DE69523605T2

DE69523605T2 - Verfahren zur herstellung vom aktieven protein dimerischen

Info

Publication number: DE69523605T2
Application number: DE69523605T
Authority: DE
Inventors: Nico Cerletti
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 1994-07-25
Filing date: 1995-07-12
Publication date: 2002-07-11
Anticipated expiration: 2015-07-13
Also published as: ZA956138B; FI970229A0; AU3109595A; JP3923516B2; DE69523605D1; HUT76668A; IL114701A0; WO1996003432A1; FI970229A; JPH11505506A; CA2194582A1; NZ290373A; ATE207933T1; ES2166401T3; HU222830B1; NO970325L; EP0775159B1; EP0775159A1; AU690311B2; NO316926B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Faltungsverfahren zur Herstellung eines biologisch aktiven, dimeren TGF-β (transformierender Wachstumsfaktor-Typ β)-artigen Proteins.

Hintergrund der Erfindung

TGF-β-artige Proteine, d. h. Proteine der TGF-β-Überfamilie, spielen eine zentrale Rolle bei vielen biologischen Regulierungswegen, wie der Embryonalentwicklung oder der Regeneration von Gewebe. Sie sind sehr wirksame biologische Mittel, die auf auch therapeutisch für eine Reihe von unterschiedlichen Zwecken verwendet werden können. Die besten bekannten Mitglieder der TGF-β- Überfamilie sind die TGF-β-Verbindungen selbst.
TGF-β wurde ursprünglich bis zur Homogenität aus menschlichen Thrombocyten, menschlicher Placenta und Rinderniere bis zur Homogenität gereinigt und als homodimeres Protein mit einer Molekülmasse von etwa 25 000 Da identifiziert. Nachdem TGF-β zuerst durch seine Fähigkeit charakterisiert wurde, synergistisch mit EGF oder TGF-α dahingehend zu wirken, dass es ein ankerunabhängiges Wachstum nichttransformierter NRK-Zellen induziert, hat sich jüngst gezeigt, dass TGF-β zahlreiche Steuereffekte auf eine breite Vielzahl sowohl von normalen Zellen als auch von neoplastischen Zellen besitzt. Dies zeigt die Bedeutung dieses Proteins als multifunktioneller Regulator der Zellaktivität. In Abhängigkeit von dem Zell- oder Gewebetyp und der Gegenwart oder Abwesenheit von anderen Wachstumsfaktoren kann TGF-β entweder die Mitogenese, die Zellproliferation und das Zellwachstum stimulieren oder diese Prozesse wirksam hemmen oder es kann weitere Wirkungen, wie beispielsweise die Steuerung einer Adipogenese, Myogenese, Chondrogenese, Osteogenese und Immunzellfunktion, Stimulation einer Chemotaxis oder Induktion oder Hemmung einer Differenzierung besitzen. Viele der Wirkungen von TGF-β stehen in Verbindung mit der Reaktion von Zellen oder Geweben auf Stress oder Verletzung und mit der Reparatur der entstandenen Beschädigung. Nach einer Entzündung spielt TGF-β die Hauptrolle bei der Bildung von Granulationsgewebe, erhöht die Expression von Genen, die mit einer extrazellulären Matrixbildung in Verbindung stehen, wie Fibronectin, Kollagen und verschiedene Proteaseinhibitoren und stimuliert eine Kollagenmatrixkontraktion durch Fibroblasten, was seine mögliche Rolle bei der Bindegewebskontraktion vermuten lässt.
Bis jetzt wurden fünf unterschiedliche, jedoch funktionell und strukturell eng verwandte TGF-βs mit der Bezeichnung TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 und TGF-β5 beschrieben.
Alle TGF-βs werden in Form von 390 bis 412 Aminosäuren langen Vorläufern synthetisiert, die eine proteolytische Spaltung unter Bildung der reifen Formen durchlaufen die aus den C-terminalen 112 Aminosäuren bestehen. In ihren reifen, biologisch aktiven Formen sind die TGF-β1 bis 5 säure- und wärmestabile disulfidverknüpfte Homodimere von zwei Polypeptidketten aus jeweils 112 Aminosäuren. Die vollständigen Aminosäuresequenzen von Human-TGF-β1 (R. Derynek et al. (1985), Nature 316, 701-705), Mäuse-TGF-β1 (R. Derynek et al. (1986), J. Biol. Chem. 261, 4377-4379) und Affen-TGF-β1 (K. Sharples et al. (1987) DNA 6, 239-244) zeigen merkliche Sequenzkonservierung und unterscheiden sich lediglich in einem Einzelaminosäurerest. Ein Vergleich der Aminosäuresequenz von Human-TGFβ1, Human-TGF-β2 (R. deMartin et al. (1987) EMBO J. 6, 3673-3677; H. Marquardt et al. (1987), J. Biol. Chem. 262, 12127-12131) und Human-TGF-β3 (P. Ten Dijke et al. (1988), PNAS 85, 4715-4719) hat gezeigt, dass die drei Proteine in ihren reifen Formen eine etwa 70- bis 80-%ige Sequenzidentität zeigen. Ein heterodimeres TGF-β1.2 wurde aus Schweinethrombocyten isoliert und besteht aus einer Untereinheit von TGF-β1, die mit einer Untereinheit von TGF-β2 über Disulfldbrücken verknüpft ist (S. Cheifetz et al. (1987), Cell 48, 409-415).
Jüngst wurden Versuche mit dem Ziel unternommen, TGF-βs mit Hilfe rekombinanter Techniken anstelle einer Isolierung dieser Faktoren aus natürlichen Quellen (beispielsweise Thrombocyten) herzustellen, um ausreichende Mengen zur Untersuchung in verschiedenen therapeutischen Anwendungen zu erhalten. Es hat sich jedoch als extrem schwierig erwiesen, ein biologisch wirksames rekombinantes TGF-β herzustellen. Wie aus den im Sequenzprotokoll unter SEQ ID Nr. 1 bis 6 angegebenen Sequenzen ersichtlich ist, enthalten die 112 Aminosäuren langen reifen Formen von TGF-β1, TGF-β2 und TGF-β3 9 Cysteinsreste. Wie für TGF-β2 gezeigt wurde, bilden die 9 Cysteinreste 4 Intraketten- und eine Interkettendisulfidbindung(en) (M. P. Schlunegger und MG. Gruetter, Nature 358 : 430-434 (1992)). Eine heterologe Expression von TGF-β kann zu einem Produkt führen, das obwohl es die korrekte Primärstruktur aufweist, nicht in der Lage ist, sich geeignet unter Bildung der korrekten komplizierten Sekundär- oder Tertiärstruktur zu falten und das folglich nicht die biologisch Aktivität besitzt.
Unter Berücksichtigung der Komplexität der nativen TGF-β-Moleküle wurde es im allgemeinen als zweckdienlich angesehen, die jeweiligen TGF-β-Gene in Zellen, die von höheren Organismen abgeleitet sind, zu exprimieren. Obwohl eine Expression von rekombinanten TGF-βs in eukaryontischen Systemen erreicht werden kann, sind die Ausbeuten des erhaltenen biologisch aktiven, korrekt gefalteten Materials weit davon entfernt, zufriedenstellend zu sein.
Folglich wurden Versuche unternommen, biologisch aktives TGF-β in einem mikrobiellen Wirt herzustellen. Beispielsweise in Bakterien sind jedoch die intrazellulären Bedingungen für eine korrekte Faltung, eine Disulfidbindungsbildung und eine disulfidstabilisierte Dimerisierung, die offensichtlich essentiell für die Aktivität ist, nicht förderlich. Somit konnte lediglich sehr wenig biologisch aktives TGF-β nach Expression des jeweiligen Gens in E. coli unter Steuerung des Lambdapromotors erhalten werden (vgl. EP-A-0 268 561). Ein weiterer Report beschreibt die Expression einer TGF-β-cDNA in E. coli unter der Steuerung des trp-Promotors, wobei eine radioaktiv markierte Proteinbande mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 13 000 Da in einem Autoradiogramm eines SDS-Polyacrylamidgels erhalten wurde, eine Aktivität jedoch nicht gemessen wurde (Y. Urushizaki et al. (1987), Tumro Res. 22, 41-55).
Wenn rekombinante Proteine in hohen Mengen in bakteriellen (beispielsweise E. coli) Expressionssystemen hergestellt werden, treten sie häufig in Form von in hohem Maße unlöslichen intrazellulären Präzipitaten auf, die als Einschlusskörper oder refraktile Körper bezeichnet werden, die als helle Spots erkannt werden können, die in der Einfassung der Zellen unter einem Phasenkontrastmikroskop sichtbar sind. Diese Einschlusskörper, die bereitwillig von den löslichen bakteriellen Proteinen abgetrennt werden können, enthalten das rekombinante Protein in einer hauptsächlich denaturierten und reduzierten Form, die die funktionelle Aktivität ihres natürlichen Gegenparts nicht zeigt und die sich folglich nicht als kommerzielles Produkt eignet. Es herrscht folglich die allgemeine Übereinkunft, dass das rekombinante refraktile Protein unter Bedingungen solubilisiert werden muss, die sich dazu eignen, es in seiner denaturierten Form zu halten, worauf es gefaltet werden muss, um den Übergang von der denaturierten nichtgefalteten Form in die geeignete funktionell aktive dreidimensionale Struktur zu durchlaufen, deren Konformation durch relativ schwache Interatomkräfte, wie Wasserstoffbrückenbindungen, hydrophobe Wechselwirkungen und Ladungswechselwirkungen stabilisiert wird. Im Falle von Cystein enthaltenden Proteinen kann dieses Verfahren auch eine Bildung von Disulfidbrücken umfassen. Wenn die Bildung von Disulfldbrücken chemisch gefördert wird, sollte die Bildung von nicht korrekten intramolekularen und, im Falle von dimeren oder multimeren Proteinen, intermolekularen Brücken verhindert oder zumindest minimiert werden, da die Bildung unerwünschter, nicht korrekt gefalteter Isomere nicht-homogenes Material liefern kann, wodurch die weitere Reinigung des Proteins mit der gewünschten Struktur kompliziert wird, oder es kann ein Protein mit reduzierter Aktivität erzeugt werden.
Das Falten der Proteine erfolgt üblicherweise in einem mehrstufigen Verfahren, das die Solubilisierung des Proteins unterstark denaturierenden Bedingungen und das anschließende Reduzieren der Konzentration des Chaotrops, um die Faltung des Proteins zu gewährleisten, umfasst. Ein derartiger Ansatz schlug jedoch bei der Faltung von TGF-β fehl. In der EP-A-0 433 225 wird jedoch ein erfolgreiches Verfahren zur Herstellung von biologisch aktivem, dimerem TGF-β-artigen Protein beschrieben, bei dem ein mildes Detergens verwendet wird, das die Faltung des TGF-β-Proteins gewährleistet, während das Detergens in dem Faltungspuffer vorhanden bleibt.
Es ist auf dem einschlägigen Fachgebiet bekannt (Tam et al., J. Am. Chem. Soc. 113 : 6657- 6662, 1991), dass Dimethylsulfoxid (DMSO) zur Förderung einer selektiven und wirksamen Bildung von Disulfldbindungen in Peptiden verwendet werden kann. Das Verfahren ist selektiv, d. h. ohne Nebenreaktionen und kann in einem breiten pH-Bereich angewendet werden. Es hat sich jedoch gezeigt, dass eine korrekte Disulfidbrückenbildung lediglich bei Peptiden mit bis zu 30 Aminosäuren erfolgt. In einer anderen Publikation (Bentle et al., US-A-4 731 440) wurde Dimethylsulfon oder ein Gemisch aus Dimethylsulfon und Harnstoff zur Solubilisierung von Somatotropin aus Einschlusskörpern verwendet. Das solubilisierte Protein konnte anschließend durch In-Berührung-Bringen der Dimethylsulfon enthaltenen Lösung des Proteins mit einem milden Oxidationsmittel renaturiert werden.
Überraschenderweise wurde nun festgestellt, dass ein Verfahren, in dem ein mildes Detergens für die Faltung eines TGF-β-artigen Proteins verwendet wird, verbessert werden kann, wenn Dimethylsulfoxid (DMSO), Dimethylsulfon (DMSO&sub2;) oder Dimethylformamid (DMF) zugegeben wird.

Aufgabe der Erfindung

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein verbessertes Verfahren zur Herstellung eines biologisch aktiven, dimeren TGF-β-artigen Proteins aus seiner denaturierten und ansonsten nicht-nativen Form anzugeben. Diese Aufgabe wird durch die unerwartete Erkenntnis gelöst, dass beträchtliche Mengen des gewünschten dimeren Produkts in einer unerwarteten Ausbeute erhalten werden können, wenn die monomere Form des Proteins mit einem Faltungspuffer behandelt wird, der
(a) ein mildes Detergens und
(b) DMSO, DMF oder DMSO&sub2;
oder ein Gemisch aus zwei oder drei der aus DMSO, DMSO&sub2; und DMF bestehenden Gruppe umfasst.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein verbessertes Verfahren zur Herstellung eines dimeren, biologisch aktiven Proteins eines transformierender Wachstumsfaktor-Tvp β (TGF-β)-artigen Proteins, das das Behandeln eines TGF-β-artigen Proteins mit einem Faltungspuffer umfasst, der
(a) ein mildes Detergens, das die Faltung eines Proteins der TGF-β-Überfamilie gewährleistet und
(b) ein organisches Lösungsmittel, das aus DMSO, DMF und DMSO&sub2; und einem beliebigen Gemisch aus zwei oder drei der aus DMSO, DMSO&sub2; und DMF bestehenden Gruppe ausgewählt ist, umfasst.
Der Ausdruck "TGF-β-artiges Protein" bezeichnet im Kontext der vorliegenden Erfindung ein Protein, das in seiner monomeren Form eine Sequenz mit einer mindestens 75%igen Homologie zu mindestens einer der Aminosäuresequenzen eines Monomers der folgenden Mitglieder der TGF-β- Überfamilie (die auch unter dem Ausdruck "TGF-β-artiges Protein" fallen) aufweist:
TGF-β1, TGF-β2 und TGF-β3, ein Wachstumsfaktor, der aus konditioniertem Medium von BSC-1-Affennierenzellen isoliert wurde (d. h. Polyergin: R. W. Holley et al. (1980) PNAS 77. 5989-5992: H. J. Ristow (1986), PNAS 83, 5531-5533); TGF-β4 aus Hühnchenembryochondrocvten (S. B. Jakowlew et al. (1988), Molekular Endocrinology 2, 1186-1195); TGF-β5 von Xenopus-Laevis (P. Kondaiah et al (1990), J. Biol. Chem. 265, 1089-1093); TGF-β-verwandte Inhibine und Aktivine (Gonadenproteine, die Hypophysensekretion von Follikel stimulierendem Hormon steuern); Anti-Müller-Hormon (MIS, das die Entwicklung des Müllergangs bei männlichen Säugetierembryos hemmt); Knochenmorphogenprotein (BMP, eine Gruppe von Polypeptiden, die bei der Induktion der Knorpel- und der Knochenbildung beteiligt sind; die heute bekannte Mitglieder dieser Gruppe sind BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8 und BMP-9); das Transkript aus dem decapentaplegischen Genkomplex von Drosophila (dpp, das dahingehend wirkt, die Morphogenese in dem Fliegenembryo zu steuern); Vg-1 (das Produkt des Xenopus-Transkripts, das im vegetativen Pol von Oocyten vorhanden ist); und Vgr-1, ein Vg-1- verwandtes Säugetiergen (A. Mason et al. (1986), Biochem. Biophys. Res. Commun. 135, 957-964: R. Cate et al. (1986), Cell 45, 685-698; J. M. Wozney et al. (1988), Science 242, 1528-1534; R. Padgett et al. (1986), Nature 325, 81-84; D. L. Weeks und D. A. Melton (1987), Cell 51, 861-868; K. Lyons et al. (1989), PNAS 86, 4554-4558).
Ferner fallen unter den Ausdruck "TGF-β-artiges Protein" Heterodimere, die Untereinheiten verschiedener TGF-β-artiger Proteine oder Fragmente oder Mutanten der oben genannten Proteine enthalten, die eine oder alle biologischen Aktivitäten des Muttermoleküls beibehalten.
In einer bevorzugten Bedeutung im Kontext der vorliegenden Erfindung bezeichnet der Ausdruck "TGF-β-artiges Protein" jedes beliebige Protein der TGF-β-Überfamilie. In einer stärker bevorzugten Bedeutung bezeichnet er die folgenden Proteine der TGF-β-Überfamilie: TGF-β1, TGF-β2 und TGF- β3 mit Säugetierursprung, beispielsweise menschlicher oder tierischer Herkunft, wie Affen-, Mäuse-, Schweine-, Pferde- oder Rinderherkunft sowie die heterodimeren TGF-βs aus zwei unterschiedlichen Untereinheiten aus jeweils 112 Aminosäuren und Fragmenten und Mutanten eines TGF-β einschließlich Hybridmolekülen, in denen Teile unterschiedlicher TGF-βs ausgetauscht sind; ein aus konditioniertem Medium von BSC-1-Affennierenzellen isolierter Wachstumsinhibitor (d. h. Polyergin); TGF-β4 von Hühnchenembryochondrocyten; TGF-β5 von Xenopus-Laevis; TGF-β-verwandte Inhibine und Aktivine (Gonadenproteine, die die Hypophysensekretion von follikelstimulierendem Hormon steuern); Anti- Müller-Hormon (MIS, das die Entwicklung des Müller-Gangs bei männlichen Säugetierembryos hemmt); Knochenmorphogenproteine (BMP, eine Gruppe von Polypeptiden, die bei der Induktion einer Knorpel- und Knochenbildung beteiligt sind; die bisher bekannten Mitglieder dieser Gruppe sind BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8 und BMP-9); das Transkript aus dem decapentaplegischen Genkomplex von Drosophila (dpp, das dahingehend wirkt, dass es die Morphogenese in dem Fliegenembryo steuert); Vg-1 (das Produkt des Xenopus-Transkripts, das in dem vegetativen Pol von Oocvten vorhanden ist) und Vgr-1, ein Vg-1-verwandtes Säugetiergen. Ferner fallen unter die Bedeutung "TGF-βartiges Protein" Heterodimere, die Untereinheiten unterschiedlicher TGF-β-artiger Proteine enthalten oder Fragmente und Mutanten der oben genannten Proteine, die eine oder alle biologischen Aktivitäten des Muttermoleküls beibehalten.
Noch stärker bevorzugte TGF-β-artige Proteine sind aus TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, heterodimeren TGF-βs, Fragmenten und Mutanten von TGF-β umfassenden Hybridmolekülen, in denen Teile unterschiedlicher TGF-βs ausgetauscht sind, BMPs, Inhibinen und Aktivinen ausgewählt. Noch stärker bevorzugt sind solche, die aus BMP-2, TGF-β1. TGF-β2, TGF-β3 und Heterodimeren sowie Fragmenten und Mutanten hiervon einschließlich Hybridmolekülen, in denen Teile der unterschiedlichen TGF-βs ausgetauscht sind, vorzugsweise TGF-β1-3, TGF-β2-3 oder TGF-β3-2 gemäß der nachfolgenden Definition oder TGF-β1-2 aus - in der Reihenfolge vom N-Terminus zum C-Terminus - den endterminalen 44 Aminosäuren von Human-TGF-β1 und aus den C-terminalen 68 Aminosäuren von TGF-β2 ausgewählt sind. Noch stärker bevorzugte TGF-β-artige Proteine sind solche, die aus den Proteinen mit den in dem Sequenzprotokoll unter SEQ ID Nr. 1, 3, 5, 7, 9, 11 oder 13 angegebenen Aminosäuresequenzen ausgewählt sind. Das am stärksten bevorzugte TGF-β-artige Protein ist TGF-β3. Der Ausdruck BMP-2 umfasst ferner Varianten von BMP-2, die dieselbe biologische Aktivität aufweisen. Derartige Varianten sind beispielsweise die in den Beispielen hergestellten, d. h. das BMP-2 mit der SEQ ID Nr. 13 mit einem zusätzlichen N-terminalen Methionin und das BMP-2 mit der SEQ ID Nr. 13, dem die N-terminale Aminosäure Gln fehlt.
Die biologische Aktivität von TGF-β für die Zwecke der vorliegenden Anmeldung lässt sich entweder als
die eine Zellmigration fördernde Aktivität von TGF-β auf Fibroblasten (A. E. Postlethwaite et al. (1987), J. Exp. Med. 165,251, modifiziert gemäß R. Burk (1973), PNAS 70,369),
die Hemmwirkung von TGF-β auf das Wachstum von Humanen-A-375-Melanomzellen (T. J. Brown et al. (1987), J. Immunol. 139, 2977),
die Hemmung eines CCl-64-Zell-DNA-Synthesetests (J. L. Graycar et al. (1989), Molecular Endocrinology 3 : 1977-1986) oder
die Hemmung des Wachstums einer kontinuierlichen Nerz-Lungen-Epithelzelllinie Mv-1-Lu (ATCC/CCL64) gemäß Beschreibung in den folgenden Beispielen. definieren.
Aus jeder beliebigen Quelle und jedem beliebigen Verfahren stammendes monomeres TGFβ-artiges Protein kann gemäß dem vorliegenden Verfahren in das entsprechende dimere, biologisch aktive TGF-β-artige Protein gefaltet werden. Beispielsweise kann die monomere Form des TGF-β-artigen Proteins aus einer natürlichen Quelle stammen oder kann mit Hilfe rekombinanter DNA-Technologie oder synthetisch nach auf dem einschlägigen Fachgebiet wohlbekannten Verfahren hergestellt werden. In Fällen, in denen das Monomer infolge von verunreinigenden Substanzen sich nicht für eine in-vitro-Faltung eignet, kann das solubilisierte und denaturierte Monomer durch Chromatographie, beispielsweise durch Größenausschlussluftchromatographie auf beispielsweise Sephacryl S-100 HR gereinigt werden.
Vor dem Falten muss das monomere TGF-β-artige Protein in einer denaturierten (d. h. nichtgefalteten) solubilisierten Form vorhanden sein. Die auf dem einschlägigen Fachgebiet gut bekannten sogen, chaotropen Mittel, die in wässriger Lösung und in geeigneten Konzentrationen die räumliche Konfiguration des jeweiligen Proteins durch Änderung an ihrer Oberfläche entweder durch Verändern des Hydratationszustands, der Lösungsmittelumgebung oder der Lösungsmittel-Oberfläche-Wechselwirkung verändern, sind in der Lage, Proteine in wirksamer Weise zu denaturieren und zu solubilisieren. Beispiele für derartige chaotrope Mittel oder Denaturierungsmittel umfassen Harnstoff, Guanidinhydrochlorid, Natriumthiocyanat in Konzentrationen in einem Bereich von etwa 4 bis etwa 9 M, sowie die Detergenzien, wie SDS, die in Konzentrationen einer Größenordnung von 0,01 bis 2% bereitgestellt werden. Ferner führt ein Ansäuern der das TGF-β-artige Protein enthaltenen wässrigen Lösung auf einen pH-Wert von etwa 2 bis etwa 4, beispielsweise mit einer ein niedriges Molekulargewicht aufweisenden aliphatischen organischen Säure, vorzugsweise mit 2, 3 oder 4 C-Atomen, in stärker bevorzugter Weise Essigsäure, sowie basische Bedingungen eines pH-Werts von beispielsweise 10 oder darüber und erhöhte Temperaturen zu einer Denaturierung und Solubilisierung des Monomers.
Das Monomer wird anschließend "Faltungsbedingungen" unterzogen, die die Gewinnung des biologisch aktiven Dimers gewährleisten. Der Ausdruck "Faltungsbedingungen" bezeichnet Bedingungen, unter denen eine Intra- und Interkettendisulfldbindungsbildung gefördert wird und zugelassen wird, dass das denaturierte Monomer eine mit der biologischen Aktivität in Verbindung stehende Konformation annimmt. Dieses Verfahren umfasst keinerlei Änderung der Primärstruktur (d. h. der Aminosäuresequenz) des Monomers, sondern betrifft die Bildung der dreidimensionalen Konformation des dimeren Produkt, die mit der biologischen Aktivität in Verbindung steht. Dieses Verfahren umfasst die Bildung von Disulfldbindungen und die Assoziation von Monomeren zu einer dimeren, biologisch aktiven Struktur.
Für diesen Zweck wird das denaturierte Monomer mit einem Faltungspuffer behandelt, der
(a) ein mildes Detergens gemäß der nachfolgenden Definition und
(b) ein organisches Lösungsmittel, das aus DMSO, DMF, DMSO&sub2; und einem beliebigen Gemisch aus zwei oder drei der aus DMSO, DMSO&sub2; und DMF bestehenden Gruppe
ausgewählt ist, bei einem neutralen oder alkalischen pH-Wert und bei einer vernünftigen Temperatur von beispielsweise zwischen etwa 0 und etwa 40ºC umfasst. Ein bevorzugter pH-Wert liegt zwischen etwa 7 und etwa 10, in stärker bevorzugter Weise ist im Falle von DMSO der pH-Wert etwa 9 bis 9,5, im Falle von DMF ist der pH-Wert etwa 8,5 und im Falle von DMSO ist der pH-Wert etwa 9,5.
Herkömmliche Puffersysteme, die zur Faltung gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind Puffer, die eine ausreichende Pufferkapazität zwischen einem pH-Wert von 6 und 10 liefern. Alle Puffer, die keine hemmende Wirkung auf die Faltung von Proteinen aufweisen, sind erfindungsgemäß einsetzbar. Beispielsweise sind geeignete Puffer Tris-, Bis-Tris- oder Piperazinpuffer. Die Puffer können darüber hinaus gewünschtenfalls ein Salz und gewünschtenfalls eine basische Aminosäure enthalten.
In dem Faltungspuffer verwendbare Salze sind beispielsweise Salze von Na&spplus;, Li&spplus;, K&spplus;, NH&sub4;&spplus;, Mg²&spplus;, Ca²&spplus; oder Mn²&spplus; mit Cl&supmin;, F&supmin;, Br&supmin;, J&supmin;, HCO&sub3;&supmin;, SO&sub4;²&supmin;, Phosphat, Acetat, Cyanat oder Rhodanid oder andere Alkalimetall- oder Erdalkalimetall-halogen- oder -pseudohalogenverbindungen in einer Konzentration von bis zu 3 M. Bevorzugt ist NaCl in einer Konzentration von 1 bis 3 M.
Eine in dem Faltungspuffer verwendbare basische Aminosäure ist beispielsweise Arginin, vorzugsweise in einer Konzentration von 0,5 M.
Die bevorzugte Konzentration von DMSO, DMSO&sub2; oder DMF für die Zwecke der vorliegenden Erfindung beträgt etwa 5% bis etwa 40%, in stärker bevorzugter Weise etwa 10 bis etwa 30%. Die noch stärker bevorzugte Konzentration von DMSO beträgt etwa 10% bis etwa 30%, noch stärker bevorzugt bis etwa 20%. Für DMF ist die noch stärker bevorzugte Konzentration etwa 10% bis etwa 30%, noch stärker bevorzugt ist etwa 10%; für DMSO&sub2; ist die noch stärker bevorzugte Konzentration etwa 10%. Gemische aus DMSO und DMF oder aus DMSO und DMSO&sub2; oder aus DMF und DMSO&sub2;, können in einer Konzentration von etwa 5% bis etwa 40%, vorzugsweise in einer Konzentration von etwa 10% bis etwa 30%, in stärker bevorzugter Weise in einer Konzentration von etwa 10% bis etwa 20% für die Lösungsmittelkombinationen verwendet werden.
Ein mildes Detergens mit Eignung zur Faltung eines Proteins der TGF-β-Überfamilie gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein beliebiges Detergens, das ein Falten des monomeren TGF-β-artigen Proteins in die räumliche Konformation gewährleistet, die nach Dimerisierung mit der biologischen Aktivität in Verbindung steht, während das Monomer in einer löslichen Form gehalten wird.
Derartige Detergenzien können nichtionisch, kationisch, anionisch oder zwitterionisch sein. Bevorzugte Detergenzien sind das nichtionische Detergens Digitonin und in stärker bevorzugter Weise die zwitterionischen Detergenzien 3-(3-Chlolamidopropyl)dimethylammonio-1-propansulfonat (CHAPS) und 3-(3-Chlolamidopropyl)dimethylammonio-2-hydroxy-I-propansulfonat (CHAPSO). Es ist ferner möglich, ein Gemisch der Detergenzien zu verwenden, beispielsweise ein Gemisch aus CHAPS und CHAPSO. Ein müdes Detergens ist vorzugsweise in dem Faltungspuffer in einer Konzentration von etwa 1 bis 100 mM, in stärker bevorzugter Weise in einer Konzentration von 30 bis 60 mM, in noch stärker bevorzugter Weise in einer Konzentration von 30 mM vorhanden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält der Faltungspuffer darüber hinaus eine reduzierende Substanz. Eine geeignete reduzierende Substanz, die die Bildung von Disulfiden in Proteinen oder Peptiden fördert, ist beispielsweise ein ein niedriges Molekulargewicht aufWeisendes Sulflwdrylreagens, das aus Glutathion in seiner reduzierten Form, Dithiotreit in seiner reduzierten Form, β-Mercaptoethanol in seiner reduzierten Form, Mercaptomethanol in seiner reduzierten Form. Cystein und Cysteamin ausgewählt ist. Das Verfahren läuft jedoch auch ab, wenn keine derartige Substanz vorhanden ist. Eine geeignete Konzentration für das Sulfhydrylreagens ist beispielsweise etwa 1 bis 100 mM, vorzugsweise etwa 1 bis 10 mM, in stärker bevorzugter Weise etwa 2,5 mM.
Die Faltung erfolgt bei vernünftigen Temperaturen, beispielsweise zwischen etwa 0ºC und etwa 40ºC, vorzugsweise bei etwa 4ºC während einer vernünftigen Zeitdauer, beispielsweise von etwa 2 bis etwa 720 h. Da die Dauer der Faltung von der verwendeten Temperatur abhängt, kann die Temperatur für jede beliebige gewünschte Faltungszeitdauer und umgekehrt optimiert werden.
Die Herstellung eines dimeren, biologisch aktiven TGF-β-artigen Proteins gemäß der vorliegenden Erfindung kann in einem einstufigen Verfahren durchgeführt werden, wobei das Monomer des Proteins in den Faltungspuffer überführt und das Reaktionsgemisch für eine Zeitdauer von beispielsweise 2 h bis 7 oder mehr Tagen bei einer Temperatur zwischen beispielsweise 0ºC und 40ºC, vorzugsweise bei 4ºC, inkubiert wird, während die Faltung und Dimerisierung kontinuierlich abläuft. Die Proteinkonzentration während der Faltungsreaktion ist von beachtlicher Bedeutung, da die Monomere, wenn die Konzentration zu hoch ist, eine merkliche Aggregation eingehen können, was zur Bildung der unerwünschten Oligomere höherer Ordnung führt. Die Endausbeuten des dimeren Produkts neben zu, wenn die Proteinkonzentration bei weniger als etwa 2 mg/l liegt, wobei ein Konzentrationsbereich von 0,01 bis 0,5 mg/ml bevorzugt ist.
Bevorzugte Beispiele von Faltungsexperimenten gemäß der vorliegenden Erfindung für die Faltung von TGF-β3 sind die folgenden:
0,1 mg/ml TGF-β3,
100 mM Tris,
gegebenenfalls 1-50 mM einer Substanz, die aus reduziertem Glutathion, Cystein, Cysteamin und β-Mercaptoethanol ausgewählt ist (das Verfahren läuft jedoch, wie oben bereits ausgeführt, auch ab, wenn kein Sulfhydrylredoxsystem vorhanden ist),
1 M NaCl,
0,5 M Arginin,
20-30% DMSO,
30 mM CHAPS oder CHAPSO.
pH 9 bis 9,5;
oder
0,1 mg/l TGF-β3,
100 mM Tris,
2,5 mM einer Substanz, die aus reduziertem Glutathion, Cystein, Cysteamin und β- Mercaptoethanol ausgewählt ist (das Verfahren läuft jedoch, wie oben bereits ausgeführt, auch ab, wenn kein Sulfhydrylredoxsystem vorhanden ist),
1 M NaCl,
0,5 M Arginin,
10% DMF,
30 mM CHAPS oder CHAPSO,
pH 8,5.
Nach dem Falten wird das biologisch aktive Dimer gereinigt, um unvollständig gefaltetes TGF-β-artiges Protein und Verunreinigungen, insbesondere Pyrogene oder andere Endotoxine, die bei der Herstellung nach Produktion des rekombinanten Proteins in mikrobiellen Wirtszellen vorhanden sein können, zu entfernen. Die Abtrennung des Dimers erfolgt durch Chromatographie, beispielsweise durch Dimensionierungsgelchromatographie, hydrophobe Wechselwirkungschromatographie oder Ionenaustauschchromatographie, beispielsweise mit einer Mono-S-Säule oder Umkehrphasen-HPLC.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner dimere biologisch aktive TGF-β-artige Proteine, wenn sie gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurden. Diese TGF-β-artigen Proteine können in verschiedenen therapeutischen Anwendungen eingesetzt werden.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung, ohne sie in irgendeiner Weise einzuschränken.

Beispiel 1:

Expression von TGF-β1, TGF-β2 und TGF-β3 in E. coli

Beispiel 1A: Allgemeine Verfahren

Bakterienstamm:

- E. coli K12/LC 137: htpRam, IonR9, Iacam, malam, trpam, phoam, rspl, tsx::Tn10, supCts (S. A. Goff et al. (1984) PNAS 81, 6647-6651).

Plasmide:

- pPLMu (G. Buell et al. (1985), Nucleic Acids Res. 13, 1923-1938): Dieses Plasmid trägt den Bacteriophagen-I-PL-Promotor mit der Phagen-Mu-ner-Genribosomenbindungsstelle (E. von Leerdam et al. (1982), Virology 123, 19-28).
- pcl&sub8;&sub5;&sub7;: Ein Plasmid mit Codierung für einen thermolabilen λcl&sub8;&sub5;&sub7;-Repressor, das eine Kanamycinresistenz überträgt (E. Remault et al. (1983), Gene 22, 103-113).

SDS-Gelelektrophorese:

Die SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) und die Proteinanfärbung erfolgen gemäß früherer Beschreibung (U. K. Laemmli (1970), Nature 227, 680-685) unter Verwendung der Miniprotean II-zellen von BIORAD und 1 mm dicken 18% Polyacrylamidgelen.

Wärmeinduktion:

7 ml LB-Medium (Maniatis et al. (1982), Molecular Cloning, Cold spring Harbor Laboratory, New York) in einem 20 ml fassenden Kulturröhrchen, das 40 ug sowohl Ampicillin als auch Kanamycin (LB/amp/kan) enthält, werden mit einer einzelnen Kolonie angeimpft und unter Schütteln über Nacht bei 30ºC inkubiert. 5 ml dieser über Nacht inkubierten Kultur werden zu 15 ml LB/amp/kan in einem 100 ml fassenden Erlenmeyer-Kolben gegeben. Dieser Kolben wird in einen Schüttler mit einem Wasserbad von 42ºC überführt. Eine 2-ml-Probe wird vor Überführung (nicht-induzierende Bedingungen) entnommen und 1-ml-Proben werden in 1-Stunden-Intervallen nach der Überführung (induzierende Bedingungen) genommen. Die Zellen werden durch Zentrifugation (5 min. 10 000/min in einer Eppendorf- Zentrifuge) pelletiert und der Überstand verworfen. Das Pellet wird in 100 ul Probenpuffer für eine SDS- PAGE resuspendiert und 10 min lang auf 95ºC erwärmt. 5 ul Allquote werden für eine SDS-PAGE aufgegeben.

Herstellung von kompetenten Zellen:

Kompetente E. coli-Zellen werden nach dem Calciumchloridverfahren gemäß Beschreibung bei Maniatis et al. (1982), Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, hergestellt. Die Zellen, die das Plasmid pcl&sub8;&sub5;&sub7; tragen, werden bei 30ºC gezüchtet.

Beispiel 1B

Konstruktion der Expressionsvektoren pPLMu.hTGF-β1, pPLMu.hTGF-β2 und pPLMu.hTGF-β3 und Expression von TGF-β1, TGF-β2 und TGF-β3

Die Codiersequenzen von TGF-β1, TGF-β2 bzw. TGF-β3 (angegeben in dem Sequenzprotokoll) werden in ein mit Ncol verdautes, mit Kalbsdarmalkaliphosphatase (Boehringer), dephosphoryllertes und mit Klenow-Polymerase (Gibco-BRL) aufgefülltes Plasmid pGem-SZF(+) (Promega) kloniert. Die erhaltenen Konstrukte werden als pGKM 125 (TGF-β1), pGKM 740 (TGF-β2) bzw. pGKM 126 (TGF-β3) bezeichnet und verwendet, um kompetente E. coli Y 1090-Zellen zu transformieren. Die korrekte Inserte mit Codierung für TGF-β1, TGF-β2 bzw. TGF-β3 tragenden Klone werden als E. co- LiY1090/pGKM 125 (TGF-β1), E. coliY1090/pGKM 740 (TGF-β2) bzw. E. coliY1090/pGKM 126 (TGF-β3) bezeichnet.
E. eoliY1090/pGKM 125-, E. coliY1090/pGKM 740- und E. coliY1090/pGKM 126-Zellen werden in LB-Medium gezüchtet und Plasmid-DNA nach dem Verfahren von H. C. Birnboim und H. Doly (1979), Nucleic Acids Research 7, 1513, hergestellt. 5 ug der Plasmid-DNA werden in 50 ml Restriktionspuffer mit entweder NcoI oder SaII (pGKM125), NcoI und EcoRV (pGKM740) oder NcoI allein (pGKM126) gemäß dem Empfehlungen des Herstellers (Boehringer) vollständig geschnitten. Die DNA wird durch Zugabe von 5 ul 3 M Natriumacetat, 100 mM MgCl&sub2;, 5 mM EDTA und 150 ul Ethanol gefällt. Nach 15-minütiger Inkubation bei -70ºC wird die DNA durch Zentrifugation bei 13 000 g während 15 min in einem SS34-Rotor in einer Sorvall-Zentrifuge pelletiert. Der Überstand wird verworfen und das Pellet in 80 ul 0,089 M Tris-Borat,0,089 M Borsäure und 0,002 M EDTA (TBE-Puffer), der 0,25% Bromphenolblau und 0,25% Xylolcyanol enthält, resuspendiert. Viermal 20 ul-Proben werden durch ein 1% Agarosegel in TBE-Puffer, der 0,5 ug/ml Ethidiumbromid enthält, bei 50 Volt elektrophoresiert, bis der Bromphenolblaumarker den Boden des 10 em langen und 0,8 cm dicken Gels erreicht. Die DNA- Fragmente mit Codierung für reifes TGF-β1, TGF-β2 bzw. TGF-β3 werden unter kurzwelligem UV- Licht sichtbar gemacht, mit einer Rasierklinge ausgeschnitten und aus dem Gelstück in einer Schleicher & Schüll Biotrap-Vorrichtung unter Anlegen von 200 mamp während 1,5 h elektroeluiert. Die eluierten DNA-Fragmente werden (wie oben) gefällt und in 20 ul TE resuspendiert.
5 ul Plasmid pPLMu werden durch Verdauung mit entweder NcoI und SalI, NcoI und EcoRV oder NcoI alleine linearisiert und gemäß obiger Beschreibung für die Fragment-DNAs einer Gclreinigung unterzogen. 100 ng der linearisierten und gereinigten pPLMu-Vektor-DNA und das dreifache Moläquivalent der jeweiligen gereinigten Fragment-DNA werden bei 4ºC während 15 h in 20 ul Ligationspuffer (70 mM TRIS/HCl, pH-Wert 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 5 mM DTT, 0,1 mM Adenosintriphosphat), der 1 Einheit DNA-Ligase (Boehringer) enthält, inkubiert.
10 ul des Ligationsgemisches werden zu 200 ul kalten (4ºC) kompetenten E. coli LC 137- Zellen, die das Plasmid pcl&sub8;&sub5;&sub7; tragen, zugegeben. Nach 30 min werden die Zellen durch 1,5-minütige Inkubation in einem 42ºC warmen Wasserbad einer Wärmeschockbehandlung unterzogen. 2 ml LB- Medium werden zugegeben, worauf die Kultur 60 min lang bei 30ºC geschüttelt wird. 200 ul Aliquote werden auf LB-Platten plattiert, die Ampicillin und Kanamycin enthalten, und 22 h lang bei 30ºC inkubiert. Einzelne Kolonien werden kultiviert und Plasmid-DNA wird analysiert. Ein Subklonieren der DNA-Fragmente mit Codierung für TGF-β1, TGF-β2 bzw. TGF-β3 in pPLMu führt zu den Plasmiden pPLMu.hTGF-β1, pPLMu.hTGF-β2 bzw. pPLMu.hTGF-β3. Klone, die die obigen Konstrukte enthalten, werden als E. coli LC 137/pPLMu.hTGF-β1, E. coli LC 137/pPLMu.hTGF-β2 bzw. E. coli LC 137/pPLMu.hTGF-β3 bezeichnet.
E. coli LC 137/pPLMu.hTGF-β1-, E. coli LC 137/pPLMu.hTGF-β2- und E. coli LC 137/pPLMu.hTGF-β3-Zellen werden wärmeinduziert (vgl. Beispiel 1A) und die exprimierten Proteine durch SDS-PAGE analysiert. TGF-β1, TGF-β2 und TGF-β3 erscheinen alle 2 h nach der Wärmeinduktion als wärmeinduzierte Proteine, die mit einer scheinbaren Molekülmasse von etwa 12 000 Da wandern.

Beispiel 1C:

Fermentation von Transformanten

Übernachtkulturen von E. coli LC 137/pPLMu.hTGF-β1, E. coli LC 137/pPLMu.hTGF-β2 und E. coli LC 137/pPLMu.hTGF-β3 in 2 l fassenden Erlenmeyer-Kolben, die 750 ml LB-Medium zusammen mit 40 mg/l Ampicillin und Kanamycin enthalten, werden bei 30ºC gezüchtet. 300 ml der Übernachtkulturen werden zu 75,0 ml LB-Medium, das Antibiotika gemäß den obigen Ausführungen enthält, in 2 l fassenden Erlenmeyer-Kolben zugegeben und das Ganze durch etwa 3,5-minütiges Schütteln in einem 65ºC warmen Wasserbad auf 42ºC erwärmt. Die Kolben werden anschließend in einen 42ºC warmen Schüttler überführt und 3 h inkubiert. Die Kolben werden danach in einem Eiswasserbad auf 12 ºC abgekühlt und die Zellen nach Zentrifugation während 10 min bei 8 000/min in einem GSA-Rotor (Sorvall) gesammelt.

Beispiel 2:

Expression von TGF-β1, TGF-β2 und TGF-β3 in Saccharomvces cerevisiae

Die Codicrsequenzen von reifem TGF-β1, TGF-β2 und TGF-β3 werden in Saccharomyces cerevisiae unter der Steuerung eines induzierbaren Promotors einer sauren Hefephosphatase (PHOS) exprimiert.
Die Expressionsvektoren werden in zwei Stufen konstruiert:
A. Konstruktion eines Plasmids pJDB207/PHOS-RIT 12;
B. Konstruktion der Plasmide pJDB207R/PHOS-TGF-β1, pJDB207R/PH05-TGF-β2 und pJDB207R/PH05-TGF-β3,
wobei A) den Hefevektor und den PHOS-Transkriptionsterminator liefert und B) die Expressionskassetten mit einem Insert mit Codierung für reifes TGF-β1. TGF-β2 bzw. TGF-β3 unter der Steuerung des PH05-Promotors liefert.

Beispiel 2A:

Konstruktion des Plasmids pJDB207/PHOS-RIT 12

Das Plasmid p31RT 12 (EP-A-0 277 313) wird mit der Reduktionsendonuclease SaII linearisiert. Ein teilweiser HindIII-Verdau in Gegenwart von Ethidiumbromid führt zu einem 1 kb großen SalI/HindIII-Fragment, das die 276 bp große Sall/BamHI-pBR322-Sequenz, den 534 bp großen Promotor der sauren Hefephosphatase PHOS, die Hefeinvertasesignalsequenz (mit Codierung für 19 Aminosäuren) und den PHOS-Transkriptionsterminator umfasst.
Das 1 kb große SalI/HindIII-Fragment von p31RIT 12 wird in den Hefe-W.coli- Shuttlevektor pJDB207 (J. D. Beggs in: Molecular Genetics in yeast, Alfred Benzon Symposium 16, Kopenhagen, 1981, S. 383-389) kloniert, der mit SaII und MmdlindIII geschnitten wurde. Das erhaltene Plasmid, das das 1 kb große Insert enthält, wird als pJDB207/PH05-RIT 12 bezeichnet.

Beispiel 2B:

Konstruktion des Plasmids pJDB207R/PH05-TGF-β3

Das Plasmid pGKM740 (TGF-β3) (vgl. Beispiel 1B) wird mit NcoI geschnitten. Die klebrigen Enden werden in einer Reaktion mit Klenow-DNA-Polymerase gefüllt. EcoRI-Linker (5'- CCGGAATTCCGG; Biolabs) werden zugegeben und das Gemisch ligiert. Das erhaltene kreisförmige Plasmid wird als pGKMA668 (TGF-β3) bezeichnet und mit EcoRI und SaII geschnitten. Ein 0,4 kb großes EcoRI/SalI-Fragment wird aus einem Agarosegel isoliert, gereinigt und in sterilem Wasser in einer Konzentration von 25 ug/ml resuspendiert. Das Fragment enthält die reife Codiersequenz für TGF-β3 mit einem ATG im Rahmen zum Codon GCT, das die Aminosäure Ala 1 von reifem TGF-β definiert.
Der PH05-Promotor wird aus dem Plasmid p31RIT 12 (vgl. oben) auf einem 534 bp großen BamHI/EcoRI-Fragment isoliert. Das Plasmid pJDB207/PH05-RIT 12 wird mit BamHI und XhoI geschnitten. Das große, 6,8 kb BamHI/XhoI-Fragment wird isoliert. Der PH05-Transkriptionsterminator verbleibt in dem Fragment. Das BamHI/EcoRl PH05-Promotorfragment, das EcoRI/SaII-Frngment mit Codierung für TGF-β3 und das BamHIIXhoI-Vektorfragment werden ligiert. Ein korrektes Klon mit dem TGF-β3-Gen unter der Steuerung des PH05-Promotors, der in Gegenuhrzeigerorientierung in pJDB207 kloniert wurde, wird als pJDB207R/PH05-TGF-β3 bezeichnet.
In analoger Weise werden reifes TGF-β1 und TGF-β2 in S. cerevisiae exprimiert. Die die Codiersequenzen von TGF-β1 bzw. TGF-β3 enthaltenden Plasmide sind pGKM 125 bzw. pGKM 126 (vgl. Beispiel 1B). Nach Verdauung dieser Plasmide mit NcoI, Zugabe der EcoRI-Linker und Ligation werden die erhaltenen kreisförmigen Plasmide mit EcoRI und SaII geschnitten. Die EcoR1- und Sall-Fragmente werden gemäß obiger Beschreibung in pJDB207 kloniert. Die erhaltenen Plasmide werden als pJDB207R/PH05-TGF-β1 bzw. pJDB207R/PH05-TGF-β3 bezeichnet.

Beispiel 2C:

Transformation des S. cerevisiae-Stamms GRF 18

Der Saccharomyces cerevisiae-Stamm GRF18 (MATα, his3-11, his3-15, leu2-3, leu2-112, canR, DSM 3665) wird unter Verwendung des bei A. Hinnen et al. (1978) PNAS 75, 1929, beschriebenen Transformationsprotokolls mit den Plasmiden
pJDB207R/PH05-TGF-β1,
pJDB207R/PH05-TGF-β2,
pJDB207R/PH05-TGF-β3
transformiert. Transformierte Hefezellen werden auf Hefeminimalmediumplatten, denen Leucin fehlt, ausgewählt. Einzelne transformierte Hefekolonien werden isoliert und als
Saccharomyces cerevisiae GRF 18/pJDB207R/PH05-TGF-β1
Saccharomyces cerevisiae GRF 18/pJDB207R/PH05-TGF-β2 und
Saccharomyces cerevisiae GRF 18/pJDB207R/PH05-TGF-β3
bezeichnet.

Beispiel 2D:

Fermentation von S. cerevisiae-Transformanten und Herstellung von Zellextrakten

Die Hefetransformanten gemäß den obigen Ausführungen enthalten Plasmide mit Expressionskassetten unter PH05-Promotorsteuerung und erfordern folglich eine Derepression des Promotors für die Expression von TGF-β1, TGF-β2 oder TGF-β3. Transformanten werden jeweils in zwei aufeinanderfolgenden Vorkulturen (10 ml und 50 ml) in Hefeminimalmedium mit hohem Pj, das gemäß der Rezeptur des Difco Yeast Nitrogen Base-Mediums ohne Aminosäuren hergestellt wurde, aber 10 g/l L-Asparagin anstelle von (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 1 g/l L-Histidin und 20 g/l Glucose enthält, gezüchtet. Die Zellen der zweiten Vorkultur werden in 0,9% NaCl gewaschen und alle Zellen zum Animpfen von 100 ml eines Minimalmediums mit niedrigem Pi verwendet, das gemäß der Rezeptur des Difco Yeast Nitrogen Base-Mediums (ohne Aminosäuren) hergestellt wurde, aber 0,03 g/l KH&sub2;PO&sub4;, 10 g/l L-Asparagin, 1 g/l L-Histidin und 20 g/l Glucose enthält. Die Kulturen werden bei 30ºC und 180/min gerührt.
Zellen aus 10 ml der Kultur werden nach 5 h, 24 h bzw. 48 h durch Zentrifugation bei 3000/min gesammelt und einmal in 0,9% NaCl gewaschen. Das Zellpellet wird in Lysepuffer [66 mM Kaliumphosphat eines pH-Werts von 7,4, 4 mM Zwittergent (Calbiochem)] resuspendiert. 8 g Glasperlen (0,5-0,75 mm Durchmesser) werden zugegeben und die Suspension kräftig 4- bis 5-mal jeweils 2 min lang in einem Vortex-Mischer in der Kälte geschüttelt. Das Zellextrakt wird abdekantiert, um die Glasperlen zu entfernen. Die Zellbruchstücke im Extrakt werden durch 5-minütiges Zentrifugieren bei 3000/min bei 4ºC sedimentiert. Der Überstand und die Pellets werden getrennt und bei -20ºC aufbewahrt.

Beispiel 3

Beispiel 3A:

Gewinnung nichtlöslicher, monomerer TGF-β3 aus E. coli

E. coli LC 137/pPLMu.hTGF-β3-Zellen werden gemäß Beschreibung in Beispiel 1C fermentiert. Das Zellauibrechen und die Gewinnung von nichtlöslichem TGF-β3 erfolgen bei 4ºC. Etwa 18 g der nassen Zellen werden in 60 ml 0,1 M TRIS/HCl, 10 mM EDTA, 1 mM PMSF (Phenylmethansulfonylfluorid), pH-Wert 8,3 (Spaltungspuffer) suspendiert. Die Zellen werden zweimal durch eine "Frenchpresse" (SLM-Instruments, Inc.) gemäß den Instruktionen der Hersteller geführt und das Volumen mit dem
Spaltungspuffer auf 200 ml gebracht. Die Suspension wird 20 min lang bei 15 000 g zentrifugiert. Das erhaltene Pellet wird in 100 ml Spaltungspuffer, der 1 mol NaCl enthält, suspendiert und das Ganze 10 min lang wie oben zentrifugiert. Das Pellet wird in 100 ml Spaltungspuffer, der 1% Triton X- 100 (Pierce) enthält, suspendiert und das Ganze abermals 10 min lang wie oben zentrifugiert. Das gewaschene Pellet wird anschließend in 50 ml aus 20 mM Tris/HCl, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF und 1% DTT suspendiert und in einer Teflongewebemahlvorrichtung homogenisiert. Die erhaltene Suspension enthält rohes monomeres TGF-β3 in einer nichtlöslichen Form.

Beispiel 3B:

Solubilisierung und Reinigung von monomerem TGF-β3

10 ml der gemäß Beispiel 3A erhaltenen TGF-β3-Suspension werden mit 10% Essigsäure auf einen pH-Wert von 2,5 angesäuert und das Ganze 10 min lang bei Raumtemperatur in einer Eppendorf-Zentrifuge zentrifugiert. Der Überstand wird über eine Sephacryl S-100-Säule (Pharmacia, 2,6 · 78 cm) in 10% Essigsäure bei einer Strömungsrate von 1,4 ml/min chromatographiert. (Alternativ kann die Chromatographie auf einer Sephacryl S-100HR-Säule (Pharmacia) durchgeführt werden und die Säule kann mit 1% Essigsäure oder 5 mM HCl betrieben werden). Fraktionen, die monomeres denaturiertes TGF-β3 enthalten, das bei 190-220 min eluiert wird, werden gepoolt. Dieses Material wird zur Faltung, um biologisch aktives dimeres TGF-β3 (Beispiel 4) zu erhalten, oder für eine weitere Reinigung und Strukturanalyse (Beispiel 3D) verwendet.

Beispiel 3C:

Gewinnung von monomerem TGF-133 aus Saccharomyces cerevisiae

Das Pellet der aufgebrochenen Zellen, das aus einer wie oben beschrieben durchgeführten 500 ml-Fermentation erhalten wurde, wird in 20 ml 4 M Harnstoff, 0,1 M TRIS und 1% DTT eines pH- Werts von 8,0 suspendiert. Das Gemisch wird 30 min lang bei Raumtemperatur gehalten, wobei alle 5 min ein intermittierendes Durchwirbein erfolgt. Unlösliches Material wird durch 30-minütiges Zentrifugieren bei 30 000 g bei 4ºC entfernt und der Überstand mit Essigsäure auf einen pH-Wert von 2,5 eingestellt. Anschließend erfolgt ein ausgiebiges Dialysieren gegen 5% Essigsäure über Nacht bei 4ºC. Die Lösung wird wie oben zentrifugiert und der klare Überstand durch Ultrafiltration mit einer YM-10- Membran (Amicon) auf ein Endvolumen von 4 ml eingeengt. Die Probe wird anschließend auf einer Sephacryl S-100 HR-Säule (Pharmacia) in 5% Essigsäure gemäß Beschreibung in Beispiel 3 chromatographiert, wobei monomeres TGF-β3 erhalten wird.

Beispiel 3D:

Weitere Reinigung von monomerem TGF-β3 durch RP-HPLC

Allquote der gepoolten Fraktionen aus der Sephacryl S-100-Säule (Beispiel 3B) werden auf einer Vydac 214TP5415-HPLC-Umkehrphasensäule (4,6 · 150 mm, The Separations Group, Hesperia, CA. USA) gereinigt. Die Säule wird in einem Gemisch aus 70% TFA 0,1% in Wasser und 30% TFA 0,08% in Acetonitril equilibriert und das Produkt durch einen linearen Gradienten im Verlauf von 30 min. der mit einem Gemisch von 55% TFA 0,1% in Wasser und 45% TFA 0,08% in Acetontril endet, bei einer Strömungsrate von 1 ml/min eluiert. Das Eluat wird bezüglich Absorption bei 216 nm überwacht und einzelne Peaks manuell gemäß UV-Absorption gesammelt.
Denaturiertes, monomeres TGF-β3 wird bei 21,5 min eluiert. In Abhängigkeit von der zur Trennung verwendeten individuellen Umkehrphasensäule wird dieselbe Zubereitung von TGF-β3 bei etwa 16 bzw. 18 min eluiert.
TGF-β3-Fraktionen werden durch RP-HPLC unter Verwendung der oben beschriebenen Säule und des oben beschriebenen Lösungsmittelsystems analysiert. TGF-β3 wird durch einen linearen Gradienten im Verlauf von 42 min. der mit 100% TFA 0,1% in Wasser startet und mit einem Gemisch aus 30% TFA in Wasser und 70% TFA 0,08% in Acetonitril endet, eluiert. TGF-β3 wird als einzelner Peak nach 30,4 min eluiert. In Abhängigkeit von der verwendeten jeweiligen Säule werden Retentionszeiten von 29 min bzw. 29,9 min erreicht.

Beispiel 3E:

Analyse von monomerem TGF-β3 durch SDS-PAGE

Individuelle Aliquote der Sephacryl S-100-Säule (Beispiel 3B) oder der Umkehrphasensäule (Beispiel 3D) werden im Vakuum getrocknet und durch SDS-PAGE auf 15% Polyacrylamidplattengelen, die mit Coomassieblau R-250 gefärbt sind, analysiert. Eine einzelne Bande einer offensichtlichen Molekularmasse von etwa 12 000 Da wird erhalten, die von reduziertem natürlichem Schweine-TGF-β3 nicht unterscheidbar ist.

Beispiel 3F:

N-terminale Aminosäuresequenzbestimmung von monomerem TGF-β3

TGF-β aus Beispiel 3B wird im Vakuum eingedampft, in 25 ul 0,1 M Essigsäure gelöst und einer Aminosäuresequenzbestimmung auf einem Gasphasenproteinsequenziergerät Modell 470A (Applied Biosystems) unterzogen.
Die N-terminale Aminosäuresequenz ist identisch mit der im Sequenzprotokoll unter SEQ ID Nr. 6 gezeigten Sequenz.

Beispiel 4:

In-vitro-Faltung TGF-β3

Das oben erhaltene TGF-β3 wird bei 4ºC in einem Puffer aus 0,1 M Tris, 30 mM CHAPS, 1 M NaCl, 5 mM reduziertem Glutathion und 20% (v/v) DMSO gefaltet. Wenn nötig wird der pH-Wert des Puffers mit NaOH auf 9,5 eingestellt. Die Endkonzentration von TGF-β3 beträgt 0,1 mg/ml. Nach 7 Tagen bei 4ºC wird die Lösung mit konzentrierter Essigsäure auf 3,5 angesäuert und etwa 10-mal durch Ultrafiltration in einer gerührten Amiconzelle mit YM 10-Membran (Amicon) konzentriert. Die konzentrierte Lösung wird mit 0,1 M Essigsäure auf das ursprüngliche Volumen verdünnt und wieder konzentriert. Das Vorgehen wird zweimal wiederholt. Die Lösung wird anschließend gemäß Beschreibung von Beispiel 5 einer Ionenaustauschchromatographie unterzogen.

Beispiel 5:

Isolierung von dimerem, biologisch aktivem TGF-β3 durch Kationenaustauschchromatographie

Die in Beispiel 4 erhaltene Lösung, die zwischen etwa 10 und 50 mg TGF-β3 enthält, wird bei 6 ml/min auf eine HiLoad 26/10 S-Sepharose-High-Performance-Säule (Pharmacia) aufgegeben. Die Säule wird zuerst mit 20 mM Natriumacetat, 30% Isopropanol, pH-Wert 4,0 (Puffer A) während 5 min gewaschen und anschließend mit einem linearen Gradienten im Verlauf von 45 min. der mit Puffer A, der 0,2 M NaCl enthält, gestartet und mit Puffer A, der 0,5 M NaCl enthält, endet, eluiert. Das Eluat wird bei 280 nm überwacht und von Hand fraktioniert. Die Fraktionen werden bezüglich dimerem TGF-β3 durch nicht-reduzierende SDS-PAGE und bezüglich biologischer Aktivität durch einen In-vitro-Bioassav untersucht.

Beispiel 6:

Weitere Reinigung und Charakterisierung von dimerem TGF-β3

Beispiel 6A:

Weitere Reinigung durch RP-HPLC

Fraktionen, die das dimere, biologisch aktive TGF-β3 enthalten, werden gepoolt, gegen 0,1 M Essigsäure dialysiert oder mit demselben Volumen 0,1% TFA in Wasser verdünnt und einer RP- HPLC-Chromatographie auf einer Vydac-214TP510-Säule (1 cm · 25 cm, The Separations Group. USA) unterzogen. Die Säule wird bei einer Strömungsrate von 4,5 ml/min mit einem Gemisch aus 75% Lösungsmittel A (TFA 0,1% in Wasser) und 25% Lösungsmittel B (TFA 0,08% in Acetonitril) equilibriert. Nach Beladen der Säule mit der Probe erfolgt ein Waschen unter Equilibrierungsbedingungen, bis die Absorption, die bei 235 nm überwacht wird, das Basislinienniveau erreicht hat. Die Säule wird anschließend innerhalb von 30 min mit einem linearen Gradienten, der bei Equilibrierungsbedingungen startet und mit einem Gemisch aus 45% Lösungsmittel A und 55% Lösungsmittel B endet, eluiert. Das Eluat wird von Hand fraktioniert und durch nicht-reduzierende SDS-PAGE und durch in-vitro-Bioassay analvsiert.

Beispiel 6B:

Analyse durch SDS-PAGE

Aliquote des gereinigten TGF-β3 von Beispiel 6 werden im Vakuum getrocknet und durch SDS-PAGE auf 15% Polyacrylamidplattengelen, die mit Coomassieblau R-250 angefärbt sind, analysiert. Die nicht-reduzierten Proben zeigen eine einzelne Bande eines scheinbaren Molekulargewichts von etwa 25 kDa, während die reduzierten Proben eine Bande bei etwa 12,5 kDa zeigen.

Beispiel 6C:

Molekülmassenbestimmung

Gereinigtes TGF-β3 von Beispiel 6A wird durch Elektro- sprayionisationsmassenspektrometrie (ESI-MS) analysiert. Die festgestellte Gesamtmasse kommt dem theoretisch erwarteten Wert sehr nahe.

Beispiel 6D:

Aminosäureanalyse

Die Aminosäureanalyse erfolgt gemäß Beschreibung bei R. Knecht und J.-X. Chang, Analytical Chemistry 58 : 2375-2379 (1986). Die Ergebnisse stehen in guter Übereinstimmung mit der Theorie.

Beispiel 6E:

N-terminale Aminosäuresequenzbestimmung

10-20 mg TGF-β3 von Beispiel 6A werden im Vakuum eingedampft, in 25 ml 10 mM Essigsäure gelöst und einer Aminosäuresequenzbestimmung auf einem Gasphasensequenziergerät Modell 477A (Applied Biosystems) unterzogen. Die Aminosäuresequenz der ersten 10 bestimmten Reste war die theoretisch erwartete.

Beispiel 6F:

Proteolytische Fragmentierung mit Asp-N-Protease

92 mg (6,7 nmol) TGF-β3 werden reduziert, 4-vinylpyridylethyliert, in einer Vakuumzentrifuge getrocknet und in 200 ml 5 mM HCl wieder aufgelöst. 200 ml 0,2 M Tris-Acetatpuffer eines pH- Werts von 7, 8, der 10 mM Zwittergent-3-12-detergens (Calbiochem Corporation. La Jolla, CA) enthält, wird zugegeben und mit der Proteinlösung gemischt. Die Spaltung erfolgt mit 2 mg (gelöst in 50 ml Wasser) Endoproteinase Asp-N (aus einer Pseudomonas fragi-Mutante, Sequenzierreinheit, Boehriger Mannheim Biochemica, BRD) bei 37ºC. Nach 13 h werden 50 ml 10% (v/v) TFA zugegeben und das Gemisch durch RP-HPLC-Chromatographie auf einer Vydac-218TP5415-Säule (4,6 mm · 150 mm, The Separations Group) mit einem linearen Gradienten von 5-45% (v/v) Acetonitril in 0,1% TFA/Wasser in 40 min bei einer Strömungsrate von 0,1 ml/min getrennt. Isolierte Peptide werden durch Elektrospravionisationsmassenspektroskopie (ESI-MS) analysiert. Die bestimmten Molekülmassen stehen in guter Übereinstimmung mit den berechneten Werten für die erwarteten Asp-N-Fragmente.
Die identifizierten Fragmente decken die vollständige Aminosäuresequenz ab. mit der Ausnahme der Reste 1 und 2. Diese Aminosäuren werden durch die N-terminale Sequenzbestimmung des gesamten Proteins und durch Analyse der V8-Fragmente identifiziert.

Beispiel 6G:

Proteolytische Fragmentierung mit V8-Protease

Ähnliche Experimente 9 mit Asp-N-Protease wird 4-vinylpyridyliertes TGF-β3 mit Protease V8 verdaut und die Fragmente durch RP-HPLC getrennt und durch ESI-MS analysiert. Die bestimmten Molekülmassen stehen in guter Übereinstimmung mit den theoretischen Werten, so dass die Identität von TGF-β3 weiter bestätigt wird. Die identifizierten Fragmente decken die Gesamtsequenz der 112 Aminosäurereste ab.

Beispiel 7:

In-vitro-Aktivitätstest für gefaltetes TGF-β: Nerz-Lungenepithelzellen (Mv-1-Lu)-saure Phosphatase-Assay.

TGF-β oder Hybrid-TGF-β wird in vitro in einem Zellbioassay gescreent, der die Wirksamkeit der Verbindung bei der Hemmung des Wachstums einer kontinuierlichen Nerz-Lungenepithelzelllinie Mv-1-Lu (ATCC/CCL64) misst. Die Mv-1-Lu-Zelllinie hat sich als empfindlicher Reporter in dem Bioassay bezüglich TGF-βs erwiesen, die eine sigmaoidförmige Konzentrationsreaktion bei einem berichteten EC50-Wert von etwa 10-50 pg/ml liefert (Tucker et al., Science 1984; 226: 70-707; Asher et al., J. Immunol. Methods 1991; 138 : 301-303; Danielpour et al., J. Cell. Physiol. 1989: 138: 79- 86). Mv-1-Lu-Zeilen, deren Proliferation durch TGF-β stark gehemmt wird, wird gegenwärtig als die Zeltlinie angesehen, die sich für die Entwicklung eines analytischen Bioassays für dieses Cytokin am meisten eignet (Kelley et al., Exp. Lung Res. 1992; 18 : 877-887; J. Meager, J. Immunol. Methods 1991; 141 : 1-14). Der Assay wird in 96 Ausnehmungen aufweisenden Mikrotiterplatten unter Verwendung von Zellen, die ursprünglich bei Durchgang 46 von der American Type Culture Collection, Rockville MD, USA, erhalten wurden, durchgeführt. Die Zellen werden bei einer niedrigen Dichte (5000 Zellen pro Ausnehmung) in Wachstumsmedium (Minimalessentialmedium mit 5% (v/v) fötalem Kalbsserum), das serielle Verdünnungen eines TGF-β-Standards oder eine TGF-β-Probe enthält, angesetzt. Die Assavs werden anschließend bei 37ºC in einem befeuchteten 5% CO&sub2;-Inkubator 72 h lang inkubiert. Die Hemmung der Zellproliferation wird durch ein empfindliches enzymatisches Zellfärbeverfahren (die eine kolorimetrische Schätzung der Menge der in jeder Ausnehmung gebildeten sauren Phosphatase liefert) bestimmt, wobei die Intensität der Färbung der Zahl der in jeder Ausnehmung vorhandenen Zellen entspricht. Der Extinktions-O.D.-Wert einer jeden Ausnehmung wird bei 405 nm bestimmt und die Assavdaten graphisch aufgetragen und mit Hilfe eines geeigneten PC-Softwareprogramms analysiert. Bei diesem Assay bezeichnet eine Einheit(U)-Aktivität die Menge an TGF-β, die für die halbmaximale Hemmung einer Mv-1-Lu-Zellproliferation erforderlich ist.

Beispiel 8:

In-vivo-Aktivitätstests für gefaltetes TGF-β3

Beispiel 8A:

Heilung von Teilhautwunden bei alten Mäusen

Es ist bekannt, dass Wundheilungsprozesse mit fortschreitendem Alter beeinträchtigt werden und folglich die Hauptprobleme auf dem Gebiet der gematrischen Medizin darstellen. Folglich werden die biologischen in-vivo-Effekte des gefalteten, aktiven, dimeren TGF-β3 auf die Heilung von Teilhauhvunden (entstanden durch Verbrennungen 2. Grades) in teilweise mangelhaften oder beeinträchtigten Wundenreparatursituationen, d. h. bei alten Tieren unter Verwendung des folgenden Protokolls untersucht:
Einzelne mitteldermale thermische Verletzungen werden auf dem dorsalen Thorax von anästhesierten, alten C57/BL6-Mäusen (Alter 450 Tage oder mehr), deren Rücken zuvor rasiert und mit einem kommerziellen Haarentferner vom Cremetyp epiliert wurden, durch einmalige 10 s lange Applikation einer Messingschablone (1 · 1 cm, 8 g), die in einem Wasserbad auf 80ºC equilibriert worden war, verursacht. Die entstandene Blase wird chirurgisch entfernt und die Verbrennungen täglich 5 Tage lang durch topische Applikation von 25 ml steriler Trägerpufferlösung (aus 0,8% g/v Hydroxypropylcellulose in einer Lösung aus 10 mlvi Histidin, 140 mM NaCl eines pH-Werts von 7,4), die wechselnde Mengen (500 ng, 100 ng oder 10 ng) des gefalteten aktiven dimeren TGF-β3 enthält, oder mit Pufferlösung alleine behandelt oder unbehandelt gelassen. Alle topisch applizierten Materialien sind steril, endotoxinfrei und pyrogenfrei. Alle Mäuse werden während der Dauer des Experiments in Einzelkäfigen gehalten. Jede Experimentengruppe besteht aus 5 Tieren.
Nach 5-tägiger Behandlung mit TGF-β3 werden die Mäuse anästhesiert, die Blasen (falls vorhanden) chirurgisch von den Verbrennungen entfernt und die Verbrennungen photographiert. Die Verbrennungsflächen, die Epithel neu bildeten, sind auf einem eine gleichmäßige Dicke aufweisenden, transparenten Overhead-Projektorfilm umrissen, wobei der Prozentsatz einer jeden ursprünglichen Verbrennungsfläche, die geheilt wurde, durch Planimetrie berechnet wird. Die Ergebnisse werden auch mit dem Epithelregenerationsprozess bei jungen (56-84 Tage alten) C57/BL6-Mäusen mit identischen mitteldermalen Verbrennungen, die während der Dauer des Experiments unbehandelt blieben, verglichen.
Die Ergebnisse der planimetrischen Analysen zeigen, dass eine topische Applikation von gefaltetem aktivem dimerem TGF-β3 täglich während 5 Tagen in einem geeigneten Trägerpuffer die Epithelregeneration bei Teilhautwunden bei alten Mäusen in einer dosisabhängigen Weise bei Vergleich mit lediglich Trägerpuffer oder unbehandelten Wunden stimuliert und beschleunigt. Junge Mäuse sind offensichtlich funktionsfähig bzw. kompetent genug, um ihre Wunden in Abwesenheit von jeglichem topisch appliziertem TGF-β3 erfolgreich zu reepithelisieren. Histologische Analysen zeigen das Ausmaß des erhöhten Reepithelisierungsprozesses zusammen mit einer Hyperkeratose der regenerierten Epidermis am 6. Tag bei mit TGF-β3 behandelten Wunden.

Beispiel 8B:

Heilung von Vollhautwunden bei erwachsenen Ratten

Die biologischen Effekte von gefaltetem, aktivem, dimerem TGF-β3 werden ferner in einem zweiten In-vivo-Modell einer Wundenreparatur, d. h. bei der Heilung von Vollhautwunden (ausgebildet durch operative Schnitte) bei erwachsenen Ratten unter Verwendung des folgenden Protokolls untersucht, das dem einen bei T. A. Mustoe et al. (1987), Science 237: 1333 beschriebenen ähnelt.
Einzelne 5 cm lange lineare Vollhautschnitte werden mit Operationsmessern 1,5 cm auf beiden Seiten der Rückenmittellinie von mit Pentobarbiton anästhesierten männlichen Wistar-Ratten (300 -350 g), deren Rücken zuvor rasiert und mit einem im Handel erhältlichen Haarentferner vom Cremetyp depiliert worden waren, durchgeführt. Bei den experimentellen Gruppen erhielten die Ränder der Schnitte auf der linken Seite (bei Betrachtung mit der Rückenseite nach oben) eine einzelne topische Applikation (100 ml) mit sterilem Trägerpuffer (aus 0,8% g/v Hydroxypropylcellulose in einer Lösung aus 10 mM Histidin, 140 mM NaCl eines pH-Werts von 7,4), der wechselnde Mengen (2 mg, 1 mg, 0,1 mg oder 0,01 mg) eines gefalteten, aktiven, dimeren TGF-β3 enthält. Ränder der auf der entgegengesetzten Seite liegenden Schnitte auf der rechten Seite erhielten entsprechende gleiche Mengen einer Placebokontrolle (Rinderserumalbumin) in dem Trägerpuffer und Ränder der Schnitte bei Vergleichstieren erhielten Trägerpuffer alleine bei den Schnitten auf der linken Seite und keine Behandlung bei den Schnitten auf der rechten Seite nach dem operativen Schneiden. Alle topisch applizierten Materialien sind steril, endotoxinfrei und pyrogenfrei. Die Ränder einer jeden Wunde werden anschließend mit 5 gleichmäßig angeordneten, unterbrochenen horizontalen Matrazennähten aus 5-0-Ethilon angenähert. Alle Tiere befinden sich in getrennten Käfigen, wobei die Wunden wechselnde Zeiträume bis zu einschließlich 21 Tagen nach Behandlung heilen gelassen werden. Nach dem Töten wird die gesamte dorsale Haut bei jedem Tier entfernt und alles subkutane Fett sorgfältig von der Unterseite einer jeden der Häute mittels eines chirurgischen Messers disseziert. Anschließend wird eine Matrize aus zwei parallelen chirurgischen Klingen (8 mm Abstand zwischen den Klingen) verwendet, um Streifen der Haut (zwischen den Nähten bei jedem Schnitt) für Zugfestigkeitsmessungen auszuschneiden. Proben werden von einem Ende eines jeden Schnitts für eine histologische Analyse genommen. Die maximale von jeder ausgeschnitten Hautprobe tolerierte Last wird mit einem Universalzugfestigkeitsgerät Modell 144501 (Zwick, Ulm, BRD) gemessen. Die Messungen erfolgen mit 30 mm · 8 mm großen Streifen, die zwischen hydraulischen Klammern befestigt und anschließend bis zum Reißpunkt bei einer Rate von 10 mm/min gestreckt werden, wobei die maximale Last auf einem Bandschreiber aufgezeichnet wird. Die Messungen erfolgten mit jeweils drei Proben von jeder Wunde, wobei die experimentellen Gruppen aus 4 Tieren bestanden. Die Bruchfestigkeit wird bei Wunden, die Zeichen einer Infektion oder übermäßiges Bluten (weniger als 3% aller Wunden) zeigen, nicht gemessen.
Die Ergebnisse der Zugfestigkeitsmessungen zeigen, dass eine einzelne topische Applikation von gefaltetem, aktivem, dimerem TGF-β3 in einem geeigneten Trägerpuffer die Bruchfestigkeit bis um das zweifache erhöht und die Heilung einer Vollhauteinschnittwunde bei erwachsenen Ratten in einer dosisabhängigen Weise über einen Zeitraum von 21 Tagen hinweg bei Vergleich gegen die Vergleichsgruppe beschleunigt. Histologische Analysen zeigen den deutlich erhöhten Zustrom von mononuklearen Zellen, Fibroblasten und einer Kollagenproduktion bei mit TGF-β3 behandelten Wunden über einen Zeitraum von 21 Tagen hinweg bei Vergleich mit Vergleichswunden. Eine vorübergehende Hyperkeratose ist ebenfalls bei mit TGF-β3 behandelten Wunden bis zu 14 Tage nach der Behandlung sichtbar.

Beispiel 9:

Herstellung von solubilisierten monomeren Hybrid-TGF-13-Proteinen und solubilisiertem monomerem BMP-2

Beispiel 9.1: Hybrid-TGF-β

5 ml des Plasmids pPLMu werden durch Verdauen mit NcoI und SaII linearisiert und gemäß obiger Beschreibung für die Fragment-DNAs gelgereinigt. 100 ng der linearisierten und gereinigten pPLMu-Vektor-DNA und das dreifache Moläquivalent der jeweiligen gereinigten Fragment-DNA mit Codierung für Hybrid-T1GF-β1-3, TGF-β2-3 bzw. TGF-β3-2, die in dem Sequenzprotokoll angegeben sind, werden bei 4ºC 15 h lang in 20 ul Ligationspuffer (70 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5, 10 mg McCl&sub2;, 5 mM DTT, 0,1 mM Adenosintriphosphat), der 1 Einheit DNA-Ligase (Boehringer) enthält, inkubiert.
10 ul des Ligationsgemisches werden zu 200 ul kalten (4ºC) kompetenten E. coli-LC 137- Zellen, die das Plasmid pe1857 tragen, zugegeben. Nach 30 min werden die Zellen durch 1,5-minütige Inkubation in einem 42ºC warmen Wasserbad einem Wärmeschock ausgesetzt. Es werden 2 ml LB- Medium zugegeben und die Kultur 60 min lang bei 30ºC geschüttelt. 200 ul Aliquote werden auf LB- Platten, die Ampicillin und Kanamycin enthalten, plattiert und 22 h lang bei 30ºC inkubiert. Einzelne Kolonien werden kultiviert und Plasmid-DNA wird analysiert. Ein Subklonieren der DNA-Fragmente mit Codierung für TGF-β1-3, TGF-β2-3 bzw. TGF-β3-2 in pPLMu führt zu den Plasmiden pPLMu.TGFβ1(44/45)β3, pPLMu.TGF-β2(44/45)β3 bzw. pPLMu.TGF-β3(44/45)β2. Klone, die die obigen Konstrukte enthalten, werden als E. coliLC 137/pPLMu.TGF-β1(44/45)β3, E. coliLC137/pPLMu.TGF-β2(44/45)β3 bzw. E.coliLC137/pPLMu.TGF-β3(44/45)β2 bezeichnet.
E.coliLC137/pPLMu.TGF-β1(44/45)β3, E.coliLC137/pPLMu.TGF-β2(44/45)β3 und E.coliLCl37/pPLMu.TGF-β3(44/45)β2 werden einer Wärmeinduktion (vgl. Beispiel 3A) unterzogen und die exprimierten Proteine durch SDS-PAGE analysiert. TGF-β1-3, TGF-β2-3 und TGF-β3-2 erscheinen alle 2 h nach der Wärmeinduktion als wärmeinduzierte Proteine, die mit einer scheinbaren Molekülmasse von etwa 12 000 Da wandern.
Übernachtkulturen von E. coliLC137/pPLMu.TGF-β1(44/45)β3, E. coliLC137/pPLMu.TGFβ2(44/45)β3 und E. coliLC 137/pPLMu.TGF-β3(44/45)β2 in 2 l fassenden Erlenmeyer-Kolben, die 750 ml LB-Medium zusammen mit 40 mg/l Ampicillin und Kanamycin enthalten, werden bei 30ºC gezüchtet. 300 ml der Übernachtkulturen werden zu 750 ml LB-Medium, das Antibiotika gemäß den obigen Ausführungen enthält, in 2 l fassende Erlenmeyer-Kolben zugegeben, worauf das Ganze durch etwa 3,5- minütiges Schütteln in einem 65ºC warmen Wasserbad auf 42ºC erwärmt wird. Die Kolben werden anschließend in einCn 42ºC warmen Schüttler überführt und 3 h lang inkubiert. Die Kolben werden anschließend auf 12ºC in einem Eiswasserbad abgekühlt und die Zellen nach Zentrifugation während 10 min bei 8 000/min in einem GSA-Rotor (Sorvall) gesammelt.
Das im folgenden für die Herstellung von monomerem solubilisiertem TGF-β1-3-Hybrid angegebene Vorgehen wird auch für die Solubilisierung von TGF-β2-3 und TGF-β3-2 verwendet.
E. coliLC137/pPLMu.TGF-β1(44/45)β3-Zellen werden gemäß den obigen Ausführungen fermentiert und Einschlusskörper werden wie folgt hergestellt. Ein Zellaufbrechen und Gewinnen der Einschlusskörper erfolgt bei 4ºC. Etwa 18 g der nassen Zellen werden in 60 ml 0,1 M Tris/HCl, 10 mM EDTA, 1 mM PMSF (Phenylmethansulfonylfluorid), pH-Wert 8,3 (Spaltungspuffer) suspendiert. Die Zellen werden zweimal durch eine "Frenchpresse" (SLM Instruments, Inc.) gemäß den Anleitungen der Hersteller geführt und das Volumen mit Spaltungspuffer auf 200 ml gebracht. Die Suspension wird 20 min lang bei 15 000 g zentrifugiert. Das erhaltene Pellet wird in 100 ml Spaltungspuffer, der 1 M NaCl enthält, suspendiert und 10 min lang wie oben zentrifugiert. Das Pellet wird in 100 ml Spaltungspuffer,
der 1% Triton-X-100 (Pierce) enthält, suspendiert und das Ganze abermals 10 min lang wie oben zentrifugiert.
0,3 g des gewaschenen Pellets werden anschließend in 10 ml aus 20 mM Tris/HCl, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 0,1% DTT, pH-Wert 8,0, suspendiert, worauf das Ganze mit einem Magnetrührer 1 h lang bei Raumtemperatur verrührt wird. Die Probe wird anschließend mit konzentrierter Essigsäure auf einen pH-Wert von 2,5 gebracht und danach in einem Teflongewebehomogenisator homogenisiert und in einer Centricon-H-401-Zentrifuge (Kontron Instruments) mit einem fixierten Winkelrotor A.8.24 während 60 min bei 15ºC und 12 000/min zentrifugiert. Die Essigsäure des das solubilisierte monomere TGF-β-Hybrid enthaltende klaren Überstands wird durch 10 mM HCl in einer gerührten Amicon-8010- Zelle mit YM05-Filter durch wiederholtes Einengen und Verdünnen der Lösung mit 10 mM HCl ausgetauscht.

Beispiel 9.2: BMP

Einschlusskörper, die die reife Form von BMP-2 (ursprüngliche Nomenklatur = BMP-2A) gemäß der Beschreibung bei Wozney et al., Science 242 : 1528-1534 (1988) mit der N-terminalen Sequenz Q-A-K-H-K-Q-R-K-R-L-K-S-S-C-K-R-H enthalten, werden gemäß dem üblichen Vorgehen bei E. coli mit dem T7-Polymeraseexpressionssystem hergestellt. Die zur Expression verwendete BMP-2-DNA ist im Sequenzprotokoll unter SEQ ID Nr. 13 angegeben. Das rekombinante BMP-2 besitzt ein zusätzliches Methionin am N-Terminus. In einem zweiten Ansatz wird eine Mutante von BMP-2, d. h. (-Q1)BMP-2 hergestellt, bei dem es sich um dasselbe Protein wie oben handelt, mit der Ausnahme, dass die erste Aminosäure deletiert ist und am N-Terminus kein Methionin vorhanden ist.
10 ml einer BMP-2- oder (Q1)BMP-2-Einschlusskörpersuspension werden mit 10%iger Essigsäure auf einen pH-Wert von 2,5 angesäuert und 10 min lang in einem Eppendorf-Zentrifuge bei Raumtemperatur zentrifugiert. Der Überstand wird auf einer Sephacryl-S-100-Säule (Pharmacia, 2,6 · 78 em) in 10% Essigsäure bei einer Strömungsrate von 1,4 ml/min chromatographiert. Monomeres, denaturiertes BMP-2 enthaltende Fraktionen werden gepoolt. Das gepoolte Material wird für die folgenden Rückfaltungsexperimente verwendet.

Beispiel 10:

Reihe von Rückfaltungsexperimenten mit unterschiedlichen TGF-βs, TGF-β-Hvbriden und BMP-2

Die Vielseitigkeit und breite Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung wird durch die in den folgenden beiden Serien von Beispielen zusammengefassten Ergebnisse beispielhaft veranschaulicht. Die speziellen Bedingungen und individuellen, bei den in-vitro-Proteinrückfaltungsexperimenten verwendeten Proteine sind angegeben. Die weiteren experimentellen Bedingungen sind wie in Beispiel 4 beschrieben.
Die biologische Aktivität wurde 3 und 7 Tage nach Beginn der in vitro Proteinfaltung bestimmt. Serie 1: In-vitro-Faltung mit einem organischen Lösungsmittel DMSO oder DMF in Gegenwart von CHAPS oder CHAPSO: Ergebnisse des Bioassays. Serie 1 (Fortsetzung)
RSH: Sulthydrylreagens gemäß Angabe in der Tabelle
GSH: reduziertes Glutathion
β-Me: β-Mercaptoethanol
DMF: Dimethylformamid
DMSO: Dimethylsulfoxid
β3: TGF-β3; β2: TGF-β2;
β1-3: TGF-β1-3-Hybrid, β3-2: TGF-β3-2-Hybrid, β2-3: TGF-β2-3-Hybrid
Aktivität: +: Mittlere Aktivität bei dem in Beispiel 7 beschriebenen in-vitro-Bioassav
++ Hohe Aktivität bei dem in Beispiel 7 beschriebenen in-vitro-Bioassay. Serie 2: In-vitro-Faltung von TGF-β3 in DMSO&sub2;/CHAPS und von BMP2 und (-Q1)BMP-2 in DMSO/CHAPS
GSH: Reduziertes Glutathion
DMSO: Dimethylsulfoxid
DMSO&sub2;: Dimethylsulfon
BMP-2: BMP-2 mit zusätzlichem N-terminalen Methionin
(-Q1)BMP-2: BMP-2, dem das N-terminale Glutamin fehlt
β3: TGF-β3
Aktivität: +: Mittlere Aktivität von TGF-β3 bei dem in Beispiel 7 beschriebenen in-vitro- Bioassay oder Bildung von gefaltetem BMP-2 bzw. (-Ql)BMP-2 entweder gemäß Bestimmung bei dem in-vitro-Bioassay gemäß Y. Takuwa et al. (1991), Biochemical and Biophysical Research Communication, Band 174, 96-101, "Bone Morphogenetic Protein-2 stimulates alkaline phosphatase activity and collagen synthesis in cultured osteoblastic cells, MC3T3-E1" oder durch Chromatographie und Elektrophorese.

Hinterlegung der Mikroorganismen

Die folgenden Mikroorganismen sind bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Mascheroder Weg 1b, D-3300 Braunschweig (BRD) hinterlegt:
Die folgenden Ausdrücke sind eingetragene Marken:
Coomassicblau, Mono S. Sephacryl, Triton-X, Vydac und Zwittergent.

SEQUENZPROTOKOLL

(1) Allgemeine Information:
(i) ANMELDER:
(A) NAME: CIBA-GEIGY AG
(B) STRASSE: Klybeckstr. 141
(C) STADT: Basel
(E) LAND: Schweiz
(F) POSTLEiTZAHL (ZIP): 4002
(G) TELEFON: +41 61 69 11 11
(H) TELEFAX: +41 61 696 79 76
(I) TELEX: 962 991
(ii) TITEL DER ERFINDUNG: Neues Verfahren zur Herstellung eines biologisch aktiven dimeren Proteins
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 14
(iv) COMPUTERLESBARE FORM:
(A) ART DES MEDIUMS: Diskette
(B) COMPUTER: IBM PC kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (EPO)
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 1:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 339 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: doppelt
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA zu mRNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(vii) UNMITTELBARE QUELLE:
(B) KLON: E. coli LC137/pPLMu.hTGF-beta1 (DSM 5656)
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 1...336
(D) WEITERE INFORMATION:/ Produkt = "Human-TGF-beta1" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 2:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 112 Aminosäuren
(B) TYP. Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 3:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 339 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: doppelt
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA zu mRNA
(vii) UNMITTELBARE QUELLE:
(B) KLON: E. coli LC137/pPLMu.hTGF-beta2 (DSM 5657)
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 1...336
(D) WEITERE INFORMATION:/ Produkt = "Human-TGF-beta2" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 112 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 5:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 339 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: doppelt
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA zu mRNA
(vii) UNMITTELBARE QUELLE:
(B) KLON: E. coli LC137/pPLMu.hTGF-beta3 (DSM 5658)
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 1...336
(D) WEITERE INFORMATION:/ Produkt = "Human-TGF-beta3" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 6:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 112 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 7:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 336 Basenpaare
(B) TYP Nukleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: doppelt
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: weitere Nukleinsäure
(A) BESCHREIBUNG: /Bescbr "rekombinante Hybrid-DNA von TGF-beta1- und TGFbeta3-DNA
(vii) UNMITTELBARE QUELLE:
(B) KLON: E. coli LC137/pPLMu.TGF-beta1(44/45)beta3
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: mat_Peptid
(B) LAGE: 1...132
(D) WEITERE INFORMATION:/ Produkt = "N-terminale 44 Aminosäuren von Human-TGFbetal"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: mat_Peptid
(B) LAGE: 133...336
(D) WEITERE INFORMATION:/ Produkt = "C-terminale 68 Aminosäuren von Human-TGFbeta3"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 1...336
(D) WEITERE INFORMATION:/ Produkt = "Human-TGF-beta mit der Bezeichnung TGFbetal-3" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 8:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 112 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 8:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 9:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 336 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: doppelt
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: weitere Nukleinsäure
(A) BESCHREIBUNG: /Beschr = "rekombinante Hybrid-DNA mit Codierung für Hybrid-TGF- beta2-3
(vii) UNMITTELBARE QLrELLE:
(B) KLON: E. coli LC 137/pPLMu.TGF-beta2(44/45)beta3
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: mat_Peptid
(B) LAGE: 1...132
(D) WEITERE INFORIMATION:/Produkt = "N-terminale 44 Aminosäuren von Human-TGFbeta2"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: mat_Peptid
(B) LAGE: 133...336
(D) WEITERE INFORMATION:/ Produkt = "C-terminale 68 Aminosäuren von Human-TGFbeta3"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEh: CDS
(B) LAGE: 1...336
(D) WEITERE INFORM. ATION:/ Produkt = "Hybrid-TGF-beta2-3" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 9:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO : 10:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 112 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 10:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 11:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFCEN:
(A) LÄNGE: 336 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT doppelt
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: weitere Nukleinsäure
(A) BESCHREIBUNG: /Beschr = "rekombinante Hybrid-DNA mit Codierung für Hybrid-TGFbeta3-2
(vii) UNMITTELBARE QUELLE:
(B) KLON: E. coli LC137/pPLMu.TGF-beta3(44/45)beta2
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: mat Peptid
(B) LAGE: 1...132
(D) WEITERE INFORM. ATION:/ Produkt = "N-terminale 44 Aminosäuren von Human-TGFbeta3"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: mat Peptid
(B) LAGE: 133...336
(D) WEITERE INFORMATION:/ Produkt = "C-terminale 6ß Aminosäuren von Human-TGFbeta2"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 1...336
(D) WEITERE INFORMATION:/ Produkt = "Hybrid-TGF-beta3-2" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 11:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 12:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 112 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 12:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 13:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 345 Basenpaare
(B) TYP. Nukleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: doppelt
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA zu mRNA
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 1...342
(D) WEITERE INFORMATION:/ Produkt = "Human-Knochenmorphogeneseprotein-2" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 13:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 14:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 114 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 14:

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines dimeren, biologisch aktiven transformierender Wachstumsfaktor-Typ-β (TGF-β)-artigen Proteins oder eines Salzes hiervon, umfassend ein Behandeln der denaturierten, monomeren Form des TCiF-β-artigen Proteins mit einem Faltungspuffer, der ein mildes Detergens, das die Faltung des monomeren TGF-β-artigen Proteins in die räumliche Konformation ermöglicht, die nach Dimerisierung mit der biologischen Aktivität in Verbindung steht, während das Monomer in einer löslichen Form gehalten wird, und ein organisches Lösungsmittel umfasst, das aus DMSO, DMSO&sub2;, DMF und einem beliebigen Gemisch aus zwei oder drei Bestandteilen aus der Gruppe, die aus DMSO, DMSO&sub2; und DMF besteht, ausgewählt ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Puffer zusätzlich eine reduzierende Substanz enthält.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das milde Detergens aus Digitonin, CHAPS, CHAPSO und einem beliebigen Gemisch der Bestandteile aus der Gruppe, die aus Digitonin, CHAPS und CHAPSO besteht, ausgewählt ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das milde Detergens aus CHAPS, CHAPSO und einem beliebigen Gemisch hiervon ausgewählt ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das milde Detergens in dem Faltungspuffer in einer Konzentration von etwa 1 bis 100 mM vorhanden ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das milde Detergens in dem Faltungspuffer in einer Konzentration von 30 bis 60 mM vorhanden ist.

7. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das milde Detergens in dem Faltungspuffer in einer Konzentration von 30 mM vorhanden ist.

8. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das organische Lösungsmittel aus DMSO, DMSO&sub2; und DMF ausgewählt ist.

9. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das organische Lösungsmittel in einer Konzentration von etwa 5 bis etwa 40% verwendet wird.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das organische Lösungsmittel in einer Konzentration von etwa 10 bis etwa 30% verwendet wird.

11. Verfahren nach Anspruch 9, wobei DMSO in einer Konzentration von etwa 10 bis etwa 30% verwendet wird.

12. Verfahren nach Anspruch 9, wobei DMSO in einer Konzentration von etwa 30% verwendet wird.

13. Verfahren nach Anspruch 9, wobei DMF in einer Konzentration von etwa 10 bis etwa 30 % verwendet wird.

14. Verfahren nach Anspruch 9, wobei DMF in einer Konzentration von etwa 10% verwendet wird.

15. Verfahren nach Anspruch 9, wobei DMSO&sub2; in einer Konzentration von etwa 10% verwendet wird.

16. Verfahren nach Anspruch 9, wobei ein Gemisch aus DMSO und DMF in einer Konzentration von 10 bis 30% für die Kombination beider Lösungsmittel verwendet wird.

17. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das TGF-β-artige Protein aus TGF-β2, TGFβ3, Hybrid-TGF-β1-2, Hybrid-TGF-β1-3, Hybrid-TGF-β2-3, Hybrid-TGF-β3-2 und BMP-2 ausgewählt ist.

18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei das TGF-β-artige Protein TGF-β3 ist.

19. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Puffer einen pH-Wert von etwa 6 bis etwa 10 aufweist.

20. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Puffer eine Temperatur von etwa 0ºC bis etwa 40ºC aufweist.

21. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die reduzierende Substanz eine reduzierte Sulfhydrylverbindung ist.

22. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die reduzierte Sulfhydrylverbindung aus Glutathion in seiner reduzierten Form, β-Mercaptoethanol in seiner reduzierten Form, Mercaptomethanol in seiner reduzierten Form, Cystein, Cysteamin und Dithiothreit in seiner reduzierten Form ausgewählt ist.

23. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die reduzierte Sulfhydrylverbindung in einer Konzentration von etwa 1 bis 100 mM verwendet wird.

24. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die reduzierte Sulfhydrylverbindung in einer Konzentration von etwa 1 bis 10 mM verwendet wird.

25. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die reduzierte Sulfhydrylverbindung in einer Konzentration von etwa 2,5 mM verwendet wird.