ES2797901T3 - Proteínas de fusión para la inhibición de angiogénesis - Google Patents

Abstract

Una proteína de fusión que comprende: un péptido de unión a integrina que comprende unión de desintegrina a integrina αvβx o α5β1 o sus fragmentos de unión a integrina; otro péptido de unión a proteínas que se une a un factor angiogénico, en el que el factor angiogénico comprende angiopoyetina (ANG), efrina (Eph), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), neuropilina (NRP), activadores de plasminógeno, receptor activador de plasminógeno de tipo uroquinasa (uPAR), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento tumoral beta (TGF-β), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), cadherina endotelial vascular (VE-cadherina), Factor de crecimiento similar a la insulina (IGF), factor de crecimiento del tejido conectivo (CTGF), Factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α), Interleucina 1 (IL-1), Interleucina 6 (IL- 6), Factor estimulante de colonias de macrófagos de granulocitos (GMCSF), y sus receptores; y un dominio Fc; en donde x es 1, 3, 5, 6 u 8 .

Description

DESCRIPCIÓN

Proteínas de fusión para la inhibición de angiogénesis

CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0001] La presente invención se refiere a un producto biológico que inhibe la angiogénesis. En particular, la presente invención se refiere a proteínas de fusión que inhiben las vías activadas por el factor angiogénico, las composiciones de estas proteínas de fusión, así como los métodos para producir y usar las mismas.

REFERENCIA A UNA LISTA DE SECUENCIAS PRESENTADA COMO ARCHIVO DE TEXTO A TRAVÉS DE LA WEB DE EFS

[0002] La copia oficial de la lista de secuencias se envía electrónicamente a través de la Web de EFS como una lista de secuencias con formato ASCII con un archivo llamado 479685SEQLIST.TXT, creado el 17 de junio de 2016 y que tiene un tamaño de 37 kb, y se presenta simultáneamente con la especificación. La lista de secuencias contenida en este documento con formato ASCII es parte de la especificación y se incorpora aquí como referencia en su totalidad.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0003] La angiogénesis es el proceso de crecimiento de nuevos vasos sanguíneos a partir de la vasculatura existente. Desempeña un papel importante en varios procesos fisiológicos, incluido el desarrollo embrionario, así como la reparación de tejidos y heridas (Folkman J et al., Angiogenic factors. Science 1987; 235:442-7). Los pasos fisiológicos de la angiogénesis están bien caracterizados e implican la proteólisis de la matriz extracelular, la proliferación, la migración y el ensamblaje de las células endoteliales en un canal tubular, reclutamiento y diferenciación de células murales y producción de matriz extracelular (Carmeliet P et al., Nature 2011; 473:298-307). La angiogénesis patológica puede ocurrir en la formación de tumores, trastornos oculares (p. ej., retinopatía diabética, edema macular diabético o degeneración macular), artritis, psoriasis, enfermedades fibróticas, enfermedades inflamatorias y arteriosclerosis (Polverini PJ. Crit Rev Oral Biol Med. 1995; 6 (3): 230-47).

[0004] La angiogénesis patológica es más heterogénea y caótica, y a menudo demuestra una organización de vasos tortuosa, huecos hipóxicos de varios tamaños, paredes y revestimientos de vasos desiguales e imperfectos, y perfusión ineficaz (Jain RK., Nat Med. 2003; 9(6): 685-93). Estas características distintivas de la formación de nuevos vasos sanguíneos en las enfermedades han convertido en un desafío la focalización terapéutica de la angiogénesis. Aunque las terapias anti-VEGF como Lucentis®, Eylea® o el uso fuera de etiqueta de Avastin® generalmente pueden estabilizar o mejorar la función visual, pueden desarrollarse cicatrices subretinianas (fibrosis) en aproximadamente la mitad de todos los ojos tratados dentro de los dos años posteriores al tratamiento anti-VEGF y se ha identificado como una causa de resultados no exitosos (Daniel E et al., Ophthalmology. 2014;121(3):656-66). Es probable que muchos de los jugadores críticos en la fibrosis sub-retiniana sean los factores de crecimiento y las proteínas matricelulares que están involucradas en el proceso fibrótico (proliferación celular, migración y remodelación de ECM). A pesar de su complejidad, con nuestro conocimiento creciente del proceso angiogénico, el desarrollo de fármacos antiangiogénicos sigue siendo un área de gran interés.

[0005] Actualmente, se han identificado muchos actores clave en el proceso de neovascularización, y la familia del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) tiene un papel predominante. La familia humana VEGf consta de 6 miembros: VEGF-A VEGF-B, VEGF-C, Ve GF-D, VEGF-E y factor de crecimiento placentario (PIGF). Además, se generan múltiples isoformas de VEGF-A, VEGF-B y PIGF a través del empalme de ARN alternativo (Sullivan et al., MAbs, 2002, 2 (2): 165-75). VEGF-A es el factor primario involucrado con la angiogénesis; se une tanto a VEGFR-1 como a VEGFR-2. La estrategia de inhibir la angiogénesis mediante la obstrucción de la señalización de VEGF-A ha establecido terapias exitosas para el tratamiento de cánceres específicos, así como enfermedades neovaculares e isquémicas de la retina. (Major et al., J Pharmacol Exp Then, 1997, 283 (1): 402-10; Willet et al., Nat. Med. 2004, 10: 145-7; Papadopoulos et al., Angiogenesis, 2012, 15 (2): 171-85; Aiello et al., PNAS, 1995, 92: 10457-61).

[0006] Otros factores de crecimiento, citocinas, quimiocinas incluyen factores de crecimiento derivados de plaquetas (PDGF), factores de crecimiento transformantes beta (TGF-p), factores de crecimiento epidérmico (EGF), factores de crecimiento nervioso (NGF), factor inducido por hipoxia (HIF), factor de crecimiento de tejido conectivo (CTGF), factor estimulador de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), factor de crecimiento similar a la insulina (IGF), factores de crecimiento de hepatocitos/factor de dispersión (HGF/SF), factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a), Interleucina 1 (IL-1), interleucina 6 (IL-6), interleucina 8 (IL-8), interleucina 17 (IL-17), interleucina 18 (IL-18), interleucina 20 (IL-20), interleucina 23 (IL-23), quimioatrayentes como el ligando con motivo C-C (CCL28, CCL21) y el ligando con motivo C-X-C (CXCL1, CXCL5), el factor inhibidor de la migración de macrófagos (MIF) y las proteínas de la superficie de las células inmunes como los grupos de diferenciación (CD). Se informa que estos factores están sobreexpresados y juegan un papel clave en las enfermedades relacionadas con la angiogénesis (Elshabrawy et al., Angiogenesis (2015) 18: 433-448; Brian P. Eliceiri, Circ Res. 2001 7 de diciembre; 89 (12): 1104-10). La focalización a estos factores para reducir su activación de la ruta corriente abajo puede disminuir las enfermedades relacionadas con la angiogénesis.

[0007] También se encuentra que las integrinas, una familia de receptores de la superficie celular, se sobreexpresan en la superficie de las células endoteliales y se cree que facilitan el crecimiento y la supervivencia de los vasos recién formados durante la angiogénesis. Las integrinas son receptores heterodiméricos de la superficie celular que interactúan con las proteínas de la matriz extracelular y son fundamentales para muchos procesos biológicos. La expresión de las integrinas en varios tipos de células están involucradas en la progresión tumoral, y su capacidad de cruzarse con los receptores del factor de crecimiento los ha convertido en dianas terapéuticas atractivas. (Staunton DE, et al., Adv Immunol. 2006; 91:111-57; Avraamidas, C. J., et al., Nat Rev Cancer 2008; 8: 604-617.) En particular, la integrina avp3 está regulada positivamente tanto en células tumorales como en células endoteliales angiogénicas, y es importante para la migración de células tumorales, angiogénesis y señalización de células desreguladas. Por lo tanto, los antagonistas de la integrina avp3 se estudian intensamente por sus propiedades antiangiogénicas y antitumorales (Desgrosellier JS et al., Nat Rev Cancer. 2010 10: 9-22).

[0008] Las desintegrinas son los péptidos que se encuentran en el veneno de serpiente de la familia de las víboras e inhiben principalmente la función de las integrinas asociadas a p1 y p3. Primero se identificaron como inhibidores de la integrina allp3 y posteriormente se unió con alta afinidad a otras integrinas, bloqueando la interacción de las integrinas con las proteínas que contienen RGD. Contienen 47 a 84 aminoácidos con aproximadamente 4 a 7 enlaces disulfuro y llevan el mismo motivo RGD (McLane MA, et al., Proc Soc Exp Biol Med 1998219: 109-1 19; Niewiarowski S, et al., Semin Hematol 199431: 289-300; Calvete JJ., Curr Pharm Des, 2005 11:829-835; Blobel CP et al., Curr Opin Cell Biol 19924: 760-765). La secuencia RGD conservada en la familia de desintegrina juega el papel más importante en el reconocimiento de las integrinas. Se descubrió que las desintegrinas interactúan con ocho de veinticuatro integrinas e inhiben la adhesión celular, la migración y la angiogénesis mediadas por integrinas (McLane MA, et al., Front Biosci. 2008 13: 6617-6637; Swenson S, et al., Curr Pharm Des,2007 13: 2860-2871). Los estudios en animales mostraron que las desintegrinas apuntaban al endotelio neovascular y los tumores metastásicos, lo que indica su posible uso en la terapia contra el cáncer. La unión específica de las proteínas que contienen RGD a la integrina es una función tanto de la conformación como de la secuencia local que rodea el motivo RGD. Muchos estudios han demostrado que los residuos que flanquean el motivo RGD de las proteínas que contienen RGD afectan sus especificidades y afinidades de unión a las integrinas (Scarborough r M et al., J Biol Chem 1993 268: 1058-1065; Rahman S et al., Biochem J 1998) 335: 247-257).

[0009] La angiogénesis es un proceso biológico complejo que involucra varios factores de crecimiento y receptores de señalización, y dirigir moléculas individuales en la cascada de señalización puede no proporcionar un tratamiento clínico efectivo para la angiogénesis no controlada en enfermedades como el cáncer. Por lo tanto, existe una creciente necesidad de desarrollar terapias innovadoras capaces de unir varios factores angiogénicos clave de manera cooperativa para inhibir efectivamente la angiogénesis y la progresión de la enfermedad.

BREVE RESUMEN DE LA INVENCIÓN

[0010] La invención proporcionada en el presente documento describe polipéptidos para unirse específicamente a múltiples objetivos para antagonizar varios factores angiogénicos. La invención también proporciona proteínas de fusión que inhiben una ruta de integrina selectiva y otras rutas angiogénicas. La invención proporciona además composiciones que tienen estas proteínas de fusión. La invención proporciona además composiciones que tienen un vector que comprende un ácido nucleico que codifica las proteínas de fusión. La invención describe además métodos para producir y usar estas proteínas de fusión para el tratamiento o prevención de enfermedades angiogénicas, enfermedades oculares, enfermedades autoinmunes, enfermedades inflamatorias, enfermedades fibróticas y/o cáncer.

[0011] De acuerdo con la presente invención, una proteína de fusión que comprende desintegrina, uniéndose a avpx o a5p1 o sus fragrmentos de unión a integrina, otros péptidos de unión a proteína que se unen a un factor angiogénico, en donde el factor angiogénico comprende Angiopoyetina (ANG), efrina (Eph), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), neuropilina (NRP), activadores de plasminógeno, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento tumoral beta (TGF-p), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), cadherina endotelial vascular (VE-cadherina), factores de crecimiento epidérmico (EGFs), factores de crecimiento de nervios (NGF), factor de crecimiento del tejido conectivo (CTGF), factor estimulante de colonias de macrófagos de granulocitos (GM-CSF), factor de crecimiento similar a la insulina (IGF), factores de crecimiento de hepatocitos/factor de dispersión (HGF/SF), factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a), interleucina 1 (IL-1), interleucina 6 (lL-6), interleucina 8 (IL-8), interleucina 17 (IL-17), Interleucina 18 (IL-18), interleucina 20 (IL-20), interleucina 23 (IL-23), quimioatrayentes como el ligando de motivo C-C (CCL28, CCL21), el ligando de motivo C-X-C (CXCL1, CXCL5), inhibidor de la migración de macrófagos Factor (MIF), proteína de la superficie de la célula inmune, como los grupos de diferenciación (CD), y sus receptores.

[0012] Según un aspecto, la invención proporciona una proteína de fusión que comprende un péptido de unión a integrina que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de un grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 y SEQ ID No : 7, o secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 7, otros péptidos de unión a proteínas que comprenden dominios extracelulares de receptores VEGF y un dominio Fc, en donde el péptido de unión a integrina tiene al menos un mutación en o adyacente a un motivo RGD.

[0013] Según otro aspecto, la invención proporciona una proteína de fusión que comprende un péptido de unión a integrina que incluye desintegrina y sus fragmentos de unión a integrina, otro péptido de unión a proteína que comprende dominios extracelulares de receptores VEGF y un dominio Fc, en donde el péptido de unión a integrina comprende al menos una mutación en o adyacente al motivo RGD. En algunas realizaciones, la proteína de fusión comprende el péptido de unión a integrina, el dominio Fc y el otro péptido de unión a proteína desde el extremo C al extremo N. En algunas realizaciones, la proteína de fusión comprende el péptido de unión a integrina, el dominio Fc y el otro péptido de unión a proteína desde el extremo N al extremo C. En otras realizaciones de la proteína de fusión, el péptido de unión a integrina tiene al menos un 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 7.

[0014] De acuerdo con otras realizaciones, la invención también proporciona una proteína de fusión que comprende un péptido de unión a integrina que incluye una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 con al menos una mutación en o adyacente al motivo RGD, una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, una subregión constante humana o humanizada que comprende un dominio CH² de inmunoglobulina y un dominio CH³ , y otro péptido de unión a proteínas que tiene un tipo similar a dominio Ig D2 de un VEGFR1 y un dominio similar a Ig D3 de un VEGFR2. En una realización adicional de la proteína de fusión, el péptido de unión a integrina tiene al menos un 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2.

[0015] De acuerdo con un aspecto, la invención proporciona una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión de la invención descrita en el presente documento.

[0016] De acuerdo con otro aspecto, la invención proporciona un dímero de proteínas de fusión de la invención descrita aquí.

[0017] De acuerdo con otro aspecto, la invención proporciona un método para producir una proteína de fusión de la invención, que comprende cultivar una célula huésped transfectada con un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico de la invención, en una condición que produce la proteína de fusión y recupera la fusión proteína producida por la célula huésped.

[0018] De acuerdo con otro aspecto, la invención proporciona un método para tratar o prevenir una enfermedad angiogénica que comprende administrar una cantidad eficaz de la proteína de fusión a un sujeto que la necesita. En algunas realizaciones, la enfermedad angiogénica comprende artritis reumatoide, artritis inflamatoria, osteoartritis, cáncer ocular y sistémico, metástasis e invasión relacionadas con tumores, enfermedades fibróticas sistémicas que incluyen fibrosis pulmonar idiopática (FPI), esteatohepatitis no alcohólica (NASH) o fibrosis hepática, nefropatía diabética y/o fibrosis renal, fibrosis dérmica o queloide, cicatrización de heridas, cardio-fibrosis y accidente cerebrovascular inducido por isquemia; enfermedad ocular caracterizada por neovascularización o isquemia (como la neovascularización coroidea), uveítis, retinitis pigmentosa, degeneración macular asociada a la edad (DMAE), retinopatía diabética y edema macular diabético (EMD), oclusión venosa retiniana central y ramificada (CRVO y BRVO), retinopatía humana de prematuridad (ROP), vasculopatía coroidea polipoidal (PCV), adhesión vitreomacular sintomática y glaucoma. En algunas realizaciones, la proteína de fusión de la invención comprende una secuencia enlazadora entre el péptido de unión a integrina y el otro péptido de unión a proteína. En algunas realizaciones, la proteína de fusión de la invención comprende la secuencia del péptido señal corriente arriba del otro dominio de unión.

[0019] De acuerdo con otro aspecto, la invención proporciona una composición que comprende una proteína de fusión de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

[0020] De acuerdo con otro aspecto, la invención proporciona un polipéptido dirigido a múltiples factores angiogénicos que comprende: un péptido de unión a integrina que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de un grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, y SEQ ID NO: 7, o secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 7; otro péptido de unión a proteínas seleccionado de un grupo que consiste en dominios extracelulares de receptores VEGF, anticuerpo anti-VEGF, anticuerpo anti-PDGF y sus fragmentos; y un dominio Fc; en donde el péptido de unión a integrina comprende al menos una mutación en o adyacente al motivo RGD.

[0021] En algunas realizaciones, los dominios extracelulares de los receptores de VEGF en el polipéptido de la invención comprenden los dominios de tipo Ig D1-D7 de los receptores de VEGF. En algunas realizaciones, los dominios extracelulares de los receptores de VEGF en el polipéptido de la invención comprenden: i) el dominio similar a Ig 2 (D2) de un VEGFR1 y un dominio similar a Ig 3 (D3) de un VEGFR2; ii) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; o iii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90% de identidad con la SEQ ID NO: 10. En algunas realizaciones, los dominios extracelulares de los receptores PDGF en el polipéptido de la invención comprenden los dominios similares a Ig 1-5 de los receptores PDGF. En algunas realizaciones, los dominios extracelulares de los receptores PDGF en el polipéptido de la invención comprenden: i) los dominios similares a Ig 1­ 3 de un PDGFRPp; ii) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; o iii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90% de identidad con la SEQ ID NO: 11. En algunas realizaciones, el polipéptido de la invención comprende además un conector Gly-Ser (GS) o Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly (G^g) entre el dominio Fc y el péptido de unión a integrina o los dominios extracelulares de los receptores VEGF o PDGF.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0022] Los anteriores y otros objetos, aspectos, características y ventajas de las realizaciones ejemplares se harán más evidentes y pueden entenderse mejor haciendo referencia a la siguiente descripción tomada junto con los dibujos adjuntos.

La Figura 1 es un esquema que ilustra la composición de una proteína de fusión ejemplar de acuerdo con una realización de la invención.

La Figura 2 es un esquema que ilustra la proteína de fusión 1 purificada analizada por SDS-PAGE.

La Figura 3 es un esquema que ilustra un ensayo de unión de ligando de VEGF.

La Figura 4 es un esquema que ilustra un ensayo de unión competitiva avp3.

La Figura 5 es un esquema que ilustra la proliferación de HUVEC inducida por VEGF.

La Figura 6 es un esquema que ilustra la inhibición de la adhesión celular CHO-avp3.

Las Figuras 7A-G es un esquema que ilustra el efecto inhibidor de la formación de tubos por Proteínas de Fusión. Las Figuras 8A-D proporcionan una realización que muestra la inhibición de la respuesta a la dosis de la fuga inducida por VEGF en conejos con cinturón holandés por proteínas de fusión.

Las Figuras 9A-C proporcionan una realización que muestra la reducción del tamaño de la lesión en la neovascularización coroidea inducida por láser (CNV) en ratas por Proteínas de Fusión. Una flecha (T) indica la ubicación de la lesión láser.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

[0023] A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por una persona experta en la técnica a la que pertenece esta invención.

[0024] Como se usa en este documento, las formas singulares “un”, “una”, “el” y “ la” incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Así, p. ej., la referencia a "un dominio de unión" incluye una pluralidad de dominios de unión y equivalentes de los mismos conocidos por los expertos en la materia.

[0025] Como se usa en el presente documento, el término "polipéptido" y "proteína" se pueden usar indistintamente para referirse a una cadena larga de péptidos que tiene una secuencia de aminoácidos de la proteína nativa o la secuencia de aminoácidos con una o más mutaciones tales como deleción, adiciones, y/o sustituciones de uno o más residuos de aminoácidos.

[0026] Una "proteína de fusión" se refiere a una proteína que tiene dos o más porciones unidas covalentemente, donde cada una de las porciones se deriva de proteínas diferentes.

[0027] La presente invención proporciona una proteína de fusión que comprende un péptido de unión a integrina seleccionado de un grupo que consiste en desintegrina (véanse las Patentes de los Estados Unidos Núms. 7,943,728 y la Solicitud PCT Núm. PCT/US 15/46322 para la descripción de secuencias de aminoácidos, anticuerpo anti-integrina avpx (véanse las Patentes de Estados Unidos N° 6,160,099 y 8,350,010 para la descripción de secuencias de aminoácidos, anticuerpo anti-integrina a5p1, fibronectina (véase la publicación de EE.UU. n° 2015/0218251 para la descripción de secuencias de aminoácidos, isoforma de integrina de focalización avpx o a5p1 y sus fragmentos de unión a integrina, a otro péptido de unión a proteína dirigido a un factor angiogénico y un dominio Fc, en donde x es 1, 3, 5, 6 u 8.

[0028] El término "anticuerpo", como se usa en el presente documento, pretende referirse a moléculas de inmunoglobulina que comprenden cuatro cadenas de polipéptidos, dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras interconectadas por enlaces disulfuro. Una cadena pesada de longitud completa incluye un dominio de región variable, VH, y tres dominios de región constante, CH1, CH2 y CH3. El dominio VH está en el extremo amino del polipéptido, y el dominio CH3 está en el extremo carboxilo. Una cadena ligera de longitud completa incluye un dominio de región variable, VL, y un dominio de región constante, CL. Un fragmento de unión a antígeno (Fab) está compuesto por una cadena ligera y el CH1 y regiones variables de una cadena pesada. La cadena pesada de una molécula Fab no puede formar un enlace disulfuro con otra molécula de cadena pesada. Un fragmento Fab' contiene una cadena ligera y una cadena pesada que contiene más de la región constante, entre los dominios CH1 y CH2, de modo que se puede formar un enlace disulfuro entre cadenas entre dos cadenas pesadas para formar diacuerpos. Una región de fragmento variable (Fv) comprende las regiones variables de las cadenas pesada y ligera, pero carece de las regiones constantes. Los fragmentos de cadena única (scFv) son moléculas Fv en las que las regiones variables de la cadena pesada y ligera se han conectado mediante un conector flexible para formar una cadena de polipéptidos única que forma una región de unión a antígeno. Los anticuerpos de cadena sencilla se discuten en detalle en WO88/01649 y la patente de EE.UU. Nos 4,946,778 y 5,260,203. Como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo" incluye una molécula de inmunoglobulina con dos cadenas L de longitud completa y dos cadenas H de longitud completa, y fragmentos de las mismas, tales como un fragmento de unión a antígeno (Fab), una región Fv, un scFv, etc.

[0029] El término "dominio Fc" se refiere a una molécula o secuencia que comprende la secuencia de una porción de un anticuerpo que no se une al antígeno, ya sea en forma monomérica o multimérica. La fuente de inmunoglobulina original de un Fc es preferiblemente de origen humano y puede ser de cualquier isotipo, p. ej., IgG, IgA, IgM, IgE o IgD. Un Fc de longitud completa consta de las siguientes regiones de cadena pesada de Ig: CH1, CH2 y CH3, en donde las regiones CH1 y CH2 están típicamente conectadas por una región de bisagra flexible.

[0030] La presente invención proporciona una proteína de fusión que comprende un péptido de unión a integrina que incluye desintegrina y sus fragmentos de unión a integrina, otro péptido de unión a proteína que comprende dominios extracelulares del receptor VEGF y un dominio Fc, en donde el péptido de unión a integrina comprende al menos una mutación en o adyacente al motivo RGD. De acuerdo con las realizaciones de la presente invención, la desintegrina y sus fragmentos de unión a integrina tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada de un grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 7, o secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 7.

[0031] Como se usa en este documento, "desintegrina" se refiere a una clase de proteínas o polipéptidos ricos en cisteína que son potentes ligandos solubles de integrinas. El motivo RGD es un tri-péptido (Arg-Gly-Asp) conservado en la mayoría de las desintegrinas monoméricas y está ubicado en un bucle de unión a integrina. Las desintegrinas descritas en el presente documento están aisladas del veneno de serpiente o derivadas de formas de tipo salvaje y tienen al menos una mutación en o adyacente a un motivo RGD para unirse selectivamente o dirigirse a diversas isoformas de integrina. El término "adyacente a un motivo RGD" como se usa en el presente documento significa cualquier mutación que ocurre en cualquier residuo de aminoácido dentro de 15-20 aminoácidos del motivo RGD en una secuencia de péptido o polipéptido dada.

[0032] También se contemplan otras variantes de secuencia de aminoácidos de la desintegrina. Por ejemplo, la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas de una desintegrina pueden mejorarse alterando la secuencia de aminoácidos que codifica la proteína. Los mutantes de desintegrina pueden prepararse introduciendo modificaciones apropiadas en la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína o introduciendo modificación por síntesis de péptidos. Tales modificaciones incluyen mutaciones tales como deleciones, inserciones y/o sustituciones dentro de la secuencia de aminoácidos o ácidos nucleicos de la desintegrina. Se puede hacer una combinación de deleción, inserción y sustitución para llegar al constructo de aminoácidos final de la desintegrina, siempre que el constructo final posea las características deseadas tales como la unión a un miembro de la superfamilia de integrina y/o inhibir la ruta activada por integrina.

[0033] Modificaciones sustanciales en las propiedades biológicas de las proteínas o los polipéptidos se logran seleccionando sustituciones que difieren significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de (a) la estructura del esqueleto del polipéptido en el área de la sustitución, p. ej., como una lámina o conformación helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, o (c) la mayor parte de la cadena lateral.

[0034] Un método útil para identificar ciertos residuos o regiones de la proteína de fusión que son ubicaciones preferidas para la mutagénesis se conoce como "mutagénesis de exploración de alanina" como se describe en Science, 1989, 244: 1081-1085. Por ejemplo, se identifica un residuo o grupo de residuos diana (p. ej., residuos cargados como Arg, Asp, His, Lys y Glu) y se reemplazan por un aminoácido neutro o cargado negativamente (lo más preferiblemente alanina o polialanina) para afectar la interacción de los aminoácidos con el compañero de unión diana. Esas ubicaciones de aminoácidos que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones luego se refinan mediante la introducción de otras variantes u otras en, o para, los sitios de sustitución. Por lo tanto, aunque el sitio para introducir una variación de secuencia de aminoácidos está predeterminado, la naturaleza de la mutación per se no tiene que estar predeterminada. Por ejemplo, para analizar el rendimiento de una mutación en un sitio dado, se puede realizar mutagénesis aleatoria en el codón o región diana y las variantes de polipéptidos de fusión expresadas se seleccionan para la actividad deseada. Por ejemplo, se pueden agregar enlace(s) de cisteína a la proteína de fusión o componentes de proteína para mejorar su estabilidad.

[0035] Por consiguiente, en el presente documento se proporcionan mutantes de desintegrina que pueden ser un componente de cualquier proteína de fusión descrita en el presente documento. En algunas realizaciones, la desintegrina comprende una secuencia de aminoácidos con al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de desintegrinas seleccionadas de un grupo que consiste en Rodostomina (SEQ ID NO: 1), Triflavina (SEQ ID NO: 3), Equistatina (SEQ ID NO: 4), Trimucrina (Se Q ID NO: 5), Elegantina (SEQ ID NO: 6) y Trigramina (SEQ ID NO: 7). En algunas realizaciones, una desintegrina comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una mutación en o adyacente al motivo RGD de Rodostomina (SEQ ID NO: 1), Triflavina (Se Q ID NO: 3), Equistatina (SEQ ID NO: 4), Trimucrina (SEQ ID NO: 5), Elegantina (SEQ ID NO: 6) o Trigramina (SEQ ID NO: 7). En algunas realizaciones, la desintegrina comprende una secuencia de aminoácidos con al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de un mutante de desintegrina (SEQ ID NO: 2). El Xaa en SEQ ID NO: 2 indica varias posiciones que pueden modificarse mediante inserción, sustitución o deleción para producir variantes de secuencia de aminoácidos que son diferentes de la forma de desintegrina de tipo salvaje. De acuerdo con algunos ejemplos, el Xaa en la posición 50 de la SEQ ID NO: 2 que corresponde a la glicina (Gly) en el motivo RGD de Rodostomina de tipo salvaje (SEQ ID NO: 1) puede sustituirse con aminoácidos naturales distintos de la glicina para generar mutantes Rodostomina. En otros ejemplos, uno o más Xaa en la SEQ ID NO: 2 también pueden sustituirse con aminoácidos naturales distintos de los encontrados originalmente en las posiciones correspondientes de Rodostomina de tipo salvaje (SEQ ID NO: 1) para generar diversos mutantes de Rodostomina. Se observa además que los mutantes de desintegrina no se limitan a incluir solo una mutación única en cualquier Xaa en SEQ ID NO: 2, mutaciones múltiples que ocurren en varias ubicaciones de Xaa en SEQ ID NO: 2 o ubicaciones correspondientes en otras secuencias consenso de desintegrina (tal como SEQ ID NOs: 3-7) también pueden estar abarcadas por el alcance de la invención.

[0036] Aunque las variantes de desintegrinas se discuten principalmente con referencia a las secuencias de aminoácidos discutidas anteriormente, las secuencias de polipéptidos o la secuencia de nucleótidos que codifican el veneno de serpiente como Albolabrina, Aplagina, Basilicina, Batroxostatina, Bitistatina, Cereberina, Cerastina, Crotatroxina, Durisina, Flavoridina, Flavostatina, Halisina, Halistatina, Jararacina, Jarastatina, Kistrina, Laquesina, Lutosina, Molosina, Salmosina, Saxatilina, Tergeminina, Trimestatino, Trimutasa, Usuristatino, Viridiano y sus mutantes que tienen al menos una mutación o adyacente al motivo RGD también pueden estar abarcados por el alcance de la presente invención.

[0037] Sin limitarse a la teoría, se contempla en este documento que las desintegrinas inhiben la ruta activada por la integrina uniéndose a un miembro de la superfamilia de integrina para bloquear su interacción con un receptor de integrina multivalente. En algunos aspectos, la desintegrina se une a un miembro de la superfamilia de integrina que incluye pero no se limita a las isoformas de integrina avp1, avp3, avp5, avp6, avp5, a5p1 y/o avllbp3.

[0038] Según la presente invención, el otro péptido de unión a proteínas de la proteína de fusión puede ser una proteína receptora que se une a una diana seleccionada del grupo que consiste en un antígeno tumoral, un miembro de la superfamilia del receptor de TNF, un miembro de la familia Hedgehog, un receptor de tirosina quinasa, una molécula relacionada con proteoglicanos, un miembro de la superfamilia TGF-beta, una molécula relacionada con Wnt y una diana de angiogénesis.

[0039] De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, el otro péptido de unión a proteínas puede unirse específicamente a un diana de angiogénesis que incluye, pero sin limitación, angiopoyetina (ANG), efrina (Eph), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), neuropilina (NRp), activadores de plasminógeno, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento tumoral beta (TGF-p), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), cadherina endotelial vascular (VE-cadherina) y sus receptores. Por lo tanto, de acuerdo con las realizaciones de la invención, el otro péptido de unión a proteínas puede incluir porciones extracelulares de una proteína receptora que se une y antagoniza la diana de angiogénesis. En otras realizaciones, el otro péptido de unión a proteínas puede unirse a porciones extracelulares de receptores de factor angiogénico.

[0040] En algunas realizaciones, el otro péptido de unión a proteínas puede ser un anticuerpo anti-VEGF (véase el documento WO2015/200905 para la descripción de su secuencia de aminoácidos, que se incorpora aquí como referencia en su totalidad) que se une al ligando de VEGF o un anticuerpo anti-VEGFR1 o anti-VEGFR2 (véase la Pat. de EE.UU. N° 5,874,542 para la descripción de su secuencia de aminoácidos, que se incorpora aquí como referencia en su totalidad) que se une al receptor VEGF. En otras realizaciones, el otro péptido de unión a proteínas también puede ser un anticuerpo anti-PDGF (véase la Patente de Estados Unidos N° 5,094,941 para la descripción de su secuencia de aminoácidos, que se incorpora aquí como referencia en su totalidad) que se une al ligando PDGF o un anticuerpo beta anti-PDGFR (véase la Patente de Estados Unidos N° 9,265,827 para la descripción de su secuencia de aminoácidos, que se incorpora aquí como referencia en su totalidad para todos los fines) que se une al receptor PDGF.

[0041] En ciertas realizaciones, el otro péptido de unión a proteínas se une al mismo VEGF como cualquiera de los receptores de VEGF (VEGFR): VEGFR1, VEGFR2 y VEGFR3. En algunas realizaciones, el otro péptido de unión a proteínas comprende al menos una porción extracelular de un VEGFR de cualquiera de los VEGFR descritos en este documento. Por ejemplo, el otro péptido de unión a proteínas comprende al menos una porción extracelular de VEGFR1 o una porción extracelular de VEGFR2. En otro ejemplo, el otro péptido de unión a proteínas comprende una porción extracelular de VEGFR1 tal como el dominio 2 similar a Ig (D2) y una porción extracelular de VEGFR2 tal como el dominio 3 similar a Ig (D3). En algún aspecto, el otro péptido de unión a proteínas comprende una porción extracelular de un VEGFR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 y una porción extracelular de un VEGFR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9. En algún aspecto, el otro péptido de unión a proteínas comprende una fusión de porciones extracelulares de VEGFR1 y VEGFR2 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 o una secuencia de aminoácidos con al menos un 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 10.

[0042] En otras realizaciones, el otro péptido de unión a proteínas se une al mismo PDGF que cualquiera de los receptores de PDGF (PDGFR): PDGFR-a y PDGFR-p. En algunas realizaciones, el otro péptido de unión a proteínas comprende al menos una porción extracelular de un PDGFR de cualquiera de los PDGFR descritos en este documento. Por ejemplo, el otro péptido de unión a proteínas comprende al menos una porción extracelular de PDGFR-a o una porción extracelular de PDGFR-p. En otro ejemplo, el otro péptido de unión a proteínas comprende una porción extracelular de PDGFR-p tal como el dominio similar a Ig 1 - 3. En algún aspecto, el otro péptido de unión a proteínas comprende una porción extracelular de un PDGFR que comprende una secuencia de aminoácidos de s Eq ID NO: 11 o una secuencia de aminoácidos con al menos un 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 11.

[0043] De acuerdo con otras realizaciones, la invención también proporciona una proteína de fusión que comprende un péptido de unión a integrina que incluye una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 con al menos una mutación en o adyacente al motivo RGD, una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, una subregión constante humana o humanizada que comprende un dominio CH² de inmunoglobulina y un dominio CH³ , y otro péptido de unión a proteínas que tiene un tipo similar a Ig D2 de un VEGFR1 y un D3 similar a Ig de un VEGFR2. En una realización adicional de la proteína de fusión, el péptido de unión a integrina tiene al menos un 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2.

[0044] El término "porcentaje (%) de identidad de secuencia" con respecto a un polipéptido de referencia o secuencia de ácido nucleico se define como el porcentaje de residuos de aminoácidos o nucleótidos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos de aminoácidos o nucleótidos en el polipéptido de referencia o secuencia de ácido nucleico, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia, y no considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. La alineación con el fin de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos o de ácidos nucleicos se puede lograr de varias maneras que están dentro de la habilidad en la técnica, p. ej., utilizando programas de computadora disponibles al público, p. ej., como los descritos en Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., Eds., 1987), e incluyen el software b La ST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la materia pueden determinar los parámetros apropiados para medir la alineación, incluidos los algoritmos necesarios para lograr la máxima alineación en toda la longitud de las secuencias que se comparan. Para los fines del presente documento, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos A dada, con o contra una secuencia de aminoácidos B dada se calcula de la siguiente manera: 100 veces la fracción X/Y, donde X es el número de puntuación de residuos de aminoácidos como coincidencias idénticas por el programa de alineación de secuencia en la alineación de ese programa de A y B, y donde Y es el número total de residuos de aminoácidos en B. Se apreciará que donde la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de A a B no será igual al % de identidad de secuencia de aminoácidos de B a A.

[0045] La presente invención proporciona una proteína de fusión dimérica que comprende dos proteínas de fusión, en donde cada proteína de fusión comprende cualquier proteína de fusión descrita aquí. En una realización, la proteína de fusión dimérica comprende dos proteínas de fusión idénticas. En otra realización, la proteína de fusión dimérica puede comprender dos proteínas de fusión diferentes. Las proteínas de fusión descritas en el presente documento pueden formar multímeros de dos o más proteínas de fusión idénticas o formar proteínas de fusión heterólogas a través de un dominio de multimerización que incluye una subregión constante de un anticuerpo humano o humanizado. En algunas realizaciones, la subregión constante de un anticuerpo humano o humanizado se selecciona del grupo que consiste en una región IgG Fc, región IgA Fc, región IgM Fc, región IgD Fc y región IgE Fc. En la realización adicional, la subregión constante de un anticuerpo humano o humanizado se selecciona del grupo que consiste en una región lgG1 Fc, región lgG2 Fc, región lgG3 Fc y región lgG4 Fc. En algún aspecto, la subregión comprende una región CH² y una región CH³ de lgG1, lgG2, lgG3 o lgG4. Las secuencias de aminoácidos que codifican las inmunoglobulinas que comprenden regiones Fc son bien conocidas en la técnica.

[0046] Los componentes de la proteína de fusión se pueden conectar directamente entre sí o mediante conectores. Generalmente, el término "enlazador" significa una o más moléculas, p. ej., ácidos nucleicos, aminoácidos o restos no peptídicos que pueden insertarse entre uno o más dominios componentes. Por ejemplo, los enlazadores pueden usarse para proporcionar un sitio de interés deseable entre los componentes para facilitar la manipulación. También se puede proporcionar un conector para mejorar la expresión de la proteína de fusión de una célula huésped, para disminuir el impedimento estérico de manera que el componente pueda asumir su estructura terciaria óptima y/o interactuar apropiadamente con su molécula diana. Una secuencia enlazadora puede incluir uno o más aminoácidos conectados naturalmente a un componente receptor, o puede ser una secuencia añadida utilizada para mejorar la expresión de la proteína de fusión, para proporcionar sitios de interés específicamente deseados, para permitir que los dominios componentes formen estructuras terciarias óptimas y/o para mejorar la interacción de un componente con su molécula diana.

[0047] Preferiblemente, el conector aumenta la flexibilidad de los componentes de la proteína de fusión sin interferir con la estructura de cada componente funcional dentro de la proteína de fusión. En algunas realizaciones, el resto conector es un conector peptídico con una longitud de 2 a 100 aminoácidos. Los enlazadores ejemplares incluyen péptidos lineales que tienen al menos dos residuos de aminoácidos tales como el enlazador Gly-Gly, Gly-Ala-Gly, Gly-Pro-Ala, Gly (G)n y Gly-Ser (GS). El enlazador GS descrito en este documento incluye, entre otros, (GS)n, (GSGSG)n, (G²S)n, G2 S²G, (G²SG)n, (G³S)n, (G⁴S)n, (GGSGG)nGn y GSG⁴SG⁴SG, en donde n es 1 o más. Un ejemplo del enlazador (G)n incluye un enlazador G⁹. Los péptidos lineales adecuados incluyen poliglicina, poliserina, poliprolina, polialanina y oligopéptidos que consisten en residuos de aminoácidos alanilo y/o serinilo y/o prolinilo y/o glicililo. Los restos enlazadores pueden usarse para unir cualquiera de los componentes de las proteínas de fusión descritas en este documento. En algunas realizaciones, se usa un conector entre una porción extracelular de una proteína receptora y una subregión constante de una inmunoglobulina. En otras realizaciones, se usa un conector entre desintegrina o su variante y una subregión constante de una inmunoglobulina. En ciertas realizaciones, la proteína de fusión comprende un conector entre una porción extracelular de una proteína receptora y desintegrina o su variante, y un conector entre desintegrina o su variante y una subregión constante de una inmunoglobulina. Como se realiza en la presente invención, una proteína de fusión puede comprender al menos un enlazador pero no más de cuatro enlazadores.

[0048] La proteína de fusión descrita en el presente documento puede o no comprender un péptido señal que funciona para secretar la proteína de fusión de una célula huésped. Una secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido señal puede unirse operativamente a una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de interés. En algunas realizaciones, la proteína de fusión comprende un péptido señal. En alguna realización, la proteína de fusión no comprende un péptido señal.

[0049] Además, las proteínas de fusión descritas en la presente invención pueden comprender formas modificadas de los péptidos de unión a proteínas. Por ejemplo, los componentes de proteína de fusión pueden tener modificaciones posteriores a la traducción, que incluyen, por ejemplo, glucosilación, sialilación, acetilación y fosforilación a cualquiera de los péptidos de unión a proteínas.

[0050] Aunque las realizaciones se describen generalmente con referencia a dos péptidos de unión a proteínas incluidos en la proteína de fusión, la invención también contempla una proteína de fusión que incorpora más de dos péptidos de unión a proteínas para proporcionar cualquier efecto adicional o sinérgico en términos de inhibición del proceso de angiogénesis. Por ejemplo, puede haber un péptido de unión a proteínas adicional que se una a otras dianas de angiogénesis o que actúe como antagonistas del factor angiogénico para unirse a los dos péptidos de unión a proteínas existentes.

[0051] La presente invención proporciona un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión de la invención descrita aquí. La invención proporciona además un método para producir una proteína de fusión descrita aquí. El método implica cultivar una célula huésped transfectada con un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico de la invención y recuperar la proteína de fusión producida por la célula huésped en condiciones adecuadas.

[0052] El término "polinucleótido" o "ácido nucleico" como se usa en el presente documento se refiere a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sea ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos. Por lo tanto, este término incluye, entre otros, ADN o ARN monocatenario, bicatenario o multicatenario, ADN genómico, ADNc, híbridos de ADN-ARN o un polímero que comprende bases de purina o pirimidina u otras bases de nucleótidos naturales, modificadas químicamente o bioquímicamente, no naturales o derivatizadas.

[0053] Las moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican una proteína de fusión o un componente de una proteína de fusión pueden estar en forma de ARN, como ARNm, ARNhn, ARNt o cualquier otra forma, o en forma de ADN, que incluye, entre otros, ADNc y ADN genómico obtenido por clonación o producido sintéticamente, o cualquier combinación de los mismos. El ADN puede ser de triple cadena, de doble cadena o de cadena sencilla, o cualquier combinación de los mismos. Cualquier porción de al menos una cadena del ADN o ARN puede ser la cadena codificante, conocida como la cadena sentido, o puede ser la cadena no codificante, también conocida como la cadena antisentido. Los ácidos nucleicos aislados que codifican una proteína de fusión o un componente de proteína de fusión pueden prepararse mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica que incluyen, pero no se limitan a, aislamiento de una fuente natural o preparación mediante mutagénesis mediada por oligonucleótidos y mutagénesis en casete de una variante anterior preparada o una versión no variante de la proteína de fusión o componente de proteína de fusión. Ver Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook et al., 4a ed., Cold Spring Harbor, N.Y.

2012) y Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al. eds., 2003).

[0054] Un "vector" se refiere a un plásmido recombinante que comprende un ácido nucleico para ser entregado en una célula huésped, in vitro o in vivo.

[0055] La presente invención contempla el uso de un vehículo de suministro de ácido nucleico para la introducción de una o más secuencias de ácido nucleico que codifican una proteína de fusión o un componente de proteína de fusión en una célula para la expresión de dicha proteína. Ejemplos de vehículos de suministro de ácido nucleico son liposomas, polímeros biocompatibles, que incluyen polímeros naturales y polímeros sintéticos; lipoproteínas; polipéptidos; polisacáridos; lipopolisacáridos; sobres virales artificiales; partículas de metal; y bacterias, virus, tales como baculovirus, adenovirus y retrovirus, bacteriófagos, cósmidos, plásmidos, vectores fúngicos y otros vehículos recombinantes típicamente utilizados en la técnica que se han descrito en una variedad de huéspedes eucariotas y procariotas. En algunas realizaciones, el vehículo de suministro de ácido nucleico es un vector de expresión tal como un plásmido. El vector puede incluir cualquier elemento para establecer una función convencional de un vector de expresión (p. ej., un promotor, elemento de unión al ribosoma, terminador, potenciador, marcador de selección) y un origen de replicación. El promotor puede ser un promotor constitutivo, inducible o represible. En la técnica se conocen varios vectores de expresión capaces de suministrar ácidos nucleicos a una célula y pueden usarse en la presente memoria para la producción de una proteína de fusión o componente de proteína de fusión en la célula. Las proteínas de fusión expresadas o los componentes de proteínas de fusión se pueden cosechar de las células y purificar de acuerdo con técnicas convencionales conocidas en la técnica y como se describe en el presente documento.

[0056] En el presente documento se proporcionan células huésped que comprenden un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión descrita en el presente documento. Los ácidos nucleicos que codifican proteínas de fusión o componentes de proteínas de fusión (p. ej., una porción extracelular de un receptor de factor angiogénico, una desintegrina o su variante y/o una subregión constante de una inmunoglobulina) pueden proporcionarse a una célula diana por cualquier medio conocido en la técnica. En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica una proteína de interés está en un vector de expresión tal como un plásmido. En otras realizaciones, el ácido nucleico que codifica una proteína de interés está en un vector viral y el vector ha sido empaquetado, entonces los viriones pueden usarse para infectar células. Se sabe que los procedimientos de transfección y transformación se usan apropiadamente para introducir un ácido nucleico que codifica una proteína de interés en una célula diana. Las formulaciones que utilizan polímeros, liposomas o nanoesferas se pueden usar para administrar ácidos nucleicos que codifican una proteína de interés. Las células que se transforman o transfectan con construcciones recombinantes de acuerdo con la invención pueden ser cualquiera que sea conveniente para un experto en la técnica. Los tipos de células ejemplares que pueden usarse incluyen células de bacterias, levaduras, hongos, insectos, plantas y mamíferos. En algunas realizaciones, las células transformadas o transfectadas pueden proporcionarse a una célula o huésped de mamífero. Las células adecuadas para el suministro a una célula o huésped de mamífero incluyen cualquier tipo de célula de mamífero de cualquier origen, tumor o línea celular.

[0057] Las células utilizadas para producir las proteínas de fusión o los componentes de la proteína de fusión de la invención se cultivan en medios conocidos por los expertos en la técnica y adecuados para el cultivo de las células huésped seleccionadas. Un medio dado generalmente se complementa, según sea necesario, con hormonas y/u otros factores de crecimiento, DHFR, sales, tampones, nucleósidos, antibióticos, oligoelementos y glucosa o una fuente de energía equivalente. Cualquier otro suplemento necesario también puede incluirse en concentraciones apropiadas que serían conocidas por los expertos en la materia. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y similares, son las que se usaron previamente con la célula seleccionada para la expresión, y serán evidentes para un experto en la materia.

[0058] Las proteínas pueden purificarse e identificarse usando métodos comúnmente conocidos tales como fraccionamiento en columnas de inmunoafinidad o de intercambio iónico; precipitación de etanol; HPLC de fase inversa; cromatografía sobre sílice o sobre una resina de intercambio catiónico tal como DEAE; cromatofocalización; SDS-PAGE; precipitación con sulfato de amonio; filtración en gel usando, p. ej., Sephadex G-75; resinas de afinidad hidrofóbica, afinidad de ligando usando un compañero de unión adecuado inmovilizado en una matriz, centrifugación, ensayo de inmunosorbente ligado a enzimas (ELISA), BIACore, ensayo de transferencia Western, secuenciación de aminoácidos y ácidos nucleicos, y actividad biológica. En algunas realizaciones, la proteína de fusión se expresa en células huésped y se purifica a partir de la misma usando una combinación de una o más técnicas de purificación estándar, que incluyen, pero no se limitan a, cromatografía de afinidad de proteína A, cromatografía de afinidad de proteína G, intercambio de tampón, cromatografía de exclusión molecular, ultrafiltración y diálisis. En consecuencia, la proteína de fusión recuperada es sustancialmente pura. En una realización adicional, la proteína de fusión recuperada es al menos cualquiera de 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% puro.

[0059] Las proteínas de fusión o los componentes de la proteína de fusión descritos en este documento pueden caracterizarse o evaluarse para actividades biológicas que incluyen, pero no se limitan a, afinidad con un compañero de unión a la diana, unión competitiva, actividad inhibidora, inhibición de la proliferación celular, inhibición del crecimiento tumoral e inhibición de angiogénesis. En algunas realizaciones, las proteínas de fusión o los componentes de la proteína de fusión descritos aquí pueden evaluarse para determinar la actividad biológica in vitro e in vivo. En la técnica se conocen muchos métodos para evaluar la afinidad de unión y se pueden usar para identificar las afinidades de unión de las proteínas de fusión o los componentes de la proteína de fusión a un compañero de unión. Las afinidades de unión se pueden expresar como valores de constante de disociación (Kd) o valores de concentración efectiva media máxima (CE⁵⁰).

[0060] En cualquiera de las realizaciones de la presente memoria, una proteína de fusión tiene una CE50 menor o igual a 1 j M, 1 O0 nM, 10 nM, 1 nM, 0,1 nM, 0,01 nM o 0,001 nM para la inhibición de una actividad (p. ej., inhibición de actividad del factor angiogénico y/o actividad de la integrina). En cualquiera de las realizaciones de la presente memoria, una proteína de fusión tiene una Kd para un compañero de unión (factor angiogénico y/o integrina) de menos de aproximadamente 1,0 mM, 500 j M, 100 j M, 50 j M, 10 j M, 5 j M, 1 j M, 500 nM, 100 nM, 50 nM, 10 nM, 5 nM, 1 nM, 500 pM, 100 pM, 50 pM, 10 pM o 5 pM, incluidos los valores entre estos números.

[0061] La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende una proteína de fusión que comprende un péptido de unión a integrina seleccionado de un grupo que consiste en desintegrina, anticuerpo antiintegrina avpx, anticuerpo anti-integrina a5p1, integrina dirigida a fibronectina avpx o a5p1 y sus fragmentos de unión a integrina, otro péptido de unión a proteína dirigido a un factor angiogénico y un dominio Fc, en donde x es 1, 3, 5, 6 u 8. Las composiciones de la invención comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de la proteína de fusión.

[0062] El término "cantidad terapéuticamente efectiva" significa una cantidad de un compuesto terapéuticamente activo necesaria para provocar el efecto biológico o clínico deseado. De acuerdo con las realizaciones de la invención, "una cantidad terapéuticamente efectiva" es una cantidad suficiente para lograr resultados beneficiosos o deseados, incluyendo resultados clínicos. Se puede administrar una cantidad terapéuticamente efectiva en una o más administraciones. En términos de un estado de enfermedad, una cantidad terapéuticamente efectiva es una cantidad suficiente para mejorar, estabilizar o retrasar el desarrollo de una enfermedad. De acuerdo con realizaciones específicas de la invención, una cantidad terapéuticamente efectiva es una cantidad de una proteína de fusión necesaria para tratar o prevenir un trastorno caracterizado por angiogénesis anormal, tal como una enfermedad caracterizada por neovascularización, permeabilidad vascular, edema, inflamación, retinopatías, fibrosis o cáncer.

[0063] En algunas realizaciones, la composición farmacéutica que comprende una proteína de fusión comprende una proteína de fusión formulada en un tampón a una concentración de proteína de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 100 mg/ml, preferiblemente de aproximadamente 40 a aproximadamente 80 mg/ml, tal como aproximadamente 40, 50, 60, 70 u 80 mg/ml, lo más preferiblemente aproximadamente 40 ± aproximadamente 5 mg/ml. En otras realizaciones preferidas, la proteína de fusión se formula en un tampón a una concentración de proteína de más de aproximadamente 40 mg/ml.

[0064] En realizaciones particulares, el tampón es un tampón fosfato con un pH de aproximadamente 6,5 a 8, más preferiblemente de aproximadamente 7 a 7,5, incluso más preferiblemente de aproximadamente 7,2. El tampón fosfato comprende aproximadamente 5 a 20 mM de fosfato de sodio, tal como 5, 10, 15 o 20 mM de fosfato de sodio, más preferiblemente aproximadamente 10 mM de fosfato de sodio; aproximadamente 20 a 60 mM de cloruro de sodio, más preferiblemente aproximadamente 40 mM de cloruro de sodio; aproximadamente 1 a 10% en peso por volumen (p/v) de sacarosa, más preferiblemente aproximadamente 5% p/v de sacarosa; y aproximadamente 0,01 a 0,05% p/v de un tensioactivo, más preferiblemente aproximadamente 0,03% p/v de polisorbato 20.

[0065] En otras realizaciones particulares, el tampón es un tampón de histidina con un pH de aproximadamente 5 a 8, más preferiblemente aproximadamente 6 a 7, lo más preferiblemente aproximadamente 6,8. El tampón de histidina comprende histidina de aproximadamente 10 a 50 mM, tal como histidina 10, 20, 30, 40 o 50 mM, más preferiblemente histidina aproximadamente 25 mM; aproximadamente 10 a 30 mM de cloruro de sodio, tal como 10, 20 o 30 mM de cloruro de sodio, más preferiblemente aproximadamente 20 mM de cloruro de sodio; aproximadamente 1 a 10% p/v de sacarosa, tal como 1, 2, 4, 6, 8 o 10% p/v de sacarosa, más preferiblemente aproximadamente 6% p/v de sacarosa; y aproximadamente 0,01 a 0,05% p/v de un tensioactivo, más preferiblemente aproximadamente 0,03% p/v de polisorbato 20.

[0066] La presente invención también se refiere a un uso de la composición según la presente invención para tratar o prevenir una enfermedad asociada a la integrina en un individuo o un sujeto. Un "individuo" o "sujeto" es un mamífero. Los mamíferos incluyen, entre otros, animales domesticados (p. ej., vacas, ovejas, gatos, perros y caballos), primates (p. ej., primates humanos y no humanos como monos), conejos y roedores (p. ej., ratones y ratas). En algunas realizaciones, un método para tratar o prevenir uno o más aspectos o síntomas de una enfermedad comprende administrar una cantidad efectiva de una composición que comprende la proteína de fusión a un individuo.

[0067] Los métodos descritos en este documento pueden usarse para el tratamiento de una variedad de enfermedades, que incluyen, pero no se limitan a, enfermedad inflamatoria, enfermedad ocular, enfermedad autoinmune o cáncer. En algunas realizaciones, la enfermedad a tratar incluye, pero no se limita a, artritis reumatoide, artritis inflamatoria, osteoartritis, cáncer, fibrosis, retinitis pigmentosa, uveítis (como uveítis anterior o posterior y enfermedad ocular caracterizada por neovascularización o isquemia (como la neovascularización coroidea, retiniopatía diabética, edema macular diabético, degeneración macular asociada a la edad (DMAE), oclusión venosa retiniana, vascularización coroidea polipoidal.

[0068] Las composiciones descritas en el presente documento pueden administrarse a un individuo por cualquier vía, que incluye, pero no se limita a, intravenosa, intraperitoneal, ocular, intraarterial, intrapulmonar, oral, inhalación, intravesicular, intramuscular, intratraqueal, subcutánea, intratecal, transdérmica, transpleural, intraarterial, tópica, inhalatoria, mucosa, subcutánea, transdérmica, gastrointestinal, intraarticular, intracisternal, intraventricular, intracraneal, intrauretral, intrahepática e intratumoral. En algunas realizaciones, las composiciones se administran sistémicamente (p. ej., por inyección intravenosa). En algunas realizaciones, las composiciones se administran localmente (p. ej., por inyección intraarterial o intraocular).

[0069] En algunas realizaciones, las composiciones se administran directamente al ojo o al tejido ocular. En algunas realizaciones, las composiciones se administran tópicamente al ojo, p. ej., en gotas para los ojos. En algunas realizaciones, las composiciones se administran mediante inyección al ojo (inyección intraocular) o a los tejidos asociados con el ojo. Las composiciones pueden administrarse, p. ej., mediante inyección intraocular, inyección periocular, inyección subretiniana, inyección intravítrea, inyección supercoroidal, inyección trans-septal, inyección subescleral, inyección intracoroidal, inyección intracameral, inyección subconjuntival, inyección sub-tenon, inyección retrobulbar, inyección peribulbar o entrega yuxtascleral posterior. Estos métodos son conocidos en la técnica. Las composiciones pueden administrarse, p. ej., en el humor vítreo, acuoso, esclera, conjuntiva, el área entre la esclerótica y la conjuntiva, los tejidos de la retina coroides, la mácula u otra área en el ojo de un individuo o cerca de él.

[0070] La cantidad efectiva óptima de las composiciones puede determinarse empíricamente y dependerá del tipo y la gravedad de la enfermedad, la vía de administración, la progresión de la enfermedad y la salud, la masa y el área corporal del individuo. Dichas determinaciones están dentro de la habilidad de alguien en la técnica. Las composiciones que comprenden una proteína de fusión también se pueden administrar seis veces a la semana, cinco veces a la semana, cuatro veces a la semana, tres veces a la semana, dos veces a la semana, una vez a la semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez al mes, una vez cada dos meses, una vez cada tres meses, una vez cada seis meses, una vez cada nueve meses o una vez al año.

[0071] Amenos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en este documento tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por un experto en la materia a la que pertenece esta invención. Aunque cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en este documento se puede usar en la práctica o prueba de la presente invención, los métodos y materiales preferidos se describen ahora.

[0072] La presente invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes Ejemplos, que se proporcionan con fines de demostración en lugar de limitación.

Ejemplo 1: Producción de proteínas mutantes de rodostomina

Método de expresión de desintegrina

[0073] Se usaron técnicas de reacción en cadena de la polimerasa de extensión solapada (PCR) para crear construcciones mutantes de Rodostomina (Rho). El kit de expresión y el vector de transferencia de levadura, pPICZaA, se compraron de Invitrogen. Las construcciones mutantes genéticas se crearon amplificando por PCR la secuencia del gen usando un cebador sentido que contiene una secuencia complementaria al mutante del gen más un sitio de reconocimiento EcoR1 y seis residuos de histidina para facilitar la purificación, y el cebador antisentido diseñado para contener un sitio de reconocimiento Sac II y TTA para el codón. El producto de PCR se purificó y luego se clonó en los sitios EcoR1 y Sac II del vector de recombinación de levadura, pPICZaA. El plásmido recombinante se transformó en la célula DH5a competente de E. coli, y las colonias se seleccionaron por placa de agar con caldo Luria bajo en sal (LB, 1% de triptona, 0,5% de extracto de levadura, 0,5% de NaCl y 1,5% de agar a pH 7,0) y 25 pg/ml del antibiótico Zeocin. Se seleccionó una única colonia para amplificar el plásmido para la secuenciación. Después de que los clones habían sido confirmados por secuenciación de a Dn , se prepararon 10 pg del plásmido y luego se linealizaron mediante digestión con la enzima SacI. La construcción linealizada se transformó en la cepa Pichia X33 usando un kit (Pichia EasyComp; Invitrogen), y las colonias se seleccionaron por placa de agar usando YPDS (1% de extracto de levadura, 2% de peptona, 2% de glucosa, 2% de agar y 1 M Sorbitol) y 100 pg/ml de zeocina. El análisis de PCR se utilizó para analizar los integrantes de Pichia para determinar si el gen se había integrado en el genoma de Pichia. De una serie de clones con múltiples copias de inserción de genes, se eligieron los clones con la expresión de proteína más alta.

Método de purificación de desintegrina

[0074] Los mutantes Rho se produjeron de la siguiente manera: 100 pl de stock de células se cultivaron a 30°C durante 48 horas en 200 ml de medio de extracto de levadura dextrosa de peptona (YPD) (1% de extracto de levadura, 2% de peptona y 2% de dextrosa) y 100 pg/ml de zeocina. Las células se transfirieron luego a 800 ml de medio YPD. Después de otras 48 horas, las células se recogieron por centrifugación y se cultivaron en 1 L de medio mínimo de metanol (1,34% de base de nitrógeno de levadura (YNB) con sulfato de amonio sin aminoácidos, 4x10'5% de biotina y 1% de metanol). Una vez cada 24 horas, se añadió metanol al 1% para inducir la expresión de proteínas durante 2 días. El sobrenadante se recogió después de la centrifugación y se dializó dos veces contra 5 L de H2O y una vez contra 5 L de 20 mM Tris-HCl y NaCl 200 mM a pH 8. La solución final se carga en una columna quelante de níquel y se eluyó con una gradiente de 200 mM de imidazol. Las proteínas Rho recombinantes producidas en P. pastoris se purificaron adicionalmente por HPLC C18 de fase inversa con un gradiente de acetonitrilo del 15% al 18%. Un análisis de tricina-SDS-PAGE confirmó que la purificación de las proteínas fue superior al 95%.

Ejemplo 2: Generación de proteínas de fusión mutantes VEGFR/Rho

[0075] El dominio extracelular D2 del receptor Flt-1 (VEGFR1) de SEQ ID NO: 8 y el dominio extracelular D3 del receptor Flt-1 (VEGFR2) de SEQ ID NO: 9, conocido colectivamente como trampa de VEGF, proporcionaron el componente de proteína para unirse al ligando VEGF. Para unirse tanto al ligando de VEGF como a las integrinas, se generaron proteínas de fusión que comprenden VEGFR1 D2/VEGFR2 D3 de SEQ ID NO: 10 y el mutante Rho de SEQ ID NO: 13.

[0076] Se usó una trampa VEGF previamente generada unida a los dominios de inmunoglobulina humana G1 CH2 y Ch 3 (lgG1 Fc) para generar construcciones de ADN que codifican el híbrido mutante VEGFR1 D2/VEGFR2 D3-Rho. Ver Holash, J., et al., PNAS, 2002, 99 (17): 11393-11398 para una descripción de la trampa VEGF que se incorpora aquí como referencia en su totalidad. Se construyó una proteína de fusión de SEQ ID NO: 16 uniendo VEGFR1 d 2/VEGFR2 D3 de SEQ ID NO: 10 y el mutante Rho de SEQ ID NO: 13 a través de al menos un conector peptídico de Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (G⁴S).

[0077] De forma similar, las proteínas de fusión 2 y 3 de SEQ ID NO: 15 y 17 también se generaron fusionando mutantes Rho de SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 14 respectivamente con el VEGFR1 D2/VEGFR2 D3 de SEQ ID NO: 10. Proteína de fusión 4 de la s Eq ID NO: 18 se generó mediante la fusión de una Trampa de VEGF disponible comercialmente, aflibercept (Eylea^® , Regeneron) y el mutante Rho de SEQ ID NO: 13. La Figura 1 proporciona un esquema que muestra la estructura de una proteína de fusión de acuerdo con una realización de la invención. SS es una secuencia de péptido señal de SEQ ID NO: 20 que ayuda a la secreción de proteínas de la célula CHO. La trampa de VEGF está formada por los dominios extracelulares de tipo Ig 2 y 3 de VEGFR1 y VEGFR2 humanos. Un fragmento Fc es la región CH² y CH³ de lgG1 humano. Un GS es un enlazador. Los mutantes Rho se han descrito en la patente de EE.UU. N^os 7,943,728 y la Solicitud PCT N° PCT/US 15/46322.

[0078] Para generar Proteína de Fusión 1, que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, la secuencia de ADN que codifica Proteína de Fusión 1 se optimizó con codón para la expresión en células CHO. El ADN sintetizado con codón optimizado, con una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 19, junto con el péptido señal que tiene una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 21 se clonó en un vector de expresión. Las células huésped CHO K1 se sembraron a 2 x 105 células/ml en CD CHO (Gibco 12490-003) que contenía glutamina 4 mM (JT Baker 2078-06) y suplemento de HT al 1% (Gibco 11067-030) 72 horas antes de la transfección. Las células huésped se incubaron en un agitador Infors (36,5°C, 75% de humedad, 6% CO², 110 RPM) y se contaron para la densidad celular antes de su uso. Se añadió una cantidad adecuada de ADN plasmídico de expresión en las células huésped (volumen de trabajo de 1 L o 5 L), y se añadió reactivo de transfección basado en polímero. Los cultivos transfectados se incubaron en un agitador Infors (36,5°C, 75% de humedad, 6% CO² , 110 RPM) se añadió durante 4 horas y una solución de alimentación patentada. Los cultivos transfectados se incubaron entonces en un agitador Infors (32°C, 75% de humedad, 6% CO², 110 RPM). Los cultivos transfectados se cosecharon el día 10 después de transfección. Los sobrenadantes se purificaron para la generación de materiales de investigación. El proceso de purificación incluyó clarificación, cromatografía de afinidad de proteína A, concentración por Amicon Ultracel, cromatografía de exclusión por tamaño, diálisis por Slide-A-Lyzer y concentración final por Amicon Ultracel en el tampón de formulación.

[0079] Las proteínas de fusión que tienen actividades simultáneas anti-VEGF y anti-integrina se construyeron, expresaron, purificaron y caracterizaron. La Figura 2 proporciona un esquema que caracteriza la proteína de fusión 1 purificada por SDS-PAGe . El marcador molecular se cargó en el Carril M. Las formas reducidas y no reducidas de VEGF-trampa de ingeniería (Control Positivo 1; SEQ ID NO: 22) que consisten en porciones de VEGFR1 y VEGFR2 humano fusionados a la porción Fc de lgG1 humano se cargaron en Carriles 1 y 2, respectivamente. Formas no reducidas y reducidas de trampa VEGF disponible comercialmente, aflibercept (Eylea^® , Regeneron) (Control Positivo 2) se cargaron en los carriles 3 y 4, respectivamente. Las formas no reducidas y reducidas de proteína de fusión 1 se cargaron en los carriles 5 y 6. Cada muestra de proteína se cargó en un volumen de 3 |jg en cada carril. Como se muestra en la Figura 2, los resultados indican que tanto el Control Positivo como la proteína de fusión 1 exhibieron una alta integridad y pureza en condiciones reductoras y no reductoras. La concentración final de la proteína de fusión 1 fue de aproximadamente 40 mg/ml en el tampón de formulación designado (basado en la absorción a 280 nm).

[0080] La producción de homodímeros de proteínas por transfección celular con sus respectivas construcciones se confirmó mediante SDS-PAGE y análisis de bioactividad.

Ejemplo 3: Afinidad de unión de proteína de fusión a VEGF ¹⁶⁵ humano

[0081] Se usó un ensayo de inmunosorbente ligado a enzima de unión directa (ELISA) para medir la afinidad de unión de las proteínas de fusión de la invención con VEGF¹⁶⁵ humano, una variante de empalme de VEGF-A.

[0082] La trampa de VEGF es un receptor de VEGF soluble que fue diseñado para uso terapéutico y actualmente está aprobado por la FDA para tratar la DMAe . La trampa VEGF contiene el segundo dominio similar a Ig 2 (D2) de VEGFR1 fusionado con el tercer dominio similar a Ig 3 (D3) de VEGFR2 fusionado a la región Fc de lgG1 humano (Holash, J., et al, Proc Natl Acad Sci EE.UU. 20 de agosto de 2002; 99(17):11393-8). La trampa VEGF se dirige a VEGF-A, VEGF-B y PIGF. La trampa de VEGF disponible comercialmente, aflibercept (Eylea^® , Regeneron), se incluyó como Control Positivo 2.

[0083] Se agregaron 100 |jl de una solución de recubrimiento (1 jg/mL de VEGF¹⁶⁵ en 1 x solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,2) a cada pocillo de una placa ELISA de 96 pocillos, y la placa se incubó durante la noche a 4°C. Los pocillos se lavaron dos veces con 400 j l de 1 x tampón PBS, y el exceso de líquido se eliminó cuidadosamente con una toalla de papel.

[0084] Se añadieron 400 j l de una solución de bloqueo (5 g de leche descremada sin grasa en 100 ml de 1 x PBS) a cada pocillo, y la placa se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Los pocillos se lavaron dos veces con 1 x tampón PBS.

[0085] Las proteínas de fusión y las muestras de control se diluyeron en serie tres veces en solución de bloqueo, con una concentración de proteína más alta de 10 nM. Se añadieron 100 j l de las muestras diluidas en serie a cada pocillo. La placa se cubrió y se incubó en un agitador de placa (-100 rpm) durante 1 hora a temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron tres veces con tampón de lavado (1 x PBS, Tween-20 al 0,05%).

[0086] Se agregaron a cada pocillo 100 j l de 1:2500 anticuerpos específicos de IgG Fc anti-humano de cabra conjugado con peroxidasa de rábano diluido en solución de bloqueo. Las placas se sellaron y se incubaron en un agitador de placas durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron tres veces con tampón de lavado.

[0087] Se añadieron 100 j l de 3,5,3',5'-tetrametilbencidina (TMB) a cada pocillo, y las placas se incubaron durante 3 a 5 minutos para permitir que tenga lugar la reacción. Para detener la reacción, se añadieron 100 j l de solución de parada (1N HCl) a cada pocillo.

[0088] La densidad óptica (DO) de cada pocillo se determinó usando un lector de placas ELISA a una longitud de onda de absorbancia de 450 nm. La absorbancia se representó frente a la concentración de proteína de la proteína de fusión o el control, y se determinó la concentración a la cual la señal era la mitad de la concentración efectiva máxima (CE⁵⁰).

[0089] La afinidad de unión, expresada como el valor EC ⁵ o, estaba entre 0,10 y 0,21 nM para las proteínas de fusión probadas de la invención. Los resultados de ELISA se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1

[0090] Los resultados del Ejemplo 3 mostraron que las proteínas de fusión de acuerdo con las realizaciones de la invención, se unen a VEGF165 con alta afinidad. Esto también se ilustra en la Figura 3.

Ejemplo 4: Unión competitiva de la proteína de fusión a Integrina avp3

[0091] La unión competitiva se usó para medir la afinidad de unión de la proteína de fusión 1 de la invención a la integrina avp3. Rho de tipo salvaje (SEQ ID NO: 1) y variante Rho KG (SEQ ID NO: 13) se sintetizaron de acuerdo con el ejemplo 1 y se incluyeron como Control Positivo 3 y Control Positivo 4 respectivamente en el ensayo de unión competitiva.

[0092] Se añadió 1 jg/m l de victronectina disuelta en solución de recubrimiento a cada pocillo de una placa ELISA de 96 pocillos, y la placa se incubó durante la noche a 4°C. Los pocillos se lavaron dos veces con tampón PBS, y el exceso de líquido se eliminó cuidadosamente con una toalla de papel.

[0093] Se añadió solución de bloqueo (5 g de leche descremada sin grasa en 100 ml de 1 x PBS) a cada pocillo, y la placa se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Los pocillos se lavaron dos veces con 1 x tampón PBS.

[0094] Se mezclaron diversas concentraciones de Control Positivo 3, Control Positivo 4 y Proteína de fusión 1 con cierta concentración de integrina soluble avp3. Se añadieron cien microlitros (100 j l ) de las muestras diluidas en serie a cada pocillo. La placa se cubrió y se incubó en un agitador de placa (-100 rpm) durante 1 hora a temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron tres veces con tampón de lavado (1 x PBS, Tween-20 al 0,05%).

[0095] Se añadió anticuerpo primario anti-integrina av diluido y se incubó, luego se lavó. Se agregaron a cada pocillo anticuerpos específicos de IgG Fc de cabra conjugados con peroxidasa de rábano en solución de bloqueo. Las placas se sellaron y se incubaron en un agitador de placas durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron tres veces con tampón de lavado.

[0096] Se añadieron 100 |jl de 3,5,3',5'-tetrametilbencidina (TMB) a cada pocillo, y las placas se incubaron durante 3 a 5 minutos para permitir que tenga lugar la reacción. Para detener la reacción, se añadieron 100 j l de solución de parada (1N HCl) a cada pocillo.

[0097] La densidad óptica (DO) de cada pocillo se determinó usando un lector de placas ELISA a una longitud de onda de absorbancia de 450 nm. La absorbancia se representó frente a la concentración de proteína de la proteína de fusión o el control, y se determinó la concentración a la cual la señal era la mitad de la concentración de inhibición máxima (CI⁵⁰).

[0098] La unión competitiva, expresada como el valor IC⁵⁰, estaba entre 2,2 y 16 nM para la proteína de fusión probada de la invención. Los resultados se muestran en la Tabla 2 y también se ilustran en la Figura 4.

Tabla 2

Ejemplo 5 - Inhibición de la proliferación de HUVEC por proteína de fusión

[0099] Se realizó un ensayo de proliferación de células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) para probar la funcionalidad de las proteínas de fusión de la invención. Una Trampa de VEGF comercialmente disponible, aflibercept (Eylea^® , Regeneron), se incluyó como Control Positivo 2.

[0100] Se agregaron 100 j l de una solución de recubrimiento (gelatina al 1% en agua doblemente destilada) a cada pocillo de una placa ELISA de 96 pocillos, y la placa se incubó durante 2 horas o durante la noche a 37°C. Los pocillos se lavaron dos veces con 1 x tampón PBS.

[0101] Se agregaron 3500 recuentos de células endoteliales de la vena umbilical humana en medio de crecimiento de células endoteliales a cada pocillo, y la placa se incubó durante la noche a 37°C.

[0102] Las muestras de proteína de fusión se diluyeron en tampón de ensayo (Medio-199 1 x Sales de Earle, suero bovino fetal al 10%, HEPES 10 mM, 1 x antibiótico/antimicótico), con una concentración de proteína más alta de 300 nM. Las muestras de proteína de fusión se mezclaron con VEGF¹⁶⁵ (8 ng/ml), y las mezclas se incubaron durante la noche a temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron con 200 j l de 1 x PBS.

[0103] Se añadieron 100 j l de la mezcla VEGFWmuestra a cada pocillo, y las placas se incubaron durante 72 horas a 37°C con 5% de CO2. Después de la incubación, reactivo de detección de 10 j l MTS (3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-5-(3-carboximetoxifenilo)-2-(4-sulfofenilo)-2H-tetrazolio) metosulfato de fenazina en PBS destilado) se añadieron a cada pocillo, y las placas se incubaron a 37°C durante 2,5 horas.

[0104] La DO de cada pocillo se determinó usando un lector de placa ELISA a una longitud de onda de absorbancia de 490 nm. La absorbancia se representó frente a la concentración de proteína de la proteína de fusión o el control, y se determinó la concentración a la que se inhibió la proliferación celular en un 50% (CI⁵⁰).

[0105] Se determinó que la inhibición de la proliferación celular (CI⁵⁰) estaba entre 0,039 y 0,103 nM para la proteína de fusión probada de la invención. Los resultados del ensayo de proliferación se muestran en la Tabla 3 y también se ilustran en la Figura 5. Tanto el Control Positivo 2 como la Proteína de Fusión 1 exhibieron una actividad similar en la inhibición de la proliferación de HUVEC dependiente de VEGF.

Tabla 3

Ejemplo 6 - Inhibición de la adhesión celular avp3 y a5p1 por la proteína de fusión

[0106] Se evaluó la adhesión de las células CHO que sobreexpresan avp3 al fibrinógeno y las células K562 que expresan a5p1 a la fibronectina en presencia de proteínas de fusión.

[0107] Las placas de microtitulación lmmulon-2 de 96 pocilios (Costar, Corning, NY) se recubrieron con 100 |jl de solución salina tamponada con fosfato (PBS: tampón fosfato 10 mM, NaCi 0,15 M, pH 7,4) que contenía sustratos a una concentración de 50-500 nM, y se incubaron durante la noche a 4°C. Los sustratos y sus concentraciones de recubrimiento fueron fibrinógeno (Fg) a 200 jg/m L y fibronectina (Fn) a 25 jg/mL. Los sitios de unión a proteínas no específicos se bloquearon incubando cada pocillo con 200 jL de albúmina de suero bovino (BSA) desnaturalizada al 1% (Calbiochem) a temperatura ambiente durante 1,5 horas. El BSA desnaturalizado por calor se desechó y cada pocillo se lavó dos veces con 200 j l de PBS.

[0108] Las células CHO que expresaron la integrina avp3 (CHO-avp3) de la misma fuente de la Solicitud de Patente N° 62/US2015/46322 se mantuvieron en DMEM. La eritroleucemia humana K562 se mantuvo tal como está escrita en la Solicitud de Patente N° 62/US2015/46322 de ATCC y se cultivó en medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 que contiene 5% de FCS. El K562 cosechado se lavó en tampón PBS que contenía EDTA 1 mM y se resuspendió en tampón de Tyrode (NaCl 150 mM, KCI 5 mM y HEPES 10 mM, pH 7,35) que contenía MgSO41 mM, CaCh 2 mM y 500 jM MnCl2.

[0109] Las células (CHO y K562) se diluyeron a 3 x 105 células/ml, y 100 j l de las células se usaron para el ensayo. Rho y sus mutantes se añadieron a las células cultivadas y se incubaron a 37°C, 5% de CO2 durante 15 minutos. Rho y sus variantes se usaron como inhibidores a las concentraciones de 0,001-500 jM . Las células tratadas se añadieron luego a la placa recubierta y se incubaron a 37°C, 5% de CO2 durante 1 hora. La solución de incubación se desechó y las células no adheridas se eliminaron lavando dos veces con 200 j l PBS. Las células unidas se cuantificaron por tinción con cristal violeta. Brevemente, el pozo se fijó con 100 j l de formalina al 10% durante 10 minutos y se secó. Cincuenta microlitros (50 j l ) de cristal violeta al 0,05% se añadieron al pozo a temperatura ambiente durante 20 minutos. Cada pocillo se lavó con 200 j l de agua destilada cuatro veces y se secó. La coloración se realizó mediante la adición de 150 j l de solución colorante (50% de alcohol y 0,1% de ácido acético). La absorbancia resultante se leyó a 600 nm y las lecturas se correlacionaron con el número de células adheridas.

[0110] El cálculo de inhibición de la adhesión celular se realizó de acuerdo con la siguiente ecuación.

% Inhibición = 100 - ODfinn(TA) - ODfinn(NC) x 100

OD600(PC) - OD600(NC)

[0111] En la ecuación anterior, TA se refiere a un "artículo de prueba"; NC se refiere a "control negativo" y PC se refiere a "control positivo".

[0112] La CI⁵⁰ se definió como la concentración (nM) de una variante de desintegrina requerida para una inhibición del 50% de la adhesión celular mediada por una integrina particular. Por lo tanto, baja CI⁵⁰ indica una mayor especificidad o potencia de la variante de desintegrina al inhibir la actividad de adhesión celular de la respectiva integrina, por lo tanto, una mayor actividad de unión (o selectividad) de la variante de desintegrina a la respectiva integrina. Los resultados de CI⁵⁰ se resumen en la Tabla 4. La Figura 6 proporciona un esquema que muestra la inhibición de la adhesión celular CHO-avp3 por la Proteína de Fusión 1.

Tabla 4

Ejemplo 7: Inhibición de la formación de tubos HUVEC por proteína de fusión

[0113] Se colocaron HUVEC (1,5 X 10⁴ células/pocillo) en una placa recubierta con matrigel de 96 pocillos. Seis dosis de proteína de fusión 1 (0,1 jM , 0,3 jM , 1 jM , 3 jM , 10 jM , y 30 jM ) y vehículo se añadieron a cada pocillo en medio de crecimiento en una atmósfera de CO² al 5% a 37°C. Después de un período de incubación de 18 horas, se evaluó por fotomicroscopía la morfología de los tubos de células endoteliales, que se asemejan a una red capilar. La interrupción (antiangiogénesis) de la longitud total del tubo se midió a partir de cada fotografía y se determinó en relación con el grupo de control del vehículo. La concentración inhibitoria mínima (MIC > 30%) de la formación del tubo se determinó y se usó para evaluar el grado de antiangiogénesis. La Suramin se usó como control positivo antiangiogénico (Control Positivo 5) para todos los estudios.

[0114] Se determinó que la inhibición de la formación del tubo (CI⁵⁰) era inferior a 0,1 jM para la proteína de fusión 1 probada, que mostró una mayor potencia que el Control Positivo 4. Los resultados del ensayo de formación del tubo se muestran en la Tabla 5. Las Figuras 7A-G proporcionan un esquema que muestra el efecto inhibitorio de Proteína de Fusión 1 sobre la formación del tubo cuando se agregó Proteína de Fusión 1 a una dosis de 0,1 jM , 0,3 jM , 1 jM , 3 jM , 10 jM y 30 jM , respectivamente.

Tabla 5

Ejemplo 8 - Inhibición de la fuga inducida por VEGF en conejos con cinturón holandés por proteínas de fusión

[0115] Las proteínas de fusión de la invención se probaron en un modelo in vivo de permeabilidad vascular para determinar su eficacia en la prevención de la fuga vascular. En este modelo, se inyectó VEGF por vía intravítrea en el vitreo de los ojos de conejo para inducir una fuga retiniana incontrolada. Aflibercept (Eylea®, Regeneron), una proteína de fusión recombinante que consiste en porciones de VEGFR1 y VEGFR2 humanos fusionados a la porción Fc de lgG1 humano, y bevacizumab (Avastin®, Roche), un anticuerpo monoclonal humanizado recombinante que bloquea la angiogénesis inhibiendo VEGF-A se incluyeron como controles positivos 2 y 6, respectivamente.

[0116] En una realización, una composición farmacéutica contenía 20.000 pg/mL de Proteína de Fusión 1 en un tampón de formulación que comprende tampón de histidina 25 mM, NaCl 20 mM, sacarosa al 6% (p/v), polisorbato al 0,03% (p/v), pH 6,0.

[0117] Los conejos con cinturón holandés fueron anestesiados con isoflurano (3-5%), y sus ojos fueron tratados con solución oftálmica de Betadine. Los ojos de los conejos se lavaron con solución salina estéril y se aplicó clorhidrato de lidocaína (inyectable al 2%) o proparacaína (0,5%) a la superficie ocular.

[0118] El día 1, se inyectó por vía intravítrea a conejos con cinturón holandés proteínas de fusión de la invención, control de vehículo (negativo) o controles de referencia (positivos) a dosis predeterminadas usando una jeringa de insulina BD 300 pl (31 ga x 5/16 pulgada). La aguja se insertó a través del cuadrante dorsotemporal del ojo, aproximadamente 3-4 mm posterior al limbo y 3-4 mm lateral a los músculos rectos dorsales, y se administraron 50 pl de solución. La fuga vascular se indujo inyectando VEGF165 exógeno en los mismos ojos el día 3.

[0119] La angiografía con fluoresceína (AF) se realizó en todos los grupos de dosificación 3 días después de la inyección de VEGF para evaluar la fuga y la tortuosidad utilizando una escala de 0 (normal) a 4 (grave).

[0120] Los signos de irritación ocular se puntuaron utilizando el sistema de puntuación Draize antes de la dosificación de la proteína de fusión, la inducción de VEGF y las evaluaciones. Según el análisis de Draize, todos los ojos de conejo eran normales antes del inicio de la dosificación. Se observaron signos transitorios de inflamación ocular mínima en todos los grupos de tratamiento después de la administración de dosis intravítrea, y se atribuyeron al procedimiento intravítreo. No hubo hallazgos relacionados con las drogas evidentes durante el curso del estudio.

[0121] Las AF asociadas con el grupo de control del vehículo tuvieron la puntuación media más alta (2,58) asociada con la fuga y la tortuosidad de la vasculatura retiniana. Los dos grupos de Control Positivo de referencia 2 y 6 tuvieron puntuaciones medias de 0 y 0,25, lo que indica una reducción significativa en la fuga y la tortuosidad de la vasculatura retiniana. Las proteínas de fusión probadas de la invención tenían una puntuación media de 0,167, mostrando efectividad en la reducción de la fuga retiniana inducida por VEGF y la tortuosidad comparable a los controles positivos. Los resultados del ensayo in vivo se muestran en la Tabla 6. Las Figuras 8A-D proporcionan las AF representativas que muestran la inhibición de la fuga inducida por VEGF en conejos de cinturón holandés por la proteína de fusión 1 y controles positivos.

Tabla 6

Ejemplo 9 - Inhibición de la respuesta a la dosis de la fuga inducida por VEGF en conejos con cinturón holandés por proteína de fusión

[0122] Las proteínas de fusión de la invención se probaron en un modelo in vivo de permeabilidad vascular retiniana a dosis variables para determinar su efectividad dosis-respuesta para prevenir la fuga vascular. En este modelo, se inyectó intravenalmente VEGF165 humano en el vítreo de los ojos de conejo para inducir la fuga retiniana.

[0123] El día 1, a los conejos con cinturón holandés se les inyectó intravítreamente proteína de fusión 1 de acuerdo con una realización de la invención a varias dosis, control de vehículo (negativo) o controles de referencia (positivos). La fuga vascular se indujo inyectando VEGF165 exógeno en los mismos ojos el día 3.

[0124] Las AF se realizaron en todos los grupos de dosificación 3 días después de la inducción de VEGF (día 6) para evaluar la filtración y la tortuosidad utilizando una escala de 0 (normal) a 4 (grave).

[0125] Los signos de irritación ocular se puntuaron utilizando el sistema de puntuación Draize antes de la dosificación de la proteína de fusión, la inducción de VEGF y las evaluaciones. Según el análisis de Draize, todos los ojos de conejo eran normales antes del inicio de la dosificación. Se observaron signos transitorios de inflamación ocular mínima en todos los grupos de tratamiento después de la administración de dosis intravítrea, y se atribuyeron al procedimiento intravítreo. No hubo hallazgos relacionados con las drogas evidentes durante el curso del estudio.

[0126] Para la primera inyección exógena de VEGF, las AF asociadas con el grupo de control del vehículo tuvieron la puntuación media más alta (3,4) asociada con la fuga y la tortuosidad de la vasculatura retiniana. Los dos grupos de Control Positivo de referencia tuvieron puntajes promedio de 0, lo que indica una reducción significativa en la fuga y la tortuosidad de la vasculatura retiniana. La proteína de fusión probada de la invención (proteína de fusión 1) tenía puntuaciones de 0,08, 0,42 y 0,17 a dosis de 100, 500 y 1000 |jg, respectivamente, lo que demuestra la eficacia en la reducción de la fuga retiniana inducida por VEGF y la tortuosidad comparable a los controles positivos.

[0127] Los resultados del ensayo in vitro dosis-respuesta se muestran en la Tabla 7.

Tabla 7

Ejemplo 10 - Reducción del tamaño de la lesión en neovascularización coroidea inducida por láser (CNV) en ratas por proteínas de fusión

[0128] Los ojos de las ratas Brown Norway se dilataron con una solución de ciclogilo al 1% y se protegieron de la luz. Después de la dilatación, las ratas se anestesiaron usando una mezcla de ketamina y xilazina. Se introdujeron tres quemaduras de lesión en la retina de cada ojo usando un láser a 532 nm el día 1.

[0129] El día 3, los animales se anestesiaron con una mezcla de ketamina y xilazina, sus ojos se dilataron, y se inyectaron intravítreamente 5 j l de proteína de fusión 1, vehículo (control negativo) o Control Positivo 2 (referencia) a dosis predeterminadas en ambos ojos de un animal usando una jeringa Hamilton con aguja de calibre 33.

[0130] Para confirmar la formación exitosa de la lesión, se tomaron imágenes del fondo utilizando un oftalmoscopio de animales pequeños de Micron III (Phoenix Research) antes de la introducción de la lesión, después de que la lesión se haya quemado y el día 22. Los animales recibieron una inyección IP de fluoresceína sódica al 10% a 1 jL /g de peso corporal el día 22 para evaluar la neovascularización de las quemaduras por lesiones. A partir de los angiogramas de fluoresceína, se determinó el tamaño de la lesión y se comparó entre los grupos de dosificación como se muestra en las Figuras 9A-C, en donde la Figura 9A muestra un esquema del vehículo, la Figura 9B muestra un esquema del Control Positivo 2, y la Figura 9C muestra un esquema de la proteína de fusión 1. Las flechas (T) en las Figuras 9A-C indicaron puntos de lesión con láser.

Ejemplo 11 - Reducción del tamaño de la lesión en CNV inducida por láser en monos por proteínas de fusión

[0131] Las proteínas de fusión se prueban en un modelo de CNV inducido por láser establecido en monos. Se introducen de seis a nueve quemaduras alrededor de la mácula de cada ojo usando fotocoagulación con láser de diodo de 532 nm, y se inyectan intravítreamente 0,5-4 mg de proteínas de fusión de la invención el mismo día.

[0132] Los animales están sedados con pentobarbitona soluble intravenosa al 2,5% (1 ml/kg) 20 días después Los párpados se fijan para mantener los ojos abiertos, y se toman fotografías en color con una cámara de fondo de ojo.

[0133] Se inyecta un tinte de fluoresceína (20% de fluoresceína sódica; 0,05 ml/kg) en una vena de una extremidad inferior. Se toman fotografías en varios puntos de tiempo después de la inyección del tinte, incluida la fase arterial, la

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Una proteína de fusión que comprende:

un péptido de unión a integrina que comprende unión de desintegrina a integrina avpx o a5p1 o sus fragmentos de unión a integrina;

otro péptido de unión a proteínas que se une a un factor angiogénico, en el que el factor angiogénico comprende angiopoyetina (ANG), efrina (Eph), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), neuropilina (NRP), activadores de plasminógeno, receptor activador de plasminógeno de tipo uroquinasa (uPAR), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento tumoral beta (TGF-p), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), cadherina endotelial vascular (VE-cadherina), Factor de crecimiento similar a la insulina (IGF), factor de crecimiento del tejido conectivo (CTGF), Factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a), Interleucina 1 (IL-1), Interleucina 6 (IL-6), Factor estimulante de colonias de macrófagos de granulocitos (GM-CSF), y sus receptores; y

un dominio Fc;

en donde x es 1, 3, 5, 6 u 8 .

2. Una proteína de fusión que comprende:

un péptido de unión a integrina que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de un grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 7, o secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID 25 NO: 4, SEQ ID NO: 5 , SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 7; otro péptido de unión a proteínas que comprende dominios extracelulares de receptores VEGF; y un dominio Fc;

en donde el péptido de unión a integrina tiene al menos una mutación en o dentro de 15-20 aminoácidos de un motivo de RGD.

3. Una proteína de fusión que comprende:

un péptido de unión a integrina que comprende desintegrina y sus fragmentos de unión a integrina; otro péptido de unión a proteínas que comprende dominios extracelulares de receptores VEGF; y un dominio Fc;

en donde el péptido de unión a integrina comprende al menos una mutación en 15-20 aminoácidos de un motivo RGD.

4. Una proteína de fusión que comprende:

una porción de unión a integrina seleccionada de un grupo que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 con al menos una mutación en o dentro de 15-20 aminoácidos de un motivo RGD, una secuencia de 10 aminoácidos que tiene al menos un 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1, y una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2;

una subregión constante humana o humanizada que comprende un dominio CH2 de inmunoglobulina y un dominio CH3;

otro péptido de unión a proteínas que tiene un dominio D2 de tipo Ig de un VEGFR1 y un dominio similar a Ig D3 de un VEGFR2.

5. La proteína de fusión de acuerdo con las reivindicaciones 1, 2 o 3

que comprende el péptido de unión a integrina, el dominio Fc y el otro péptido de unión a proteína desde el extremo C al extremo N; o

que comprende el péptido de unión a integrina, el dominio Fc y el otro péptido de unión a proteína desde el extremo N al extremo C; o

que comprende además un enlazador GS o Gg entre el dominio Fc y el péptido de unión a integrina o el otro péptido de unión a proteína.

6. La proteína de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4,

en donde el péptido de unión a integrina tiene al menos un 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 7; preferiblemente en donde el péptido de unión a integrina tiene al menos un 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2; o

que comprende además una secuencia enlazadora entre el péptido de unión a integrina y

el otro péptido de unión a proteínas; o

que comprende además una secuencia de péptido señal corriente arriba del otro péptido de unión a proteína.

7. Un ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

8. Un dímero de la proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

9. Un vector que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

10. Un método para producir una proteína de fusión, que comprende cultivar una célula huésped que comprende un ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1-4 en una condición que produce la proteína de fusión y recuperar la proteína de fusión producida por la célula huésped.

11. La proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 2 o 3,

en donde los dominios extracelulares de los receptores de VEGF comprenden un dominio de tipo Ig D1-D7 de los receptores de VEGF; o

en donde los dominios extracelulares de receptores de VEGF que comprenden i) un dominio D2 similar a Ig de un VEGFR1 y un dominio D3 similar a Ig de un VEGFR2; ii) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 o iii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90% de identidad con la SEQ ID NO: 10.

12. Una composición que comprende la proteína de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4 y un adyuvante, vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

13. Una proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1-4 para uso en el tratamiento/prevención de una enfermedad angiogénica; preferiblemente en donde la enfermedad angiogénica comprende artritis reumatoide, artritis inflamatoria, osteoartritis, cáncer ocular y sistémico, metástasis e invasión relacionadas con tumores, enfermedades de fibrosis sistémica que incluyen fibrosis pulmonar idiopática (IFF), esteatohepatitis no alcohólica (NASH) o fibrosis hepática, nefropatía diabética y/o fibrosis renal, fibrosis dérmica o queloide, cicatrización de heridas, cardio-fibrosis, accidente cerebrovascular inducido por isquemia, enfermedad ocular caracterizada por neovascularización o isquemia (como neovascularización coroidea), uveítis, retinitis pigmentosa, degeneración macular relacionada con la edad (DMAE), retinopatía diabética y edema macular diabético (EMD).