MX2012000895A

MX2012000895A - Polipeptidos selectivos para integrina alfavbeta3 conjugada con una variante de albumina de suero humana (hsa) y usos farmaceuticos de los mismos.

Info

Publication number: MX2012000895A
Application number: MX2012000895A
Authority: MX
Inventors: Woei-Jer Chuang; Wen-Mei Fu
Original assignee: Univ Nat Cheng Kung
Priority date: 2009-07-20
Filing date: 2010-07-19
Publication date: 2012-06-01
Also published as: US20110015130A1; JP2012533631A; IL217424A0; AR077764A1; WO2011011315A1; CN102470156A; CA2768360A1; EP2456454A1; RU2012105915A; EP2456454A4; TWI557224B; TW201107471A; NZ597580A; KR20120097481A; RU2547592C2; AU2010276453A1

Abstract

La invención generalmente se refiere a proteínas de fusión que comprenden una variante de rodostomina que tiene una variante de motivo RGD 48ARLDDL53, en donde la variante de rodostomina es conjugada con una variante de albúmina de suero humano (HSA); la invención también se refiere al uso de estas proteínas de fusión para tratamiento y prevención de enfermedades asociadas a integrina avß3.

Description

POLIPÉPTIDOS SELECTIVOS PARA INTEGRINA ALFAVBETA3 CONJUGADA CON UNA VARIANTE DE ALBÚMINA DE SUERO HUMANA (HSA) Y USOS FARMACÉUTICOS DE LOS MISMOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere en general a proteínas de fusión que comprenden una variante de rodostomina que tiene una variante de motivo de RGD 48ARLDDL53, en donde la variante de rodostomina es conjugada con una variante de albúmina de suero humana (HSA). La invención también se refiere al uso de estas proteínas de fusión para el tratamiento y prevención de enfermedades asociadas a integrina a?ß3.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El hueso es un tejido complejo compuesto de varios tipos de células que continuamente pasan por un proceso de renovación y reparación denominado "remodelación de hueso". Los dos tipos de células principales responsables de la remodelación de hueso son los osteoclastos, que resorben hueso, y los osteoblastos, que forman hueso nuevo. Se ha sabido que la remodelación de hueso es regulada por varias hormonas sistémicas (v.gr., hormona paratiroidea, 1 ,25-dihidroxi vitamina D3, hormonas sexuales, y calcitonina) y factores locales (v.gr., óxido nítrico, prostaglandinas, factores de crecimiento, y citocinas).

Las integrinas son receptores de matriz heterodiméricos que anclan las células a sustratos y transmiten señales externamente derivadas a través de la membrana plasmática. La integrina a?ß3 está implicada en la resorción de hueso mediada por osteoclastos, tanto in vivo como in vitro. Esta molécula heterodimérica reconoce el motivo de aminoácido Arg-Gly-Asp (RGD) contenido en las proteínas de matriz ósea tales como osteopontina y sialoproteína ósea. La integrina a?ß3 es expresada en un osteoclasto y su expresión es modulada por esferoides de resorción y citocinas. Con base en experimentos de bloqueo, la integrina a?ß3 ha sido identificada como un receptor de adhesión funcional mayor en osteoclastos. Los inhibidores de integrina a?ß3 reducen la capacidad de los osteoclastos para unirse a y resorber hueso. La integrina a?ß3 juega un papel importante en la función de los osteoclastos y los inhibidores de esta integrina están siendo considerados para tratar o prevenir osteoporosis, metástasis osteolítica y hipercalcemia inducida por malignidad.

Hay muchas enfermedades de los huesos que están relacionadas con osteolisis que es mediada por osteoclastos. La osteoporosis es la más común que es inducida cuando la resorción y formación de hueso no están coordinadas y el rompimiento de hueso supera a la construcción de hueso. La osteoporosis es también causada por otras condiciones, tales como desequilibrio hormonal , enfermedades o medicamentos (v.gr., corticosteroides o agentes anti-epilépticos). El hueso es uno de los sitios más comunes de metástasis por cáncer de mama, próstata, pulmón y tiroides humanos, así como otros cánceres. La osteoporosis también puede resultar de deficiencia de estrógeno post-menopáusica. La osteoporosis secundaria puede estar asociada con artritis reumatoide. La metástasis de hueso muestra un paso único de resorción de hueso osteoclástico que no se ve en metástasis de otros órganos. Es ampliamente aceptado que la osteólisis que está asociada con cáncer es esencialmente mediada por osteoclastos, que parece ser activada y puede ser indirectamente activada a través de osteoblastos o directamente por productos de tumor. Además, la hipercalcemia (concentración de calcio en la sangre incrementada) es una complicación importante de enfermedad de los huesos osteolítica. Ocurre con relativa frecuencia en pacientes con destrucción extensiva de hueso, y es particularmente común en carcinomas de mama, pulmón, renal, ovario y páncreas y en mieloma.

Las desintegrinas son una familia de péptidos que contienen RGD de peso molecular bajo que se unen específicamente a integrinas allbp3, a5ß1 y a?ß3 expresadas en plaquetas y otras células incluyendo células endoteliales vasculares y algunas células tumorales. Además de su actividad antiplaquetas potente, los estudios de desintegrinas han revelado nuevos usos en el diagnóstico de enfermedades cardiovasculares y el diseño de agentes terapéuticos en trombosis arterial, osteoporosis y crecimiento tumoral relacionado con angiogénesis y metástasis. Rodostomina (Rho), una desintegrina derivada del veneno de Colloselasma rhodostoma, se ha encontrado que inhibe la agregación de plaquetas in vivo e in vitro a través del bloqueo de glicoproteína de plaquetas allbp3. Además, se reporta que la rodostomina inhibe la adhesión de células de carcinoma de mama y próstata tanto a matrices no mineralizadas como mineralizadas de una manera dependiente de la dosis, sin afectar la viabilidad de células tumorales. Además, la rodostomina inhibe la migración e invasión de células de carcinoma de mama y próstata. También se ha mostrado que la rodostomina inhibe la adipogénesis y obesidad. Sin embargo, debido a que la rodostomina se une de manera no específica a las integrinas allbp3, a5ß1 y a?ß3, los usos farmacéuticos de la rodostomina pueden causar serios efectos colaterales. Por ejemplo, cuando se aplica rodostomina en el tratamiento de carcinomas, la inhibición de agregación de plaquetas es un efecto colateral no deseable.

El papel de la integrina a?ß3 en enfermedades de los huesos ha sido bien documentada. Véase, por ejemplo, F. Patrick Ross et al, Nothing but skin and bone, the Journal of Clinical Investigation, Vol. 1 16, #5, mayo de 2006; S.B. Rodan et al, Integrin function in osteoclasts, Journal of Endocrinology (1997) 154, S47-S56; Steven L. Teitelbaum, Editorial: Osteoporosis and Integrins, the Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, April 2005, 90(4): 2466-2468; Steven L. Teitelbaum, Osteoclasts, integrins, and osteoporosis, Journal of Bone and Mineral Metabolism, (2000) 18: 344-349; Ichiro Nakamura et al, Involvement of a?ß3 integrins in osteoclast function, Journal of Bone and Mineral Metabolism, (2007) 25: 337-344; Le T. Duong et al, The role of integrins in osteoclast function, Journal of Bone and Mineral Metabolism, (1999) 17: 1-6; y A Teti et al, The Role of the AlphaVbeta3 Integrín in the Development of Osteolytic Bone Metastases: A Pharmacological Target for Alternative Therapy?, Calcified Tissue International (2002) 71 : 293-299.

Además de las enfermedades de los huesos, la integrina a?ß3 juega un papel importante en angiogénesis y crecimiento tumoral en condiciones no relacionadas con enfermedades de los huesos.

Por lo tanto, puede ser deseable crear polipéptidos selectivos para integrina a?ß3 con estabilidad mejorada y efectos duraderos. Estos polipéptidos serán potencialmente adecuados para tratar enfermedades y condiciones que implican integrina a?ß3, incluyendo pero sin limitarse a varias enfermedades de los huesos, cáncer y enfermedades que implican angiogénesis.

La tecnología de fusión de albúmina de suero humano (HSA) se ha usado en la técnica para crear agentes farmacéuticos de proteína de acción larga. Sin embargo, los polipéptidos conjugados con HSA pueden ser sometidos a agregación enlazada con disulfuro, especialmente en condiciones ácidas, lo que da por resultado la formación de dímeros intermoleculares. La formación de dímeros intermoleculares puede reducir la actividad de los polipéptidos y/o causar inmunogenicidad cuando estos polipéptidos son administrados a mamíferos.

Por consiguiente, existe la necesidad en la técnica de crear un polipéptido que es selectivo para integrina a?ß3 con mejor estabilidad y menos dímeros intermoleculares que el polipéptido fusionado con HSA de tipo silvestre.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En una modalidad, la invención se refiere a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 , en donde el polipéptido es conjugado con una variante de albúmina de suero humana (HSA) que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, o una sal farmacéuticamente aceptable de dicho polipéptido.

SEQ ID NO: 1 representa una secuencia de aminoácidos de una variante de rodostomina que tiene una variante de motivo de RGD 8ARLDDL53.

SEQ ID NO: 2 y la SEQ ID NO: 3 representan dos de las posibles secuencias de nucleótidos que codifican una variante de rodostomina que tienen una variante de motivo de RGD 8ARLDDL53.

SEQ ID NO: 4 representa una secuencia de aminoácidos de la variante HSA, en donde el residuo de cisteina en la posición 34 de la secuencia de aminoácidos de HSA ha sido reemplazada por serina. Esta variante de HSA es referida como HSA C34S.

SEQ ID NO: 5 representa una secuencia de nucleótidos que codifica la variante de HSA C34S .

En otra modalidad, la invención se refiere a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 , en donde el polipéptido es conjugado con una vanante de HSA que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, o una sal farmacéuticamente aceptable de dicho polipéptido.

SEQ ID NO: 6 representa una secuencia de aminoácidos de la variante de HSA, en donde el residuo de cisteína en la posición 34 de la secuencia de aminoácidos de HSA ha sido reemplazado por alanina. Esta variante de HSA es referida como HSA C34A.

SEQ ID NO: 7 representa una secuencia de nucleótidos que codifica la variante de HSA C34A.

En una modalidad preferida, la invención provee un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 , en donde el polipéptido es conjugado con una variante de HSA que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 6, en donde dicho polipéptido además comprende una secuencia de aminoácidos enlazadora, o una sal farmacéuticamente aceptable de dicho polipéptido.

En una modalidad más preferida, la secuencia de aminoácidos enlazadora comprende una combinación de los aminoácidos glicina y serina .

En una modalidad más preferida, la secuencia de aminoácidos enlazadora comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.

En una modalidad aún más preferida, la invención se refiere a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, o una sal farmacéuticamente aceptable de dicho polipéptido.

SEQ ID NO: 9 representa una secuencia de aminoácidos de HSA(C34S)-ARLDDL proteína de fusión, en donde la variante de rodostomina ARLDDL es fusionada a la variante HSA C34S a través de la secuencia de aminoácidos enlazadora de SEQ ID NO: 8.

En otra modalidad más preferida, la invención se refiere a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11.

SEQ ID NO: 1 representa una secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión HSA(C34A)-ARLDDL , en donde la variante ARLDDL de rodostomina es fusionada a la variante HSA C34A a través de la secuencia de aminoácidos enlazadora de SEQ ID NO: 8.

En una modalidad, la invención se refiere a un polipéptido codificado por un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 10.

En otra modalidad, la invención se refiere a un polipéptido codificado por un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 12.

Debido a la degeneración del código genético, está dentro del alcance de la técnica modificar las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 12 para crear otros polinucleótidos que codifican los polipéptidos de la presente invención. Por lo tanto, los polipéptidos de la presente invención codificados por otros polinucleótidos también son abarcados por la presente invención.

Los polipéptidos de la presente invención son generalmente altamente selectivos para integrina a?ß3 y presentan unión reducida a allb 3 y/o integrina a5ß1 en comparación con una desintegrina de tipo silvestre.

Los polipéptidos de la presente invención generalmente presentan por lo menos aproximadamente una disminución de 5, 50 ó 100 veces en afinidad a allbp3 y/o a5ß1 en comparación con rodostomina.

En otra modalidad, los polipéptidos de la presente invención generalmente presentan por lo menos aproximadamente una disminución de 200 veces en afinidad a integrina a???ß3 en comparación con rodostomina, muy preferiblemente por lo menos aproximadamente una disminución de 500 veces en afinidad a integrina a?^ß3 en comparación con rodostomina, En otra modalidad, los polipéptidos de la presente invención generalmente presentan por lo menos aproximadamente una disminución de 20 veces en afinidad a integrina a5ß1 en comparación con rodostomina, y muy preferiblemente, por lo menos aproximadamente una disminución de 70 o 90 veces en afinidad a integrina a5ß1 en comparación con rodostomina.

Los polipéptidos de la presente invención generalmente presentan una disminución de por lo menos aproximadamente 5, 50, 100 ó 150 veces en afinidad a plaquetas en comparación con rodostomina.

En otra modalidad adicional de la invención, los polipéptidos presentan una actividad sustancialmente reducida en prolongación de tiempo de coagulación de la sangre en comparación con rodostomina y/o una desintegrina de tipo silvestre.

En otra modalidad, la invención se refiere a una composición fisiológicamente aceptable que comprende un polipéptido de la invención, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En una modalidad preferida, la invención se refiere a una composición fisiológicamente aceptable que comprende un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, o una sal farmacéuticamente aceptable de dicho polipéptido, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En otra modalidad más preferida, la invención se refiere a una composición fisiológicamente aceptable que comprende un polipéptido codificado por un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 10, o una sal farmacéuticamente aceptable de dicho polipéptido, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En otra modalidad, la invención se refiere a un método para tratamiento y/o prevención de una enfermedad asociada a integrina a?ß3 que comprende administrar a un mamífero que necesita el mismo una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 , en donde el polipéptido es conjugado con una variante de HSA que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 6, o una sal farmacéuticamente aceptable de dicho polipéptido.

En una modalidad preferida, la invención se refiere a un método para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad asociada a integrina a?ß3 que comprende administrar a un mamífero que necesita el mismo una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, o una sal farmacéuticamente aceptable de dicho polipéptido.

En otra modalidad más preferida, la invención se refiere a un método para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad asociada a integrina a?ß3 que comprende administrar a un mamífero que necesita el mismo una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido codificado por un polinucleótido que comprende a secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 10, o una sal farmacéuticamente aceptable de dicho polipéptido.

En una modalidad de la invención, la enfermedad asociada a integrina a?ß3 incluye, pero no se limita a, osteoporosis, crecimiento de tumor o cáncer de hueso y síntomas relacionados de los mismos, crecimiento y metástasis de tumor relacionados con angiogénesis, metástasis de tumor en hueso, hipercalcemia inducida por malignidad, enfermedad de Paget, cambio fisiológico inducido por ovariectomía, artritis reumática, osteoartritis y enfermedad ocular relacionada con angiogénesis, incluyendo pero sin limitarse a, degeneración macular relacionada con la edad, retinopatía diabética, enfermedades de neurovascularización de la córnea, retinopatía por neovascularización inducida por isquemia, miopía alta y retinopatía de premadurez.

En otra modalidad, la invención se refiere a un método de uso de un polipéptido de la invención para la inhibición y/o prevención de crecimiento de células tumorales en hueso u otros órganos y síntomas relacionados con los mismos en un mamífero.

En otra modalidad, el método de tratamiento y/o prevención de una enfermedad asociada a integrina a?ß3 comprende administrar a un mamífero que necesita el mismo una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, o una sal farmacéuticamente aceptable de dicho polipéptido en combinación con una cantidad terapéuticamente efectiva de otro agente activo. El otro agente activo puede ser administrado antes, durante o después de administrar el polipéptido de la presente invención.

En una modalidad preferida, el otro agente activo se selecciona del grupo que consiste de antagonistas de VEGF, agentes anti-inflamatorios, bisfosfonatos y agentes citotóxicos.

En otra modalidad, la invención se refiere a un método para hacer un polipéptido de la invención, que comprende (a) construir un gen que codifica el polipéptido de la invención; (b) transfectar una célula hospedera con el gen del paso (a); (c) hacer crecer dicha célula hospedera en un medio de cultivo; y (d) aislar dicho polipéptido.

En una modalidad preferida, la invención se refiere a un método para hacer un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, que comprende (a) construir un gen que codifica dicho polipéptido; (b) transfectar una célula hospedera con el gen del paso (a); (c) hacer crecer dicha célula hospedera en un medio de cultivo; y (d) aislar dicho polipéptido.

Los métodos para hacer los polipéptidos de la presente invención además pueden comprender hacer crecer una célula hospedera en un medio de cultivo libre de aminoácidos; y recolectar el sobrenadante para obtener el polipéptido.

Estos métodos además pueden comprender añadir metanol al medio de cultivo para inducir expresión de polipéptido en las células hospederas.

Los métodos además pueden comprender el paso de realizar cromatografía en columna para obtener el polipéptido.

En una modalidad, los métodos además pueden comprender el paso de realizar cromatografía de líquidos de alto rendimiento (CLAR) para obtener el polipéptido aislado.

Estos y otros aspectos se harán evidentes a partir de la siguiente descripción de las diversas modalidades tomadas junto con los siguientes dibujos, aunque variaciones y modificaciones en los mismos pueden seer afectadas sin apartarse de la esencia y alcance de los conceptos novedosos de la descripción.

Cabe entender que tanto la descripción general anterior como la siguiente descripción detallada son ilustrativos y explicativos únicamente y no son restrictivos de la invención, como se reivindica.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las figuras 1A y 1 B muestran perfiles de CLAR de HSA-ARLDDL y HSA(C34S)-ARLDDL, respectivamente.

Las figuras 1C y 1 D muestran perfiles de cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) de HSA-ARLDDL y HSA(C34S)-ARLDDL, respectivamente.

Las figuras 1 E y 1 F muestran fotografías de perfiles de SDS-PAGE de HSA-ARLDDL y HSA(C34S)-ARLDDL, respectivamente.

La figura 1G muestra una fotografía de perfiles de 2D SDS- PAGE de HSA-ARLDDL, HSA(C34S)-ARLDDL y HSA.

La figura 1 H muestra un espectro de RMN de HSA(C34S)-ARLDDL y BSA.

La figura 2 muestra una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 de variante ARLDDL de rodostomina.

La figura 3A muestra a secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 2 de variante ARLDDL de rodostomina.

La figura 3B muestra a secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 3 de variante ARLDDL de rodostomina.

Las figuras 4A y 4B muestran una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 4 y una secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 5 de mutante HSA C34S, respectivamente.

Las figuras 5A y 5B muestran una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 6 y una secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 7 de muíante HSA C34A, respectivamente.

La figura 6 muestra una secuencia de aminoácidos SEQ I D NO: 8 de un aminoácido enlazador.

Las figuras 7A y 7B muestran una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 9 y una secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 10 de HSA(C34S)-ARLDDL, respectivamente.

Las figuras 8A y 8B muestran una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 11 y una secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 12 de HSA(C34A)-ARLDDL, respectivamente.

Las figuras 9A, 9B y 9C son fotografías de células hematopoyéticas de médula ósea que muestran que HSA(C34S)-ARLDDL inhibe la diferenciación de osteoclastos.

Las figuras 10A, 10B y 10C son gráficas que muestran que HSA-ARLDDL y HSA(C34S)-ARLDDL inhiben la diferenciación de osteoclastos.

Las figuras 1 A, 1 1 B, 1 1 C y 1 1 D son gráficas que muestran que HSA-ARLDDL y HSA(C34S)-ARLDDL inhiben angiogénesis en un modelo de ratón de retinopatía de premadurez (ROP).

Las figuras 1 1 E, 11 F y 11 G son fotografías que muestran angiogénesis en un modelo de ratón de retinopatía inducida por oxígeno. Éstas muestran que HSA(C34S)-ARLDDL inhibe la angiogénesis en un ratón con retinopatía inducida por oxígeno.

Las figuras 12A y 12B son fotografías de ratones a los que se inyectaron células de tumor PC-3 humanas. La figura 12A es control y la figura 12B muestra dos ratones tratados con HSA(C34S)-ARLDDL.

Las figuras 12C y 12D son fotografías de tumores extirpados, respectivamente, de ratones de control y ratones tratados con HSA(C34S)-ARLDDL.

Las figuras 13 es una gráfica que muestra que HSA(C34S)-ARLDDL redujo significativamente el tamaño del tumor y el peso del tumor en ratones a los que se inyectaron células de tumor PC-3 humanas..

La figura 14A es un conjunto de fotografías que muestran una densidad de vasos sanguíneos reducidos en tapones de MATRIGEL™ de ratones C57BU6 tratados con HSA(C34S)-ARLDDL en comparación con ratones de control no tratados.

La figura 14B es una gráfica que muestra un contenido de hemoglobina reducido en tapones MATRIGEL™ de ratones C57BU6 tratados con HSA(C34S)-ARLDDL en comparación con ratones de control no tratados.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Ahora se describen con detalle varias modalidades de la invención . Como se usa en la descripción y a lo largo de las reivindicaciones, el significado de "un", "una", "el" y "la" incluye referencia plural a menos que el contexto determine claramente otra cosa. También, como se usa en la descripción y a lo largo de las reivindicaciones, el significado de "en" incluye "dentro" y "sobre" a menos que el contexto determine claramente otra cosa. Además, algunos términos usados en esta especificación son definidos de manera más específica a continuación.

Definiciones Los términos usados en esta especificación generalmente tienen sus significados ordinarios en la técnica, dentro del contexto de la invención, y en el contexto específico en donde se usa cada término. Ciertos términos que se usan para describir la invención se discuten a continuación, o en otra parte en la especificación, para proveer una guía adicional al practicante con respecto a la descripción de la invención. Se proveen sinónimos de ciertos términos. El uso de uno o más sinónimos no excluye el uso de otros sinónimos. El uso de ejemplos en cualquier parte en esta especificación incluyendo ejemplos de cualesquiera términos discutidos en la presente es ilustrativo únicamente, y de ninguna manera limita el alcance y significado de la invención o de cualquier término ejemplificado. La invención no se limita a las diversas modalidades dadas en esta especificación.

A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado que es comúnmente entendido por un experto en la técnica al cual compete esta invención. En caso de conflicto, el presente documento, incluyendo definiciones serán de control.

"Alrededor de" "aproximadamente" o "cerca de" generalmente significarán dentro de 20 por ciento, dentro de 10 por ciento, dentro de 5, 4, 3, 2 ó 1 por ciento de un valor o intervalo dado. Las cantidades numéricas dadas son aproximadas, lo que significa que el término "alrededor de ", "aproximadamente" o "cerca de" puede ser inferido si no se establece expresamente.

Los términos "polinucleótido", "nucleótido", "ácido nucleico", "molécula de ácido nucleico", "secuencia de ácido nucleico", "secuencia de polinucleótidos" y "secuencia de nucleótidos" se usan indistintamente para referirse a formas poliméricas de nucleótidos de cualquier longitud. Los polinucleótidos pueden comprender desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, y/o sus análogos o derivados. El término incluye variantes. Las variantes pueden incluir inserciones, adiciones, deleciones o sustituciones. Las secuencias de nucleótidos se listan en la dirección 5' a 3'.

Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" usados indistintamente para referirse a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud, que pueden incluir aminoácidos que ocurren naturalmente, aminoácidos codificados y no codificados, aminoácidos químicamente o bioquímicamente modificados, derivados o diseñados, análogos de aminoácido, peptidomiméticos, y depsipéptidos, y polípéptidos que tienen estructuras de base de péptido modificada, cíclica, biciclica, depsieíciica o depsibicíclica. El término incluye proteína de cadena sencilla así como multímeros.

Los términos también incluyen proteínas de fusión, incluyendo, pero sin limitarse a, proteínas de fusión de glutatión S-transferasa (GST), proteínas de fusión con una secuencia de aminoácidos heterologa tal como proteínas bioluminiscentes, por ejemplo, luciferina, o aequorina (proteína fluorescente verde), con secuencias líderes heterólogas y homologas, proteínas de fusión con o sin residuos de metionina N-terminales, proteínas pegiladas, y proteínas inmunológicamente etiquetadas, o con his-etiquetadas. Dichas proteínas de fusión también incluyen fusiones a epítopes. Dichas proteínas de fusión pueden comprender multímeros de los péptidos de la invención, v.gr., homodímeros u homomultímeros, y heterodímeros y heteromultímeros. El término también incluye aptámeros de péptido.

El término "híbrida específicamente," en el contexto de un polinucleótído, se refiere a hibridización bajo condiciones astringentes. Condiciones que incrementan astringencia tanto de reacciones de hibricación de ADN/ADN como de ADN/ARN son ampliamente conocidas y publicadas en la técnica. Ejemplos de condiciones de hibridación astringentes incluyen hibridación en 4 X cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC), a aproximadamente 65-70°C, o hibridación en 4 X SSC más 50% de formamida a aproximadamente 42-50°C, seguido por uno o más lavados en 1X SSC, a aproximadamente 65-70°C.

El término "ligando" se refiere a una molécula que se une a otra molécula, incluyendo un receptor.

El término "mamífero" incluye, pero no se limita a, un humano. El término "célula hospedera" es una célula individual o cultivo de células que puede ser o ha sido un receptor de cualquier vector(es) recombinante o polinucleótido . Las células hospederas incluyen progenie de una sola célula hospedera, y la progenie puede no necesariamente ser completamente idéntica (en morfología o en complemento de ADN total) a la célula progenitora original debido a mutación y/o cambio natural, accidental, o deliberado. Una célula hospedera incluye células transfectadas o infectadas in vivo o in vitro con un vector recombinante o un polinucleótido de la invención. Una célula hospedera que comprende un vector recombinante de la invención se puede llamar una "célula hospedera recombinante".

El término "tratamiento" se refiere a cualquier administración o aplicación de remedios para enfermedad en un mamífero e incluye inhibir la enfermedad, detener su desarrollo, aliviar la enfermedad, por ejemplo, al causar regresión, o restaurar o reparar una pérdida, carencia o función defectuosa; o estimular un proceso ineficiente. El término incluye obtener un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado , cubrir cualquier tratamiento de una condición o trastorno patológico en un mamífero. El efecto puede ser profiláctico en términos de prevenir completamente o parcialmente un trastorno o síntoma del mismo y/o puede ser terapéutico en términos de una cura parcial o completa para un trastorno y/o efecto adverso atribuí ble al trastorno. Incluye (1 ) evitar el trastorno ocurra o vuelva a ocurrir en un sujeto que puede estar predispuesto al trastorno pero aún no es sintomático, (2) inhibir el trastorno, tal como detener su desarrollo, (3) detener o terminar el trastorno o por lo menos sus síntomas asociados, de modo que el hospedero ya no padezca el trastorno o sus síntomas, tales como causar regresión del trastorno o sus síntomas, por ejemplo, al restaurar o reparar una pérdida, carencia o función defectuosa, o estimular un proceso infeccioso, o (4) atenuar, aliviar o mitigar el trastorno, o síntomas asociados con el mismo, en donde la mitigación se usa en un sentido amplio para referirse a por lo menos una reducción en la magnitud de un parámetro, tal como inflamación, dolor y/o tamaño del tumor.

El término "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un llenador sólido, semisólido o líquido no tóxico, diluyente, material encapsulante, auxiliar de formulación, o excipiente de cualquier tipo convencional. Un vehículo farmacéuticamente aceptable es no tóxico para receptores en las dosis y concentraciones utilizadas y es compatible con otros ingredientes de la formulación.

El término "composición" se refiere a una mezcla que usualmente contiene un portador, tal como un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable que es convencional en la técnica y que es adecuado para administrarse a un sujeto para propósitos terapéuticos, de diagnóstico o profilácticos. Puede incluir un cultivo de células en el cual el polipéptido o polinucleótido está presente en las células o en el medio de cultivo. Por ejemplo, las composiciones para administración oral puede formar soluciones, suspensiones, tabletas, pildoras, cápsulas, formulaciones de liberación sostenida, enjuagues orales o polvos.

El término "enfermedad" se refiere a cualquier condición, infección, trastorno o síndrome que requiere intervención médica o para el cual es deseable la intervención médica. Dicha intervención médica puede incluir tratamiento, diagnóstico y/o prevención.

La abreviatura "Rho" significa "rodostomina," que es una disintegrina derivada del veneno de Colloselasma rhodostoma. La rodostomina se une de manera no específica a las integrinas allbp3, a5ß1 y a?ß3, y prolonga el tiempo de coagulación de la sangre al inhibir la agregación de plaquetas a través del bloqueo de glicoproteína de plaquetas allbp3.

El término "CI50," o "la mitad de la concentración inhibidora máxima" se refiere a la concentración de Rho o su variante que es requerida para 50% de inhibición de su receptor. Cl50 es una medida de cuánto de Rho o su variante se necesita para inhibir un proceso biológico por 50%, tal como la afinidad de variante a su receptor.

El término "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad que, cuando se administra a un sujeto vivo, logra un efecto deseado en el el sujeto vivo. Por ejemplo, una cantidad efectiva del polipéptido de la invención para administrarse al sujeto vivo es una cantidad que previene y/o trata una enfermedad mediada por integrina a?ß3. La cantidad exacta dependerá del propósito del tratamiento, y lo obtendrá un experto en la técnica usando técnicas conocidas. Como se conoce en la técnica, ajustes para suministro sistémico versivslocalizado, edad, peso corporal, salud general, sexo, dieta, tiempo de administración, interacción de fármacos y la severidad de la condición pueden ser necesarios, y los obtendrán con experimentación de rutina los expertos en la técnica.

El término "antagonista de receptor" se refiere a un ligando de unión de un receptor que inhibe la función de un receptor al bloquear la unión de un agonista al receptor, o que permite al agonista unirse, pero inhibe la capacidad del agonista para activar el receptor.

El término "actividad bloqueadora de receptor de integrina allbp3 y/o a5ß1 sustancialmente reducida" se refiere a una actividad reducida de por lo menos cinco veces en bloqueo del receptor de integrina allb 3 y/o a5ß1 en comparación con rodostomina de tipo silvestre u otras disintegrinas. Por ejemplo, para calcular la reducción en actividad bloqueadora de receptor de allbp3 y/o a5ß1, la Cl50 de una variante de rodostomina para la inhibición de unión de integrina allbp3 y/o a5ß1 a una proteína de matriz, tal como fibrinógeno, se compara con la CI50 de Rho.

El término "variante de motivo RGD" se refiere a un péptido que comprende una modificación en la secuencia de aminoácidos que abarca la secuencia de RGD de una secuencia de tipo silvestre correspondiente, tal como la secuencia que comprende RGD en rodostomina.

El término "ARLDDL" se refiere a una variante de rodostomina que tiene una variante de motivo RGD 48ARLDDL53. Los números "48" y "53" se refieren a posiciones de estos aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de rodostomina de tipo silvestre.

El término "HSA C34S" se refiere a una variante de albúmina de suero humana (HSA) en donde el residuo de cisteina en la posición 34 de la secuencia de aminoácidos de HSA de tipo silvestre ha sido remplazada por serina. HSA C34S comprende SEQ ID NO: 4.

El término "HSA C34A" se refiere a una variante de HSA en donde el residuo de cisteína en la posición 34 de la secuencia de aminoácidos de HSA de tipo silvestre ha sido remplazada por alanina. HSA C34A comprende SEQ ID NO: 6.

El término "HSA(C34S)-ARLDDL" se refiere a una proteína de fusión que comprende a) una variante de albúmina de suero humana (HSA) en donde el residuo de cisteína en la posición 34 de la secuencia de aminoácidos de HSA de tipo silvestre ha sido remplazada por serina, b) la secuencia de aminoácidos enlazadora de SEQ ID NO: 8, y c) una variante de rodostomina que tiene una variante de motivo RGD 8ARLDDL53.

HSA(C34S)-ARLDDL está representada por SEQ ID NO: 9.

El término "HSA(C34A)-ARLDDL" se refiere a una proteína de fusión que comprende a) una variante de albúmina de suero humana (HSA) en donde el residuo de cisteína en la posición 34 de la secuencia de aminoácidos de HSA de tipo silvestre ha sido remplazada por alanina, b) la secuencia de aminoácidos enlazadora de SEQ ID NO: 8, y una variante de rodostomina que tiene una variante de motivo RGD 8ARLDDL53.

HSA(C34A)-ARLDDL está representada por SEQ ID NO: 1 1.

El término "selectividad inhibidora para integrina a?ß3 en relación con receptores de allb 3 y/o a5ß1" se refiere a una selectividad de unión del polipéptido hacia integrina a?ß3 sobre receptores allb 3 y/o s5ß1 , que es expresada como una relación de la CI50 de la variante para inhibición de receptores de a?? ß3 y/o a5ß1 sobre aquella para la inhibición de receptor de a?ß3.

El término "actividad sustancialmente reducida en prolongación del tiempo de sangrado" se refiere a la capacidad reducida de un polipéptido para inhibir la coagulación de la sangre de una manera estadísticamente significativa como se mide por el experimento de tiempo de sangrado descrito en la especificación.

Los términos "ARLDDL-pegilada" o "ARLDDL-peg" se refiere a un producto pegilado de proteína ARLDDL.

Los términos "albúmina-ARLDDL" o "HSA-ARLDDL" se refiere a aun producto conjugado a la albúmina humana de proteína ARLDDL.

Generalidades de la invención Variantes de desintegrina av33 selectiva La solicitud de patente e E.U.A. Serie No. 12/004,045 describe varios polipéptidos selectivos para integrina a?ß3 y que presentan actividad bloqueadora de receptor de integrina a?? ß3 y/o a5ß1 reducida en comparación con una disintegrina de tipo silvestre. Estos polipéptidos son codificados por secuencias de nucleótidos de desintegrina modificadas que codifican secuencias de aminoácidos modificadas. Como resultado, se crean polipéptidos que tienen actividad bloqueadora de receptor de integrina a?^ß3 y/o a5ß1 sustancialmente reducida.

Las variantes de desintegrina tales como compuestos relacionados con RD inhiben de manera potente la diferenciación de osteoclastos in vitro. También inhiben la actividad de resorción de osteoclastos y el incremento en formación de osteoclastos inducido por ovariectomía en estudios con animal. Además, RD inhibe el crecimiento tumoral de células de cáncer de próstata y mama humanas en hueso. La hipercalcemia inducida por malignidad también fue bloqueada de manera efectiva por proteínas relacionadas con RD. La enfermedad de Paget (también conocida como osteítis deformans) es un trastorno de hueso crónico que típicamente da por resultado huesos agrandados y deformes debido a rompimiento y formación irregulares de tejidos óseos. Los bisfosfonatos han sido aprobados para el tratamiento de enfermedad de Paget. La osteoartritis también está relacionada con el incremento en la actividad de osteoclastos. Con base en el mecanismo de acción similar, derivados de RD también deben ser efectivos para el tratamiento de estos trastornos de huesos. Una inyección intravenosa de RD o PGP a una dosis muy grande de 30 mg/kg no afectó la supervivencia de ratones (n=3). Además, la administración a largo plazo de PGP (I.V., 0.5 mg/kg/día) durante 6 semanas no afectó el nivel de creatinina en el suero, GOT, y GPT, lo que sugiere la ausencia de efectos colaterales sobre el riñon y el hígado. Por lo tanto, RD y sus derivados, especialmente ARLDDL, son candidatos de fármacos potenciales para el tratamiento de osteoporosis, tumor de hueso, hipercalcemia inducida por malignidad, enfermedad de Paget, artritis reumática, osteoartritis y enfermedades de los ojos relacionadas con angiogénesis.

Los inventores incorporan expresamente por referencia toda la descripción, incluyendo los polipéptidos, en la solicitud de patente de E.U.A. Serie No. 12/004,045.

La presente invención generalmente está relacionada con polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 , en donde estos polipéptidos son conjugados con una variante de albúmina de suero humana (HSA), en donde el residuo de cisteína en la posición 34 de la secuencia de aminoácidos de HSA ha sido reemplazada ya sea por serina para , crear proteína mutante HSA C34S, o por alanina para crear proteína mutante HSA C34S.

SEQ ID NO: 2 y la SEQ ID NO: 3 representan dos de las posibles secuencias de nucleótidos que codifican una variante de rodostomina que tienen una variante de motivo de RGD 48ARLDDL53.

SEQ ID NO: 4 representa una secuencia de aminoácidos de la proteína mutante HSA C34S.

SEQ ID NO: 6 representa una secuencia de aminoácidos de la proteína mutante HSA C34S.

SEQ ID NO: 7 representa una secuencia de nucleótidos que codifica la variante de HSA C34A .

En una modalidad preferida, la secuencia de aminoácidos enlazadora comprende una combinación de aminoácidos glicina y serina.

En otra modalidad más preferida, la secuencia de aminoácidos enlazadora comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.

SEQ ID NO: 11 representa una secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión HSA(C34A)-ARLDDL , en donde la variante ARLDDL de rodostomina es fusionada a la variante HSA C34A a través de la secuencia de aminoácidos enlazadora de SEQ ID NO: 8.

En otra modalidad, un polipéptido de la invención es codificado por un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 12.

Debido a la degeneración del código genético, está dentro de la capacidad de un experto en la técnica modificar las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 12 para crear otros polinucleótidos que codifican los polipéptidos de la presente invención. Por lo tanto, los polipéptidos de la presente invención codificados por otros polinucleótidos también son abarcados por la presente invención.

Los polipéptidos de la invención generalmente son altamente selectivos para integrina a?ß3 y presentan unión reducida a integrina a?^ß3 y/o a5ß1 comparado con una desintegrina de tipo silvestre.

En otra modalidad, los polipéptidos de la presente invención generalmente presentan por lo menos aproximadamente una disminución de 200 veces en afinidad a integrina allb 3 en comparación con rodostomina, muy preferiblemente por lo menos aproximadamente una disminución de 500 veces en afinidad a ¡ntegrina allbp3 en comparación con rodostomina.

Los polipéptidos de la presente invención generalmente presentan por lo menos aproximadamente una disminución de 20 veces en afinidad a a5ß1 integrina en comparación con rodostomina, y muy preferiblemente, por lo menos aproximadamente una disminución de 70 ó 90 veces en afinidad a integrina a5ß1 en comparación con rodostomina.

En otra modalidad adicional de la invención, el polipéptido presenta una actividad sustancialmente reducida en prolongación del tiempo de coagulación de la sangre en comparación con rodostomina y/o una desintegrina de tipo silvestre.

Polipéptidos de la invención Los polipéptidos de la invención pueden ser creados y expresados usando métodos conocidos en la técnica. Los métodos basados en células y los métodos libres de células son adecuados para producir los polipéptidos de la invención. Los métodos basados en células generalmente implican introducir un constructo de ácido nucleico en una célula hospedera in vitro y cultivar la célula hospedera bajo condiciones adecuadas para la expresión, después cosechar el péptido, ya sea del medio de cultivo o de la célula hospedera, (por ejemplo, al alterar la célula hospedera), o ambas. La invención también provee métodos de producción de un péptido usando métodos de transcripción/translación in vitro libres de células, que son bien conocidos en la técnica.

Las células hospederas adecuadas incluyen células procarióticas o eucarióticas, incluyendo, por ejemplo, células bacterianas, de levadura, de hongos, vegetales, de insecto y de mamífero.

El ejemplo 1 siguiente describe la construcción y expresión de un polipéptido de conformidad con la invención, HSA(C34S)-ARLDDL.

Típicamente, un polipéptido de la invención se puede expresar como tal y puede incluir señales de secreción y/o una secuencia líder secretora. Una secuencia líder secretora de la invención puede dirigir ciertas proteínas al retículo endoplásmico (ER). El ER separa las proteínas unidas a membrana de otras proteínas. Una vez localizadas al ER, las proteínas pueden ser dirigidas posteriormente al aparato de Golgi para distribuirse a vesículas, incluyendo vesículas secretoras, la membrana plasmática, lisosomas y otros organelos.

Además, porciones de péptido y/o etiquetas de purificación pueden añadirse a los polipéptidos de la invención, además de una variante de HSA. Estas porciones de péptido y/o etiquetas de purificación pueden ser removidas antes de una preparación final del polipéptido. Las etiquetas de purificación adecuadas incluyen, por ejemplo, V5, polihistidinas, avidina y biotina. La conjugación de péptidos a compuestos, tales como biotina, se puede lograr usando técnicas bien conocidas en el campo. (Hermanson ed. (1996) Bioconjugate Techniques; Academic Press). Los polipéptidos de la invención también se pueden conjugar con radioisótopos, toxinas, enzimas, marcadores fluorescentes, oro coloidal, ácidos nucleicos, vinorelbina y doxorrubicina usando técnicas conocidas en el campo. (Hermanson ed. (1996) Bioconjugate Techniques; Academic Press; Stefano et al. (2006).

También es posible crear proteínas de fusión, en donde las proteínas de fusión de HSA-desintegrina mutante de la presente invención posteriormente se fusionan con otras proteínas. Las parejas de fusión adecuadas para dicho uso incluyen, por ejemplo, fetuina, Fe y/o uno o más de sus fragmentos. También se proveen los conjugados de polietilenglicol con las proteínas de fusión de la presente invención .

Los polipéptidos de la invención también pueden ser químicamente sintetizados usando técnicas conocidas en el campo (v.gr., véase Hunkapiller et al., Nature, 310:105 111 (1984); Grant ed. (1992) Synthetic Peptides, A Users Guide, W.H. Freeman and Co.; patente de E.U.A. No. 6,974,884)). Por ejemplo, un polípéptido correspondiente a un fragmento de un polípéptido puede ser sintetizado mediante el uso de un sintetizador de péptido o a través del uso de métodos de fase sólida conocidos en la técnica.

Además, si se desea, aminoácidos no clásicos o análogos de aminoácido químicos pueden ser introducidos como una sustitución o adición en la secuencia de polípéptido. Los aminoácidos no clásicos incluyen, pero no se limitan a, los isómeros-D de los aminoácidos conocidos, ácido 2,4- diaminobutírico, ácido a-amino isobutírico, ácido 4-aminobutírico, Abu, ácido 2-amino butírico, g-Abu, e-Ahx, ácido 6-amino hexanoico, Aib, ácido 2-amino isobutírico, ácido 3-amino propiónico, ornitina, norleucina, norvalina, hidroxiprolina, sarcosina, citrulina, homocitrulina, ácido císteico, t-butilglicina, t-butilalanina, fenilglicina, ciclohexilalanina, b-alanina, fluoro-aminoácidos, aminoácidos diseñados tales como b-metil aminoácidos, Ca-metil aminoácidos, Na-metil aminoácidos, y análogos de aminoácido en general. Además, el aminoácido puede ser D (dextrógiro) o L (levógiro).

Los polipéptidos de la invención pueden ser recuperados y purificados a partir de síntesis química y cultivos de células recombinantes por métodos estándares que incluyen, pero no se limitan a, sulfato de amonio o precipitación de etanol , extracción con ácido, cromatografía de intercambio de aniones y cationes, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de afinidad, cromatografía de hidroxiapatita y cromatografía de lectina. En una modalidad, se utiliza cromatografía de alto rendimiento ("CLAR") para purificación. Técnicas bien conocidas para redoblar proteína se pueden utilizar para regenerar la conformación activa cuando el polipéptido es desnaturalizado durante el aislamiento y/o purificación.

Un polipéptido o peptidomimético de la invención puede ser modificado adicionalmente con o covalentemente acoplado a uno o más de una variedad de polímeros hidrofílicos para incrementar la solubilidad y vida media en circulación del polipéptido. Los polímeros hidrofílicos no proteináceos adecuados para acoplarse a un péptido incluyen, pero no se limitan a, éteres polialquílicos como se ejemplifica por polietilenglicol y polipropilenglicol, ácido poliláctico, ácido poliglicólico, polioxialquenos, alcohol polivinilico, polivinilpirrolidona, celulosa y derivados de celulosa, dextrano y derivados de dextrano. Generalmente, dichos polímeros hidrofílicos tienen un peso molecular promedio que varía de aproximadamente 500 a aproximadamente 100,000 daltons, de aproximadamente 2,000 a aproximadamente 40,000 daltons, o de aproximadamente 5,000 a aproximadamente 20,000 daltons. El péptido puede ser derivado con o acoplado a dichos polímeros usando cualquiera de los métodos expuestos en Zallipsky, S. (1995) Bioconjugate Chem., 6:150-165; Monfardini, C, et al. (1995) Bioconjugate Chem. 6:62-69; patente de E.U.A. Nos. 4,640,835; 4,496,689; 4,301 ,144; 4,670,417; 4,791 ,192; 4,179,337, o WO 95/34326.

Los polipéptidos de la invención pueden incluir aminoácidos que ocurren naturalmente y que no ocurren naturalmente. Los polipéptidos pueden comprender D-aminoácidos, una combinación de D- y L-aminoácidos, y varios aminoácidos "de diseño" o "sintéticos" (por ejemplo, ß-metil aminoácidos, Ca-metil aminoácidos, y ?a-metil aminoácidos, etc.) para transmitir propiedades especiales. Además, los polipéptidos pueden ser cíclicos. Los polipéptidos pueden incluir cualesquiera aminoácidos no clásicos conocidos. Además, análogos de aminoácidos y peptidomiméticos se pueden incorporar en un polipéptido para inducir o favorecer estructuras secundarias específicas, incluyendo, pero sin limitarse a, LL-Acp (ácido LL-3- amino-2-propenidon-6-carboxílico), un análogo de dipéptido inductor de vuelta ß; análogos inductores de hoja ß; análogos inductores de vuelta ß; análogos inductores de hélice a; análogos inductores de vuelta ?; análogos de vuelta Gly-Ala; isostera de enlace de amida; o tretrazol, y similares.

Además, residuos de desamino o descarboxi pueden ser incorporados en los extremos terminales del polipéptido para disminuir la susceptibilidad a proteasas o para restringir la conformación.

En una modalidad, los grupos funcionales C-terminales de los polipéptidos de la presente invención incluyen amida, amida alquilo inferior, amida di-alquilo inferior, alcoxi inferior, hidroxi, carboxi, los derivados de éster inferiores de los mismos, y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

Composiciones farmacéuticas En otra modalidad, la invención se refiere a una composición fisiológicamente aceptable que comprende un polipéptido de la invención, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden proveer como formulaciones con vehículos, excipientes y diluyentes farmacéuticamente aceptables, que son conocidos en la técnica. Estos vehículos, excipientes y diluyentes farmacéuticos incluyen aquellos listados en el listado de excipientes farmacéuticos de USP. USP and NF Excipients, Listed by Categories, p. 2404-2406, USP 24 NF 19, United States Pharmacopeial Convention Inc., Rockville, Md. (ISBN 1-889788-03-1). Excipientes farmacéuticamente aceptables, tales como vehículos, adyuvantes, portadores o diluyentes, están fácilmente disponibles al público. Más aún, las sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables, tales como agentes ajustadores de pH y reguladores de pH, agentes ajustadores de tonicidad, estabilizadores, agentes humectantes y similares, están fácilmente disponibles al público.

Los vehículos adecuados incluyen, pero no se limitan a, agua, dextrosa, glicerol, solución salina, etanol y combinaciones de los mismos. El vehículo puede contener agentes adicionales tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes reguladores de pH, o adyuvantes que incrementan la efectividad de la formulación. Los vehículos tópicos incluyen petróleo líquido, palmitato de isopropilo, polietilenglicol, etanol (95%), monolaurato de polioxietileno (5%) en agua, o laurilsulfato de sodio (5%) en agua. Otros materiales tales como antioxidantes, humectantes, estabilizadores de viscosidad, y agentes similares se pueden añadir según sea necesario. Los incrementadores de penetración percutáneos tales como Azone también se pueden incluir.

Los polipéptidos de la invención se pueden formular en preparaciones para inyección al disolverlos, suspenderlos o emulsionarlos en un solvente acuoso o no acuoso, tal como aceites vegetales u otros aceites similares, glicérídos de ácidos alifáticos sintéticos, ésteres de ácidos alifáticos superiores o propilenglicol; y si se desea, con aditivos convencionales tales como solubilízantes, agentes isotónicos, agentes de suspensión, agentes emulsionantes, estabilizadores y conservadores. Otras formulaciones para suministro oral o parenteral también se pueden usar, como convencionales en la técnica.

Las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden formular en preparaciones en formas sólida, semi-sólida, líquida o gaseosa, tales como tabletas, cápsulas, polvos, gránulos, pomadas, soluciones, supositorios, inyecciones, inhalantes y aerosoles.

En formas de dosis farmacéuticas, las composiciones de la invención se pueden administrar en forma de sus sales farmacéuticamente aceptables, o también se pueden usar solas o en asociación apropiada, así como en combinación, con otros compuestos farmacéuticamente activos. Las composiciones de la presente se formulan de conformidad con el modo de administración potencial.

Métodos de tratamiento En otra modalidad, la invención se refiere a un método para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad asociada a integrina a?ß3 que comprende administrar a un mamífero que necesita el mismo una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 , en donde el polipéptido es conjugado con una variante de HSA que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 6, o una sal farmacéuticamente aceptable de dicho polipéptido.

Una enfermedad asociada a integrina a?ß3, incluye, pero no se limita a, osteoporosis, tumor de hueso o crecimiento de cáncer y síntomas relacionados con los mismos, crecimiento y metástasis de tumor relacionados con angiogénesis, metástasis de tumor en hueso, hipercalcemia inducida por malignidad, mieloma múltiple, enfermedad de Paget, cambio fisiológico inducido por ovariectomía, artritis reumática, osteoartritis y enfermedad ocular relacionada con angiogénesis, incluyendo pero sin limitarse a, degeneración macular relacionada con la edad, retinopatía diabética, enfermedades de neurovascularización de la córnea, retinopatía por neovascularización inducida por isquemia, miopía alta y retinopatía de premadurez.

La osteoporosis puede estar asociada con una condición patológica escogida de deficiencia de estrógeno post-menopáusica, osteoporosis secundaria, artritis reumatoide, ovariectomía, enfermedad de Paget, cáncer de hueso, tumor de hueso, osteoartritis, formación de osteoclastos incrementada y actividad de osteoclastos incrementada. Además, la osteoporosis incluye, pero no se limita a, una osteoporosis inducida por ovariectomía o post-menopáusica, cambio fisiológico o pérdida de hueso.

En otra modalidad, la invención se refiere a un método para usar un polipéptido de la invención para la inhibición y/o prevención de crecimiento de células tumorales en hueso u otros órganos y síntomas relacionados con los mismos en un mamífero que necesita el mismo.

Los síntomas patológicos relacionados con crecimiento de células tumorales en hueso incluyen una actividad de osteoclastos incrementada, una resorción de hueso incrementada, lesión de hueso, hipercalcemia, una pérdida de peso corporal, y cualesquiera combinaciones de los mismos. El crecimiento de células tumorales incluye células de cáncer de hueso y células cancerosas metastasizadas que se originan de cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer renal, cáncer de ovario, cáncer pancreático o cáncer de mieloma.

Los polipéptidos de la invención pueden ser administrados a un sujeto que necesita tratamiento por inyección sistémica, tal como por inyección intravenosa; o por inyección o aplicación al sitio relevante, tal como por inyección directa, o aplicación directa al sitio cuando el sitio es expuesto en cirugía; o por aplicación tópica.

Los polipéptidos de la invención se pueen usar como monoterapia. Alternativamente, los polipéptidos de la invención se pueden usar en combinación con otro agente activo para tratar enfermedades asociadas a integrina a?ß3 .

La administración de los agentes activos se puede lograr de varias formas, incluyendo administración oral, bucal, nasal, rectal, parenteral, intraperitoneal, intradérmica, transdérmicá, subcutánea, intravenosa, intra-arterial, intracardiaca, intraventricular, intracraneal, intratraqueal, e intratecal, inyección intramuscular, inyección intravítrea, aplicación tópica, incluyendo pero sin limitarse a gotas para los ojos, cremas y emulsiones, implantación e inhalación.

Métodos para hacer polipéptidos En otra modalidad, la invención se refiere a un método para hacer un polipéptido de la invención, que comprende (a) construir el gen que codifica el polipéptido de la invención; (b) transfectar una célula hospedera con el gen del paso (a); (c) hacer crecer dicha célula hospedera en un medio de cultivo; y (d) aislar dicho polipéptido.

Los métodos para hacer los polipéptidos de la presente invención además pueden comprender hacer crecer la célula hospedera en un medio de cultivo libre de aminoácidos; y recolectar sobrenadante para obtener dicho polipéptido.

Estos métodos además pueden comprender añadir metanol al medio de cultivo para inducir la expresión de polipéptido en las células hospederas.

Los métodos además pueden comprender el paso de realizar una cromatografía en columna para obtener dicho polipéptido.

En una modalidad, los métodos además pueden comprender el paso de realizar una cromatografía de líquidos de alto rendimiento (CLAR) para obtener el polipéptido aislado.

La presente invención se describe en forma más particular en los siguientes ejemplos que se pretende que sean únicamente ilustrativos, ya que muchas modificaciones y variaciones en los mismos serán evidentes para los expertos en la técnica.

RANKL y M-CSF recombinantes humanos se compraron de R&D Systems (Minneapolis, MN). Los telopéptidos C-terminales de kit de ELISA de colágeno de tipo I se obtuvo de Cross Laps (Herlev, Dinamarca).

Todos los demás compuestos químicos se obtuvieron de Sigma.

EJEMPLO 1 Construcción de un gen que codifica HSA(C34S)-ARLDDL EJEMPLO 1A Construcción de un gen que codifica HSA(C34S)-ARLDDL por PCR de extensión de traslape y ligación El gen estructural de HSA C34S se construyó usando HSA (Invitrogen®, clon ID: IOH23065) como una plantilla. La mutación de C34S fue producida por reacción en cadena de polimerasa (PCR) de dos pasos. La primera PCR fue amplificada con el iniciador de sentido que contenía el sitio de mutación de C34S y con el iniciador de antisentido que contenía los sitios de restricción Kpn I, Sac II y un codón de detención TAA. La segunda PCR fue amplificada con el iniciador de sentido que contenía el sitio de restricción BstB I y la secuencia de señal de secreción y con el iniciador de antisentido que contenía los sitios de restricción Kpn I, Sac II y un codón de detención TAA La secuencia de señal de secreción de péptido de HSA prepro , el péptido de factor a prepro de Saccharomyces cerevisiae, o preHSA y péptido de fusión de factor pro a se usó para expresión de proteína secretora. El gen estructural de ARLDDL fue amplificado por PCR con el iniciador de sentido que contenía el sitio de restricción Kpn I y la región separadora que contenía la secuencia GS y con el iniciador de antisentido que contenía el sitio de restricción Sac II y un codón de detención TAA . Los productos de PCR de HSA C34S con el péptido de señal de secreción y muíante Rho ARLDDL con la región separadora fueron digeridas usando enzima de restricción Kpn I y después se ligaron. El producto de gen resultante se clonó en los sitios BstB I y Sac II del vector de recombinacion de levadura. El plásmido recombinante después fue transformado en una cepa XL1-blue de Escheríchia coli, y las colonias se seleccionaron usando las placas de agar con sal LB baja (1% de triptona, 0.5% de extracto de levadura, 0.5% de NaCI, 1.5% de agar a pH 7.0) y 25 µ?/??? de antibiótico Zeocina. Las colonias de E. coli XL1-blue se recolectaron y el ADN del plásmido se aisló y se secuenció.

EJEMPLO 1B Construcción de un gen que codifica HSA(C34S)-ARLDDL por síntesis de gen Se sintetizó el ADN que codifica secuencia de señal de secreción HSA(C34S)-ARLDDL . La secuencia de señal de secreción de péptido de HSA prepro , el péptido de factor a prepro de Saccharomyces cerevisiae, o preHSA y péptido de fusión de factor pro a se usó para expresión de proteina secretora. El producto de gen resultante se clonó en el vector de recombinación de levadura con sitio de restricción apropiado. El plásmido recombinante después fue transformado en una cepa XL1-blue de Escheríchia coli, y las colonias se seleccionaron usando las placas de agar con sal LB baja (1 % de triptona, 0.5% de extracto de levadura, 0.5% de NaCI, 1.5% de agar a pH 7.0) y 25 µ9/?t?? de antibiótico Zeocina. Las colonias de E. coli XL1-blue recolectaron y el ADN del plásmido se aisló y se secuenció.

EJEMPLO 2 Expresión de proteína y purificación de HSA(C34S)-ARLDDL en P.

Pastoris v caracterización de HSA(C34S)-ARLDDL Después de que se confirmó el clon, un total de 10 jg de plásmidos fueron digeridos con el sitio de enzima de restricción apropiado para linealizar los plásmidos. Cepa hospedera de Pichia fue transformada con los constructos linealizados por un método de choque término usando un kit Pichia EasyComp™ de Invitrogen®, o electroporación. El transformante integrado en el locus 5' AOX1 por una sola cruza. PCR se usó para analizar integrantes de Pichia para determinar si el gen de HSA(C34S)-ARLDDL se había integrado al genoma de Pichia. Las colonias se seleccionaron en placas de agar que contenían YPD (1% de extracto de levadura, 2% de peptona, 2% de glucosa y 2% de agar) y 100 pg/ml de Zeocina. Un número de clones con múltiples copias de inserciones de gen de HSA(C34S)-ARLDDL se seleccionaron para escoger el clon con la expresión de proteína más alta. La HSA(C34S)-ARLDDL recombinante resultante contenía 585 aminoácidos de HSA, un separador que contenía 17 residuos de aminoácido, y 68 aminoácidos de muíante de rodostomina ARLDDL.

La proteina de fusión de HSA(C34S)-ARLDDL recombinante resultante fue posteriormente purificada por CLAR (CLAR de C18 de fase inversa).

Los perfiles de CLAR de HSA-ARLDDL y HSA(C34S)-ARLDDL se muestran en las figuras 1A y 1 B, respectivamente.

La HSA(C34S)-ARLDDL recombinante purificada fue posteriormente analizada por cromatografía de filtración en gel (también llamada cromatografía de exclusión de tamaño (SEC)) para separar proteínas de acuerdo al tamaño.

Los perfiles de SEC de HSA-ARLDDL y HSA(C34S)-ARLDDL se muestran en las figuras 1 C y 1 D, respectivamente. El análisis mostró que la mutación en la posición 34 de C a S en HSA-ARLDDL causó aproximadamente una disminución de cinco veces en la formación de agregados.

El cuadro 1 muestra la reducción de agregados de proteína en HSA(C34S)-ARLDDL CUADRO 1 Reducción de agregados de proteína en HSA(C34S)-ARLDDL Las figuras 1 E y 1 F muestran fotografías de perfiles de SDS- HSA-ARLDDL y HSA(C34S)-ARLDDL, respectivamente.

La franja 1 contiene marcadores de peso molecular; La franja 2 contiene inducción de metanol; La franja 3 contiene HSA-ARLDDL o HSA(C34S)-ARLDDL purificada por cromatografía de sefarosa azul; La franja 4 contiene HSA-ARLDDL o HSA(C34S)-ARLDDL purificada por columna de CLAR de fase inversa; La franja 5 contiene BSA comercial; La franja 6 contiene HSA-ARLDDL o HSA(C34S)-ARLDDL purificada por cromatografía de sefarosa azul con 2Me; y La franja 7 contiene HSA-ARLDDL or HSA(C34S)-ARLDDL purificada por columna de CLAR de fase inversa con 2Me.

Las fotografías demuestran que HSA(C34S)-ARLDDL tiene menos dímeros (representados por una flecha roja) que HSA-ARLDDL.

HSA(C34S)-ARLDDL, HSA-ARLDDL y albúmina de suero humana (HSA) también fueron analizadas por 2D SDS-PAGE. 2D SDS-PAGE de HSA(C34S)-ARLDDL, HSA-ARLDDL y HSA se muestran en la figura 1 G.

El análisis mostró que, similar a HSA, HSA(C34S)-ARLDDL y HSA-ARLDDL recombinantes producidos a partir de Pichia Pastoris presentaron por lo menos cinco isoformas en dimensión de enfoque isoeléctrico.

HSA(C34S)-ARLDDL y albúmina de suero de bovino (BSA) se analizaron por espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN). La figura 1 H muestra los espectros de RMN de HSA(C34S)-ARLDDL y BSA. El análisis mostró que el doblez de HSA(C34S)-ARLDDL fue similar al de BSA. La flecha muestra las señales de protones Ha de la región enlazadora (G4S)s.

EJEMPLO 3 Prueba de inhibición de adhesión celular Efecto inhibidor sobre las integrinas a?33, a5ß1 y allbB3 La prueba de inhibición de adhesión celular se realizó como se describe en la solicitud de patente de E.U.A. Serie No. 12/004,045. En resumen, pozos de placas de microtitulación de 96 pozos lmmulon-2 (Costar, Corning, E.U.A.) fueron revestidos con 100 µ? de solución salina regulada en su pH con fosfato (PBS: 10 mM de regulador de pH de fosfato, 0.15M de NaCI, pH 7.4) que contenía sustratos a una concentración de 50-500 nM, e incubados durante la noche a 4°C. Los sustratos y sus concentraciones de revestimiento fueron fibrinógeno (Fg) 200 pg/ml, vitronectina (Vn) 50 pg/ml, y fibronectina (Fn) 25 pg/ml. Sitios de unión a proteína no específicos fueron bloqueados al incubar cada pozo con 200 µ? de albúmina de suero de bovino al 1 % desnaturalizada con calor (BSA, Calbiochem) a temperatura ambiente (25° C) durante 1.5 hr. La BSA desnaturalizada con calor se desechó y cada pozo se lavó dos veces con 200 µ? de PBS.

Las células de ovario de hámster chino (CHO) que expresan integrinas a?ß3 (CHO-av 3) y allb 3 (CHO-allbp3) se mantuvieron en 100 µ? de medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM). Las células de ovario de hámster chino (CHO) que expresan integrinas a?ß3 (???-a?ß3) y a??_)ß3 (CHO-allb 3) fueron amablemente provistas por Dr. Y. Takada (Scripps Research Institute). Las células de erihroleucemia humana K562 se compraron de ATCC y se cultivaron en medio RPMI-1640 que contenía 5% de suero de ternera fetal. Las células CHO y K562 que crecen en fase log fueron desprendidas por tripsinización y se usaron en la prueba a 3 x 105 y 2.5 x 105 células/ml, respectivamente. ARLDDL, pegilada-ARLDDL, HSA-ARLDDL, y HSA(C34S)-ARLDDL se añadieron a las células cultivadas y se incubaron a 37°C, 5% de CO2 durante 15 minutos. Rho y sus variantes se usaron como inhibidores a las concentraciones de 0.001-500 µ?. Las células tratadas después se añadieron a la placa revestida y se hace reaccionar a 37°C, 5% C02 durante 1 hora. La solución de incubación después se desechó y las células no adheridas fueron removidas al lavar dos veces con 200 µ? de PBS. Las células unidas fueron cuantificadas por tinción con cristal violeta. En resumen, el pozo se fijó con 100 µ? de formalina al 10% durante 10 minutos y se secó. Cincuenta microlitros de 0.05% de cristal violeta después se añadieron al pozo a temperatura ambiente durante 20 minutos. Cada pozo se lavó con 200 µ? de agua destilada cuatro veces y se secó. La coloración se llevó a cabo al añadir 150 µ? de solución colorante (50% de alcohol y 0.1 % de ácido acético). La absorbancia resultante se leyó a 600 nm y las lecturas se correlacionaron con el número de células adherentes. La inhibición se definió como % de inhibición = 100 - [OD600 (variante de muestra tratado con rodostomina)/ OD600 (muestra no tratada)] ? 100.

Efecto inhibidor sobre agregación de plaquetas La determinación de efectos inhibidores de ARLDDL y proteínas fusionadas sobre la agregación de plaquetas se realizó como se describe en la solicitud de patente de E.U.A. Serie No. 12/004,045.

En resumen, muestras de sangre venosa (9 partes) de donadores sanos que no habían recibido ningún medicamento por lo menos durante dos semanas se recolectaron en 3.8 % de citrato de sodio (1 parte). Las muestras de sangre se centrifugaron a 150 x g durante 10 min para obtener plasma rico en plaquetas (PRP) y se dejó reposar durante 5 min, y PRP se recolectó. El plasma pobre en plaquetas (PPP) se preparó de la sangre restante rentrifugando a 2000x g durante 25 min. El conteo de plaquetas de PPP se midió en un analizador de hematología y se diluyó a 250,000 plaquetas/µ?. Una solución de 190 µ? de PRP y 10 µ? de ya sea regulador de pH Rho o PBS se incubaron durante 5 min en un agregómetro Hema Tracer 601 a 37°C. Diez microlitros de 200 µ? de difosfato de adenosina (ADP) se añadieron posteriormente para monitorear la respuesta de agregación de plaquetas por trasnsmisión de luz. Mientras más baja es la CI50, mayor será la especificidad o potencia de la variante.

Resultados El cuadro 2 demuestra los efectos inhibidores de HSA(C34S)-ARLDDL y otras proteínas probadas sobre integrinas a?ß3, a5ß1 , y allb33 y sobre agregación de plaquetas.

CUADRO 2 Inhibición de agregación de plaquetas y adhesión celular por HSA(C34S)-ARLDDL y otras proteínas Cl50 (nM) Agregación a?ß3 a5ß1 allbp3 Proteínas de plaquetas ARLDDL 10380 48 6420 23171 Peg-ARLDDL 13210 115 >5850 15672 HSA-ARLDDL 11234 53 >5850 12321 HSA(C34S)- 10973 38 >5850 11432 ARLDDL Como lo demuestra el cuadro 2 , la modificación de C34S en el constructo HSA-ARLDDL virtualmente no tenía efecto sobre la actividad para inhibir la unión de integrina allb 3 o a5ß1 a las proteínas de matriz. Sin embargo, la selectividad a la integrina a?ß3 se incrementó como resultado de la modificación de secuencia (CI50 of 38 vs 53).

EJEMPLO 4 Efectos de HSA(C34S)-ARLDDL sobre osteoclastoqénesis Los osteoclastos son miembros de la familia de monocitos/macrófagos especializados que se diferencian de precursores hematopoyéticos de médula ósea. Cultivos de precursores de osteoclastos en presencia de M-CSF (20 ng/ml) y sRANKL (50 ng/ml) durante 8 días indujeron la formación de osteoclastos maduros grandes con múltiples núcleos, que se caracterizaron por la adquisición de marcadores fenotipicos maduros, tales como TRAP. El método de osteoclastogénesis de células hematopoyéticas cultivadas de médula ósea y los efectos de HSA(C34S)-ARLDDL y proteínas relacionadas sobre osteoclastogénesis se investigaron como sigue.

Las células de médula ósea se prepararon removiendo fémures de ratas DS de 6~8 semanas de edad y se lavó a chorro la cavidad de la médula ósea con a-MEM que es complementada con 20 mM de HEPES y 10%de FCS inactivados con calor, 2 mM-glutamina, penicilina (100 U/ml) y estreptomicina (100 pg/ml). Las células no adherentes (células hematopoyéticas) se recolectaron y se usaron como precursores de osteoclastos después de 24 hr. Las células se sembraron a 1 x106 células/pozo (0.5 mi) en placas de 24 pozos en presencia de RANKL soluble recombinante humano (50 ng/ml) y M-CSF de murino (20 ng/ml). El medio de cultivo fue remplazado cada 3 días. La formación de osteoclastos fue confirmada por una prueba de fosfatasa ácida resistente al tartrato (TRAP) el día 8. En resumen, las células adherentes se fijaron con 10% de formaldehído en solución salina regulada en su pH con fosfato durante 3 min. Después del tratamiento con etanol/acetona (50:50 v/v) durante 1 min, la superficie celular se secó con aire y se incubó durante 10 min a temperatura ambiente en un regulador de pH de acetato (0.1 M de acetato de sodio, pH 5.0) que contenía 0.01 % de fosfato de naftol AS-MX (Sigma) y 0.03% de sal de LB de rojo violeta resistente (Sigma) en presencia de 50 mM de tartrato de sodio. Células TRAP-positivas similares a opsteaoclastos en cada pozo se marcaron al contar el número de células TRAP-positivas y multinucleadas que contenían más de tres núcleos.

HSA(C34S)-ARLDDL y HSA-ARLDDL inhibieron marcadamente la diferenciación de osteoclastos.

La figura 9A es control. Demuestra los osteoclastos en células que no se trataron con ningún polipéptido.

La figura 9B muestra células tratadas con 10 nM de HSA(C34S)- ARLDDL.

La figura 9C muestra células tratadas con 30 nM de HSA(C34S)-ARLDDL.

La figura 10A es una gráfica que demuestra que a medida que la concentración de alendronato incrementa, el número de osteoclastos disminuye. La CI50 para alendronato se midió para ser 1.9 µ?.

La figura 10B es una gráfica que demuestra que a medida que la concentración de HSA-ARLDDL incrementa, el número de osteoclastos disminuye. La Cl50 para HSA-ARLDDL se midió para ser 11.7 nM.

La figura 10C es una gráfica que demuestra que a medida que la concentración de HSA(C34S)-ARLDDL incrementa, el número de osteoclastos disminuye. La CI50 para HSA(C34S)-ARLDDL se midió para ser 6.7 nM.

Como lo demuestra este experimento, tanto HSA(C34S)-ARLDDL como HSA-ARLDDL fueron significativamente más efectivos que alendronato en la reducción del número de osteoclastos.

EJEMPLO 5 Inhibición de angioqénesis por HSA-ARLDDL v HSA(C34S)-ARLDPL en un modelo de ratón de retinopatía de premadurez Un modelo animal para retinopatía de premadurez en ratones se generó usando angiogénesis hipóxico-inducida como se describe en Wilkinson-Berka et al. (Wilkinson-Berka, J.L., Alousis, N.S., Kelly D.J. , et al (2003) COX-2 inhibition and retina! angiogenesis in a mouse model of retinopathy of prematurity. Invest Ophthalmol Vis Sci 44: 974-979.28). En resumen, ratones de siete días de edad y su madre fueron alojados en cámaras selladas que contenían 75% O2 y aire. Los ratones permanecieron en la cámara por cinco días (período hiperóxico, P7 to P12) y después se alojaron en aire ambiental por siete días adicionales (período angiogénenico hipóxico-inducido, 12 días postnatales a 19 días postnatales, o P12 a P19). Ya sea HSA-ARLDDL o HSA(C34S)-ARLDDL en varias cantidades se administraron por una vía intravítrea el día 12 y los ratones fueron sacrificados el día 19.

Se hicieron tres secciones de uno de los ojos de cada animal, se desparafinizaron, y se tiñeron con hematoxilina y eosina. Los perfiles de vasos sanguíneos (BVPs) se contaron en la retina interna, y se incluyeron vasos adherentes a la membrana limitante interna. El conteo se realizó en un fotomicroscopio (Leica) a una amplificación de 100x.

Como se muestra en la figura 1 1 A, HSA-ARLDDL inhibió la angiogénesis en un modelo de ratón de retinopatía de premadurez (ROP). HSA-ARLDDL a dosis de 0.001 , 0.1 y 10 pg/ojo redujo el número de vasos por sección retinal en comparación con el grupo tratado con solución salina normal. Los datos se presentan como Media±EE. Con la excepción del grupo al que se administró 0.001 pg/ojo de HSA-ARLDDL, p fue menor que 0.001.

Las células endoteliales se contaron en la parte anterior de la capa de células de ganglión en la membrana limitante interna de la retina por una persona que no conocía la misma identidad. Los resultados se muestran en la figura 1 1 B.

Los resultados demuestran que HSA-ARLDDL a 0.001 pg, 0.1 pg y 10 pg por ojo redujeron el número de células endoteliales por sección retinal en comparación con el grupo tratado con solución salina normal.

Como se muestra en la figura 11 C, HSA(C34S)-ARLDDL también inhibió la angiogénesis en un modelo de ratón de retinopatía de premadurez (ROP). HSA(C34S)-ARLDDL a dosis de 0.1 , 10 y 1000 pg/ojo redujo el número de vasos por sección retinal en comparación con el grupo tratado con solución salina normal. Los datos se presentan como Media±EE. En todos los casos, p fue menor que 0.001.

Las células endoteliales se contaron en la parte anterior de la capa de células de ganglión en la membrana limitante interna de la retina por una persona que no conocía la misma identidad. Los resultados se muestran en la figura 1 D.

Los resultados demuestran que HSA(C34S)-ARLDDL en 0.1 pg, 10 pg y 1000 pg por ojo redujo el número de células endoteliales por sección retinal en comparación con el grupo tratado con solución salina normal.

Las figuras 1 1 E, 11 F y 11 G son fotografías que muestran angiogénesis en un modelo de ratón de retinopatía inducida por oxígeno. La figura 11 E muestra normoxia (grupo de control, La figura 11 F muestra angiogénesis en un ratón con retinopatía inducida por oxígeno y la figura 11 G muestra reducción de angiogénesis en un ratón con retinopatía inducida por oxígeno tratada con 10 pg de HSA(C34S)-ARLDDL.

Los resultados del experimento muestran que HSA(C34S)-ARLDDL inhibe la angiogénesis en un ratón con retinopatía inducida por oxígeno .

EJEMPLO 6 Inhibición de crecimiento tu moral por HSA(C34S)-ARLDDL Células de PC-3 humanas (cáncer de próstata) FUERON implantadas en ratones con deficiencia combinada con deficiencia inmunológica severa diabética no obesos (NOD-SCID) como sigue. A cada ratón se inyectó subcutáneamente en el flanco derecho 1 x 107 células. Los tumores se monitorearon cada dos días. El día 27 del estudio, los animales se dividieron en dos grupos. Un grupo se trató con solución salina y otro grupo se trató con HSA(C34S)-ARLDDL (20 mg/kg, por vía intravenosa, dos veces a la semana).

El tamaño del tumor en mm3 se calculó como sigue: Volumen del tumor = w2 x 112, en donde w es la anchura (mm) y / es la longitud (mm) del tumor.

El peso del tumor se estimó con base en la suposición de que 1 mg es equivalente a 1 mm3 de volumen del tumor.

La figura 12A es un control que muestra una fotografía de dos ratones a los que se inyectó las células PC-3 humanas. La figura 12B es una fotografía de dos ratones a los que se inyectó las células PC-3 humanas y tratados con HSA(C34S)-ARLDDL (20 mg/kg, por vía intravenosa, dos veces a la semana).

La figura 12C es una fotografía de tumores extirpados de los ratones de control y la figura 12D es una fotografía de tumores extirpados de los ratones tratados con HSA(C34S)-ARLDDL La figura 13 es una gráfica que muestra que HSA(C34S)-ARLDDL significativamente inhibió el crecimiento de tumores en los ratones tratados con esta proteína como se mide por el tamaño del tumor. Las flechas en la gráfica indican inyecciones de HSA(C34S)-ARLDDL.

EJEMPLO 7 Pruebas anti-anqiogénesis de tapón de MATRIGEL Para investigar si HSA(C34S)-ARLDDL puede inhibir la angiogénesis, se usaron pruebas de angiogénesis de tapón de MATRIGEL™ se usaron como se describe en la publicación de solicitud de patente de E.U.A. No. 2008-0188413 A1. En resumen, una alícuota (500µ?) de MATRIGEL™ (Becton Dickinson Lab.) que contenía 200 ng/ml VEGF se inyectó subcutáneamente en la región dorsal de ratones C57BL/6 de 6-8 semanas de edad. El MATRIGEL™ formó un tapón rápidamente. HSA(C34S)-ARLDDL a 10 mg/kg o a 1 mg/kg se administró por vía intravenosa una vez el día 2 y los ratones fueron sacrificados el día 7. La figura 14A ilustra fotografías de los tapones.

Los vasos nuevos se cuantificaron midiendo la hemoglobina de los tapones como una indicación de la formación de vasos sanguíneos con el método Drabkin y kit de reactivo Drabkin 525 (Sigma) (figura 14B).

Las figuras 14A y 14B muestran que HSA(C34S)-ARLDDL fue efectiva para inhibir angiogénesis usando pruebas de tapón de MATRIGEL™. *: P < 0.05 versus control Secuencias de aminoácidos y nucleótidos usadas en la solicitud SEQ ID NO: 1 es una secuencia de aminoácidos de variante ARLDDL de rodostomina. Se expone en la figura 2.

SEQ ID NO: 2 es una secuencia de nucleótidos que codifica variante ARLDDL de rodostomina. Se expone en la figura 3A. SEQ ID NO: 3 es otra secuencia de nucleótidos que codifica variante ARLDDL de rodostomina. Se expone en la figura 3B.

SEQ ID NOS: 4 y 5 son, respectivamente, secuencias de aminoácidos y nucleótidos de mutante HSA C34S. Se exponen en las figuras 4A y 4B.

SEQ ID NOS: 6 y 7 son, respectivamente, secuencias de aminoácidos y nucleótidos de mutante HSA C34A. Se exponen en las figuras 5A y 5B.

SEQ ID NO: 8 es una secuencias de aminoácidos de un aminoácido enlazador. Se expone en la figura 6.

SEQ ID NOS: 9 y 10 son, respectivamente, secuencias de aminoácidos y nucleótidos de mutante HSA(C34S)-ARLDDL. Se exponen en las figuras 7A y 7B.

SEQ ID NOS: 11 y 12 son, respectivamente, secuencias de aminoácidos y nucleótidos de mutante HSA(C34A)-ARLDDL. Se exponen en las figuras 8A y 8B.

La descripción anterior de las modalidades ilustrativas de la invención se ha presentado únicamente para propósitos de ilustración y descripción y no se pretende que sea exhaustiva o limite la invención a las formas precisas descritas. Muchas modificaciones y variaciones son posibles a la luz de las enseñanzas anteriores.

Otras modalidades de la invención serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la consideración de la especificación y práctica de la invención descrita aquí. Se pretende que la especificación y ejemplos sean considerados como ilustrativos únicamente, con un alcance y esencia verdaderos de la invención siendo indicados por las siguientes reivindicaciones.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1- Un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 , en donde el polipéptido es conjugado con una variante de albúmina de suero humana (HSA) que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, o una sal farmacéuticamente aceptable de dicho polipéptido.

2. - Un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 , en donde el polipéptido es conjugado con una variante de albúmina de suero humana (HSA) que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, o una sal farmacéuticamente aceptable de dicho polipéptido.

3. - El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado además porque dicho polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos enlazadora.

4. - El polipéptido de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque dicha secuencia de aminoácidos enlazadora comprende una combinación de aminoácidos glicina y serina.

5. - El polipéptido de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque dicha secuencia de aminoácidos enlazadora comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.

6. - Un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, o una sal farmacéuticamente aceptable de dicho polipéptido.

7. - Un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 1 , o una sal farmacéuticamente aceptable de dicho polipéptido.

8. - Un polipéptido codificado por un polinucleótido que comprende a secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 10.

9. - Un polipéptido es codificado por un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 12.

10. - Una composición fisiológicamente aceptable que comprende el polipéptido de las reivindicaciones 1 ó 2, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. 1 1.- Una composición fisiológicamente aceptable que comprende un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, o una sal farmacéuticamente aceptable de dicho polipéptido, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. 12.- Una composición fisiológicamente aceptable que comprende un polipéptido codificado por un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 10, o una sal farmacéuticamente aceptable de dicho polipéptido, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. 13.- El uso del polipéptido de las reivindicaciones 1 o 2, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad asociada a integrina a?ß3 en un mamífero. 14.- El uso de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad asociada a integrina a?ß3 en un mamífero. 15. - El uso de un polipéptido codificado por un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 10, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad asociada a integrina a?ß3 en un mamífero. 16. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 14 ó 15, en donde dicha enfermedad asociada a integrina a?ß3 es crecimiento tumoral o metástasis de tumor en hueso. 17. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 14 ó 15, en donde dicha enfermedad asociada a integrina a?ß3 es una enfermedad ocular relacionada con angiogénesis seleccionada del grupo que consiste de degeneración macular relacionada con la edad, retinopatía diabética, enfermedades neovascularizantes de la córnea, retinopatía neovascularizante inducida por isquemia relacionada con la edad, miopía alta y retinopatía de premadurez. 18.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 14 ó 15, en donde dicha enfermedad asociada a integrina a?ß3 se selecciona del grupo que consiste de osteoporosis, hipercalcemia inducida por malignidad, mieloma múltiple, y enfermedad de Paget. 19.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 14 ó 15, en donde el medicamento se adapta además para ser co-administrable con otro agente activo. 20. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 9, en donde el otro agente activo se selecciona del grupo que consiste de antagonistas de VEGF, agentes anti-inflamación, bisfosfonatos, y agentes citotóxicos. 21. - Un método para hacer el polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 ó 2 que comprende (a) construir un gen que codifica el polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, (b) transfectar una célula hospedera con el gen del paso (a); (c) hacer crecer dicha célula hospedera en un medio de cultivo; y (d) aislar dicho polipéptido. 22. - Un método para hacer un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 que comprende (a) construir un gen que codifica dicho polipéptido, (b) transfectar una célula hospedera con el gen del paso (a); (c) hacer crecer dicha célula hospedera en un medio de cultivo; y (d) aislar dicho polipéptido.