CN101495515A - 免疫原性降低的高亲和力人及人源化抗α5β1整联蛋白功能阻断性抗体 - Google Patents

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本发明涉及以高亲和力结合于α5β1整联蛋白并阻断其功能的重组人多肽或人源化多肽。此外，本发明披露了所述多肽的诊断及药物用途。

Description

免疫原性降低的高亲和力人及人源化抗α5β1整联蛋白功能阻断性抗体
本发明涉及以高亲和力结合于α5β1整联蛋白并阻断其功能的重组人多肽或人源化多肽。此外，披露了所述多肽的诊断及药物用途。
血管生成是新血管从先前存在的血管中发育的过程。新血管的生长促进胚发育、伤口愈合和雌性繁殖周期。它也在实体癌和其它疾病例如血管瘤、糖尿病性视网膜病变、年龄相关性黄斑变性、银屑病、类风湿性关节的病理发展并可能在骨关节炎和炎性肠病的病理发展中发挥重要作用(1)。
由低含氧量的肿瘤组织释放的生长因子刺激了新血管生成。尽管生长因子及其受体在血管生成出芽中发挥重要作用，然而与胞外基质(ECM)粘着也是血管生成的激发调节物。粘着促进内皮细胞存活及内皮增殖和移行(2-5)。一种ECM蛋白尤其纤连蛋白表达在临时(肿瘤)基质中并向血管细胞提供增殖信号(2，3)。值得注意地，无纤连蛋白的小鼠在发育中因综合缺陷而早期死亡，所述的综合缺陷包括不适当形成的脉管系统(6，7)。
在实验动物模型和在突变小鼠中的研究表明α5β1整联蛋白作为纤连蛋白的最重要受体在调节血管生成中发挥作用。这种整联蛋白的胚性缺失诱导了早期及致死性间充质异常，这包括新生脉管系统(8，9)的构造缺陷和内皮细胞体外形成脉管样结构的能力缺陷(10，11)。
α5β1整联蛋白的表达尤其与血管生成相关：α5β1整联蛋白在静止的内皮中检测不到，但是在应答于血管生成生长因子(3，4)时体外表达或在生长的肿瘤的血管生成性脉管系统中体内表达(12，20，21)。
Kim等(3)可以证实小鼠抗α5β1整联蛋白-功能阻断性抗体IIA1在体内抑制生长因子诱导的血管生成和肿瘤血管生成。研究当α5β1整联蛋白受拮抗时所转导的信号表明未结合的受体激活了PKA，后者随后激活胱天蛋白酶3和8并且诱导凋亡(2，13)。
已经开展工作以制备小鼠抗体IIA1的人源化衍生物(BD Pharmingen产品目录号555614)。因此，产生了称作M200的82％人/18％小鼠的嵌合IgG4单克隆抗体。此外，已经产生M200的单价Fab-片段(称作F200)并在用于黄斑变性的猕猴(cynomolgus monkey)模型中成功测试。然而进一步试图制备M200的完全人源化抗体衍生物则导致生物学活性的严重丧失(14)。
在人类医学中目前抗α5β1整联蛋白的已知抗体如M200或F200的任何应用存在诱导人患者中免疫原性人抗嵌合抗体(HACA)应答的风险。因此，本发明的目的旨在提供人抗α5β1整联蛋白抗体，其与现有抗体相比具有减少的免疫原性，同时保留靶特异性和高生物学活性及亲和力。
根据本发明，使用α5β1整联蛋白转染的细胞，通过噬菌体展示法从
Figure A20078002651700071
抗体文库分离Fab形式的全人抗体。这些抗体显示高度的体外活性，同时因人类来源而可以在人患者中期望低的免疫原性。
因此，本发明的第一方面是这样的人抗体或人源化抗体或其抗原结合片段，其(i)以100nM并优选以≤10nM的亲和力结合于α5β1整联蛋白并且(ii)体外和体内地抑制表达α5β1整联蛋白的细胞与其受体粘着。
本发明的多肽是人抗体或人源化抗体或其抗原结合片段。根据本发明，术语“人抗体”涉及这样的抗体分子，其具有基本上人的或全人的可变结构域以及(若存在)人恒定结构域。如本申请中所用，术语“人”涉及可以在人类个体中形成的或通过利用源于人类个体的共有序列形成的序列，例如，如Kabat等(1991)，Sequences of Proteins of immunological Interest，第五版，NIH出版编号91-3242，美国卫生和福利部，Washington，DC在相应的摘要中描述那样。术语“基本上人的”指可以不同于如Kabat所述的“全人”序列至多到1、2、3、4或5个氨基酸的序列。更具体地，本发明的抗体或抗体片段包含免疫球蛋白重链(H)和轻链(L)中基本上或完全的人可变框架区。术语“人源化抗体”在本发明的含义中涉及这样的抗体分子，其具有基本上小鼠的或全小鼠的可变结构域和人的或基本上人的恒定结构域，并且是＞82％、优选至少90％并且特别优选至少98％人源的。术语“小鼠”如本申请中所用涉及在啮齿动物个体中或通过利用源于啮齿动物个体的共有序列形成的序列。术语“基本上小鼠的”指可以不同于“全小鼠”序列至多到1、2、3、4或5个氨基酸的序列。优选地，抗体或其抗体片段是IgG抗体，例如人的或人源化的IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体或其片段，例如Fab、Fab′或(Fab)2片段。然而，本发明也涉及具有人序列的重组抗体(例如单链(sc)抗体)或其片段，例如scFv片段。
本发明的抗体或抗体片段含有特异性地相互作用于α5β1整联蛋白的一个或多个抗原-结合位点。优选地，这种抗原结合特性通过组合可变重链(VH)区和可变的轻链(VL)区获得。VH或VL区包括框架区(FR1、FR2、FR3和FR4)和介导抗原结合的CDR区(VH区的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3和VL区的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3)。
本发明的人抗体或人源化抗体或抗体片段优选地具有针对α5β1整联蛋白的亲和力，其对应于≤100nM、优选≤10nM并最优选≤1nM的KD值，其中该亲和力如实施例中所述通过在α5β1阳性人HUVEC细胞上的FACS滴定法或通过竞争BIAcore或竞争ELISA测量法确定。
此外，本发明的多肽体外抑制表达α5β1整联蛋白的人肿瘤细胞(例如Lozzio(1979)，Leukemia Research，3：363-370研究的K562细胞(ATCC登录号：CCL-243))的粘着，如实施例中所述。优选地，所述抗体或抗体片段在≤10nM和优选≤5nM的浓度(IC50)上显示50％细胞粘着抑制。
此外，本发明的多肽优选地能够诱导HUVEC细胞中的胱天蛋白酶活性。对应于HUVEC生存力的IC50值优选地是≤10nM，更优选是≤5nM，其中IC50值(50％生存力)如实施例中所述确定。
此外，本发明的多肽、抗体和抗体片段可以优选地用于诊断并用于预防及治疗肿瘤和癌症，尤其结肠癌。
所述的多肽、抗体和抗体片段可以与可检测标记基团(如放射性标记基团、NMR、染料、酶和荧光标记基团)缀合。放射性基团可以例如是I125、I113或Y90。
优选地，本发明的抗体或抗体片段包含：
(a)VH区，其选自
(iii)氨基酸序列SEQ ID NO：1(MOR04624)、SEQ IDNO：3(MOR04055)或所述VH区之一的至少一个H-CDR1、H-CDR2和/或H-CDR3区，或
(iv)通过改变至少一个H-CDR区而从(i)的序列衍生的氨基酸序列，和/或
(b)VL区，其选自
(v)氨基酸序列SEQ ID NO：2(MOR04624)、SEQ IDNO：4(MOR04055)或所述VL区之一的至少一个L-CDR1、L-CDR2和/或L-CDR3区，或
(vi)通过改变至少一个L-CDR区而从(i)的序列衍生的氨基酸序列。
特别优选这样的抗体或抗体片段，其包含通过H-CDR2区的随机化而从如上所述的(a)(i)的VH区中衍生的VH区。
在另一个特别优选的实施方案中，抗体或抗体片段包含通过L-CDR3区的随机化而从如上所述的(b)(i)的VL区中衍生的VL区。
在又一个特别优选的实施方案中，抗体或抗体片段包含通过抗体链的改组作用而从(a)(i)的VH区或和/或从(b)(i)的VL区衍生的VH区和/或VL区。
H-CDR2和L-CDR3的亚文库通过蛋白质工程方法分别将H-CDR2和L-CDR3与人CDR库交换而产生(17)。
例如，抗体或抗体片段包含从如SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2(MOR04624)中描述的VH和/或VL区所衍生的VL和/或VH区。特别优选这样的多肽，包含：
(a)选自氨基酸序列SEQ ID NO：5(MOR04971)、SEQ IDNO：7(MOR04974)、SEQ ID NO：9(MOR04975)、SEQ IDNO：11(MOR04977)和SEQ ID NO.11(MOR04985)的VH区，或所述VH区的至少一个H-CDR1、H-CDR2和/或H-CDR3区，和/或
(b)选自氨基酸序列SEQ ID NO：6(MOR04971)、SEQ IDNO：8(MOR04974)、SEQ  ID  NO：10(MOR04975)、SEQ  IDNO：12(MOR04977)和SEQ ID NO：14(MOR04985)的VL区，或所述VL区的至少一个L-CDR1、L-CDR2和/或L-CDR3区。
本发明多肽的具体实例如下：
抗体或抗体片段，包含SEQ ID NO：1的VH区和SEQ ID NO：2的VL区(MOR04624)或其至少一个H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3区。
抗体或抗体片段，包含SEQ ID NO：3的VH区和SEQ ID NO：4的VL区(MOR04055)或其至少一个H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3区。
抗体或抗体片段，包含SEQ ID NO：5的VH区和SEQ ID NO：6的VL区(MOR04971)或其至少一个H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3区。
抗体或抗体片段，包含SEQ ID NO：7的VH区和SEQ ID NO：8(的VL区MOR04974)或其至少一个H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3区。
抗体或抗体片段，包含SEQ ID NO：9的VH区和SEQ ID NO：10的VL区(MOR04975)或其至少一个H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3区。
抗体或抗体片段，包含SEQ ID NO：11的VH区和SEQ ID NO：12的VL区(MOR04977)或其至少一个H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3区。
抗体或抗体片段，包含SEQ ID NO：13的VH区和SEQ ID NO：14的VL区(MOR04985)或其至少一个H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3区。
本发明还涉及针对抗原上相同表位的抗体或抗体片段，如上文提及的优选和/或举例的抗体或抗体片段。
所述多肽的VH和VL链包含以下区：
MOR04624、MOR04055和衍生物的VH链(根据(17)的编号方案)：
-框架1区从第1位氨基酸延伸至第30位氨基酸
-CDR1区从第31位氨基酸延伸至第35位氨基酸
-框架2区从第36位氨基酸延伸至第49位氨基酸
-CDR2区从第50位氨基酸延伸至第65位氨基酸
-框架3区从第66位氨基酸延伸至第94位氨基酸
-CDR3区从第95位氨基酸延伸至第102位氨基酸
-框架4区从第103位氨基酸延伸至第113位氨基酸
MOR04624和衍生物的VLκ1链(根据(17)的编号方案)：
-框架1区从第1位氨基酸延伸至第23位氨基酸
-CDR1区从第24位氨基酸延伸至第35位氨基酸
-框架2区从第36位氨基酸延伸至第50位氨基酸
-CDR2区从第51位氨基酸延伸至第57位氨基酸
-框架3区从第59位氨基酸延伸至第89位氨基酸
-CDR3区从第90位氨基酸延伸至第98位氨基酸
-框架4区从第99位氨基酸延伸至第109位氨基酸
MOR04055和衍生物的VLκ1链(根据(17)的编号方案)：
-框架1区从第1位氨基酸延伸至第23位氨基酸
-CDR1区从第24位氨基酸延伸至第35位氨基酸
-框架2区从第36位氨基酸延伸至第50位氨基酸
-CDR2区从第51位氨基酸延伸至第57位氨基酸
-框架3区从第58位氨基酸延伸至第89位氨基酸
-CDR3区从第90位氨基酸延伸至第98位氨基酸
-框架4区从第99位氨基酸延伸至第109位氨基酸
VH链和/或VL链的框架区可以通过交换一个或多个氨基酸例如1、2、3、4或5个氨基酸加以改变。例如，VLκ1链的框架3区可以在MOR04624家族的成员中加以改变。优选地，在Fab序列第85位置处的氨基酸是可交换的，以缬氨酸(MOR04624、MOR04985)交换成苏氨酸(MOR04974、-75、-77)为特别优选。此外，VH链的框架1区可以加以改变。在优选的实施方案中，可以交换在每个VH-Fab序列第3位置处的氨基酸。特别优选谷氨酰胺(q)交换成谷氨酸(e)，这可以例如在克隆期间进行。
本发明的多肽适合用于治疗或诊断用途，例如用于体外或体内诊断用途。
对于治疗用途，抗体或抗体片段可以原样使用。或者，多肽可以是带有治疗剂的缀合物形式，所述的治疗剂例如选自放疗剂或化疗药，例如低分子量或生物性细胞抑制剂或细胞毒性剂。所述治疗剂可以根据已知方法缀合于抗体或抗体片段，优选地经共价连接与多肽的活性氨基、羧基、羟基和/或巯基缀合，任选地使用同双官能性接头或异双官能性接头。
在其它实施方案中，此多肽可以是融合蛋白形式，所述的融合蛋白包含抗体或抗体片段结构域和异源融合结构域，例如细胞因子如IL-2、IL-12或TNF-α。本发明抗体或抗体片段的其它治疗相关性融合伴侣包括用以增加或减少免疫效应细胞召集的工程化IgG Fc部分、蛋白质毒素如RNA酶或ETA、小药物分子如美登素(maytansine)或auristatin衍生物、用于活化前体药物的酶、带有阻断其它整联蛋白功能的拮抗物的融合蛋白或带有具备血管生成活性的酶如MMP-2或MMP-9的融合蛋白(15)。此外，融合蛋白可以是双特异性抗体形式，所述的双特异性抗体包含如上文所述的至少一个结合α5β1整联蛋白的结构域和对其它抗原特异的结合结构域。例如，第二抗原结合结构域可以针对用于诊断性和/或治疗性放射性核素(例如α、β或γ发射的放射性核素如90Y)的螯合剂、诊断性NIR(近红外型)染料、治疗活性染料、免疫效应细胞(例如NK-细胞、细胞毒T-细胞或NKT-细胞)上的表面分子、功能性阻断抗VEGF结合结构域和针对VEGF受体1、2与3及细胞因子(如白细胞介素)的功能性阻断结合结构域。
对于诊断用途，所述多肽可以是带有可检测标记基团(例如用于体外或体内诊断用途的标记基团)的缀合物形式。例如，所述可检测标记基团可以选自放射性、NMR、染料、酶和荧光(例如NIR荧光)标记基团。
对于治疗用途，将多肽优选地配制成药物组合物，所述的药物组合物还可以包含其它活性成分和/或可药用的载体、稀释剂和/或辅药。该药物组合物包含治疗活性剂量的活性成分，其中所述的治疗活性剂量可以由技术人员根据标准方法例如通过体外实验或在动物模型中确定。该组合物优选地通过输注、注射或吸入加以施用。活性成分的剂量根据疾病的类型及严重性和待治疗患者的基本状况确定。优选地，治疗组合物以几个剂量经至少2-4周时间施用。在这种情况下，参考用于施用抗体或抗体缀合物的已知方案(例如，如在Ferrara Nature Reviews Drug Discovery，第3卷，2004年5月，391-400和Salgaller，Current Opinion in Molecular Therapeutics，2003，5(6)，657-667描述)或参考用于施用药用抗体如利妥昔单抗、阿仑珠单抗、英利昔单抗等的方案。
此外，本发明涉及包含如上文所述的抗体或抗体片段作为诊断试剂的诊断组合物。该诊断组合物可以包含其它诊断可用的试剂、载体、稀释剂和/或辅药。该诊断组合物以足够在相应的测定模式(如在体内或体外诊断性测定模式)中提供诊断性检测的量包含所述多肽。
该组合物可以用于α5β1整联蛋白相关性病症中的治疗性或诊断性用途。例如，这些病症可以是过度增殖性疾病，例如与血管生成和/或转移相关的病症，尤其癌症。可以由本发明组合物治疗的癌症包含全部种类的实体肿瘤，例如结肠、肾、肺、前列腺、乳腺、脑、胃、肝脏或皮肤的癌。或者，该组合物可以用于治疗与血管生成相关的血液性癌症中。与新血管形成相关的其它病症包括，但不限于子宫内膜异位、血管瘤、类风湿性关节炎、骨关节炎、动脉粥样硬化、炎性肠病、炎性CNS病、银屑病、眼病如糖尿病性视网膜病变或年龄相关性黄斑病和肥厚性瘢痕。在优选的实施方案中，该组合物的抗血管生成活性不依赖生长因子。
该组合物可以包含一种或几种抗体或抗体片段，例如与α5β1整联蛋白的不同结构域结合的抗体或抗体片段的组合。该组合物也可以含有小分子药物用于联合疗法。该组合物合适在人医学和兽医学中使用。特别优选在人类医学中使用。
此外，本发明涉及编码如上文所述的抗体或抗体片段或融合多肽的核酸。此核酸可以例如是单链或双链DNA或RNA。优选地，该核酸有效地连接于提供在合适宿主细胞或宿主生物中表达的表达控制序列。该核酸可以存在于可导入宿主细胞或宿主生物中的载体或载体系统(即多种载体)内。载体可以是适于原核细胞的原核载体，例如质粒或噬菌粒。此外，载体可以是用于真核宿主细胞或宿主生物的真核载体，例如质粒、人工染色体或病毒载体。合适载体例如在Sambrook(1989)，Molecular Cloning，a LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press和Ausubel(1989)，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons中描述。
本发明也指涉及用如上文所述核酸或载体转化的细胞，例如原核细胞或真核细胞，如人细胞。此外，本发明涉及用如上文所述核酸或载体转化的非人生物，例如转基因动物，如转基因非人哺乳动物。术语“转化”包括用于将外来核酸导入细胞或生物的全部方法，包括转染法或感染法。
多肽可以通过在这样的条件下培养如上文所述的细胞或非人生物来制备，在所述条件下表达该多肽并回收表达的多肽，例如从细胞、细胞培养基、生物或该生物的分泌物中回收。
此外，本发明将在以下附图和实施例中详细地说明。
图1A：FACS分析K562细胞的α5表达：
用功能阻断性抗α5β1整联蛋白小鼠单克隆抗体IIA1(14)证实人α5β1整联蛋白在活K562细胞的细胞表面上的表达。为此目的，使用如在MorphoSys提供的GOLD手册中描述的标准FACS方法。
图1B：人结肠癌细胞系HT29不表达α5整联蛋白链：
FACS分析表明HT29细胞不表达α5整联蛋白链，其中β1链高密度地存在于该细胞表面上。出于该原因，HT29细胞非常适于用α5整联蛋白链转染。
图1C：人结肠癌细胞系HT29在用α5整联蛋白cDNA转染后表达α5β1整联蛋白：
在用α5整联蛋白转染后，使用功能阻断性小鼠抗人α5β1整联蛋白单克隆抗体IIA1作为参考，由FACS分析法证实α5β1整联蛋白在HT29α5细胞表面上的均匀表达。
图2：抑制K562细胞对纤连蛋白包被的培养平板粘着：
在功能阻断性(IIA1)或非阻断性(VC5)抗α5β1整联蛋白小鼠单克隆抗体存在下孵育用钙荧光素预载的K562-细胞。使用10mM EDTA确定K562-细胞与纤连蛋白发生整联蛋白非依赖性背景结合。在BSA封闭的孔内确定该测定法的整体背景，其中所述的孔不支持K562细胞对培养平板表面的粘着。将贴壁细胞(在洗涤后)裂解并测定荧光。
图3：Fab介导对K562细胞与纤连蛋白粘着的剂量依赖性抑制：
对抗人α5β1特异性Fab测试其抑制载有荧光染料的K562细胞与固定化纤连蛋白结合的能力。在粘着后，将细胞裂解并确定荧光，作为贴壁细胞的度量。单独的纤连蛋白表现最大粘着，而在BSA包被的细胞上确定该测定法的整体背景。
图4：抗α5β1-功能阻断性抗体在内皮细胞中诱导凋亡：
使用在无血清内皮细胞培养基中的HUVEC细胞确定单价形式的纯化Fab对胱天蛋白酶3/7活化的诱导。使用市售的化学发光测定系统(CaspaseGlo，PROMEGA)根据制造商说明书测定胱天蛋白酶活性。
图5：Fab和IIA1的竞争FACS法：
FACS竞争法显示MOR04624与参考抗体IIA1竞争HT29α5细胞上的表位。可以得出的结论是这两种抗体共有相似的表位，而全部其它Fab与α5β1整联蛋白上的不相关结合位点反应(黑色线表示Fab结合，绿色线表示当与参考抗体IIA1竞争时的Fab结合)。
图6：亲和力成熟的抗α5β1-功能阻断性抗体强烈地在内皮细胞中诱导凋亡：
使用在无血清内皮细胞培养基中的HUVEC细胞确定单价形式的纯化Fab对胱天蛋白酶3/7活化的诱导。使用市售的化学发光测定系统(CaspaseGlo，PROMEGA)根据制造商说明书测定胱天蛋白酶活性。
图7：亲和力成熟的抗α5β1-功能阻断性Fab抗体抑制内皮细胞增殖：
将贴壁的HUVEC细胞在无血清内皮细胞培养基中于所示量的纯化Fab或参考抗体IIA1存在下孵育48小时。用市售XTT测定法根据制造商说明书确定正在增殖的细胞。测定IC50值并汇总于表4。
图8：HUVEC粘着测定法中的优化IgG：
通过α5β1功能阻断性IgG抗体抑制HUVEC细胞对纤连蛋白的粘着。IgG MOR04974、MOR04975、MOR04977、MOR04985以相似于IIA1的IC50阻断粘着。从Fab至IgG的转变引起大约2倍改善。
图9：HUVEC生存力测定法-对抗α5β1整联蛋白IgG的分析：
通过α5β1功能阻断性IgG抗体抑制HUVEC细胞的生存力。将HUVEC细胞铺在纤连蛋白包被的平板内，与递增浓度的IgG抗体孵育并且在48小时后测量存活。IgG MOR04974、MOR04975、MOR04977、MOR04985以相似于IIA1的IC50阻断粘着。从Fab至IgG的转变引起大约2倍改善。
图10：对抗α5β1整联蛋白IgG的HUVEC胱天蛋白酶测定法：
使用在无血清内皮细胞培养基中的HUVEC细胞确定由α5β1功能阻断性IgG抗体对胱天蛋白酶3/7活化的诱导。使用市售的化学发光测定系统(CaspaseGlo，PROMEGA)根据制造商说明书测定胱天蛋白酶活性。MOR04974、MOR04975、MOR04977和MOR04985具有相似于参考抗体IIA1的活性。
图11：亲和力成熟的Fab特异性地从表面生物素化细胞裂解物中沉淀α5β1整联蛋白：
HT29α5和HT29wt的表面生物素化NP40-裂解物与偶联至Dyna珠的Fab孵育。将免疫沉淀物转移至PVDF膜并用链霉抗生物素-碱性磷酸酶(AP)分析。全部Fab特异性地从HT29α5裂解物中沉淀出与参考抗体IIA1预期大小相当的蛋白质，而在HT29wt裂解物中检测不到任何蛋白质。无关FabMOR03207没有特异性地沉淀出任何蛋白质。
图12：抗α5β1整联蛋白IgG(实例MOR04974)对HT29-wt和HT29α5(FACS测量法)的结合特异性：
亲和力成熟的IgG抗体以10μg/mL与5×105个HT29wt和HT29α5细胞孵育。用Cy3标记的第二抗体检测特异性结合的抗体。上半部分：与HT29wt(左)或HT29α5细胞(右)孵育的IIA1，下半部分：IgG1 MOR04974。荧光迁移表示与α5整联蛋白的特异性结合并且以MOR04975、MOR04977、MOR04985和MOR04624找到这种荧光迁移。抗体同种型对照呈阴性(黑色线)。我们的抗整联蛋白抗体以与参考抗体IIA1相同的特异性结合于α5-链转染的细胞。
图13：抗α5β1整联蛋白IgG(实例MOR04974)与IIA1在HT29α5细胞上的竞争结合作用(FACS测量法)。抗α5β1整联蛋白IgG与IIA1竞争重叠表位：
自产的抗α5β1整联蛋白抗体以1μg/mL与5×105个HT29α5细胞孵育，其中所述的HT29α5细胞与或不与20μg/mL IIA1预孵育。通过用山羊-抗小鼠-FITC的检测证实存在IIA1结合作用(左半部分)。通过用羊-抗人-FITC第二抗体的检测证实人抗体(MOR04974)的结合及竞争(右半部分)。本实施例显示MOR04974的竞争作用。以MOR04975、MOR04977、MOR04985、MOR04624得到相同结果。
图14：在管形成测定法中分析IgG1抗α5β1整联蛋白抗体(实例MOR04974)。亲和力优化的抗α5β1整联蛋白IgG1抗体如IIA1一样高效地阻断管形成：
将低代人脐静脉内皮细胞(HUVEC #2519)以60-80％融合收获并且将2×104个细胞接种在EBM-2培养基(Clonetics #CC3156)中的含有基质胶(Becton Dickinson #354234)的孔内。15分钟后添加抗体并且允许管形成在37℃进行18-24小时。随后将细胞固定(4％福尔马林)、透化、封闭并用抗CD31染色。抗体以6nM、3nM、600pM、300pM和60pM施加。代表性图像显示的是在300pM上的该效应。A：未处理的样本，B：人IgG1抗溶菌酶MOR03207，C：IgG1MOR04624，D：IgG1 MOR04974，E：IIA1，F：小鼠IgG1。对MOR04975和MOR04977也得到相同结果。
图15：亲和力优化的抗α5β1整联蛋白IgG抗体在跨孔移行测定法中的活性：
移行测定法在96-孔跨孔移行微量平板(8μm孔，#351163 Falcon/BD)中进行，以纤连蛋白作为唯一刺激物。Fluoroblok膜的底面用纤连蛋白在37℃包被1小时并用2％BSA在37℃封闭30分钟。使用含有0.1％BSA的人内皮无血清培养基(Invitrogen)作为在上半腔室和下半腔室中的移行缓冲液。抗α5β1整联蛋白抗体(0.6-10μg/mL)添加至各孔的上半腔室，添加低代HUVEC(2×104)并且使细胞移行在37℃进行4小时。对所述膜底面上的移行细胞随后进行钙荧光素染色并且产生的荧光用Perkin Elmer 1220Victor计数仪在485nm激发和535nm发射处确定。
A：所示图像在10μg/mL抗体浓度上获得。MOR04974、MOR04975、MOR04977如IIA1一样高效地抑制HUVEC移行。
B：MOR04974、-75、-77(IgG4-Pro抗体同种型)的抗移行活性的剂量反应。IC50(MOR04974：1μg/ml，MOR04975：1.5μg/ml，MOR04977：1μg/ml，IIA1：2μg/ml)。
图16：亲和力优化的IgG1抗α5β1整联蛋白抗体在结肠癌组织上的IHC染色模式：
放大率10×，在结肠癌的系列组织切片上滴定生物素化抗体。用链霉抗生物素-碱性磷酸酶实行检测。作为一个实例，显示了用浓度2.5μg/mL获得的免疫组织化学切片。对于IIA1和MOR04974，找到了微小至中等大小的血管和基质区室。黑色箭头表示用这两种抗体染色的相同血管。对MOR04975和MOR04977观察到相似的染色模式。蓝色箭头表示染色的血管。可以得出的结论是优化的抗α5β1整联蛋白抗体显示与IIA1相当的染色模式。
图17：亲和力优化的抗α5β1整联蛋白抗体(IgG4-Pro)的肿瘤导向作用：
抗α5β1整联蛋白抗体用碘-125放射性标记(1分钟，四氯二苯基苷脲法)。测定剩余的免疫反应性是75-80％并且将3μg标记抗体注射至HT29α5异种移植的裸鼠中。
A：IgG1 MOR04974、MOR04975和对照(参考抗体IIA1和抗溶菌酶MOR03207)的肿瘤摄取，B：IgG1 MOR04977和对照的肿瘤摄取。
抗α5β1整联蛋白抗体的抗体摄取与IIA1相似并且与无关IgG1MOR03207相比显著较高。从该结果得出的结论是抗α5β1整联蛋白抗体特异性地靶向α5β1整联蛋白阳性的HT29α5异种移植物。
图18：在血管生成作用3D体内球状体替代模型中分析优化的抗α5β1整联蛋白IgG抗体：
将含有限定数目的内皮细胞以及VEGF和FGF2的球状体的基质胶塞皮下植入SCID小鼠中。在用优化的人抗α5β1整联蛋白抗体和对照抗体处理后，分析带有小鼠脉管系统的复杂网络的EC出芽和血管形成。人IgGMOR04974和MOR04975与IIA1一样有效。
本发明进一步在实施例中说明。然而，以下实施例不理解为是限制性的。
实施例
1.功能阻断性抗α5β1整联蛋白抗体的产生
1.1筛选策略
小鼠单克隆抗体IIA1与α5β1整联蛋白的构象表位结合，该表位仅存在于激活的活(内皮)细胞上。为涵盖选择性和功能活性，建立这样的筛选途径用以鉴定Fab形式的
Figure A20078002651700181
GOLD衍生的前导抗体候选物，其中所述的筛选途径由在分离的抗原和表达抗原的细胞上交替淘洗联合基于细胞的功能性筛选测定法组成：
1.使用
Figure A20078002651700182
文库(MorphoSys)，通过噬菌体展示法选择抗α5β1整联蛋白结合性Fab抗体片段。淘洗实验在分离的抗原和表达抗原的细胞上进行。基于最佳抗体克隆的氨基酸序列，使用人CDR序列，通过VL-CDR3或VH-CDR2的随机化作用产生亚文库并且在进一步淘洗实验中从所述亚文库选择出更高级的结合物。其它克隆通过将含有目的VL-CDR3和VH-CDR2的轻链及重链组合克隆在一个抗体分子中获得(″X-克隆作用″)。
2.如下进行对富集的Fab-抗体的筛选。在α5β1整联蛋白阳性及α3β1整联蛋白阴性细胞上对全部淘洗实验的结合物测试ELISA结合作用。随后进一步在FACS实验中在α5-过量表达的细胞和α5-阴性细胞上分析ELISA阳性克隆的细胞结合作用。随后在功能性测定法中对合适的克隆分析i)细胞与纤连蛋白粘着，ii)诱导HUVEC(人脐静脉内皮细胞)和/或HDMVEC(人真皮血管内皮的细胞)凋亡，iii)用参考抗体IIA1的亲和力测量法及FACS竞争测定法和iv)物种交叉反应性。
1.2工具生成和测定法开发
α5整联蛋白链cDNA
人α5-链的cDNA从RZPD(IMAGE-ID 6821577)购买并且根据标准方法克隆到pcDNA3表达载体(INVITROGEN)。
纯化的整联蛋白受体
去垢剂增溶的人整联蛋白受体α5β1(Chemicon CC1052)和α3β1(Chemicon CC1092)从CHEMICON INTERNATIONAL(Temecula，CA，USA)购买。对于固相噬菌体展示法、ELISA和BiaCore测定法而言，通过非变性SDS-PAGE选出具有至少90％纯度的整联蛋白批次。
细胞系
人慢性粒细胞白血病细胞系K562(ATCC登录号：CCL-243)对纤连蛋白的粘着仅由α5β1整联蛋白介导(16)。该细胞系用在纤连蛋白介导的粘着测定法中用于初始的功能性筛选。使用检测抗体IIA1，通过FACS分析法证实α5β1整联蛋白的存在(图1A)。
差异性细胞淘洗策略的前提是存在一种模型系统，其中目的靶过量表达于靶-阴性细胞系上。为此目的，已经选择到表达β1整联蛋白链而不表达α5-链的人结肠癌细胞系HT29(ATCC登录号：HTB-38)(图1B)。使用Lipofectamine根据制造商说明书，将α5-链的cDNA转染至亲代HT29-细胞。使用用以特异性地标记表面表达的α5β1整联蛋白的小鼠单克隆抗体IIA1，通过FACS筛选法选择出过量表达α5的稳定克隆(图1C)。
粘着测定法
使用仅表达人α5β1整联蛋白的K562细胞系建立用于功能性筛选的敏感粘着测定法。为此目的，用1μg/ml人纤连蛋白或BSA作为非黏附性底物包被96孔平板，以确定该测定法的整体背景。因为整联蛋白对ECM分子的粘着依赖Ca2+/Mg2+的存在，故使用10mM EDTA来确定对纤连蛋白的不依赖整联蛋白的背景结合。使用功能阻断性抗体IIA1作为参考物并且非阻断性抗α5β1整联蛋白小鼠单克隆抗体(VC5)充当阴性抗体对照。
如所期望，EDTA、IIA1(5μg/ml)和BSA包被作用均抑制K562介导的粘着结合，而VC5(5μg/ml)不干扰细胞粘着(图2)。
1.3抗体噬菌体展示和淘洗策略
根据文献中所述的方案(17-20)，以文库开展用以鉴定全人抗α5β1整联蛋白抗体的抗体噬菌体展示法。应用以下淘洗策略并平行进行(表1)
  淘洗次级编号   第一轮   第二轮   第三轮
  1298.1-3   α5β1整联蛋白固相   α5β1整联蛋白固相   α5β1整联蛋白固相
  1298.4-6   α5β1整联蛋白固相   K562细胞   α5β1整联蛋白固相
  1299.1-3   K562细胞   α5β1整联蛋白固相   K562细胞
  1321.1-3   α5β1整联蛋白固相   HT29α5细胞   α5β1整联蛋白固相
  1322.1-3   HT29α5细胞p.a.HT29wt   α5β1整联蛋白固相   HT29α5细胞
  1322.4-6   HT29α5细胞p.a.HT29wt   HT29α5细胞p.a.HT29wt   HT29α5细胞
  1324.1-3   HDMVEC   α5β1整联蛋白固相   HDMVEC
  1369.1-2   α5β1整联蛋白固相   HT29α5细胞p.a.HT29w   α5β1整联蛋白固相
  1371.1-2   HT29α5细胞p.a.HT29wt   α5β1整联蛋白固相   HT29α5细胞p.a.HT29w
表1：淘洗方法概览
p.a：用HT29wt吸附后(以减少非特异性细胞表面结合)
结果：
在淘洗1298-1324期间，筛选出几千个克隆。尽管应用多种展示策略，然而反复分离到在ELISA和FACS中呈选择性的一个克隆(MOR04055)。除了明显结合至免疫优势表位的MOR04055之外，还鉴定到4个额外克隆(MOR04139、04141、04160、04568)。为进一步提高选择到更多样和更特异的整联蛋白结合物的几率，进行额外的两次淘洗(1369.1-2和1371.1-2)。这里，在噬菌体展示期间添加10μg/ml MOR04055-Fab以便抑制占优势的克隆MOR04055富集。尽管存在Fab竞争，经淘洗1369所找到的全部特异性结合物还是MOR04055。在淘洗1371中，鉴定到一个额外的单独结合物(MOR04624)。
1.4功能性测试Fab-抗体
粘着测定法
从第一淘洗方法获得的抗体根据它们在预筛选实验中的功能阻断效力进行如下排序：MOR04624＞MOR04055＞MOR04141＝MOR04568＝MOR04160。MOR04139具有轻度抑制性，但未达到50％抑制。抗体在K562粘着测定法中在不同浓度下的剂量依赖性再测试证实了预筛选实验的结果，不过存在一个例外：MOR04139未显示任何剂量依赖性抑制。未进一步研究该抗体(图3)。
诱导凋亡
进一步评估从第一淘洗方法所获得抗体的凋亡诱导特性。因而将96孔平板用0.2μg/ml和0.4μg/ml纤连蛋白在37℃包被1小时并用2％BSA封闭。1×104个HUVEC细胞与各自抗体在用于内皮细胞培养的无血清培养基(Gibco)中一起孵育。在18小时后，将胱天蛋白酶3/7测定试剂盒根据制造商所述的方法(CaspaseGlo 3/7；Promega)用于细胞裂解并定量胱天蛋白酶活性。在100μg/ml浓度上，单价Fab MOR04055和04624在HUVEC细胞中诱导与10μg/ml上的双价参考IgG IIA同样强烈的胱天蛋白酶3/7活性(图4)。全部其它Fab在本测定法中是阴性的。
通过FACS滴定法的亲和力测量
为在天然α5β1整联蛋白上分析结合效能，通过FACS滴定法在α5β1-阳性HUVEC细胞上测试全部抗体(表2)。MOR04055具有最高结合亲和力(0.9nM)并且其二聚体IgG形式的结合亲和力增加。对于MOR04624，发现单价Fab的KD处在低的纳摩尔范围内，并且其二聚体IgG的KD增加。
  MOR   KD(nM)单价Fab   KD IgG
  04055   0.9   0.5
  04139   无可靠拟合(no rel.fit)   未测定
  04624   7.5   3.1
  IgG IIA1   -   0.6/1.0
表2：通过FACS滴定法确定单价Fab和IgG亲和力的结果。
Fab和IIA1的竞争FACS
为研究Fab抗体是否与IIA1共有相同的表位，将HT29α5细胞仅与0.5μg/ml Fab孵育或还与10μg/ml IIA1一起孵育。以用于FACS分析的山羊抗人Fab-特异性-PE缀合物检测与细胞结合的人Fab。图7显示仅Fab染色(黑色线)和Fab+IIA1(绿色线)的叠加。作为结果，添加IIA1导致MOR04624的染色强度明显降低。全部其它Fab不受IIA1影响。该结果表明IIA1与MOR04624相互竞争结合至相同或重叠的表位上，而其它4种Fab结合至不相关的表位上。
1.5亲和力-成熟：对Fab和IgG抗体的分析
Fab MOR04055和04624接受一轮亲和力成熟处理。因此，通过VL-CDR3或VH-CDR2的随机化作用(17)从亲代Fab中构建亚文库并在纯化的α5β1和HT29α5细胞上进行噬菌体展示选择。将这种筛选法的阳性结合物在粘着测定法中在HT29α5细胞上进一步分析并根据其抑制活性排序。发现MOR04624的衍生物具有最佳抑制效能。MOR04055、MOR04568、MOR04141的衍生物仅显示中等的抑制改善或不显示显著抑制改善。基于这些克隆的重链和轻链，克隆VL-CDR3和VH-CDR2的12种新组合用于进一步优化(所谓的″X-克隆作用″)。将最佳抑制性克隆和来自X-克隆作用的克隆表达并纯化并且进行体外比较，从而逐步鉴定出具有改善的功能阻断性活性的7种强化的独特结合物用于进一步详细分析(MOR04971、-72、-74、-75、-77、-85、-87)。
诱导凋亡
在HUVEC细胞上的体外凋亡诱导作用通过胱天蛋白酶活性和细胞存活测量(图6和图7)。在这两种测定法中，单价Fab MOR04974、04975和04977的效力与双价小鼠单克隆参考抗体IIA1是可比的。
  IC50(μg/ml)   IC50(nM)
  IIA1   0.05   0.3
  MOR04624   11.25   225.0
  MOR04985   0.09   1.8
  MOR04987   0.12   2.4
  MOR04977   0.09   1.9
  MOR04975   0.09   1.8
  MOR04974   0.06   1.2
  MOR04055   1.87   37.3
  MOR04971   0.21   4.3
  MOR04972   0.67   13.3
表3：Fab抗体在XTT-增殖测定法中的IC50值
与亲代Fab相比，亲和力成熟的抗体得以明显改善(至多到190倍)。单价Fab抑制增殖作用的效率比双价参考抗体IIA1低四倍。
免疫沉淀法
为证实Fab抗体的特异性，表面生物素化HT29α5和HT29wt细胞的NP-40裂解物与偶联至Dyna磁珠的Fab孵育。使用IIA1作为参考抗体。在密集洗涤后，将沉淀物在还原条件下在DS-PAGE样本缓冲液中煮沸，印迹至PVDF-膜上并用链霉抗生物素-AP探测。全部抗α5β1整联蛋白抗体特异性地沉淀出约135kDa的蛋白质双条带，其对应于整联蛋白链a5和β1的预期分子量(图11)并且在HT29wt细胞裂解物中未找到。用IIA1找到相同的双条带。使用无关Fab MOR03207作为阴性对照并且未沉淀出所述双条带。该结果证实了Fab抗体的高度特异性。
HUVEC粘着测定法中优化的IgG
为研究上文所述Fab抗体的体外效能是否在二聚体形式下进一步得以改善，将所述抗体根据标准技术，使用MorphoSys HuCAL IgG载体试剂盒(MorphoSys AG，Munich；Germany)转化成完整的IgG1分子并通过HUVEC粘着测定法(图8)、HUVEC生存力测定法(图9)和HUVEC凋亡测定法(图10)分析，以与参考抗体IIA1比较。
最重要地，在每个实验中包含IIA1作为参考点。在此方面，MOR04974、-75及-77的IgG转化产生与IIA1具有极相似IC50的HuCAL IgG，这表明与单价Fab形式相比，转化的确导致约2倍的改变。
HUVEC生存力测定法中优化的IgG
观察到在IgG转化后，5种结合物与Fab形式相比具有约2倍改善的IC50值。MOR04974、-75和-77在降低HUVEC生存力方面显示与参考IgG IIA1极相似的效力。
HUVEC凋亡测定法中优化的IgG
从胱天蛋白酶3/7测定法内对前导IgG的分析中，可以得出结论：MOR04974、-75和-77与参考抗体IIA1可比较地良好诱导凋亡。
1.6对亲和力优化的抗整联蛋白IgG抗体的详细分析
亲和力优化的抗整联蛋白抗体的特异性
通过FACS分析在HT29wt与HT29α5细胞上测试IgG1形式的亲和力成熟抗体的结合特异性。HT29wt细胞是α5-阴性的，但的确含有β1整联蛋白链。HT29α5而非HT29wt细胞特异性地由IgG1-抗整联蛋白抗体和参考抗体IIA1识别，如荧光迁移所示(图12)。非特异性抗体同种型对照不与此细胞结合并且未观察到所测量荧光的迁移。这些实验显示前导候选抗体特异性地识别α5整联蛋白并以与参考抗体IIA1相同的特异性发生结合。
抗α5β1整联蛋白抗体的表位特异性在亲和力成熟和再克隆成IgG形式后仍保留
已经通过FACS竞争实验证实Fab抗体MOR04624及其衍生物与参考抗体IIA1竞争结合至重叠表位上。在转化成IgG1形式后，再次测试抗α5β1整联蛋白抗体与IIA1的结合竞争作用。IgG1抗α5β1整联蛋白抗体MOR04974、-75、-77、-85和MOR04624对HT29α5细胞的结合导致荧光迁移，其中所述的荧光迁移在细胞与IIA预孵育时受到完全抑制。该结果证实IIA1与IgG1抗α5β1整联蛋白抗体的表位竞争作用(图13)。
在管形成血管生成测定法中对抗α5β1整联蛋白IgG1抗体的定性分析
将阻断活化的内皮细胞新形成血管视为抗α5β1整联蛋白抗体的关键抑制活性之一。为充分表征，在HUVEC管形成测定法中，与参考抗体IIA1相比而分析亲和力优化的IgG1抗α5β1整联蛋白抗体。
在本测定法中，2×104个人脐静脉内皮细胞(UVEC#2519，Promocell)接种在EBM-2培养基(Clonetics#CC3156)中的生长因子丰富基质胶(BectonDickinson#354234)上。15分钟后添加抗体(6nM、3nM、600pM、300pM、60pM)并且允许管形成在37℃进行18-24小时。随后将细胞固定并用抗CD31染色用于管形成的光记录
对孔内形成的复杂网络的肉眼分析揭示出全部MOR04624衍生性抗α5β1整联蛋白抗体均具有管形成阻断活性，它们的效能与参考抗体相似(图14)。在高浓度上，对人和小鼠IgG1同种型对照也发现管形成的抗体阻断作用。然而，在较低的抗体浓度(下降至300pM)上，观察到活性窗口，在其中管形成仅在用特异性抗体处理的孔内被阻断，而在未处理的孔或用抗体同种型对照或弱功能阻断性抗体MOR04624处理的孔内则不被阻断。
在移行测定法中对抗α5β1整联蛋白IgG抗体的分析
在血管生成过程期间，活化的内皮细胞在主要由纤连蛋白(FN)组成的血管生成特异性临时基质上向血管生成刺激物移行。我们在跨孔移行测定法中分析了优化的抗α5β1整联蛋白IgG抗体并对全部抗α5β1抗体观察到α5β1-纤连蛋白依赖性HUVEC移行的阻断活性，其中所述的抗α5β1抗体具有与IIA1相同数量级别的效力(1-10μg/ml)(图15)。
抗α5β1整联蛋白抗体的反应性
在肿瘤和内皮细胞系上的反应性
通过FACS结合实验在多种内皮和肿瘤细胞系上测试抗α5β1整联蛋白抗体的反应性(表4)。观察到与全部受测试内皮和肿瘤细胞系的结合作用，除了已知为α5-链阴性的HT29wt细胞外。与参考抗体IIA1相比，前导候选抗体同等地充分接合于全部受测试细胞系并且所得的荧光迁移对于全部抗体是相似的。同种型对照抗体不结合。总而言之，抗α5β1整联蛋白抗体在FACS细胞结合实验中显示与IIA1同等的反应性。
Figure A20078002651700261
抗α5β1抗体在正常组织切片和肿瘤组织切片上的反应性-免疫组织化学
在免疫组织化学实验中在不同组织上分析了亲和力优化的抗α5β1整联蛋白抗体并且所述抗整联蛋白抗体在相应组织上的特异反应性与IIA1的染色极为相似。总而言之，可得出结论：我们的抗α5β1整联蛋白抗体显示与IIA1可比较的染色模式(图16)。
亲和力优化的抗α5β1整联蛋白IgG抗体的体内表征
体内靶向作用在异种移植的裸鼠中的证实
与IIA1相比，在携带HT29α5细胞的异种移植物的裸鼠中比较优化的抗α5β1整联蛋白抗体的体内靶向特性。
优化的抗α5β1整联蛋白抗体(IgG4-Pro)的放射性标记根据四氯二苯基苷脲法用碘-125依据标准程序进行1分钟。在细胞结合测定法(“Lindmo测定法”)中测量免疫反应性。50ng放射性标记的抗体与递增数目(0.25-10Mio)的α5β1整联蛋白阳性细胞在4℃孵育2小时。随后洗涤细胞并在闪烁计数仪中确定结合的放射性活性。将总计数/结合计数的商对细胞数目的倒数作图并且数据用非线形回归模型拟合。从与Y轴的交叉中计算在无限抗原密度下的剩余免疫反应性并且发现它对于全部抗α5β1整联蛋白抗体是75-80％。
除MOR04975之外，对于全部所分析抗体而言，人抗α5β1整联蛋白抗体从24小时范围内以＞10％ID/g聚集至HT29α5异种移植物，持续96小时，其中所述的MOR04975在48小时后迅速下降至72小时后小于5％ID/g。MOR04974在48小时后以18％ID/g达到其峰值并且MOR04977在72小时后以18％ID/g达到其峰。相比之下，小鼠IIA1抗体从24小时范围内以＞10％ID/g聚集在HT29α5异种移植物处，持续至多到96小时。对于非特异性抗溶菌酶抗体MOR03207，在任何时间点上存在小于3％ID/g。从这些结果中，可以得出结论：对α5β1阳性HT29α5异种移植物存在特异性靶向作用。抗α5β1整联蛋白抗体MOR04974和MOR04977的体内靶向作用与IIA1相似并且在单个时间点上甚至优于IIA1。
来自血管生成替代动物模型的抗α5β1整联蛋白抗体的体内效力
作为参考抗体IIA1，抗α5β1整联蛋白抗体不与小鼠及大鼠的α5β1整联蛋白交叉反应。因此，在动物模型中分析体内治疗效力和证实特异性体内血管生成效果是困难的并且这些分析不得不在血管生成的替代模型中进行。
抗α5β1整联蛋白IgG抗体与IIA1的体内比较已经在血管生成作用3D体内球状体替代模型中进行(图18)。
对于此模型，限定内皮细胞数目的球状体与胶原混合，其中使所述的胶原在24孔平板中聚合。位于含有VEGF和FGF2的基质胶塞中的EC球状体随后皮下置入SCID小鼠，在此处受刺激的EC形成人毛细血管的复杂三维网络，其与小鼠脉管系统吻合。每周给予抗α5β1整联蛋白抗体(200μg)两次，持续3周。在第21日终止该研究，取出基质胶塞并检验血管密度。就参考抗体IIA1而言，用优化的抗α5β1整联蛋白IgG抗体MOR04974和MOR04975的处理降低基质胶塞中微血管密度达系数每平方毫米2至大约20条微血管，而用无关人抗溶菌酶抗体MOR03277的处理导致每平方毫米约40条微血管。
基于这个结果，可以得出结论即优化的人抗α5β1整联蛋白抗体MOR04974和MOR04975在血管生成作用3D体内球状体替代模型中具有与IIA1可比较的体内抗血管生成效力。
结论：
在体外实验中，对MOR4974、-75、-77始终发现了在Fab形式以及IgG1形式下的最佳抑制特性。全部三种IgG与参考mAb IIA1是可比较的。这些结合物是MOR04624的衍生物。在体内实验中，证实全人的且优化的IgGMOR04974、-75、-77高效地靶向裸鼠中及血管生成作用3D球状体模型中的肿瘤异种移植物。MOR04974和MOR04975与参考抗体IIA1一样有效。以上抗体的V链的氨基酸序列示于表4：
亲代MOR04624
最终hIgG1κ    VH-h-IgG1-载体    VL-h-κ-载体
MOR04974       MOR04985          MOR04990
MOR04975       MOR04985          MOR04991
MOR04977       MOR04987          MOR04989
MOR04985       MOR04985          MOR04624
MOR04624
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MOR04977
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2.结论：
抗α5β1整联蛋白功能阻断性抗体仅在嵌合抗体形式下可获得。用于完全人源化的方法目前不成功。此类抗体在临床环境下的应用可以诱导人患者中的免疫应答。尤其对于长期使用的抗血管生成性化合物，这可以导致剂量增加或甚至导致可以造成治疗早期终止的副作用。
我们鉴定了具有优异生物学特图谱的完全人的α5β1整联蛋白功能阻断性抗体。其优于现存的小鼠抗体和嵌合抗体，原因在于完全人类本质，这将确保在临床环境下尽可能地不存在副作用。预期诱导针对这种分子的免疫应答及具有严重副作用和/或剂量增加的概率大大降低。因此，这些分子更合适人类医学中应用，例如用于治疗实体肿瘤。
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Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Glu
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    50                  55                  60
Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
65                  70                  75                  80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
                85                  90                  95
Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Gly Asp Tyr Gly His His His Gly Leu Ser
            100                 105                 110
Gly Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
<210>11
<211>108
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<221>DOMAIN
<222>(1)..(108)
<223>VLk
<400>11
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Asn
            20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65                  70                  75                  80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Asn Pro Gln Thr
                85                  90                  95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr
            100                 105
<210>12
<211>128
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<221>DOMAIN
<222>(1)..(128)
<223>VH
<400>12
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Phe Ile Glu Pro Lys Trp Arg Gly Gly Ala Thr His Tyr Ala Ala
    50                  55                  60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
65                  70                  75                  80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
                85                  90                  95
Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Gly Asp Tyr Gly His His His Gly Leu Ser
            100                 105                 110
Gly Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
<210>13
<211>108
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<221>DOMAIN
<222>(1)..(108)
<223>VLk
<400>13
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln GlyIle Ser Ser Asn
            20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65                  70                  75                  80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Asp Gln Ser Tyr Thr
                85                  90                  95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr
            100                 105
<210>14
<211>128
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<221>DOMAIN
<222>(1)..(128)
<223>VH
<400>14
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Gly Ile Arg Ala Lys Gln Ser Gly Tyr Ala Thr Asp Tyr Ala Ala
    50                  55                  60
Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
65                  70                  75                  80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
                85                  90                  95
Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Gly Asp Tyr Gly His His His Gly Leu Ser
            100                 105                 110
Gly Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125

Claims (44)

1.人抗体或人源化抗体或其抗原结合片段，其以≤100nM的亲和力结合于α5β1整联蛋白并且体外和体内抑制表达α5β1整联蛋白的细胞与其受体粘着。
2.权利要求1所述的抗体或片段，其以≤10nM的亲和力结合于α5β1整联蛋白。
3.权利要求1或2所述的抗体或抗体片段，其体外抑制K562细胞系的粘着。
4.权利要求1-3任一项中所述的抗体或抗体片段，其包含：
(a)VH区，其选自
(i)氨基酸序列SEQ ID NO：1(MOR04624)、SEQ ID NO：3(MOR04055)或所述VH区之一的至少一个H-CDR1、H-CDR2和/或H-CDR3区，或
(ii)通过改变至少一个H-CDR区而从(i)的序列衍生的氨基酸序列，和/或
(b)VL区，其选自
(i)氨基酸序列SEQ ID NO：2(MOR04624)、SEQ ID NO：4(MOR04055)或所述VL区之一的至少一个L-CDR1、L-CDR2和/或L-CDR3区，或
(ii)通过改变至少一个L-CDR区而从(i)的序列衍生的氨基酸序列。
5.权利要求4所述的抗体或抗体片段，包含通过H-CDR2区的随机化而从(a)(i)的VH区衍生的VH区。
6.权利要求4或5所述的抗体或抗体片段，包含通过L-CDR3区的随机化而从(b)(i)的VL区衍生的VL区。
7.权利要求4-6任一项中所述的抗体或抗体片段，包含通过抗体链的改组作用而从(a)(i)的VH区或和/或从(b)(i)的VL区衍生的VH区和/或VL区。
8.权利要求4-7任一项中所述的抗体或抗体片段，包含
(a)VH区，其选自氨基酸序列SEQ ID NO：5(MOR04971)、SEQ IDNO：7(MOR04974)、SEQ ID NO：9(MOR04975)、SEQ ID NO：11(MOR04977)和SEQ ID NO.11(MOR04985)，或所述VH区的至少一个H-CDR1、H-CDR2和/或H-CDR3区，和/或
(b)VL区，其选自氨基酸序列SEQ ID NO：6(MOR04971)、SEQ IDNO：8(MOR04974)、SEQ ID NO：10(MOR04975)、SEQ ID NO：12(MOR04977)和SEQ ID NO：14(MOR04985)，或所述VL区的至少一个L-CDR1、L-CDR2和/或L-CDR3区。
9.抗体或抗体片段，包含SEQ ID NO：1的VH区和SEQ ID NO：2的VL区(MOR04624)或其至少一个H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3区。
10.抗体或抗体片段，包含SEQ ID NO：3的VH区和SEQ ID NO：4的VL区(MOR04055)或其至少一个H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3区。
11.抗体或抗体片段，包含SEQ ID NO：5的VH区和SEQ ID NO：6的VL区(MOR04971)或其至少一个H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3区。
12.抗体或抗体片段，包含SEQ ID NO：7的VH区和SEQ ID NO：8的VL区(MOR04974)或其至少一个H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3区。
13.抗体或抗体片段，包含SEQ ID NO：9的VH区和SEQ ID NO：10的VL区(MOR04975)或其至少一个H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3区。
14.抗体或抗体片段，包含SEQ ID NO：11的VH区和SEQ ID NO：12的VL区(MOR04977)或其至少一个H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3区。
15.抗体或抗体片段，包含SEQ ID NO：13的VH区和SEQ ID NO：14的VL区(MOR04985)或其至少一个H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3区。
16.权利要求1-15任一项中所述的抗体或抗体片段，其是IgG抗体，例如人或人源化IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体或其片段，例如Fab、Fab′或F(ab)2片段。
17.权利要求1-15任一项中所述的抗体或抗体片段，其是重组抗体，例如单链(sc)抗体或其片段，例如sc Fv片段。
18.权利要求1-17任一项中所述的抗体或抗体片段，其形式为带有治疗剂的缀合物。
19.权利要求18所述的抗体或抗体片段，其中所述的治疗剂选自放疗剂和化疗药。
20.权利要求19所述的抗体或抗体片段，其中所述的放疗剂是I125、I131或Y90。
21.权利要求1-17任一项中所述的抗体或抗体片段，其形式为融合多肽。
22.权利要求21所述的抗体或抗体片段，其是与细胞因子融合的融合多肽或是双特异性抗体。
23.权利要求1-17任一项中所述的抗体或抗体片段，其形式为带有可检测标记基团的缀合物。
24.权利要求23所述的抗体或抗体片段，其中所述的可检测标记基团选自放射性标记基团、NMR、染料、酶和荧光标记基团。
25.权利要求24所述的抗体或抗体片段，其中所述的可检测放射性标记基团选自I125、I131或Y90。
26.药物组合物，包含权利要求1-25任一项中所述的抗体或抗体片段作为活性成分。
27.权利要求26所述的组合物，用于预防或治疗过度增殖性疾病。
28.权利要求26或27所述的组合物，用于预防或治疗癌症。
29.权利要求26或27所述的组合物，用于预防或治疗结肠癌。
30.权利要求26或27所述的组合物，用于预防或治疗肿瘤。
31.诊断组合物，包含权利要求1-17或23-24任一项中所述的抗体或抗体片段作为诊断试剂。
32.权利要求32所述的组合物，用于诊断过度增殖性疾病或其易感性。
33.权利要求32所述的组合物，用于诊断癌症或其易感性。
34.权利要求26-33任一项中所述的组合物，用于人类医学中。
35.核酸，其编码权利要求1-17或21-22任一项中所述的抗体或抗体片段。
36.权利要求35所述的核酸，其有效连接于表达控制序列。
37.载体或载体系统，其包含权利要求35或37所述的核酸。
38.细胞，其用权利要求35或36所述的核酸或用权利要求37所述的载体转化。
39.非人生物体，其用权利要求35或36所述的核酸或用权利要求37所述的载体转化。
40.用于制备权利要求1-17或21-22任一项中所述多肽的方法，其中在所述多肽被表达并且所表达的多肽被回收的条件下培养权利要求38的细胞或权利要求39的非人生物体。
41.权利要求1-25任一项中所述多肽用于制造用以预防或治疗α5β1整联蛋白相关性病症或其易感性的药物的用途。
42.权利要求41的用途，用于制造用以预防或治疗癌症的药物。
43.权利要求1-25任一项中所述多肽用于制造用以诊断α5β1整联蛋白相关性病症或其易感性的试剂的用途。
44.权利要求43的用途，用于制造用以诊断癌症的试剂。
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