HU222830B1 - Eljárás biológiailag aktív dimer TGF-béta protein előállítására - Google Patents

Abstract

A találmány tárgya eljárás dimer, biológiailag aktív ?-típusútranszformáló növekedési faktor (TGF-?)-szerű fehérje vagy sójaelőállítására. A találmány értelmében úgy járnak el, hogy a (TGF-?)-szerű fehérje denaturált, monomer formáját egy térszerkezetkialakítására alkalmas (folding) pufferrel kezelik, amely tartalmazegy enyhe detergenst; ez lehetővé teszi, hogy a mo- nomer (TGF-?)-szerű fehérje háromdimenziós térszerkezetet vegyen fel, amelydimerizálás után biológiai aktivitást nyújt, miközben a monomeroldható alakban marad és egy szerves oldószert, éspedig dimetil-szulfoxidot, dimetil-for- mamidot, dimetil-szulfont vagy az ezenoldószerekből álló csoport két vagy három tagjának tetszőlegeskeverékét. A (TGF-?)-szerű fehérjék nagy hatású, sokféle terápiáscélra felhasználható biológiai anyagok. ŕ

Description

A találmány tárgya háromdimenziós térszerkezetet kialakító (folding) eljárás biológiailag aktív, dimer TGFβ (β-típusú transzformáló növekedési faktor)-szerű protein előállítására.

A TGF^-szerű, például a TGF-β főcsoportba tartozó proteinek sokféle biológiai szabályozási útvonalon például az embrionális fejlődésben vagy a szövetregenerálásban központi szerepet játszanak. Ezek nagy hatású biológiai anyagok, amelyek sokféle terápiás célra felhasználhatók. A TGF-β főcsoport legismertebb tagjai maguk a TGF^-proteinek.

A TGF-β-1 eredetileg emberi trombocitából, emberi placentából és boíjúveséből nyerték homogenitásig végzett tisztítással, és körülbelül 25 000 Da molekulatömegű homodimer fehéijeként azonosították. Először azon képességével jellemezték, hogy az EGF-fel vagy TGFa-val szinergetikus hatást fejt ki a transzformálatlan NRK-sejtek beágyazódási helytől független szaporodására, újabban kimutatták, hogy a TGF-β a normális és daganatsejtek széles körében sokféle szabályozó hatást fejt ki, és ez mutatja, hogy ez a protein a sejtműködés többfunkciós regulátoraként milyen nagy jelentőségű. A szövet vagy sejt típusától és más növekedési faktorok esetleges jelenlététől függően a TGF-β a mitogenezist, a sejtszaporodást és -növekedést is stimulálhatja vagy hatásosan gátolhatja ezeket a folyamatokat, vagy egyéb hatásokat is kifejthet, amilyen például az adipogenezis, myogenezis, chondrogenezis, osteogenezis (a zsír-, izom-, ízület- és csontképződés) vagy az immunsejtfunkciók szabályozása, a chemotaxis (kémiai vonzás) stimulálása, a differenciálódás indukciója vagy gátlása. A TGF^-nak sok olyan hatása van, amely a sejteknek és szöveteknek a stresszre vagy sérülésekre adott válaszával és az ebből eredő károsodás helyrehozásával kapcsolatos. Gyulladás után a TGF-β fontos szerepet játszik a saijadzó szövetek képződésében, fokozza a gének expresszióját, amely kapcsolatban áll a sejtközi állomány, például fibronektin, kollagén és bizonyos proteázinhibitorok képződésével, és stimulálja a kollagén sejtközi állománynak a fibroblasztok hatására bekövetkező kontrakcióját (összehúzódás), amiből arra következtethetünk, hogy esetleg szerepe van a kötőszövet kontrakciójában is.

Eddig öt különböző, bár funkcionálisan és szerkezetileg egymáshoz nagyon hasonló TGF-β-ί írtak le: TGF-βΙ, TGF^2, TGF^3, ΤΟΡ-β4 és TGF^5.

Minden TGF-β-ί 390-412 aminosavprekurzorként szintetizálnak, ezekből proteolízissel állítják elő az érett formákat, amelyek a 112 aminosavas C-terminálisból állnak. Érett, biológiailag aktív alakjukban a TGFβΙ-5 fehérjék két, egyenként 112 aminosavat tartalmazó polipeptidlánc sav- és hőálló diszulfidkötéses homodimeqei. A Derynck, R. és munkatársai [Natúré 316, 701-705 (1985)] által leírt emberi, a szintén Derynck, R. és munkatársai [J. Bioi. Chem., 261, 4377-4379 (1986)] által leírt patkány/egér-, valamint a Sharples, K. és munkatársai [DNS 6, 239-244] által leírt komplett majom-TGF-βΙ aminosavszekvenciák jelentős mértékű szekvenciamegőrzést mutatnak, mindössze egy aminosavban térnek el egymástól. A deMartin, R.

és munkatársai [EMBO J. 6, 3673-3677 (1987)], valamint Marquardt, H. és munkatársai [J. Bioi, Chem., 262, 12 127-12 131 (1987)] által leírt emberi TGF-βΙ, emberi TGF^2 és a Ten Dijke, P. és munkatársai [PNAS 85, 4715-4719] által leírt emberi TGF^3 összehasonlításából kiderül, hogy ez a háromféle protein körülbelül 70-80%-os szekvenciaazonosságot mutat. Cheifetz, S. és munkatársai [Cell 48, 409-415 (1987)] sertés trombocitából izolálták a heterodimer ΤΟΡ-β1.2-ζ ez egy TGF^2 alegységhez diszulfidkötéssel kapcsolódó TGF-βΙ alegységből áll.

Ma olyan kísérletek folynak, amelyeknek célja, hogy a TGF^-kat ahelyett, hogy természetes forrásokból, például trombocitákból nyernék ki, rekombináns technikákkal állítsák elő, hogy különböző terápiás modellekben végzendő vizsgálatokhoz elegendő mennyiséget kapjanak. Rendkívül nehéznek bizonyult azonban a biológiailag aktív rekombináns TGF-β előállítása. Amint a szekvencialistán 1-6. szekvencia-azonosítószámon felsorolt szekvenciákból látható, a TGF-βΙ, TGF^2 és TGFβ3 112 aminosav hosszúságú érett formái 9 ciszteint tartalmaznak. Schlunegger, Μ. P. és Gruetter, M. G. [Natúré, 358:430-434 (1992)] kimutatták, hogy a TGF^2nél a 9 cisztein 4 láncközi és 1 láncon belüli diszulfidkötést képez. A TGF-β heterológ expressziója olyan terméket eredményezhet, amelynek bár elsődleges szerkezete korrekt, a kapcsolódásai nem megfelelők ahhoz, hogy a pontos, bonyolult elsődleges és másodlagos szerkezetet alakuljon ki, ezért biológiai aktivitást nem mutat.

Ami a természetes TGF-β molekulákat illeti, általában úgy tartják, hogy ezek mindegyike alkalmas arra, hogy magasabb rendű élő szervezetekből származó sejtekben a megfelelő TGF-β géneket expresszálja. A rekombináns TGF^-k expressziója eukariotikus rendszerekben megoldható, de a biológiailag aktív, pontos térszerkezetű anyag kihozatala távolról sem kielégítő.

Ezért próbálkoztak azzal, hogy biológiailag aktív TGF-β-ΐ egy mikrobiológiai gazdaszervezetben állítsanak elő. De például egy baktériumban a sejtközi körülmények nem segítik elő a pontos térszerkezet és a diszulfidkötések kialakulását, valamint a diszulfidkötésekkel stabilizált dimerizációt, amely az aktivitás szempontjából alapvető jelentőségű. Ezért csak nagyon kicsiny biológiai aktivitású TGF-β-ί nyertek ki a megfelelő génnek E. coliban, lambda-promoterrel szabályozott expressziója után; ennek leírása megtalálható az EP-A-0,268,561 számon közzétett európai szabadalmi bejelentésben. Egy másik, Urushizaki, Y. és munkatársai [Tumor Rés. 22,41-55] által közölt jelentés egy TGF-β cDNS-nek trp promoterrel szabályozott expresszióját hja le, amely egy SDS poli(akril-amid)-gél autodiagramjában egy 13 000 Da molekulatömegnél megjelenő radioaktív jelzéssel ellátott fehéijesávot eredményezne, de semmiféle radioaktivitást nem tapasztaltak.

Ha egy bakteriális (például E. coli) expressziós rendszerben nagy mennyiségben termelődnek rekombináns proteinek, ezek sokszor nagymértékben oldhatatlan zárványtesteknek vagy refrakciós (fénytörő) testeknek nevezett sejtközi csapadék alakjában jelennek meg,

HU 222 830 Bl amely fáziskontraszt-mikroszkóp alatt a sejtek által körülzárt térben csillogó foltok alakjában észlelhető. Ezek az oldható baktériumfehéijéktől könnyen elválasztható zárványtestek tartalmazzák a rekombináns fehéijét erősen denaturált és redukált formában, amely természetes ellenanyagával szemben nem mutat aktivitást, s amely ezért kereskedelmi terméknek nem alkalmas. Ezért általában egyetértenek abban, hogy a rekombináns fénytörő fehéijét szolubilizálni kell olyan körülmények között, amelyek alkalmasak arra, hogy denaturált formájában megtartsák, majd ezután ki kell alakítani a megfelelő térszerkezetet, hogy a denaturált, kötetlen alakból egy olyan megfelelő, funkcionálisan aktív háromdimenziós szerkezet jöjjön létre, amelyet viszonylag gyenge, atomok közötti erőhatások, például hidrogénhidak, hidrofób kölcsönhatások és töltések kölcsönhatásai stabilizálnak. Ciszteint tartalmazó fehérjéknél diszulfidkötések is képződhetnek. Ha a diszulfidkötések képződését kémiailag előmozdítjuk, akkor a nem megfelelő intramolekuláris és dimer vagy multimer fehérjék esetén intermolekuláris hidak képződését meg kell előzni, vagy legalábbis minimálisra kell csökkenteni, mert a nem kívánt, nem pontosan összekapcsolt izomerek inhomogén anyagot hozhatnak létre, így bonyolulttá teszik a kívánt szerkezetű fehérje további tisztítását, vagy csökkent aktivitású fehérjét eredményezhetnek.

A fehérjék térszerkezetének kialakítását általában több lépésből álló eljárással végzik, amely magában foglalja a fehérje szolubilizálását erősen denaturáló körülmények között, majd a chaotrop besűrítését, hogy a térszerkezet kialakulása végbemenjen. Ilyen eljárással azonban TGF-β térszerkezetének kialakítása nem járt sikerrel. Viszont az EP-A-0,433,225 számon közzétett európai szabadalmi bejelentés egy sikeres eljárást ismertet biológiailag aktív dimer TGF^-szerű fehérje előállítására, ebben egy enyhe detergenst használnak, amely lehetővé teszi a TGF-β fehérje térszerkezetének kialakulását, miközben a detergens jelen marad az e célra szolgáló (folding) oldatban.

Az irodalomból, például Tam és munkatársai közleményéből [J. Am. Che. Soc., 113: 6657-6662 (1991)] ismert, hogy dimetil-szulfoxid használható arra, hogy peptidekben előmozdítsa diszulfidkötések szelektív és hatékony kialakulását. Az eljárás szelektív, vagyis mellékreakcióktól mentes, és széles pH-tartományban alkalmazható. Pontos diszulfidhidak képződését azonban csak legfeljebb körülbelül 30 aminosavból álló peptideknél mutatták ki. A 4,731,440 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás szerint dimetil-szulfont vagy dimetil-szulfon és karbamid keverékét használták zárványtestekből származó szomatotropin szolubilizálására. A szolubilizált fehérje azután renaturálható volt oly módon, hogy a dimetil-szulfon-tartalmú fehérjeoldatot egy enyhe oxidálószerrel hozták érintkezésbe.

Most meglepő módon azt tapasztaltuk, hogy az olyan eljárás, amelyben a TGF-p-szerű fehérje térszerkezetének kialakításához egy enyhe detergenst alkalmazunk, dimetil-szulfoxid, dimetil-szulfon vagy dimetilformamid hozzáadásával javítható.

A találmány tárgya javított eljárás biológiailag aktív dimer TGF^-szerű fehérjék előállítására denaturált vagy a természetestől más módon eltérő formájukból kiindulva. Ezt a célt azzal a meglepő felismeréssel érjük el, hogy számottevő mennyiségű kívánt dimer terméket kaphatunk váratlanul magas kihozatallal, ha a fehérje monomer formáját egy, a térszerkezet kialakítására szolgáló (folding) pufferrel kezeljük, amely (a) egy enyhe detergenst és (b) dimetil-szulfoxidot, dimetil-formamidot, dimetil-szulfont vagy e csoport két vagy három tagjának keverékét tartalmazza.

Az alábbiakban a találmányt részletesen ismertetjük.

A találmány tárgya javított eljárás dimer, biológiailag aktív β-típusú transzformáló növekedési faktor feltétje (TGF^-szerű fehérje) előállítására, amely abból áll, hogy egy TGF^-szerű fehérjét foldingpufferrel kezelünk, amely (a) egy, a TGF-β főcsoportba tartozó fehérje térszerkezetének kialakítását lehetővé tevő enyhe detergenst és (b) egy szerves oldószert, éspedig dimetil-szulfoxidot, dimetil-formamidot, dimetil-szulfont vagy e csoport két vagy három tagjának tetszőleges keverékét tartalmazza.

A leírásban a „TGF^-szerű fehérje” kifejezés olyan fehéijét jelent, amelynek monomer alakban a szekvenciája legalább 75%-ban homológ a TGF-β főcsoport alábbi tagjai közül (amelyek egyben „TGF^-szerű fehérjék” is) legalább egynek a monomer aminosavszekvenciájával:

TGF-βΙ, TGF-32, TGF^3; egy növekedésgátló, a poliergin, amelyet Holley, R. W. és munkatársai [PNAS 77, 5989-5992 (1980)], valamint Ristow, H. J. [PNAS 83, 5531-5533 (1980)] BSC-1 majomvesesejtek kondicionált közegéből izoláltak; a TGF^4, amit Jakowlew, S. B. és munkatársai [Molecular Endocrinology 2, 1186-1195 (1988)] csirkeembrió-chondrocitákból (porcsejtek) izoláltak; a Kondaiah, P. és munkatársai által [J. Bioi. Chem. 265, 1089-1093 (1990)] leírt TGF^5 a Xenopus-Laevisből; a TGF-P-val rokon inhibinek és aktivinek (ivarmirigy-fehérjék, amelyek a tüsző nyálkakiválasztását szabályozzák); a Müller-féle inhibitor (MIS, amely a hím emlősembriókban a Müller-cső kialakulását megakadályozza); morfogén (alakfejlődési) csontfehérjék (BMP-k, a polipeptideknek a csontok és porcok kialakulásában szerepet játszó csoportja, közülük jelenleg ismertek a BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8 és BMP-9); a Drosophila dekapentapleg génkomplexéből a légyembrióban a morfogenezist (alakfejlődést) szabályozó dpp-ből származó transzkriptum; a Vg-1, a Xenopus transzkriptum terméke, amely az oociták (primitív petesejtek) szikpólusában van jelen; továbbá a Vgr-1, egy, a Vg-l-hez hasonló emlősgén. Ezeket Mason, A. és munkatársai [Biochem. Biophys. Rés. Commun. 135, 957-964 (1986)], Cate, R. és munkatársai [Cell 45, 685-698 (1986)], Wozney, J. M. és munkatársai [Science 242, 1528-1534 (1988)]; Padgett, R. és munkatársai [Natúré 325, 81-84 (1986)]; Weeks, D. L. és Méltón, D. A. [Cell 51, 861-868 (1987)], valamint Lyons, K. és munkatársai [PNAS 86, 4554-4558 (1989)] ismertetik.

HU 222 830 Β1

A „TGF-P-szerű fehérje” kifejezés jelentése kiterjed továbbá a különböző TGF-p-szerű fehérjék alegységeit vagy az említett fehérjék olyan fragmentumait vagy mutánsait tartalmazó heterodimerekre, amelyek az eredeti molekulának egy- vagy többféle biológiai hatását megtartják.

A leírásban a „TGF-p-szerű fehérje” előnyösen a TGF-β főcsalád bármely tagját jelenti. Még előnyösebben ez a kifejezés a TGF-β főcsalád következő tagjait jelenti: emlősökből, például emberből vagy állatokból, mint majom, patkány/egér, sertés, ló vagy szarvasmarha, származó, valamint heterodimer TGF-p-k, amelyek két különböző, egyenként 112 aminosavat tartalmazó alegységből állnak, a TGF-β fragmentumai és mutánsai, beleértve beleértve az olyan hibrid molekulákat, amelyekben a különböző TGF-β fehérjék egyes részei ki vannak cserélve; a majomvesesejtek kondicionált közegéből izolált növekedésgátló, a poliergin; a TGF-p4, amit csirkeembrió-chondrocitákból (porcsejtek) izoláltak; a Xenopus-Laevisből izolált TGF-p5; a TGF-βval rokon inhibinek és aktivinek (ivarmirigy-fehéijék, amelyek a tüsző nyálkakiválasztását szabályozzák); a Müller-féle inhibitor (MIS, amely a hím emlősembriókban a Müller-cső kialakulását megakadályozza); morfogén (alakfejlődési) csontfehérjék (BMP-k, a polipeptideknek a csontok és porcok kialakulásában szerepet játszó csoportja, közülük jelenleg ismertek a BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8 és BMP-9); a Drosophila dekapentapleg génkomplexéből a légyembrióban a morfogenezist (alakfejlődést) szabályozó dpp-ből származó transzkriptum; a Vg-1, a Xenopus transzkriptum terméke, amely az oociták (primitív petesejtek) szikpólusában van jelen; továbbá a Vgr-1, egy, a Vg-l-hez hasonló emlősgén. A „TGF-p3-szerű fehérje” kifejezés jelentése kiterjed továbbá a különböző TGF-P-szerű fehérjék alegységeit vagy az említett fehérjék olyan fragmentumait és mutánsait tartalmazó heterodimerekre, amelyek az eredeti molekulának egy vagy minden biológiai hatását megtartják.

Még előnyösebbek a TGF-βΙ, TGF-P2, TGFβ3 csoportba tartozó TGF-P-szerű fehérjék, a heterodimer TGF-β fehérjék, ezek fragmentumai és mutánsai, beleértve az olyan hibrid molekulákat, amelyekben a különböző TGF-β fehérjék egyes részei ki vannak cserélve, a BMP-k, inhibinek és aktivinek. Ezen belül még előnyösebbek a BMG-2, TGF-βΙ, TGF-P2, TGFβ3 csoport tagjai közül választott fehérjék, ezek heterodimerjei, fragmentumai és mutánsai, beleértve az olyan hibrid molekulákat, amelyekben a különböző TGF-β fehérjék egyes részei ki vannak cserélve, különösen a későbbiekben definiált TGF-pl-3, a TGF-P2-3 és a TGF-P3-2, vagy a TGF-pi-2, amely az N-terminálistól a C-terminális felé haladó sorrendben az N-terminális 44 humán TGF-βΙ aminosavát és a C-terminális 68 TGF-P2 aminosavát tartalmazza. Még előnyösebbek az olyan TGF-P-szerű fehérjék, amelyeknek aminosavszekvenciája a szekvencialistán 1., 3., 5., 7., 9., 11. vagy 13. szekvencia-azonosítószámon szerepel. A legelőnyösebb TGF-P-szerű fehérje a TGF-p3.

A BMP-2 kifejezés a BMP-2 variánsait is jelenti, amelyek ugyanolyan biológiailag aktivitást mutatnak. Ilyenek többek között a példákban előállított variánsok, például a 13. szekvencia-azonosítószámú BMP-2 egy további N-terminális metioninnal kiegészítve, valamint az olyan 13. szekvencia-azonosítószámú BMP-2, amelyből hiányzik az N-terminális Gin aminosav.

A TGF-β biológiai aktivitását a találmány céljára az alábbi módszerek valamelyikével határoztuk meg:

- a TGF-p-nak fibroblasztokra kifejtett, a sejtmigrációt elősegítő hatása a Postlethwaite, A. E. és munkatársai [J. Exp. Med. 165, 261 (1987)] által kidolgozott módszer Burk, R. [PNAS 70, 369 (1973)] szerinti módosítása,

- Brown, T. J. és munkatársai [J. Immunoi. 139, 2977 (1987)]: a TGF-β inhibiáló hatása az emberi A 375 melanomasejtekre,

- Graycar, J. L. és munkatársai [molecular Endocrinology3: 1977-1986(1989)]: CCL-64 sejtek inhibíciója, DNS-szintézises vizsgálati módszer vagy

- Mv-l-Lu (ATCC/CCL64) folytonos nyérctüdőhámsejtvonal szaporodásának inhibíciója, amint azt a későbbiekben a példákban leírjuk.

A találmány szerinti térszerkezet-kialakítási eljárással bármilyen forrásból vagy módszerből származó monomer TGF-P-szerű fehétje a megfelelő dimer, biológiailag aktív TGF-p-szerű fehérjévé kapcsolható össze. A TGF-p-szerű fehérje monomer alakja származhat például természetes forrásból vagy előállítható rekombináns DNS-technikával vagy a szakmában jól ismert szintetikus módszerekkel. Ha a monomer a szennyezések miatt a térszerkezetnek in vitro végzett kialakítására nem alkalmas, akkor a szolubilizált és denaturált monomer kromatográíiával, például Sephacryl S-100 HR-en végzett molakulaszűrős kromatográíiával tisztítható.

A térszerkezet kialakítása előtt a monomer TGF-pszerű fehérjének denaturált (vagyis térszerkezet nélküli), szolubilizált formában kell jelen lennie. A szakmában jól ismert, úgynevezett chaotrop szerek képesek a fehérjéket hatásosan denaturálni és szolubilizálni, ami vizes oldatban és alkalmas körülmények között a felületen végrehajtott változtatások, a hidratációs állapot, az oldószerkömyezet vagy az oldószer és a felület közötti kölcsönhatás változtatása révén megváltoztatja a szóban forgó fehérje térbeli konfigurációját. Ilyen chaotrop vagy denaturálószer például a karbamid, a guanidin-hidroklorid, a nátrium-tiocianát körülbelül 4 és körülbelül 9 M közötti koncentrációban, továbbá detergensek, például az SDS, amely 0,01 és 2% közötti koncentrációkban kapható. A monomer denaturálását és szolubilizását eredményezi az is, ha a TGF-P-szerű fehérjét tartalmazó vizes oldatot például egy kis molekulatömegű, előnyösen 2, 3 vagy 4 szénatomos alifás szerves savval, még előnyösebben ecetsavval körülbelül 2 és körülbelül 4 közötti pH-értékre megsavanyítjuk, valamint bázisos körülmények, például 10 vagy magasabb pH és emelt hőmérséklet alkalmazása.

A monomert ezután „a térszerkezet kialakulását elősegítő körülmények” közé helyezzük, amelyek lehetővé teszik a biológiailag aktív dimer kialakulását. Ezek olyan körülmények, amelyek az intra- és intermolekulá4

HU 222 830 Β1 ris (molekulán belüli és kívüli) kötések létrejöttét elősegítik, és lehetővé teszik, hogy a denaturált monomer egy biológiai aktivitást mutató alakot vegyen fel. Ebben a folyamatban a monomer elsődleges szerkezete (vagyis az aminosavszekvencia) nem változik, viszont egy háromdimenziós szerkezetű, biológiailag aktív dimer termék alakul ki. A folyamat során diszulfidkötések jönnek létre, és a monomerek biológiailag aktív dimerré kapcsolódnak össze.

E célból a denaturált monomert egy foldingpufferrel kezeljük, amely semleges vagy lúgos pH-értéken és valamilyen alkalmas, például körülbelül 0 °C és körülbelül 40 °C közötti hőmérsékleten (a) egy enyhe, a későbbiekben definiált detergenst és (b) egy szerves oldószert, éspedig dimetil-szulfoxidot, dimetil-formamidot, dimetil-szulfont vagy e csoport két vagy három tagjának bármely keverékét tartalmazza. A pH előnyösen körülbelül 7 és körülbelül 10 közé, még előnyösebben dimetil-szulfoxid esetén körülbelül 9 és 9,5 közé esik, dimetil-formamid esetén körülbelül 8,5, dimetilszulfon esetén pedig körülbelül 9,5.

A találmány szerint a térszerkezet kialakítására használhatók az olyan hagyományos pufferrendszerek, amelyek pH=6 és 10 között megfelelő pufferkapacitást nyújtanak. A találmány szerinti eljárásban minden olyan puffer alkalmazható, amely a fehérjék térszerkezetének kialakulását nem gátolja. Pufferként használhatók például a Tris-, bisz-Tris- vagy piperazinpufferek. A pufferek kívánt esetben tartalmazhatnak továbbá valamilyen sót és kívánt esetben egy bázisos aminosavat is. A foldingpufferekben alkalmazhatók például a nátriumnak, lítiumnak, káliumnak, ammóniának, magnéziumnak, kalciumnak vagy mangánnak klorid-, fluorid-, bromid-, jodid-, hidrogén-karbonát-, szulfát-, foszfát-, acetát-, cianát- vagy rodanidionnal képzett sói, vagy más alkálifémek vagy alkáliföldfémek halogénvagy pszeudohalogénvegyületei, legfeljebb 3 M koncentrációban. Előnyösen 1 -2 M nátrium-kloridot alkalmazunk.

A foldingpufferben bázisos aminosavként például arginint alkalmazhatunk, előnyösen 0,5 M koncentrációban.

A találmány céljára a dimetil-szulfoxidot, dimetilformamidot vagy dimetil-szulfont előnyösen körülbelül 5% és körülbelül 40% közötti, még előnyösebben körülbelül 10% és körülbelül 30% közötti koncentrációban alkalmazzuk. A dimetil-szulfoxidot még előnyösebben körülbelül 10% és körülbelül 30% közötti, a legelőnyösebben körülbelül 20%-os koncentrációban; a dimetil-formamidot még előnyösebben körülbelül 10% és körülbelül 30% közötti, a legelőnyösebben körülbelül 10%-os koncentrációban; a dimetil-szulfont még előnyösebben körülbelül 10%-os koncentrációban alkalmazzuk. A dimetil-szulfoxid és dimetil-formamid, vagy a dimetilszulfoxid és dimetil-szulfon, vagy a dimetil-formamid és dimetil-szulfon elegyei körülbelül 5% és körülbelül 40% közötti, előnyösen körülbelül 10% és körülbelül 30% közötti, még előnyösebben körülbelül 10% és körülbelül 20% közötti koncentrációban alkalmazhatók. A koncentrációérték az oldószerelegyre vonatkozik.

A TGF-β főcsoportba tartozó fehérjék térszerkezetének a találmány szerinti kialakításához enyhe detergensként bármely olyan detergenst alkalmazhatunk, amely lehetővé teszi, hogy a monomer TGF-p-szerű fehérje olyan térbeli szerkezetté alakuljon át, amely dimerizálás után biológiai aktivitást mutat, miközben az említett monomer oldható formában marad.

Ezek lehetnek nemionos, kationos, anionos vagy zwitterionos detergensek. Előnyösen alkalmazható a nemionos digitonin, még előnyösebben a zwitterionos 3-(3-chlolamido-propil)-dimetil-ammónio-l-propánszulfonát (CHAPS) és 3-(3-chlolamido-propil)-dimetilammónio-2-hidroxi-l-propánszulfonát (CHAPSO). Detergensek keverékét, például CHAPS és CHAPSO keverékét is alkalmazhatjuk. Az enyhe detergens a foldingpufferben előnyösen körülbelül 1 és 100 mM közötti, még előnyösebben 30 és 60 mM közötti, a legelőnyösebben 30 mM koncentrációban van jelen.

A találmány egy előnyös megvalósításában a térszerkezet kialakításához használt puffer az eddigieken kívül egy redukálóanyagot is tartalmaz. Alkalmas redukálószer, amely fehérjékben vagy peptidekben elősegíti a diszulfidok képződését, lehet például egy kis molekulatömegű szulfhidrilreagens, éspedig glutation redukált alakban, ditiotreitol redukált alakban, β-merkapto-etanol redukált alakban, merkapto-metanol redukált alakban, cisztein vagy cisztein-amin. A módszer azonban úgy is alkalmazható, hogy ilyen anyag nincs jelen. A szulfhidrilreagens alkalmas koncentrációja körülbelül 1 és 100 mM közötti, előnyösen körülbelül 1 és 10 mM közötti, még előnyösebben körülbelül 2,5 mM.

A térszerkezet kialakítását megfelelő, például körülbelül 0 °C és körülbelül 40 °C közötti, előnyösen 4 °C körüli hőmérsékleten és megfelelő, például körülbelül 2 és körülbelül 720 óra közötti idő alatt hajtjuk végre. Minthogy a térszerkezet kialakításának időtartama az alkalmazott hőmérséklettől függ, a hőmérsékletet optimalizálhatjuk tetszőleges kívánt reakcióidőhöz, vagy fordítva.

A dimer, biológiailag aktív TGF^-szerű fehérje találmány szerinti előállítását végezhetjük egy lépésben, amikor is a fehérje monomerjét behelyezzük a foldingpufferbe, és a reakcióelegyet például 2 órától 7 napig terjedő vagy hosszabb időn át például 0 °C és 40 °C közötti hőmérsékleten, előnyösen 4 °C-on inkubáljuk, miközben a térszerkezet kialakulása és a dimerizálódás folyamatosan végbemegy. Nagyjelentőségű a fehérje koncentrációja a térszerkezet kialakulása során, mert ha túl nagy, a monomerek erősen aggregálódhatnak, ami nem kívánatos nagyságú oligomerek képződéséhez vezet. A dimer termék kihozatala növekszik, ha a fehérjekoncentráció 2 mg/ml-nél kisebb, az előnyös koncentrációk 0,01 és 0,5 mg/ml közé esnek.

A TGF^3 térszerkezetének a találmány szerinti kialakítására irányuló vonatkozó kísérletek előnyös példái a következők:

0,1 mg/ml TGF^3,

100 ml Tris, adott esetben 1-50 mM redukált glutation, cisztein, ciszteamin vagy β-merkapto-etanol (bár, mint mondot5

HU 222 830 Bl tűk, a módszer szulfhidril redoxrendszer jelenléte nélkül is alkalmazható).

M nátrium-klorid,

0,5 M arginin,

20-30% dimetil-szulfoxid, mM CHAPS vagy CHAPSO, pH=9-9,5;

vagy

0,1 mg/ml TGF-p3,

100 ml Tris,

2,5 mM redukált glutation, cisztein, ciszteamin vagy β-merkapto-etanol (bár, mint mondottuk, a módszer szulfhidril redoxrendszer jelenléte nélkül is alkalmazható).

M nátrium-klorid,

0,5 M arginin,

10% dimetil-szulfoxid, mM CHAPS vagy CHAPSO, pH=8,5.

A térszerkezet kialakítása után a biológiailag aktív dimert pufferoljuk, hogy eltávolítsuk belőle a nem pontos szerkezetű TGF^-szerű fehéijét és a szennyezéseket, különösen a pirogéneket és más endotoxinokat, amelyek a rekombináns fehéijének a mikrobiológiai gazdaszervezet sejtjeiben végzett előállítása után a készítményben jelen lehetnek. A dimer elválasztásához kromatográfiát, például gélkromatográfiával végzett méret szerinti frakcionálási, hidrofób kölcsönhatásos kromatográfiát vagy ioncserélő, például egy Mono S oszlopon végrehajtott vagy reverz fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiát alkalmazunk.

A találmány további tárgyát képezik a találmány szerinti eljárással előállított dimer, biológiailag aktív TGF^-szerű fehéijék, amelyek a terápiában sokféle módon alkalmazhatók.

Az alábbi példák a találmány illusztrálására szolgálnak, annak oltalmi körét nem befolyásolják.

1. példa: TGF-ftl, TGF-^2 és TGF-$3 expressziója E. coliban

A. példa: Általános módszerek

Baktériumtörzs:

E. coli K.12/LC 137:htpR_am, Ion_R9, Iac_am, rnal_am, trp_am, ph°am’ rspL, tsx: :Tnl0, supC_B leírása megtalálható az alábbi szakirodalmi helyen: Goff és munkatársai [PNAS 81, 6647-6651 (1984)]

Plazmidok:

- A Buell, G. és munkatársai [Nucleic Acids Rés. 13, 1923-1938 (1985)] által leírt pPLMu: ez a plazmid hordozza a bakteriofág IP_L promotert a phage Mu ner gén riboszómakötő hellyel, leírása megtalálható az alábbi helyen: Van Leerman és munkatársai [Virology 123,19-28 (1982)],

- a Remault és munkatársai [Gene 22, 103-113 (1983)] által leírt plc857:a termolabilis lambda cl₈₅₇ represszort (egy gén működését megakadályozó anyag) kódoló és a kanamicinnel szembeni ellenállást adó plazmid.

SDS gélelektroforézis:

Az SDS poli(akril-amid)-gélelektroforézist (SDS-PAGE) és a proteinszínezést a Laemmli, U. K.

[Natúré 227, 680-685 (1970)] által ismertetett, a fentiekben leírt módon, a BIORAD cégtől beszerzett Miniprotean II cella és 1 mm vastagságú 18%-os poli(akril-amid)-gél alkalmazásával végezzük.

Hőindukció:

Egy 20 ml-es kémcsőben, amely 40 pg ampicillint és 40 pg kanamicint tartalmaz, 7 ml, Maniatis és munkatársai [Molecular cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982)] által leírt LB- (ligációs puffer) közeget (LB/amp/kan) egy izolált teleppel beoltunk, és rázás közben egy éjszakán át 30 °C-on inkubáljuk. Ebből az egyéjszakás tenyészetből 15 ml-t adunk egy 100 ml-es Erlenmeyer-lombikba betöltött (LB/amp/kan) közeghez, és a lombikot egy 42 °C-os vízfürdős rázógépbe helyezzük. Egy 2 ml-es mintát veszünk a hőközlés előtt (indukciómentes körülmények), és egy 1 ml-es mintát 1 órával a hőközlés után (indukciós körülmények). A sejteket Eppendorf centrifugában 5 percig, 10 000 fordulat/perc sebességgel végzett centrifugálással ülepítjük, a felülúszót elöntjük. Az üledéket 100 1 SDS-PAGE mintapufferben szuszpendáljuk, és 10 percig 90 °C-on melegítjük. 5 pl-es aliquot mintákkal elvégezzük a gélelektroforézist.

Kompetens sejtek előállítása:

A kompetens E. coli-sejteket a Maniatis és munkatársai [Molecular cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982)] által leírt kalcium-kloridos eljárással állíthatjuk elő. A sejthordozó plc₈₅₇ plazmidot 30 °C-on szaporítjuk.

1B. példa: A pPLMu.hTGF-βΙ, a pPLMu.hTGFβ2 és a pPLMu.hTGF^3 expressziós vektor felépítése és a TGF-βΙ, ΤΟΡ-β2 és TGF^3 expressziója

A TGF-β 1-et, TGF-p2-t, illetve TGF^3-at kódoló szekvenciákat (amelyek a szekvencialistán láthatók) PGem-5ZF(+) (Promega) plazmidba klónozzuk, Ncolgyel emésztjük, Calf Intestinal Alkaline Phoshatase-zal (a Boehringertől beszerzett lúgos borjúbélfoszfatáz) foszformentesítjük, majd Klenow-polimerázzal (GibcoBRL) kitöltjük. A kapott szerkezeteket pGKM 125-nek (TGF-βΙ), pGKM 740-nek (TGF^2), illetve pGKM 126-nak (TGF^3) nevezzük, és a kompetens E. coli Y 1090 sejtek transzormálására használjuk. Azokat a kiónokat, amelyek a TGF-β 1-et, TGF^2-t, illetve TGFβ3-3ί kódoló pontos inszerciókat hordozzák, E. coli Y 1090/pGKM 125 (TGF^l)-nek, E. coli Y 1090/pGKM 740 (TGF^2)-nek, illetve E. coli Y 1090/pGKM 126(TGF^3)-nak nevezzük.

Az E. coli Y 1090/pGKM 125, E. coli Y 1090/pGKM 740 és E. coli Y 1090/pGKM 126 sejteket LB közegben szaporítjuk, a DNS-plazmidot pedig a Bimbóim, H. C. és Doly, H. [Nucleic Acids Research 7. 1513 (1979)] által leírt módon állítjuk elő. Ehhez 50 pl restrikciós pufferben 5 pg plazmid DNS-t hasítunk Ncol és Sáli (pGKM 125) vagy Ncol és EcoRV (pGKM 740) vagy egymagában Ncol (pGKM 126) alkalmazásával, a szállító (Boehringer) utasításait követve. A DNS-t 5 pl 3 M nátrium-acetát, 100 mM magnézium-klorid és 5 mM etilén-diamin-tetraecetsav (EDTA) hozzáadásával kicsapjuk. -70 °C-on végzett 15 perces inkubálás után a DNS-t Sorvall centrifugá6

HU 222 830 Bl val, SS34 rotorban 13 000 g-vel végzett 15 perces centrifugálással ülepítjük. A felülúszót elöntjük, az üledéket 80 1 0,089 M TRIS-borátot, 0,089 M bórsavat, 0,002 M EDTA-t, 0,25% bróm-fenolkéket és 0,25% xilol-cianolt tartalmazó oldatban szuszpendáljuk. Négyszer 20 μΐ-es mintákkal, TBE-pufferben 0,5 μg/ml etídium-bromidot tartalmazó 1%-os agarózgélben 50 V feszültséggel addig végezzük a gélelektroforézist, míg a bróm-fenolkék-jelző a 10 cm hosszúságú és 0,8 cm vastagságú gél alját el nem éri. Az érett TGF-β 1-et, TGFβ2-1, illetve TGF^3-at kódoló DNS-fragmentumokat rövid hullámhosszú ultraibolya fénnyel láthatóvá tesszük, borotvapengével kivágjuk, és a géldarabról elektroelúcióval, Schleicher & Schüll Biotrap készülékkel, 1,5 órán át 200 mamp áram alkalmazásával leoldjuk. A leoldott DNS-fragmentumokat a fenti módon kicsapjuk, majd 20 μΐ TE-ben reszuszpendáljuk.

μΐ pPLMu plazmidot Ncol és Sáli vagy Ncol és EcoRV vagy egymagában Ncol alkalmazásával végzett emésztéssel linearizálunk, és a gélt az előzőekben a DNS-fragmentumokra vonatkozóan leírt módon tisztítjuk. 100 ng linearizált és tisztított pPLMu vektorDNS-t és a megfelelő, tisztított DNS-fragmentum 3 mólekvivalensnyi mennyiségét 1 egység DNS-ligázt (Boehringer) tartalmazó 20 μΐ ligációs pufferben (70 mM pH=7,5-es TRIS/sósav, 10 mM magnéziumklorid, 5 mM DTT, 0,1 mM adenozin-trifoszfát) 4 °Con 15 órán át inkubáljuk.

A ligációs keverékből 10 μΐ-t hozzáadunk 200 μΐ hideg (4 °C-os), plc_s57 plazmidot hordozó kompetens E. coli 137 sejthez. 30 perc múlva a sejteket 42 °C-os vízfürdőben 1,5 percen át végzett inkubálással hősokknak tesszük ki, majd a tenyészethez 2 ml ligációs puffért (LB) adunk, és 60 percig 30 °C-on rázzuk. Ezután 200 μΐ-es aliquot részeket ampicillint és kanamicint tartalmazó LB lemezekre oltunk, és ezeket 22 órán át 30 °Con inkubáljuk. Izolált telepeket tenyésztünk, és a plazmid DNS-t elemezzük. A TGF^l-et, TGF^2-t, illetve TGFβ3-8ΐ kódoló DNS-fragmentumokat pPLMu-ban szubklónozzuk, így pPLMu.hTGF-βΙ, pPLMu.hTGF-fi2, illetve pPLMu.hTGF^3 plazmidot kapunk. A fenti szerkezeteket tartalmazó kiónokat E. coli 137/pPLMu.hTGF^lnek, E. coli 137/pPLMu.hTGF-p2-nek, illetve E. coli 137/pPLMu.hTGF-p3-nak nevezzük.

Az E. coli 137/pPLMu.hTGF^l, E. coli 137/pPLMu.hTGF^2 és E. coli 137/pPLMu.hTGFβ3 sejteken az 1A. példa szerinti módon hőindukciót hajtunk végre, és az expresszált fehéqéket SDS-PAGE módszenei elemezzük. A hőindukció után 2 óra múlva a TGF-βΙ, TGF^2 és TGF^3 mindegyike megjelenik hőindukciós fehérjeként, amely fehérjék körülbelül 12 000 Da látszólagos molekulatömeggel vándorolnak.

IC. példa: A transzformánsok előállítása fermentálással

Az E. coli 137/pPLMu.hTGF^l, E. coli 137/pPLMu.hTGF^2 és E. coli 137/pPLMu.hTGFβ3 egyéjszakás tenyészeteit 750 ml LB közeget és 40 mg ampicillint és kanamicint tartalmazó 2 literes Erlenmeyer-lombikokban 30 °C-on szaporítjuk. A 2 literes Erlenmeyer-lombikokban az említett antibiotikumokat tartalmazó 750 ml LB közeghez 300 ml-t adunk az egyéjszakás tenyészetekből, majd 65 °C-os vízfürdőben 42 °C-ra melegítve körülbelül 3,5 percig rázzuk. Ezután a lombikokat jégfürdővel 12 °C-ra hűtjük, és a sejteket GSA rotorban 8000 fordulat/perc sebességgel 10 percig végzett centriíugálással összegyűjtjük.

2. példa: A TGF-βΙ, TGF-$2 és TGF-$3 expressziója Saccharomyces cerevisiae-ben

Az érett TGF^l-et, TGF^2-t és TGF~03-at kódoló szekvenciák expressziója Saccharomyces cerevisiae-ben, savas élesztő-foszfatázzal (PH05) szabályozva megy végbe.

Az expressziós vektorokat két lépésben építjük fel:

A) a pJDB207/PH05-RIT 12 plazmid felépítése és

B) a pJDB207/PH05-TGF^l, a pJDB207/PH05-TGF^2 és a pJDB207/PH05-TGFβ3 plazmid felépítése, ahol az A) lépésben kapjuk az élesztővektort és a PH05 transzkripciós terminátort, a B) lépésben pedig a PH05 promoterrel szabályozott expressziós kazettákat egy-egy, az érett TGF^l-et, TGF^2-t, illetve TGF^3-at kódoló inszertummal.

2A. példa: A pJDB207/PH05-RIT 12 plazmid felépítése

Az EP 277313 számú európai szabadalmi leírásban ismertetett p31 RIT 12 plazmidot Sáli restrikciós endonukleázzal kiegyenesítjük. Etídium-bromid jelenlétében végzett részleges HindlII-emésztéssel egy 1 kb-os SalI/HindlII fragmentumot kapunk, amely tartalmazza a 276 bp-os Sall/BamHI pBR322 szekvenciát, a PH05 savas élesztő-foszfatáz 534 bp-os promoterét, a 19 aminosavat kódoló élesztő invertáz szignálszekvenciát és a PH05 transzkripciós terminátort.

A p31 RIT 12 1 kb-os SalI/HindlII fragmentumát a Beggs, J. D. [Molecular Genetics in yeast, Alfréd Benzon Symposium 16, Copenhagen, 383-398 (1981)] által ismertetett, Sall-vel és HindlII-mal hasított pJDB207 élesztő-E. coli ingázó vektorba klónozzuk. Az így kapott, 1 kb-ot tartalmazó inszertumot pJBD207/PH05 RIT 12-nek nevezzük.

2B. példa: A pJDB207R/PH05-TGF^3 plazmid felépítése

A pGKM740 (ΤΟΡ-β3) plazmidot Ncol-gyel hasítjuk. A ragadós végeket Klenow DNS-polimerázzal végzett reakcióval kitöltjük. Ezután EcoRI linkért (57CCGGAATTCCGG; Biolabs) adunk hozzá, és a keveréket Egáljuk. A kapott cirkuláris plazmidot GKMA668 (TGF^3)-nak nevezzük, és EcoRI-gyel és Sall-vel hasítjuk. Egy 0,4 kb-os EcoRI/Sall fragmentumot izolálunk az agarózgélről, tisztítjuk, és steril vízben, 25 g/ml koncentrációban szuszpendáljuk. A fragmentum tartalmazza az érett TGF^3-at kódoló szekvenciát egy ATG-vel, az érett TGF^3 Ala aminosavát definiáló CGT kodonhoz való keretben.

A PH05 promotert a fenti p31 RIT plazmidból egy 534 bázispáros (bp) BamHI/EcoRI fragmentumon izoláljuk. A pJBD207/PH05 RIT 12 plazmidot BamHIgyel és Xhol-gyel hasítjuk. A nagy, 6,8 kb-os BamHI/ Xhol fragmentumot izoláljuk. A PH05 transzkripciós terminátor a fragmentumon marad. A BamHI/EcoRI

HU 222 830 Bl

PH05 promoter fragmentumot, a TGF-p3-at kódoló EcoRI/Sall fragmentumot és a BamHI/XhoI vektorfragmentumot összekötjük. A pJDB207-be az óramutató járásával ellentétes irányban klónozással bevitt, a PH05 promoterrel szabályozott TGF-p3 gént tartalmazó pontos kiónt pJDB207R/PH05-TGF-33-nak nevezzük.

Hasonlóképpen hajtjuk végre érett TGF-βΙ és TGF^2 expresszióját Saccharomyces cerevisiae-ben. A TGF^l-et, illetve TGF^3-at kódoló szekvenciákat tartalmazó plazmidokat pGKM 125-nek, illetve pGKM 126-nak nevezzük. Ezeket a plazmidokat Ncol-gyel emésztjük, EcoRI linkereket adunk hozzá, összekapcsoljuk, és a kapott cirkuláris plazmidot EcoRI-gyel és Sall-vel hasítjuk. Az EcoRI/Sall fragmentumokat a fenti módon pJDB207-be klónozzuk. Az így kapott plazmidokat pJDB207R/PH05-TGF^l-nek, illetve pJDB207R/PH05-TGF^3-nak nevezzük.

2C. példa: A S. cerevisiae GRF18 törzs transzformálása

Saccharomyces cerevisiae GRF18 törzset (MÁT, his3-11, his3—15, leu2-3, leu2-112, canR, DSM3665 a Hinnen, A. és munkatársai [PNAS 75,1929 (1978)] által leírt transzformációs eljárással, pJDB207R/PH05-TGF^l, pJDB207R/PH05-TGF^2 és pJDB207/PH05-TGF^3 plazmidokkal transzformálunk. A transzformált élesztősejteket leucinhiányos élesztő minimál táplemezeken választjuk szét. A transzformált különálló élesztőtelepeket izoláljuk, ezeket Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207R/PH05-TGF^l-nek, Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207R/PH05-TGFβ2-ηε^ illetve Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PH05 -TGF^3-nak nevezzük.

2D. példa: Saccharomyces cerevisiae transzformánsok tenyésztése és sejtkivonatok előállítása

Az élesztőtranszformánsok, mint mondtuk, olyan plazmidokat tartalmaznak, amelyekben PH05 promoterrel szabályozott expressziós kazetták vannak, ezért végre kell hajtani a TGF-βΙ-, TGF^2-, illetve TGF^3expresszió promoterének derepresszióját [a gén működését megakadályozó anyag (represszor) eltávolítása]. Mindegyik transzformánst két, egymást követő, 10, illetve 50 ml-es előtenyészetben a Difco Yeast Nitrogén Base recept alapján aminosavak nélkül készített, de az ammónium-szulfát helyett 10 g/liter L-aszparagint, továbbá 1 g/liter L-hisztidint és 20 g/liter glükózt tartalmazó, nagy ionkoncentrációjú élesztő minimál táptalajon szaporítjuk. A második előtenyészet sejtjeit 0,9%os nátrium-klorid-oldattal mossuk, és 100 ml, a Difco Yeast Nitrogén Base táptalajrecept alapján aminosavak nélkül készített, de 0,03 g/liter kálium-dihidrogén-foszfátot, 10 g/liter L-aszparagint, 1 g/liter L-hisztidint és 20 g/liter glükózt tartalmazó, kis ionkoncentrációjú minimál táptalajba oltjuk. A tenyészetet 30 °C-on 180 fordulat/perc sebességgel keverjük.

5,24, illetve 48 óra elteltével a sejteket 10-10 ml tenyészetből 3000 fordulat/perc sebességgel végzett centrifúgálással kinyerjük, és 0,9%-os nátrium-klorid-oldattal egyszer átmossuk. Ezután a sejteket 66 mM pH=7,4-es kálium-foszfátot és 4 mM Zwittergentet (Calbiochem) tartalmazó lízis- (roncsoló) pufferben szuszpendáljuk. A szuszpenzióhoz 8 g 0,5-0,75 mm átmérőjű üveggyöngyöt adunk, majd Vortex keverőben hidegen 4-5-ször 2 percig erőteljesen felrázzuk. A sejtkivonatot az üveggyöngytől dekantálással választjuk el. A kivonatból a sejttörmeléket 4 °C-on 3000 fordulat/perc sebességgel végzett centrifúgálással kiülepítjük. A felülúszót az üledéktől elválasztjuk, és mindkettőt -20 °C-on tároljuk.

3. példa

3A. példa: Oldhatatlan TGF-33 monomer kinyerése E. coliból

E. coli 137/pPLMu.hTGF^3 sejteket tenyésztünk az IC. példában leírt módon. A sejtek roncsolását és az oldhatatlan TGF^3 kinyerését 4 °C-on hajtjuk végre. Körülbelül 18 g nedves sejtet pH=8,3-as roncsolópufferben szuszpendálunk, amely 60 ml TRIS/sósavat, 10 mM EDTA-t és 1 mM fenil-metánszulfonil-kloridot (PMSF) tartalmaz. A sejteket egy Frenchpress (SLM Instruments, Inc.) készüléken a gyártó utasításai szerint kétszer áteresztjük, majd a térfogatot a roncsolópufferrel 200 ml-re kiegészítjük. A szuszpenziót 15 000 gvel 20 percig centrifugáljuk. A kapott üledéket 1 M nátrium-kloridot tartalmazó 100 ml roncsolópufferben szuszpendáljuk, és a fenti módon 10 percig centrifugáljuk. Ezután az üledéket 1% Triton Χ-100-at (Pierce) tartalmazó roncsolópufferben ismét szuszpendáljuk, majd újabb 10 percig centrifugáljuk a fenti módon. A mosott üledéket 20 ml TRIS/sósavat, 1 mM EDTA-t, 1 mM PMSF-et és 1% DTT-t tartalmazó 50 ml oldatban szuszpendáljuk, és egy teflonszitás őrlőgépben homogenizáljuk. Az így kapott szuszpenzió nyers monomer TGF^3-at tartalmaz oldhatatlan alakban.

3B. példa: A monomer TGF^3 szolubilizálása és tisztítása

A 3A. példa szerinti módon kapott 10 ml TGF^3szuszpenziót 10%-os ecetsavval pH=2,5-re megsavanyítunk, és Eppendorf centrifugában szobahőmérsékleten 10 percig centrifugáljuk. A felülúszót 2,6x78 cmes Sephacryl S-100 oszlopon (Pharmacia) 10%-os ecetsavban 1,4 ml/perc áramlási sebességgel kromatografáljuk. [A kromatográfiához használhatunk Sephacryl S-100 HR (Pharmacia) oszlopot is, és a futtatást 1%os ecetsavban vagy 5 mM sósavoldatban is végezhetjük.] A monomer, denaturált TGF^3-at tartalmazó, 190 és 220 perc között leoldódó frakciókat összegyűjtjük. Ezt az anyagot a biológiailag aktív, dimer TGFβ3 térszerkezetének kialakításához (4. példa) vagy további tisztítás után szerkezeti elemzéshez (3D. példa) használjuk.

3C. példa: A monomer TGF^3 kinyerése a Saccharomyces cerevisiae-ből

Egy, a fenti módon végrehajtott 500 ml-es fermentálásból kapott, roncsolt sejtekből álló üledéket 4 M karbamidot, 0,1 M TRIS-t és 1% DTT-t tartalmazó 20 ml, pH = 8,0 -as oldatban szuszpendálunk. A keveréket 30 percig szobahőmérsékleten tartjuk, eközben 5 per8

HU 222 830 Β1 cenként Vortex keverővei megkeverjük. Az oldhatatlan részt 4 °C-on, 30 000 g-vel 30 percig végzett centrifugálással eltávolítjuk, a felülúszó pH-ját ecetsavval 2,5-re állítjuk, és 5%-os ecetsavval szemben 4 °C-on egy éjszakán át extenzíven dializáljuk. Az oldatot a fenti módon centrifugáljuk, és a tiszta felülúszót YM 10 (Amicon) membránon át végzett ultraszűréssel 4 ml végtérfogatra sűrítjük. Ezután a mintát a 3. példa szerinti módon Sephacryl S-100 HR (Pharmacia) oszlopon, 5%os ecetsavval kromatografáljuk, így megkapjuk a monomer TGF-p3-at.

3D. példa: A monomer TGF-33 további tisztítása

A 3B. példában a Sephacryl S-100 oszlopról összegyűjtött frakciók aliquot részeit 4,6 x 150 mm-es Vydac 214TP5415 reverz fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiás oszlopon (The Separations Group, Hesperia, CA, USA) tisztítjuk. Az oszlopot 70% 0,1%-os vizes trifluor-ecetsav-oldat és 30% 0,08%-os acetonitriles trifluor-ecetsav-oldat elegyével egyenlítjük ki, és a terméket 30 perc alatt lineáris gradienssel amelynek végső összetétele 55% 0,1%-os vizes trifluor-ecetsav-oldat és 45% 0,08%-os acetonitriles trifluor-ecetsav-oldat, 1 ml/perc áramlási sebességgel oldjuk le. 216 mm-nél vizsgáljuk az eluátum fényelnyelését, és kézi úton gyűjtjük össze az ultraibolya fényelnyelés szerinti egyedi csúcsértékeihez tartozó frakciókat.

A denaturált monomer TGF-33 21,5 percnél oldódik le. Attól függően, hogy milyen reverz fázisú oszlopot használunk, ugyanez a TGF-33 készítmény 16, illetve 18 percnél oldódik le.

A TGF-33 frakciókat reverz fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiával, a fentivel azonos oszlop és oldószerelegy alkalmazásával elemezzük. A TGF-p3-at 42 percen át eluáljuk egy olyan lineáris gradienssel, amely 100% 0,1%-os vizes trifluor-ecetsav-oldattal indul, és végső összetételében 30% vizes trifluor-ecetsav-oldatot és 70% 0,08%-os acetonitriles trifluor-ecetsav-oldatot tartalmaz. A TGF-33 egyetlen csúcsként, 30,4 percnél oldódik le. Az alkalmazott oszlop típusától függően 29 perces, illetve 29,9 perces retenciós időt kapunk.

3E. példa: A monomer TGF-33 elemzése SDS-PAGE módszerrel

A 3B. példában a Sephacryl S-100 oszlopról vagy a 3C. példában a reverz fázisú oszlopról összegyűjtött frakciók aliquot részeit vákuumban szárítjuk, és Coomassie Blue R-250-nel színezett 15%-os poli(akril-amid)-gél-lemezeken SDS-PAGE módszenei vizsgáljuk. 12 000 Da látszólagos molekulatömegnél egy különálló sávot kapunk, amely megkülönböztethetetlen a redukált természetes sertés-TGF-33-tól.

3F. példa: A monomer TGF-33 N-terminális aminosavszekvenciájának meghatározása

A 3B. példában kapott TGF-33-at vákuumban bepároljuk, 25 1 0,1 M ecetsavban oldjuk, és 470A típusú gázfázisú proteinszekvenálóval (Applied Biosystems) meghatározzuk az aminosavszekvenciáját.

Az N-terminális aminosavszekvencia megegyezik azzal, ami a szekvencialistán 6. szekvencia-azonosítószámon szerepel.

4. példa: A TGF-$3 térszerkezetének in vitro kialakítása

A fenti módon kapott TGF-33 térszerkezetét 4 °Con, olyan pufferben alakítjuk ki, amely 0,1 M Tris-t, 30 mM CHAPS-t, 1 M nátrium-kloridot, 5 mM redukált glutationt és 20 térfogat% dimetil-szulfoxidot tartalmaz. Szükséges esetben a puffer pH-ját nátrium-hidroxid-oldattal 9,5-re állítjuk. A TGF-33 végső koncentrációja 0,1 mg/ml. 7 nap múlva az oldatot 4 °C-on tömény ecetsavval pH=3,5-re megsavanyítjuk, és Amicon vegyes cellás YM10 membránon (Amicon) át végzett ultraszűréssel körülbelül 10-szeres koncentrációra besűrítjük. A tömény oldatot 0,1 M ecetsavoldattal eredeti térfogatára hígítjuk, majd ismét besűrítjük. Ezt az eljárást kétszer megismételjük. Ezután az oldatot az

5. példában leírt módon ioncserés kromatográfiával tisztítjuk.

5. példa: A dimer, biológiailag aktív TGF-Q3 izolálása kationcserés kromatográfiával

A 4. példában kapott oldatot, amely körülbelül 10 és 50 mg közötti TGF-33-at tartalmaz, 6 ml/perc sebességgel egy HiLoad 26/10 S-Sepharose High Performation (Pharmacia) oszlopra töltjük. Az oszlopot először egy pH=4-es, 20 mM nátrium-acetátot és 30% izopropil-alkoholt tartalmazó oldattal (A puffer) 5 percig mossuk, majd 45 percig eluáljuk egy lineáris gradienssel, amely 0,2 M nátrium-kloridot tartalmazó A pufferrel kezdődik, és 0,5 M nátrium-kloridot tartalmazó A pufferrel végződik. Az eluátumot 280 nm-nél vizsgáljuk, a frakciókat kézzel gyűjtjük. A frakciókat nemredukáló SDS-PAGE-vel vizsgáljuk TGF-33-ra, a biológiai aktivitást pedig in vitro biológiai vizsgálattal ellenőrizzük.

6. példa: A TGF-$3 további tisztítása és jellemzése

6A. példa: További tisztítás reverz fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiával

A dimer, biológiailag aktív TGF-33-at tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, azonos térfogatú 0,1%-os vizes trifluor-ecetsav-oldattal hígított 0,1 M ecetsavval szemben dializáljuk, majd 1 χ 25 cm-es Vydac 214TP5415 oszlopon (The Separations Group, Hesperia, CA, USA) kromatografáljuk. Az oszlopot 4,5 ml/perc áramlási sebességű, 75% A oldószert (0,1%-os vizes trifluor-ecetsav-oldat) és 25% B oldószert (0,08%-os acetonitriles trifluorecetsav-oldat) tartalmazó eleggyel kiegyenlítjük. A minta feltöltése után az oszlopot egyensúlyi körülmények között addig mossuk, míg a 235 nm-nél mért abszorpció el nem éri az alapvonalat. Ezután az oszlopot 30 perc alatt lineáris gradienssel, amely az egyensúlyi állapottal kezdődik, végső összetétele pedig 45% A oldószer és 55% B oldószer, eluáljuk. Az eluátum frakcióit kézzel gyűjtjük, és nemredukáló SDS-PAGE-vel, valamint in vitro biológiai vizsgálattal elemezzük.

6B. példa: SDS-PAGE elemzés

A 6A. példában előállított tisztított TGF-33 aliquot részeit vákuumban szárítjuk, és Coomassie Blue R-250-nel színezett 15%-os poli(akril-amid)-gél-lemezeken SDS-PAGE módszerrel vizsgáljuk. A redukálat9

HU 222 830 Bl lan minták körülbelül 25 kDa látszólagos molekulatömegnél egy különálló sávot mutatnak, míg a redukált minták 12,5 kDa körüli értéknél mutatnak egy sávot.

6C. példa: A molekulatömeg meghatározása

A 6A. példában kapott tisztított TGF-P3-a elektrospray-ionizációs tömegspektrometriával (ESI-MS) elemezzük. A mért tömegösszeg nagyon közel áll az az elméletileg számítotthoz.

6D. példa: Aminosavanalízis

Az aminosavanalízist a Knecht, R. és Chang, J.-X. [Analytical Chemistry 58: 2375-2379 (1986)] által leírt módon végezzük. Az eredmények az elméletiekkel jó egyezést mutatnak.

6E. példa: Az N-terminális aminosavszekvencia meghatározása

A 6A. példában kapott TGF-P3-ból 10-20 mg-ot vákuumban szárítunk, 25 ml 10 mM ecetsavoldatban oldunk, és 477A típusú gázfázisú szekvenálóval (Applied Biosystems) meghatározzuk az aminosavszekvenciáját. Az első 10 meghatározott aminosavszekvenciája az elméletivel azonos volt.

6F. példa: Proteolitikus fragmentálás Asp-N-proteázzal mg (6,7 nmol) TGF-p3-at redukálunk, a kapott anyagot 4-vinil-piridil-etilezzük, vákuumcentrifugálással szárítjuk, és ismét feloldjuk 200 ml 5 mM sósavoldatban. Hozzáadunk 200 ml pH=7,8-es 0,2 M Trisacetát-puffert, amely 10 mM Zwittergent 3-12 detergenst (Calbiochem Corporation, La Jolla, CA) tartalmaz, és összekeverjük vele. A hasítást 50 ml vízben oldott 2 mg endoproteináz Asp-N-nel (forrás: Sequence Grade, a németországi Boehringer Mannheim Biochemica cégtől beszerzett Pseudomonas fragi mutant) 37 °C-on végezzük. 13 óra múlva 50 ml 10 térfogat%os trifluor-ecetsav-oldatot adunk hozzá, és a keveréket 4,6 mmxl50 mm-es Vydac 218TP5415 oszlopon (The Separations Group) nagynyomású folyadékkromatográfiával, 0,1 %-os vizes trifluor-ecetsav-oldatban 5-45 térfogat% acetonitrilt tartalmazó, 0,1 ml/perc áramlási sebességű lineáris gradienssel 40 perc alatt elválasztjuk. Az izolált peptideket elektrospray-ionizációs tömegspektrometriával (ESI-MS) elemezzük. Az így meghatározott molekulatömegek az Asp-Nfragmentumokra számított értékekkel jó egyezést mutatnak.

Az azonosított fragmentumok a teljes aminosavszekvenciát lefedik az 1. és 2. aminosav kivételével. Ezeket az aminosavakat a teljes protein N-terminális aminosavszekvenciájának meghatározásával és a V8 fragmentumok elemzésével azonosítjuk.

6G. példa: Proteolitikus fragmentálás V8 proteázzal

Az Asp-N-proteázzal végzett kísérlethez hasonló módon 4-vinil-piridinezett TGF-P3-at V8 proteázzal emésztünk, a fragmentumokat nagynyomású folyadékkromatográfiával választjuk el, és ESI-MS-sel elemezzük. Az így kapott molekulatömeg-értékek az elméletileg számítottakkal jól egyeznek, ez alátámasztja a TGF-P3 azonosítását. Az azonosított fragmentumok a teljes, 112 aminosavból álló szekvenciát lefedik.

7. példa: A háromdimenziós térszerkezetű TGF-β in vitro aktivitásának mérése nyérctüdőhámsejt (Mv-l-Lu) savas foszfatázos vizsgálatával

TGF-p-t vagy hibrid TGF-p-t szkrínelünk egy sejtbiológiai vizsgálattal, amelyben azt méijük, hogy a vegyület milyen mértékben képes inhibiálni egy folytonos nyérctüdő-hámsejtvonal, az Mv-l-Lu (ATCC/CCL64) szaporodását. Az Mv-l-Lu sejtvonal érzékeny jelzőnek bizonyult a TGF-ek biológiai vizsgálatában: Tucker és munkatársai [Science 226, 705-707 (1984)], Absher és munkatársai [J. Immunoi. Methods 138: 301-303 (1991)], valamint Danielpour és munkatársai [J. Cell Physiol. 138: 79-86 (1989)] szerint szigmoid alakú koncentráció-választ ad, EC₅₀ értéke körülbelül 10-50 pg/ml. Kelley és munkatársai [Exp. Lung Rés. 18: 877-887 (1992)], valamint Meager [J. Immunoi. Methods 141: 1-14 (1991)] az Mv-l-Lu sejteket, amelyeknek szaporodását a TGF-β erősen gátolja, tartják jelenleg a legalkalmasabb sejtvonalnak egy, erre a citokinre vonatkozó biológiai analitikai vizsgálat kidolgozásához. A vizsgálatot 96 lyukú mikrotiterlemezeken, az American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA-tól eredetileg megkapott sejtekkel végezzük. A sejteket kis sűrűsséggel (lyukanként 5000 sejt) oltjuk be a tenyésztőközegbe (minimum esszenciális közeg 5 térfogat% boíjúmagzatszérummal), amely egy TGF-p3-összehasonlító vagy minta sorozathígításait tartalmazza. A vizsgált mintákat ezután egy nedvesített, 5% szén-dioxidot tartalmazó légterű inkubátorban 72 órán át 37 °C-on inkubáljuk. A sejtszaporodás gátlását egy érzékeny enzimes sejtfestési eljárással határozzuk meg (amely kolorimetriás úton megadja az egyes lyukakban termelt savas foszfatáz mennyiségét), az elszíneződés arányos az egyes lyukakban jelen lévő sejtek számával. Az egyes lyukak abszorbanciáját 405 nm-nél mérjük, a mért adatokat ábrázoljuk, és egy alkalmas PC szoftverrel elemezzük. Ebben a vizsgálatban az aktivitás egysége (U) a TGF-P-nak azon mennyisége, amely az Mv-l-Lu sejtek szaporodását a maximális érték felével gátolja.

8. példa: A háromdimenziós térszerkezetű TGF-βί in vivő aktivitási vizsgálatai

8A. példa: Öreg egerek közepesen mély sebeinek gyógyulása

Tudjuk, hogy a sebgyógyulási folyamatok a kor előrehaladásával romlanak, és ez a geriátriai gyógyászatban nagy problémákat okoz. Ezért vizsgáljuk a háromdimenziós térszerkezetű aktív dimer TGF-p3 in vivő biológiai hatását másodfokú égéssel létrehozott közepesen mély sebek gyógyulásására részlegesen hiányos vagy leromlott gyógyulási helyzetben, nevezetesen öreg állatoknál az alábbiak szerint.

450 napos vagy idősebb C57/BL6 egerek hátát leborotváljuk, és egy kommersz szőrtelenítőkrémmel depiláljuk, majd érzéstelenített állapotban a mellkas dorsalis részén egy 80 °C-os vízfürdőben egyensúlyig felmelegített lxl cm-es, 8 g-os vörösréz lapka egyszeri, 10 másodperces alkalmazásával egyszeri, middermális égési sebeket hozunk létre. Az ebből eredő hólyagot sebészeti úton eltávolítjuk, és az égéseket 5 napon át na10

HU 222 830 Bl ponta egyszer 25 ml, 10 mM hisztidin és 140 mM nátrium-klorid pH=7,4-es oldatában 0,8 g/100 ml hidroxipropil-cellulózt tartalmazó steril közegű pufferoldat helyi alkalmazásával, amely változó mennyiségű (500 ng, 100 ng vagy 10 ng) háromdimenziós térszerkezetű TGF-β-ί tartalmaz, vagy csak magával a pufferoldattal kezeljük vagy kezeletlenül hagyjuk. Minden helyileg alkalmazott anyag steril, endotoxin- és pirogénmentes, és a kísérlet idején minden egeret külön ketrecben tartunk. Az egyes kísérleti csoportok 5-5 állatból állnak.

TGF-p3-mal 5 napig végzett kezelés után az egereket érzéstelenítjük, az esetleg jelen lévő hólyagokat sebészeti úton eltávolítjuk, és a sebeket lefényképezzük. A gyógyult hámmal borított égési területeket filmvetítőhöz való, egyenletes vastagságú átlátszó filmre felrajzoljuk, és planimetriásan kiszámítjuk az egyes égési területek gyógyult részeinek százalékos arányát. Az eredményeket összehasonlítjuk az olyan fiatal (56-84 napos) C57/BL6 egerek azonos middermális égési sebeinél megfigyelt hámgyógyulási eredményekkel, amelyeket a kísérlet során nem kezeltünk.

A planimetriás elemzési eredmények azt mutatják, hogy a háromdimenziós térszerkezetű aktív dimer TGF-P3-nak egy megfelelő pufferoldatban 5 napon át naponta végzett helyi alkalmazása dózisfuggő módon stimulálja és gyorsítja öreg egerek részlegesen mély sebeinek hámgyógyulását a csak pufferoldattal kezelt vagy kezeletlen sebekhez viszonyítva. A fiatal egerek TGF-p3 helyi alkalmazása nélkül is képesek a sebek hámszöveteinek megújítására. A szövettem elemzés azt mutatja, hogy a hámszövet helyreállításának folyamata gyors elszarusodás kíséretében a TGF-P3-mal kezelt sebeknél a 6. napon gyorsul fel.

8B. példa: Mély sebek gyógyulása kifejlett patkányoknál

A háromdimenziós térszerkezetű aktív dimer TGFP3-nak a sebgyógyulásra kifejtett biológiai hatásait egy másik in vivő modellen, nevezetesen felnőtt patkányokon sebészeti bemetszéssel ejtett teljes mélységű sebek gyógyulásán is vizsgáltuk a Mustoe, T. A. és munkatársai [Science 237: 1333 (1987)] által leírtakhoz hasonló módon.

Pentobarbitonnal érzéstelenített, 300-350 g-os hím Wistar-patkányoknál, amelyeknek hátát leborotváltuk, és egy kommersz szőrtelenítőkrémmel depiláltuk, sebészeti ollóval a hátközépvonaltól mindkét oldalon 1,5 cm-re teljes mélységű, 5 cm hosszú egyenes bemetszéseket végzünk. A kísérleti csoportokban a (felülről nézve) bal oldali bemetszések széleit egyszeri helyi alkalmazásban 100 ml, 10 mM hisztidin és 140 mM nátrium-klorid pH=7,4-es oldatában 0,8 g/100 ml hidroxipropil-cellulózt és változó mennyiségű (2 mg, 1 mg, 0,1 mg vagy 0,01 mg) háromdimenziós térszerkezetű aktív dimer TGF-p3-at tartalmazó steril pufferoldattal kezeljük. A szemközti (jobb oldali) bemetszések széleit azonos mennyiségű ugyanilyen pufferoldatban placebo összehasonlító anyaggal (marhaszérum-albumin) kezeljük, a kontrollállatokon ejtett bemetszések széleit a bal oldali bemetszéseknél magával a pufferoldattal kezeljük, a jobb oldali bemetszések pedig semmiféle kezelést nem kapnak. Minden helyileg alkalmazott anyag steril, endotoxin- és pirogénmentes. Ezután mindegyik seb széleit összefogjuk 5 egyenletesen elosztott, szaggatott, vízszintes matracvarrattal. Az állatokat elkülönített ketrecekbe tesszük, és a sebeket a kezelés után különböző időtartamokig, legfeljebb 21 napig gyógyulni hagyjuk. Ezután az állatokat leöljük, teljes hátbőrüket leválasztjuk, a bőrök hátoldaláról az összes bőr alatti zsírt sebészeti csontkaparóval gondosan eltávolítjuk. Ezután egy két, egymástól 8 mm-es távolságban elhelyezett sebészeti pengét tartalmazó kivágósablonnal csíkokat hasítunk a bőrből (a bemetszések varratai között) a szakítószilárdság méréséhez. Mindegyik bemetszés egyik végéből mintát veszünk szövettani vizsgálathoz. A kimetszett bőrminták által elviselt maximális terhelést Zwick (Ulm, Németország) Universal Tensile Strenght Machine Model 144501 típusú szakítógépen mérjük. A méréseket hidraulikus befogópofák közé erősített és a szakadásig 10 mm/perc sebességgel nyújtott 30 mm χ 8 mm-es csíkokon végezzük, miközben a maximális terhelést egy diagramíró rögzíti. Minden sebből 3 mintát vizsgálunk, és minden kísérleti csoportban 4 állat van. Az elfertőződött vagy erős vérzés nyomait mutató sebeknél (ez az általunk vizsgált sebek 3%-át tette ki) szakítószilárdságot nem mérünk.

A mérési eredmények azt mutatják, hogy egy alkalmas pufferben oldott háromdimenziós térszerkezetű aktív dimer TGF-P3 egyszeri helyi alkalmazása a 21 napos gyógyulási időszak alatt a kontrollcsoporthoz viszonyítva kétszeresre növeli a szakítószilárdságot, és dózisfüggően meggyorsítja felnőtt patkányok teljes bőrmélységű sebeinek gyógyulását. A szövettani elemzés azt mutatja, hogy a TGF-p3-mal 21 napig kezelt sebekben a kontrolisebekhez képest jelentősen megnövekszik a monocelluláris sejtek beáramlása, a fibroblasztés kollagéntermelés. A TGF-p3-mal 21 napig kezelt sebeknél 14 nap után elszarusodás is jelentkezett.

9. példa: Szolubilizált monomer hibrid TGF-$ fehérjék és szolubilizált monomer BMP-2 előállítása

9.1. példa: Hibrid TGF-β ml pPLMu plazmidot Ncol-gyel és Sall-vel végzett emésztéssel kiegyenesítünk, és elvégezzük rajta a fentiekben a DNS-ffagmentumokra leírt géltisztítást. 100 ng linearizált és tisztított pPLMu DNS-vektort és a megfelelő, a szekvencialistán szereplő tisztított DNSfragmentumból, amely a hibrid TGF-31-3-at, TGFβ2-3-8ζ illetve TGF-p3-2-t kódolja, 3 mólekvivalensnyit 4 °C-on 15 órán át 20 1, 1 egység DNS-ligázt (Boehringer) tartalmazó ligációs pufferben (70 mM TRIS-sósav, 10 mM magnézium-klorid, 5 mM DTT és 0,1 mM adenozin-trifoszfát) inkubálunk.

A ligációs keverékből 10 μΐ-t hozzáadunk 200 μΐ hideg (4 °C-os), pcl_g57 plazmidot hordozó kompetens E. coli 137 sejthez. 30 perc múlva a sejteket 42 °C-os vízfürdőben 1,5 percen át végzett inkubálással hősokknak tesszük ki, majd a tenyészethez 2 ml ligációs puffért (LB) adunk, és 60 percig 30 °C-on rázzuk. Ezután 200 μΐ-es aliquot részeket ampicillint és kanamicint tartalmazó LB lemezekre oltunk, és ezeket 22 órán át 30 °C11

HU 222 830 Bl on inkubáljuk. Izolált telepeket tenyésztünk, és a plazmid DNS-t elemezzük. A TGF-pl-et, TGF-p2-t, illetve TGFββ-at kódoló DNS-fragmentumokat pPLMu-ban szubklónozzuk, így pPLMu.TGF-pl(44/45)b3, pPLMu.TGFP2(44/45)b3, illetve pPLMu.TGF-p3(44/45)b2 plazmidokat kapunk. A fenti szerkezeteket tartalmazó kiónokat E. coli 137/pPLMu.TGF-pi(44/45)b3-nak, E. coli 137/pPLMu.TGF-p2(44/45)b3-nak, illetve E. coli 137/pPLMu.TGF-p3(44/45)b2-nek nevezzük.

Az E. coli 137/pPLMu.TGF-pl(44/45)b3-at, E. coli 137/pPLMu.TGF-p2(44/45)b3-at s E. coli 137/pPLMu.TGF-P3(44/45)b2-t a 3A. példában leírt módon hővel indukáljuk, és az expresszált fehérjéket SDS-PAGE módszerrel elemezzük. A hőindukció után 2 óra múlva a TGF-βΙ, TGF-P2 és TGF-P3 mindegyike megjelenik hőindukciós fehérjeként, amelyek körülbelül 12 000 Da látszólagos molekulatömeggel vándorolnak.

Az E. coli 137/pPLMu.TGF-pi(44/45)b3-at, az E. coli 137/pPLMu.TGF-p2(44/45)b3-at és az E. coli 137/pPLMu.TGF-p3(44/45)b2-t 2 literes Erlenmeyerlombikokban, 40 mg/1 ampicillint és kanamicint tartalmazó 750 ml LB közegben 30 °C-on éjszakán át szaporítjuk. Az egyéjszakás tenyészetből 300 ml-t 2 literes Erlenmeyer-lombikokba töltünk, amelyek 750 ml LB közegben a fenti antibiotikumokat tartalmazzák, és 65 °C-os vízfürdőben körülbelül 3,5 percig rázva 42 °C-ra melegítjük. Ezután a lombikokat 42 °C-os rázógépbe tesszük, 3 órán át inkubáljuk, majd jégfürdővel 12 °C-ra hűtjük, és a sejteket GSA rotorban (Sorvall) 10 percig, 8000 fordulat/perc sebességgel végzett centrifugálással összegyűjtjük.

A szolubilizált monomer TGF-βΙ-β hibrid előállításának alábbi módszere a TGF-P2-3 és a TGF-P3-2 szolubilizálására is alkalmas.

E. coli 137/pPLMu.TGF-pi(44/45)b3 sejteket tenyésztünk a fenti módon, és zárványtesteket állítunk elő a következőképpen. A sejtek elroncsolását és a zárványtestek kinyerését 4 °C-on hajtjuk végre. Körülbelül 18 g nedves sejtet pH=8,3-es roncsolópufferben szuszpendálunk, amely 60 ml TRIS/sósavat, 10 mM EDTA-t és 1 mM fenil-metánszulfonil-kloridot (PMSF) tartalmaz. A sejteket egy Frenchpress (SLM Instruments, Inc.) készüléken a gyártó utasításai szerint kétszer áteresztjük, majd a térfogatot a roncsolópufferrel 200 ml-re kiegészítjük. A szuszpenziót 15 000 gvel 20 percig centrifugáljuk. A kapott üledéket 1 M nátrium-kloridot tartalmazó 100 ml roncsolópufferben szuszpendáljuk, és a fenti módon 10 percig centrifügáljuk. Ezután az üledéket 1% Triton Χ-100-at (Pierce) tartalmazó roncsolópufferben szuszpendáljuk, majd újabb 10 percig centrifügáljuk a fenti módon.

A mosott üledékből 0,3 g-ot 20 ml TRIS/sósavat, 1 mM EDTA-t, 1 mM PMSF-et és 1% DTT-t tartalmazó 10 ml pH=8,0-es oldatban szuszpendálunk, és a szuszpenziót mágneses keverővei 1 órán át szobahőmérsékleten keverjük. Ezután a minta pH-ját tömény ecetsavval 2,5-re állítjuk, a mintát teflonszitás őrlőgépben homogenizáljuk, és Centricon H-401 centrifugával (Kontron Instruments), egy rögzített szögű A.8.24. rotorral 60 percen át 15 °C-on, 12 000 fordulat/perc sebességgel centrifugáljuk. A szolubilizált monomer TGF-β hibridet tartalmazó tiszta felülúszó ecetsavtartalmát 10 mM sósavoldatra cseréljük oly módon, hogy az oldatot Amicon 8010 vegyes cellás YM05 szűrőn betöményítjük, 10 mM sósavoldattal meghígítjuk, és ezt a két műveletet többször megismételjük.

9.2. példa: BMP

A zárványtesteket, amelyek Wozney és munkatársai [Science 242: 1528-1534 (1988)] szerint a ΒΜΡ-2-nek (eredeti elnevezéssel: BMP-2A) a Q-AK-H-Q-R-K-R-L-K-S-S-C-K-R-H N-terminális szekvenciát hordozó érett formáit tartalmazzák, hagyományos eljárással, E. coliban, a T7 polimeráz expressziós rendszerrel állítjuk elő. Az expresszióhoz használt BMP-2 DNS a szekvencialistán 13-as szekvencia-azonosítószámon szerepel. A rekombináns BMP-2 az Nterminuson egy további metionint tartalmaz. Egy másik kísérletben a ΒΜΡ-2-k egy mutánsát (-Ql)BMP-2-t állítunk elő a fentivel azonos fehérjéből, azzal a különbséggel, hogy az első aminosavat eltávolítjuk (deléció), és az N-terminuson metionin nincs jelen.

ml BMP-2- vagy (-Ql)BMP-2-szuszpenziót 10%-os ecetsavoldattal pH=2,5-re megsavanyítunk, és Eppendorf centrifugával 10 percig szobahőmérsékleten centrifügáljuk. A felülúszót 2,6x78 cm-es Sephacryl S-100 oszlopon (Pharmacia) 10%-os ecetsavoldatban 1,4 ml/perc áramlási sebességgel kromatografáljuk. A monomer, denaturált ΒΜΡ-2-t tartalmazó frakciókat összegyűjtjük; ezt az anyagot használjuk a térszerkezet visszaállításához az alábbi kísérletekben.

10. példa: Kísérletsorozat a térszerkezet visszaállítására különböző TGF-fi-kkal, TGF-β hibridekkel és BMP-2-vel

A találmány sokoldalúságát és széles körű felhasználhatóságát az alábbi két kísérletsorozat eredményein keresztül mutatjuk be. A fehérjék térszerkezetének in vitro visszaállítására irányuló kísérletekben alkalmazott speciális körülményeket és fehérjetípusokat megadjuk. Az egyéb kísérleti körülmények megegyeznek a 4. példában megadottakkal.

A biológiai aktivitást a térszerkezet in vitro kialakításának megkezdése után 3 és 7 nap múlva mértük.

1. sorozat: A térszerkezet in vitro kialakítása dimetil-szulfoxid vagy dimetil-formamid szerves oldószerrel, CHAPS vagy CHAPSO jelenlétében - biológiai vizsgálati eredmények

Sorszám	CHAPS/CHAPSO	RSH	DMSO	DMF	PH	TGF-β	Aktivitás
1.	30 mM CHAPS	2,5 mM GSH	10%		8,0	β3	+
2.	30 mM CHAPS	2,5 mM GSH	10%		9,0	β3	+ +

HU 222 830 Bl

1. sorozat (folytatás)

Sorszám	CHAPS/CHAPSO	RSH	DMSO	DMF	pH	TGF-β	Aktivitás
3.	30 mM CHAPS	2,5 mM GSH	20%		8,0	β3	+ +
1 4·	30 mM CHAPS	2,5 mM GSH	30%		8,0	β3	+ +
5.	30 mM CHAPS	2,5 mM GSH	10%		9,5	β3	+ +
6.	30 mM CHAPS	2,5 mM GSH	20%		9,5	β3	+ +
7.	30 mM CHAPS	2,5 mM GSH	30%		9,5	β3	+ +
8.	30 mM CHAPS	2,5 mM GSH	40%		9,5	β3	+ +
1 9·	30 mM CHAPS	2,5 mM GSH	50%		9,5	β3	+
10.	30 mM CHAPS	10 mM GSH	10%		8,0	β3	+
11.	30 mM CHAPS	1,0 mM GSH	20%		9,5	β3	+ +
!2.	30 mM CHAPS	5,0 mM GSH	20%		9,5	β3	+ +
13.	30 mM CHAPS	10 mM GSH	20%		9,5	β3	+ +
14.	30 mM CHAPS	20 mM GSH	20%		9,5	β3	+
15.	30 mM CHAPS	50 mM GSH	20%		9,5	β3	+
16.	30 mM CHAPS	2,5 mM C	20%		9,5	β3	+ +
17.	30 mM CHAPS	2,5 mM CA	20%		9,5	β3	+ +
18.	30 mM CHAPS	2,5 mM β-ΜΕ	20%		9,5	β3	+
1 19·	30 mM CHAPS	2,5 mM GSH		10%	6,5	β3	+
20.	30 mM CHAPS	2,5 mM GSH		10%	7,5	β3	+
1 21·	30 mM CHAPS	2,5 mM GSH		10%	8,5	β3	+ +
1 22.	30 mM CHAPS	2,5 mM GSH		10%	9,5	β3	+ +
1 23.	30 mM CHAPS	2,5 mM GSH		20%	9,5	β3	+ +
1 24·	30 mM CHAPS	2,5 mM GSH		30%	9,5	β3	+ +
25.	30 mM CHAPS	2,5 mM GSH		40%	9,5	β3	+
26.	30 mM CHAPS	2,5 mM GSH		10%	10,5	β3	+
27.	30 mM CHAPS	0,0 mM GSH		10%	8,5	β3	+ +
28.	30 mM CHAPS	2,5 mM GSH		10%	8,5	β2	+ +
29.	30 mM CHAPS	2,5 mM GSH		10%	8,5	β1-3	+ +
30.	30 mM CHAPS	2,5 mM GSH		10%	8,5	β3-2	+ +
31.	30 mM CHAPS	2,5 mM GSH		10%	8,5	β2—3	+ +
32.	30 mM CHAPSO	2,5 mM GSH	20%		9,5	β3	+ +
33.	30 mM CHAPSO	2,5 mM GSH	20%		9,5	β2	+ +
34.	30 mM CHAPSO	2,5 mM GSH	20%		9,5	βΐ—3	+ +
35.	30 mM CHAPSO	2,5 mM GSH	20%		9,5	β3—2	+ +
36.	30 mM CHAPSO	2,5 mM GSH	20%		9,5	β2—3	+ +

C=ciszteri

CA=ciszteamin

RSH=a táblázatban megadott szulfhidrilreagens

GSH=redukált glutation β-Me=β-merkapto-etanol

DMF=dimetil-formamid

DMSO=dimetil-sznlfoxid β3=ΤΰΡ-β3; 02=TGF-p2;

β1-3=ΤΰΡ-β1-3 hibrid; p3-2=TGF-03-2 hibrid; p2-3=TGF-02-3 hibrid aktivitás: +=közepes aktivitás a 7. példa szerinti biológiai vizsgálatban + + =nagy aktivitás a 7. példa szerinti biológiai vizsgálatban

HU 222 830 Bl

2. sorozat: Térszerkezet in vitro kialakítása: TGF-$3 dimetil-szulfonban CHAPSjelenlétében, valamint BMP-2 és (-Ql)BMP-2 dimetil-szulfoxidban CHAPS jelenlétében

Sorszám	CHAPS	GSH	DMSO	DMSO2	PH	Protein	Aktivitás
1.	30 mM	2,5 mM GSH	20%		9,2	BMP-2	+
2·	30 mM	2,5 mM GSH	20%		7,5	(-Qi)BMP-2	+
3.	30 mM	2,5 mM GSH	20%		8,0	(-Q,)BMP-2	+
4.	30 mM	2,5 mM GSH	20%		8,5	(-Q,)BMP-2	+
5.	30 mM	2,5 mM GSH	20%		9,0	(-Q,)BMP-2	+
6.	30 mM	2,5 mM GSH	20%		9,5	BMP-2	+
7.	30 mM	2,5 mM GSH	20%		9,5	(-Q0BMP-2	+
1 8·	30 mM	0,0 mM GSH		10%	9,5	β3	+
1 9·	30 mM	2,5 mM GSH		10%	9,5	β3	+

GSH=redukált glutation

DMSO=dimetil-szulfoxid

DMSO₂=dimetil-szulfon

BMP-2=BMP-2 egy további N-terminális metioninnal (-Ql)BMP 2=BMP-2 az N-terminális glutamin nélkül

P3=TGF-P3;

aktivitás: + =a TGF-P3 közepes aktivitása a 7. példa szerinti biológiai vizsgálatban vagy háromdimenziós térszerkezetű BMP-2, illetve (-Ql)BMP-2 képződése a Takuwa Y. és munkatársai [Biochemical and Biophysical Research Communication Vol. 174,96-101, „Boné Morphogenetic Protein-2 stimulates alkaline phosphatase activity and collagen synthesis in cultured osteoblastoc cells, MC3T3-E1” (1991)] által leírt in vitro biológiai vizsgálattal, vagy kromatográfiával és elektroforézissel meghatározva.

A leírás 6. oldalán a technika állásának ismertetésénél ismertetett EP 0433225 számú szabadalmi leírás eljárása és a találmány szerinti eljárás összehasonlítására, az alábbiakban ismertetettek szerint eljárva a következő foldingeljárást hajtottuk végre TGF-P2 és TGF-03 esetében, az eredmények az alábbi táblázatokban láthatók.

Monomer TGF-P2-t és monomer TGF-p3-at állítottunk elő és vidramenyét (Mustela vison)-tüdő epithelialis sejt (Mv-l-Lu) sav-foszfatáz-mérés segítségével vizsgáltuk a foldingkísérletekből kapott anyag biológiai aktivitását, valamint vizsgáltuk az 1. táblázatban felsorolt mintákon a sejtmigrációt és -szaporodást, összehasonlítva az EP 0433225 irodalom szerinti eredményekkel.

Monomer TGF-P2 és monomer TGF-p-3 esetében foldingeljárást hajtottunk végre 4 °C hőmérsékleten egy pufferben, amely 0,1 M Tris-t és adott esetben szulfhidrilreagens (RSH), CHAPS vagy CHAPSO, vagy vízzel elegyedő oldószer (WMS) mellett 1 M nátrium-kloridot tartalmazott, az alábbi táblázatokban látható módon. A puffer pH-ját a táblázatokban látható értékekre állítottuk be. A TGF-β végső koncentrációja 0,1 mg/ml volt. 4 °C hőmérsékleten különböző időintervallumok után az oldatokat koncentrált ecetsavval pH=3,5 értékre megsavanyítjuk, és ultraszűréssel kb. tízszer koncentráljuk (YM10 membrán, Amicon). A koncentrált oldatokat 0,1 M ecetsavval eredeti térfogatra hígítottuk és újra koncentráltuk. Ezt a műveletet kétszer ismételtük. Ezt követően az oldatokat ioncserés kromatográfiával kezeltük. Az oldatok aliquot részét egy in vitro biológiai vizsgálattal mérve, meghatároztuk a biológiai aktivitást, valamint egy Mono S HR5/5 oszlopon (Pharmacia) ioncserés kromatográfiát hajtottunk végre, a karakterisztikus retenciós időnél eluált dimer

TGF-β kromatográfiás azonosítása céljából. Az oszlopot 1 ml/perc áramlási sebességgel 20 mM-os nátrium30 acetát, 30%-os izopropil-alkohol, pH=4 (A puffer) alkalmazásával egyenlítettük ki, és lineáris gradienselúcióval 20 percen át eluáltuk, az A pufferrel kezdve, és az A pufferben 0,5 M-os nátrium-klorid-oldattal végezve az eluálást.

Számos foldingkísérletet hajtottunk végre, a foldingpufferben számos vízzel elegyedő oldószert alkalmazva, CHAPS vagy CHAPSO és egy szulfhidrilreagens nélkül. Az eredmények az 1. táblázatban láthatók.

1. táblázat

WMS	TGF-β	Aktivitás
10% izopropil-alkohol	β3	-
15% izopropil-alkohol	β3	-
0,1 M glicerin	β2	-
0,5 M glicerin	β2	-
10% glicerin + 10% izopropilalkohol	β2	-
10% etilénglikol	β3	-
15% etilénglikol	β3	-
10% acetonitril	β2	-
20% acetonitril	β2	-
30% acetonitril	β2	-
40% acetonitril	β2	-
0,3% polietilénglikol 4000 (PEG 4000)	β2	-

HU 222 830 Bl

1. táblázat (folytatás)

1	TGF-β	Aktivitás
10% hexametil-foszfonsavtriamid (HMPT)	β3	-
20% 10% hexametil-foszfonsav-triamid	β3	-
| 10% dimetil-szulfon (DMSO2)	β3	-

- egyik minta sem mutatott aktivitást a biológiai vizsgálatban, vagy Mono S oszlopon kationcserélő kromatográfiával nézve nem mutatkozott korrekt módon foldingolt dimer TGF-β fehétje jelenléte.

A foldingpufferben DMSO-t és DMF-et CHAPS vagy CHAPSO, és adott esetben szulfhidrilreagens jelenlétében végrehajtott kezdeti sikeres kísérletek után végrehajtottunk egy nagyobb foldingkísérlet-sorozatot, amelyek mindegyike aktív TGF-β fehérjéket eredményezett. A kapott eredmények a 2. táblázatban láthatók.

2. táblázat

Szám	CHAPS/CHAPSO	RSH	DMSO	DMF	dmso2	pH	TGF-β	Aktivitás
1 h	30 mM CHAPS	2,5 mM GSH	10%			8,0	β3	+
I 2·	30 mM CHAPS	2,5 mM GSH	10%			9,0	β3	+ +
I 3-	30 mM CHAPS	2,5 mM GSH	20%			8,0	β3	+ +
I 4·	30 mM CHAPS	2,5 mM GSH	30%			8,0	β3	+ +
1 5	30 mM CHAPS	2,5 mM GSH	10%			9,5	β3	+ +
I 6-	30 mM CHAPS	2,5 mM GSH	20%			9,5	β3	+ +
I 7·	30 mM CHAPS	2,5 mM GSH	30%			9,5	β3	+ +
I 8·	30 mM CHAPS	2,5 mM GSH	40%			9,5	β3	+ +
9.	30 mM CHAPS	2,5 mM GSH	50%			9,5	β3	+
10.	30 mM CHAPS	10 mM GSH	10%			8,0	β3	+
11.	30 mM CHAPS	1,1 mMGSH	20%			9,5	β3	+ +
12.	30 mM CHAPS	5,0 mM GSH	20%			9,5	β3	+ +
13.	30 mM CHAPS	10 mM GSH	20%			9,5	β3	+ +
14.	30 mM CHAPS	20 mM GSH	20%			9,5	β3	+
15.	30 mM CHAPS	50 mM GSH	20%			9,5	β3	+
16.	30 mM CHAPS	2,5 mM cisztein	2%			9,5	β3	+ +
17.	30 mM CHAPS	2,5 mM cisztamin	2%			9,5	β3	+ +
19.	30 mM CHAPS	2,5 mM GSH		10%		6,5	β3	+
20.	30 mM CHAPS	2,5 mM GSH		10%		7,5	β3	+
21.	30 mM CHAPS	2,5 mM GSH		10%		8,5	β3	+ +
22.	30 mM CHAPS	2,5 mM GSH		10%		9,5	β3	+ +
23.	30 mM CHAPS	2,5 mM GSH		20%		9,5	β3	+ +
24.	30 mM CHAPS	2,5 mM GSH		30%		9,5	β3	+ +
25.	30 mM CHAPS	2,5 mM GSH		40%		9,5	β3	+
26.	30 mM CHAPS	2,5 mM GSH		10%		10,5	β3	+
27.	30 mM CHAPS	0,1 mM GSH		10%		8,5	β3	+ +
28.	30 mM CHAPS	2,5 mM GSH		10%		8,5	β2	+ +
29.	30 mM CHAPSO	2,5 mM GSH	20%			9,5	β3	+ +
3°.	30 mM CHAPSO	2,5 mM GSH	20%			9,5	β2	+ +

I

HU 222 830 Β1

2. táblázat (folytatás)

1 Szám	CHAPS/CHAPSO	RSH	DMSO	DMF	DMSO2	PH	TGF-P	Aktivitás
31·	30 mM CHAPS	0,0 mM GSH			10%	9,5	β3	+
1 32·	30 mM CHAPS	2,5 mM GSH			10%	9,5	P3	+

RSH: szulfhidrilreagens a táblázat szerint

GSH: csökkentett galation β-Me: β-merkapto-etanol

DMF: dimetil-formamid

DMSO: dimetil-szulfoxid

DMSO₂: dimetil-szulfon

P3:TGF-P3;P2:TGF-P2 aktivitás: +: közepes aktivitás a fentiek szerinti in vitro biológiai vizsgálatban + +: nagy aktivitás a fentiek szerinti in vitro biológiai vizsgálatban

Egy következő kísérletben DMSO-t vagy DMF-et ferrel hajtottuk végre az eljárást, amely minden esetben szulfhidril jelenlétében, vagy egy esetben anélkül, de 20 aktív TGF-β-ί eredményezett. A kapott eredmények a CHAPS-t vagy CHAPSO-t nem tartalmazó foldingpuf- 3. táblázatban láthatók.

3. táblázat

| Szám	RSH	DMSO	DMF	PH	TGF-β	Aktivitás
1.	2,5 mM GSH	10%		9,5	β3
I 2·	2,5 mM GSH	20%		9,5	β3	+
1 3·	2,5 mM GSH	30%		8,0	β3	+
I 4·	2,5 mM GSH	30%		9,5	β3	+ +
I 5-	2,5 mM GSH	40%		9,5	β3	+ +
1 6-	2,5 mM GSH	50%		9,5	β3	+ +
1 7-	2,5 mM GSH	40%		6,5	β3	+
1 8.	2,5 mM GSH	40%		7,5	β3	+
1 9·	2,5 mM GSH	40%		8,5	β3	+
10.	2,5 mM GSH	40%		10,5	β3	+ +
11.		40%		9,5	β3	+
12.	2,5 mM GSH	40%		9,5	β2	+
13.	2,5 mM GSH		10%	9,5	β3	+
14.	2,5 mM GSH		20%	9,5	β3	+ +
15.	2,5 mM GSH		30%	9,5	β3	+ +
16.	2,5 mM GSH		40%	9,5	β3	+
17.	2,5 mM cisztein		40%	9,5	β3	+
18.	2,5 mM cisztamin		40%	9,5	β3	+

RSH: szulfhidrilreagens a táblázat szerint

GSH: csökkentett glutation

DMSO: dimetil-szulfoxid

DMF: dimetil-formamid p3: TGF-P3

P2: TGF-P2 aktivitás: +: közepes aktivitás a fenti in vitro biológiai vizsgálatban + +: nagy aktivitás a fenti in vitro biológiai vizsgálatban

HU 222 830 Bl

Egy további vizsgálatban a következő anyagokat tartalmazó foldingpuffereket használtunk: A) 30 mM CHAPS, B) 30% DMSO és C) 30 mM CHAPS+30% DMSO+egyéb, az alábbiakban látható adalék anyagok.

A foldingeljárást lényegében a fentiek szerint hajtottuk végre, azzal a kivétellel, hogy itt a folding alatt a hőmérséklet 25 °C volt. Az eredmények, valamint a kísérlet egyéb paraméterei az alábbi 4. táblázatban láthatók.

4. táblázat

Kísérlet száma	Pufferadalék	Aktivitás (U/pgl)	Aktivitás (U/pgl)	Aktivitás (U/pgl)
(A)	30 mM CHAPS	0 (50 óra)	270 (144 óra)	180 (310 óra)
(B)	30% DMSO	1400 (65 óra)	4900 (165 óra)	3500 (235 óra)
(C)	30 mM CHAPS	4600 (65 óra)	7800 (165 óra)	9300 (235 óra)
	30% DMSO

puffer: 100 mM TRIS, 1 M nátrium-klorid, 0,5 arginin, 2,5 mM GSH (csökkentett glutation), pH=8,0, a táblázatban felsorolt megfelelő adalékokat tartalmazva aktivitás: az EP 0433225 referenciában ismertetettek szerint meghatározva, ahol az aktivitás meghatározásának időpontjai a zárójelben találhatók Hőmérséklet: 25 °C

Fehérje: humán TGF-P3 (monomer, redukált és denaturált)

Az eredményekből levonható következtetések A fenti eredmények világosan mutatják, hogy egy enyhe reagens és DMSO, DMSO₂ és DMF közül választott szerves oldószer kombinációját tartalmazó föl- 25 dingpuffer alkalmazása meglepő módon különösen előnyös kitermeléssel eredményezte aktív foldingolt TGFβ fehérjék, különösen TGF^3 fehérje létrejöttét. Amint a 4. táblázat eredményei mutatják, 30 mM CHAPS alkalmazása oldószer nélkül viszonylag ala- 30 csony kitermeléssel eredményezte az aktív TGF^3 fehérje keletkezését. Emellett az is látható az 1. és 3. táblázatokból, hogy a számos tesztelt oldószer között csak a DMSO és DMF eredményezett valamennyi aktív foldingolt terméket detergens jelenléte nélkül. Továbbá, ahogyan a 2. és 4. táblázatok eredményei mutatják, a gyenge detergens, így CHAPS vagy CHAPSO DMSO-val, DMSO₂-nal vagy DMF-fel való kombinációja meglepően kiváló kitermeléssel eredményezi aktív foldingolt TGF-β fehérje keletkezését.

A mikroorganizmusok deponálása

Az alábbi mikroorganizmusokat deponáltuk a

Deutsche Sammlung von Mikroorganismennél (DSM), Mascheroder Weg lb, D-3300 Braunschweig (NSZK):

1 mikroorganizmus	deponálás dátuma	azonosító szám
E. coli 137/pPLMu.hTGF-pi	1989. november 28.	DSM 5656
| E. coli 137/pPLMu.hTGF-p2	1989. november 28.	DSM 5657
E. coli 137/pPLMu.hTGF-p3	1989. november 28.	DSM 5658
1 Saccharomyces cerevisiae GRF18	1986. március 4.	DSM 3665

SZEKVENCIALISTA (1) Általános információ:

(i) Bejelentő:

(A) Név: Ciba-GeigyAG (B) Utca: Klybeckstr. 141 (C) Város: Bázel (E) Ország: Svájc (F) Irányítószám: (ZIP), 4002 (G) Telefonszám: +41 61 69 11 11 (H) Telefaxszám: +41 61 696 79 76 (I) Telexszám: 962 991 (ii) A találmány címe: Új eljárás biológiailag aktív dimer proteinek előállítására (iii) Szekvenciák száma: 14 (iv) Komputerrel olvasható forma :

(A) Eszköz típusa: Floppy disk (B) Komputer: IBM PC kompatibilis

HU 222 830 Bl (C) Operációs rendszer: PC-DOS/MS-DOS (D) Szoftver: Patentln Release#10, Version #1.30 (EPO) (2) Információ az 1. azonosító számú szekvenciához (i) Szekvenciajellemzők:

(A) Hosszú szál: 339 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Lánctípus: kétfonalas (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: cDNS mRNS-hez (iii) Feltételezett: nincs (vii) Közvetlen forrás:

(B) Klón: E. coli LC137/pPLMu.hTGF-betal (DMS 5656) (ix) Jellemzők:

(A) Név/kulcsszó: CDS (B) Elhelyezkedés: 1...336 (D) Más információ: termék=„humán TFG-betal” (xi) Szekvencialeírás: 1. azonosító számú szekvencia:

GCC CTG GAC ACC AAC

TAT Tyr

TGC Cy s

TTC AGC TCC ACG GAG AAG

AAC Asn

TGC Cy s 15

TGC Cy s

48

Al a 1

Leu

Asp Thr

Asn 5

Phe

Ser

Ser 10

Thr

Glu

Lys

GTG

CGG

CAG

CTG

TAC

ATT

GAC

TTC

CGC

AAG

GAC

CTC

GGC

TGG

AAG

TGG

96

Val

Arg

Gin

Leu

Tyr

Ile

Asp

Phe

Arg

Ly s

Asp

Leu

Gly

Trp

Ly s

Trp

20

25

30

ATC

CAC

GAG

CCC

AAG

GGC

TAC

CAT

GCC

AAC

TTC

TGC

CTC

GGG

CCC

TGC

144

Ile

Hi s

Glu

Pro

Ly s

Gly

Tyr

Hi s

Al a

Asn

Phe

Cy s

Leu

Gly

Pro

Cy s

35

40

45

CCC

TAC

ATT

TGG

AGC

CTG

GAC

ACG

CAG

TAC

AGC

AAG

GTC

CTG

GCC

CTG

192

Pro

Tyr

Ile

Trp

Ser

Leu

As p

Thr

Gin

Tyr

Ser

Lys

Val

Leu

Al a

Leu

50

55

60

TAC

AAC

CAG

CAT

AAC

CCG

GGC

GCC

TCG

GCG

GCG

CCG

TGC

TGC

GTG

CCG

240

Tyr

Asn

Gin

Hi s

Asn

Pro

Gly

Al a

Ser

Al a

Al a

Pro

Cy s

Cy s

Val

Pro

65

70

75

80

CAG

GCG

CTG

GAG

CCG

CTG

CCC

ATC

GTG

TAC

TAC

GTG

GGC

CGC

AAG

CCC

288

Gin

Al a

Leu

Glu

Pro

Leu

Pro

Ile

Val

Tyr

Tyr

Val

Gly

Arg

Lys

Pro

85

90

95

AAG

GTG

GAG

CAG

CTG

TCC

AAC

ATG

ATC

GTG

CGC

TCC

TGC

AAG

TGC

AGC

336

Lys

Va 1

Glu

Gin

Leu

Ser

Asn

Me t

Ile

Val

Arg

Ser

Cy s

Ly s

Cy s

Ser

100

105

110

TGA 339 (2) Információ a 2. azonosító számú szekvenciához:

(i) Szekvenciajellemzők:

(A) Hosszúság: 112 aminosav (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: protein (xi) Szekvencialeírás: 2. azonosító számú szekvencia

Al a 1

Leu

Asp

Thr

Asn Tyr 5

Cy s

Phe

Ser

Ser 10

Thr

Glu

Lys

As n

Cy s 15

Cy s

Val

Arg

Gin

Leu

Tyr

Ile

Asp

Phe

Arg

Lys

As p

Leu

Gly

Trp

Ly s

Trp

20

25

30

HU 222 830 Bl

Ile

Hi s

Glu 35

Pro

Ly s

Gly

Tyr

Hi s 40

Al a

Asn

Phe

Cy s

Leu 45

Gly

Pro

Cy s

Pro

Tyr 50

Ile

Trp

Ser

Leu

Asp 55

Thr

Gin

Tyr

Ser

Ly s 60

Val

Leu

Al a

Leu

Tyr 65

As n

Gin

Hi s

Asn

Pro 70

Gly

Al a

Ser

Al a

Al a 75

Pro

Cy s

Cy s

Va 1

Pro 80

Gin

Al a

Leu

Glu

Pro 85

Leu

Pro

Ile

Val

Tyr 90

Tyr

Val

Gly

Arg

Lys 95

Pro

Lys

Val

Glu

Gin 100

Leu

Ser

Asn

Me t

Ile 105

Val

Arg

Ser

Cy s

Ly s 110

Cy s

Ser

(2) Információ a 3. azonosító számú szekvenciához:

(i) Szekvenciajellemzők:

(A) Hosszúság: 339 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Lánctípus: kétfonalas (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: cDNS mRNS-hez (vii) Közvetlen forrás:

(B) Klón: E. coli LC137/pPLMu.hTGF-pi (DSM5657) (ix) Jellemzők:

(A) Név/kulcsszó: CDS (B) Elhelyezkedés: 1...336 (D) Más információ: termék=„humán TGF-P2” (xi): Szekvencialeírás: 3. azonosító számú szekvencia

GCT

TTG

GAT

GCG

GCC

TAT

TGC

TTT

AGA

AAT

GTG

CAG

GAT

AAT

TGC

TGC

Al a

Leu

Asp 115

Al a

Al a

Tyr

Cy s

Phe 120

Arg

Asn

Val

Gin

Asp 125

As n

Cy s

Cy s

CTA

CGT

CCA

CTT

TAC

ATT

GAT

TTC

AAG

AGG

GAT

CTA

GGG

TGG

AAA

TGG

Leu

Arg 130

Pro

Leu

Tyr

Ile

Asp 135

Phe

Lys

Arg

As p

Leu 140

Gly

Trp

Lys

Trp

ATA

CAC

GAA

CCC

AAA

GGG

TAC

AAT

GCC

AAC

TTC

TGT

GCT

GGA

GCA

TGC

Ile 145

Hi s

Glu

Pro

Ly s

Gly 150

Tyr

Asn

Al a

Asn

Phe 155

Cy s

Al a

Gly

Al a

Cy s 160

CCG

TAT

TTA

TGG

AGT

TCA

GAC

ACT

CAG

CAC

AGC

AGG

GTC

CTG

AGC

TTA

Pro

Tyr

Leu

Trp

Ser 165

Ser

Asp

Thr

Gin

Hi s 170

Ser

Arg

Va 1

Leu

Ser 175

Leu

TAT

AAT

ACC

ATA

AAT

CCA

GAA

GCA

TCT

GCT

TCT

CCT

TGC

TGC

GTG

TCC

Tyr

Asn

Thr

Ile 180

Asn

Pro

Glu

Al a

Ser 185

Al a

Ser

Pro

Cy s

Cy s 190

Val

Ser

CAA

GAT

TTA

GAA

CCT

CTA

ACC

ATT

CTC

TAC

TAC

ATT

GGC

AAA

ACA

CCC

Gin

Asp

Leu 195

Glu

Pro

Leu

Thr

Ile 200

Leu

Tyr

Tyr

Ile

Gly 205

Ly s

Thr

Pro

AAG

ATT

GAA

CAG

CTT

TCT

AAT

ATG

ATT

GTA

AAG

TCT

TGC

AAA

TGC

AGC

Ly s

Ile 210

Glu

Gin

Leu

Ser

Asn 215

Me t

Ile

Val

Lys

Ser 220

Cy s

Ly s

Cy s

Ser

TAA

144

192

240

288

336

339

HU 222 830 Β1 (2) Információ a 4. azonosító számú szekvenciához:

(i) Szekvenciajellemzők:

(A) Hosszúság: 112 aminosav (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: protein (xi) Szekvencialeírás: 4. azonosító számú szekvencia

Al a 1

Leu Asp Alá

Al a 5

Tyr

Cy s

Phe Arg Asn 10

Val

Gin

Asp

Asn

Cys 15

Cy s

Leu

Arg

Pro

Leu

Tyr

Ile

As p

Phe

Ly s

Arg

Asp

Leu

Gly

Trp

Ly s

Trp

20

25

30

Ile

Hi s

Glu

Pro

Ly s

Gly

Tyr

Asn

Al a

Asn

Phe

Cy s

Al a

Gly

Alá

Cys

35

40

45

Pro

Tyr

Leu

Trp

Ser

Ser

Asp

Thr

Gin

Hi s

Ser

Arg

Val

Leu

Ser

Leu

50

55

60

Tyr

Asn

Thr

Ile

Asn

Pro

Glu

Al a

Ser

Al a

Ser

Pro

Cys

Cys

Val

Ser

65

70

75

80

Gin

Asp

Leu

Glu

Pro

Leu

Thr

Ile

Leu

Tyr

Tyr

Ile

Gly

Ly s

Thr

Pro

85

90

95

Lys

Ile

Glu

Gin

Leu

Ser

Asn

Me t

Ile

Va 1

Ly s

Ser

Cys

Ly s

Cys

Ser

100 105 110 (2) Információ az 5. azonosító számú szekvenciához:

(i) Szekvenciajellemzők:

(A) Hosszúság: 339 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Lánctípus: kétfonalas (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: cDNSmRNS-hez (vii) Közvetlen forrás:

(B) Klón: E. coli LC137/pPLMu.hTGF-p3 (DSM 5658) (xi) Jellemzők:

(A) Név/kulcsszó: CDS (B) Elhelyezkedés: 1...336 (D) Más információ: termék=„humán TGF-p3” (xi) Szekvencialeírás: 5. azonosító számú szekvencia

GCT TTG GAC ACC AAT TAC TGC TTC CGC AAC TTG GAG GAG AAC TGC TGT Alá Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Arg Asn Leu Glu Glu Asn Cys Cys

115 120 125

GTG CGC CCC CTC TAC ATT GAC TTC CGA CAG GAT CTG GGC TGG AAG TGG

Val Arg Pro Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Gin Asp Leu Gly Trp Lys Trp

130 135 140

GTC CAT GAA CCT AAG GGC TAC TAT GCC AAC TTC TGC TCA GGC CCT TGC

Val His Glu Pro Lys Gly Tyr Tyr Alá Asn Phe Cys Ser Gly Pro Cys

145 150 155 160

CCA TAC CTC CGC AGT GCA GAC ACA ACC CAC AGC ACG GTG CTG GGA CTG

Pro Tyr Leu Arg Ser Alá Asp Thr Thr His Ser Thr Val Leu Gly Leu

165 170 175

144

192

HU 222 830 Β1

TAC

AAC

ACT

CTG

AAC

CCT

GAA

GCA

TCT

GCC

TCG

CCT

TGC

TGC

GTG

CCC

Tyr

Asn

Thr

Leu 180

Asn

Pro

Glu

Al a

Ser 185

Al a

Ser

Pro

Cys

Cys 190

Val

Pro

CAG

GAC

CTG

GAG

CCC

CTG

ACC

ATC

CTG

TAC

TAT

GTT

GGG

AGG

ACC

CCC

Gin

As p

Leu 195

Glu

Pro

Leu

Thr

Ile 200

Leu

Tyr

Tyr

Val

Gly 205

Arg

Thr

Pro

AAA

GTG

GAG

CAG

CTC

TCC

AAC

ATG

GTG

GTG

AAG

TCT

TGT

AAA

TGT

AGC

Lys

Va 1

Glu

Gin

Leu

Ser

Asn

Me t

Va 1

Val

Ly s

Ser

Cys

Lys

Cys

Ser

210 215 220

240

288

336

TGA (2) Információ a 6. azonosító számú szekvenciához: (i) Szekvenciajellemzők:

(A) Hosszúság: 112 aminosav

339

(B) Típus: aminosav

(D) Topológia: lineáris

(ii) Molekulatípus: protein

(xi) Szekvencialeírás:

6. azonosító számú szekvencia

Alá Leu

As p

Thr

As n

Tyr

Cys

Phe

Arg

Asn

Leu

Glu

Glu

Asn

Cys

Cys

1

5

10

15

Val Arg

Pro

Leu

Tyr

Ile

As p

Phe

Arg

Gin

Asp

Leu

Gly

Trp

Lys

Trp

20

25

30

Val His

Glu

Pro

Ly s

Gly

Tyr

Tyr

Al a

Asn

Phe

Cy s

Ser

Gly

Pro

Cys

35

40

45

Pro Tyr

Leu

Arg

Ser

Al a

Asp

Thr

Thr

Hi s

Ser

Thr

Val

Leu

Gly

Leu

50

55

60

Tyr Asn

Thr

Leu

Asn

Pro

Glu

Al a

Ser

Al a

Ser

Pro

Cys

Cys

Val

Pro

65

70

75

80

Gin Asp

Leu

Glu

Pro

Leu

Thr

Ile

Leu

Tyr

Tyr

Val

Gly

Arg

Thr

Pro

85

90

95

Lys Val

Glu

Gin

Leu

Ser

Asn

Me t

Val

Val

Ly s

Ser

Cys

Ly s

Cys

Ser

100

105

110

(2) Információ a 7. azonosító számú szekvenciához (i) Szekvenciajellemzők:

(A) Hosszúság: 336 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Lánctípus: kétfonalas (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: más nukleinsav (A) Leírás: desc=„TGF-fi és TGF-P3 DNS rekombináns hibrid DNS-e” (vii) Közvetlen fonás:

(B) Klón: E. coli LC137/pPLMu.TGF-P(44/45)P3 (ix) Jellemzők:

(A) Név/kulcsszó:mat_peptid (B) Elhelyezkedés: 1...132 (D) Más információ: termék=„humán TGF-β 44 N-terminális aminosava” (ix) Jellemzők:

(A) Név/kulcsszó: mat_peptide (B) Elhelyezkedés: 133.. .336 (D) Más információ: termék=„humán TGF-fi3 68 C-terminális aminosava”

HU 222 830 Bl (ix) Jellemzők (A) Név/kulcsszó: CDS (B) Elhelyezkedés: 1... 336 (D) Más információ: termék=„hibrid TGF-β, amit TGF^3-nak nevezünk.” (xi) Szekvencialeírás: 7. azonosító számú szekvencia:

GCC Al a 1

CTG GAC

ACC AAC TAT

TGC TTC AGC TCC ACG GAG AAG AAC TGC TGC

48

Leu

Asp

Thr

As n 5

Tyr

Cy s

Phe

Ser

Ser 10

Thr

Glu

Lys

Asn Cys 15

Cys

GTG

CGG

CAG

CTG

TAC

ATT

GAC

TTC

CGC

AAG

GAC

CTC

GGC

TGG

AAG

TGG

96

Val

Arg

Gin

Leu

Tyr

Ile

Asp

Phe

Arg

Lys

As p

Leu

Gly

Trp

Lys

Trp

20

25

30

ATC

CAC

GAG

CCC

AAG

GGC

TAC

CAT

GCC

AAC

TTC

TGC

TCA

GGC

CCT

TGC

144

Ile

Hi s

Glu

Pro

Lys

Gly

Tyr

Hi s

Al a

Asn

Phe

Cy s

Ser

Gly

Pro

Cys

35

40

45

CCA

TAC

CTC

CGC

AGT

GCA

GAC

ACA

ACC

CAC

AGC

ACG

GTG

CTG

GGA

CTG

192

Pro

Tyr

Leu

Arg

Ser

Al a

Asp

Thr

Thr

Hi s

Ser

Thr

Val

Leu

Gly

Leu

50

55

60

TAC

AAC

ACT

CTG

AAC

CCT

GAA

GCA

TCT

GCC

TCG

CCT

TGC

TGC

GTG

CCC

240

Tyr

Asn

Thr

Leu

Asn

Pro

Glu

Al a

Ser

Alá

Ser

Pro

Cy s

Cy s

Val

Pro

65

70

75

80

CAG

GAC

CTG

GAG

CCC

CTG

ACC

ATC

CTG

TAC

TAT

GTT

GGG

AGG

ACC

CCC

288

Gin

Asp

Leu

Glu

Pro

Leu

Thr

Ile

Leu

Tyr

Tyr

Val

Gly

Arg

Thr

Pro

85

90

95

AAA

GTG

GAG

CAG

CTC

TCC

AAC

ATG

GTG

GTG

AAG

TCT

TGT

AAA

TGT

AGC

336

Lys

Va 1

Glu

Gin

Leu

Ser

Asn

Me t

Val

Val

Ly s

Ser

Cy s

Ly s

Cys

Ser

100 105 110 (2) Információ a 8. azonosító számú szekvenciához:

(i) Szekvenciajellemzők:

(A) Hosszúság: 112 aminosav (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: protein (x) Szekvencialeírás: 8. azonosító számú szekvencia

Al a 1

Leu

Asp

Thr

Asn 5

Tyr

Cys

Phe

Ser

Ser 10

Thr

Glu

Lys

Asn

Cys 15

Cys

Val

Arg

Gin

Leu 20

Tyr

Ile

Asp

Phe

Arg 25

Lys

As p

Leu

Gly

Trp 30

Lys

Trp

Ile

Hi s

Glu 35

Pro

Lys

Gly

Tyr

Hi s 40

Al a

Asn

Phe

Cys

Ser 45

Gly

Pro

Cys

Pro

Tyr 50

Leu

Arg

Ser

Al a

Asp 55

Thr

Thr

Hi s

Ser

Thr 60

Val

Leu

Gly

Leu

Tyr 65

Asn

Thr

Leu

Asn

Pro 70

Glu

Alá

Ser

Al a

Ser 75

Pro

Cys

Cys

Val

Pro 80

Gin

Asp

Leu

Glu

Pro 85

Leu

Thr

Ile

Leu

Tyr 90

Tyr

Va 1

Gly

Arg

Thr 95

Pro

Ly s

Val

Glu

Gin 100

Leu

Ser

Asn

Me t

Val 105

Va 1

Ly s

Ser

Cy s

Lys 110

Cy s

Ser

HU 222 830 Bl (2) Információ a 9. azonosító számú szekvenciához:

(i) Szekvenciajellemzők:

(A) Hosszúság: 336 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Lánctípus: kétfonalas (D) Topológia : lineáris (ii) Molekulatípus: nukleinsav (A) Leírás: desc=„hibrid TGF-p2-3-at kódoló rekombináns hibrid DNS” (vi) Közvetlen forrás:

(B) Klón: E. coli LC137/pPLMu.TGF-p2(44/45)p3 (ix) Jellemzők:

(A) Név/kulcsszó: mat_peptid (B) Elhelyezkedés: 1...132 (D) Más információ: termék=„humán TGF-p2 44 N-terminális aminosava” (ix) Jellemzők:

(A) Név/kulcsszó: mat_peptid (B) Elhelyezkedés: 133... 336 (D) Más információ: termék=„humán TGF-P3 68 C-terminális aminosava” (ix) Jellemzők:

(A) Név/kulcsszó: CDS (B) Elhelyezkedés: 1.. .336 (D) Más információ: termék „hibrid TGF-p2-3” (xi) Szekvencialeírás: 9. azonosító számú szekvencia

GCT TTG GAT GCG GCC

TAT TGC TTT AGA AAT GTG CAG GAT AAT TGC TGC

48

Al a 1

Leu

Asp Alá

Al a 5

Tyr

Cys

Phe

Arg

Asn 10

Va 1

Gin

As p

Asn

Cys 15

Cys

CTA

CGT

CCA

CTT

TAC

ATT

GAT

TTC

AAG

AGG

GAT

CTA

GGG

TGG

AAA

TGG

96

Leu

Arg

Pro

Leu

Tyr

I le

Asp

Phe

Lys

Arg

As p

Leu

Gly

Trp

Lys

Trp

20

25

30

ATA

CAC

GAA

CCC

AAA

GGG

TAC

AAT

GCC

AAC

TTC

TGC

TCA

GGC

CCT

TGC

144

I le

Hi s

Glu

Pro

Ly s

Gly

Tyr

Asn

Al a

Asn

Phe

Cys

Ser

Gly

Pro

Cys

35

40

45

CCA

TAC

CTC

CGC

AGT

GCA

GAC

ACA

ACC

CAC

AGC

ACG

GTG

CTG

GGA

CTG

192

Pro

Tyr

Leu

Arg

Ser

Al a

Asp

Thr

Thr

Hi s

Ser

Thr

Val

Leu

Gly

Leu

50

55

60

TAC

AAC

ACT

CTG

AAC

CCT

GAA

GCA

TCT

GCC

TCG

CCT

TGC

TGC

GTG

CCC

240

Tyr

Asn

Thr

Leu

Asn

Pro

Glu

Al a

Ser

Alá

Ser

Pro

Cys

Cy s

Val

Pro

65

70

75

80

CAG

GAC

CTG

GAG

CCC

CTG

ACC

ATC

CTG

TAC

TAT

GTT

GGG

AGG

ACC

CCC

288

Gin

As p

Leu

Glu

Pro

Leu

Thr

I le

Leu

Tyr

Tyr

Val

Gly

Arg

Thr

Pro

85

90

95

AAA

GTG

GAG

CAG

CTC

TCC

AAC

ATG

GTG

GTG

AAG

TCT

TGT

AAA

TGT

AGC

336

Lys

Val

Glu

Gin

Leu

Ser

Asn

Me t

Val

Val

Ly s

Ser

Cys

Lys

Cys

Ser

100

105

110

(2) Információ a 10. azonosító számú szekvenciához (i) Szekvenciajellemzők:

(A) Hosszúság: 112 aminosav (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: protein (xi) Szekvencialeírás: 10. azonosító számú szekvencia Alá Leu Asp Alá Alá Tyr Cys Phe Arg Asn Val Gin Asp Asn Cys Cys

10 15

HU 222 830 Bl

Leu

Arg

Pro

Leu

Tyr

Ile

As p

Phe

Ly s

Arg

As p

Leu

Gly

Trp

Lys

Trp

20

25

30

Ile

Hi s

Glu

Pro

Lys

Gly

Tyr

As n

Al a

Asn

Phe

Cys

Ser

Gly

Pro

Cys

35

40

45

Pro

Tyr

Leu

Arg

Ser

Al a

Asp

Thr

Thr

Hi s

Ser

Thr

Val

Leu

Gly

Leu

50

55

60

Tyr

Asn

Thr

Leu

Asn

Pro

Glu

Al a

Ser

Al a

Ser

Pro

Cy s

Cy s

Val

Pro

65

70

75

80

Gin

As p

Leu

Glu

Pro

Leu

Thr

Ile

Leu

Tyr

Tyr

Val

G1 y

Arg

Thr

Pro

85

90

95

Ly s

Val

Glu

Gin

Leu

Ser

Asn

Me t

Val

Val

Ly s

Ser

Cy s

Ly s

Cys

Ser

100

105

110

(2) Információ all. azonosító számú szekvenciához (i) Szekvenciajellemzők:

(A) Hosszúság: 336 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Lánctípus: kétfonalas (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: más nukleinsav (A) Leírás desc=,Rekombináns hibrid DNS, ami hibrid TGF-p3-2-t kódol” (vii) Közvetlen forrás:

(B) Klón: E. coli LC137/pPLMu.TGF-p3(44/45)p2 (ix) Jellemzők:

(A) Név/kulcsszó: mat_peptid (B) Elhelyezkedés: 1...132 (D) Más információ: termék=„humán TGF-33 44N-terminális aminosava” (ix) Jellemzők:

(A) Név/kulcsszó: mat_peptide (B) Elhelyezkedés: 133...336 (D) Más információ: termék=TGF-p2 68 C-terminális aminosava” (ix) Jellemzők:

(A) Név/kulcsszó: CDS (B) Elhelyezkedés: 1...336 (D) Más információ: termék=„hibrid TGF-P3-2” (ix) Szekvencialeírás: 11. azonosító számú szekvencia

GCT Al a 1

TTG GAC Leu Asp

ACC Thr

AAT Asn 5

TAC Tyr

TGC Cy s

TTC CGC AAC

TTG GAG

GAG AAC TGC TGT

48

Phe

Arg

Asn 10

Leu

Glu

Glu

Asn

Cys 15

Cys

GTG

CGC

CCC

CTC

TAC

ATT

GAC

TTC

CGA

CAG

GAT

CTG

GGC

TGG

AAG

TGG

96

Val

Arg

Pro

Leu

Tyr

Ile

Asp

Phe

Arg

Gin

As p

Leu

Gly

Trp

Ly s

Trp

20

25

30

GTC

CAT

GAA

CCT

AAG

GGC

TAC

TAT

GCC

AAC

TTC

TGT

GCT

GGA

GCA

TGC

144

Val

Hi s

Glu

Pro

Ly s

Gly

Tyr

Tyr

Al a

Asn

Phe

Cys

Alá

Gly

Alá

Cys

35

40

45

CCG

TAT

TTA

TGG

AGT

TCA

GAC

ACT

CAG

CAC

AGC

AGG

GTC

CTG

AGC

TTA

192

Pro

Tyr

Leu

Trp

Ser

Ser

Asp

Thr

Gin

Hi s

Ser

Arg

Val

Leu

Ser

Leu

50

55

60

TAT

AAT

ACC

ATA

AAT

CCA

GAA

GCA

TCT

GCT

TCT

CCT

TGC

TGC

GTG

TCC

240

Tyr

Asn

Thr

I le

As n

Pro

Glu

Al a

Ser

Al a

Se r

Pro

Cy s

Cy s

Val

Ser

65

70

75

80

HU 222 830 Β1

CAA

GAT

TTA

GAA

CCT

CTA

ACC

ATT

CTC

TAC

TAC

ATT

GGC

AAA

ACA

CCC

Gin

Asp

Leu

Glu

Pro 85

Leu

Thr

Ile

Leu

Tyr 90

Tyr

Ile

Gly

Lys

Thr 95

Pro

AAG

ATT

GAA

CAG

CTT

TCT

AAT

ATG

ATT

GTA

AAG

TCT

TGC

AAA

TGC

AGC

Lys

Ile

Glu

Gin

Leu

Ser

Asn

Me t

Ile

Val

Ly s

Ser

Cys

Ly s

Cy s

Ser

100 105 110

288

336 (2) Információ a 12. azonosító számú szekvenciához:

(i) Szekvenciajellemzők: (A) hosszúság: 112 aminosav (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: protein (xi) Szekvencialeirás: 12. azonosító számú szekvencia	Leu	Glu	Glu Asn Cys 15	Cys
Al a 1	Leu Asp	Thr Asn Tyr 5	Cy s	Phe	Arg Asn 10
Val	Arg Pro	Leu Tyr Ile 20	Asp	Phe	Arg Gin 25	Asp	Leu	Gly Trp Lys 30	Trp
Val	His Glu 35	Pro Lys Gly	Tyr	Tyr 40	Alá Asn	Phe	Cy s	Alá Gly Alá 45	Cy s
Pro	Tyr Leu 50	Trp Ser Ser	Asp 55	Thr	Gin His	Ser	Arg 60	Val Leu Ser	Leu
Tyr 65	Asn Thr	Ile Asn Pro 70	Glu	Al a	Ser Alá	Ser 75	Pro	Cys Cys Val	Ser 80
Gin	Asp Leu	Glu Pro Leu 85	Thr	Ile	Leu Tyr 90	Tyr	Ile	Gly Lys Thr 95	Pro
Lys	Ile Glu	Gin Leu Ser 100	Asn	Me t	Ile Val 105	Lys	Ser	Cys Lys Cys 110	Ser

(2) Információ a 13. azonosító számú szekvenciához:

(i) Szekvenciajellemzők:

(A) Hosszúság: 336 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Lánctípus: kétfonalas (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: cDNS mRNS-hez (ix) Jellemzők:

(A) Név/kulcsszó: CDS (B) Elhelyezkedés: 1... 342 (D) Más információ: termék „humán csont morfogenetikus protein-2” (xi) Szekvencialeírás: 13. azonosító számú szekvencia

CAA GCC

AAA CAC

AAA Ly s

CAG Gin

CGG Arg

AAA Ly s 120

CGC CTT AAG TCC AGC

TGT Cy s

AAG Lys

AGA Arg

Gin

Al a

Lys 115

Hi s

Arg

Leu

Ly s

Ser

Ser 125

CAC

CCT

TTG

TAC

GTG

GAC

TTC

AGT

GAC

GTG

GGG

TGG

AAT

GAC

TGG

ATT

Hi s

Pro

Leu

Tyr

Val

As p

Phe

Ser

Asp

Va 1

Gly

Trp

Asn

As p

Trp

Ile

130

135

140

GTG

GCT

CCC

CCG

GGG

TAT

CAC

GCC

TTT

TAC

TGC

CAC

GGA

GAA

TGC

CCT

Val

Al a

Pro

Pro

G1 y

Tyr

Hi s

Al a

Phe

Tyr

Cys

Hi s

G1 y

Glu

Cys

Pro

145

150

155

160

144

HU 222 830 Β1

TTT

CCT

CTG

GCT

GAT

CAT

CTG

AAC

TCC

ACT

AAT

CAT

GCC

ATT

GTT

CAG

Phe

Pro

Leu

Al a

Asp 165

Hi s

Leu

Asn

Ser

Thr 170

Asn

Hi s

Al a

Ile

Val 175

Gin

ACG

TTG

GTC

AAC

TCT

GTT

AAC

TCT

AAG

ATT

CCT

AAG

GCA

TGC

TGT

GTC

Thr

Leu

Val

Asn 180

Ser

Val

Asn

Ser

Lys 185

Ile

Pro

Lys

Al a

Cy s 190

Cys

Val

CCG

ACA

GAA

CTC

AGT

GCT

ATC

TCG

ATG

CTG

TAC

CTT

GAC

GAG

AAT

GAA

Pro

Thr

Glu 195

Leu

Se r

Alá

Ile

Ser 200

Me t

Leu

Tyr

Leu

Asp 205

Glu

Asn

Glu

AAG

GTT

GTA

TTA

AAG

AAC

TAT

CAG

GAC

ATG

GTT

GTG

GAG

GGT

TGT

GGG

Lys

Val

Val

Leu

Ly s

Asn

Tyr

Gin

As p

Me t

Va 1

Val

Glu

Gly

Cys

Gly

210 215 220

192

240

288

336

TGT CGC TAG

Cys Arg

225 (2) Információ a 14. azonosító számú szekvenciához:

(i) Szekvenciajellemzők·.

(A) Hosszúság: 114 aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: protein

345

(xi) Szekvencialeírás:

14. azonosító számú szekvencia

Gin 1

Al a

Lys

Hi s

Lys Gin Arg 5

Ly s

Arg

Leu 10

Lys

Ser

Ser

Cy s

Ly s 15

Arg

Hi s

Pro

Leu

Tyr 20

Val Asp Phe

Ser

Asp 25

Val

Gly

Trp

Asn

Asp 30

Trp

Ile

Val

Al a

Pro 35

Pro

Gly Tyr His

Al a 40

Phe

Tyr

Cy s

Hi s

Gly 45

Glu

Cys

Pro

Phe

Pro 50

Leu

Al a

Asp His Leu 55

Asn

Ser

Thr

Asn

Hi s 60

Al a

Ile

Val

Gin

Thr 65

Leu

Val

Asn

Ser Val Asn 70

Ser

Lys

Ile

Pro 75

Lys

Al a

Cys

Cys

Val 80

Pro

Thr

Glu

Leu

Ser Alá Ile 85

Ser

Me t

Leu 90

Tyr

Leu

Asp

Glu

Asn 95

Glu

Lys

Val

Val

Leu 100

Lys Asn Tyr

Gin

Asp 105

Me t

Va 1

Val

Glu

G1 y 110

Cys

Gly

Cys Arg

Claims (25)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás dimer, biológiailag aktív β-típusú transzformáló növekedési faktor (TGF-p)-szerű fehérje vagy sója előállítására, azzal jellemezve, hogy a (TGF-β)szerű fehérje denaturált, monomer formáját egy térszerkezet kialakítására alkalmas (folding) pufferrel kezeljük, amely tartalmaz egy enyhe detergenst, ez lehetővé teszi, hogy a monomer (TGF-p)-szerű fehérje háromdimenziós térszerkezetet vegyen fel, amely dimerizálás után biológiai aktivitást nyújt, miközben a monomer oldható alakban marad és egy szerves oldószert, éspedig dimetil-szulfoxidot, dimetil-formamidot, dimetilszulfont vagy a dimetil-szulfoxidból, dimetil-formamidból és dimetil-szulfonból álló csoport két vagy három tagjának tetszőleges keverékét.

   HU 222 830 Bl
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan puffért alkalmazunk, amely egy redukálószert is tartalmaz.
3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy enyhe detergensként digitonint, CHAPSt, CHAPSO-t vagy a digitoninból, CHAPS-ból és CHAPSO-ból álló csoport tagjainak tetszőleges keverékét alkalmazzuk.
4. 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy enyhe detergensként CHAPS-t, CHAPSO-t vagy a CHAPS és CHAPSO tetszőleges keverékét alkalmazzuk.
5. 5. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan foldingpuffert alkalmazunk, amelyben az enyhe detergens körülbelül 1 és 100 mM közötti koncentrációban van jelen.
6. 6. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan foldingpuffert alkalmazunk, amelyben az enyhe detergens 30 és 60 mM közötti koncentrációban van jelen.
7. 7. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan foldingpuffert alkalmazunk, amelyben az enyhe detergens 30 mM koncentrációban van jelen.
8. 8. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szerves oldószert a dimetil-szulfoxidot, dimetil-formamidot és dimetil-szulfont tartalmazó csoportból választjuk.
9. 9. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szerves oldószert körülbelül 5% és körülbelül 40% közötti koncentrációban alkalmazzuk.
10. 10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szerves oldószert körülbelül 10% és körülbelül 30% közötti koncentrációban alkalmazzuk.
11. 11. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy dimetil-szulfoxidot alkalmazunk körülbelül 10% és körülbelül 30% közötti koncentrációban.
12. 12. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy dimetil-szulfoxidot alkalmazunk körülbelül 30%os koncentrációban.
13. 13. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy dimetil-formamidot alkalmazunk körülbelül 10% és körülbelül 30% közötti koncentrációban.
14. 14. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy dimetil-formamidot alkalmazunk körülbelül 10%-os koncentrációban.
15. 15. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy dimetil-szulfont alkalmazunk körülbelül 10%-os koncentrációban.
16. 16. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy dimetil-szulfoxid és dimetil-formamid elegyét alkalmazzuk összesen körülbelül 10% és 30% közötti koncentrációban.
17. 17. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a TGF-p-szerű fehérjét a TGF-p2-t, TGF-p3-at, TGF-pi-2 hibridet, TGF-pl-3 hibridet, TGF-p2-3 hibridet, TGF-P3-2 hibridet és a ΒΜΡ-2-t tartalmazó csoport tagjai közül választjuk.
18. 18. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy TGF-P-szerű fehérjeként TGF-p3-at alkalmazunk.
19. 19. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy körülbelül 6 és körülbelül 10 közötti pH-értékű puffért alkalmazunk.
20. 20. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy körülbelül 0 °C és körülbelül 40 °C közötti hőmérsékletű puffért alkalmazunk.
21. 21. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy redukálószerként egy redukált szulfhidrilvegyületet alkalmazunk.
22. 22. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a redukált szulfhidrilvegyületet a redukált alakú glutationt, a redukált alakú -β-merkapto-etanolt, a redukált alakú merkapto-metanolt, a ciszteint, ciszteinamint és a redukált alakú ditiotreitolt tartalmazó csoportból választjuk.
23. 23. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a redukált szulfhidrilvegyületet körülbelül 1 és 100 mM közötti koncentrációban alkalmazzuk.
24. 24. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a redukált szulfhidrilvegyületet körülbelül 1 és 10 mM közötti koncentrációban alkalmazzuk.
25. 25. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a redukált szulfhidrilvegyületet körülbelül 2,5 mM koncentrációban alkalmazzuk.