TWI698447B - 用於抑制血管新生之融合蛋白 - Google Patents
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Abstract
本發明係關於一種抑制血管新生(angiogenesis)之生物製劑(biologic)。特別是,本發明係關於融合蛋白,該融合蛋白可抑制整合蛋白活化路徑(integrin activated pathway)及一其他之血管新生因子活化路徑(angiogenic factor-activated pathway);且關於該等融合蛋白之組合物;以及其製備及使用方法。
Description
本申請案主張於2015年6月28日提出申請之美國臨時專利申請案第62/185,716號之權益,該美國臨時專利申請案之全文併於此處以供參考。
本發明係關於一種抑制血管新生(angiogenesis)之生物製劑(biologic)。特別是,本發明係關於融合蛋白,該融合蛋白可抑制血管新生因子活化路徑(angiogenic factor-activated pathway);且關於該等融合蛋白之組合物;以及其製備及使用方法。
血管新生係自既存血管形成新血管的過程。其在數種生理過程中皆扮演重要之角色,該生理過程包括胚胎發育以及組織及傷口修復(Folkman J等人,Angiogenic factors.Science 1987;235:442-7)。血管新生之生理步驟已被清楚了解,包含胞外基質之分解、內皮細胞之增生、遷移、及重組成管道通路、壁細胞之募集及分化、以及胞外基質的產生(Carmeliet P等人,Nature.2011;473:298-307)。病理性的血管新生可發生在腫瘤形成、眼部病症(例如,糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy)、糖尿病黃斑水腫(diabetic macular edema)或糖尿病黃斑退化(diabetic macular degeneration))、關節炎、牛皮癬、纖維化疾病、發炎疾病、及動脈硬化
(Polverini PJ.Crit Rev Oral Biol Med.1995;6(3):230-47)。
病理性血管新生更加的多樣且混亂,通常呈現彎曲的血管組織、不同大小的低氧縫隙(hypoxic void),不均勻且不完整的血管壁及內壁(lining)、及無效的灌流(Jain RK.,Nat Med.2003;9(6):685-93)。疾病中之新血管形成的該些特殊表徵,使得靶向血管新生之治療具有挑戰性。雖然抗VEGF療法,例如:樂舒晴(Lucentis®)、采視明(Eylea®)、或藥品仿單標示外使用(off-label use)的癌思停(Avastin®)一般可穩定或改善視覺功能,在以抗VEGF治療兩年內,所有經治療之眼睛中大約半數會產生次視網膜結痂(纖維化),這被視為癒後不成功的其中一個原因(Daniel E等人,Ophthalmology.2014;121(3):656-66)。在次視網膜纖維化中一些重要因子很可能是參與在纖維化過程(細胞增生、遷移及ECM重塑)中的生長因子及基質細胞蛋白(matricellular protein)。儘管其具有複雜性,隨著我們對血管新生過程的知識增加,抑制血管新生藥物的發展依然是頗受關注的區域。
最近,在新生血管(neovascularization)過程中的許多關鍵因子已被確認,其中血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)家族扮演至為關鍵的角色。人類VEGF家族共有6個成員:VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、及胎盤生長因子(placental growth factor,PlGF)。除此,VEGF-A、VEGF-B及PlGF之多種同功體係透過選擇性RNA剪接來產生(Sullivan等人,MAbs,2002,2(2):165-75)。VEGF-A係參與血管新生之主要因子;其與VEGFR-1及VEGFR-2兩者結合。藉由阻礙VEGF-A訊息傳遞來抑制血管新生的策略已建立成功的治療方式,該治療方式係用於治療特定的癌症,視網膜新生血管及缺血性疾病。(Major等人,J Pharmacol Exp Ther.,1997,283(1):402-10;Willet等人,Nat.Med.2004,10:145-7;Papadopoulos等人,Angiogenesis,2012,15(2):171-85;Aiello等人,PNAS,
1995,92:10457-61)。
其他生長因子、細胞激素(cytokine)、趨化介素(chemokine)係包括:血小板衍生生長因子(Platelet-Derived Growth Factor,PDGF)、轉變生長因子-β(Transforming Growth Factor-β,TGF-β)、表皮生長因子(Epidermal Growth Factor,EGF)、神經生長因子(Nerve Growth Factor,NGF)、缺氧誘導因子(Hypoxia-Induced Factor,HIF)、結締組織生長因子(Connective-Tissue Growth Factor,CTGF)、顆粒球巨噬細胞株刺激因子(Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor,GM-CSF)、類胰島素生長因子(Insulin-Like Growth Factor,IGF)、肝細胞生長因子/分散因子(Hepatocyte Growth Factors/Scatter Factor,HGF/SF)、腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor alpha,TNF-α)、介白素-1(Interleukin 1,IL-1)、介白素-6(IL-6)、介白素-8(IL-8)、介白素-17(IL-17)、介白素-18(IL-18)、介白素-20(IL-20)、介白素-23(IL-23)、化學吸引因子(例如C-C趨化因子配體(CCL28、CCL21)及C-X-C趨化因子配體(CXCL1、CXCL5))、巨噬細胞遷移抑制因子(Macrophage migration Inhibitory Factor,MIF)、及免疫細胞表面蛋白(例如分化簇(Clusters of Differentiation,CD))。該等因子在血管新生相關之疾病中已被報告會過度表現,並扮演關鍵性的角色(Elshabrawy等人,Angiogenesis(2015)18:433-448;Brian P.Eliceiri,Circ Res.2001 Dec 7;89(12):1104-10)。靶向該等因子以減少其下游路徑的活化可降低血管新生相關之疾病。
整合蛋白係細胞表面受體的一個家族,其亦被發現在內皮細胞表面過度表現,並被認為在血管新生期間會促進新形成之血管的生長及存活。整合蛋白係異二聚體型細胞表面受體,其與胞外基質蛋白交互作用,並對許多生物學的過程而言至關重要。在許多細胞型中整合蛋白的表現係
參與在腫瘤發展,且其與生長因子受體交互溝通(crosstalk)的能力使其成為引人注目的治療標的(Staunton DE等人,Adv Immunol.2006;91:111-57;Avraamides,C.J.等人,Nat Rev Cancer 2008;8:604-617)。特別的是整合蛋白αvβ3在腫瘤細胞及血管新生的內皮細胞兩者中皆過量表現(upregulate),且其對腫瘤細胞遷移、血管新生、及細胞訊息失調而言係重要的。因此,整合蛋白αvβ3之拮抗劑的抑制血管新生及抗腫瘤性質係被廣泛地研究(Desgrosellier JS等人,Nat Rev Cancer.2010 10:9-22)。
去整合蛋白(disintegrin)係於蝮蛇家族之蛇毒中發現的胜肽,且其主要抑制β1-及β3-相關之整合蛋白。一開始去整合蛋白被辨識為整合蛋白αIIbβ3之抑制劑,接著被發現可與其他整合蛋白以高親合力結合,並阻斷整合蛋白與含RGD之蛋白的交互作用。去整合蛋白含有47至84個胺基酸、具有約4-7條雙硫鍵、並帶有相同的RGD區域(motif)(McLane MA等人,Proc Soc Exp Biol Med 1998 219:109-119;Niewiarowski S等人,Semin Hematol 1994 31:289-300;Calvete JJ.,Curr Pharm Des.2005 11:829-835;Blobel CP等人,Curr Opin Cell Biol 1992 4:760-765)。去整合蛋白家族中的保守性RGD序列,在辨認整合蛋白中扮演最重要的角色。已發現去整合蛋白與24種整合蛋白中的8種交互作用,並抑制整合蛋白調節(integrin-mediated)之細胞黏附、遷移、及血管新生(McLane MA等人,Front Biosci.2008 13:6617-6637;Swenson S等人,Curr Pharm Des.2007 13:2860-2871)。動物研究顯示去整合蛋白靶向新生血管內皮及轉移型腫瘤,說明其用於癌症治療的潛力。含RGD之蛋白與整合蛋白的專一性結合,係其構型及RGD區域周圍的序列兩者的功能。許多研究已顯示在含RGD蛋白之RGD區域兩側的殘基,會影響其對整合蛋白的結合專一性及親合力(Scarborough RM等人,J Biol Chem 1993 268:1058-1065;Rahman S等人,Biochem J 1998 335:
247-257)。
血管新生係一複雜的生物學過程,牽涉多種生長因子及其訊息傳遞受體,且靶向在訊息傳遞路徑(signaling cascade)中的單一分子可能無法對疾病(例如癌症)中不受控之血管新生提供有效的臨床治療。因此,發展可協同結合數種關鍵之血管新生因子,以有效抑制血管新生及疾病進程之創新療法的需求將不斷的增加。
本文所提供之發明揭露用於專一地結合至多標靶之多胜肽,以拮抗多種血管新生因子。本發明亦提供融合蛋白,其選擇性的抑制整合蛋白路徑及其他血管新生路徑。本發明更提供組合物,其具有該些融合蛋白。本發明更提供組合物,其具有包含編碼該些融合蛋白之核酸的載體。本發明更描述用於製備及使用該些融合蛋白來治療或預防血管新生疾病、眼部疾病、自體免疫疾病、發炎性疾病、纖維化疾病、及/或癌症的方法。
根據本發明,融合蛋白係包含結合整合蛋白的胜肽(integrin binding peptide)、其他結合蛋白的胜肽以靶向血管新生因子、及可結晶區(Fc)結構域,其中該結合整合蛋白的胜肽係選自由以下所組成之群組:去整合蛋白(disintegrin)、抗整合蛋白αvβx(anti-integrin αvβx)抗體、抗整合蛋白α5β1抗體、靶向整合蛋白αvβx或α5β1之纖維黏連蛋白(fibronectin)以及其結合整合蛋白的片段,其中x係1、3、5、6或8。在一些實施態樣中,血管新生因子包含血管生成素(Angiopoietin,ANG)、酪胺酸蛋白激酶(Ephrin,Eph)、纖維母細胞生長因子(Fibroblast Growth Factor,FGF)、神經纖毛蛋白(Neuropilin,NRP)、血纖維蛋白溶酶原活化物(Plasminogen Activator)、血小板衍生生長因子(PDGF)、腫瘤生長因子-β(TGF-β)、血管內皮生長因子(VEGF)、血管內皮鈣黏蛋白(Vascular Endothelial cadherin,
VE-cadherin)、表皮生長因子(EGF)、神經生長因子(NGF)、結締組織生長因子(CTGF)、顆粒球巨噬細胞株刺激因子(GM-CSF)、類胰島素生長因子(IGF)、肝細胞生長因子/分散因子(HGF/SF)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、介白素-1(IL-1)、介白素-6(IL-6)、介白素-8(IL-8)、介白素-17(IL-17)、介白素-18(IL-18)、介白素-20(IL-20)、介白素-23(IL-23)、化學吸引因子(例如C-C趨化因子配體(CCL28、CCL21)、C-X-C趨化因子配體(CXCL1、CXCL5))、巨噬細胞遷移抑制因子(MIF)、免疫細胞表面蛋白(例如分化簇(CD))、及其受體。
根據一方面,本發明提供融合蛋白,該融合蛋白包含結合整合蛋白的胜肽、其他結合蛋白的胜肽、及Fc結構域,其中該結合整合蛋白的胜肽係具有一選自由以下所組成之群組的胺基酸序列:SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6及SEQ ID NO:7,或一與SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7具有至少85%序列同一性之胺基酸序列;該其他結合蛋白的胜肽係包含VEGF受體之胞外結構域(extracellular domain);其中該結合整合蛋白的胜肽在RGD區域上或相鄰處具有至少一突變。
根據另一方面,本發明提供融合蛋白,該融合蛋白係包含結合整合蛋白的胜肽、其他結合蛋白的胜肽、及Fc結構域,其中該結合整合蛋白的胜肽係包含去整合蛋白及其結合整合蛋白的片段;該其他結合蛋白的胜肽係包含VEGF受體之胞外結構域;其中該結合整合蛋白的胜肽在RGD區域上或相鄰處具有至少一突變。在一些實施態樣中,該融合蛋白自C-端至N-端係包含結合整合蛋白的胜肽、Fc結構域、及其他結合蛋白的胜肽。在一些實施態樣中,該融合蛋白自N-端至C-端係包含結合整合蛋白的胜肽、Fc結構
域、及其他結合蛋白的胜肽。在融合蛋白的另一實施態樣中,結合整合蛋白的胜肽與SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7具有至少85%之序列同一性。
根據其他實施態樣,本發明亦提供融合蛋白,該融合蛋白係包含結合整合蛋白的胜肽、人類或人源化之恆定亞區(constant sub-region)、及其他結合蛋白的胜肽,其中該結合整合蛋白的胜肽包含在RGD區域上或相鄰處具有至少一突變之SEQ ID NO:1胺基酸序列、與SEQ ID NO:1具有至少85%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO:2胺基酸序列;該恆定亞區係包含免疫球蛋白之CH2結構域及CH3結構域;該其他結合蛋白的胜肽具有VEGFR1之類免疫球蛋白(Ig-like)結構域D2、及VEGFR2之類免疫球蛋白結構域D3。在融合蛋白的另一實施態樣中,結合整合蛋白的胜肽與SEQ ID NO:2具有至少85%序列同一性。
根據一方面,本發明提供編碼揭露於本文之本發明融合蛋白的核酸序列。
根據另一方面,本發明提供揭露於本文之本發明融合蛋白的二聚體。
根據另一方面,本發明提供製備本發明融合蛋白的方法,其係包含:在製備該融合蛋白之條件下培養宿主細胞,其中該宿主細胞係被轉染(transfected)包含本發明胺基酸序列之載體,以及重獲該宿主細胞所製備之融合蛋白。
根據另一方面,本發明提供一種治療或預防血管新生疾病的方法,其係包含:對一有需要的個體投予一有效量之融合蛋白。在一些實施態樣中,該血管新生疾病係包含:類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis)、
炎症性關節炎(inflammatory arthritis)、骨關節炎(osteoarthritis)、眼部及系統性癌症、與腫瘤相關之轉移及入侵、系統性纖維化疾病(其係包括:原發性肺纖維化(idiopathic lung fibrosis,IPF)、非酒精性脂肪肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH)或肝纖維化、糖尿病腎病變及/或腎纖維化、皮膚纖維化(dermal fibrosis)或蟹足腫、傷口癒合、心肌纖維化(cardio-fibrosis)、及缺血性中風(ischemia induced stroke))、具有新生血管或缺血之特徵的眼部疾病(例如,脈絡膜新生血管(choroidal neovascularization))、眼色素層炎(uveitis)、色素性視網膜炎(retinitis pigmentosa)、老年性黃斑退化(age-related macular degeneration,AMD)、糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy)及糖尿病黃斑水腫(diabetic macular edema,DME)、視網膜中央靜脈阻塞(central retinal vein occlusion,CRVO)及視網膜分支靜脈阻塞(branch retinal vein occlusion,BRVO)、人類早產兒視網膜病變(human retinopathy of prematurity,ROP)、多發息肉性脈絡膜血管病變(polypoidal choroidal vasculopathy,PCV)、症狀性玻璃體黃斑粘連(symptomatic vitreomacular adhesion)、及青光眼(glaucoma)。在一些實施態樣中,本發明融合蛋白包含連接子序列(linker sequence),該連接子序列係位於結合整合蛋白的胜肽與其他結合蛋白的胜肽間。在一些實施態樣中,本發明融合蛋白包含訊息胜肽序列(signal peptide sequence),該訊息胜肽序列係在其他結合結構域的上游。
根據另一方面,本發明提供組合物,其係包含本發明融合蛋白、及醫藥上可接受之載劑(pharmaceutically acceptable carrier)。
根據另一方面,本發明提供靶向多種血管新生因子之多胜肽,其係包含:一結合整合蛋白的胜肽、其他結合蛋白的胜肽、及一Fc結構域,其中該結合整合蛋白的胜肽係包含一選自由以下所組成之群組的胺基
酸序列:SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6及SEQ ID NO:7,或一與SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7具有至少85%序列同一性之胺基酸序列;該其他結合蛋白的胜肽係選自由以下所組成之群組:VEGF受體之胞外結構域、抗VEGF抗體、抗PDGF抗體、及其片段;其中該結合整合蛋白的胜肽在RGD區域上或相鄰處具有至少一突變
在一些實施態樣中,本發明多胜肽中的VEGF受體之胞外結構域係包含VEGF受體之類免疫球蛋白結構域D1至D7。在一些實施態樣中,在本發明多胜肽中的VEGF受體之胞外結構域係包含:(i)VEGFR1之類免疫球蛋白結構域2(D2)、及VEGFR2之類免疫球蛋白結構域3(D3);(ii)SED ID NO:10之胺基酸序列;或(iii)與SED ID NO:10具有至少90%同一性的胺基酸序列。在一些實施態樣中,本發明多胜肽中的PDGF受體之胞外結構域係包含PDGF受體之類免疫球蛋白結構域1至5。在一些實施態樣中,在本發明多胜肽中的PDGF受體之胞外結構域係包含:(i)PDGFRβ之類免疫球蛋白結構域1至3;(ii)SED ID NO:11之胺基酸序列;或(iii)與SED ID NO:11具有至少90%同一性的胺基酸序列。在一實施態樣中,本發明多胜肽更包含Gly-Ser(GS)或Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly(G9)連接子,該連接子係位於結合整合蛋白的胜肽、或VEGF受體或PDGF受體之胞外結構域與Fc結構域之間。
本說明書足以使熟習此技術領域者能夠實行本發明。除了本文所示及描述外,由先前的描述,本發明之多種修飾對熟習此技術領域者而言係顯而易見的,並落入後附申請專利範圍內。本文所引用之所有出版品、專利、及專利申請案之全文併於此處以供參考。
例示性實施態樣之前述及其他目的、方面、特徵及優點,將因參照下列描述及配合附圖,而變得更顯而易見並更易於理解。
第1圖係示意圖,其說明根據本發明之一實施態樣的例示性融合蛋白之組成;第2圖係示意圖,其說明純化的融合蛋白1之十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析;第3圖係示意圖,其說明VEGF配體結合檢定;第4圖係示意圖,其說明αvβ3競爭性結合檢定;第5圖係示意圖,其說明VEGF誘導之HUVEC增生;第6圖係示意圖,其說明對於CHO-αvβ3細胞黏附之抑制;第7A-G圖係示意圖,其說明融合蛋白對微管形成(tube formation)之抑制性效果;第8A-D圖提供一實施態樣,顯示藉由融合蛋白在荷蘭黑帶兔中對於VEGF所誘導之滲漏(leakage)的劑量一反應抑制;第9A-C圖提供一實施態樣,顯示藉由融合蛋白在大鼠中降低雷射誘導之脈絡膜新生血管(CNV)的傷口大小,箭頭(▼)表示雷射傷口的所在位置。
除非另外定義,此處所用之所有技術及科學術語係具有與本發明所屬技術領域中具通常知識者通常所了解之相同意義。
於本文中,除非內文另外明確指出,否則單數型式之「一」、「該」係包括複數型式。因此,舉例而言,涉及「一結合結構域」係包括複數的結合結構域及其為熟習此項技術領域者所知的同等物。
於本文中,可交換使用術語「多胜肽」及「蛋白質」來表示長鏈胜肽,其具有天然蛋白質的胺基酸序列、或有一或多個突變(例如,一或多個胺基酸殘基的刪除(deletion)、添加(addition)、及/或取代(substitution))的胺基酸序列。
「融合蛋白」意指具有二或更多以共價連接之部分(portion)的蛋白,其中該各部分係衍生自不同的蛋白。
本發明提供一融合蛋白,其包含結合整合蛋白的胜肽、其他結合蛋白的胜肽以靶向血管新生因子、及Fc結構域,其中該結合整合蛋白的胜肽係選自由以下所組成之群組:去整合蛋白(參見美國專利號7,943,728及PCT申請號PCT/US 15/46322對胺基酸序列之描述,該些文獻之全文併於此處以供參考)、抗整合蛋白αvβx抗體(參見美國專利號6,160,099及8,350,010對胺基酸序列之描述,該些文獻之全文併於此處以供參考)、抗整合蛋白α5β1抗體、靶向整合蛋白同功體αvβx或α5β1之纖維黏連蛋白(參見美國公開號2015/0218251對胺基酸序列之描述,該些文獻之全文併於此處以供參考)以及其結合整合蛋白的片段;其中x係1、3、5、6或8。
於本文中,術語「抗體」意指免疫球蛋白分子,其包含四條多胜肽鏈(二條重鏈及二條輕鏈,之間藉由雙硫鍵連結)。全長重鏈包括一個可變區結構域(variable region domain)VH以及三個恆定區結構域(constant region domain)CH1、CH2、及CH3。VH結構域係在多胜肽的胺基端,且CH3結構域係在羧基端。全長輕鏈包括一個可變區結構域VL、及一個恆定區結構域CL。抗原結合片段(antigen binding fragment,Fab)包含一條輕鏈、以及一條重鏈的CH1及可變區。Fab分子之重鏈不能與另一重鏈分子形成雙硫鍵。Fab’片段含有一輕鏈及一重鏈,該重鏈含有更多在CH1及CH2結構域之間的恆定區,致使兩條重鏈之間可以形成鏈間雙硫鍵以形成雙
體(diabody)。一可變片段(variable fragment,Fv)區係包含重鏈及輕鏈兩者的可變區,但缺少恆定區。單鏈片段(single-chain fragment,scFv)係Fv分子,其中該重鏈及輕鏈可變區已藉由撓性連接子(flexible linker)連結以形成單多胜肽鏈(single polypeptide chain),其形成抗原結合區(antigen-binding region)。WO 88/01649、美國專利號4,946,778以及5,260,203中詳細討論單鏈抗體。於本文中,術語「抗體」係包括具有二條全長L-鏈及二條全長H-鏈的免疫球蛋白分子、及其片段(例如,抗原結合片段(Fab)、Fv區、scFv等)。
術語「Fc結構域」意指單體或多聚體型式的分子或序列,其包含非抗原結合部分(non-antigen binding portion)的序列。Fc之原始免疫球蛋白來源較佳係源自人類,並可來自任意同功體,例如,IgG、IgA、IgM、IgE、或IgD。全長Fc由以下Ig重鏈區組成:CH1、CH2、及CH3,其中該CH1及CH2區一般係藉由撓性鉸鏈區(hinge region)連結。
本發明提供融合蛋白,其係包含結合整合蛋白的胜肽、及其他結合蛋白的胜肽,其中該結合整合蛋白的胜肽包括去整合蛋白及其結合整合蛋白的片段;該其他結合蛋白的胜肽係包含VEGF受體之胞外結構域及Fc結構域;其中該結合整合蛋白的胜肽包含至少一在RGD區域上或相鄰處的突變。根據本發明之實施態樣,去整合蛋白及其結合整合蛋白的片段具有選自由以下所組成之群組的胺基酸序列:SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6及SEQ ID NO:7,或一與SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7具有至少85%序列同一性之胺基酸序列。
於本文中,「去整合蛋白」意指一類富含半胱胺酸的蛋白質
或多胜肽,其係整合蛋白之有效的可溶性配體。RGD區域係三胜肽(tri-peptide)精胺酸-甘胺酸-天冬胺酸(Arg-Gly-Asp),其在大部分的單體去整合蛋白中係保守的,且位於整合蛋白結合環(integrin-binding loop)上。本文所述之去整合蛋白係分離自蛇毒、或衍生自野生型,並具有至少一在RGD區域上或相鄰處的突變,以選擇性地結合至或靶向多種整合蛋白同功體。於本文中,術語「RGD區域相鄰處」意謂在給定之胜肽或多胜肽序列中之任意突變係出現在任意自RGD區域算來第15-20個胺基酸內的胺基酸殘基。
在此亦考慮了去整合蛋白之其他胺基酸序列變異體。舉例而言,去整合蛋白的結合親合力及/或其他生物性質可藉由改變編碼該蛋白之胺基酸序列來改善。去整合蛋白突變體可藉由將適當的修飾引入編碼該蛋白的核酸序列中、或藉由胜肽合成引入修飾來製備。該等修飾包括突變,例如將該去整合蛋白之核酸或胺基酸序列進行刪除、插入、及/或取代。去整合蛋白的最終胺基酸構築體(construct)可藉由進行刪除、插入及取代之任意組合來達成,該最終構築體具有所需之特徵,例如結合至整合蛋白超家族成員及/或抑制整合蛋白活化之路徑。
對該蛋白質或多胜肽之生物性質的實質修飾係藉由選擇對維持以下各項有顯著不同效果的取代來實現:(a)取代區域之多胜肽骨架的構造,舉例而言,作為摺疊或螺旋構型、(b)分子在標靶位點的電荷或疏水性、或(c)支鏈之主體。
一種用於辨別融合蛋白之某些殘基或區之較佳突變作用位置的方法係稱為「丙胺酸掃描突變(alanine scanning mutagenesis)」,如Science,1989,244:1081-1085中所描述。舉例而言,將一殘基或一群標靶殘基辨別出來(例如,帶電荷之殘基,諸如,Arg、Asp、His、Lys、及Glu),
並以中性或負電荷胺基酸(最佳係丙胺酸或聚丙胺酸)替換,以影響胺基酸與標靶結合伴侶之交互作用。接著,對取代呈現功能敏感性的該些胺基酸所在位置,藉由於該取代位點引入另一或其他變異體來改進。因此,雖然用於引入胺基酸序列變異的位點係預先決定的,但突變本身的性質不需要預先決定。舉例而言,為分析在給定位點之突變的性能,可在標靶密碼子或區實行隨機突變,並對表現出的融合多胜肽變異體進行所需活性篩選。舉例而言,可在融合蛋白或蛋白組分中添加半胱胺酸鍵以改善其穩定性。
因此,本文提供之去整合蛋白突變體,可為本文所揭露之任意融合蛋白的組分。在一些實施態樣中,該去整合蛋白係包含與選自由以下所組成之群組的去整合蛋白胺基酸序列具有至少85%、至少90%、至少95%、或至少99%之序列同一性的胺基酸序列:馬來亞蝮素(Rhodostomin)(SEQ ID NO:1)、黃綠竹葉青素(Triflavin)(SEQ ID NO:3)、鉅鱗蝰素(Echistatin)(SEQ ID NO:4)、台灣龜殼花素(Trimucrin)(SEQ ID NO:5)、麗紋龜殼花蛇素(Elegantin)(SEQ ID NO:6)及赤尾鮐素(Trigramin)(SEQ ID NO:7)。在一些實施態樣中,去整合蛋白係包含一胺基酸序列,該胺基酸序列具有至少一在馬來亞蝮素(SEQ ID NO:1)、黃綠竹葉青素(SEQ ID NO:3)、鉅鱗蝰素(SEQ ID NO:4)、台灣龜殼花素(SEQ ID NO:5)、麗紋龜殼花蛇素(SEQ ID NO:6)或赤尾鮐素(SEQ ID NO:7)之RGD區域上或相鄰處的突變。在一些實施態樣中,去整合蛋白係包含與去整合蛋白突變體之胺基酸序列(SEQ ID NO:2)具有至少85%、至少90%、至少95%、或至少99%之序列同一性的胺基酸序列。在SEQ ID NO:2中的Xaa指出多個位置,該些位置可藉由插入、取代或刪除來進行修飾,以生產與野生型去整合蛋白不同的胺基酸序列變異體。根據一些實施例,位於SEQ ID NO:2位置50之Xaa,其對應到野生型馬來亞蝮素(SEQ ID NO:1)之RGD區域中的
甘胺酸(Gly),可用甘胺酸之外的天然產生胺基酸取代,以產生馬來亞蝮素變異體。在其他實施例中,SEQ ID NO:2中之一或多個Xaa亦可用原來在野生型馬來亞蝮素(SEQ ID NO:1)之對應位置上找到的胺基酸之外的天然產生胺基酸取代,以產生多種馬來亞蝮素變異體。還需說明的是,去整合蛋白變異體並不限於只包括SEQ ID NO:2中任意Xaa之單一突變,本發明之範圍亦包含在SEQ ID NO:2中Xaa的數個位置或在其他具一致序列的去整合蛋白(例如,SEQ ID NO:3-7)中的對應位置產生多突變。
雖然去整合蛋白之變異體大多參考上述胺基酸序列來討論,編碼蛇毒蛋白之多胜肽序列或核苷酸序列、及其具有至少一RGD區域上或相鄰處之突變的變異體亦可被包含在本發明之範圍中,其中該蛇毒蛋白係例如白唇竹葉青蛇素(Albolabrin)、百步蛇素(Applagin)、墨西哥西海岸響尾蛇素(Basilicin)、矛頭蝮素(Batroxostatin)、鼓腹巨蛇素(Bitistatin)、西部亞種響尾蛇素(Cereberin)、角響尾蛇素(Cerastin)、西部菱背響尾蛇素(Crotatroxin)、南美響尾蛇素(Duressin)、黃綠龜殼花蛇素(Flavoridin)、黃綠龜殼花蛇毒解離素(Flavostatin)、日本蝮蛇素(Halysin)、西伯利亞蝮蛇毒解離素(Halystatin)、巴西蝮素(Jararacin)、巴西蝮蛇毒解離素(Jarastatin)、馬來亞紅口蝮素(Kistrin)、亞馬遜巨蝮素(Lachesin)、西部亞種響尾蛇素(Lutosin)、黑尾響尾蛇素(Molossin)、韓國亞種短尾蝮素(Salmosin)、白眉蝮素(Saxatilin)、北美侏儒響尾蛇素(Tergeminin)、黃綠龜殼花蛇毒解離素(Trimestatin)、台灣龜殼花去整合蛋白(Trimutase)、烏蘇里蝮素(Ussuristatin)、及草原響尾蛇素(Viridin)。
不受理論所限制,本文在此考慮了去整合蛋白藉由結合至整合蛋白超家族成員,以阻斷其與多價整合蛋白受體交互作用,來抑制整合蛋白活化之路徑。在一些方面,去整合蛋白結合至整合蛋白超家族成員,包括
但不限於整合蛋白同功體:αvβ1、αvβ3、cαvβ5、αvβ6、αvβ8、α5β1、及/或αvIIbβ3。
根據本發明,融合蛋白之其他結合蛋白的胜肽可為受體蛋白,該受體蛋白結合至選自由以下所組成之群組的標靶:腫瘤抗原、腫瘤壞死因子(TNF)受體超家族成員、刺蝟因子(Hedgehog)家族成員、受體酪胺酸激酶、蛋白多糖相關之分子、腫瘤生長因子-β(TGF-β)超家族成員、Wnt相關之分子及血管新生標靶。
根據本發明之一些實施態樣,其他結合蛋白的胜肽可專一性地結合至血管新生標靶,其包括但不限於血管生成素(ANG)、酪胺酸蛋白激酶(Eph)、纖維母細胞生長因子(FGF)、神經纖毛蛋白(NRP)、血纖維蛋白溶酶原活化物、血小板衍生生長因子(PDGF)、TGF-β、血管內皮生長因子(VEGF)、血管內皮鈣黏蛋白(VE-cadherin)、及其受體。因此,根據本發明實施態樣,其他結合蛋白的胜肽可包括受體蛋白之胞外部分,其結合至並拮抗該血管新生標靶。在其他實施態樣中,其他結合蛋白的胜肽可結合至血管新生因子受體之胞外部分。
在一些實施態樣中,其他結合蛋白的胜肽可係結合至VEGF配體的抗VEGF抗體(參見WO2015/200905對胺基酸序列之描述,該文獻之全文併於此處以供參考)、或結合至VEGF受體的抗VEGFR1或抗VEGFR2抗體(參見美國專利號5,874,542對胺基酸序列之描述,該文獻之全文併於此處以供參考)。在其他實施態樣中,其他結合蛋白的胜肽亦可係結合至PDGF配體的抗PDGF抗體(參見美國專利號5,094,941對胺基酸序列之描述,該文獻之全文併於此處以供參考)、或結合至PDGF受體的抗PDGFRβ抗體(參見美國專利號9,265,827對胺基酸序列之描述,該文獻之全文併於此處以供參考)。
在某些實施態樣中,其他結合蛋白的胜肽作為以下VEGF受體(VEGFR)之任意一者結合至相同的VEGF:VEGFR1、VEGFR2、及VEGFR3。在一些實施態樣中,其他結合蛋白的胜肽係包含VEGFR之至少一胞外部分,該VEGFR係本文所述之任意VEGFR。舉例而言,其他結合蛋白的胜肽係包含VEGFR1之至少一胞外部分、或VEGFR2之至少一胞外部分。在另一實施例中,其他結合蛋白的胜肽係包含VEGFR1之一胞外部分,例如類免疫球蛋白結構域2(D2)、及VEGFR2之一胞外部分,例如類免疫球蛋白結構域3(D3)。在一些方面,其他結合蛋白的胜肽係包含VEGFR1之一胞外部分(其包含SEQ ID NO:8之胺基酸序列)、及VEGFR2之一胞外部分(其包含SEQ ID NO:9之胺基酸序列)。在一些方面,其他結合蛋白的胜肽係包含VEGFR1及VEGFR2之胞外部分的融合體,其包含SEQ ID NO:10之胺基酸序列、或與SEQ ID NO:10具有至少85%序列同一性之胺基酸序列。
在其他實施態樣中,其他結合蛋白的胜肽作為以下PDGF受體(PDGFR)之任一者結合至相同的PDGF:PDGFR-α、及PDGFR-β。在一些實施態樣中,其他結合蛋白的胜肽係包含PDGFR之至少一胞外部分,該PDGFR係本文所述之任意PDGFR。舉例而言,其他結合蛋白的胜肽係包含PDGFR-α之至少一胞外部分、或PDGFR-β之至少一胞外部分。在另一實施例中,其他結合蛋白的胜肽係包含PDGFR-β之一胞外部分,例如類免疫球蛋白結構域1至3。在一些方面,其他結合蛋白的胜肽係包含PDGFR之胞外部分,其包含SEQ ID NO:11之胺基酸序列、或與SEQ ID NO:11具有至少85%序列同一性之胺基酸序列。
根據其他實施態樣,本發明亦提供融合蛋白,其係包含結合整合蛋白之胜肽、人類或人源化恆定亞區、及其他結合蛋白的胜肽,其中該結合整合蛋白之胜肽係包括在RGD區域上或相鄰處具有至少一突變之SEQ
ID NO:1的胺基酸序列、與SEQ ID NO:1具有至少85%序列同一性之胺基酸序列、或SEQ ID NO:2之胺基酸序列;該人類或人源化恆定亞區係包含免疫球蛋白CH2結構域及免疫球蛋白CH3結構域;該其他結合蛋白的胜肽具有VEGFR1之類免疫球蛋白D2及VEGFR2之類免疫球蛋白D3。在融合蛋白的另一實施態樣中,結合整合蛋白的胜肽具有與SEQ ID NO:2至少85%之序列同一性。
就多胜肽或核酸序列而言,術語「序列同一性百分比(%)」係定義為:在比對序列並在需要時引入間隙(gap)以達到最大序列同一性百分比之後,在保守性置換(conservative substitution)不被視為序列同一性的一部分之情況下,候選序列中與參照的多胜肽或核酸序列中相同的胺基酸殘基或核苷酸的百分比。為了測定胺基酸或核酸序列同一性百分比所進行的比對,可用多種本技術領域中之方式達成,例如,使用公開之電腦軟體程式,舉例而言,如該等描述於Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人,eds.,1987)中的電腦軟體程式,以及包括BLAST、BLAST-2、ALIGN、或Megalign(DNASTAR)軟體。熟習此項技術領域者可選定用於測量比對之適當參數,包括對欲比較序列之全長達到最大化比對所需的演算法。就本文之目的而言,給定胺基酸序列A對比給定胺基酸序列B之胺基酸序列同一性百分比,係如下計算:100乘以分數X/Y,其中X係藉由序列比對程式在程式比對A及B時,評分為相同的胺基酸殘基的數目,且其中Y係B中胺基酸殘基的總數。應了解,當胺基酸序列A之長度與胺基酸序列B之長度不相等時,A對B的胺基酸序列同一性百分比不會與B對A的胺基酸序列同一性百分比相等。
本發明提供二聚體融合蛋白,其係包含二融合蛋白,其中各融合蛋白包含本文所揭露的任意融合蛋白。在一實施態樣中,二聚體融合蛋
白係包含兩個完全相同的融合蛋白。在另一實施態樣中,二聚體融合蛋白可包含兩個不同的融合蛋白。本文所揭露之融合蛋白可透過多聚化結構域形成二或更多個完全相同之融合蛋白多聚體或異種(heterologous)融合蛋白,該結構域包括人類或人源化抗體之恆定亞區。在一些實施態樣中,人類或人源化抗體之恆定亞區係選自由以下所組成之群組:IgG Fc區、IgA Fc區、IgM Fc區、IgD Fc區、及IgE Fc區。在另一實施態樣中,人類或人源化抗體之恆定亞區係選自由以下所組成之群組:IgG1 Fc區、IgG2 Fc區、IgG3 Fc區、及IgG4 Fc區。在一些方面,亞區包含IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4之CH2區及CH3區。編碼包含Fc區之免疫球蛋白的胺基酸序列,係為本技術領域所熟知。
融合蛋白的組分可互相直接連結,或透過連接子連結。一般而言,術語「連接子」意為一或多個分子(例如,核酸、胺基酸、或非胜肽部分(non-peptide moiety)),其可插入於一或多個組分結構域之間。舉例而言,連接子可用於在組分之間提供所需之受關注位點,以便於操作。連接子亦可提供來使宿主細胞提升融合蛋白表現量、減少立體阻礙(steric hindrance)致使該組分可取得其最適的三級結構、及/或適當地與其標靶分子交互作用。連接子序列可包括一或多個天然連結至受體組分的胺基酸、或可係添加來用於提升融合蛋白表現量之序列,以提供特別所需之受關注位點、以使組分結構域形成最適的三級結構、及/或以提升組分與其標靶分子的交互作用。
較佳的情況為連接子增加融合蛋白組分之撓性,而不干擾在該融合蛋白中之各功能性組分的結構。在一些實施態樣中,連接子部分係長度為2至100個胺基酸之胜肽連接子。例示性連接子包括具有至少二個胺基酸殘基之線性胜肽,例如:Gly-Gly、Gly-Ala-Gly、Gly-Pro-Ala、Gly(G)n、及Gly-Ser(GS)連接子。本文所述之GS連接子包括但不限於(GS)n、
(GSGSG)n、(G2S)n、G2S2G、(G2SG)n、(G3S)n、(G4S)n、(GGSGG)nGn、及GSG4SG4SG,其中n係1或1以上。(G)n連接子的一個例子包括G9連接子。適合的線性胜肽包括聚甘胺酸(polyglycine)、聚絲胺酸(polyserine)、聚脯胺酸(polyproline)、聚丙胺酸(polyanaline)、及由丙胺醯基(alanyl)及/或絲胺醯基(serinyl)及/或脯胺醯基(prolinyl)及/或甘胺醯基(glycyl)之胺基酸殘基所組成的寡胜肽(oligopepetide)。連接子部分可用來連接本文所揭露之融合蛋白的任意組分。在一些實施態樣中,連接子係用在受體蛋白之胞外部分、及免疫球蛋白之恆定亞區之間。在其他實施態樣中,連接子係用在去整合蛋白或其變異體、及免疫球蛋白之恆定亞區之間。在某些實施態樣中,融合蛋白包含一位在受體蛋白之胞外部分、及去整合蛋白或其變異體之間的連接子;及一位在去整合蛋白或其變異體、及免疫球蛋白之恆定亞區之間的連接子。如本發明所體現,融合蛋白可包含至少一條但不多於四條之連接子。
本文所述之融合蛋白可包含或不包含使融合蛋白自宿主細胞分泌出來的訊息胜肽。編碼該訊息胜肽的核酸序列,能夠可操作地連接至編碼感興趣之蛋白的核酸序列。在一些實施態樣中,該融合蛋白包含訊息胜肽。在一些實施態樣中,融合蛋白並不包含訊息胜肽。
此外,本發明所述之融合蛋白可包含結合蛋白的胜肽之經修飾型態。舉例而言,融合蛋白組分可具有轉譯後修飾,包括例如對任意結合蛋白的胜肽進行醣化、唾液酸化、乙醯化、及磷酸化。
雖然,實施態樣已大致描述包含於融合蛋白中的二條結合蛋白的胜肽,本發明亦包含併入二條以上結合蛋白的胜肽之融合蛋白,以在抑制血管新生過程之方面提供任何加成的或協同的效果。舉例而言,可有一額外的結合蛋白的胜肽,其結合至其他血管新生標靶、或作為血管新生因子拮
抗劑而連接至現存之二條結合蛋白的胜肽。
本發明提供一編碼本文所揭露之融合蛋白的核酸。本發明更提供一種用於製備本文所揭露之融合蛋白的方法。該方法包含培養一宿主細胞,其中該宿主細胞係以包含本發明核酸序列之載體轉染,以及在適合的條件下重獲該宿主細胞所製備之融合蛋白。
於本文中,術語「多核苷酸」、或「核酸」意指任意長度之核苷酸多聚型,其可為核醣核苷酸或去氧核醣核苷酸之任一者。因此,該術語包括但不限於單股、雙股、或多股DNA或RNA、基因體DNA、cDNA、DNA-RNA雜交體、或包含嘌呤或嘧啶鹼基的多聚體、或包含其他天然、經化學或生化修飾、非天然、或衍生之核苷酸鹼基的多聚體。
經分離之編碼融合蛋白的核酸分子、或融合蛋白之組分可係RNA形式(例如,mRNA、hnRNA、tRNA、或其他任意形式)、或DNA形式(包括但不限於cDNA及基因體DNA),其係藉由選殖(cloning)、或合成生產、或其任意組合來獲得。DNA可係三股、雙股或單股,或其任意組合。DNA或RNA之至少一股的任意部分可係編碼股(稱作正股(sense strand)),或其可係非編碼股(亦稱作反股(anti-sense strand))。經分離之編碼融合蛋白的核酸、或融合蛋白之組分可藉由各種本發明所屬技術領域中所知之方法來製備,包括但不限於由天然來源所分離、或藉由寡核苷酸調節之突變作用(oligonucleotide-mediated mutagenesis)來製備、及將先前製備的融合蛋白或融合蛋白組分的變異體或非變異體形式進行盒式突變(cassette mutagenesis)。參見Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Sambrook等人,4th ed.,Cold Spring Harbor,N.Y.2012)、及Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人,eds.,2003)。
「載體(vector)」意指一重組質體,其係包含於體外或體內
欲遞送入宿主細胞的核酸。
本發明包含一核酸遞送媒介物(nucleic acid delivery vehicle)的用途,其係用於將一或多個編碼融合蛋白或融合蛋白組分之核酸序列引入細胞中,來表現所述蛋白。核酸遞送媒介物的例子係:脂質體、生物可相容多聚體(包括天然多聚體及合成多聚體)、脂蛋白、多胜肽、多醣、脂多醣、人工病毒套膜、金屬顆粒、及細菌、病毒(例如,桿狀病毒、腺病毒、及反轉錄病毒)、噬菌體、黏質體(cosmid)、質體、真菌載體、及其他常用於本技術領域之重組媒介物,該等媒介物係已被描述用於在多種真核及原核宿主中表現。在一些實施態樣中,核酸遞送媒介物係表現載體,例如質體。載體可包括任意元件以建立表現載體(例如,啟動子、核醣體結合元件、終止子、強化子、選擇標記)及複製起點之常見功能。啟動子可係組成型(constitutive)啟動子、誘導型(inducible)啟動子、或阻抑型(repressible)啟動子。若干可遞送核酸進入細胞的表現載體係為本技術領域所知,且在本文中其可用於在細胞中產生融合蛋白或融合蛋白之組分。表現之融合蛋白或融合蛋白之組分可自細胞中穫得,並根據本技術領域所知之習用技術以及如本文所述來純化。
本文所提供的宿主細胞,其包含編碼本文所述之融合蛋白的核酸。編碼融合蛋白或融合蛋白之組分(例如,血管新生因子受體之胞外部分、去整合蛋白或其變異體、及/或免疫球蛋白之恆定亞區)的核酸,可藉由本技術領域所知之任意手段提供至目標細胞。在一些實施態樣中,編碼有興趣之蛋白的核酸係在表現載體(例如,質體)中。在其他實施態樣中,編碼有興趣之蛋白質的核酸係在病毒載體中,且該載體已被包裹,然後病毒體(virion)可用來感染細胞。已知轉染及轉型(transformation)程序適合用於將編碼有興趣之蛋白的核酸引入目標細胞中。利用多聚體、脂質體、或奈
米球(nanosphere)之調配物可用於遞送編碼有興趣之蛋白的核酸。根據本發明之重組構築體轉型或轉染之細胞,可係任意熟習此項技術領域者所習用的。可用之例示性細胞型包括:細菌、酵母菌、真菌、昆蟲、植物、及哺乳類細胞。在一些實施態樣中,經轉型或轉染之細胞可被提供至細胞或哺乳類宿主。適合用於遞送至細胞或哺乳類宿主的細胞包括來自任意起源、腫瘤、或細胞株之任意哺乳類細胞型。
用於製備本發明融合蛋白或融合蛋白之組分的細胞,係生長於熟習此項技術領域者所知之培養基中,且該培養基適合用於培養所選擇之宿主細胞。給予的培養基通常在必要時以荷爾蒙及/或其他生長因子、DHFR、鹽類、緩衝液、核苷、抗生素、微量元素、及葡萄糖或同等之能量來源補充。熟習此項技術領域者所知的任何其他必要的補充物亦可以適當之濃度包括在內。培養條件,例如溫度、pH值、及諸如此類,係與先前所選擇之用於表現的細胞所用的條件相同,且對熟習此項技術領域者係顯而易見的。
蛋白可使用一般所知的方法來純化及辨識,例如在免疫親合或離子交換管柱上進行分餾;乙醇沉澱法;反相高壓液相層析(HPLC);在矽膠上或陽離子交換樹脂(例如,DEAE)上進行色層分析法;色層交集法(chromatofocusing);SDS-PAGE;硫酸銨沉澱法;膠體過濾法(例如,葡萄糖凝膠G-75(Sephadex G-75));疏水親合力樹脂,使用固化在基質上之適合之結合伴侶的配體親合力、離心、酵素免疫檢定法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA)、BIACore、西方墨點法、胺基酸及核酸定序、及生物活性。在一些實施態樣中,融合蛋白係在宿主細胞內表現,並使用一種或多種標準純化技術之組合自其中純化,該等技術包括但不限於蛋白A親合力層析、蛋白G親合力層析、緩衝液置換、粒徑排阻層析、超過濾、及透
析。因此,回收之融合蛋白實質上是純的。在另一實施態樣中,回收之融合蛋白係以下之任一者:純度至少為90%、95%、96%、97%、98%、或99%。
本文所揭露之融合蛋白或融合蛋白之組分,可對生物活性做定性或評估,該等生物活性包括但不限於對目標結合伴侶之親合力、競爭性結合、抑制性活性、細胞增生之抑制、腫瘤生長之抑制、及血管新生之抑制。在一些實施態樣中,本文所揭露之融合蛋白或融合蛋白之組分可在體外及體內進行生物活性評估。許多用於評估結合親合力之方法係為本技術領域所知,並可用於辨識融合蛋白或融合蛋白之組分對結合伴侶之結合親合力。結合親合力可以解離常數(dissociation constant,Kd)值或最大有效濃度之一半(half maximal effective concentration,EC50)表示。
在本文之任意實施態樣中,融合蛋白對活性之抑制(例如,對血管新生因子活性及/或整合蛋白活性之抑制)具有小於或等於1μM、100nM、10nM、1nM、0.1nM、0.01nM、或0.001nM的EC50。在本文之任意實施態樣中,融合蛋白對結合伴侶(血管新生因子及/或整合蛋白)具有小於約1.0mM、500μM、100μM、50μM、10μM、5μM、1μM、500nM、100nM、50nM、10nM、5nM、1nM、500pM、100pM、50pM、10pM、或5pM的Kd值,包含該些數字之間的任意值。
本發明亦提供一醫藥組合物,其係包含融合蛋白,該融合蛋白係包含結合整合蛋白的胜肽、其他結合蛋白的胜肽以靶向血管新生因子、及Fc結構域,其中該結合整合蛋白的胜肽係選自由以下所組成之群組:去整合蛋白、抗整合蛋白αvβx抗體、抗整合蛋白α5β1抗體、靶向整合蛋白αvβx或α5β1之纖維黏連蛋白、及其結合整合蛋白的片段,其中x係1、3、5、6或8。本發明組合物包含治療有效量之融合蛋白。
術語「治療有效量」意謂具治療活性之化合物引起所需之生
物或臨床效果所需要之量。根據本發明之實施態樣,「治療有效量」係可達到有利影響或所需結果(包括臨床結果)之足夠的量。治療有效量可以一次或多次給藥中投予。依照疾病狀態,治療有效量係足夠改善、穩定、或延緩疾病發展的量。根據本發明之特定實施態樣,治療有效量係治療或預防不正常血管新生之病症(例如其表徵為新生血管、血管滲透性、水腫、發炎、視網膜病變、纖維化或癌症之疾病)所需之融合蛋白量。
在一些實施態樣中,包含融合蛋白之醫藥組合物係包含在緩衝液中調配的融合蛋白,其蛋白質濃度自約0.5至約100毫克/毫升,較佳為約40至約80毫克/毫升,例如約40、50、60、70或80毫克/毫升,最佳為約40±約5毫克/毫升。在其他較佳實施態樣中,融合蛋白係以高於約40毫克/毫升之蛋白濃度在緩衝液中調配。
在具體實施態樣中,緩衝液係具有約6.5至8、更佳為約7至7.5、甚至更佳為約7.2之pH值的磷酸鹽緩衝液。該磷酸鹽緩衝液係包含約5至20mM之磷酸鈉,例如5、10、15、或20mM之磷酸鈉,更佳為約10mM之磷酸鈉;約20至60mM之氯化鈉,更佳為約40mM之氯化鈉;約1至10%重量/體積(w/v)之蔗糖,更佳為約5%重量/體積之蔗糖;以及約0.01至0.05%重量/體積之界面活性劑,更佳為約0.03%重量/體積之聚山梨醇酯20。
在其他具體實施態樣中,緩衝液係pH值具有約5至8、更佳為約6至7、最佳為約6.8的組胺酸緩衝液。該組胺酸緩衝液係包含約10至50mM之組胺酸,例如10、20、30、40、或50mM之組胺酸,更佳為約25mM之組胺酸;約10至30mM之氯化鈉,例如10、20、或30mM之氯化納,更佳為約20mM之氯化鈉;約1至10%重量/體積之蔗糖,例如1、2、4、6、8、或10%重量/體積之蔗糖,更佳為約6%重量/體積之蔗糖;以及約0.01至0.05%重
量/體積之界面活性劑,更佳為約0.03%重量/體積之聚山梨醇酯20。
本發明亦關於使用根據本發明之組合物,在一個體或受試者中治療或預防整合蛋白相關之疾病的用途。「個體」或「受試者」係哺乳類。哺乳類包括但不限於馴養動物(例如,牛、羊、貓、狗、及馬)、靈長類(例如,人類及非人類靈長類(non-human primates)(例如猴子))、兔子及囓齒類(例如,小鼠及大鼠)。在一些實施態樣中,用於治療或預防疾病之一或多種方面或症狀的方法係包含,對一個體投予一有效量之包含融合蛋白的組合物。
本文所述之方法可用於治療多種疾病,包括但不限於發炎性疾病、眼部疾病、自體免疫疾病、或癌症。在一些實施態樣中,欲治療之疾病包括但不限於類風濕性關節炎、炎症性關節炎、骨關節炎、癌症、纖維化、色素性視網膜炎、眼色素層炎(例如,前眼色素層炎或後眼色素層炎)、及特徵係新生血管或缺血之眼部疾病(例如,脈絡膜新生血管、糖尿病視網膜病變、糖尿病黃斑水腫、老年性黃斑退化(AMD)、視網膜靜脈阻塞、多發息肉性脈絡膜血管病變)。
本文所述之組合物可透過任意途徑投予至個體,途徑包括但不限於靜脈、腹膜、眼部、動脈、肺臟、口服、吸入、血管(intravesicular)、肌肉、氣管、皮下、脊髓(intrathecal)、經皮、經胸膜(transpleural)、局部、黏膜、胃腸、關節(intraarticular)、腦池內(intracisternal)、心室內、顱內、尿道內、肝內、及腫瘤內。在一些實施態樣中,組合物係系統性投予(例如藉由靜脈注射)。在一些實施態樣中,組合物係局部投予(例如藉由動脈注射或眼內注射)。
在一些實施態樣中,組合物係直接投予至眼睛或眼睛組織。在一些實施態樣中,組合物係局部地投予至眼睛,舉例而言,眼藥水。在一
些實施態樣中,組合物係藉由注射至眼睛(眼內注射)或至與眼部相連的組織來投予。組合物可被投予,舉例而言,藉由眼內注射、眼周注射、次視網膜注射、玻璃體內注射(intravitreal injection)、脈絡膜表面(superchoroidal)注射、經中膈(trans-septal)注射、鞏膜下(subscleral)注射、脈絡膜內注射、前房內(intracameral)注射、結膜下注射、坦諾囊下(sub-Tenon’s)注射、眼球後(retrobulbar)注射、眼球周邊(peribulbar)注射、或後鞏膜旁遞送(posterior juxtascleral delivery)。這些方法係為本技術領域所知。組合物可被投予至例如玻璃體、前房液、鞏膜、結膜、在鞏膜及結膜之間的部位、視網膜脈絡膜組織、黃斑、或其他在個體眼睛中或鄰近的部位。
組合物之最適有效量可憑經驗決定,且將取決於疾病之型態及嚴重性、投予途徑、疾病進程及個體之健康狀況、重量及身體部位。該等決定係在本技術領域者之通常知識範圍內。包含融合蛋白之組合物亦可以一週六次、一週五次、一週四次、一週三次、一週二次、一週一次、二週一次、三週一次、一個月一次、二個月一次、三個月一次、六個月一次、九個月一次、或一年一次來投予。
除非另外定義,此處所用之所有技術及科學術語係具有與本發明所屬技術領域中具通常知識者通常所了解之相同意義。雖然任何與本文所述類似或同等之方法及材料可用來實施或測試本發明,但較佳的為現在描述的方法及材料。所有本文所提到之供參考的出版品係併於本文中,以描述與該些被引用之出版品相關的方法及/或材料。
本發明藉由以下實施例進一步說明,該等實施例係為了證明之目的而提供,並非用以限制本發明。
重疊延伸聚合酶連鎖反應(overlap extension polymerase chain reaction,PCR)技術係用於創造馬來亞蝮素(Rho)突變構築體。表現套組(expression kit)及酵母菌轉染載體pPICZaA係購自Invitrogen。藉由PCR放大基因序列來製造基因突變構築體,該基因序列使用含有基因突變體加上EcoRI辨認位點、及用於促進純化之六個組胺酸殘基之互補序列的正股引子(sense primer),且設計反股引子(anti-sense primer)使其含有Sac II辨認位點及TTA終止密碼子。純化PCR產物,然後選殖入酵母菌重組載體pPICZaA之EcoRI及Sac II位點。將重組質體轉型入大腸桿菌勝任細胞(E.coli competent cell)DH5α,並藉由具有低鹽Luria Broth(LB,1%胰化蛋白、0.5%酵母萃取物、0.5% NaCl、及1.5%瓊脂,pH 7.0)及25微克/毫升之抗生素吉歐黴素(Zeocin)的瓊脂盤來選取群落。選取單一群落來為定序放大質體。在藉由DNA定序確定群落後,製備10微克之質體,然後以Sac I酵素消化來線性化。使用套組(Pichia Easy Comp;Invitrogen)將線性化之構築體轉型入嗜甲醇酵母菌(Pichia)株X33中,並藉由使用YPDS(1%酵母萃取物、2%蛋白腖、2%葡萄糖、2%瓊脂、及1M山梨醇)及100微克/毫升之吉歐黴素的瓊脂盤來選取群落。使用PCR分析來分析嗜甲醇酵母菌整合蛋白,以測定基因是否嵌合入嗜甲醇酵母菌基因體中。自具有多份基因插入的數個群落中,選取具有最高蛋白表現量之群落。
Rho突變體係如下製備:100微升之細胞儲液係在200毫升之酵母萃取物蛋白腖葡萄糖(yeast extract peptone dextrose,YPD)培養基(1%酵母萃取物、2%蛋白腖、及2%葡萄糖)及100微克/毫升之吉歐黴素中、30℃下生長48小時。然後將細胞轉移到800毫升之YPD培養基中。又經過48小時後,藉由離心蒐集細胞,並在1公升之最小甲醇培養基(minimal methanol
medium)(1.34%具有硫酸銨不具胺基酸的酵母氮源基礎培養基(yeast nitrogen base,YNB)、4x10-5%生物素、1%甲醇)生長。在2天中每24小時添加1%甲醇一次,以誘導蛋白表現。在離心後蒐集上清液,並以5公升H2O透析二次、以5公升20mM Tris-HCl及200mM NaCl(pH 8)透析一次。裝填最終溶液進鎳離子螯合管柱,並以200mM咪唑之梯度沖提。在嗜甲醇酵母菌(P.pastoris)中製備的重組Rho蛋白,進一步藉由反相C18 HPLC以15%至18%乙睛之梯度純化。甘胺酸十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(tricine-SDS-PAGE)分析確定蛋白之純化係大於95%。
Flt-1受體(VEGFR1)之胞外結構域D2(即,SEQ ID NO:8)及KDR/Flk-1受體(VEGFR2)之胞外結構域D3(即,SEQ ID NO:9),統稱為VEGF誘捕劑(trap),其為提供結合至VEGF配體的蛋白組分。為了結合至VEGF配體及整合蛋白二者,產生包含VEGF1 D2/VEGF2 D3(即,SEQ ID NO:10)及Rho突變體(即,SEQ ID NO:13)的融合蛋白。
先前產生之VEGF誘捕劑係連接至人類免疫球蛋白G1之CH2及CH3結構域(IgG1 Fc),用來產生編碼VEGF1 D2/VEGF2 D3-Rho突變雜交體的DNA構築體。參見Holash,J.等人,PNAS,2002,99(17):11393-11398對VEGF誘捕劑之描述,該文獻之全文併於此處以供參考。SEQ ID NO:16之融合蛋白係藉由透過至少一Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(G4S)胜肽連接子,連接SEQ ID NO:10之VEGFR1 D2/VEGFR2 D3及SEQ ID NO:13之Rho突變體來構築。
類似地,SEQ ID NO:15及17之融合蛋白2及3亦係藉由將SEQ ID NO:12及SEQ ID NO:14之Rho突變體分別與SEQ ID NO:10之VEGFR1 D2/VEGFR2 D3融合來產生。SEQ ID NO:18之融合蛋白4係藉由
將市售的VEGF誘捕劑阿普西柏(aflibercep)(采視明(Eylea®),雷傑納隆(Regeneron))與SEQ ID NO:13之Rho突變體融合來產生。第1圖提供示意圖,顯示根據本發明之一實施態樣的融合蛋白之構造。SS係SEQ ID NO:20之訊息胜肽序列,其幫助中國倉鼠卵巢(CHO)細胞分泌蛋白質。VEGF誘捕劑係由人類VEGFR1及VEGFR2之胞外類免疫球蛋白結構域2及3所構成。Fc片段係人類免疫球蛋白G1(IgG1)之CH2及CH3區。GS係連接子。Rho突變體已描述於美國專利號7,943,728及PCT申請號PCT/US 15/46322中,且其序列係併於此處以供參考。
為產生具有SEQ ID NO:16胺基酸序列之融合蛋白1,編碼融合蛋白1之DNA序列係經密碼子優化,以用於在CHO細胞中表現。該合成的經密碼子優化DNA具有SEQ ID NO:19之胺基酸序列,與具有SEQ ID NO:21胺基酸序列之訊息胜肽一起選殖入表現載體中。於轉染前72小時,將CHO K1宿主細胞以2x105個細胞/毫升種入含有4mM麩醯胺酸(J.T Baker 2078-06)及1% HT補充液(Gibco 11067-030)之CD CHO(Gibco 12490-003)中。宿主細胞係培養於Infors震盪培養箱中(36.5℃、75%濕度、6% CO2、每分鐘110轉(110RPM),且在使用前計數細胞密度。適合量之表現質體DNA係添加入宿主細胞(1公升或5公升工作體積),並添加以聚合物為基礎(polymer-based)之轉染試劑。經轉染之培養物係培養於Infors震盪培養箱中(36.5℃、75%濕度、6% CO2、110RPM)4小時,並添加適當之飼養溶液。然後將經轉染之培養物培養於Infors震盪培養箱中(32℃、75%濕度、6% CO2、110RPM)。在轉染後第10天收穫經轉染培養物。純化上清液以產生研究材料。純化過程包括淨化作用、蛋白A親合力層析、藉由Amicon Ultracel濃縮、粒徑排阻層析、藉由Slide-A-Lyzer透析、及藉由Amicon Ultracel在調配物緩衝液中進行最終濃縮。
具有同時抗VEGF及抗整合蛋白活性的融合蛋白係被構築、表現、純化及定性。第2圖提供示意圖,定性藉由SDS-PAGE純化之融合蛋白1。裝填分子標記進泳道M。建構之VEGF誘捕劑(正對照組1;SEQ ID NO:22)的非還原型及還原型係分別裝填入泳道1及2中,該VEGF誘捕劑係由人類VEGFR1及VEGFR2之部分融合至人類IgG1之Fc部分所組成。市售之VEGF誘捕劑阿普西柏(采視明,雷傑納隆)(正對照組2)的非還原型及還原型係分別裝填入泳道3及4中。融合蛋白1的非還原型及還原型係分別裝填入泳道5及6中。各蛋白質樣本係以3微克之體積裝填於各泳道中。如第2圖所示,結果指出正對照組及融合蛋白1在還原及非還原條件下皆呈現高整體性及純度。融合蛋白1在指定調配物緩衝液中之最終濃度係大約40毫克/毫升(來自於280奈米(nm)波長下之吸光值)。
藉由各自構築體進行細胞轉染以製備蛋白同二聚體(homodimer),該蛋白同二聚體之製備係藉由SDS-PAGE及生物活性分析加以確定。
使用直接結合酵素免疫檢定法(ELISA)來測量本發明融合蛋白對人類VEGF165之結合親和力,其中人類VEGF165係VEGF-A的剪接變異體。
VEGF誘捕劑係為了治療用途而建造的可溶性VEGF受體,且近來被FDA核准來治療AMD。VEGF誘捕劑含有VEGFR1之第二類免疫球蛋白結構域2(D2)融合至VEGFR2之第三類免疫球蛋白結構域3(D3)融合至人類IgG1之可結晶(Fc)區(Holash,J.等人,Proc Natl Acad Sci USA.2002 Aug 20;99(17):11393-8)。VEGF誘捕劑靶向VEGF-A、VEGF-B、及人類胎盤生長因子(PlGF)。其中包括市售VEGF誘捕劑阿普西柏(采視明,雷傑
納隆)作為正對照組2。
添加100微升之塗佈溶液(1微克/毫升VEGF165在1倍磷酸鹽緩衝生理食鹽水(phosphate buffered saline,PBS),pH7.2)至96-孔ELISA盤之各孔中,且該盤係於4℃下培養過夜。以400微升之1倍PBS緩衝液清洗孔二次,並以紙巾小心地移除過量液體。
添加400微升之封塞液(5克脫脂牛奶在100毫升之1倍PBS中)至各孔中,且該盤係於室溫下培養1小時。以1倍PBS緩衝液清洗孔二次。
融合蛋白及對照組樣品以封塞液依序稀釋三倍,最高之蛋白濃度係10nM。添加100微升之系列稀釋樣品至各孔中。將該盤加蓋並於室溫下在盤震盪器上以大約每分鐘100轉(~100rpm)的轉速培養1小時。以清洗緩衝液(1倍PBS、0.05%聚山梨醇酯20)清洗該些孔三次。
添加100微升的山葵過氧化酶共軛之山羊抗人類IgG Fc專一性抗體(horseradish peroxidase-conjugated goat anti-human IgG Fc specific antibody)至各孔中,該抗體係經封塞液以1:2500稀釋。密封該盤並於室溫下在盤震盪器上培養1小時。以清洗緩衝液清洗該盤三次。
添加100微升之3,5,3’,5’-四甲基聯苯胺(tetramethylbenzidine,TMB)至各孔中,將該盤培養3至5分鐘以使反應進行。為停止反應,添加100微升之停止液(1N HCl)至各孔中。
各孔之光學密度(optical density,OD),係使用ELISA盤讀取器在吸收波長450奈米下測定。該吸光值對融合蛋白或對照組之蛋白濃度作圖,且該濃度係以EC50的訊號決定。
經測試之本發明融合蛋白的結合親合力,以EC50值表現,係在0.10nM及0.21nM之間。ELISA之結果係顯示於表1中。
實施例3之結果顯示,根據本發明實施態樣之融合蛋白,以高親和力與VEGF165結合。此亦在第3圖中說明。
使用競爭性結合來測量本發明融合蛋白1對整合蛋白αvβ3之結合親和力。根據實施例1合成野生型Rho(SEQ ID NO:1)及Rho變異體KG(SEQ ID NO:13),並分別包括在競爭性結合檢定中作為正對照組3及正對照組4。
添加溶解在塗佈溶液中的1微克/毫升玻璃黏結蛋白(vitronectin)至96-孔ELISA盤之各孔中,並於4℃下培養該盤過夜。以PBS緩衝液清洗孔二次,並以紙巾小心地移除過量液體。
添加封塞液(5克脫脂牛奶在100毫升之1倍PBS中)至各孔中,且該盤係於室溫下培養1小時。以1倍PBS緩衝液清洗孔二次。
將各種不同濃度之正對照組3、正對照組4、及融合蛋白1與一定濃度之可溶性整合蛋白αvβ3混和。添加100微升之系列稀釋樣品至各孔中。將該盤加蓋並於室溫下在盤震盪器(~100rmp)上培養1小時。以清洗緩衝液(1倍PBS、0.05%聚山梨醇酯20)清洗該些孔三次。
添加經稀釋之一級抗整合蛋白αv抗體,並培養,然後清洗。添加在封塞液中的山葵過氧化酶共軛之山羊抗人類IgG Fc專一性抗體至各孔中。密封該盤並於室溫下在盤震盪器上培養1小時。以清洗緩衝液清洗該盤三次。
添加100微升之3,5,3’,5’-四甲基聯苯胺(TMB)至各孔中,將該盤培養3至5分鐘以使反應進行。為停止反應,添加100微升之停止液(1N HCl)至各孔中。
各孔之光學密度(OD),係使用ELISA盤讀取器在吸收波長450奈米下測定。該吸光值對融合蛋白或對照組之蛋白濃度作圖,且該濃度係以最大抑制濃度之一半(half the maximal inhibition concentration,IC50)的訊號決定。
經測試之本發明融合蛋白的競爭性結合,以IC50值表現,係在2.2nM及16nM之間。結果顯示於表2中,且亦在第4圖中說明。
實施人類臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)增生檢定以測試本發明融合蛋白之功能。包括市售之VEGF誘捕劑阿普西柏(采視明,雷傑納隆)作為正對照組2。
添加100微升之塗佈溶液(1%明膠在二次蒸餾水中)至96-孔ELISA盤之各孔中,該盤係於37℃下以2小時或隔夜培養。孔盤係以1倍PBS緩衝液清洗二次。
添加3500計數之在內皮細胞生長基中的人類臍靜脈內皮細胞至各孔中,並將該盤於37℃下隔夜培養。
融合蛋白樣品以檢定緩衝液(培養基-199 1倍厄爾鹽(Earle’s Salts)、10%胎牛血清(fetal bovine serum)、10mM 4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、1倍抗生素/抗黴劑)稀釋,其最高蛋白濃度係300nM。融合蛋白樣品係與VEGF165(8奈克/毫升)混合,且該混合物係在室溫下隔夜培養。然後該些孔係以200微升之1倍PBS清洗。
添加100微升之VEGF165/樣品混合物至各孔中,且該盤係在37℃下與5%之CO2培養72小時。在培養後,添加10微升之MTS偵測試劑(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲氧苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑)+吩嗪硫酸甲酯在蒸餾之PBS中)至各孔中,並將該盤於37℃下培養2.5小時。
各孔之OD,係使用ELISA盤讀取器在吸收波長490奈米下測定。吸光值係對融合蛋白或對照組之蛋白濃度作圖,且測定細胞增生被抑制50%時的濃度(IC50)。
對經測試之本發明融合蛋白而言,細胞增生之抑制(IC50)係測得於0.039nM及0.103nM之間。增生檢定之結果係顯示於表3中,且其亦在第5圖中說明。正對照組2及融合蛋白1對於抑制VEGF依賴性之HUVEC增生皆呈現類似的活性。
在融合蛋白存在下,評估過度表現αvβ3之CHO細胞至血纖維蛋白原(fibrinogen)之黏附、及表現α5β1之K562細胞至纖維黏連蛋白之黏附。
96-孔Immulon-2微量滴定板(Costar,紐約州康寧市(Corning,NY))係以含有50至500nM之基質的100微升磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS:10mM磷酸鹽緩衝液,0.15M NaCl、pH 7.4)塗佈,且在4℃下隔夜培養。基質及其塗佈濃度係血纖維蛋白原(Fg)200微克/毫升、及纖維黏連蛋白(Fn)25微克/毫升。非專一性蛋白質之結合位點係經由在每個孔中加入200微升之熱變性1%牛血清白蛋白(BSA)(Calbiochem)在室溫下共同培養1.5小時來阻塞。去除熱變性BSA且以200微升之PBS清洗每個孔兩次。
表現整合蛋白αvβ3之CHO細胞(CHO-αvβ3)係與專利申請號62/US2015/46322來自相同來源,且保存於DMEM中。人類紅血球性白血病K562係如專利申請號62/US2015/46322所寫般培養,其購自ATCC且培養於含有5%胎牛血清(FCS)之洛斯維-帕克紀念研究所(Roswell Park Memorial Institute,RPMI)-1640培養基中。在含有1mM EDTA之PBS緩衝液中清洗收穫之K562,並在含有1mM MgSO4、2mM CaCl2、及500μM MnCl2之台氏緩衝液(Tyrode’s buffer)(150mM NaCl、5mM KCl、及10mM Hepes,pH 7.35)中再懸浮。稀釋細胞(CHO及K562)至3x105個細胞/毫升,且100微升之細胞係用於實驗。添加Rho及其突變體至經培養細胞且在37℃、5% CO2下培養15分鐘。Rho及其變異體係在0.001至500μM下作為抑制劑使用。然後將經處理細胞添加進塗覆盤並在37℃、5% CO2下反應1小時。之後去除培養溶液,且經由以200微升之PBS清洗兩次來移除未黏附細胞。經由結晶紫染色法(crystal violet staining)計量黏附細胞。簡言之,以100微升之10%福馬林固定孔10分鐘並乾燥。然後添加50微升之0.05%結晶紫進入孔中,在室溫下20分鐘。以200微升之蒸餾水清洗每個孔四次並乾燥。染色係藉由添加150微升之染色溶液(50%酒精及0.1%
乙酸)達成。吸光度之結果係在600奈米吸收光譜下讀取,且該讀取值係對應黏附細胞之數量。
抑制細胞黏附之計算係根據以下方程式進行。
在上述方程式中,TA意指「測試物(test article)」;NC意指「負對照組(negative control)」;以及PC意指「正對照組(positive control)」。
IC50係被定義為抑制50%由特定整合蛋白所調節之細胞黏附所需之去整合蛋白變異體濃度(nM)。因此,具較低之IC50的去整合蛋白變異體表示其在抑制各自之整合蛋白的細胞黏附活性中具有較好之專一性與活性效力,因此對該各自之整合蛋白有較高的結合活性(或選擇性)。IC50之結果總結於下表4中。第6圖提供示意圖,顯示藉由融合蛋白1抑制CHO-αvβ3細胞黏附。
將HUVEC(1.5x104個細胞/孔)置於96-孔經基質膠(Matrigel)塗佈之盤中。在5% CO2、37℃的環境下添加六種用量之融合蛋白1(0.1μM、0.3μM、1μM、3μM、10μM、及30μM)及媒介物進各孔之生長基中。於18小時培養期間後,藉由顯微照相評估內皮細胞管(endothelial cell tube)之型態,其類似於類微血管網。自各照片測量對總微
管長度之干擾(抗血管新生),並相對於媒介物對照組測定。然後測定對微管形成之最低抑制濃度(MIC≧30%),並用以評估抗血管新生之程度。在所有實驗中使用蘇拉明(Suramin)作為抗血管新生之正對照組(正對照組5)。
經測試之融合蛋白1的微管形成之抑制(IC50)係測定為小於0.1μM,融合蛋白1顯示較正對照組4為高之活性效力。微管形成檢定之結果係顯示於表5中。第7A-G圖提供示意圖,顯示當融合蛋白1分別以0.1μM、0.3μM、1μM、3μM、10μM、及30μM之用量添加時,融合蛋白1對微管形成之抑制效果。
本發明融合蛋白係在血管滲透性之體內模式中測試,以測定其在預防血管滲漏中之功效。在此模式中,將VEGF以玻璃體內注射之方式,注射至兔眼之玻璃體中,以誘導不受控之視網膜滲漏。阿普西柏(采視明,雷傑納隆)係一由人類VEGFR1及VEGFR2之部分融合至人類IgG1之Fc部分所組成的重組融合蛋白、及貝伐珠(bevacizumab)(癌思停(Avastin®),羅氏(Roche))係藉由抑制VEGF-A來阻斷血管生成之重組人源化單株抗體;係分別納入作為對照組2及6。
在一實施態樣中,醫藥組合物含有20,000微克/毫升之融合蛋白1,該融合蛋白1係在包含25mM組胺酸緩衝液、20mM NaCl、6%(重量/體積)蔗糖、0.03%(重量/體積)聚山梨醇酯且pH 6.0的調配物緩衝液中。
使用活寧液(isoflurane)(3至5%)麻醉荷蘭黑帶兔,且以眼用必達淨(Betadine)溶液處理其眼睛。然後以滅菌生理食鹽水清洗兔眼,施用鹽酸利多卡因(lidocaine hydrochloride)(2%注射液)或丙對卡因(proparacaine)至眼睛表面。
第1天,荷蘭黑帶兔係使用BD 300微升胰島素注射器(31線規x 5/16英吋),經玻璃體內注射預決定劑量之本發明融合蛋白、媒介物(負)對照組、或參考(正)對照組。該注射針係穿過眼之背顳象限(dorsotemporal quadrant),大約在緣後3至4毫米及上直肌側3至4毫米,遞送50微升之液體。第3天,藉由對相同眼睛注射外源的VEGF165來誘導血管滲漏。
在注射VEGF 3天後,對所有給藥之組別進行螢光血管攝影(fluorescein angiogram,FA),並使用從0(正常)至4(嚴重)之量尺評估其滲漏及曲折度。
在以融合蛋白給藥之前、VEGF誘導之前及評估之前,使用德萊茲(Draize)評分系統來評分眼部刺激之徵象。根據德萊茲分析,在開始給藥之前所有兔子的眼睛皆係正常的。在玻璃體內給藥後,在所有給藥組別中皆觀察到短暫之最小的眼部發炎徵象,其係玻璃體內之注射所造成。在研究過程中並未發現藥物引起之反應。
媒介物對照組相關之FA具有最高之視網膜血管分佈滲漏及曲折度相關的平均分數(2.58)。二參考正對照組2及6具有0及0.25之平
均分數,顯示視網膜血管分佈滲漏及曲折度顯著降低。經測試之本發明融合蛋白具有0.417之平均分數,顯示其呈現可相比於正對照組之降低VEGF所誘導視網膜滲漏及曲折度的效果。體內檢定之結果係顯示於表6中。第8A-D圖提供代表性的FA,顯示經融合蛋白1及正對照組在荷蘭黑帶兔中抑制VEGF誘導之滲漏。
本發明融合蛋白係以多種劑量在視網膜血管新生之體內模式中測試,以測定其在預防血管滲漏中之劑量反應功效。在此模式中,將人類VEGF165以玻璃體內注射之方式,注射至兔眼之玻璃體中,以誘導視網膜滲漏。
第1天,荷蘭黑帶兔係經玻璃體內注射多種濃度之根據本發明實施態樣的融合蛋白1、媒介物(負)對照組、或參考(正)對照組。第3天,藉由對相同眼睛注射外源的VEGF165來誘導血管滲漏。
經VEGF誘導3天後(第6天),對所有給藥之組別進行FA,並使用從0(正常)至4(嚴重)之量尺評估其滲漏及曲折度。
在以融合蛋白給藥之前、VEGF誘導之前及評估之前,使用德萊茲評分系統來評分眼部刺激之徵象。根據德萊茲分析,在開始給藥之前所有兔子的眼睛皆係正常的。在玻璃體內給藥後,在所有給藥組別中皆觀察到短暫之最小的眼部發炎徵象,其係玻璃體內之注射所造成。在研究過程中並未發現藥物相關結果。
對第一次的外源的VEGF注射而言,媒介物對照組相關之FA具有最高之視網膜血管分佈滲漏及曲折度相關的平均分數(3.4)。二參考正對照組具有0之平均分數,顯示視網膜血管分佈滲漏及曲折度顯著降低。經測試之本發明融合蛋白(融合蛋白1)在100微克、500微克、及1000微克之劑量下分別具有0.60、0.40、及0.33之分數,顯示其呈現可相比於正對照組之降低VEGF所誘導視網膜滲漏及曲折度的效果。
體內檢定之劑量反應結果係顯示於表7中。
棕色挪威大鼠之眼睛係以露睫體痺露眼藥水(Cyclogyl,1%)溶液放大,並採取避光。在放大後,使用K他命及甲苯噻嗪(xylazine)之混合物來麻醉大鼠。在第1天,各眼之視網膜利用532奈米之雷射產生三處燒傷。
第3天以K他命及甲苯噻嗪之混合物麻醉動物,放大其眼,並以漢彌爾頓注射器(Hamilton syringe)配合33線規針頭,經玻璃體內注射預決定劑量之5微升根據本發明實施態樣的融合蛋白1、媒介物(負對照組)、或正對照組2(參考)至動物之兩眼中。
眼底影像(fundus image)係在引入傷口前、燒傷後、及在第22天使用Micron III小動物眼底鏡(Phoenix Research)拍攝以確認成功傷口。第22天,動物接受1微升/克體重之10%螢光素鈉的腹腔內(IP)注射,以評估燒傷之新生血管。自螢光血管攝影(fluorescein angiograms)測定傷口大小,並交叉比對給藥組別,如第9A-C圖中所示,其中第9A圖顯示媒介物之示意圖、第9B圖顯示正對照組2之示意圖、及第9C圖顯示融合蛋白1之示意圖。在第9A-C圖中的箭頭(▼)表示雷射傷口的所在位置。
在建立於猴子中的雷射誘導CNV模式中測試融合蛋白。在各眼之黃斑部周圍使用532奈米二極體雷射光凝來產生6至9處燒傷,並在同一天經玻璃體內注射0.5-4毫克之本發明融合蛋白。
20天後,以靜脈注射2.5%可溶性戊巴比妥(pentobarbitone,1毫升/公斤)來鎮靜動物。固定眼皮使眼睛保持打開,並使用眼底相機拍攝彩色照片。
然後注射螢光染劑(20%之螢光素鈉;0.05毫升/公斤)至
下肢靜脈中。在注射染劑後數個時間點拍攝照片,包括動脈階段、動靜脈階段早期、及數個動靜脈階段晚期,以監測與CNV傷口相關之螢光素滲漏。
將人類神經膠母細胞瘤細胞株U87-MG(2.5x105個細胞/2微升,螢光素酶細胞(Luciferase cell))植入BALB/c裸鼠中,以建立原位異種移植模式(orthotopic xenograft model)。
為了評估本發明融合蛋白對腫瘤生長之抑制效果,腫瘤細胞係移植入裸鼠內,且多種濃度之根據本發明實施態樣的融合蛋白(範圍從3至30毫克/公斤)係每週二次經靜脈內投予至小鼠。每週測量腫瘤之生長及動物存活率,達8週。
使用重20±2克之雄性C57BL/6小鼠來誘導肺纖維化,及融合蛋白對抑制肺纖維化的效果。使用活寧液麻醉動物,然後在第1天經氣管內投予單一劑量1.5IU/公斤(溶於25微升之生理食鹽水中)之博萊黴素。已知該劑量之博萊黴素可重複地產生肺部纖維化,且可能誘導10-20%之死亡率。
每天藉由口服灌食10-50毫克/公斤之尼達尼布(Nintedanib),作為正對照組。投予體積為10毫升/公斤體重。融合蛋白媒介物係藉由靜脈注射投予至動物,作為負對照組。未處理之對照組係用於觀測投予博萊黴素後肺部之病理變化。自第1天開始至第21天,一天一次靜脈內投予多種劑量之融合蛋白1及媒介物。每天進行包括體重的臨床觀察。動物在第22天犧牲。蒐集支氣管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid),以調查細胞數及TGF-β1。
為了評估本發明融合蛋白對纖維化形成之抑制效果,移除肺組織並在緩衝液中均質化,以測量相較於標準曲線的羥脯胺酸(hydroxyproline)變化。進行其他組織病理學實驗,以收集纖維化及發炎專一性生物標記的表現。
雖然已詳述本發明細節,且參照其特定實施態樣,然而對本技術領域中具通常知識者而言,在不悖離其精神與範圍下可在其中作多種變化及修飾。
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<213> 蛇
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<221> VARIANT
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<223> 馬來亞蝮素突變體
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<223> 馬來亞蝮素突變體
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<223> 鉅鱗蝰素
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<223> 台灣龜殼花素
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<223> 麗紋龜殼花蛇素
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<223> 赤尾鮐素
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<223> PDGFR-β胞外結構域D1-D3
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<223> 馬來亞蝮素變異體KG-WN
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<223> VEGFR1 D2/VEGFR2 D3及馬來亞蝮素變異體KG-WN的融合
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<220>
<223> VEGFR1 D2/VEGFR2 D3及馬來亞蝮素變異體KG的融合
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<223> VEGFR1 D2/VEGFR2 D3及馬來亞蝮素變異體KA的融合
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<212> PRT
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<223> 采視明及馬來亞蝮素變異體KG的融合
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<223> SEQ ID NO:16之融合蛋白的核苷酸序列
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<223> 訊息胜肽
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<223> 訊息胜肽之核苷酸序列
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<223> SEQ ID NO:18之融合蛋白的訊息胜肽
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<220>
<223> VEGFR1胞外結構域D2/VEGFR2胞外結構域D3與人類IgG1 Fc區融合
Claims (20)
- 一種融合蛋白,其係包含:一結合整合蛋白(integrin)的胜肽,其係包含去整合蛋白(disintegrin)或其結合整合蛋白的片段,其中,該結合整合蛋白的胜肽在精胺酸-甘胺酸-天冬胺酸(RGD)區域上或自RGD區域算來第15-20個胺基酸內的胺基酸殘基包含至少一突變,且該結合整合蛋白的胜肽係結合整合蛋白αvβ3及α5β1;其他結合蛋白的胜肽以結合一血管新生因子,其中該血管新生因子係包含:血管生成素(Angiopoietin,ANG)、酪胺酸蛋白激酶(Ephrin,Eph)、纖維母細胞生長因子(Fibroblast Growth Factor,FGF)、神經纖毛蛋白(Neuropilin,NRP)、血纖維蛋白溶酶原活化物(Plasminogen Activators)、尿激酶型血纖維蛋白溶酶原活化物受體(urokinase-type plasminogen activator receptor,uPAR)、血小板衍生生長因子(Platelet-Derived Growth Factor,PDGF)、腫瘤生長因子-β(Tumor Growth Factor beta,TGF-β)、血管內皮生長因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)、血管內皮鈣黏蛋白(Vascular Endothelial cadherin,VE-cadherin)、類胰島素生長因子(Insulin-like Growth Factor,IGF)、結締組織生長因子(Connective-Tissue Growth Factor,CTGF)、腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor alpha,TNF-α)、介白素-1(Interleukin 1,IL-1)、介白素-6(Interleukin 6,IL-6)、顆粒球巨噬細胞株刺激因子(Granulocyte Macrophage Colony-Stimulating Factor,GM-CSF)、及其受體;以及一可結晶區(Fc)結構域。
- 一種融合蛋白,其係包含: 一結合整合蛋白的胜肽,其係具有一選自由以下所組成之群組的胺基酸序列:SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6及SEQ ID NO:7,或一與SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7具有至少85%序列同一性之胺基酸序列,其中,該結合整合蛋白的胜肽在RGD區域上或自RGD區域算來第15-20個胺基酸內的胺基酸殘基具有至少一突變,且該結合整合蛋白的胜肽係結合整合蛋白αvβ3及α5β1;其他結合蛋白的胜肽,其係包含VEGF受體之胞外結構域;以及一Fc結構域。
- 一種融合蛋白,其係包含:一結合整合蛋白的胜肽,其係包含去整合蛋白及其結合整合蛋白的片段,其中,該結合整合蛋白的胜肽在RGD區域上或自RGD區域算來第15-20個胺基酸內的胺基酸殘基包含至少一突變,且該結合整合蛋白的胜肽係結合整合蛋白αvβ3及α5β1;其他結合蛋白的胜肽,其係包含VEGF受體之胞外結構域;以及一Fc結構域。
- 如請求項1-3中任一項所述之融合蛋白,其自C-端至N-端係包含該結合整合蛋白的胜肽、該Fc結構域、及該其他結合蛋白的胜肽。
- 如請求項1-3中任一項所述之融合蛋白,其自N-端至C-端係包含該結合整合蛋白的胜肽、該Fc結構域、及該其他結合蛋白的胜肽。
- 如請求項1-3中任一項所述之融合蛋白,其更包含一GS或G9連接子,該連接子係位於該結合整合蛋白的胜肽或該其他結合蛋白的胜肽與該Fc結構域之間。
- 如請求項2或3所述之融合蛋白,其中該VEGF受體之胞外結構域係包含一VEGF受體之類免疫球蛋白結構域D1至D7。
- 如請求項2或3所述之融合蛋白,其中該VEGF受體之胞外結構域係包含(i)一VEGFR1之類免疫球蛋白結構域D2、及一VEGFR2之類免疫球蛋白結構域D3;(ii)SED ID NO:10之胺基酸序列;或(iii)一與SED ID NO:10具有至少90%同一性的胺基酸序列。
- 一種融合蛋白,其係包含:一結合整合蛋白的胜肽,其係選自由以下所組成之群組:一具有至少一在RGD區域上或自RGD區域算來第15-20個胺基酸內的胺基酸殘基的突變之SEQ ID NO:1胺基酸序列、及一SEQ ID NO:2胺基酸序列,其中,該結合整合蛋白的胜肽係結合整合蛋白αvβ3及α5β1;一人類或人源化之恆定亞區(constant sub-region),其係包含免疫球蛋白的一CH2結構域、及一CH3結構域;其他結合蛋白的胜肽,其具有一VEGFR1之類免疫球蛋白結構域D2、及一VEGFR2之類免疫球蛋白結構域D3。
- 如請求項1-3及9中任一項所述之融合蛋白,其中該結合整合蛋白的胜肽與SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7具有至少85%之序列同一性。
- 如請求項10所述之融合蛋白,其中該結合整合蛋白的胜肽與SEQ ID NO:2具有至少85%之序列同一性。
- 如請求項1-3及9中任一項所述之融合蛋白,其更包含一連接子序列(linker sequence),該連接子序列係位於該結合整合蛋白的胜肽與該其他結合蛋白的胜肽之間。
- 如請求項1-3及9中任一項所述之融合蛋白,其更包含一訊息胜肽序列(signal peptide sequence),該訊息胜肽序列係在該其他結合蛋白的胜肽的上游。
- 一種核酸,其係編碼該如請求項1-3及9中任一項之融合蛋白。
- 一種如請求項1-3及9中任一項之融合蛋白的二聚體。
- 一種載體,其係包含一編碼如請求項1-3及9中任一項之融合蛋白的核苷酸序列。
- 一種用於製備一融合蛋白的方法,其係包含在製備該融合蛋白之條件下培養一宿主細胞,其中該宿主細胞係包含一編碼如請求項1-3及9中任一項之融合蛋白的核酸,以及重獲該宿主細胞所製備之融合蛋白。
- 一種組合物,其係包含如請求項1-3及9中任一項之融合蛋白、及一醫藥上可接受之佐劑、載劑、或賦形劑。
- 一種使用如請求項1-3及9中任一項之融合蛋白於製備治療或預防一血管新生性疾病之藥劑的用途。
- 如請求項19所述之用途,其中該血管新生性疾病係包含:類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis)、炎症性關節炎(inflammatory arthritis)、骨關節炎(osteoarthritis)、眼部及系統性癌症、與腫瘤相關之轉移及入侵、系統性纖維化疾病、非酒精性脂肪肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH)或肝纖維化、糖尿病腎病變及/或腎纖維化、皮膚纖維化(dermal fibrosis)或蟹足腫、傷口癒合、心肌纖維化(cardio-fibrosis)、缺血性中風(ischemia induced stroke)、具有新生血管(neovascularization)或缺血之特徵的眼部疾病、眼色素層炎(uveitis)、色素性視網膜炎(retinitis pigmentosa)、老年性黃斑退化(age-related macular degeneration,AMD)、視網膜病變、糖尿病黃斑水腫(diabetic macular edema(DME))、 視網膜靜脈阻塞、多發息肉性脈絡膜血管病變(polypoidal choroidal vasculopathy(PCV))、以及症狀性玻璃體黃斑粘連(symptomatic vitreomacular adhesion)。
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Families Citing this family (18)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
MX2017002323A (es) * | 2014-08-22 | 2017-08-02 | Univ Nat Cheng Kung | Variantes de desintegrina y usos farmaceuticos de las mismas. |
AU2016229053B2 (en) * | 2015-03-11 | 2018-07-12 | Ap Biosciences, Inc. | Fusion protein comprising a ligand binding domain of VEGF and PDGF |
EP3313426B1 (en) | 2015-06-28 | 2020-04-29 | Allgenesis Biotherapeutics Inc. | Fusion proteins for inhibiting angiogenesis |
WO2019004799A1 (ko) * | 2017-06-30 | 2019-01-03 | 한국과학기술원 | Vegf-grab 단백질과 약물의 결합체 및 이의 용도 |
AU2017426938B2 (en) * | 2017-08-09 | 2020-08-27 | Dcb-Usa Llc | Disintegrin variants and uses thereof |
AU2018347521A1 (en) | 2017-10-12 | 2020-05-07 | Immunowake Inc. | VEGFR-antibody light chain fusion protein |
MX2020003945A (es) * | 2017-10-18 | 2020-11-09 | Regenxbio Inc | Tratamiento de enfermedades oculares y cancer de colon metastasico con vegf-trap humano modificado post-traduccionalmente . |
CN111741761B (zh) * | 2018-01-26 | 2023-04-18 | 加利福尼亚大学董事会 | 用于使用抗vegf剂治疗血管生成病症的方法和组合物 |
US11518819B2 (en) | 2018-08-17 | 2022-12-06 | Trican Biotechnology Co., Ltd | Anti-angiogenesis fusion protein and uses thereof |
WO2020114355A1 (en) * | 2018-12-03 | 2020-06-11 | Immuneonco Biopharmaceuticals (Shanghai) Co., Ltd | Recombinant protein targeting pd-l1 and vegf |
CN112342228B (zh) * | 2019-08-09 | 2023-07-21 | 上海朗昇生物科技有限公司 | 表达抗vegf融合蛋白的aav病毒载体及其应用 |
CN112552410A (zh) * | 2019-09-26 | 2021-03-26 | 三生国健药业(上海)股份有限公司 | 一种抗体融合蛋白及其制法和在抗肿瘤中的应用 |
JP2023502501A (ja) | 2019-11-25 | 2023-01-24 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア | 眼内血管新生のための長時間作用型vegf阻害剤 |
CN111084879A (zh) * | 2020-02-14 | 2020-05-01 | 中国人民解放军第四军医大学 | 白介素18在抑制创面血管新生中的应用 |
CN115040695B (zh) * | 2021-03-09 | 2023-10-13 | 南开大学 | 一种基于VE-cad-Fc/N-cad-Fc的融合蛋白活性界面的应用 |
US11723955B1 (en) * | 2022-05-13 | 2023-08-15 | Allgenesis Biotherapeutics Inc. | VEGFR fusion protein pharmaceutical composition |
WO2024060167A1 (zh) * | 2022-09-23 | 2024-03-28 | 庄伟哲 | 靶向整合素αIIbβ3的含组织纤维溶酶原活化剂或其变异体的融合蛋白质及其应用 |
CN116239704B (zh) * | 2023-05-09 | 2023-07-14 | 北京青云智创科技有限公司 | 一种治疗新生血管性眼病的多肽及其制剂 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20030064053A1 (en) * | 2001-08-31 | 2003-04-03 | Shengjiang Liu | Multivalent protein conjugate with multiple ligand-binding domains of receptors |
US20060177443A1 (en) * | 2000-02-25 | 2006-08-10 | Immunex Corporation | Integrin antagonists |
CN101677537A (zh) * | 2006-12-26 | 2010-03-24 | 国立台湾大学 | 解联蛋白变体及其药学用途 |
Family Cites Families (19)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7220724B2 (en) | 1993-10-22 | 2007-05-22 | University Of Southern California | Contortrostatin CN and methods for its use in preventing metastasis and other conditions |
US20030027751A1 (en) * | 2001-04-10 | 2003-02-06 | Genvec, Inc. | VEGF fusion proteins |
WO2005121176A1 (fr) | 2004-06-08 | 2005-12-22 | Chengdu Kanghong Biotechnologies Co. Ltd | Proteine chimerique inhibitrice d'angiogenese et utilisation associee |
US7659374B2 (en) | 2004-08-16 | 2010-02-09 | Medimmune, Llc | Eph receptor Fc variants with enhanced antibody dependent cell-mediated cytotoxicity activity |
EP1812030A4 (en) * | 2004-10-14 | 2009-01-14 | Sopherion Therapeutics Inc | ANTI-ANGIOGENIC PEPTIDES AND METHODS OF USE THEREOF |
ES2325344B1 (es) * | 2004-11-02 | 2010-06-09 | Univ Madrid Autonoma | Inhibidores de angiogenesis multifuncionales y multivalentes. |
EP1917024A2 (en) * | 2005-08-12 | 2008-05-07 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of treating diseases with a vegf antagonist |
MX2008014910A (es) | 2006-05-24 | 2009-01-23 | Bayer Schering Pharma Ag | Anticuerpos bloqueantes de la funcion de la integrina ?5?1 humanos y humanizados de gran afinidad con inmunogenicidad reducida. |
US8454960B2 (en) * | 2008-01-03 | 2013-06-04 | The Scripps Research Institute | Multispecific antibody targeting and multivalency through modular recognition domains |
EP2456454A4 (en) * | 2009-07-20 | 2013-03-20 | Univ Nat Cheng Kung | FOR AV-3-INTEGRIN SELECTIVE POLYPEPTIDE AND PHARMACEUTICAL USES THEREOF ASSOCIATED WITH A HUMAN SERUM ALUMINUM (HSA) VARIATION |
US9044436B2 (en) * | 2009-12-23 | 2015-06-02 | National Cheng Kung University | Compositions and methods for the treatment of angiogenesis-related eye diseases |
KR101397088B1 (ko) | 2011-06-10 | 2014-05-19 | 강원대학교산학협력단 | 암세포 증식 억제와 혈관신생 억제를 위한 융합 단백질 및 이를 포함한 항암 조성물 |
CN104159926B (zh) | 2011-12-01 | 2019-02-01 | 圆祥生命科技有限公司 | 补体和vegf途径的蛋白质抑制剂及其使用方法 |
ES2933558T3 (es) * | 2013-03-13 | 2023-02-10 | Genzyme Corp | Proteínas de fusión que comprenden porciones de unión a PDGF y VEGF y métodos de uso de las mismas |
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Patent Citations (3)
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US20060177443A1 (en) * | 2000-02-25 | 2006-08-10 | Immunex Corporation | Integrin antagonists |
US20030064053A1 (en) * | 2001-08-31 | 2003-04-03 | Shengjiang Liu | Multivalent protein conjugate with multiple ligand-binding domains of receptors |
CN101677537A (zh) * | 2006-12-26 | 2010-03-24 | 国立台湾大学 | 解联蛋白变体及其药学用途 |
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