CN108430489A - 用于抑制血管新生的融合蛋白 - Google Patents
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Abstract
本发明是涉及一种抑制血管新生(angiogenesis)的生物制剂(biologic)。特别是,本发明是涉及融合蛋白,该融合蛋白可抑制整合蛋白活化路径(integrin activated pathway)及一其他的血管新生因子活化路径(angiogenic factor‑activated pathway);且涉及这些融合蛋白的组合物;以及其制备及使用方法。
Description
技术领域
本发明是涉及一种抑制血管新生(angiogenesis)的生物制剂(biologic)。特别是,本发明是涉及融合蛋白,该融合蛋白可抑制血管新生因子活化路径(angiogenicfactor-activated pathway);且涉及这些融合蛋白的组合物;以及其制备及使用方法。
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背景技术
血管新生是自既存血管形成新血管的过程。其在数种生理过程中都扮演重要的角色,该生理过程包括胚胎发育以及组织及伤口修复(Folkman J等人,Angiogenicfactors.Science 1987;235:442-7)。血管新生的生理步骤已被清楚了解,包含胞外基质的分解、内皮细胞的增生、迁移、及重组成管道通路、壁细胞的募集及分化、以及胞外基质的产生(Carmeliet P等人,Nature.2011;473:298–307)。病理性的血管新生可发生在肿瘤形成、眼部病症(例如,糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy)、糖尿病黄斑水肿(diabeticmacular edema)或糖尿病黄斑退化(diabetic macular degeneration))、关节炎、牛皮癣、纤维化疾病、发炎疾病、及动脉硬化(Polverini PJ.Crit Rev Oral Biol Med.1995;6(3):230-47)。
病理性血管新生更加的多样且混乱,通常呈现弯曲的血管组织、不同大小的低氧缝隙(hypoxic void),不均匀且不完整的血管壁及内壁(lining)、及无效的灌流(JainRK.,Nat Med.2003;9(6):685–93)。疾病中的新血管形成的这些特殊表征,使得靶向血管新生的治疗具有挑战性。虽然抗VEGF疗法,例如:乐舒晴采视明或药品仿单标示外使用(off-label use)的癌思停一般可稳定或改善视觉功能,在以抗VEGF治疗两年内,所有经治疗的眼睛中大约半数会产生次视网膜结痂(纤维化),这被视为愈后不成功的其中一个原因(Daniel E等人,Ophthalmology.2014;121(3):656-66)。在次视网膜纤维化中一些重要因子很可能是参与在纤维化过程(细胞增生、迁移及ECM重塑)中的生长因子及基质细胞蛋白(matricellular protein)。尽管其具有复杂性,随着我们对血管新生过程的知识增加,抑制血管新生药物的发展依然是颇受关注的区域。
最近,在新生血管(neovascularization)过程中的许多关键因子已被确认,其中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)家族扮演至为关键的角色。人类VEGF家族共有6个成员:VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、及胎盘生长因子(placental growth factor,PlGF)。除此,VEGF-A、VEGF-B及PlGF的多种同功体通过选择性RNA剪接来产生(Sullivan等人,MAbs,2002,2(2):165-75)。VEGF-A是参与血管新生的主要因子;其与VEGFR-1及VEGFR-2两者结合。通过阻碍VEGF-A讯息传递来抑制血管新生的策略已建立成功的治疗方式,该治疗方式是用于治疗特定的癌症,视网膜新生血管及缺血性疾病。(Major等人,J Pharmacol Exp Ther.,1997,283(1):402-10;Willet等人,Nat.Med.2004,10:145-7;Papadopoulos等人,Angiogenesis,2012,15(2):171-85;Aiello等人,PNAS,1995,92:10457-61)。
其他生长因子、细胞激素(cytokine)、趋化介素(chemokine)包括:血小板衍生生长因子(Platelet-Derived Growth Factor,PDGF)、转变生长因子-β(TransformingGrowth Factor-β,TGF-β)、表皮生长因子(Epidermal Growth Factor,EGF)、神经生长因子(Nerve Growth Factor,NGF)、缺氧诱导因子(Hypoxia-Induced Factor,HIF)、结缔组织生长因子(Connective-Tissue Growth Factor,CTGF)、颗粒球巨噬细胞株刺激因子(Granulocyte–Macrophage Colony-Stimulating Factor,GM-CSF)、类胰岛素生长因子(Insulin-Like Growth Factor,IGF)、肝细胞生长因子/分散因子(Hepatocyte GrowthFactors/Scatter Factor,HGF/SF)、肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor alpha,TNF-α)、介白素-1(Interleukin 1,IL-1)、介白素-6(IL-6)、介白素-8(IL-8)、介白素-17(IL-17)、介白素-18(IL-18)、介白素-20(IL-20)、介白素-23(IL-23)、化学吸引因子(例如C-C趋化因子配体(CCL28、CCL21)及C-X-C趋化因子配体(CXCL1、CXCL5))、巨噬细胞迁移抑制因子(Macrophage migration Inhibitory Factor,MIF)、及免疫细胞表面蛋白(例如分化簇(Clusters of Differentiation,CD))。这些因子在血管新生相关的疾病中已被报告会过度表现,并扮演关键性的角色(Elshabrawy等人,Angiogenesis(2015)18:433–448;Brian P.Eliceiri,Circ Res.2001Dec7;89(12):1104-10)。靶向这些因子以减少其下游路径的活化可降低血管新生相关的疾病。
整合蛋白是细胞表面受体的一个家族,其也被发现在内皮细胞表面过度表现,并被认为在血管新生期间会促进新形成的血管的生长及存活。整合蛋白为异二聚体型细胞表面受体,其与胞外基质蛋白交互作用,并对许多生物学的过程而言至关重要。在许多细胞型中整合蛋白的表现是参与在肿瘤发展,且其与生长因子受体交互沟通(crosstalk)的能力使其成为引人注目的治疗标的(Staunton DE等人,Adv Immunol.2006;91:111-57;Avraamides,C.J.等人,Nat Rev Cancer 2008;8:604-617)。特别的是整合蛋白αvβ3在肿瘤细胞及血管新生的内皮细胞两者中都过量表现(upregulate),且其对肿瘤细胞迁移、血管新生、及细胞讯息失调而言是重要的。因此,整合蛋白αvβ3的拮抗剂的抑制血管新生及抗肿瘤性质被广泛地研究(Desgrosellier JS等人,Nat Rev Cancer.2010 10:9-22)。
去整合蛋白(disintegrin)是于蝮蛇家族的蛇毒中发现的胜肽,且其主要抑制β1-及β3-相关的整合蛋白。一开始去整合蛋白被辨识为整合蛋白αIIbβ3的抑制剂,接着被发现可与其他整合蛋白以高亲合力结合,并阻断整合蛋白与含RGD的蛋白的交互作用。去整合蛋白含有47至84个胺基酸、具有约4-7条双硫键、并带有相同的RGD区域(motif)(McLane MA等人,Proc Soc Exp Biol Med 1998 219:109-119;Niewiarowski S等人,Semin Hematol1994 31:289-300;Calvete JJ.,Curr Pharm Des.2005 11:829-835;Blobel CP等人,CurrOpin Cell Biol 1992 4:760-765)。去整合蛋白家族中的保守性RGD序列,在辨认整合蛋白中扮演最重要的角色。已发现去整合蛋白与24种整合蛋白中的8种交互作用,并抑制整合蛋白调节(integrin-mediated)的细胞黏附、迁移、及血管新生(McLane MA等人,FrontBiosci.2008 13:6617-6637;Swenson S等人,Curr Pharm Des.2007 13:2860-2871)。动物研究显示去整合蛋白靶向新生血管内皮及转移型肿瘤,说明其用于癌症治疗的潜力。含RGD的蛋白与整合蛋白的专一性结合,是其构型及RGD区域周围的序列两者的功能。许多研究已显示在含RGD蛋白的RGD区域两侧的残基,会影响其对整合蛋白的结合专一性及亲合力(Scarborough RM等人,J Biol Chem 1993 268:1058-1065;Rahman S等人,Biochem J1998 335:247-257)。
血管新生为一复杂的生物学过程,牵涉多种生长因子及其讯息传递受体,且靶向在讯息传递路径(signaling cascade)中的单一分子可能无法对疾病(例如癌症)中不受控的血管新生提供有效的临床治疗。因此,发展可协同结合数种关键的血管新生因子,以有效抑制血管新生及疾病进程的创新疗法的需求将不断的增加。
发明内容
本文所提供的发明公开用于专一地结合至多标靶的多胜肽,以拮抗多种血管新生因子。本发明也提供融合蛋白,其选择性的抑制整合蛋白路径及其他血管新生路径。本发明还提供组合物,其具有这些融合蛋白。本发明还提供组合物,其具有包含编码这些融合蛋白的核酸的载体。本发明还描述用于制备及使用这些融合蛋白来治疗或预防血管新生疾病、眼部疾病、自体免疫疾病、发炎性疾病、纤维化疾病、及/或癌症的方法。
根据本发明,融合蛋白包含结合整合蛋白的胜肽(integrin binding peptide)、其他结合蛋白的胜肽以靶向血管新生因子、及可结晶区(Fc)结构域,其中该结合整合蛋白的胜肽选自由以下所组成的群组:去整合蛋白(disintegrin)、抗整合蛋白αvβx(anti-integrinαvβx)抗体、抗整合蛋白α5β1抗体、靶向整合蛋白αvβx或α5β1的纤维黏连蛋白(fibronectin)以及其结合整合蛋白的片段,其中x为1、3、5、6或8。在一些实施例中,血管新生因子包含血管生成素(Angiopoietin,ANG)、酪胺酸蛋白激酶(Ephrin,Eph)、纤维母细胞生长因子(Fibroblast Growth Factor,FGF)、神经纤毛蛋白(Neuropilin,NRP)、血纤维蛋白溶酶原活化物(Plasminogen Activator)、血小板衍生生长因子(PDGF)、肿瘤生长因子-β(TGF-β)、血管内皮生长因子(VEGF)、血管内皮钙黏蛋白(Vascular Endothelialcadherin,VE-cadherin)、表皮生长因子(EGF)、神经生长因子(NGF)、结缔组织生长因子(CTGF)、颗粒球巨噬细胞株刺激因子(GM-CSF)、类胰岛素生长因子(IGF)、肝细胞生长因子/分散因子(HGF/SF)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、介白素-1(IL-1)、介白素-6(IL-6)、介白素-8(IL-8)、介白素-17(IL-17)、介白素-18(IL-18)、介白素-20(IL-20)、介白素-23(IL-23)、化学吸引因子(例如C-C趋化因子配体(CCL28、CCL21)、C-X-C趋化因子配体(CXCL1、CXCL5))、巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)、免疫细胞表面蛋白(例如分化簇(CD))、及其受体。
根据一方面,本发明提供融合蛋白,该融合蛋白包含结合整合蛋白的胜肽、其他结合蛋白的胜肽、及Fc结构域,其中该结合整合蛋白的胜肽具有一选自由以下所组成的群组的胺基酸序列:SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQID NO:6及SEQ ID NO:7,或一与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6及SEQ ID NO:7具有至少85%序列同一性的胺基酸序列;该其他结合蛋白的胜肽包含VEGF受体的胞外结构域(extracellular domain);其中该结合整合蛋白的胜肽在RGD区域上或相邻处具有至少一突变。
根据另一方面,本发明提供融合蛋白,该融合蛋白包含结合整合蛋白的胜肽、其他结合蛋白的胜肽、及Fc结构域,其中该结合整合蛋白的胜肽包含去整合蛋白及其结合整合蛋白的片段;该其他结合蛋白的胜肽包含VEGF受体的胞外结构域;其中该结合整合蛋白的胜肽在RGD区域上或相邻处具有至少一突变。在一些实施例中,该融合蛋白自C-端至N-端包含结合整合蛋白的胜肽、Fc结构域、及其他结合蛋白的胜肽。在一些实施例中,该融合蛋白自N-端至C-端包含结合整合蛋白的胜肽、Fc结构域、及其他结合蛋白的胜肽。在融合蛋白的另一实施例中,结合整合蛋白的胜肽与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6及SEQ ID NO:7具有至少85%的序列同一性。
根据其他实施例,本发明也提供融合蛋白,该融合蛋白包含结合整合蛋白的胜肽、人类或人源化的恒定亚区(constant sub-region)、及其他结合蛋白的胜肽,其中该结合整合蛋白的胜肽包括在RGD区域上或相邻处具有至少一突变的SEQ ID NO:1胺基酸序列、与SEQ ID NO:1具有至少85%序列同一性的胺基酸序列、或SEQ ID NO:2胺基酸序列;该恒定亚区包含免疫球蛋白的CH2结构域及CH3结构域;该其他结合蛋白的胜肽具有VEGFR1的类免疫球蛋白(Ig-like)结构域D2、及VEGFR2的类免疫球蛋白结构域D3。在融合蛋白的另一实施例中,结合整合蛋白的胜肽与SEQ ID NO:2具有至少85%序列同一性。
根据一方面,本发明提供编码公开于本文的本发明融合蛋白的核酸序列。
根据另一方面,本发明提供公开于本文的本发明融合蛋白的二聚体。
根据另一方面,本发明提供制备本发明融合蛋白的方法,其包含:在制备该融合蛋白的条件下培养宿主细胞,其中该宿主细胞被转染(transfected)包含本发明胺基酸序列的载体,以及重获该宿主细胞所制备的融合蛋白。
根据另一方面,本发明提供一种治疗或预防血管新生疾病的方法,其包含:对一有需要的个体投予一有效量的融合蛋白。在一些实施例中,该血管新生疾病包含:类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)、炎症性关节炎(inflammatory arthritis)、骨关节炎(osteoarthritis)、眼部及系统性癌症、与肿瘤相关的转移及入侵、系统性纤维化疾病(其包括:原发性肺纤维化(idiopathic lung fibrosis,IPF)、非酒精性脂肪肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH)或肝纤维化、糖尿病肾病变及/或肾纤维化、皮肤纤维化(dermal fibrosis)或蟹足肿、伤口愈合、心肌纤维化(cardio-fibrosis)、及缺血性中风(ischemia induced stroke))、具有新生血管或缺血的特征的眼部疾病(例如,脉络膜新生血管(choroidal neovascularization))、眼色素层炎(uveitis)、色素性视网膜炎(retinitis pigmentosa)、老年性黄斑退化(age-related macular degeneration,AMD)、糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy)及糖尿病黄斑水肿(diabetic macularedema,DME)、视网膜中央静脉阻塞(central retinal vein occlusion,CRVO)及视网膜分支静脉阻塞(branch retinal vein occlusion,BRVO)、人类早产儿视网膜病变(humanretinopathy of prematurity,ROP)、多发息肉性脉络膜血管病变(polypoidal choroidalvasculopathy,PCV)、症状性玻璃体黄斑粘连(symptomatic vitreomacular adhesion)、及青光眼(glaucoma)。在一些实施例中,本发明融合蛋白包含连接子序列(linkersequence),该连接子序列是位于结合整合蛋白的胜肽与其他结合蛋白的胜肽间。在一些实施例中,本发明融合蛋白包含讯息胜肽序列(signal peptide sequence),该讯息胜肽序列是在其他结合结构域的上游。
根据另一方面,本发明提供组合物,其包含本发明融合蛋白、及医药上可接受的载剂(pharmaceutically acceptable carrier)。
根据另一方面,本发明提供靶向多种血管新生因子的多胜肽,其包含:一结合整合蛋白的胜肽、其他结合蛋白的胜肽、及一Fc结构域,其中该结合整合蛋白的胜肽包含一选自由以下所组成的群组的胺基酸序列:SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6及SEQ ID NO:7,或一与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6及SEQ ID NO:7具有至少85%序列同一性的胺基酸序列;该其他结合蛋白的胜肽选自由以下所组成的群组:VEGF受体的胞外结构域、抗VEGF抗体、抗PDGF抗体、及其片段;其中该结合整合蛋白的胜肽在RGD区域上或相邻处具有至少一突变。
在一些实施例中,本发明多胜肽中的VEGF受体的胞外结构域包含VEGF受体的类免疫球蛋白结构域D1至D7。在一些实施例中,在本发明多胜肽中的VEGF受体的胞外结构域包含:(i)VEGFR1的类免疫球蛋白结构域2(D2)、及VEGFR2的类免疫球蛋白结构域3(D3);(ii)SED ID NO:10的胺基酸序列;或(iii)与SED ID NO:10具有至少90%同一性的胺基酸序列。在一些实施例中,本发明多胜肽中的PDGF受体的胞外结构域包含PDGF受体的类免疫球蛋白结构域1至5。在一些实施例中,在本发明多胜肽中的PDGF受体的胞外结构域包含:(i)PDGFRβ的类免疫球蛋白结构域1至3;(ii)SED ID NO:11的胺基酸序列;或(iii)与SED ID NO:11具有至少90%同一性的胺基酸序列。在一实施例中,本发明多胜肽还包含Gly-Ser(GS)或Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly(G9)连接子,该连接子是位于结合整合蛋白的胜肽、或VEGF受体或PDGF受体的胞外结构域与Fc结构域之间。
本说明书足以使熟习此技术领域者能够实行本发明。除了本文所示及描述外,由先前的描述,本发明的多种修饰对熟习此技术领域者而言是显而易见的,并落入本发明的保护范围内。本文所引用的所有出版品、专利、及专利申请的全文并于此处以供参考。
附图说明
例示性实施例的前述及其他目的、方面、特征及优点,将因参照下列描述及配合附图,而变得更显而易见并更易于理解。
图1为示意图,其说明根据本发明的一实施例的例示性融合蛋白的组成;
图2为示意图,其说明纯化的融合蛋白1的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析;
图3为示意图,其说明VEGF配体结合检定;
图4为示意图,其说明αvβ3竞争性结合检定;
图5为示意图,其说明VEGF诱导的HUVEC增生;
图6为示意图,其说明对于CHO-αvβ3细胞黏附的抑制;
图7A-图7G为示意图,其说明融合蛋白对微管形成(tube formation)的抑制性效果;
图8A-图8D提供一实施例,显示通过融合蛋白在荷兰黑带兔中对于VEGF所诱导的渗漏(leakage)的剂量─反应抑制;
图9A-图9C提供一实施例,显示通过融合蛋白在大鼠中降低雷射诱导的脉络膜新生血管(CNV)的伤口大小,箭头(▼)表示雷射伤口的所在位置。
具体实施方式
除非另外定义,此处所用的所有技术及科学术语为具有与本发明所属技术领域技术人员通常所了解的相同意义。
于本文中,除非内文另外明确指出,否则单数型式的“一”、“该”是包括复数型式。因此,举例而言,涉及“一结合结构域是”包括复数的结合结构域及其为熟习此项技术领域者所知的同等物。
于本文中,可交换使用术语“多胜肽”及“蛋白质”来表示长链胜肽,其具有天然蛋白质的胺基酸序列、或有一或多个突变(例如,一或多个胺基酸残基的删除(deletion)、添加(addition)、及/或取代(substitution))的胺基酸序列。
“融合蛋白”意指具有二或更多以共价连接的部分(portion)的蛋白,其中各部分为衍生自不同的蛋白。
本发明提供一融合蛋白,其包含结合整合蛋白的胜肽、其他结合蛋白的胜肽以靶向血管新生因子、及Fc结构域,其中该结合整合蛋白的胜肽选自由以下所组成的群组:去整合蛋白(参见美国专利号7,943,728及PCT申请号PCT/US 15/46322对胺基酸序列的描述,这些文献的全文并于此处以供参考)、抗整合蛋白αvβx抗体(参见美国专利号6,160,099及8,350,010对胺基酸序列的描述,这些文献的全文并于此处以供参考)、抗整合蛋白α5β1抗体、靶向整合蛋白同功体αvβx或α5β1的纤维黏连蛋白(参见美国专利公开号2015/0218251对胺基酸序列的描述,这些文献的全文并于此处以供参考)以及其结合整合蛋白的片段;其中x为1、3、5、6或8。
于本文中,术语“抗体”意指免疫球蛋白分子,其包含四条多胜肽链(二条重链及二条轻链,之间通过双硫键连接)。全长重链包括一个可变区结构域(variable regiondomain)VH以及三个恒定区结构域(constant region domain)CH1、CH2、及CH3。VH结构域在多胜肽的胺基端,且CH3结构域在羧基端。全长轻链包括一个可变区结构域VL、及一个恒定区结构域CL。抗原结合片段(antigen binding fragment,Fab)包含一条轻链、以及一条重链的CH1及可变区。Fab分子的重链不能与另一重链分子形成双硫键。Fab’片段含有一轻链及一重链,该重链含有更多在CH1及CH2结构域之间的恒定区,致使两条重链之间可以形成链间双硫键以形成双体(diabody)。一可变片段(variable fragment,Fv)区包含重链及轻链两者的可变区,但缺少恒定区。单链片段(single-chain fragment,scFv)为Fv分子,其中该重链及轻链可变区已通过挠性连接子(flexible linker)连接以形成单多胜肽链(single polypeptide chain),其形成抗原结合区(antigen-binding region)。WO88/01649、美国专利号4,946,778以及5,260,203中详细讨论单链抗体。于本文中,术语“抗体”包括具有二条全长L-链及二条全长H-链的免疫球蛋白分子、及其片段(例如,抗原结合片段(Fab)、Fv区、scFv等)。
术语“Fc结构域”意指单体或多聚体型式的分子或序列,其包含非抗原结合部分(non-antigen binding portion)的序列。Fc的原始免疫球蛋白来源较佳为源自人类,并可来自任意同功体,例如,IgG、IgA、IgM、IgE、或IgD。全长Fc由以下Ig重链区组成:CH1、CH2、及CH3,其中该CH1及CH2区一般通过挠性铰链区(hinge region)连接。
本发明提供融合蛋白,其包含结合整合蛋白的胜肽、及其他结合蛋白的胜肽,其中该结合整合蛋白的胜肽包括去整合蛋白及其结合整合蛋白的片段;该其他结合蛋白的胜肽包含VEGF受体的胞外结构域及Fc结构域;其中该结合整合蛋白的胜肽包含至少一在RGD区域上或相邻处的突变。根据本发明的实施例,去整合蛋白及其结合整合蛋白的片段具有选自由以下所组成的群组的胺基酸序列:SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6及SEQ ID NO:7,或一与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6及SEQ ID NO:7具有至少85%序列同一性的胺基酸序列。
于本文中,“去整合蛋白”意指一类富含半胱胺酸的蛋白质或多胜肽,其是整合蛋白的有效的可溶性配体。RGD区域为三胜肽(tri-peptide)精胺酸-甘胺酸-天冬胺酸(Arg-Gly-Asp),其在大部分的单体去整合蛋白中是保守的,且位于整合蛋白结合环(integrin-binding loop)上。本文所述的去整合蛋白分离自蛇毒、或衍生自野生型,并具有至少一在RGD区域上或相邻处的突变,以选择性地结合至或靶向多种整合蛋白同功体。于本文中,术语“RGD区域相邻处”意谓在给定的胜肽或多胜肽序列中的任意突变是出现在任意自RGD区域算来第15-20个胺基酸内的胺基酸残基。
在此也考虑了去整合蛋白的其他胺基酸序列变异体。举例而言,去整合蛋白的结合亲合力及/或其他生物性质可通过改变编码该蛋白的胺基酸序列来改善。去整合蛋白突变体可通过将适当的修饰引入编码该蛋白的核酸序列中、或通过胜肽合成引入修饰来制备。这些修饰包括突变,例如将该去整合蛋白的核酸或胺基酸序列进行删除、插入、及/或取代。去整合蛋白的最终胺基酸构筑体(construct)可通过进行删除、插入及取代的任意组合来达成,该最终构筑体具有所需的特征,例如结合至整合蛋白超家族成员及/或抑制整合蛋白活化的路径。
对该蛋白质或多胜肽的生物性质的实质修饰是通过选择对维持以下各项有显著不同效果的取代来实现:(a)取代区域的多胜肽骨架的构造,举例而言,作为折叠或螺旋构型、(b)分子在标靶位点的电荷或疏水性、或(c)支链的主体。
一种用于辨别融合蛋白的某些残基或区的较佳突变作用位置的方法称为“丙胺酸扫描突变(alanine scanning mutagenesis)”,如Science,1989,244:1081-1085中所描述。举例而言,将一残基或一群标靶残基辨别出来(例如,带电荷的残基,诸如,Arg、Asp、His、Lys、及Glu),并以中性或负电荷胺基酸(最佳为丙胺酸或聚丙胺酸)替换,以影响胺基酸与标靶结合伴侣的交互作用。接着,对取代呈现功能敏感性的这些胺基酸所在位置,通过于该取代位点引入另一或其他变异体来改进。因此,虽然用于引入胺基酸序列变异的位点是预先决定的,但突变本身的性质不需要预先决定。举例而言,为分析在给定位点的突变的性能,可在标靶密码子或区实行随机突变,并对表现出的融合多胜肽变异体进行所需活性筛选。举例而言,可在融合蛋白或蛋白组分中添加半胱胺酸键以改善其稳定性。
因此,本文提供的去整合蛋白突变体,可为本文所公开的任意融合蛋白的组分。在一些实施例中,该去整合蛋白包含与选自由以下所组成的群组的去整合蛋白胺基酸序列具有至少85%、至少90%、至少95%、或至少99%的序列同一性的胺基酸序列:马来亚蝮素(Rhodostomin)(SEQ ID NO:1)、黄绿竹叶青素(Triflavin)(SEQ ID NO:3)、巨鳞蝰素(Echistatin)(SEQ ID NO:4)、台湾龟壳花素(Trimucrin)(SEQ ID NO:5)、丽纹龟壳花蛇素(Elegantin)(SEQ ID NO:6)及赤尾鲐素(Trigramin)(SEQ ID NO:7)。在一些实施例中,去整合蛋白包含一胺基酸序列,该胺基酸序列具有至少一在马来亚蝮素(SEQ ID NO:1)、黄绿竹叶青素(SEQ ID NO:3)、巨鳞蝰素(SEQ ID NO:4)、台湾龟壳花素(SEQ ID NO:5)、丽纹龟壳花蛇素(SEQ ID NO:6)或赤尾鲐素(SEQ ID NO:7)的RGD区域上或相邻处的突变。在一些实施例中,去整合蛋白包含与去整合蛋白突变体的胺基酸序列(SEQ ID NO:2)具有至少85%、至少90%、至少95%、或至少99%的序列同一性的胺基酸序列。在SEQ ID NO:2中的Xaa指出多个位置,这些位置可通过插入、取代或删除来进行修饰,以生产与野生型去整合蛋白不同的胺基酸序列变异体。根据一些实施例,位于SEQ ID NO:2位置50的Xaa,其对应到野生型马来亚蝮素(SEQ ID NO:1)的RGD区域中的甘胺酸(Gly),可用甘胺酸之外的天然产生胺基酸取代,以产生马来亚蝮素变异体。在其他实施例中,SEQ ID NO:2中的一或多个Xaa也可用原来在野生型马来亚蝮素(SEQ ID NO:1)的对应位置上找到的胺基酸之外的天然产生胺基酸取代,以产生多种马来亚蝮素变异体。还需说明的是,去整合蛋白变异体并不限于只包括SEQ ID NO:2中任意Xaa的单一突变,本发明的保护范围也包含在SEQ ID NO:2中Xaa的数个位置或在其他具一致序列的去整合蛋白(例如,SEQ ID NO:3-7)中的对应位置产生多突变。
虽然去整合蛋白的变异体大多参考上述胺基酸序列来讨论,编码蛇毒蛋白的多胜肽序列或核苷酸序列、及其具有至少一RGD区域上或相邻处的突变的变异体也可被包含在本发明的保护范围中,其中该蛇毒蛋白是例如白唇竹叶青蛇素(Albolabrin)、百步蛇素(Applagin)、墨西哥西海岸响尾蛇素(Basilicin)、矛头蝮素(Batroxostatin)、鼓腹巨蛇素(Bitistatin)、西部亚种响尾蛇素(Cereberin)、角响尾蛇素(Cerastin)、西部菱背响尾蛇素(Crotatroxin)、南美响尾蛇素(Duressin)、黄绿龟壳花蛇素(Flavoridin)、黄绿龟壳花蛇毒解离素(Flavostatin)、日本蝮蛇素(Halysin)、西伯利亚蝮蛇毒解离素(Halystatin)、巴西蝮素(Jararacin)、巴西蝮蛇毒解离素(Jarastatin)、马来亚红口蝮素(Kistrin)、亚马逊巨蝮素(Lachesin)、西部亚种响尾蛇素(Lutosin)、黑尾响尾蛇素(Molossin)、韩国亚种短尾蝮素(Salmosin)、白眉蝮素(Saxatilin)、北美侏儒响尾蛇素(Tergeminin)、黄绿龟壳花蛇毒解离素(Trimestatin)、台湾龟壳花去整合蛋白(Trimutase)、乌苏里蝮素(Ussuristatin)、及草原响尾蛇素(Viridin)。
不受理论所限制,本文在此考虑了去整合蛋白通过结合至整合蛋白超家族成员,以阻断其与多价整合蛋白受体交互作用,来抑制整合蛋白活化的路径。在一些方面,去整合蛋白结合至整合蛋白超家族成员,包括但不限于整合蛋白同功体:αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ6、αvβ8、α5β1、及/或αvIIbβ3。
根据本发明,融合蛋白的其他结合蛋白的胜肽可为受体蛋白,该受体蛋白结合至选自由以下所组成的群组的标靶:肿瘤抗原、肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族成员、刺猬因子(Hedgehog)家族成员、受体酪胺酸激酶、蛋白多糖相关的分子、肿瘤生长因子-β(TGF-β)超家族成员、Wnt相关的分子及血管新生标靶。
根据本发明的一些实施例,其他结合蛋白的胜肽可专一性地结合至血管新生标靶,其包括但不限于血管生成素(ANG)、酪胺酸蛋白激酶(Eph)、纤维母细胞生长因子(FGF)、神经纤毛蛋白(NRP)、血纤维蛋白溶酶原活化物、血小板衍生生长因子(PDGF)、TGF-β、血管内皮生长因子(VEGF)、血管内皮钙黏蛋白(VE-cadherin)、及其受体。因此,根据本发明的实施例,其他结合蛋白的胜肽可包括受体蛋白的胞外部分,其结合至并拮抗该血管新生标靶。在其他实施例中,其他结合蛋白的胜肽可结合至血管新生因子受体的胞外部分。
在一些实施例中,其他结合蛋白的胜肽可结合至VEGF配体的抗VEGF抗体(参见WO2015/200905对胺基酸序列的描述,该文献的全文并于此处以供参考)、或结合至VEGF受体的抗VEGFR1或抗VEGFR2抗体(参见美国专利号5,874,542对胺基酸序列的描述,该文献的全文并于此处以供参考)。在其他实施例中,其他结合蛋白的胜肽也可结合至PDGF配体的抗PDGF抗体(参见美国专利号5,094,941对胺基酸序列的描述,该文献的全文并于此处以供参考)、或结合至PDGF受体的抗PDGFRβ抗体(参见美国专利号9,265,827对胺基酸序列的描述,该文献的全文并于此处以供参考)。
在某些实施例中,其他结合蛋白的胜肽作为以下VEGF受体(VEGFR)的任意一者结合至相同的VEGF:VEGFR1、VEGFR2、及VEGFR3。在一些实施例中,其他结合蛋白的胜肽包含VEGFR的至少一胞外部分,该VEGFR为本文所述的任意VEGFR。举例而言,其他结合蛋白的胜肽包含VEGFR1的至少一胞外部分、或VEGFR2的至少一胞外部分。在另一实施例中,其他结合蛋白的胜肽包含VEGFR1的一胞外部分,例如类免疫球蛋白结构域2(D2)、及VEGFR2的一胞外部分,例如类免疫球蛋白结构域3(D3)。在一些方面,其他结合蛋白的胜肽包含VEGFR1的一胞外部分(其包含SEQ ID NO:8的胺基酸序列)、及VEGFR2的一胞外部分(其包含SEQ ID NO:9的胺基酸序列)。在一些方面,其他结合蛋白的胜肽包含VEGFR1及VEGFR2的胞外部分的融合体,其包含SEQ ID NO:10的胺基酸序列、或与SEQ ID NO:10具有至少85%序列同一性的胺基酸序列。
在其他实施例中,其他结合蛋白的胜肽作为以下PDGF受体(PDGFR)的任一者结合至相同的PDGF:PDGFR-α、及PDGFR-β。在一些实施例中,其他结合蛋白的胜肽包含PDGFR的至少一胞外部分,该PDGFR为本文所述的任意PDGFR。举例而言,其他结合蛋白的胜肽包含PDGFR-α的至少一胞外部分、或PDGFR-β的至少一胞外部分。在另一实施例中,其他结合蛋白的胜肽包含PDGFR-β的一胞外部分,例如类免疫球蛋白结构域1至3。在一些方面,其他结合蛋白的胜肽包含PDGFR的胞外部分,其包含SEQ ID NO:11的胺基酸序列、或与SEQ ID NO:11具有至少85%序列同一性的胺基酸序列。
根据其他实施例,本发明也提供融合蛋白,其包含结合整合蛋白的胜肽、人类或人源化恒定亚区、及其他结合蛋白的胜肽,其中该结合整合蛋白的胜肽包括在RGD区域上或相邻处具有至少一突变的SEQ ID NO:1的胺基酸序列、与SEQ ID NO:1具有至少85%序列同一性的胺基酸序列、或SEQ ID NO:2的胺基酸序列;该人类或人源化恒定亚区包含免疫球蛋白CH2结构域及免疫球蛋白CH3结构域;该其他结合蛋白的胜肽具有VEGFR1的类免疫球蛋白D2及VEGFR2的类免疫球蛋白D3。在融合蛋白的另一实施例中,结合整合蛋白的胜肽具有与SEQID NO:2至少85%的序列同一性。
就多胜肽或核酸序列而言,术语“序列同一性百分比(%)”定义为:在比对序列并在需要时引入间隙(gap)以达到最大序列同一性百分比之后,在保守性置换(conservativesubstitution)不被视为序列同一性的一部分的情况下,候选序列中与参照的多胜肽或核酸序列中相同的胺基酸残基或核苷酸的百分比。为了测定胺基酸或核酸序列同一性百分比所进行的比对,可用多种本技术领域中的方式达成,例如,使用公开的计算机软件程序,举例而言,如这些描述于Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人,eds.,1987)中的计算机软件程序,以及包括BLAST、BLAST-2、ALIGN、或Megalign(DNASTAR)软件。熟习此项技术领域者可选定用于测量比对的适当参数,包括对欲比较序列的全长达到最大化比对所需的算法。就本文的目的而言,给定胺基酸序列A对比给定胺基酸序列B的胺基酸序列同一性百分比,如下计算:100乘以分数X/Y,其中X为通过序列比对程序在程序比对A及B时,评分为相同的胺基酸残基的数目,且其中Y为B中胺基酸残基的总数。应了解,当胺基酸序列A的长度与胺基酸序列B的长度不相等时,A对B的胺基酸序列同一性百分比不会与B对A的胺基酸序列同一性百分比相等。
本发明提供二聚体融合蛋白,其包含二融合蛋白,其中各融合蛋白包含本文所公开的任意融合蛋白。在一实施例中,二聚体融合蛋白包含两个完全相同的融合蛋白。在另一实施例中,二聚体融合蛋白可包含两个不同的融合蛋白。本文所公开的融合蛋白可通过多聚化结构域形成二或更多个完全相同的融合蛋白多聚体或异种(heterologous)融合蛋白,该结构域包括人类或人源化抗体的恒定亚区。在一些实施例中,人类或人源化抗体的恒定亚区选自由以下所组成的群组:IgG Fc区、IgA Fc区、IgM Fc区、IgD Fc区、及IgE Fc区。在另一实施例中,人类或人源化抗体的恒定亚区选自由以下所组成的群组:IgG1Fc区、IgG2Fc区、IgG3Fc区、及IgG4Fc区。在一些方面,亚区包含IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4的CH2区及CH3区。编码包含Fc区的免疫球蛋白的胺基酸序列,为本技术领域所熟知。
融合蛋白的组分可互相直接连接,或通过连接子连接。一般而言,术语“连接子”意为一或多个分子(例如,核酸、胺基酸、或非胜肽部分(non-peptide moiety)),其可插入于一或多个组分结构域之间。举例而言,连接子可用于在组分之间提供所需的受关注位点,以便于操作。连接子也可提供来使宿主细胞提升融合蛋白表现量、减少立体阻碍(sterichindrance)致使该组分可取得其最适的三级结构、及/或适当地与其标靶分子交互作用。连接子序列可包括一或多个天然连接至受体组分的胺基酸、或可添加来用于提升融合蛋白表现量的序列,以提供特别所需的受关注位点、以使组分结构域形成最适的三级结构、及/或以提升组分与其标靶分子的交互作用。
较佳的情况为连接子增加融合蛋白组分的挠性,而不干扰在该融合蛋白中的各功能性组分的结构。在一些实施例中,连接子部分是长度为2至100个胺基酸的胜肽连接子。例示性连接子包括具有至少二个胺基酸残基的线性胜肽,例如:Gly-Gly、Gly-Ala-Gly、Gly-Pro-Ala、Gly(G)n、及Gly-Ser(GS)连接子。本文所述的GS连接子包括但不限于(GS)n、(GSGSG)n、(G2S)n、G2S2G、(G2SG)n、(G3S)n、(G4S)n、(GGSGG)nGn、及GSG4SG4SG,其中n为1或1以上。(G)n连接子的一个例子包括G9连接子。适合的线性胜肽包括聚甘胺酸(polyglycine)、聚丝胺酸(polyserine)、聚脯胺酸(polyproline)、聚丙胺酸(polyanaline)、及由丙胺酰基(alanyl)及/或丝胺酰基(serinyl)及/或脯胺酰基(prolinyl)及/或甘胺酰基(glycyl)的胺基酸残基所组成的寡胜肽(oligopepetide)。连接子部分可用来连接本文所公开的融合蛋白的任意组分。在一些实施例中,连接子是用在受体蛋白的胞外部分、及免疫球蛋白的恒定亚区之间。在其他实施例中,连接子是用在去整合蛋白或其变异体、及免疫球蛋白的恒定亚区之间。在某些实施例中,融合蛋白包含一位于受体蛋白的胞外部分、及去整合蛋白或其变异体之间的连接子;及一位于去整合蛋白或其变异体、及免疫球蛋白的恒定亚区之间的连接子。如本发明所体现,融合蛋白可包含至少一条但不多于四条的连接子。
本文所述的融合蛋白可包含或不包含使融合蛋白自宿主细胞分泌出来的讯息胜肽。编码该讯息胜肽的核酸序列,能够可操作地连接至编码感兴趣的蛋白的核酸序列。在一些实施例中,该融合蛋白包含讯息胜肽。在一些实施例中,融合蛋白并不包含讯息胜肽。
此外,本发明所述的融合蛋白可包含结合蛋白的胜肽的经修饰型态。举例而言,融合蛋白组分可具有转译后修饰,包括例如对任意结合蛋白的胜肽进行醣化、唾液酸化、乙酰化、及磷酸化。
虽然,实施例已大致描述包括于融合蛋白中的二条结合蛋白的胜肽,本发明也包括并入二条以上结合蛋白的胜肽的融合蛋白,以在抑制血管新生过程的方面提供任何加成的或协同的效果。举例而言,可有一额外的结合蛋白的胜肽,其结合至其他血管新生标靶、或作为血管新生因子拮抗剂而连接至现存的二条结合蛋白的胜肽。
本发明提供一编码本文所公开的融合蛋白的核酸。本发明还提供一种用于制备本文所公开的融合蛋白的方法。该方法包含培养一宿主细胞,其中该宿主细胞是以包含本发明核酸序列的载体转染,以及在适合的条件下重获该宿主细胞所制备的融合蛋白。
于本文中,术语“多核苷酸”、或“核酸”意指任意长度的核苷酸多聚型,其可为核醣核苷酸或脱氧核醣核苷酸的任一者。因此,该术语包括但不限于单股、双股、或多股DNA或RNA、基因体DNA、cDNA、DNA-RNA杂交体、或包含嘌呤或嘧啶碱基的多聚体、或包含其他天然、经化学或生化修饰、非天然、或衍生的核苷酸碱基的多聚体。
经分离的编码融合蛋白的核酸分子、或融合蛋白的组分可为RNA形式(例如,mRNA、hnRNA、tRNA、或其他任意形式)、或DNA形式(包括但不限于cDNA及基因体DNA),其通过选殖(cloning)、或合成生产、或其任意组合来获得。DNA可为三股、双股或单股,或其任意组合。DNA或RNA的至少一股的任意部分可为编码股(称作正股(sense strand)),或其可为非编码股(也称作反股(anti-sense strand))。经分离的编码融合蛋白的核酸、或融合蛋白的组分可通过各种本发明所属技术领域中所知的方法来制备,包括但不限于由天然来源所分离、或通过寡核苷酸调节的突变作用(oligonucleotide-mediated mutagenesis)来制备、及将先前制备的融合蛋白或融合蛋白组分的变异体或非变异体形式进行盒式突变(cassettemutagenesis)。参见Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Sambrook等人,4th ed.,Cold Spring Harbor,N.Y.2012)、及Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人,eds.,2003)。
“载体(vector)”意指一重组质体,其包含于体外或体内欲递送入宿主细胞的核酸。
本发明包含一核酸递送媒介物(nucleic acid delivery vehicle)的用途,其是用于将一或多个编码融合蛋白或融合蛋白组分的核酸序列引入细胞中,来表现所述蛋白。核酸递送媒介物的例子为:脂质体、生物可相容多聚体(包括天然多聚体及合成多聚体)、脂蛋白、多胜肽、多醣、脂多醣、人工病毒套膜、金属颗粒、及细菌、病毒(例如,杆状病毒、腺病毒、及反转录病毒)、噬菌体、黏质体(cosmid)、质体、真菌载体、及其他常用于本技术领域的重组媒介物,这些媒介物已被描述用于在多种真核及原核宿主中表现。在一些实施例中,核酸递送媒介物为表现载体,例如质体。载体可包括任意组件以建立表现载体(例如,启动子、核醣体结合组件、终止子、强化子、选择标记)及复制起点的常见功能。启动子可为组成型(constitutive)启动子、诱导型(inducible)启动子、或阻抑型(repressible)启动子。若干可递送核酸进入细胞的表现载体为本技术领域所知,且在本文中其可用于在细胞中产生融合蛋白或融合蛋白的组分。表现的融合蛋白或融合蛋白的组分可自细胞中获得,并根据本技术领域所知的现有技术以及如本文所述来纯化。
本文所提供的宿主细胞,其包含编码本文所述的融合蛋白的核酸。编码融合蛋白或融合蛋白的组分(例如,血管新生因子受体的胞外部分、去整合蛋白或其变异体、及/或免疫球蛋白的恒定亚区)的核酸,可通过本技术领域所知的任意手段提供至目标细胞。在一些实施例中,编码有兴趣的蛋白的核酸在表现载体(例如,质体)中。在其他实施例中,编码有兴趣的蛋白质的核酸在病毒载体中,且该载体已被包裹,然后病毒体(virion)可用来感染细胞。已知转染及转型(transformation)程序适合用于将编码有兴趣的蛋白的核酸引入目标细胞中。利用多聚体、脂质体、或纳米球(nanosphere)的调配物可用于递送编码有兴趣的蛋白的核酸。根据本发明的重组构筑体转型或转染的细胞,可为任意熟习此项技术领域者所现有的。可用的例示性细胞型包括:细菌、酵母菌、真菌、昆虫、植物、及哺乳类细胞。在一些实施例中,经转型或转染的细胞可被提供至细胞或哺乳类宿主。适合用于递送至细胞或哺乳类宿主的细胞包括来自任意起源、肿瘤、或细胞株的任意哺乳类细胞型。
用于制备本发明融合蛋白或融合蛋白的组分的细胞,是生长于熟习此项技术领域者所知的培养基中,且该培养基适合用于培养所选择的宿主细胞。给予的培养基通常在必要时以荷尔蒙及/或其他生长因子、DHFR、盐类、缓冲液、核苷、抗生素、微量元素、及葡萄糖或同等的能量来源补充。熟习此项技术领域者所知的任何其他必要的补充物也可以适当的浓度包括在内。培养条件,例如温度、pH值、及诸如此类,与先前所选择的用于表现的细胞所用的条件相同,且对熟习此项技术领域者是显而易见的。
蛋白可使用一般所知的方法来纯化及辨识,例如在免疫亲合或离子交换管柱上进行分馏;乙醇沉淀法;反相高压液相层析(HPLC);在硅胶上或阳离子交换树脂(例如,DEAE)上进行色层分析法;色层交集法(chromatofocusing);SDS-PAGE;硫酸铵沉淀法;胶体过滤法(例如,葡萄糖凝胶G-75(Sephadex G-75));疏水亲合力树脂,使用固化在基质上的适合的结合伴侣的配体亲合力、离心、酵素免疫检定法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA)、BIACore、西方墨点法、胺基酸及核酸定序、及生物活性。在一些实施例中,融合蛋白在宿主细胞内表现,并使用一种或多种标准纯化技术的组合自其中纯化,这些技术包括但不限于蛋白A亲合力层析、蛋白G亲合力层析、缓冲液置换、粒径排阻层析、超过滤、及透析。因此,回收的融合蛋白实质上是纯的。在另一实施例中,回收的融合蛋白为以下的任一者:纯度至少为90%、95%、96%、97%、98%、或99%。
本文所公开的融合蛋白或融合蛋白的组分,可对生物活性做定性或评估,这些生物活性包括但不限于对目标结合伴侣的亲合力、竞争性结合、抑制性活性、细胞增生的抑制、肿瘤生长的抑制、及血管新生的抑制。在一些实施例中,本文所公开的融合蛋白或融合蛋白的组分可在体外及体内进行生物活性评估。许多用于评估结合亲合力的方法为本技术领域所知,并可用于辨识融合蛋白或融合蛋白的组分对结合伴侣的结合亲合力。结合亲合力可以解离常数(dissociation constant,Kd)值或最大有效浓度的一半(half maximaleffective concentration,EC50)表示。
在本文的任意实施例中,融合蛋白对活性的抑制(例如,对血管新生因子活性及/或整合蛋白活性的抑制)具有小于或等于1μM、100nM、10nM、1nM、0.1nM、0.01nM、或0.001nM的EC50。在本文的任意实施例中,融合蛋白对结合伴侣(血管新生因子及/或整合蛋白)具有小于约1.0mM、500μM、100μM、50μM、10μM、5μM、1μM、500nM、100nM、50nM、10nM、5nM、1nM、500pM、100pM、50pM、10pM、或5pM的Kd值,包括这些数字之间的任意值。
本发明也提供一医药组合物,其包含融合蛋白,该融合蛋白包含结合整合蛋白的胜肽、其他结合蛋白的胜肽以靶向血管新生因子、及Fc结构域,其中该结合整合蛋白的胜肽选自由以下所组成的群组:去整合蛋白、抗整合蛋白αvβx抗体、抗整合蛋白α5β1抗体、靶向整合蛋白αvβx或α5β1的纤维黏连蛋白、及其结合整合蛋白的片段,其中x为1、3、5、6或8。本发明组合物包含治疗有效量的融合蛋白。
术语“治疗有效量”意谓具治疗活性的化合物引起所需的生物或临床效果所需要的量。根据本发明的实施例,“治疗有效量”可达到有利影响或所需结果(包括临床结果)的足够的量。治疗有效量可以一次或多次给药中投予。依照疾病状态,治疗有效量为足够改善、稳定、或延缓疾病发展的量。根据本发明的特定实施例,治疗有效量为治疗或预防不正常血管新生的病症(例如其表征为新生血管、血管渗透性、水肿、发炎、视网膜病变、纤维化或癌症的疾病)所需的融合蛋白量。
在一些实施例中,包含融合蛋白的医药组合物包含在缓冲液中调配的融合蛋白,其蛋白质浓度自约0.5至约100毫克/毫升,较佳为约40至约80毫克/毫升,例如约40、50、60、70或80毫克/毫升,最佳为约40±约5毫克/毫升。在其他较佳实施例中,融合蛋白以高于约40毫克/毫升的蛋白浓度在缓冲液中调配。
在具体实施例中,缓冲液为具有约6.5至8、更佳为约7至7.5、甚至更佳为约7.2的pH值的磷酸盐缓冲液。该磷酸盐缓冲液包含约5至20mM的磷酸钠,例如5、10、15、或20mM的磷酸钠,更佳为约10mM的磷酸钠;约20至60mM的氯化钠,更佳为约40mM的氯化钠;约1至10%重量/体积(w/v)的蔗糖,更佳为约5%重量/体积的蔗糖;以及约0.01至0.05%重量/体积的表面活性剂,更佳为约0.03%重量/体积的聚山梨醇酯20。
在其他具体实施例中,缓冲液为pH值具有约5至8、更佳为约6至7、最佳为约6.8的组胺酸缓冲液。该组胺酸缓冲液包含约10至50mM的组胺酸,例如10、20、30、40、或50mM的组胺酸,更佳为约25mM的组胺酸;约10至30mM的氯化钠,例如10、20、或30mM的氯化纳,更佳为约20mM的氯化钠;约1至10%重量/体积的蔗糖,例如1、2、4、6、8、或10%重量/体积的蔗糖,更佳为约6%重量/体积的蔗糖;以及约0.01至0.05%重量/体积的表面活性剂,更佳为约0.03%重量/体积的聚山梨醇酯20。
本发明也涉及使用根据本发明的组合物,在一个体或受试者中治疗或预防整合蛋白相关的疾病的用途。“个体”或“受试者”为哺乳类。哺乳类包括但不限于驯养动物(例如,牛、羊、猫、狗、及马)、灵长类(例如,人类及非人类灵长类(non-human primates)(例如猴子))、兔子及囓齿类(例如,小鼠及大鼠)。在一些实施例中,用于治疗或预防疾病的一或多种方面或症状的方法包含,对一个体投予一有效量的包含融合蛋白的组合物。
本文所述的方法可用于治疗多种疾病,包括但不限于发炎性疾病、眼部疾病、自体免疫疾病、或癌症。在一些实施例中,欲治疗的疾病包括但不限于类风湿性关节炎、炎症性关节炎、骨关节炎、癌症、纤维化、色素性视网膜炎、眼色素层炎(例如,前眼色素层炎或后眼色素层炎)、及特征为新生血管或缺血的眼部疾病(例如,脉络膜新生血管、糖尿病视网膜病变、糖尿病黄斑水肿、老年性黄斑退化(AMD)、视网膜静脉阻塞、多发息肉性脉络膜血管病变)。
本文所述的组合物可通过任意途径投予至个体,途径包括但不限于静脉、腹膜、眼部、动脉、肺脏、口服、吸入、血管(intravesicular)、肌肉、气管、皮下、脊髓(intrathecal)、经皮、经胸膜(transpleural)、局部、黏膜、胃肠、关节(intraarticular)、脑池内(intracisternal)、心室内、颅内、尿道内、肝内、及肿瘤内。在一些实施例中,组合物为系统性投予(例如通过静脉注射)。在一些实施例中,组合物为局部投予(例如通过动脉注射或眼内注射)。
在一些实施例中,组合物为直接投予至眼睛或眼睛组织。在一些实施例中,组合物为局部地投予至眼睛,举例而言,眼药水。在一些实施例中,组合物为通过注射至眼睛(眼内注射)或至与眼部相连的组织来投予。组合物可被投予,举例而言,通过眼内注射、眼周注射、次视网膜注射、玻璃体内注射(intravitreal injection)、脉络膜表面(superchoroidal)注射、经中膈(trans-septal)注射、巩膜下(subscleral)注射、脉络膜内注射、前房内(intracameral)注射、结膜下注射、坦诺囊下(sub-Tenon’s)注射、眼球后(retrobulbar)注射、眼球周边(peribulbar)注射、或后巩膜旁递送(posteriorjuxtascleral delivery)。这些方法为本技术领域所知。组合物可被投予至例如玻璃体、前房液、巩膜、结膜、在巩膜及结膜之间的部位、视网膜脉络膜组织、黄斑、或其他在个体眼睛中或邻近的部位。
组合物的最适有效量可凭经验决定,且将取决于疾病的型态及严重性、投予途径、疾病进程及个体的健康状况、重量及身体部位。这些决定是在本技术领域者的通常知识范围内。包含融合蛋白的组合物也可以一周六次、一周五次、一周四次、一周三次、一周二次、一周一次、二周一次、三周一次、一个月一次、二个月一次、三个月一次、六个月一次、九个月一次、或一年一次来投予。
除非另外定义,此处所用的所有技术及科学术语为具有与本发明所属技术领域中具通常知识者通常所了解的相同意义。虽然任何与本文所述类似或同等的方法及材料可用来实施或测试本发明,但较佳的为现在描述的方法及材料。所有本文所提到的供参考的出版品并于本文中,以描述与这些被引用的出版品相关的方法及/或材料。
本发明通过以下实施例进一步说明,这些实施例是为了证明的目的而提供,并非用以限制本发明。
实施例1:马来亚蝮素突变体蛋白的制备
表现去整合蛋白的方法
重叠延伸聚合酶连锁反应(overlap extension polymerase chain reaction,PCR)技术是用于创造马来亚蝮素(Rho)突变构筑体。表现套组(expression kit)及酵母菌转染载体pPICZaA为购自Invitrogen。通过PCR放大基因序列来制造基因突变构筑体,该基因序列使用含有基因突变体加上EcoRI辨认位点、及用于促进纯化的六个组胺酸残基的互补序列的正股引子(sense primer),且设计反股引子(anti-sense primer)使其含有SacII辨认位点及TTA终止密码子。纯化PCR产物,然后选殖入酵母菌重组载体pPICZaA的EcoRI及Sac II位点。将重组质体转型入大肠杆菌胜任细胞(E.coli competent cell)DH5α,并通过具有低盐Luria Broth(LB,1%胰化蛋白、0.5%酵母萃取物、0.5%NaCl、及1.5%琼脂,pH7.0)及25微克/毫升的抗生素吉欧霉素(Zeocin)的琼脂盘来选取群落。选取单一群落来为定序放大质体。在通过DNA定序确定群落后,制备10微克的质体,然后以Sac I酵素消化来线性化。使用套组(Pichia EasyComp;Invitrogen)将线性化的构筑体转型入嗜甲醇酵母菌(Pichia)株X33中,并通过使用YPDS(1%酵母萃取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖、2%琼脂、及1M山梨醇)及100微克/毫升的吉欧霉素的琼脂盘来选取群落。使用PCR分析来分析嗜甲醇酵母菌整合蛋白,以测定基因是否嵌合入嗜甲醇酵母菌基因体中。自具有多份基因插入的数个群落中,选取具有最高蛋白表现量的群落。
纯化去整合蛋白的方法
Rho突变体系如下制备:100微升的细胞储液是在200毫升的酵母萃取物蛋白胨葡萄糖(yeast extract peptone dextrose,YPD)培养基(1%酵母萃取物、2%蛋白胨、及2%葡萄糖)及100微克/毫升的吉欧霉素中、30℃下生长48小时。然后将细胞转移到800毫升的YPD培养基中。又经过48小时后,通过离心搜集细胞,并在1公升的最小甲醇培养基(minimalmethanol medium)(1.34%具有硫酸铵不具胺基酸的酵母氮源基础培养基(yeastnitrogen base,YNB)、4x10-5%生物素、1%甲醇)生长。在2天中每24小时添加1%甲醇一次,以诱导蛋白表现。在离心后搜集上清液,并以5公升H2O透析二次、以5公升20mM Tris-HCl及200mM NaCl(pH 8)透析一次。装填最终溶液进镍离子螯合管柱,并以200mM咪唑的梯度冲提。在嗜甲醇酵母菌(P.pastoris)中制备的重组Rho蛋白,进一步通过反相C18HPLC以15%至18%乙腈的梯度纯化。甘胺酸十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(tricine-SDS-PAGE)分析确定蛋白的纯化大于95%。
实施例2:VEGFR/Rho突变体融合蛋白的产生
Flt-1受体(VEGFR1)的胞外结构域D2(即,SEQ ID NO:8)及KDR/Flk-1受体(VEGFR2)的胞外结构域D3(即,SEQ ID NO:9),统称为VEGF诱捕剂(trap),其为提供结合至VEGF配体的蛋白组分。为了结合至VEGF配体及整合蛋白二者,产生包含VEGF1D2/VEGF2D3(即,SEQ ID NO:10)及Rho突变体(即,SEQ ID NO:13)的融合蛋白。
先前产生的VEGF诱捕剂为连接至人类免疫球蛋白G1的CH2及CH3结构域(IgG1Fc),用来产生编码VEGF1D2/VEGF2D3-Rho突变杂交体的DNA构筑体。参见Holash,J.等人,PNAS,2002,99(17):11393-11398对VEGF诱捕剂的描述,该文献的全文并于此处以供参考。SEQ IDNO:16的融合蛋白通过至少一Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(G4S)胜肽连接子,连接SEQ ID NO:10之VEGFR1D2/VEGFR2D3及SEQ ID NO:13的Rho突变体来构筑。
类似地,SEQ ID NO:15及17的融合蛋白2及3也通过将SEQ ID NO:12及SEQ ID NO:14的Rho突变体分别与SEQ ID NO:10的VEGFR1D2/VEGFR2D3融合来产生。SEQ ID NO:18的融合蛋白4通过将市售的VEGF诱捕剂阿普西柏(aflibercep)(采视明雷杰纳隆(Regeneron))与SEQ ID NO:13的Rho突变体融合来产生。图1提供示意图,显示根据本发明的一实施例的融合蛋白的构造。SS为SEQ ID NO:20的讯息胜肽序列,其帮助中国仓鼠卵巢(CHO)细胞分泌蛋白质。VEGF诱捕剂为由人类VEGFR1及VEGFR2的胞外类免疫球蛋白结构域2及3所构成。Fc片段为人类免疫球蛋白G1(IgG1)的CH2及CH3区。GS为连接子。Rho突变体已描述于美国专利号7,943,728及PCT申请号PCT/US 15/46322中,且其序列系并于此处以供参考。
为产生具有SEQ ID NO:16胺基酸序列的融合蛋白1,编码融合蛋白1的DNA序列经密码子优化,以用于在CHO细胞中表现。该合成的经密码子优化DNA具有SEQ ID NO:19的胺基酸序列,与具有SEQ ID NO:21胺基酸序列的讯息胜肽一起选殖入表现载体中。于转染前72小时,将CHO K1宿主细胞以2x105个细胞/毫升种入含有4mM麸酰胺酸(J.T Baker 2078-06)及1%HT补充液(Gibco 11067-030)的CD CHO(Gibco 12490-003)中。宿主细胞培养于Infors震荡培养箱中(36.5℃、75%湿度、6%CO2、每分钟110转(110RPM),且在使用前计数细胞密度。适合量的表现质体DNA添加入宿主细胞(1公升或5公升工作体积),并添加以聚合物为基础(polymer-based)的转染试剂。经转染的培养物培养于Infors震荡培养箱中(36.5℃、75%湿度、6%CO2、110RPM)4小时,并添加适当的饲养溶液。然后将经转染的培养物培养于Infors震荡培养箱中(32℃、75%湿度、6%CO2、110RPM)。在转染后第10天收获经转染培养物。纯化上清液以产生研究材料。纯化过程包括净化作用、蛋白A亲合力层析、通过AmiconUltracel浓缩、粒径排阻层析、通过Slide-A-Lyzer透析、及通过Amicon Ultracel在调配物缓冲液中进行最终浓缩。
具有同时抗VEGF及抗整合蛋白活性的融合蛋白为被构筑、表现、纯化及定性。图2提供示意图,定性通过SDS-PAGE纯化的融合蛋白1。装填分子标记进泳道M。建构的VEGF诱捕剂(正对照组1;SEQ ID NO:22)的非还原型及还原型分别装填入泳道1及2中,该VEGF诱捕剂为由人类VEGFR1及VEGFR2的部分融合至人类IgG1的Fc部分所组成。市售的VEGF诱捕剂阿普西柏(采视明,雷杰纳隆)(正对照组2)的非还原型及还原型分别装填入泳道3及4中。融合蛋白1的非还原型及还原型分别装填入泳道5及6中。各蛋白质样本为以3微克的体积装填于各泳道中。如图2所示,结果指出正对照组及融合蛋白1在还原及非还原条件下都呈现高整体性及纯度。融合蛋白1在指定调配物缓冲液中的最终浓度为大约40毫克/毫升(来自于280纳米(nm)波长下的吸光值)。
通过各自构筑体进行细胞转染以制备蛋白同二聚体(homodimer),该蛋白同二聚体的制备为通过SDS-PAGE及生物活性分析加以确定。
实施例3:融合蛋白对人类VEGF165的结合亲和力
使用直接结合酵素免疫检定法(ELISA)来测量本发明融合蛋白对人类VEGF165的结合亲和力,其中人类VEGF165为VEGF-A的剪接变异体。
VEGF诱捕剂为了治疗用途而建造的可溶性VEGF受体,且近来被FDA核准来治疗AMD。VEGF诱捕剂含有VEGFR1的第二类免疫球蛋白结构域2(D2)融合至VEGFR2的第三类免疫球蛋白结构域3(D3)融合至人类IgG1的可结晶(Fc)区(Holash,J.等人,Proc Natl AcadSci U S A.2002Aug20;99(17):11393-8)。VEGF诱捕剂靶向VEGF-A、VEGF-B、及人类胎盘生长因子(PlGF)。其中包括市售VEGF诱捕剂阿普西柏(采视明,雷杰纳隆)作为正对照组2。
添加100微升的涂布溶液(1微克/毫升VEGF165在1倍磷酸盐缓冲生理食盐水(phosphate buffered saline,PBS),pH7.2)至96-孔ELISA盘的各孔中,且该盘于4℃下培养过夜。以400微升的1倍PBS缓冲液清洗孔二次,并以纸巾小心地移除过量液体。
添加400微升的封塞液(5克脱脂牛奶在100毫升的1倍PBS中)至各孔中,且该盘于室温下培养1小时。以1倍PBS缓冲液清洗孔二次。
融合蛋白及对照组样品以封塞液依序稀释三倍,最高的蛋白浓度为10nM。添加100微升的系列稀释样品至各孔中。将该盘加盖并于室温下在盘震荡器上以大约每分钟100转(~100rpm)的转速培养1小时。以清洗缓冲液(1倍PBS、0.05%聚山梨醇酯20)清洗这些孔三次。
添加100微升的山葵过氧化酶共轭的山羊抗人类IgG Fc专一性抗体(horseradishperoxidase-conjugated goat anti-human IgG Fc specific antibody)至各孔中,该抗体经封塞液以1:2500稀释。密封该盘并于室温下在盘震荡器上培养1小时。以清洗缓冲液清洗该盘三次。
添加100微升的3,5,3’,5’-四甲基联苯胺(tetramethylbenzidine,TMB)至各孔中,将该盘培养3至5分钟以使反应进行。为停止反应,添加100微升的停止液(1N HCl)至各孔中。
各孔的光学密度(optical density,OD),为使用ELISA盘读取器在吸收波长450纳米下测定。该吸光值对融合蛋白或对照组的蛋白浓度作图,且该浓度是以EC50的信号决定。
经测试的本发明融合蛋白的结合亲合力,以EC50值表现,是在0.10nM及0.21nM之间。ELISA的结果显示于表1中。
表1
测试材料 | EC50(nM) |
正对照组2(阿普西柏) | 0.088-0.195 |
融合蛋白1(SEQ ID NO:16) | 0.106-0.207 |
实施例3的结果显示,根据本发明实施例的融合蛋白,以高亲和力与VEGF165结合。此也在图3中说明。
实施例4-融合蛋白对整合蛋白αvβ3的竞争性结合
使用竞争性结合来测量本发明融合蛋白1对整合蛋白αvβ3的结合亲和力。根据实施例1合成野生型Rho(SEQ ID NO:1)及Rho变异体KG(SEQ ID NO:13),并分别包括在竞争性结合检定中作为正对照组3及正对照组4。
添加溶解在涂布溶液中的1微克/毫升玻璃黏结蛋白(vitronectin)至96-孔ELISA盘的各孔中,并于4℃下培养该盘过夜。以PBS缓冲液清洗孔二次,并以纸巾小心地移除过量液体。
添加封塞液(5克脱脂牛奶在100毫升的1倍PBS中)至各孔中,且该盘于室温下培养1小时。以1倍PBS缓冲液清洗孔二次。
将各种不同浓度的正对照组3、正对照组4、及融合蛋白1与一定浓度的可溶性整合蛋白αvβ3混和。添加100微升的系列稀释样品至各孔中。将该盘加盖并于室温下在盘震荡器(~100rmp)上培养1小时。以清洗缓冲液(1倍PBS、0.05%聚山梨醇酯20)清洗这些孔三次。
添加经稀释的一级抗整合蛋白αv抗体,并培养,然后清洗。添加在封塞液中的山葵过氧化酶共轭的山羊抗人类IgG Fc专一性抗体至各孔中。密封该盘并于室温下在盘震荡器上培养1小时。以清洗缓冲液清洗该盘三次。
添加100微升的3,5,3’,5’-四甲基联苯胺(TMB)至各孔中,将该盘培养3至5分钟以使反应进行。为停止反应,添加100微升的停止液(1N HCl)至各孔中。
各孔的光学密度(OD),为使用ELISA盘读取器在吸收波长450纳米下测定。该吸光值对融合蛋白或对照组的蛋白浓度作图,且该浓度是以最大抑制浓度的一半(half themaximal inhibition concentration,IC50)的信号决定。
经测试的本发明融合蛋白的竞争性结合,以IC50值表现,是在2.2nM及16nM之间。结果显示于表2中,且也在图4中说明。
表2
测试材料 | IC50(nM) |
正对照组3(野生型Rho,SEQ ID NO:1) | 2.6-3.2 |
正对照组4(Rho变异体KG,SEQ ID NO:13) | 2.2-2.9 |
融合蛋白1(SEQ ID NO:16) | 2.2-16.0 |
实施例5-通过融合蛋白抑制HUVEC增生
实施人类脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)增生检定以测试本发明融合蛋白的功能。包括市售的VEGF诱捕剂阿普西柏(采视明,雷杰纳隆)作为正对照组2。
添加100微升的涂布溶液(1%明胶在二次蒸馏水中)至96-孔ELISA盘的各孔中,该盘于37℃下以2小时或隔夜培养。孔盘以1倍PBS缓冲液清洗二次。
添加3500计数的在内皮细胞生长基中的人类脐静脉内皮细胞至各孔中,并将该盘于37℃下隔夜培养。
融合蛋白样品以检定缓冲液(培养基-199 1倍厄尔盐(Earle’s Salts)、10%胎牛血清(fetal bovine serum)、10mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、1倍抗生素/抗霉剂)稀释,其最高蛋白浓度为300nM。融合蛋白样品与VEGF165(8奈克/毫升)混合,且该混合物是在室温下隔夜培养。然后这些孔是以200微升的1倍PBS清洗。
添加100微升的VEGF165/样品混合物至各孔中,且该盘在37℃下与5%的CO2培养72小时。在培养后,添加10微升的MTS监测试剂(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲氧苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑)+吩嗪硫酸甲酯在蒸馏的PBS中)至各孔中,并将该盘于37℃下培养2.5小时。
各孔的OD,为使用ELISA盘读取器在吸收波长490纳米下测定。吸光值对融合蛋白或对照组的蛋白浓度作图,且测定细胞增生被抑制50%时的浓度(IC50)。
对经测试的本发明融合蛋白而言,细胞增生的抑制(IC50)为测得于0.039nM及0.103nM之间。增生检定的结果显示于表3中,且其也在图5中说明。正对照组2及融合蛋白1对于抑制VEGF依赖性的HUVEC增生都呈现类似的活性。
表3
测试材料 | IC50(nM) |
正对照组2(阿普西柏) | 0.026-0.136 |
融合蛋白1(SEQ ID NO:16) | 0.039-0.103 |
实施例6-通过融合蛋白抑制αvβ3及α5β1细胞黏附
在融合蛋白存在下,评估过度表现αvβ3的CHO细胞至血纤维蛋白原(fibrinogen)的黏附、及表现α5β1的K562细胞至纤维黏连蛋白的黏附。
96-孔Immulon-2微量滴定板(Costar,纽约州康宁市(Corning,NY))是以含有50至500nM的基质的100微升磷酸盐缓冲生理食盐水(PBS:10mM磷酸盐缓冲液,0.15M NaCl、pH7.4)涂布,且在4℃下隔夜培养。基质及其涂布浓度为血纤维蛋白原(Fg)200微克/毫升、及纤维黏连蛋白(Fn)25微克/毫升。非专一性蛋白质的结合位点通过在每个孔中加入200微升的热变性1%牛血清白蛋白(BSA)(Calbiochem)在室温下共同培养1.5小时来阻塞。去除热变性BSA且以200微升的PBS清洗每个孔两次。
表现整合蛋白αvβ3的CHO细胞(CHO-αvβ3)与专利申请号62/US2015/46322来自相同来源,且保存于DMEM中。人类红血球性白血病K562如专利申请号62/US2015/46322所写般培养,其购自ATCC且培养于含有5%胎牛血清(FCS)的洛斯维-帕克纪念研究所(RoswellPark Memorial Institute,RPMI)-1640培养基中。在含有1mM EDTA的PBS缓冲液中清洗收获的K562,并在含有1mM MgSO4、2mM CaCl2、及500μM MnCl2的台氏缓冲液(Tyrode’sbuffer)(150mM NaCl、5mM KCl、及10mM Hepes,pH 7.35)中再悬浮。稀释细胞(CHO及K562)至3x105个细胞/毫升,且100微升的细胞用于实验。添加Rho及其突变体至经培养细胞且在37℃、5%CO2下培养15分钟。Rho及其变异体系在0.001至500μM下作为抑制剂使用。然后将经处理细胞添加进涂覆盘并在37℃、5%CO2下反应1小时。之后去除培养溶液,且通过以200微升的PBS清洗两次来移除未黏附细胞。通过结晶紫染色法(crystal violet staining)计量黏附细胞。简言之,以100微升的10%福尔马林固定孔10分钟并干燥。然后添加50微升的0.05%结晶紫进入孔中,在室温下20分钟。以200微升的蒸馏水清洗每个孔四次并干燥。染色通过添加150微升的染色溶液(50%酒精及0.1%乙酸)达成。吸光度的结果是在600纳米吸收光谱下读取,且该读取值为对应黏附细胞的数量。
抑制细胞黏附的计算是根据以下方程序进行。
在上述方程式中,TA意指“测试物(test article)”;NC意指“负对照组(negativecontrol)”;以及PC意指“正对照组(positive control)”。
IC50是被定义为抑制50%由特定整合蛋白所调节的细胞黏附所需的去整合蛋白变异体浓度(nM)。因此,具有较低的IC50的去整合蛋白变异体表示其在抑制各自的整合蛋白的细胞黏附活性中具有较好的专一性与活性效力,因此对各自的整合蛋白有较高的结合活性(或选择性)。IC50的结果总结于下表4中。图6提供示意图,显示通过融合蛋白1抑制CHO-αvβ3细胞黏附。表4
测试材料 | αvβ3,IC50(nM) | α5β1,IC50(nM) |
正对照组3(SEQ ID NO:1) | 24.7 | 252.5 |
正对照组4(SEQ ID NO:13) | 19.6 | 17.5 |
融合蛋白1(SEQ ID NO:16) | 4.76 | 3.4 |
实施例7:通过融合蛋白抑制HUVEC微管形成
将HUVEC(1.5x104个细胞/孔)置于96-孔经基质胶(Matrigel)涂布的盘中。在5%CO2、37℃的环境下添加六种用量的融合蛋白1(0.1μM、0.3μM、1μM、3μM、10μM、及30μM)及媒介物进各孔的生长基中。于18小时培养期间后,通过显微照相评估内皮细胞管(endothelial cell tube)的型态,其类似于类微血管网。自各照片测量对总微管长度的干扰(抗血管新生),并相对于媒介物对照组测定。然后测定对微管形成的最低抑制浓度(MIC≧30%),并用以评估抗血管新生的程度。在所有实验中使用苏拉明(Suramin)作为抗血管新生的正对照组(正对照组5)。
经测试的融合蛋白1的微管形成的抑制(IC50)测定为小于0.1μM,融合蛋白1显示较正对照组4为高的活性效力。微管形成检定的结果显示于表5中。图7A-图7G提供示意图,显示当融合蛋白1分别以0.1μM、0.3μM、1μM、3μM、10μM、及30μM的用量添加时,融合蛋白1对微管形成的抑制效果。
表5
测试材料 | IC50(μM) |
正对照组5(苏拉明) | 15.8 |
正对照组4(SEQ ID NO:13) | 5.9 |
融合蛋白1(SEQ ID NO:16) | <0.1 |
实施例8-通过融合蛋白在荷兰黑带兔中抑制VEGF诱导的渗漏
本发明融合蛋白是在血管渗透性的体内模式中测试,以测定其在预防血管渗漏中的功效。在此模式中,将VEGF以玻璃体内注射的方式,注射至兔眼的玻璃体中,以诱导不受控的视网膜渗漏。阿普西柏(采视明,雷杰纳隆)为一由人类VEGFR1及VEGFR2的部分融合至人类IgG1的Fc部分所组成的重组融合蛋白、及贝伐珠(bevacizumab)(癌思停),罗氏(Roche))通过抑制VEGF-A来阻断血管生成的重组人源化单株抗体;分别纳入作为对照组2及6。
在一实施例中,医药组合物含有20,000微克/毫升的融合蛋白1,该融合蛋白1是在包含25mM组胺酸缓冲液、20mM NaCl、6%(重量/体积)蔗糖、0.03%(重量/体积)聚山梨醇酯且pH 6.0的调配物缓冲液中。
使用活宁液(isoflurane)(3至5%)麻醉荷兰黑带兔,且以眼用必达净(Betadine)溶液处理其眼睛。然后以灭菌生理食盐水清洗兔眼,施用盐酸利多卡因(lidocainehydrochloride)(2%注射液)或丙对卡因(proparacaine)至眼睛表面。
第1天,荷兰黑带兔是使用BD 300微升胰岛素注射器(31线规x 5/16英寸),经玻璃体内注射预决定剂量的本发明融合蛋白、媒介物(负)对照组、或参考(正)对照组。该注射针穿过眼的背颞象限(dorsotemporal quadrant),大约在缘后3至4毫米及上直肌侧3至4毫米,递送50微升的液体。第3天,通过对相同眼睛注射外源的VEGF165来诱导血管渗漏。
在注射VEGF 3天后,对所有给药的组别进行荧光血管摄影(fluoresceinangiogram,FA),并使用从0(正常)至4(严重)的量尺评估其渗漏及曲折度。
在以融合蛋白给药之前、VEGF诱导之前及评估之前,使用德莱兹(Draize)评分系统来评分眼部刺激的征象。根据德莱兹分析,在开始给药之前所有兔子的眼睛都是正常的。在玻璃体内给药后,在所有给药组别中都观察到短暂的最小的眼部发炎征象,其为玻璃体内的注射所造成。在研究过程中并未发现药物引起的反应。
媒介物对照组相关的FA具有最高的视网膜血管分布渗漏及曲折度相关的平均分数(2.58)。二参考正对照组2及6具有0及0.25的平均分数,显示视网膜血管分布渗漏及曲折度显著降低。经测试的本发明融合蛋白具有0.417的平均分数,显示其呈现可相比于正对照组的降低VEGF所诱导视网膜渗漏及曲折度的效果。体内检定的结果显示于表6中。图8A-图8D提供代表性的FA,显示经融合蛋白1及正对照组在荷兰黑带兔中抑制VEGF诱导的渗漏。
表6
实施例9-通过融合蛋白在荷兰黑带兔中对于VEGF诱导的渗漏的剂量-反应抑制
本发明融合蛋白是以多种剂量在视网膜血管新生的体内模式中测试,以测定其在预防血管渗漏中的剂量反应功效。在此模式中,将人类VEGF165以玻璃体内注射的方式,注射至兔眼的玻璃体中,以诱导视网膜渗漏。
第1天,荷兰黑带兔经玻璃体内注射多种浓度的根据本发明实施例的融合蛋白1、媒介物(负)对照组、或参考(正)对照组。第3天,通过对相同眼睛注射外源的VEGF165来诱导血管渗漏。
经VEGF诱导3天后(第6天),对所有给药的组别进行FA,并使用从0(正常)至4(严重)的量尺评估其渗漏及曲折度。
在以融合蛋白给药之前、VEGF诱导之前及评估之前,使用德莱兹评分系统来评分眼部刺激的征象。根据德莱兹分析,在开始给药之前所有兔子的眼睛都是正常的。在玻璃体内给药后,在所有给药组别中都观察到短暂的最小的眼部发炎征象,其为玻璃体内的注射所造成。在研究过程中并未发现药物相关结果。
对第一次的外源的VEGF注射而言,媒介物对照组相关的FA具有最高的视网膜血管分布渗漏及曲折度相关的平均分数(3.4)。二参考正对照组具有0的平均分数,显示视网膜血管分布渗漏及曲折度显著降低。经测试的本发明融合蛋白(融合蛋白1)在100微克、500微克、及1000微克的剂量下分别具有0.60、0.40、及0.33的分数,显示其呈现可相比于正对照组的降低VEGF所诱导视网膜渗漏及曲折度的效果。
体内检定的剂量反应结果显示于表7中。
表7
实施例10-通过融合蛋白在大鼠中降低雷射诱导的脉络膜新生血管(CNV)的伤口大小
棕色挪威大鼠的眼睛以露睫体痹露眼药水(Cyclogyl,1%)溶液放大,并采取避光。在放大后,使用K他命及甲苯噻嗪(xylazine)的混合物来麻醉大鼠。在第1天,各眼的视网膜利用532纳米的雷射产生三处烧伤。
第3天以K他命及甲苯噻嗪的混合物麻醉动物,放大其眼,并以汉弥尔顿注射器(Hamilton syringe)配合33线规针头,经玻璃体内注射预决定剂量的5微升根据本发明实施例的融合蛋白1、媒介物(负对照组)、或正对照组2(参考)至动物的两眼中。
眼底影像(fundus image)在引入伤口前、烧伤后、及在第22天使用Micron III小动物眼底镜(Phoenix Research)拍摄以确认成功伤口。第22天,动物接受1微升/克体重的10%荧光素钠的腹腔内(IP)注射,以评估烧伤的新生血管。自荧光血管摄影(fluoresceinangiograms)测定伤口大小,并交叉比对给药组别,如图9A-图9C中所示,其中图9A显示媒介物的示意图、图9B显示正对照组2的示意图、及图9C显示融合蛋白1的示意图。在图9A-图9C中的箭头(▼)表示雷射伤口的所在位置。
实施例11-通过融合蛋白在猴子中降低雷射诱导的CNV的伤口大小
在建立于猴子中的雷射诱导CNV模式中测试融合蛋白。在各眼的黄斑部周围使用532纳米二极管雷射光凝来产生6至9处烧伤,并在同一天经玻璃体内注射0.5-4毫克的本发明融合蛋白。
20天后,以静脉注射2.5%可溶性戊巴比妥(pentobarbitone,1毫升/公斤)来镇静动物。固定眼皮使眼睛保持打开,并使用眼底相机拍摄彩色照片。
然后注射荧光染剂(20%的荧光素钠;0.05毫升/公斤)至下肢静脉中。在注射染剂后数个时间点拍摄照片,包括动脉阶段、动静脉阶段早期、及数个动静脉阶段晚期,以监测与CNV伤口相关的荧光素渗漏。
实施例12-通过融合蛋白在异种移植小鼠中抑制人类神经胶母细胞瘤生长
将人类神经胶母细胞瘤细胞株U87-MG(2.5x105个细胞/2微升,荧光素酶细胞(Luciferase cell))植入BALB/c裸鼠中,以建立原位异种移植模式(orthotopicxenograft model)。
为了评估本发明融合蛋白对肿瘤生长的抑制效果,肿瘤细胞移植入裸鼠内,且多种浓度的根据本发明实施例的融合蛋白(范围从3至30毫克/公斤)每周二次经静脉内投予至小鼠。每周测量肿瘤的生长及动物存活率,达8周。
实施例13-通过融合蛋白在博莱霉素(Bleomycin)诱导的纤维化小鼠中抑制肺纤维化
使用重20±2克的雄性C57BL/6小鼠来诱导肺纤维化,及融合蛋白对抑制肺纤维化的效果。使用活宁液麻醉动物,然后在第1天经气管内投予单一剂量1.5IU/公斤(溶于25微升的生理食盐水中)的博莱霉素。已知该剂量的博莱霉素可重复地产生肺部纤维化,且可能诱导10-20%的死亡率。
每天通过口服灌食10-50毫克/公斤的尼达尼布(Nintedanib),作为正对照组。投予体积为10毫升/公斤体重。融合蛋白媒介物通过静脉注射投予至动物,作为负对照组。未处理的对照组用于观测投予博莱霉素后肺部的病理变化。自第1天开始至第21天,一天一次静脉内投予多种剂量的融合蛋白1及媒介物。每天进行包括体重的临床观察。动物在第22天牺牲。搜集支气管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid),以调查细胞数及TGF-β1。
为了评估本发明融合蛋白对纤维化形成的抑制效果,移除肺组织并在缓冲液中均质化,以测量相较于标准曲线的羟脯胺酸(hydroxyproline)变化。进行其他组织病理学实验,以收集纤维化及发炎专一性生物标记的表现。
虽然已详述本发明细节,且参照其特定实施例,然而对本技术领域中具通常知识者而言,在不悖离其精神与范围下可在其中作多种变化及修饰。
Claims (21)
1.一种融合蛋白,其特征在于,其包含:
一结合整合蛋白的胜肽,其选自由以下所组成的群组:去整合蛋白、抗整合蛋白αvβx抗体、抗整合蛋白α5β1抗体、靶向整合蛋白αvβx或α5β1的纤维黏连蛋白、及其结合整合蛋白的片段;
其他结合蛋白的胜肽以靶向一血管新生因子;以及
一可结晶区(Fc)结构域;
其中,该x为1、3、5、6或8。
2.一种融合蛋白,其特征在于,其包含:
一结合整合蛋白的胜肽,其具有一选自由以下所组成的群组的胺基酸序列:SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6及SEQ ID NO:7,或一与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6及SEQ ID NO:7具有至少85%序列同一性的胺基酸序列;
其他结合蛋白的胜肽,其包含VEGF受体的胞外结构域;以及
一Fc结构域;
其中,该结合整合蛋白的胜肽在精胺酸-甘胺酸-天冬胺酸(RGD)区域上或相邻处具有至少一突变。
3.一种融合蛋白,其特征在于,其包含:
一结合整合蛋白的胜肽,其包含去整合蛋白及其结合整合蛋白的片段;
其他结合蛋白的胜肽,其包含VEGF受体的胞外结构域;以及
一Fc结构域;
其中,该结合整合蛋白的胜肽在RGD区域上或相邻处包含至少一突变。
4.一种融合蛋白,其特征在于,其包含:
一结合整合蛋白的胜肽,其选自由以下所组成的群组:一具有至少一在RGD区域上或相邻处的突变的SEQ ID NO:1胺基酸序列、一与SEQ ID NO:1具有至少85%序列同一性的胺基酸序列、及一SEQ ID NO:2胺基酸序列;
一人类或人源化的恒定亚区,其包含免疫球蛋白的一CH2结构域、及一CH3结构域;
其他结合蛋白的胜肽,其具有一VEGFR1的类免疫球蛋白结构域D2、及一VEGFR2的类免疫球蛋白结构域D3。
5.如权利要求1、2或3所述的融合蛋白,其特征在于,其自C-端至N-端包含该结合整合蛋白的胜肽、该Fc结构域、及该其他结合蛋白的胜肽。
6.如权利要求1、2或3所述的融合蛋白,其特征在于,其自N-端至C-端包含该结合整合蛋白的胜肽、该Fc结构域、及该其他结合蛋白的胜肽。
7.如权利要求1-4中任一项所述的融合蛋白,其特征在于,该结合整合蛋白的胜肽与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQID NO:7具有至少85%的序列同一性。
8.如权利要求7所述的融合蛋白,其特征在于,该结合整合蛋白的胜肽与SEQ ID NO:2具有至少85%的序列同一性。
9.一种核酸,其特征在于,其编码该如权利要求1-4中任一项的融合蛋白。
10.一种如权利要求1-4中任一项的融合蛋白的二聚体。
11.一种载体,其特征在于,其包含一编码如权利要求1-4中任一项的融合蛋白的核苷酸序列。
12.一种用于制备一融合蛋白的方法,其特征在于,其包含在制备该融合蛋白的条件下培养一宿主细胞,其中该宿主细胞包含一编码如权利要求1-4中任一项的融合蛋白的核酸,以及重获该宿主细胞所制备的融合蛋白。
13.一种用于治疗/预防一血管新生性疾病的方法,其特征在于,其包含对一有需要的个体投予一有效量的如权利要求1-4中任一项的融合蛋白。
14.如权利要求1-4中任一项所述的融合蛋白,其特征在于,其还包含一连接子序列,该连接子序列是位于该结合整合蛋白的胜肽与该其他结合蛋白的胜肽之间。
15.如权利要求1-4中任一项所述的融合蛋白,其特征在于,其还包含一讯息胜肽序列,该讯息胜肽序列是在该其他结合蛋白的胜肽的上游。
16.如权利要求1所述的融合蛋白,其特征在于,该血管新生因子包含:血管生成素(ANG)、酪胺酸蛋白激酶(Eph)、纤维母细胞生长因子(FGF)、神经纤毛蛋白(NRP)、血纤维蛋白溶酶原活化物、尿激酶型血纤维蛋白溶酶原活化物受体(uPAR)、血小板衍生生长因子(PDGF)、肿瘤生长因子-β(TGF-β)、血管内皮生长因子(VEGF)、血管内皮钙黏蛋白(VE-cadherin)、类胰岛素生长因子(IGF)、结缔组织生长因子(CTGF)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、介白素-1(IL-1)、介白素-6(IL-6)、颗粒球巨噬细胞株刺激因子(GM-CSF)、及其受体。
17.一种组合物,其特征在于,其包含如权利要求1-4中任一项的融合蛋白、及一医药上能够接受的佐剂、载剂、或赋形剂。
18.如权利要求13所述的方法,其特征在于,该血管新生性疾病包含:类风湿性关节炎、炎症性关节炎、骨关节炎、眼部及系统性癌症、与肿瘤相关的转移及入侵、系统性纤维化疾病(其包括:原发性肺纤维化(IPF)、非酒精性脂肪肝炎(NASH)或肝纤维化、糖尿病肾病变及/或肾纤维化、皮肤纤维化或蟹足肿、伤口愈合、心肌纤维化、缺血性中风)、具有新生血管或缺血的特征的眼部疾病(例如,脉络膜新生血管)、眼色素层炎、色素性视网膜炎、老年性黄斑退化(AMD)、糖尿病视网膜病变、及糖尿病黄斑水肿(DME)。
19.如权利要求2或3所述的融合蛋白,其特征在于,该VEGF受体的胞外结构域包含一VEGF受体的类免疫球蛋白结构域D1至D7。
20.如权利要求2或3所述的融合蛋白,其特征在于,该VEGF受体的胞外结构域包含(i)一VEGFR1的类免疫球蛋白结构域D2、及一VEGFR2的类免疫球蛋白结构域D3;(ii)SED IDNO:10的胺基酸序列;或(iii)一与SED ID NO:10具有至少90%同一性的胺基酸序列。
21.如权利要求1-3中任一项所述的融合蛋白,其特征在于,其还包含一GS或G9连接子,该连接子是位于该结合整合蛋白的胜肽或该其他结合蛋白的胜肽与该Fc结构域之间。
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