570u的酰基氨基酸消旋酶，它在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳时基本上产生单一带，从转化株ER4A纯化该酶的结果如下所示。

步骤  总蛋白  总活性  比活性  纯度  产率

（mg）  （单位）  （单位/mg）  （倍）  （倍）

细胞破碎  18000  3180  0.17  1.0  100

加热处理  7123  3256  0.46  2.7  100

BUTYL-Toyopearl  249  1620  6.50  38.2  51

DEAE-Toyopearl  198  1573  13.5  79.4  49

Claims (8)

1、生产含有酰基氨基酸消旋酶编码基因的DNA片段的方法，它包括从产生酰基氨基酸消旋酶的微生物的染色体DNA中克隆编码酰基氨基酸消旋酶的基因，并根据需要切割、插入、增加和/或消除该基因中的某些碱基。

2、如权利要求1所述的方法，基中微生物为放线茵。

3、如权利要求1所述的方法，其中基因与具有以下碱基序列的DNA杂交：

5′-GAGATCCTR⁴AACATCAAGCC-3′

其中R⁴为G和C。

4、如权利要求1所述的方法，其中所说的基因具有图1所示第62至1189号碱基序列。

5、如权利要求1所述的方法，其中所说的基因具有图1所示的第1至1400号碱基序列。

6、生产含有编码酰基氨基酸消旋酶基因的DNA片段的载体的方法，它包括将含有酰基氨基酸消旋酶编码基因的DNA片段插入到载体中。

7、生产携带有酰基氨基酸消旋酶编码基因的DNA片段的载体的转化株的方法，它包括用含有酰基氨基酸消旋酶编码基因的DNA片段的质粒转化宿主。

8、具有图1所示的氨基酸序列1-370（其N-未端可能具有Met）的多肽或其一部分或通过该多肽或其一部分中某些氨基残基的取代、插入、增加或减少而产生的具有酰基氨基酸消旋酶活性的多肽的生产方法，它包括在培养基中培养携带了编码酰基氨基酸消旋酶编码基因DNA片段的质粒的转化株，以在培养基中产生和积累酰基氨基酸消旋酶，然后回收该消旋酶。

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