JP6502856B2 - 抗インテグリンβ１抗体組成物及びその使用方法 - Google Patents

抗インテグリンβ１抗体組成物及びその使用方法 Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年１２月２６日に出願された米国特許出願第６１／７４６，０２３号に対する恩典を３５ＵＳＣ§１１９（ｅ）のもとで主張する。先の出願の開示は本出願の開示の一部であると見なされ、その全体が参照によって本出願に組み入れられる。
配列表の組入れ
添付の配列表におけるデータは参照によって本出願に組み入れられる。名称ＯＮＣＯ１１００＿１ＷＯ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇの添付の配列表テキストファイルは２０１３年１２月２３日に作られ、８１ＫＢである。ＷｉｎｄｏｗｓのＯＳを使用するコンピュータでマイクロソフトワードを用いてファイルにアクセスすることができる。
発明の分野
本発明は一般に免疫の分野に関するものであり、さらに具体的には抗インテグリン抗体及びその使用方法に関する。
背景情報
癌は先進国における死亡の主要な原因の１つであり、米国だけでも年当たり５０万人を超える死亡を生じている。１００万人を超える人々が米国では毎年、癌であると診断され、概して、３人に１人を超える人々が生涯を通して何らかの形の癌を発症すると推定される。２００を超える異なる型の癌が存在するが、乳癌、肺癌、結腸直腸癌及び前立腺癌などのそれらのうちの４つが、新しい症例全体の過半数を占めている。
乳癌は女性における最も一般的な癌であり、１２％の女性が生涯でその疾患を発症するリスクがあると推定される。早期検出及び改善された治療のために死亡率は減ってきているが、乳癌は依然として中年女性における死亡の主要な原因である。さらに、転移性乳癌はいまだに治癒不能な疾患である。初診の際、転移性乳癌のほとんどの患者は１つまたは２つの冒された臓器系を有するに過ぎないが、疾患が進行するにつれて、通常、複数の部位が関与するようになる。転移の関与の最も一般的な部位は、胸壁の皮膚及び軟組織並びに腋窩及び鎖骨上の領域における局所領域での再発である。遠隔転移の最も一般的な部位は骨（遠隔転移の３０〜４０％）、次いで肺及び肝臓である。新しく乳癌であると診断された女性の約１〜５％のみが診断の時点で遠隔転移を有するが、局所疾患を持つ患者のほぼ５０％が、最終的に５年以内に転移を伴い再発する。現在、遠隔転移の兆候からの生存期間中央値は約３年である。
乳癌の診断及び病期分類の現在の方法には、対癌米国合同委員会：ＡＪＣＣ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｔａｇｉｎｇ Ｍａｎｕａｌ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．：Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，５ｔｈ ｅｄ．，１９９７，ｐｐ １７１−１８０（非特許文献１）、及びＨａｒｒｉｓ，Ｊ．Ｒ．，Ｈｅｌｌｍａｎ，Ｓ．，Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，Ｉ．Ｃ，Ｋｉｎｎｅ Ｄ．Ｗ．（ｅｄｓ．）：Ｂｒｅａｓｔ Ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，１９９１中のＨａｒｒｉｓ，Ｊ Ｒ：「Ｓｔａｇｉｎｇ ｏｆ ｂｒｅａｓｔ ｃａｒｃｉｎｏｍａ」（非特許文献２）に記載されたような、腫瘍のサイズ、リンパ節における腫瘍の存在、及び遠隔転移の存在を頼りにする腫瘍・リンパ節転移（ＴＮＭ）方式が挙げられる。これらのパラメータを用いて予後診断を提供し、適当な治療法を選択する。腫瘍の形態的外観も評価され得るが、類似の組織的外観を持つ腫瘍が有意な臨床的変動を示し得るので、このアプローチは重大な制限を有する。最終的に、細胞表面マーカーについてのアッセイを用いて特定の腫瘍型をサブクラスに分けることができる。たとえば、エストロゲン受容体（ＥＲ）陽性乳癌はタモキシフェンまたはアロマターゼ阻害剤のようなホルモン療法に対してＥＲ陰性腫瘍よりも通常反応し易いので、乳癌の予後診断及び治療で考慮される因子の１つはエストロゲン受容体（ＥＲ）の存在である。しかしながら、これらの分析は、有用ではあるが、乳癌の臨床的挙動の部分的な予測に過ぎず、現在の診断ツールでは検出できず、現在の治療法では治療に失敗する乳癌には多くの表現型多様性が存在する。
前立腺癌は先進国の男性で最も一般的な癌であり、米国での新しい癌症例の推定３３％を占め、死亡の２番目に多い原因である。前立腺癌の早期検出である前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の血液検査の導入が生存率を劇的に改善しているので、診断時、局所及び局部的な段階の前立腺癌を有する患者の５年生存率はほぼ１００％である。しかし、５０％を超える患者が最終的には局所で進行したまたは転移した疾患を発症するであろう。
現在、前立腺全摘出及び放射線療法により、局在する前立腺癌の大半に対して治癒的治療が提供される。しかしながら、治療の選択肢は進行した症例については非常に限定される。転移疾患については、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）アゴニスト単独でのまたは抗アンドロゲンとの併用によるアンドロゲン除去が標準の治療である。しかし、最大限のアンドロゲン遮断にもかかわらず、疾患はほぼ常に進行し、大半はアンドロゲンとは無関係な疾患を発生させる。現在、ホルモン難治性の前立腺癌については一様に容認された治療はなく、化学療法が一般的に使用される。
肺癌は世界中で最も一般的な癌であり、米国では３番目に多い一般的に診断される癌であり、癌による死亡のうち群を抜いて最も多い原因である。喫煙が、すべての肺癌の推定８７％に関与すると考えられており、そのため肺癌は予防できる最も致命的な疾患である。肺癌は肺癌すべての９０％超を占める２つの主要な型：小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）と非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）に分けられる。ＳＣＬＣは症例の１５〜２０％を占め、大きな中枢気道における起源とほとんど細胞質のない小細胞のシートの組織組成を特徴とする。ＳＣＬＣはＮＳＣＬＣよりも悪性であり、急速に増殖し、転移が早くかつ頻繁である。ＮＳＣＬＣは癌すべての８０〜８５％を占め、組織学に基づいてさらに３つの主な亜型：腺癌、扁平上皮癌（類表皮癌）及び大細胞未分化癌に分けられる。
肺癌は通常、その経過の末期で症状が見つかるので、診断後たった６〜１２ヵ月の生存期間中央値を有し、５年間の全生存率はたったの５〜１０％である。外科手術が治癒の最良の機会を提供するが、好適であるのは肺癌患者のうちのほんのわずかであり、大半は化学療法及び放射線療法に頼る。これらの治療法のタイミングと用量強度を操作する試みにもかかわらず、生存率は過去１５年にわたってほとんど上昇していない。
結腸直腸癌は、世界中で３番目に最も一般的な癌であり、癌による死亡の４番目に最も多い原因である。結腸直腸癌すべてのおよそ５〜１０％は遺伝性であり、主な形態の１つは、冒された個体の約８０％が大腸腺腫様ポリポーシス（ＡＰＣ）遺伝子における生殖系列変異を含有する、常染色体優性疾患の家族性大腸腺腫様ポリープ（ＦＡＰ）である。結腸直腸癌は、周辺増殖によって局所的に浸潤する、並びにリンパ性、血行性、経腹膜性及び神経周囲の伝播により他の場所に浸潤する傾向を有する。リンパ節外の関与の最も一般的な部位は肝臓であり、肺は最も頻繁に冒される腹部外の臓器である。血行性の伝播の他の部位には骨、腎臓、副腎及び脳が挙げられる。
結腸直腸癌の現在の病期分類方式は腸壁を介した腫瘍の浸潤の程度及びリンパ節の関与の有無に基づく。この病期分類方式はＤｕｋｅの３つの主要な分類によって定義され：Ｄｕｋｅの疾患Ａは結腸または直腸の粘膜下層に限定され；Ｄｕｋｅの疾患Ｂは筋固有層を介して浸潤し、結腸または直腸の壁を貫通することができる腫瘍を有し；Ｄｕｋｅの疾患Ｃは局所リンパ節転移を伴った任意の程度の腸壁浸潤を含む。初期病期の結腸直腸癌には外科的切除が高度に有効である一方で、ＤｕｋｅのＡの患者では９５％の治癒率を提供し、ＤｕｋｅのＢの患者では率は７５％に低下し、Ｄｕｋｅの疾患Ｃにおける陽性のリンパ節の存在は５年以内の６０％の再発の可能性を予測する。術後の化学療法過程によるＤｕｋｅのＣの患者の治療は再発率を４０％〜５０％に低下させ、今やこれらの患者のケアの標準である。
頭頚部の上皮癌は頭頚領域における粘膜表面から生じ、通常、起源は扁平上皮細胞である。このカテゴリーには、副鼻腔、口腔、及び鼻咽頭、中咽頭、下咽頭及び喉頭の腫瘍が含まれる。
米国における頭頚部癌の新症例の年間数は年当たりおよそ４０，０００であり、成人の悪性腫瘍の約５パーセントを占める。頭頚部癌は一部の他の国ではさらに一般的であり、世界中の発生数は年間恐らく５０万症例を超える。北アメリカ及びヨーロッパでは、腫瘍は普通、口腔、中咽頭または喉頭から生じ、鼻咽頭癌は地中海の国々及び極東でさらに一般的である。
治療法の従来の方式（放射線療法、化学療法、及びホルモン療法）は、有用である一方で、治療耐性の癌細胞の出現によって限定されている。明らかに、頭頚部癌及び癌を一般に治療するための標的を特定する新しいアプローチが必要である。
膵臓癌は膵臓を形成する組織で生じる形質転換した細胞を起源とする悪性の新生物である。膵臓癌の最も一般的な型は、これらの腫瘍の９５％を占め、膵臓の外分泌構成要素内で生じる腺癌（光学顕微鏡で腺状構造を呈する腫瘍）である。少数は膵島細胞から生じ、神経内分泌腫瘍として分類される。膵臓癌は米国では４番目に及び世界中では８番目に多い癌関連死の原因である。
多形性膠芽腫（ＧＢＭ）は成人で最も一般的な悪性脳腫瘍であり、最大限の治療で１年未満の生存期間中央値である。今日まで、ＧＢＭ治療のためにはたった３種の薬剤しかＦＤＡによって認可されておらず、全体的な生存期間は２５年にわたって改善していない。
インテグリンは、微細環境を機械感知すること並びに正常な状態及び炎症や癌のような病理的な状態の双方で細胞外マトリクス（ＥＣＭ）が誘導するシグナル伝達を誘発することに関与する細胞接着分子である。重要なことに、インテグリンは細胞と微細環境の境界面にあって、腫瘍の進行に重要な役割を担い、増殖及び生存の経路を調節する。多数の型のインテグリンの上方調節は、特に浸潤、転移及び血管形成の過程で上皮の悪性腫瘍に関連している。重要なことに、たとえば、炎症、増殖、接着及び浸潤のような非常に広い機能的な活性を調整するβ１インテグリンは最近、複数の固形癌モデル及び造血系悪性腫瘍における治療抵抗性に関与している。重要なことに、このβ１インテグリンが介在する抵抗性は腫瘍細胞自体のレベルで生じると考えられる。上記に加えて、β１インテグリンは血管内皮細胞の移動を促進することによるＶＥＧＦ依存性及びＶＥＧＦ非依存性の血管形成のような腫瘍血管新生の間、重要な機能を有する。β１インテグリンの阻害は、複数の考えられるメカニズム：（１）血管吸収及び／または従来のＥＣＭ基質上での増殖／浸潤を防ぐこと、（２）電離放射線のような損傷の後、腫瘍細胞の生存率を低下させること、（３）腫瘍細胞の増殖を直接阻害すること、（４）血管新生過程を直接阻害すること、並びに（５）治療抵抗性の確立の後通常見られる球状増殖を含む悪性の間葉表現型を阻害することを介して、血管形成療法に対する抵抗性を克服する。
インテグリンβ１を標的とする抗体のような抗インテグリンβ１組成物は、上記で議論したような広い機能的活性におけるインテグリンβ１の役割を考えると、免疫性／炎症性の疾患及び障害でも重要であり得る。さらに、インテグリンβ１経路を介して標的とされ得る疾患及び障害には、多発性硬化症、クローン病、関節リウマチ、炎症性大腸疾患等が挙げられる。同様に、湿潤型加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）を含む特定の眼に関連する疾患も標的とされ得ることが期待できる。
対癌米国合同委員会：ＡＪＣＣ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｔａｇｉｎｇ Ｍａｎｕａｌ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．：Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，５ｔｈ ｅｄ．，１９９７，ｐｐ １７１−１８０ Ｈａｒｒｉｓ，Ｊ．Ｒ．，Ｈｅｌｌｍａｎ，Ｓ．，Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，Ｉ．Ｃ，Ｋｉｎｎｅ Ｄ．Ｗ．（ｅｄｓ．）：Ｂｒｅａｓｔ Ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，１９９１中のＨａｒｒｉｓ，Ｊ Ｒ：「Ｓｔａｇｉｎｇ ｏｆ ｂｒｅａｓｔ ｃａｒｃｉｎｏｍａ」
本発明は、インテグリンβ１に特異的に結合するヒトのフレームワーク配列を有するヒト化抗体の生成に基づく。インテグリンβ１は固形腫瘍にて過剰発現されるタンパク質であるので、癌の特徴付け、研究、診断及び治療で有用な癌細胞マーカーとして知られている。加えて、インテグリンβ１は、腫瘍微細環境からの増殖及び生存シグナルを調整することによって従来の治療法（たとえば、化学療法及び電離放射線）及び標的化療法（たとえば、トラスツズマブ、ベビシズマブ（ｂｅｖｉｃｉｚｕｍａｂ）、ラパチニブ）に対する癌の抵抗性を促進することが明らかにされている。ヒト化の試みは利用可能なヒトのフレームワークの数によって以前は制限されていた。本発明は、インテグリンβ１に特異的に結合する抗体のための追加のヒトフレームワーク配列の必要性に応える。
一実施形態では、本発明はインテグリンβ１に特異的に結合するヒト化抗体を提供する。抗体は、重鎖可変（ＶＨ）領域と軽鎖可変（ＶＬ）領域を含み、ＶＨ領域は配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するＶＨ領域に対して約９７％、９６％または９５％未満の同一性を有し、ＶＬ領域は配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するＶＬ領域に対して約９７％、９６％または９５％未満の同一性を有する。
別の実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号２９〜４３及び配列番号９１〜１００で示されるアミノ酸配列を有するＶＨ領域に対して７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％を超える同一性を有する。実施形態では、ＶＬ領域は、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号４４〜５７及び配列番号１０７〜１１６で示されるアミノ酸配列を有するＶＬ領域に対して７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％を超える同一性を有する。
別の実施形態では、抗体は、ＯＳ２９６６のようなドナー抗体に由来するＶＨ領域及びＶＬ領域のＣＤＲを有する。実施形態では、ＶＨ領域のＣＤＲは配列番号２３、配列番号２４、及び配列番号２５で示されるアミノ酸配列を有する。ＶＬ領域のＣＤＲは配列番号２６、配列番号２７、及び配列番号２８で示されるアミノ酸配列を有する。
１つの態様では、本発明は本発明のＶＨ領域及びＶＬ領域を含む抗体を提供する。
別の態様では、本発明は本発明の抗体をコードする核酸分子を提供する。
別の態様では、本発明は本発明の核酸分子を含むベクターを提供する。
別の態様では、本発明は本発明のベクターを含む単離された宿主細胞を提供する。
別の態様では、本発明は医薬組成物を提供する。一実施形態では、医薬組成物は本発明の抗体及び薬学的に許容可能なキャリアを含む。一実施形態では、医薬組成物は本発明の核酸分子及び薬学的に許容可能なキャリアを含む。
別の態様では、本発明は、検出用部分または治療用部分に連結された本発明の抗体を含むイムノコンジュゲートを提供する。
別の態様では、本発明は、サイトカインのような別のペプチドに機能的に連結された本発明の抗体を含むキメラタンパク質を提供する。
別の実施形態では、本発明は対象において疾患を治療する方法を提供する。実施形態では、方法は、本発明の抗体、本発明の核酸分子、本発明の医薬組成物、本発明のイムノコンジュゲートまたは本発明のキメラタンパク質を対象に投与し、それによって疾患を治療することを含む。一実施形態では、疾患は、癌のような細胞増殖性障害である。
別の実施形態では、本発明は、対象において疾患を検出する方法を提供する。方法は、本発明の抗体またはイムノコンジュゲートを対象に由来する試料と接触させることと、インテグリンβ１との特異的な結合を介してインテグリンβ１のレベルを検出することと、正常な試料におけるインテグリンβ１のレベルとインテグリンβ１の検出されたレベルを比較することとを含み、正常な試料と比較して対象に由来する試料におけるインテグリンβ１のレベルの上昇は疾患を示す。
別の実施形態では、本発明は、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号２９〜４３及び配列番号９１〜１００で示されるアミノ酸配列を有するＶＨ領域に対して７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％を超える同一性を有するＶＨ領域を提供する。
別の実施形態では、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号４４〜５７及び配列番号１０７〜１１６で示されるアミノ酸配列を有するＶＬ領域に対して７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％を超える同一性を有するＶＬ領域を提供する。
[本発明1001]
重鎖可変（ＶＨ）領域と軽鎖可変（ＶＬ）領域を含み、インテグリンβ1に特異的に結合するヒト化抗体であって、前記ＶＨ領域が配列番号2で示されるアミノ酸配列を有するＶＨ領域に対して約97％、96％または95％未満の同一性を有し、前記ＶＬ領域が配列番号4で示されるアミノ酸配列を有するＶＬ領域に対して約97％、96％または95％未満の同一性を有する、ヒト化抗体。
[本発明1002]
前記ＶＨ領域が、配列番号2で示されるアミノ酸配列を有するＶＨ領域に対して90％、85％、80％、または75％未満の同一性を有する、本発明1001の抗体。
[本発明1003]
前記ＶＬ領域が、配列番号4で示されるアミノ酸配列を有するＶＬ領域に対して90％、85％、80％、または75％未満の同一性を有する、本発明1001の抗体。
[本発明1004]
前記ＶＨ領域が、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号29〜43、配列番号91〜99及び配列番号100から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ領域に対して75％、80％、85％、90％、95％または99％を超える同一性を有する、本発明1001の抗体。
[本発明1005]
前記ＶＬ領域が、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号44〜57、配列番号107〜115及び配列番号116から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ領域に対して75％、80％、85％、90％、95％または99％を超える同一性を有する、本発明1001の抗体。
[本発明1006]
前記ＶＨ領域のフレームワークが、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号29〜43、配列番号91〜99及び配列番号100から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ領域のフレームワークに対して75％、80％、85％、90％、95％または99％を超える同一性を有し、前記ＶＨ領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）が配列番号23、配列番号24及び配列番号25で示されるアミノ酸配列を有する、本発明1001の抗体。
[本発明1007]
前記ＶＬ領域のフレームワークが、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号44〜57、配列番号107〜115及び配列番号116から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ領域のフレームワークに対して75％、80％、85％、90％、95％または99％を超える同一性を有し、前記ＶＬ領域のＣＤＲが配列番号26、配列番号27及び配列番号28で示されるアミノ酸配列を有する、本発明1001の抗体。
[本発明1008]
前記ＶＨ領域が配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号29〜43、配列番号91〜99及び配列番号100から成る群から選択されるアミノ酸配列を有し、前記ＶＬ領域が配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号44〜57及び配列番号107〜116から成る群から選択されるアミノ酸配列を有する、本発明1001の抗体。
[本発明1009]
前記ＶＨ領域及び前記ＶＬ領域のＣＤＲがドナー抗体に由来する、本発明1001の抗体。
[本発明1010]
前記ＶＨ領域のＣＤＲが配列番号23、配列番号24及び配列番号25で示されるアミノ酸配列を有する、本発明1009の抗体。
[本発明1011]
前記ＶＬ領域のＣＤＲが配列番号26、配列番号27及び配列番号28で示されるアミノ酸配列を有する、本発明1009の抗体。
[本発明1012]
前記ドナーがＯＳ2966である、本発明1009の抗体。
[本発明1013]
Ｆｃ領域を含む、本発明1001の抗体。
[本発明1014]
前記Ｆｃ領域がＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3、ＩｇＧ4またはそれらの変異体のものである、本発明1013の抗体。
[本発明1015]
前記Ｆｃ領域がヒトのＩｇＧ1またはＩｇＧ4である、本発明1014の抗体。
[本発明1016]
軽鎖定常領域を含む、本発明1001の抗体。
[本発明1017]
前記軽鎖定常領域がアイソタイプκのものである、本発明1016の抗体。
[本発明1018]
ｓｃＦｖまたはＦａｂである、本発明1001の抗体。
[本発明1019]
ヒト化抗体である、本発明1001の抗体。
[本発明1020]
キメラ抗体である、本発明1001の抗体。
[本発明1021]
モノクローナル抗体である、本発明1001の抗体。
[本発明1022]
インテグリンβ1への特異的結合についてＯＳ2966と競合する、本発明1001の抗体。
[本発明1023]
少なくとも10 −2 Ｍ、10 −3 Ｍ、10 −4 Ｍ、10 −5 Ｍ、10 −6 Ｍ、10 −7 Ｍ、10 −8 Ｍ、10 −9 Ｍまたは10 −10 Ｍの平衡解離定数（Ｋｄ）でインテグリンβ1に結合する、本発明1001の抗体。
[本発明1024]
ヒト集団に由来するＨＬＡ−ＤＲアロタイプの分布を有する血液試料においてＣＤ4＋ヘルパーＴ細胞応答の誘導についてインビトロで調べると、10％未満のＴ細胞応答を生じる、本発明1001〜1023のいずれかの抗体。
[本発明1025]
調べると、5％、4％、3％、2％、1％、0．5％または0．1％未満のＴ細胞応答を生じる、本発明1024の抗体。
[本発明1026]
本発明1001〜1024の1つまたは複数の抗体を含む多重特異性抗体。
[本発明1027]
本発明1001〜1025のいずれかの抗体をコードする核酸分子。
[本発明1028]
本発明1027の核酸分子を含むベクター。
[本発明1029]
発現ベクターである、本発明1028のベクター。
[本発明1030]
本発明1028または1029のベクターを含む単離された宿主細胞。
[本発明1031]
原核細胞または真核細胞である、本発明1030の宿主細胞。
[本発明1032]
哺乳類細胞である、本発明1030の宿主細胞。
[本発明1033]
本発明1001〜1025のいずれかの抗体と薬学的に許容可能なキャリアとを含む医薬組成物。
[本発明1034]
本発明1027の核酸分子と薬学的に許容可能なキャリアとを含む医薬組成物。
[本発明1035]
検出可能な部分または治療用部分に連結された本発明1001〜1025のいずれかの抗体を含むイムノコンジュゲート。
[本発明1036]
前記治療用部分が細胞傷害性部分である、本発明1035のイムノコンジュゲート。
[本発明1037]
前記治療用部分が化学療法剤である、本発明1035のイムノコンジュゲート。
[本発明1038]
前記検出可能な部分が蛍光部分である、本発明1035のイムノコンジュゲート。
[本発明1039]
対象において疾患を治療する方法であって、本発明1001〜1025のいずれかの抗体、本発明1027の核酸分子、本発明1033〜1034のいずれかの医薬組成物または本発明1035〜1038のいずれかのイムノコンジュゲートを対象に投与し、それによって前記疾患を治療することを含む、方法。
[本発明1040]
前記疾患が細胞増殖性障害である、本発明1039の方法。
[本発明1041]
前記細胞増殖性障害が癌である、本発明1040の方法。
[本発明1042]
前記癌が、治療に耐性であるか、難治性であるか、または転移性である、本発明1041の方法。
[本発明1043]
前記細胞増殖性障害が良性または悪性の腫瘍である、本発明1040の方法。
[本発明1044]
前記細胞増殖性障害が神経線維腫症Ｉ型またはＩＩ型である、本発明1043の方法。
[本発明1045]
前記疾患が炎症性疾患である、本発明1039の方法。
[本発明1046]
化学療法剤を同時投与することをさらに含む、本発明1041の方法。
[本発明1047]
対象において疾患を検出する方法であって、
（ａ）本発明1001〜1025のいずれかの抗体を前記対象に由来する試料に接触させることと、
（ｂ）インテグリンβ1との前記抗体の特異的な結合を介してインテグリンβ1のレベルを検出することと、
（ｃ）正常な試料におけるインテグリンβ1のレベルとインテグリンβ1の検出されたレベルを比較することであって、前記正常な試料と比較して前記対象に由来する試料におけるインテグリンβ1のレベルの上昇が疾患を示す、ことと
を含む、方法。
[本発明1048]
前記疾患が細胞増殖性障害である、本発明1047の方法。
[本発明1049]
前記細胞増殖性障害が癌である、本発明1048の方法。
[本発明1050]
配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号29〜43、配列番号91〜99及び配列番号100から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ領域に対して75％、80％、85％、90％、95％または99％を超える同一性を有するＶＨ領域。
[本発明1051]
配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号29〜43、配列番号91〜99及び配列番号100から成る群から選択されるアミノ酸配列を有する、本発明1050のＶＨ領域。
[本発明1052]
本発明1050及び1051のいずれかのＶＨ領域をコードする核酸分子。
[本発明1053]
配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号44〜57、配列番号107〜115及び配列番号116から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ領域に対して75％、80％、85％、90％、95％または99％を超える同一性を有するＶＬ領域。
[本発明1054]
配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号44〜57、配列番号107〜115及び配列番号116から成る群から選択されるアミノ酸配列を有する、本発明1049のＶＬ領域。
[本発明1055]
本発明1053及び1054のいずれかのＶＬ領域をコードする核酸分子。
ハイブリドーマＯＳ２９６６によって産生される抗体ＯＳ２９６６のＶＨ領域の核酸及びアミノ酸の配列を示す図である。 ハイブリドーマＯＳ２９６６によって産生される抗体ＯＳ２９６６のＶＬ領域の核酸及びアミノ酸の配列を示す図である。 本発明の抗体のＶＨ領域及びＶＬ領域で利用される、ハイブリドーマＯＳ２９６６によって産生される抗体ＯＳ２９６６のＣＤＲの解析を示す図である。 本発明の抗体のＶＨ領域及びＶＬ領域で利用される、ハイブリドーマによって産生される抗体ＯＳ２９６６のＣＤＲのアミノ酸配列を示す図である。 一実施形態における本発明の抗体のＶＨ領域の核酸及びアミノ酸の配列を示す図である。保存されたＣＤＲに下線を引く。 一実施形態における本発明の抗体のＶＨ領域の核酸及びアミノ酸の配列を示す図である。保存されたＣＤＲに下線を引く。 一実施形態における本発明の抗体のＶＨ領域の核酸及びアミノ酸の配列を示す図である。保存されたＣＤＲに下線を引く。 一実施形態における本発明の抗体のＶＨ領域の核酸及びアミノ酸の配列を示す図である。保存されたＣＤＲに下線を引く。 一実施形態における本発明の抗体のＶＨ領域の核酸及びアミノ酸の配列を示す図である。保存されたＣＤＲに下線を引く。 一実施形態における本発明の抗体のＶＬ領域の核酸及びアミノ酸の配列を示す図である。保存されたＣＤＲに下線を引く。 一実施形態における本発明の抗体のＶＬ領域の核酸及びアミノ酸の配列を示す図である。保存されたＣＤＲに下線を引く。 一実施形態における本発明の抗体のＶＬ領域の核酸及びアミノ酸の配列を示す図である。保存されたＣＤＲに下線を引く。 一実施形態における本発明の抗体のＶＬ領域の核酸及びアミノ酸の配列を示す図である。保存されたＣＤＲに下線を引く。 ベクターの模式図を示す。 抗体ＯＳ２９６６のＶＨ（配列番号２）と比較した本発明のヒト化ＶＨ鎖の配列解析及び配列アライメントを示す図である。図１５の配列は以下のとおりである：ＯＳ２９６６は配列番号２であり；変異体１は配列番号６であり；変異体２は配列番号８であり；変異体３は配列番号１０であり；変異体４は配列番号１２であり；変異体５は配列番号１４であり；変異体６は配列番号２９であり；変異体７は配列番号３０であり；変異体８は配列番号３１であり；変異体９は配列番号３２であり；変異体１０は配列番号３３であり；変異体１１は配列番号３４であり；変異体１２は配列番号３５であり；変異体１３は配列番号３６であり；変異体１４は配列番号３７であり；変異体１５は配列番号３８であり；ＶＨ２は配列番号９１であり；変異体１６は配列番号９２であり；ＶＨ４は配列番号９３であり；変異体１７は配列番号９４であり；ＶＨ５は配列番号９５であり；変異体１８は配列番号９６であり；ＶＨ６は配列番号９７であり；変異体１９は配列番号９８であり；ＶＨ７は配列番号９９であり；及び変異体２０は配列番号１００である。 抗体ＯＳ２９６６のＶＨ（配列番号２）と比較した本発明のヒト化ＶＨ鎖の配列解析及び配列アライメントを示す図である。図１５の配列は以下のとおりである：ＯＳ２９６６は配列番号２であり；変異体１は配列番号６であり；変異体２は配列番号８であり；変異体３は配列番号１０であり；変異体４は配列番号１２であり；変異体５は配列番号１４であり；変異体６は配列番号２９であり；変異体７は配列番号３０であり；変異体８は配列番号３１であり；変異体９は配列番号３２であり；変異体１０は配列番号３３であり；変異体１１は配列番号３４であり；変異体１２は配列番号３５であり；変異体１３は配列番号３６であり；変異体１４は配列番号３７であり；変異体１５は配列番号３８であり；ＶＨ２は配列番号９１であり；変異体１６は配列番号９２であり；ＶＨ４は配列番号９３であり；変異体１７は配列番号９４であり；ＶＨ５は配列番号９５であり；変異体１８は配列番号９６であり；ＶＨ６は配列番号９７であり；変異体１９は配列番号９８であり；ＶＨ７は配列番号９９であり；及び変異体２０は配列番号１００である。 抗体ＯＳ２９６６のＶＨ（配列番号２）と比較した本発明のヒト化ＶＨ鎖の配列解析及び配列アライメントを示す図である。図１５の配列は以下のとおりである：ＯＳ２９６６は配列番号２であり；変異体１は配列番号６であり；変異体２は配列番号８であり；変異体３は配列番号１０であり；変異体４は配列番号１２であり；変異体５は配列番号１４であり；変異体６は配列番号２９であり；変異体７は配列番号３０であり；変異体８は配列番号３１であり；変異体９は配列番号３２であり；変異体１０は配列番号３３であり；変異体１１は配列番号３４であり；変異体１２は配列番号３５であり；変異体１３は配列番号３６であり；変異体１４は配列番号３７であり；変異体１５は配列番号３８であり；ＶＨ２は配列番号９１であり；変異体１６は配列番号９２であり；ＶＨ４は配列番号９３であり；変異体１７は配列番号９４であり；ＶＨ５は配列番号９５であり；変異体１８は配列番号９６であり；ＶＨ６は配列番号９７であり；変異体１９は配列番号９８であり；ＶＨ７は配列番号９９であり；及び変異体２０は配列番号１００である。 抗体ＯＳ２９６６のＶＨ（配列番号２）と比較した本発明のヒト化ＶＨ鎖の配列解析及び配列アライメントを示す図である。図１５の配列は以下のとおりである：ＯＳ２９６６は配列番号２であり；変異体１は配列番号６であり；変異体２は配列番号８であり；変異体３は配列番号１０であり；変異体４は配列番号１２であり；変異体５は配列番号１４であり；変異体６は配列番号２９であり；変異体７は配列番号３０であり；変異体８は配列番号３１であり；変異体９は配列番号３２であり；変異体１０は配列番号３３であり；変異体１１は配列番号３４であり；変異体１２は配列番号３５であり；変異体１３は配列番号３６であり；変異体１４は配列番号３７であり；変異体１５は配列番号３８であり；ＶＨ２は配列番号９１であり；変異体１６は配列番号９２であり；ＶＨ４は配列番号９３であり；変異体１７は配列番号９４であり；ＶＨ５は配列番号９５であり；変異体１８は配列番号９６であり；ＶＨ６は配列番号９７であり；変異体１９は配列番号９８であり；ＶＨ７は配列番号９９であり；及び変異体２０は配列番号１００である。 抗体ＯＳ２９６６のＶＨ（配列番号２）と比較した本発明のヒト化ＶＨ鎖の配列解析及び配列アライメントを示す図である。図１５の配列は以下のとおりである：ＯＳ２９６６は配列番号２であり；変異体１は配列番号６であり；変異体２は配列番号８であり；変異体３は配列番号１０であり；変異体４は配列番号１２であり；変異体５は配列番号１４であり；変異体６は配列番号２９であり；変異体７は配列番号３０であり；変異体８は配列番号３１であり；変異体９は配列番号３２であり；変異体１０は配列番号３３であり；変異体１１は配列番号３４であり；変異体１２は配列番号３５であり；変異体１３は配列番号３６であり；変異体１４は配列番号３７であり；変異体１５は配列番号３８であり；ＶＨ２は配列番号９１であり；変異体１６は配列番号９２であり；ＶＨ４は配列番号９３であり；変異体１７は配列番号９４であり；ＶＨ５は配列番号９５であり；変異体１８は配列番号９６であり；ＶＨ６は配列番号９７であり；変異体１９は配列番号９８であり；ＶＨ７は配列番号９９であり；及び変異体２０は配列番号１００である。 抗体ＯＳ２９６６のＶＨ（配列番号２）と比較した本発明のヒト化ＶＨ鎖の配列解析及び配列アライメントを示す図である。図１５の配列は以下のとおりである：ＯＳ２９６６は配列番号２であり；変異体１は配列番号６であり；変異体２は配列番号８であり；変異体３は配列番号１０であり；変異体４は配列番号１２であり；変異体５は配列番号１４であり；変異体６は配列番号２９であり；変異体７は配列番号３０であり；変異体８は配列番号３１であり；変異体９は配列番号３２であり；変異体１０は配列番号３３であり；変異体１１は配列番号３４であり；変異体１２は配列番号３５であり；変異体１３は配列番号３６であり；変異体１４は配列番号３７であり；変異体１５は配列番号３８であり；ＶＨ２は配列番号９１であり；変異体１６は配列番号９２であり；ＶＨ４は配列番号９３であり；変異体１７は配列番号９４であり；ＶＨ５は配列番号９５であり；変異体１８は配列番号９６であり；ＶＨ６は配列番号９７であり；変異体１９は配列番号９８であり；ＶＨ７は配列番号９９であり；及び変異体２０は配列番号１００である。 図１５で示したアライメントに対応する本発明のヒト化Ｊ領域（ＶＨ）の配列解析及び配列アライメントを示す図である。配列は以下のとおりである：Ｊ１は配列番号１０１であり；Ｊ２は配列番号１０２であり；Ｊ３は配列番号１０３であり；Ｊ４は配列番号１０４であり；Ｊ５は配列番号１０５であり；及びＪ６は配列番号１０６である。 抗体ＯＳ２９６６のＶＬ（配列番号４）と比較した本発明のヒト化ＶＬ鎖の配列解析及び配列アライメントを示す図である。配列は以下のとおりである：ＯＳ２９６６は配列番号４であり；変異体１は配列番号１６であり；変異体２は配列番号１８であり；変異体３は配列番号２０であり；変異体４は配列番号２２であり；変異体５は配列番号４４であり；変異体６は配列番号４５であり；変異体７は配列番号４６であり；変異体８は配列番号４７であり；変異体９は配列番号４８であり；変異体１０は配列番号４９であり；変異体１１は配列番号５０であり；変異体１２は配列番号５１であり；変異体１３は配列番号５２であり；ＶｋＩは配列番号１０７であり；変異体１４は配列番号１０８であり；ＶｋＩＩは配列番号１０９であり；変異体１５は配列番号１１０であり；ＶｋＩＩＩは配列番号１１１であり；変異体１６は配列番号１１２であり；ＶｋＩＶは配列番号１１３であり；変異体１７は配列番号１１４であり；ＶｋＶＩは配列番号１１５であり；及び変異体１８は配列番号１１６である。 抗体ＯＳ２９６６のＶＬ（配列番号４）と比較した本発明のヒト化ＶＬ鎖の配列解析及び配列アライメントを示す図である。配列は以下のとおりである：ＯＳ２９６６は配列番号４であり；変異体１は配列番号１６であり；変異体２は配列番号１８であり；変異体３は配列番号２０であり；変異体４は配列番号２２であり；変異体５は配列番号４４であり；変異体６は配列番号４５であり；変異体７は配列番号４６であり；変異体８は配列番号４７であり；変異体９は配列番号４８であり；変異体１０は配列番号４９であり；変異体１１は配列番号５０であり；変異体１２は配列番号５１であり；変異体１３は配列番号５２であり；ＶｋＩは配列番号１０７であり；変異体１４は配列番号１０８であり；ＶｋＩＩは配列番号１０９であり；変異体１５は配列番号１１０であり；ＶｋＩＩＩは配列番号１１１であり；変異体１６は配列番号１１２であり；ＶｋＩＶは配列番号１１３であり；変異体１７は配列番号１１４であり；ＶｋＶＩは配列番号１１５であり；及び変異体１８は配列番号１１６である。 抗体ＯＳ２９６６のＶＬ（配列番号４）と比較した本発明のヒト化ＶＬ鎖の配列解析及び配列アライメントを示す図である。配列は以下のとおりである：ＯＳ２９６６は配列番号４であり；変異体１は配列番号１６であり；変異体２は配列番号１８であり；変異体３は配列番号２０であり；変異体４は配列番号２２であり；変異体５は配列番号４４であり；変異体６は配列番号４５であり；変異体７は配列番号４６であり；変異体８は配列番号４７であり；変異体９は配列番号４８であり；変異体１０は配列番号４９であり；変異体１１は配列番号５０であり；変異体１２は配列番号５１であり；変異体１３は配列番号５２であり；ＶｋＩは配列番号１０７であり；変異体１４は配列番号１０８であり；ＶｋＩＩは配列番号１０９であり；変異体１５は配列番号１１０であり；ＶｋＩＩＩは配列番号１１１であり；変異体１６は配列番号１１２であり；ＶｋＩＶは配列番号１１３であり；変異体１７は配列番号１１４であり；ＶｋＶＩは配列番号１１５であり；及び変異体１８は配列番号１１６である。 抗体ＯＳ２９６６のＶＬ（配列番号４）と比較した本発明のヒト化ＶＬ鎖の配列解析及び配列アライメントを示す図である。配列は以下のとおりである：ＯＳ２９６６は配列番号４であり；変異体１は配列番号１６であり；変異体２は配列番号１８であり；変異体３は配列番号２０であり；変異体４は配列番号２２であり；変異体５は配列番号４４であり；変異体６は配列番号４５であり；変異体７は配列番号４６であり；変異体８は配列番号４７であり；変異体９は配列番号４８であり；変異体１０は配列番号４９であり；変異体１１は配列番号５０であり；変異体１２は配列番号５１であり；変異体１３は配列番号５２であり；ＶｋＩは配列番号１０７であり；変異体１４は配列番号１０８であり；ＶｋＩＩは配列番号１０９であり；変異体１５は配列番号１１０であり；ＶｋＩＩＩは配列番号１１１であり；変異体１６は配列番号１１２であり；ＶｋＩＶは配列番号１１３であり；変異体１７は配列番号１１４であり；ＶｋＶＩは配列番号１１５であり；及び変異体１８は配列番号１１６である。 抗体ＯＳ２９６６のＶＬ（配列番号４）と比較した本発明のヒト化ＶＬ鎖の配列解析及び配列アライメントを示す図である。配列は以下のとおりである：ＯＳ２９６６は配列番号４であり；変異体１は配列番号１６であり；変異体２は配列番号１８であり；変異体３は配列番号２０であり；変異体４は配列番号２２であり；変異体５は配列番号４４であり；変異体６は配列番号４５であり；変異体７は配列番号４６であり；変異体８は配列番号４７であり；変異体９は配列番号４８であり；変異体１０は配列番号４９であり；変異体１１は配列番号５０であり；変異体１２は配列番号５１であり；変異体１３は配列番号５２であり；ＶｋＩは配列番号１０７であり；変異体１４は配列番号１０８であり；ＶｋＩＩは配列番号１０９であり；変異体１５は配列番号１１０であり；ＶｋＩＩＩは配列番号１１１であり；変異体１６は配列番号１１２であり；ＶｋＩＶは配列番号１１３であり；変異体１７は配列番号１１４であり；ＶｋＶＩは配列番号１１５であり；及び変異体１８は配列番号１１６である。 抗体ＯＳ２９６６のＶＬ（配列番号４）と比較した本発明のヒト化ＶＬ鎖の配列解析及び配列アライメントを示す図である。配列は以下のとおりである：ＯＳ２９６６は配列番号４であり；変異体１は配列番号１６であり；変異体２は配列番号１８であり；変異体３は配列番号２０であり；変異体４は配列番号２２であり；変異体５は配列番号４４であり；変異体６は配列番号４５であり；変異体７は配列番号４６であり；変異体８は配列番号４７であり；変異体９は配列番号４８であり；変異体１０は配列番号４９であり；変異体１１は配列番号５０であり；変異体１２は配列番号５１であり；変異体１３は配列番号５２であり；ＶｋＩは配列番号１０７であり；変異体１４は配列番号１０８であり；ＶｋＩＩは配列番号１０９であり；変異体１５は配列番号１１０であり；ＶｋＩＩＩは配列番号１１１であり；変異体１６は配列番号１１２であり；ＶｋＩＶは配列番号１１３であり；変異体１７は配列番号１１４であり；ＶｋＶＩは配列番号１１５であり；及び変異体１８は配列番号１１６である。 図１７で示したアライメントに対応する本発明のヒト化Ｊ領域（κ軽鎖）の配列解析及び配列アライメントを示す図である。配列は以下のとおりである：Ｊ１は配列番号１１７であり；Ｊ２は配列番号１１８であり；Ｊ３は配列番号１１９であり；Ｊ４は配列番号１２０であり；及びＪ５は配列番号１２１である。 本発明のＶＨ鎖及びＶＬ鎖のコドン使用頻度を示す図である。 本発明の複合ヒト抗体変異体の相対的な親和性（表２で示すもの）を示すグラフである。 本発明の複合ヒト抗体変異体の相対的な親和性（表２で示すもの）を示すグラフである。 本発明の複合ヒト抗体変異体の相対的な親和性（表２で示すもの）を示すグラフである。 本発明の複合ヒト抗体変異体の相対的な親和性（表２で示すもの）を示すグラフである。 本発明の複合ヒト抗体変異体の相対的な親和性（表２で示すもの）を示すグラフである。 図２５Ａ〜Ｄは、本発明の複合ヒト抗体変異体の細胞外マトリクス（ＥＣＭ）接着アッセイにおける機能的な検証を説明する一連のグラフである。複数のＥＣＭ上及び複数の癌細胞株で接着マイクロプレートアッセイにおいて本発明の複合ヒト抗体変異体（表２から）によるインテグリンβ１サブユニットの機能的な阻害をアッセイした。図２５ＡはＰＡＮＣ−１ヒト膵臓癌を利用する。 図２５Ａ〜Ｄは、本発明の複合ヒト抗体変異体の細胞外マトリクス（ＥＣＭ）接着アッセイにおける機能的な検証を説明する一連のグラフである。複数のＥＣＭ上及び複数の癌細胞株で接着マイクロプレートアッセイにおいて本発明の複合ヒト抗体変異体（表２から）によるインテグリンβ１サブユニットの機能的な阻害をアッセイした。図２５ＢはＰＡＮＣ−１ヒト膵臓癌を利用する。図２５ＢはＰＡＮＣ−１ヒト膵臓癌を利用する。 図２５Ａ〜Ｄは、本発明の複合ヒト抗体変異体の細胞外マトリクス（ＥＣＭ）接着アッセイにおける機能的な検証を説明する一連のグラフである。複数のＥＣＭ上及び複数の癌細胞株で接着マイクロプレートアッセイにおいて本発明の複合ヒト抗体変異体（表２から）によるインテグリンβ１サブユニットの機能的な阻害をアッセイした。図２５ＣはＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト三重陰性乳癌を利用した。 図２５Ａ〜Ｄは、本発明の複合ヒト抗体変異体の細胞外マトリクス（ＥＣＭ）接着アッセイにおける機能的な検証を説明する一連のグラフである。複数のＥＣＭ上及び複数の癌細胞株で接着マイクロプレートアッセイにおいて本発明の複合ヒト抗体変異体（表２から）によるインテグリンβ１サブユニットの機能的な阻害をアッセイした。図２５ＤはＡｓＰＣ−１ヒト膵臓癌を利用する。 本発明の複合ヒト抗体変異体の細胞外マトリクス（ＥＣＭ）移動アッセイにおける機能的な検証を説明する一連のグラフである。ヒト三重陰性乳癌（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）を用いたＥＣＭ成分フィブロネクチン上でのマイクロプレート「引っ掻き傷」移動アッセイにおいて本発明の複合ヒト抗体変異体（表２から）によるインテグリンβ１サブユニットの機能的な阻害をアッセイした。図２６Ａは、ＯＳ２９６６及び複合ヒト変異体（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）で処理したウェルにおいて傷への移動の減衰を示すプレートの１０倍拡大での一連の画像である。図２６Ｂは各条件（３つ組で行い、反復した）について細胞を含まない領域の定量を示すグラフである。 本発明の複合ヒト抗体変異体の、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）による管形成血管形成アッセイにおける機能的な検証を説明する一連の図である。血管形成のインビトロモデル：ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）による管形成アッセイにおいて本発明の複合ヒト抗体変異体（表２から）によるインテグリンβ１サブユニットの機能的な阻害をアッセイした。図２７ＡはＯＳ２９６６及び複合ヒト変異体（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）で処理したウェルにおける血管形成の減衰を示すプレートの１０倍拡大での一連の画像である。図２７Ｂは各条件（少なくとも３つ組で行い、内皮前駆細胞で反復した）についての閉鎖ユニット形成の定量を示す一連のグラフである。 本発明の複合ヒト抗体変異体の、三重陰性乳癌のヒト同所性異種移植モデルにおける機能的な検証を説明するグラフ及び図である。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株によるヒト三重陰性乳癌のインビボモデルにおいて本発明の複合ヒト抗体変異体（表２から）によるインテグリンβ１サブユニットの機能的な阻害をアッセイした。図２８Ａは時間ごとの群腫瘍の平均体積を示すグラフである。図２８Ｂはウエスタンブロットの画像である。 本発明の複合ヒト抗体変異体の、三重陰性乳癌に由来する自然肺転移のヒト同所性異種移植モデルにおける機能的な検証を説明する一連の図である。 図３０Ａ〜Ｃは、本発明の複合ヒト抗体変異体の、膵臓癌のヒト異種移植モデルにおける機能的な検証を説明するグラフ及び図である。ＰＡＮＣ１−ＧＥＭＲ細胞株によるゲムシタビン耐性のヒト膵臓癌のインビボモデルにおいて本発明の複合ヒト抗体変異体（表２から）によるインテグリンβ１サブユニットの機能的な阻害をアッセイした。図３０Ａは時間ごとの群腫瘍の平均体積を示すグラフである。 図３０Ａ〜Ｃは、本発明の複合ヒト抗体変異体の、膵臓癌のヒト異種移植モデルにおける機能的な検証を説明するグラフ及び図である。ＰＡＮＣ１−ＧＥＭＲ細胞株によるゲムシタビン耐性のヒト膵臓癌のインビボモデルにおいて本発明の複合ヒト抗体変異体（表２から）によるインテグリンβ１サブユニットの機能的な阻害をアッセイした。図３０Ｂは時間ごとの群腫瘍の平均体積を示すグラフである。 図３０Ａ〜Ｃは、本発明の複合ヒト抗体変異体の、膵臓癌のヒト異種移植モデルにおける機能的な検証を説明するグラフ及び図である。ＰＡＮＣ１−ＧＥＭＲ細胞株によるゲムシタビン耐性のヒト膵臓癌のインビボモデルにおいて本発明の複合ヒト抗体変異体（表２から）によるインテグリンβ１サブユニットの機能的な阻害をアッセイした。図３０Ｃはウエスタンブロットの画像である。 本発明の複合ヒト抗体変異体の、樹立した膠芽細胞腫のヒト異種移植モデルにおける機能的な検証を説明するグラフ及び図である。Ｕ８７ＭＧ細胞株による樹立したヒト膠芽細胞腫のインビボモデルにおいて本発明の複合ヒト抗体変異体（表２から）によるインテグリンβ１サブユニットの機能的な阻害をアッセイした。図３１Ａは時間ごとの群腫瘍の平均体積を示すグラフである。図３Ｂはウエスタンブロットの画像である。 免疫原性スクリーニングアッセイ（ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標））の結果を示す図である。図３２Ａはヒストグラムである。図３２Ｂはドナーコホートに対する健常なドナーＴ細胞の増殖応答の要約である。
発明の詳細な説明
本発明はヒトのＶＨ及びＶＬのフレームワーク配列並びにそれらをコードする核酸配列を提供する。そのような配列は、たとえば、ドナー抗体、たとえば、齧歯類の抗体からのＣＤＲの移植のためのフレームワークを提供するのに使用される。従って、ドナー抗体の結合特異性を持つ、本発明のＶＨ及び／またはＶＬのフレームワークを含む抗体を創ることができる。
本発明はまた、ＯＳ２９６６と呼ばれる抗体の特異性を有する、たとえば、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２９〜５７、９１〜１００及び１０７〜１１６にて示されるヒトのＶＨ及びＶＬのフレームワーク領域で提供されるマウスＯＳ２９６６のＣＤＲを介したインテグリンβ１への特異的な結合を有する、ヒト化抗体も提供する。
本発明のヒト化抗体は、本明細書で記載されるように種々の治療目的及び診断目的で使用される。使用には癌のような疾患を診断すること及び治療することが含まれる。
本組成物及び本方法が記載される前に、特定の装置、方法及び条件は変化し得るので、本発明がそのような記載される装置、方法及び実験条件に限定されないことが理解されるべきである。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書で使用される専門用語は特定の実施形態のみを記載する目的であり、限定することを意図するものではないことも理解されるべきである。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるとき、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「１つの（ｔｈｅ）」は文脈が明瞭に指示しない限り、複数の言及を含む。従って、たとえば、「組成物」または「方法」についての言及には、本開示等を読む際に当業者に明らかになるであろう本明細書で記載される種類の１つまたは複数の組成物及び方法及び／または工程が含まれる。
定義されない限り、本明細書で使用される専門用語及び科学用語はすべて、本発明が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されるのと同様の意味を有する。本明細書で記載されるものに類似するまたはそれと同等である方法及び物質を本発明の実施または試験で使用することができるが、ここでは好まれる方法及び物質が記載される。
用語「インテグリンβ１」はＣＤ２９の同義語であり、ＩＴＧＢ１遺伝子によってコードされるタンパク質についての言及を含む。インテグリンβ１は、晩期抗原受容体に関連し、α−１からα−９を含む多数のαサブユニットと結合することが知られており、たとえば、α−３サブユニットとの複合体化によりネトリン−１及びリーリンのような分子に反応するα３β１複合体が創られる。
本明細書で使用されるとき、抗体に関する用語「抗インテグリンβ１」はインテグリンβ１に特異的に結合する抗体を指す。
用語「抗体」は、抗原に特異的に結合し、認識する、免疫グロブリン遺伝子またはその機能的断片によってコードされるポリペプチドを指す。認識される免疫グロブリン遺伝子には、κ、λ、α、γ、δ、ε及びμ定常領域遺伝子、並びに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖はκまたはλのいずれかとして分類される。重鎖は、γ、μ、α、δまたはεとして分類され、それは同様にそれぞれ、免疫グロブリンのクラス、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥを定義する。
例示的な免疫グロブリン（抗体）の構造単位は四量体を構成する。各四量体は２つの同一のポリペプチド鎖対から構成され、各対は「軽」鎖（約２５ｋＤａ）１本と「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）１本を有する。各鎖のＮ末端は主として抗原認識に関与する約１００〜１１０以上のアミノ酸の可変領域を定義する。可変軽鎖（ＶＬ）及び可変重鎖（ＶＨ）なる用語はそれぞれそれらの軽鎖及び重鎖を指す。
抗体の機能的断片の例には、完全な抗体分子、抗体断片、たとえば、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、相補性決定領域（ＣＤＲ）、ＶＬ（軽鎖可変領域）、ＶＨ（重鎖可変領域）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２'、及びそれらの組合せ、または標的抗原に結合することが可能である免疫グロブリンペプチドの他の機能的部分（たとえば、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｐａｕｌ ｅｄ．， ３ｄ ｅｄ． １９９３を参照）が挙げられるが、これらに限定されない。当業者によって十分に理解されるように、種々の抗体断片は、種々の方法、たとえば、ペプシンのような酵素によるインタクトな抗体の消化；またはデノボ合成によって得ることができる。抗体断片は、化学的にまたは組換えＤＮＡ法を用いてデノボで合成されることが多い。従って、抗体なる用語には、本明細書で使用されるとき、全抗体の改変によって作製される抗体断片、または組換えＤＮＡ法を用いてデノボで合成されるもの（たとえば、単鎖Ｆｖ）、またはファージディスプレイライブラリを用いて特定されるものが含まれる。抗体なる用語には、二価のまたは二重特異性の分子、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、及びテトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）も含まれる。二価のまたは二重特異性の分子は当該技術分野で既知である。
「ＶＨ」についての言及または「ＶＨ」は、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ジスルフィド安定化Ｆｖ（ｄｓＦｖ）またはＦａｂを含む免疫グロブリン重鎖の可変領域を指す。「ＶＬ」についての言及または「ＶＬ」は、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖまたはＦａｂを含む免疫グロブリン軽鎖の可変領域を指す。
ＣＤＲは主として抗原のエピトープへの結合に関与する。各鎖のＣＤＲはＮ末端から出発して順に番号付けして通常、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３と呼ばれ、特定のＣＤＲが位置する鎖によっても通常特定される。従って、ＶＨ ＣＤＲ３はそれが見いだされる抗体の重鎖の可変ドメインに位置するのに対して、ＶＬ ＣＤＲ１はそれが見いだされる抗体の軽鎖の可変ドメインに由来するＣＤＲ１である。本明細書で記載される軽鎖及び重鎖の可変領域は、特に指示されない限り、Ｋａｂａｔ（たとえば、Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（２００１） "Ｋａｂａｔ Ｄａｔａｂａｓｅ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ： ｆｕｔｕｒｅ ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ" Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２９： ２０５−２０６；及びｔｈｅ Ｋａｂａｔ Ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， Ｆｅｂ． ２２， ２００２ Ｄａｔａｓｅｔを参照）に従う。
ＣＤＲ及びフレームワーク領域の位置は、当該技術分野で周知の種々の定義、たとえば、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、国際ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓデータベース（ＩＭＧＴ）及びＡｂＭ（たとえば、Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，上記を参照； Ｃｈｏｔｈｉａ ＆ Ｌｅｓｋ， １９８７， Ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ． Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９６， ９０１−９１７； Ｃｈｏｔｈｉａ Ｃ． ｅｔ ａｌ．， １９８９， Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎｓ． Ｎａｔｕｒｅ ３４２， ８７７−８８３； Ｃｈｏｔｈｉａ Ｃ． ｅｔ ａｌ．， １９９２， ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ＶＨ ｓｅｇｍｅｎｔｓ Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２７， ７９９−８１７； Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ １９９７， ２７３（４）を参照）を用いて決定することができる。抗原結合部位の定義も以下：Ｒｕｉｚら、ＩＭＧＴ，ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｄａｔａｂａｓｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２８，２１９−２２１（２０００）；及びＬｅｆｒａｎｃ，Ｍ．−Ｐ．ＩＭＧＴ，ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｄａｔａｂａｓｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．Ｊａｎ １；２９（ｌ）：２０７−９（２００１）；ＭａｃＣａｌｌｕｍら、Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ａｎｔｉｇｅｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：Ｃｏｎｔａｃｔ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ ｔｏｐｏｇｒａｐｈｙ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２６２（５），７３２−７４５（１９９６）；及びＭａｒｔｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，９２６８−９２７２（１９８９）；Ｍａｒｔｉｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２０３，１２１−１５３，（１９９１）；Ｐｅｄｅｒｓｅｎら、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ，１，１２６，（１９９２）；及びＲｅｅｓら、Ｉｎ Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ Ｍ．Ｊ．Ｅ．（ｅｄ．），Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ．Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１４１−１７２，１９９６）に記載されている。
本明細書で開示されるヒトのＶＨ領域及びＶＬ領域の例示的なフレームワーク配列及びＣＤＲ配列を図４に示す。
「ＯＳ２９６６」はヒトのインテグリンβ１に特異的に結合するマウスのＩｇＧ１抗体を指す。ＯＳ２９６６は、たとえば、アイオワ大学のＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｂａｎｋのような幾つかの供給源から市販されている（異なる名称のもとで）。ＯＳ２９６６の重鎖及び軽鎖はクローニングされている。ＯＳ２９６６のＶＨ領域のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１及び配列番号２にて示す。ＯＳ２９６６のＶＬ領域のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列をそれぞれ配列番号３及び配列番号４にて示す。本明細書で記載される例示的なヒト化抗体のために指定されたＯＳ２９６６のＣＤＲを配列番号２３〜２８にて示し、図４にて示す。
「ヒト化抗体」は、ドナー抗体の結合特異性を含む抗体、すなわち、ヒトのフレームワーク配列に移植されたドナー抗体のＣＤＲ領域、通常、マウスのモノクローナル抗体のＣＤＲ領域を含む抗体を指す。「ヒト化抗体」は本明細書で使用されるとき、ドナー抗体と同じエピトープに結合し、通常、結合親和性の少なくとも２５％を有する。結合親和性についての例示的なアッセイは実施例５にて記載される。抗体が同じエピトープに結合するかどうかを測定する方法は当該技術分野で周知であり、たとえば、抗体がドナー抗体と同じエピトープに結合するかどうかを測定するエピトープマッピングあるいは競合実験のための技法を開示しているＨａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９９を参照のこと。本発明で提供される新規のフレームワーク領域を含むヒト化抗体。
本発明の「ＶＨ」または「ＶＬ」「領域」または「フレームワーク」は、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２９〜５７、配列番号９１〜１００、または配列番号１０７〜１１６で示されるアミノ酸の配列に対して少なくとも７０％の同一性、大抵少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するＶＨまたはＶＬのアミノ酸の配列を指す。ＶＨ鎖またはＶＬ鎖の「フレームワーク」は、ＣＤＲを含まない、該鎖のフレームワーク領域を指す。各鎖に適用される前記用語はフレームワーク領域のすべてを包含する。
「ヒト化抗インテグリンβ１抗体」は、ヒトのフレームワーク配列に移植されたマウスのＯＳ２９６６の結合特異性を有する、該フレームワーク配列を含むヒト化抗体を指す。本発明のヒト化抗インテグリンβ１抗体のＣＤＲはそれぞれ配列番号２及び配列番号４で示される重鎖配列及び軽鎖配列のＣＤＲに対して少なくとも８５％、さらに典型的には少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。ＶＨ領域のＣＤＲは配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５にて示される。ＶＨ領域のＣＤＲは配列番号２６、配列番号２７及び配列番号２８にて示される。
１つの態様では、本発明は複合ヒト化抗体を提供する。複合ヒト化抗体の技術は、可変領域（Ｖ領域）配列においてＴ細胞エピトープを回避すること（脱免疫化（ｄｅｉｍｍｕｎｉｓａｔｉｏｎ））によってヒト化非免疫原性抗体を生成する（ＥＰ２，３８８，８７１）。出発抗体（通常、マウス）に由来する相補性決定領域（ＣＤＲ）のための「アクセプター」として単一のヒトＶ領域フレームワークを使用する他のヒト化技術とは違って、複合ヒト抗体（商標）は無関係なヒト抗体のＶ領域に由来する複数の配列セグメント（「複合物」）を含む。複合ヒト抗体の基本的な特性は以下のとおりである。
無関係なヒトＶ領域のデータベースに由来する配列セグメントは、出発抗体の抗原結合に重要であると考えられるアミノ酸を決定した後、選択される。ヒトＶ領域のデータベースに由来する選択された配列セグメントはすべて、Ａｎｔｉｔｏｐｅのインシリコツールを用いて可能性のあるＴ細胞エピトープの存在についてフィルターをかける。複合ヒト抗体（商標）は、出発抗体Ｖ領域のあらゆる部分とヒト配列セグメントとの緊密な適合のお蔭で、標準のヒト化抗体よりも良好な親和性及び特異性を保持する。複合ヒト抗体（商標）はＴ細胞エピトープを除去するので、ヒト化及び脱免疫化の双方がなされたと考えられる。
一実施形態では、本発明の抗体は、Ｔ細胞エピトープ内の特定の部位で変異されるようにフレームワーク領域における候補残基を特定することによって調製される。本発明の抗体は、ドナー抗体に比べて変化した結合親和性及び／または変化した免疫原性を呈し得る。
当該技術分野で既知の方法を用いてタンパク質配列内でＴ細胞エピトープをマッピングすることができる。たとえば、ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）（ＥＰ１９８９５４４， Ａｎｔｉｔｏｐｅ， ＵＫ）を用いてタンパク質配列内でＴ細胞エピトープをマッピングし、配列内のＴ細胞エピトープの数と能力に基づく免疫原性の可能性を判定する。ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）Ｔ細胞エピトープマッピングは、最低５０のＨＬＡ型のドナー（関心対象のヒト集団を代表するように選択される）に由来する、ＣＤ８＋Ｔ細胞を枯渇させたＰＢＭＣを通常使用する。通常、３Ｈ ＴｄＲの取り込みによるインビトロでのＣＤ４＋Ｔ細胞刺激のための多数の同型培養において、タンパク質配列にわたる１２アミノ酸の重複を伴った１５ｍｅｒのペプチドを解析する。ＭＨＣクラスＩＩ結合グルーブに結合する９ｍｅｒのコアが２つ以上のペプチド配列に存在するので、ＣＤ４＋Ｔ細胞刺激は２つまたは３つの隣接する及び重複するペプチドで検出されることが多い。ＣＤ４＋Ｔ細胞をインビトロで刺激するペプチドの正確な特定の後、インシリコ技術を用いて、コアの９ｍｅｒ配列の正確な位置及び重要なＭＨＣクラスＩＩアンカー残基の位置を決定することによって、エピトープを除去した（脱免疫化した）変異体を設計することができる。
語句「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」は、従来の２本鎖抗体の重鎖と軽鎖の可変ドメインが連結されて１本の鎖を形成する抗体を指す。通常、リンカーペプチドが２本の鎖の間に挿入されて、正しい折り畳み及び活性のある結合部位の生成を妨害することなく可変ドメインの安定化を可能にする。本発明の単鎖ヒト化抗体、たとえば、ヒト化抗インテグリンβ１抗体は単量体として結合し得る。他の例示的な単鎖抗体はダイアボディ、トリアボディ及びテトラボディを形成し得る（たとえば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９３， 上記を参照）。さらに、本発明のヒト化抗体、たとえば、ヒト化抗インテグリンβ１抗体は、「再構成された」抗体または抗体断片の一成分、たとえば、Ｆａｂ'、Ｆａｂ単量体、Ｆ（ａｂ）'２二量体、または免疫グロブリン分子全体も形成し得る。従って、本発明のヒト化抗体はさらにヒトＦｃ領域を含み得る。
「結合する」または「連結する」または「コンジュゲートする」は、非限定的に、介入ドメインを伴ったまたは伴わない組換え融合、インテイン介在性の融合、非共有会合、及び共有結合、たとえば、ジスルフィド結合、ペプチド結合；水素結合；静電結合；及び立体構造的結合、たとえば、抗体−抗原及びビオチン−アビジンの会合を含む、タンパク質ドメインを機能的に接続するための当該技術分野で既知の方法を指す。本発明の文脈で、前記用語にはエフェクター分子（ＥＭ）への抗体部分の結合についての言及が含まれる。結合は化学的手段または組換え手段のいずれかにより得る。化学的手段は、１つの分子を形成するための２つの分子間で形成される共有結合が存在するような、抗体部分とエフェクター分子の間の反応を指す。
用語「エフェクター部分」は、標的部分によって標的とされる細胞に対して効果を有するように意図されるまたはイムノコンジュゲートの存在を特定するように意図される、イムノコンジュゲートの一部を意味する。従って、エフェクター部分は、たとえば、細胞傷害性の剤若しくは薬剤のような治療用部分、または蛍光標識のような検出可能部分であることができる。
「治療用部分」は、治療剤として作用するように意図される、イムノコンジュゲートの一部である。
用語「治療剤」には、化学療法剤、抗腫瘍化合物、抗炎症性化合物、抗感染性化合物、酵素の活性化剤または阻害剤、アロステリック修飾剤、抗生剤、または患者において所望の治療効果を誘導するために投与される他の剤として作用する、現在既知のまたは最近開発された任意の多数の化合物が挙げられる。治療剤はまた、意図される治療効果が、たとえば、癌細胞の殺傷である場合、毒素または放射性同位元素であり得る。
用語「有効量」または「に対して有効な量」または「治療的に有効な量」は、対象において検出可能な治療応答を誘導するのに十分な量を指す。好ましくは、治療応答は対象において存在する癌細胞の増殖を低減するまたは癌細胞の成長を阻害するのに有効である。治療応答を測定するためのアッセイは当該技術分野で周知である。
用語「イムノコンジュゲート」は、たとえば、検出可能な標識またはエフェクター分子のような第２の分子に連結された抗体を含む組成物を指す。多くは、抗体は共有結合によって第２の分子に連結される。
イムノコンジュゲートの文脈で、「検出可能な標識」または「検出可能な部分」は、イムノコンジュゲートの存在を検出可能にする特性を有する、イムノコンジュゲートの一部を指す。たとえば、イムノコンジュゲートは、イムノコンジュゲートが存在する細胞を免疫組織化学アッセイにおいて検出可能にする放射活性同位体で標識され得る。「検出可能な標識」または「検出可能な部分」は、分光学、光化学、生化学、免疫化学、化学または他の物理学の手段によって検出可能な組成物である。たとえば、有用な標識には、放射性同位元素（たとえば、３Ｈ、３５Ｓ、３２Ｐ、５１Ｃｒまたは１２５Ｉ）、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素（たとえば、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、またはＥＬＩＳＡで一般に使用される他のもの）、ビオチン、ジゴキシゲニン、または、たとえば、放射性標識をペプチドに取り込むことによって検出可能にすることができる、またはペプチドと特異的に反応する抗体を検出するのに使用することができるハプテン及びタンパク質が挙げられる。
用語「免疫的反応条件」には、他のエピトープの実質的にすべてに対する結合よりも検出可能に高い程度に、及び／または該結合を実質的に排除するまで、特定のエピトープに対して生成された抗体がそのエピトープに結合できる条件についての言及が含まれる。免疫的反応条件は、抗体結合反応の形式に依存し、通常、免疫アッセイのプロトコールで利用されるものまたはインビボで遭遇するそれら条件である。免疫アッセイの形式及び条件の記載については上記のＨａｒｌｏｗ及びＬａｎｅを参照のこと。好ましくは、本発明の方法で採用される免疫的反応条件は、生きている哺乳類または哺乳類細胞の内部で典型的である条件（たとえば、温度、浸透圧、ｐＨ）についての言及を含む「生理的な条件」である。一部の臓器が極端な条件にさらされることが認識される一方で、生物内環境及び細胞内環境は、普通ｐＨ７前後（すなわち、ｐＨ６．０〜ｐＨ８．０、さらに典型的にはｐＨ６．５〜７．５）であり、主な溶媒として水を含有し、０℃を上回り、５０℃を下回る温度で存在する。浸透圧は細胞の生存及び増殖を支える範囲内である。
用語「特異的に結合する」、「結合特異性」、「抗体に特異的に結合する」または「との特異的な免疫反応性」は、エピトープについて言及する場合、タンパク質及び他の生物製剤の不均質な集団においてエピトープの存在を決定するような結合反応を指す。従って、指定された免疫アッセイの条件下では、特定された抗体は、バックグランドの少なくとも２倍、さらに典型的にはバックグランドの１０〜１００倍超で特定のエピトープに結合する。種々の免疫アッセイの形式を用いて特定のタンパク質または糖質と特異的に免疫反応性である抗体を選択し得る。たとえば、固相ＥＬＩＳＡ免疫アッセイを日常的に用いてタンパク質または糖質と特異的に免疫反応性である抗体を選択する。特異的な免疫反応性を測定するのに使用することができる免疫アッセイの形式及び条件の記載については、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ，ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）並びにＨａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ，ＵＳＩＮＧ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９９）を参照のこと。本明細書で使用されるとき、「特異的に結合する」は少なくとも約０．１ｍＭ、少なくとも約１μＭ、少なくとも約０．１μＭ若しくはさらに良好な、または０．０１μＭ若しくはさらに良好なＫｄで抗体がタンパク質に結合することを意味する。
「核酸」及び「ポリヌクレオチド」は本明細書では互換的に使用されて、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、及び一本鎖または二本鎖の形態でのそれらのポリマーを指す。その用語は、参照核酸と類似の結合特性を有し、参照ヌクレオチドに類似する方法で代謝される、合成の、天然に存在する及び天然に存在しない、既知のヌクレオチド類似体または修飾された主鎖残基若しくは結合を含有する核酸を包含する。そのような類似体の例には非限定的に、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、メチルホスホネート、キラル−メチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられる。当業者によって十分に理解されるように、核酸配列の相補物は他方の鎖の配列から容易に決定することができる。従って、本明細書で示される任意の特定の核酸配列は相補鎖も開示する。
「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は本明細書では互換的に使用されてアミノ酸残基のポリマーを指す。その用語は、天然に存在するアミノ酸ポリマー、並びに、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工的な化学模倣体であるアミノ酸ポリマーに適用される。
「アミノ酸」は、天然に存在する及び合成のアミノ酸、並びに、天然に存在するアミノ酸と類似の方法で機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣体を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝子コードによってコードされるもの、並びに後で修飾されるそれらのアミノ酸、たとえば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸及びＯ−ホスホセリンである。「アミノ酸類似体」は、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的な化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基及びＲ基に結合するα炭素を有する化合物、たとえば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。そのような類似体は修飾されたＲ基（たとえば、ノルロイシン）または修飾されたペプチド主鎖を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的な化学構造を保持する。「アミノ酸模倣体」は、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と類似の方法で機能する化合物を指す。アミノ酸は、一般に知られる３文字記号によってまたはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会によって推奨される１文字記号によって本明細書では呼ばれ得る。
「保存的に改変された変異体」は、核酸配列及びアミノ酸配列の双方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された変異体は、同一の若しくは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合、本質的に同一の配列を指す。遺伝子コードの縮重のために、多数の機能的に同一の核酸が所与のタンパク質をコードする。たとえば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ及びＧＣＵはすべてアミノ酸アラニンをコードする。従って、アラニンがコドンによって特定されるすべての位置において、コードされるポリペプチドを変化させることなくコドンを記載した対応するコドンのいずれかに変えることができる。そのような核酸の変化は、保存的に改変された変異の１種である「サイレント変化」である。ポリペプチドをコードする本明細書の各核酸配列は、核酸の考えられる各サイレント変化も記載する。当業者は、核酸における各コドン（普通メチオニンのための唯一のコドンであるＡＵＧ及び普通トリプトファンのための唯一のコドンであるＴＧＧを除く）を改変して機能的に同一の分子を得ることができることを認識するであろう。従って、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変化は各記載された配列に潜在的に含まれる。
アミノ酸配列に関して、当業者は、コードされた配列における単一のアミノ酸または小さな比率のアミノ酸を変える、付加するまたは欠失させる、核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質に対する個々の置換、欠失または付加は、変化が化学的に類似するアミノ酸によるアミノ酸の置換を生じる「保存的に改変された変異体」であることを認識するであろう。機能的に類似するアミノ酸を提供する保存的置換の表は当該技術分野で周知である。そのような保存的に改変された変異体は、本発明の多型変異体、種間ホモログ及び対立遺伝子に追加されるものであり、それらを排除しない。
たとえば、脂肪族アミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｉ，ＬまたはＶ）がその群の別のメンバーで置換される置換、またはたとえば、１つの極性残基の別のものとの置換、たとえば、リジンの代わりのアルギニン、アスパラギン酸の代わりのグルタミン酸、若しくはアスパラギンの代わりのグルタミンのような置換が行われ得る。以下の８群のそれぞれは互いに保存的な置換である他の例示的なアミノ酸を含有する：（１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；（２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；（３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；（４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；（５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；（６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；（７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；及び（８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（たとえば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ （１９８４）を参照）。
ポリペプチド構造のような高分子構造は種々のレベルの組織化という観点から記載することができる。この組織化の一般的な議論については、たとえば、Ａｌｂｅｒｔｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ（第３版，１９９４）並びにＣａｎｔｏｒ及びＳｃｈｉｍｍｅｌ，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｐａｒｔ Ｉ．Ｔｈｅ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（１９８０）を参照のこと。「一次構造」は特定のペプチドのアミノ酸配列を指す。「二次構造」はポリペプチド内の局所的に秩序のある三次元構造を指す。「三次構造」はポリペプチド単量体の完全な三次元構造を指す。ドメインはポリペプチドの小型の単位を形成するポリペプチドの一部であり、通常、５０〜３５０のアミノ酸の長さである。典型的なドメインは、β−シートやα−らせんのストレッチのような少ない組織化の区分で構成される。「四次構造」は独立した三次単位の非共有会合によって形成される三次元構造を指す。
用語「単離された」または「実質的に精製された」は、核酸またはタンパク質に適用される場合、核酸またはタンパク質が、天然の状態でそれが会合する他の細胞性成分を本質的に含まないことを意味する。それは無水溶液または水溶液のいずれであることもできるが、好ましくは均質な状態にある。純度及び均質性は通常、たとえば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィのような分析用化学技法を用いて決定される。調製物に存在する主要な種であるタンパク質が実質的に精製される。
２つ以上の核酸配列またはポリペプチド配列の文脈での用語「同一の」またはパーセント「同一性」は、以下に記載する初期設定パラメータのＢＬＡＳＴ若しくはＢＬＡＳＴ２．０配列比較アルゴリズムを用いて、または手動のアライメント及び視覚検査によって測定したとき、同じである、または同じであるアミノ酸残基若しくはヌクレオチドの特定された比率（すなわち、比較ウインドウまたは指定された領域にわたって最大の一致について比較し、アライメントした場合、特定された領域にわたって約６０％の同一性、好ましくは６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の同一性）を有する２つ以上の配列または部分配列を指す。そのような配列はそのとき「実質的に同一」であると言われる。この定義は試験配列の相補物も指し、またはそれに適用され得る。定義には欠失及び／または付加を有する配列、並びに置換を有するものも含まれる。以下に記載されるように、好まれるアルゴリズムがギャップ等を明らかにすることができる。好ましくは、同一性は、長さ少なくとも約２５のアミノ酸若しくはヌクレオチドである領域、またはさらに好ましくは長さ５０〜１００のアミノ酸若しくはヌクレオチドである領域にわたって存在する。
配列比較については、通常、１つの配列が、試験配列が比較される参照配列として機能する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列と参照配列をコンピュータに入れ、必要に応じて部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムのパラメータを指定する。好ましくは、初期設定のプログラムパラメータを使用することができ、または代替のパラメータを指定することができる。次いで配列比較アルゴリズムはプログラムパラメータに基づいて参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを算出する。
「比較ウインドウ」は本明細書で使用されるとき、２つの配列が最適にアライメントされた後、配列が同一数の隣接する位置の参照配列と比べられ得る２０〜６００、普通約５０〜約２００、さらに普通約１００〜約１５０から成る群から選択される隣接する位置の数のうちの任意の１つのセグメントについての言及を含む。比較のためのアライメントの方法は当該技術分野で周知である。比較のための配列の最適なアライメントは、たとえば、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局在アライメントアルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）のグローバルアライメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ'ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似性法の検索によって、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実施によって（ＧＡＰ， ＢＥＳＴＦＩＴ， ＦＡＳＴＡ， ａｎｄ ＴＦＡＳＴＡ ｉｎ ｔｈｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， ５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓ．）、または手動のアライメント及び視覚検査（たとえば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ． １９９５ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）を参照）によって実施することができる。初期設定パラメータでのＳｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎのアライメントは、本明細書で記載されるように配列を比較する場合、使用されることが多い。
配列同一性パーセント及び配列類似性を決定するのに好適なアルゴリズムの別の例はＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、それはそれぞれＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９７７）及びＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３４１０（１９９０）に記載されている。ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムは通常初期設定パラメータで使用して本発明の核酸及びタンパク質の配列同一性パーセントを決定する。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウエアは全米バイオテクノロジー情報センターを介して公的に入手可能である。このアルゴリズムは、データベース配列における長さＷのワードとアライメントした場合、一致するまたはいくつかの正の値の閾値スコアＴを満たす、クエリ配列における同じ長さの短いワードを特定することによって先ず、高スコアの配列対（ＨＳＰ）を特定することを含む。Ｔは近傍のワードスコア閾値と呼ばれる。これらの近傍のワードヒットが、それらを含有するさらに長いＨＳＰを見いだすための検索を開始するシードとして作用する。ワードヒットを、累積アライメントスコアが増加し得る限り各配列に沿って両方向に拡大する。累積スコアは、ヌクレオチド配列についてはパラメータＭ（マッチ残基の対についての報酬スコア；常に＞０）及びＮ（ミスマッチ残基についてのペナルティスコア；常に＜０）を用いて算出される。アミノ酸配列については、スコア化マトリクスを用いて累積スコアを算出する。各方向へのワードヒットの拡大は、累積アライメントスコアが達成された最大の値から量Ｘ減る場合；１つ以上の負のスコアの酸基のアライメントの蓄積のために累積スコアがゼロ以下になる場合；またはいずれかの配列の末端に達する場合、中止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータＷ、Ｔ及びＸはアライメントの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、初期設定として、１１のワード長さ（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、１００のカットオフ、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、及び両鎖の比較を使用する。アミノ酸（タンパク質）配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムは初期設定として、３のワード長さ（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）及びＢＬＯＳＵＭ６２スコア化マトリクスを使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：１０９１５）を参照）。本発明の目的で、ＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムを初期設定パラメータと共に使用する。
「ファージディスプレイライブラリ」はその表面で外来性のペプチドまたはタンパク質が発現されるバクテリオファージの「ライブラリ」を指す。外来のペプチドまたはポリペプチドはファージカプシド外表面上に提示される。外来のペプチドは、ファージコートタンパク質の一部として組み込まれる組換え融合タンパク質として、普通ファージコートタンパク質ではないが、カプシド外表面に取り込まれるようになることができる組換え融合タンパク質として、またはそのようなタンパク質に共有結合若しくは非共有結合するようになるタンパク質若しくはペプチドとして提示されることができる。これは、ファージ粒子にパッケージすることができる核酸に外来性の核酸配列を挿入することによって達成される。そのような外来性の核酸配列は、たとえば、ファージコートタンパク質遺伝子のコード配列に挿入され得る。外来性の配列がインフレームでクローニングされるのであれば、それがコードするタンパク質はコートタンパク質の一部として発現されるであろう。従って、１つ以上の個体のＢ細胞レパトア全体をコードする遺伝子セグメントから作製される抗体レパトアのもののような核酸配列のライブラリはそのようにファージに挿入されて「ファージライブラリ」を創る。核酸ライブラリによってコードされるものの代表的なペプチドまたはタンパク質がファージによって提示されるので、「ペプチドディスプレイライブラリ」が生成される。そのようなライブラリの構築には種々のバクテリオファージが使用される一方で、通常、繊維状ファージが使用される（Ｄｕｎｎ （１９９６） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ７：５４７−５５３）。たとえば、以下のファージディスプレイライブラリの記載を参照のこと。
用語「キメラ抗体」は免疫グロブリン分子のアミノ酸配列が２つ以上の種に由来する抗体を指す。通常、軽鎖及び重鎖双方の可変領域は所望の特異性、親和性及び能力を持つ哺乳類の１つの種（たとえば、マウス、ラット、ウサギ、等）に由来する可変領域に対応する一方で、定常領域は別のもの（普通、ヒト）に由来する抗体における配列に相同であってその種において免疫応答を誘発することを回避する。
用語「エピトープ」または「抗原決定基」または「抗原決定領域」は本明細書では互換的に使用されて、特定の抗体によって認識され、特異的に結合されることが可能である抗原のその部分を指す。抗原がポリペプチドである場合、エピトープは、隣接するアミノ酸、及びタンパク質の三次折り畳みによって並置される隣接しないアミノ酸の双方から形成され得る。隣接するアミノ酸から形成されるエピトープは通常、タンパク質変性の際に保持されるのに対して、三次折り畳みによって形成されるエピトープは通常、タンパク質変性の際に失われる。エピトープは通常、特有の空間配置において少なくとも３、さらに普通、少なくとも５または８〜１０のアミノ酸を含む。抗原決定基は抗体への結合についてインタクトな抗原（すなわち、免疫応答を誘発するために使用される「免疫原」）と競合することができる。
抗体間の競合は、試験下の免疫グロブリンが、共通する抗原に対する参照抗体の特異的な結合を阻害するアッセイによって測定される。多数の種類の競合結合アッセイ、たとえば、固相の直接または間接放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）、固相の直接または間接酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ（Ｓｔａｈｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ９：２４２−２５３ （１９８３）を参照）、固相の直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（Ｋｉｒｋｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３７：３６１４−３６１９ （１９８６）を参照）、固相の直接標識アッセイ、固相の直接標識サンドイッチアッセイ（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ， "Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，" Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ （１９８８）を参照）、１−１２５標識を用いた固相の直接標識ＲＩＡ（Ｍｏｒｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２５（１）：７−１５ （１９８８）を参照）、固相の直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（Ｃｈｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７６：５４６−５５２ （１９９０））、及び直接標識ＲＩＡ（Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃａｎｄ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３２：７７−８２ （１９９０））が既知である。通常、そのようなアッセイは、これらのいずれかを担持する固体表面または細胞に結合した精製抗原、未標識の試験免疫グロブリン及び標識された参照免疫グロブリンの使用を含む。競合阻害は、試験免疫グロブリンの存在下で固体表面または細胞に結合する標識の量を決定することによって測定される。普通、試験免疫グロブリンは過剰に存在する。競合アッセイによって特定される抗体（競合抗体）には、参照抗体と同じエピトープに結合する抗体、及び参照抗体が結合するエピトープに対して、立体障害が生じるのに十分に近傍の隣接するエピトープに結合する抗体が挙げられる。普通、競合する抗体が過剰に存在する場合、それは、共通する抗原への参照抗体の特異的結合を少なくとも５０％または７５％阻害するであろう。
本発明の抗体、たとえば、ＶＨポリペプチド、ＶＬポリペプチド、または単鎖抗体は組換え遺伝学の分野での日常的な技法を用いて生成され得る。本発明で使用される一般的な方法を開示している基本的な教科書には、Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （第３版、２００１）並びにＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９９）が挙げられる。
本発明のヒト化抗体は、ドナー抗体、通常マウス抗体の特異性、すなわち、抗原結合ループをヒトのフレームワークに移植することによって生成され得る。本明細書で提供されるヒトの軽鎖及び重鎖のフレームワーク領域は当業者によって容易に決定することができる。重鎖及び軽鎖の位置番号は、一般的な番号付け方式、たとえば、Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａの番号付け方式に従って指定される。Ｃｈｏｔｈｉａの番号付け方式はＫａｂａｔの方式と同一であるが、構造的に異なる位置にＣＤＲ−Ｌ１及びＣＤＲ−Ｈ１の挿入を置く。特に指示されない限り、配列の位置に関して本明細書ではＫａｂａｔの番号付け方式を使用する。特定のＶＨ及びＶＬの配列におけるアミノ酸残基の位置は特定の配列におけるアミノ酸の番号を指さず、むしろ、番号付け方式に関して指定されるような位置を指す。
ヒトの重鎖及び軽鎖のＣＤＲの位置及び従ってフレームワーク領域の位置は当該分野で標準である定義を用いて決定される。たとえば、以下の４つの定義が一般に使用される。Ｋａｂａｔの定義は配列の変動性に基づいており、最も一般的に使用される。Ｃｈｏｔｈｉａの定義は構造的なループ領域の位置に基づく。ＡｂＭの定義はＯｘｆｏｒｄ分子のＡｂＭ抗体モデル化ソフトウエアによって使用される、前記２つの間の折衷物である。接触定義は最近導入され、利用可能な複雑な結晶構造の解析に基づく。以下は４つの異なる定義を用いたループの位置、すなわち、ＣＤＲである。
本発明のＶＨ配列またはＶＬ配列は、配列番号５〜２２、２９〜５７、９１〜１００または１０７〜１１６によって構成される配列に対して典型的には少なくとも７０％の同一性、さらに典型的には７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する重鎖または軽鎖を含む。
さらに、多数の重要な残基が、好ましくはヒト化ＶＨ鎖及びＶＬ鎖で利用されるＯＳ２９６６のＣＤＲの外側で特定されている。たとえば、一実施形態では、ＶＨ鎖における１つ以上のアミノ酸残基は、残基４８、６７、６９、７３、７６、８０、８９、９１及び９３を含めてＯＳ２９６６（配列番号２）のそれと同一である。一実施形態では、ＶＬ鎖における１つ以上のアミノ酸残基は、残基３６及び７１を含めてＯＳ２９６６（配列番号４）のそれと同一である。
本発明のヒト化抗体はドナー抗体と同一のエピトープに結合し、たとえば、ＯＳ２９６６が結合する、同じインテグリンβ１のエピトープに結合するまたは同じインテグリンβ１のエピトープに結合するために競合する。抗体が同一エピトープに結合するかどうかを決定する方法は当該技術分野で周知であり、たとえば、抗体がドナー抗体と同じエピトープに結合するかどうかを決定するためのエピトープマッピングあるいは競合実験のための技法を開示しているＨａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９９を参照のこと。
本発明の安定なヒト化抗体はドナー抗体と比較すると変化した親和性を示し得る。たとえば、一部の実施形態では、単鎖ヒト化抗インテグリンβ１の親和性は、たとえば、ＯＳ２９６６のＶＨ領域及びＶＬ領域を含む単鎖抗体と比べて低下し得る。そのような低下は比較において１０倍程度であり得るが、通常、本発明のヒト化抗体は、相当する野生型抗体の親和性の少なくとも２５％、大抵の場合少なくとも５０％である親和性を有する（「相当する野生型抗体」は同じ実施形態の抗体、たとえば、ドナー抗体のＶＨ領域及びＶＬ領域を含むｓｃＦｖを指す）。一部の実施形態では、エピトープに対する親和性が上昇するので、本発明のヒト化抗体は相当する野生型抗体の親和性の２倍、時には５、１０、５０または１００倍である親和性を有する。
本発明の重鎖領域及び軽鎖領域は通常、組換えＤＮＡ技術を用いて得られる。これを行うのに一般に採用される組換えＤＮＡ法は当業者に周知である。通常、ドナー抗体のフレームワーク及びＣＤＲをコードする核酸配列をＰＣＲによって、たとえば、重複伸長によって生成する。この技法では、所望の配列をオリゴヌクレオチドに組み入れ、ＰＣＲを用いて所望のドナー及びヒトの配列を含む一連の産物を創ることによって、ドナー抗体の抗原結合配列が通常、ヒトのフレームワーク領域に連結される。次いで通常、追加のＰＣＲ反応を用いて適正な配向で産物を連結して、ドナー抗体のＣＤＲと共にヒトのフレームワーク領域を含むＶＨ鎖及びＶＬ鎖を創り得る。当業者に周知の技法を用いて、直接、またはペプチドリンカーをコードするＤＮＡ配列を介して、ＶＬ及びＶＨのＤＮＡ配列を一緒にライゲーションし得る。これらの技法にはＰＣＲと同様にインビトロでのライゲーションのような技法が含まれる。ＶＬ及びＶＨの配列はいずれの配向で連結されてもよい。
インビトロ増幅方法を通して当業者を指示するのに十分な技法の例は当該技術分野で周知である。
市販されていないオリゴヌクレオチドは、Ｖａｎ Ｄｅｖａｎｔｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：６１５９−６１６８（１９８４）に記載されたような自動化合成機を用いて、Ｂｅａｕｃａｇｅ及びＣａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｓ．２２：１８５９−１８６２（１９８１）によって最初に記載された固相ホスホルアミダイトトリエステル法に従って化学的に合成することができる。オリゴヌクレオチドの精製は、未変性アクリルアミドゲル電気泳動またはＰｅａｒｓｏｎ及びＲｅａｎｉｅｒ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．２５５：１３７−１４９（１９８３）に記載されたようなアニオン交換ＨＰＬＣによる。
クローニングした遺伝子及び合成したオリゴヌクレオチドの配列は、クローニングの後、たとえば、配列決定によって検証することができる。
ＰＣＲ産物を当業者に周知の市販されている好適なクローニングベクターにサブクローニングする。次いで重鎖または軽鎖のコード領域のヌクレオチド配列を決定する。
当業者は、可変領域について提供された配列情報を利用して、当業者に周知の幾つもの追加の方法を用いてこれらの配列をコードする核酸が得られることを十分に理解するであろう。従って、たとえば、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写増幅及び自家持続配列複製法のような他の増幅技法、または適当な配列のクローニング及び制限を含む好適な方法によってＦｖ領域をコードするＤＮＡを調製する。
本発明の抗体及び抗体断片をコードする核酸は、たとえば、ホスホトリエステル法、ホスホジエステル法、ジエチルホスホルアミダイト法、及び米国特許第４，４５８，０６６号の固体支持法のような方法を用いた直接化学合成によっても生成することができる。ＤＮＡ配列が化学的に合成されるのであれば、一本鎖オリゴヌクレオチドが生じるであろう。相補的配列とのハイブリッド形成または一本鎖を鋳型として用いたＤＮＡポリメラーゼによる重合によって、これを二本鎖ＤＮＡに変換し得る。単鎖Ｆｖ領域全体を化学的に合成することが可能である一方で、たとえば、重複伸長ＰＣＲを用いて通常後で一緒にスプライシングされる多数の短い配列（約１００〜１５０塩基）を合成することが好ましい。
核酸については、サイズはキロベース（ｋｂ）または塩基対（ｂｐ）のいずれかで与えられる。これらは、アガロース若しくはアクリルアミドゲル電気泳動、配列決定された核酸または公開されたＤＮＡ配列から導出された推定値である。タンパク質については、サイズはキロダルトン（ｋＤａ）またはアミノ酸残基の数で与えられる。タンパク質のサイズはゲル電気泳動、配列決定されたタンパク質、アミノ酸配列または公開されたタンパク質配列から推定される。
本発明の抗体のＶＨドメイン及びＶＬドメインは直接連結され、またはリンカーによって分離され、それぞれ軽鎖及び重鎖の可変抗体ドメインを安定化し得る。好適なリンカーは当業者に周知であり、それには、周知のＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ（配列番号１２２）リンカーまたはその変異体が挙げられる。たとえば、典型的なリンカーは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号１２３）である。本発明で使用することができる、ヒンジ領域を含む他のリンカーには、たとえば、Ａｌｆｔｈａｎら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８（７），７２５−３１；Ｃｈｏｉら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１（１），９４−１０６；Ｈｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６（１３），３０５５−６１；Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１０（４），４４５−５３；Ｐａｃｋら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）１１（１１），１２７１−７；及びＲｏｏｖｅｒｓら、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５０（ｌ）：５１−９に記載されたものが挙げられる。
ヒト化抗体、たとえば本発明のヒト化抗体、または本発明のヒト化抗体を含むイムノコンジュゲート若しくはキメラ抗体をコードするｃＤＮＡなどのクローニングされた遺伝子または核酸の高レベルの発現を得るためには、通常、抗体またはイムノコンジュゲートをコードする核酸を、転写を指示する適当なプロモータ、転写／翻訳のターミネータ、タンパク質をコードする核酸であれば、翻訳開始のためのリボソーム結合部位を含有する発現ベクターにサブクローニングする。好適な細菌プロモータは当該技術分野で周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋら及びＡｕｓｕｂｅｌらにて記載されている。タンパク質を発現させるための細菌の発現系は、たとえば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）及びサルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）（Ｐａｌｖａ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ ２２：２２９−２３５ （１９８３）； Ｍｏｓｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３０２：５４３−５４５ （１９８３）において入手可能である。そのような発現系のためのキットが市販されている。哺乳類細胞、酵母及び昆虫細胞のための真核生物発現系も当該技術分野で周知であり、市販されている。
大抵、細胞においてタンパク質を高レベルで発現させるために、発現される核酸配列を構築することにおいて発現系に対するコドン優先が考慮される。従って、１つの生物、たとえば、ヒトまたはマウスに由来する核酸が、発現系のコドン優先を適応させるために操作され得る。
異種性の核酸の発現を指示するのに使用されるプロモータは特定の適用に左右される。プロモータは、天然の設定では転写開始部位に由来するので、異種性の転写開始部位からほぼ同じ距離で任意で位置づけられる。しかしながら、当該技術分野で知られるように、この距離における若干の変動はプロモータ機能を失うことなく受け入れることができる。
プロモータに加えて、発現ベクターは通常、宿主細胞におけるタンパク質をコードする核酸の発現に必要とされる追加の要素すべてを含有する転写単位または発現カセットを含有する。従って、典型的な発現カセットは、発現されるタンパク質をコードする核酸配列に機能的に連結されたプロモータ、及び転写の効率的なポリアデニル化に必要とされるシグナル、リボソーム結合部位及び転写終結を含有する。タンパク質をコードする核酸配列は通常、切断可能なシグナルペプチド配列に連結されて形質転換された細胞によるコードされたタンパク質の分泌を促進する。そのようなシグナルペプチドには、とりわけ、組織プラスミノーゲン活性化因子、インスリン、ニューロン増殖因子及びＨｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓの幼若ホルモンエステラーゼに由来するシグナルペプチドが挙げられる。カセットの追加の要素には、エンハンサ、並びにゲノムＤＮＡが構造遺伝子として使用されるのであれば、機能的なスプライシングのドナー及びアクセプターの部位を伴ったイントロンが挙げられ得る。
プロモータ配列に加えて、発現カセットは構造遺伝子の下流に転写終結領域も含有して効率的な終結を提供すべきである。終結領域はプロモータ配列と同じ遺伝子から得てもよく、または異なる遺伝子から得てもよい。
特定の宿主細胞で使用するのに好適である発現制御配列はその細胞で発現される遺伝子をクローニングすることによって得られることが多い。任意でリボソーム結合部位配列と共にオペレータを伴った転写開始のためのプロモータを含むように本明細書では定義される一般に使用される原核細胞制御配列には、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）及びラクトース（ｌａｃ）プロモータ系（Ｃｈａｎｇｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ （１９７７） １９８： １０５６）、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモータ系（Ｇｏｅｄｄｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． （１９８０） ８： ４０５７）、ｔａｃプロモータ（ＤｅＢｏｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． （１９８３） ８０：２１−２５）；並びにλ−由来のＰ．ｓｕｂ．Ｌプロモータ及びＮ−遺伝子リボソーム結合部位（Ｓｈｉｍａｔａｋｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ （１９８１） ２９２： １２８）のような一般的に使用されるプロモータが挙げられる。特定のプロモータ系は本発明にとって重要ではなく、原核生物で機能する任意の利用可能なプロモータを使用することができる。
標準的な細菌の発現ベクターには、ｐＢＲ３２２−系プラスミド、たとえば、ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（商標）、ｐＳＫＦ、ｐＥＴ２３Ｄ、λファージ由来のベクターのようなプラスミド、及びＧＳＴやＬａｃＺのような融合発現系が挙げられる。エピトープタグ、たとえば、ｃ−ｍｙｃ、ＨＡ−タグ、６−Ｈｉｓタグ（配列番号１２４）、マルトース結合タンパク質、ＶＳＶ−Ｇタグ、抗−ＤＹＫＤＤＤＤＫタグ（配列番号１２５）、または任意のそのようなタグも組換えタンパク質に付加して単離の好都合な方法を提供するが、そのうちの多数は当業者に周知である。
哺乳類細胞、酵母及び昆虫細胞のための真核生物発現系は当該技術分野で周知であり、市販もされている。酵母では、ベクターには、酵母組込みプラスミド（たとえば、ＹＩｐ５）及び酵母複製プラスミド（ＹＲｐシリーズのプラスミド）及びｐＧＰＤ−２が挙げられる。真核生物ウイルスに由来する調節要素を含有する発現ベクターは通常、真核生物発現ベクター、たとえば、ＳＶ４０ベクター、パピローマウイルスベクター、及びエプスタインバーウイルスに由来するベクターにおいて使用される。他の例示的な真核生物ベクターには、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥ；及びＣＭＶプロモータ、ＳＶ４０初期プロモータ、ＳＶ４０後期プロモータ、メタロチオネインプロモータ、マウス乳癌ウイルスプロモータ、ラウス肉腫ウイルスプロモータ、ポリヘドリンプロモータ、または真核細胞における発現に有効であることが示された他のプロモータの指示のもとでタンパク質の発現を可能にする他のベクターが挙げられる。
一部の発現系は、たとえば、チミジンキナーゼ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、及びジヒドロ葉酸還元酵素のような、遺伝子増幅を提供するマーカーを有する。或いは、遺伝子増幅を含まず、たとえば、ポリヘドリンプロモータまたは他の強力なバキュロウイルスプロモータの指示のもとでＧＰＣＲをコードする配列と共に昆虫細胞においてバキュロウイルベクターを用いる高収率の発現系も好適である。
発現ベクターに通常含まれる要素にはまた、大腸菌で機能するレプリコン、抗生剤耐性をコードして組換えプラスミドを有する細菌の選択を可能にする遺伝子、及び真核生物配列の挿入を可能にするプラスミドの非必須領域における特有の制限部位が挙げられる。選択される特定の抗生剤耐性遺伝子は重要ではなく、当該技術分野で既知の多数の耐性遺伝子のいずれかが好適である。原核生物の配列は、必要に応じて、真核細胞におけるＤＮＡの複製を妨害しないように任意で選択される。
標準的な形質移入法を用いて大量のタンパク質を発現する細菌、哺乳類、酵母または昆虫の細胞株を作製し、次いで標準の技法を用いてそれを精製する（たとえば、Ｃｏｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４：１７６１９−１７６２２ （１９８９）； Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ， ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， ｖｏｌ． １８２ （Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ， ｅｄ．， １９９０）を参照）。真核細胞及び原核細胞の形質転換は標準の技法に従って行われる（たとえば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｊ． Ｂａｃｔ． １３２：３４９−３５１ （１９７７）； Ｃｌａｒｋ−Ｃｕｒｔｉｓｓ ＆ Ｃｕｒｔｉｓｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １０１：３４７−３６２ （Ｗｕ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ， １９８３を参照）。
宿主細胞に外来のヌクレオチド配列を導入するための周知の手順のいずれかが使用され得る。これらには、リン酸カルシウム形質移入、ポリブレン、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム、微量注入、プラズマベクター、ウイルスベクター、及びクローニングしたゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡまたは他の遺伝物質を宿主細胞に導入するための他の周知の方法の使用が挙げられる（たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ、上記を参照）。使用される特定の遺伝子操作手順が、本発明のポリペプチドを発現することが可能である宿主細胞に少なくとも１つの遺伝子を上手く導入することが可能であればよい。
発現ベクターを細胞に導入した後、形質移入した細胞をタンパク質の発現に好ましい条件下で培養し、以下で特定される標準の技法を用いてタンパク質を培養物から回収する。
当業者は、その生物活性を減らすことなく、本発明のポリペプチド（すなわち、抗体、標識若しくはエフェクター、または抗体を用いて形成されるイムノコンジュゲート）をコードする核酸に対して改変を行うことができることを認識する。幾つかの改変を行って標的分子のクローニング、発現または融合タンパク質への組入れを円滑にし得る。そのような改変は当業者に周知であり、それには、たとえば、終結コドン、開始部位を提供するためのアミノ末端に付加されるメチオニン、好都合に位置する制限部位を創るためのいずれかの末端に配置される追加のアミノ酸、または精製工程を助けるための追加のアミノ酸（たとえば、ポリＨｉｓ）が挙げられる。
いったん発現されると、硫酸アンモニウム沈殿、親和性カラム、カラムクロマトグラフィ等を含む標準の手順に従って本発明の組換えの抗体、イムノコンジュゲート及び／またはエフェクター分子を精製することができる（一般に、Ｒ． Ｓｃｏｐｅｓ， ＰＲＯＴＥＩＮ ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｎ．Ｙ． （１９８２）を参照）。少なくとも約９０〜９５％均質性の実質的に純粋な組成物が好まれ、９８〜９９％以上の均質性が医薬用途には最も好まれる。部分的にまたは治療用に使用されるのであれば所望のような均質性にいったん精製されると、ポリペプチドは実質的に内毒素を含まないはずである。
単鎖抗体の発現のための方法及び／または大腸菌のような細菌からの単鎖抗体を含む適当な活性形態へのリフォールディングの方法は記載されており、周知であり、本発明の抗体に適用可能である。すべて参照によって本明細書に組み入れられるＢｕｃｈｎｅｒら、Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０５：２６３−２７０（１９９２）；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：５４５（１９９１）；Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５（１９８９）及びＷａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４（１９８９）を参照のこと。
大抵、大腸菌または他の細菌に由来する機能的な異種タンパク質は封入体から単離され、強力な変性剤を用いた可溶化、及びその後のリフォールディングを必要とする。可溶化工程の間で、当該技術分野で周知のように、ジスルフィド結合を分離するために還元剤が存在しなければならない。還元剤を伴う例示的な緩衝液は、０．１ＭのトリスｐＨ８、６Ｍのグアニジン、２ｍＭのＥＤＴＡ、０．３ＭのＤＴＥ（ジチオエリスリトール）である。参照によって本明細書に組み入れられるＳａｘｅｎａら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、９：５０１５−５０２１（１９７０）に記載されたように、特に上記のＢｕｃｈｎｅｒらによって記載されたように還元及び酸化の形態での低分子量チオール試薬の存在下ではジスルフィド結合の再酸化が生じ得る。
復元は通常、変性され、還元されたタンパク質のリフォールディング緩衝液への希釈（たとえば、１００倍）によって達成される。例示的な緩衝液は、０．１Ｍのトリス、ｐＨ８．０、０．５ＭのＬ−アルギニン、８ｍＭの酸化グルタチオン（ＧＳＳＧ）及び２ｍＭのＥＤＴＡである。
二本鎖抗体の精製プロトコールに対する改変として、重鎖領域及び軽鎖領域が別々に可溶化され、還元され、次いでリフォールディング溶液にて組み合わせられる。これら２つのタンパク質を、他方に対する一方のタンパク質の５倍モル過剰を超えないようなモル比で混合すると好ましい収率が得られる。酸化還元シャフリング（ｒｅｄｏｘ−ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）が完了した後、過剰な酸化型グルタチオンまたは他の低分子量酸化化合物をリフォールディング溶液に加えることが望ましい。
組換え法に加えて、標準のペプチド合成を用いて全体としてまたは部分的に本発明の抗体またはイムノコンジュゲートを構築することもできる。長さ約５０未満のアミノ酸の本発明のポリペプチドの固相合成は、配列のＣ末端のアミノ酸を不溶性の支持体に結合し、その後、配列における残りのアミノ酸を順に付加することによって達成され得る。固相合成の技法は、Ｂａｒａｎｙ及びＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，ＴＨＥ ＰＥＰＴＩＤＥＳ：ＡＮＡＬＹＳＩＳ，ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ，ＢＩＯＬＯＧＹ．ＶＯＬ．２：ＳＰＥＣＩＡＬ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＰＥＰＴＩＤＥ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ，ＰＡＲＴ Ａ．ｐｐ．３−２８４；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１５６（１９６３）及びＳｔｅｗａｒｔら、ＳＯＬＩＤ ＰＨＡＳＥ ＰＥＰＴＩＤＥ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ，２ＮＤ ＥＤ．，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．（１９８４）によって記載されている。長さの長いタンパク質は短い断片のアミノ末端とカルボキシル末端の縮合によって合成され得る。カルボキシル末端の活性化（たとえば、カップリング剤、Ｎ，Ｎ'−ジシクロヘキシルカルボジイミドの使用による）によってペプチド結合を形成する方法は当業者に既知である。
本発明の抗体の保存的に改変された変異体は、本発明のヒト化抗体のような関心対象のタンパク質と、アミノ酸レベルで少なくとも８０％の配列類似性、多くは少なくとも８５％の配列類似性、９０％の配列類似性、または少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の配列類似性を有する。
言及されるように、用語「保存的に改変された変異体」はアミノ酸配列及び核酸配列の双方に適用することができる。特定の核酸配列に関連して、保存的に改変された変異体は、同一の若しくは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸配列、または核酸がアミノ酸配列をコードしていないのであれば、本質的に同一の核酸配列を指す。遺伝子コードの縮重のために、多数の機能的に同一の核酸が所与のポリペプチドをコードする。たとえば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ及びＧＣＵはすべてアミノ酸アラニンをコードする。従って、アラニンがコドンによって特定されるすべての位置において、コードされるポリペプチドを変化させることなくコドンを記載した対応するコドンのいずれかに変えることができる。そのような核酸の変化は、保存的に改変された変異の１種である「サイレント変化」である。ポリペプチドをコードする本明細書の各核酸配列は、核酸の考えられる各サイレント変化も記載する。当業者は、核酸における各コドン（普通メチオニンのための唯一のコドンであるＡＵＧを除く）を改変して機能的に同一の分子を得ることができる。従って、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変化は各記載された配列に潜在的に含まれる。
アミノ酸配列に関しては、当業者は、コードされた配列における単一のアミノ酸または小さな比率のアミノ酸を変える、付加するまたは欠失させる、核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の配列に対する個々の置換、欠失または付加は、変化が化学的に類似するアミノ酸によるアミノ酸の置換を生じる「保存的に改変された変異体」であることを認識するであろう。
本発明の一実施形態は、エフェクター分子または検出可能な標識に連結された、本発明のヒト化抗体を含むイムノコンジュゲートを提供する。好ましくは、エフェクター分子は、たとえば、毒素、化学療法剤、小分子、サイトカイン若しくはケモカイン、酵素または放射性標識のような治療用分子である。例示的な毒素にはシュードモナス外毒素及びジフテリア毒素が挙げられるが、これらに限定されない。好適な毒素は、たとえば、Ｃｈａｕｄｈａｒｙら、（１９８７）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４：４５３８，Ｃｈａｕｄｈａｒｙら、（１９８９）、Ｎａｔｕｒｅ、３３９：３９４，Ｂａｔｒａら、（１９９１）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１：２２００．Ｂｒｉｎｋｍａｎｎら、（１９９１）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：８６１６，Ｓｉｅｇａｌｌ，（１９９５）、Ｓｅｍｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．６：２８９に記載されている。小分子の例には、たとえば、タキソール、ドキソルビシン、エトポシド及びブレオマイシンのような化学療法化合物が挙げられるが、これらに限定されない。例示的なサイトカインには、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６及びＩＬ−１２が挙げられるが、これらに限定されない。好適なサイトカイン及びケモカインは、たとえば、Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍら、（２０００）、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、８８：２６７及びＸｕら、（２０００）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、６０：４４７５及びＢｉｒａｇｙｎら、（１９９９）、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：２５３に記載されている。例示的な酵素には、ＲＮＡ分解酵素、ＤＮＡ分解酵素、プロテアーゼ、キナーゼ及びカスパーゼが挙げられるが、これらに限定されない。好適なプロテアーゼは、たとえば、Ｂｏｓｓｌｅｔら、（１９９２）、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、６５：２３４，Ｇｏｓｈｏｍら、（１９９３）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：２１２３，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓら、（１９９５）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５：６３，Ｍｉｃｈａｅｌら、（１９９６）、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２：４７，Ｈａｉｓｍａら、（１９９８）、Ｂｌｏｏｄ、９２：１８４に記載されている。例示的な放射性同位元素には３２Ｐ及び１２５Ｉが挙げられるが、これらに限定されない。好適な放射性核種は、たとえば、Ｃｏｌｃｈｅｒら、（１９９９）、Ａｎｎ．ＮＹ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８０：２６３に記載されている。追加の例示的なエフェクター部分は、たとえば、同種のまたは異種の抗体に由来するＦｃ断片である。
タンパク質エフェクター分子の配列が、エフェクタータンパク質の機能的利点に実質的に影響を及ぼさない方法で変えられ得ることが当業者によって十分に理解されるであろう。たとえば、グリシンとアラニンは、アスパラギン酸とグルタミン酸及びアスパラギンとグルタミンのように通常、相互交換可能であると見なされる。当業者は、エフェクター配列の多数の異なる変化がネイティブのエフェクターと大まかに同じ活性を持つエフェクターをコードすることを認識するであろう。
エフェクター分子と抗体は、上述のような化学的手段または組換え手段によってコンジュゲートされ得る。化学的な修飾には、たとえば、タンパク質化学の当該技術分野で周知である方法によって直接または連結化合物を介してエフェクター分子と抗体を互いに連結する目的での誘導体化が挙げられる。共有結合の手段及び非共有結合の手段の双方を本発明のヒト化抗体と共に使用し得る。
抗体にエフェクター分子を結合する手順は抗体に結合させる部分の化学的な構造に従って変化するであろう。ポリペプチドは通常、種々の官能基、たとえば、エフェクター分子の結合を生じる抗体上の好適な官能基との反応に利用可能であるカルボン酸（ＣＯＯＨ）基、遊離のアミン（−ＮＨ２）基またはスルフヒドリル（−−ＳＨ）基を含有する。
或いは、追加の反応性官能基を露出するまたは結合するように抗体を誘導体化する。誘導体化には、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ Ｉｌｌから入手可能なもののような多数のリンカー分子のいずれかの連結が含まれ得る。
リンカーは抗体及びエフェクター分子双方への共有結合を形成することが可能である。好適なリンカーは当業者に周知であり、それには、直鎖若しくは分枝鎖の炭素リンカー、複素環炭素リンカーまたはペプチドリンカーが挙げられるが、これらに限定されない。抗体及びエフェクター分子がポリペプチドである場合、リンカーは側鎖を介して（たとえば、システインへのジスルフィド結合を介して）構成的なアミノ酸に連結され得る。しかしながら、好まれる実施形態では、末端アミノ酸のα炭素アミノ基及びカルボキシル基に連結されるであろう。
一部の実施形態では、イムノコンジュゲートが標的部位に到達している場合、抗体からエフェクター分子を遊離させることが望ましい。従って、これらの状況では、イムノコンジュゲートは標的部位の近傍で切断可能である結合を含むであろう。抗体からエフェクター分子を放出するためのリンカーの切断は、酵素活性によってまたはイムノコンジュゲートが標的細胞内で若しくは標的部位の近傍でさらされる条件によって促され得る。標的部位が腫瘍である場合、腫瘍部位に存在する条件下（たとえば、腫瘍関連酵素または酸性ｐＨに曝露される場合）で切断可能であるリンカーが使用され得る。
現在好まれる化学的結合の実施形態では、エフェクター分子と抗体を連結する手段は、最終的にエフェクター分子と抗体の間での分子間ジスルフィド結合の形成に寄与するヘテロ二官能性カップリング試薬を含む。本発明のためのこの能力に有用であるカップリング試薬の他の種類は、たとえば、米国特許第４，５４５，９８５号に記載されている。或いは、分子間ジスルフィドは、天然に存在するまたは遺伝子操作で挿入されるエフェクター分子と抗体におけるシステイン間で好都合に形成され得る。エフェクター分子と抗体を連結する手段はまた、ヘテロ二官能性架橋試薬、または特定の低ｐＨ切断可能な架橋剤、または特定のプロテアーゼ切断可能な架橋剤、または他の切断可能な若しくは切断できない化学結合の間でのチオエーテル結合も使用し得る。エフェクター分子と抗体を連結する手段はまた、標準のペプチド合成化学または組換え手段によって別々に合成されるエフェクター分子と抗体の間で形成されるペプチジル結合も含み得る。
エフェクター分子と本発明の抗体の例示的な化学修飾には、周知の方法（たとえば、Ｌｉｓｉ， ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ４：１９ （１９８２）； Ｂｅａｕｃｈａｍｐ， ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． １３１：２５ （１９８２）； ａｎｄ Ｇｏｏｄｓｏｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：３４３ （１９９０）を参照）に従った、循環系における滞留時間を延ばし、免疫原性を減らすためのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）による誘導体化も含まれる。
本発明の抗体は任意で検出可能な標識に共有結合または非共有結合され得る。そのような使用に好適な検出可能な標識には、分光学、光化学、生化学、免疫化学、電気、光学または化学の手段によって検出可能な組成物が挙げられる。本発明における有用な標識には、磁気ビーズ（たとえば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ）、蛍光色素（たとえば、フルオレセインイソチオシアネート、Ｔｅｘａｓ ｒｅｄ、ローダミン、緑色蛍光タンパク質等）、放射性標識（たとえば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３２Ｐ）、酵素（たとえば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、及びＥＬＩＳＡで一般に使用される他のもの）及び、たとえば、コロイド状金または着色されたガラス若しくはプラスチック（たとえば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス等）のビーズのような比色標識が挙げられる。
そのような標識を検出する方法は当業者に周知である。従って、たとえば、放射性標識は写真フィルムまたはシンチレーションカウンタを用いて検出してもよく、蛍光マーカーは放出された照光を検出する光検出器を用いて検出してもよい。酵素標識は通常、酵素に基質を提供し、基質上での酵素の作用によって生じる反応生成物を検出することによって検出され、比色標識は着色された標識を単に視覚化することによって検出される。
本発明の抗体及び／またはイムノコンジュゲートの組成物は、たとえば、静脈内投与または体腔への投与のような非経口投与に特に有用である。
投与のための組成物は一般に、薬学的に許容可能なキャリア、特に水性キャリアに溶解された抗体及び／またはイムノコンジュゲートの溶液を含む。種々の水性キャリア、たとえば、緩衝生理食塩水等を使用することができる。これらの溶液は無菌であり、一般に望ましくないものを含まない。これらの組成物は従来の周知の無菌化法によって無菌化され得る。組成物は、たとえば、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、毒性調整剤等、たとえば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム等のようなほぼ生理的条件に必要とされるような薬学的に許容可能な補助物質を含有し得る。これらの製剤における融合タンパク質の濃度は、広く変化することができ、選択される投与の特定の方式及び患者のニーズに従って、主として、流体容積、粘度、体重等に基づいて選択されるであろう。
従って、静脈投与用の本発明の典型的な医薬組成物は、１日当たり患者当たり約０．１〜１０ｍｇである。１日当たり患者当たり０．１ｍｇから約１００ｍｇまでの投与量が使用され得る。投与可能な組成物を調製する実際の方法は当業者に既知または明らかであり、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮのＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥ，第１９版，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（１９９５）のような出版物にさらに詳細に記載されている。
本発明の組成物は治療用処置のために投与することができる。治療的な適用では、組成物は、疾患を患っている患者にその疾患及びその合併症を治癒させるまたは少なくとも部分的に止めるのに十分な量で投与される。これを達成するのに適正な量を「治療的に有効な用量」と定義する。この使用に有効な量は疾患の重症度及び患者の健康の一般的な状態に左右される。化合物の有効量は、症状の主観的な緩和または臨床医若しくは他の資格のある観察者によって言及されるような客観的に特定可能な改善を提供するものである。
患者によって必要とされ、認容されるような投与量及び回数に応じて組成物の単回投与または複数回投与が実施される。任意の事象で、組成物は十分な量の本発明のタンパク質を提供して患者を効果的に治療すべきである。好ましくは、投与量は１回投与されるが、治療結果が達成されるまで、または副作用が治療の中断の理由となるまで定期的に適用され得る。一般に、用量は、患者に受け入れられない毒性を生じることなく、疾患の症状または兆候を治療するまたは改善するのに十分である。
本発明のイムノコンジュゲート組成物の制御放出性非経口製剤は、埋没物、油性注入物または粒子状システムとして作製することができる。タンパク質送達システムの広い概説については、参照によって本明細書に組み入れられるＢａｎｇａ，Ａ．Ｊ．，ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＰＥＰＴＩＤＥＳ ＡＮＤ ＰＲＯＴＥＩＮＳ：ＦＯＲＭＵＬＡＴＩＯＮ，ＰＲＯＣＥＳＳＩＮＧ，ＡＮＤ ＤＥＬＩＶＥＲＹ ＳＹＳＴＥＭＳ，Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．，Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，Ｐａ．，（１９９５）を参照のこと。粒子状システムには、マイクロスフェア、マイクロ粒子、マイクロカプセル、ナノカプセル、ナノスフェア及びナノ粒子が挙げられる。マイクロカプセルは中核として治療用タンパク質を含有する。マイクロスフェアでは、治療剤は粒子全体にわたって分散される。約１μｍより小さい粒子、マイクロスフェア及びマイクロカプセルはそれぞれ一般にナノ粒子、ナノスフェア及びナノカプセルと呼ばれる。キャピラリーはナノ粒子のみが静脈内に投与されるように約５μｍの直径を有する。マイクロ粒子は通常直径１００μｍ前後であり、皮下または筋肉内に投与される。たとえば、参照によって本明細書に組み入れられるＫｒｅｕｔｅｒ，Ｊ．，ＣＯＬＬＯＩＤＡＬ ＤＲＵＧ ＤＥＬＩＶＥＲＹ ＳＹＳＴＥＭＳ，Ｊ．Ｋｒｅｕｔｅｒ編，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｐｐ．２１９−３４２（１９９４）；並びにＴｉｃｅ及びＴａｂｉｂｉ，ＴＲＥＡＴＩＳＥ ＯＮ ＣＯＮＴＲＯＬＬＥＤ ＤＲＵＧ ＤＥＬＩＶＥＲＹ，Ａ．Ｋｙｄｏｎｉｅｕｓ編，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｐｐ．３１５−３３９，（１９９２）を参照のこと。
本発明のイムノコンジュゲート組成物のイオン制御放出のためにポリマーを使用することができる。制御された薬剤放出で使用するための種々の分解性及び非分解性のポリマーマトリクスが当該技術分野で既知である（Ｌａｎｇｅｒ， Ｒ．， Ａｃｃｏｕｎｔｓ Ｃｈｅｍ． Ｒｅｓ． ２６：５３７−５４２ （１９９３））。たとえば、ブロックコポリマーであるポラキサマー４０７は低温では粘性であるが流動性の液体として存在するが、体温では半固体のゲルを形成する。それは、製剤及び組換えのインターロイキン−２やウレアーゼの製剤及び持続送達のための有効なビヒクルであることが示されている（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ． ９：４２５−４３４ （１９９２）； ａｎｄ Ｐｅｃ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐａｒｅｎｔ． Ｓｃｉ． Ｔｅｃｈ． ４４（２）：５８−６５ （１９９０））。或いは、タンパク質の制御放出のためのマイクロキャリアとしてヒドロキシアパタイトが使用されている（Ｉｊｎｔｅｍａ， ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｈａｒｍ． １１２：２１５−２２４ （１９９４））。さらに別の態様では、脂質でカプセル化した薬剤の制御放出並びに薬剤標的化にリポソームが使用される（Ｂｅｔａｇｅｒｉ， ｅｔ ａｌ．， ＬＩＰＯＳＯＭＥ ＤＲＵＧ ＤＥＬＩＶＥＲＹ ＳＹＳＴＥＭＳ， Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｉｎｃ．， Ｌａｎｃａｓｔｅｒ， Ｐａ． （１９９３））。治療用タンパク質の制御放出のための多数の追加のシステムが既知である。たとえば、それぞれ参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第５，０５５，３０３号、同第５，１８８，８３７号、同第４，２３５，８７１号、同第４，５０１，７２８号、同第４，８３７，０２８号、同第４，９５７，７３５号、同第５，０１９，３６９号、同第５，０５５，３０３号、同第５，５１４，６７０号、同第５，４１３，７９７号、同第５，２６８，１６４号、同第５，００４，６９７号、同第４，９０２，５０５号、同第５，５０６，２０６号、同第５，２７１，９６１号、同第５，２５４，３４２号及び同第５，５３４，４９６号を参照のこと。
本明細書で使用されるとき、用語「癌」及び「癌性」は、細胞集団が無秩序な細胞増殖を特徴とする哺乳類における生理的な状態を指すまたは記載する。癌の例には、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫、白血病、良性または悪性の腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。そのような癌のさらに特定の例には、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺腫、肺の扁平上皮癌、腹膜の癌、肝細胞癌、消化器癌、膵臓癌、膠芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、脳腫瘍、肝臓癌腫及び頭頚部の種々のタイプの癌、Ｉ型またはＩＩ型の神経線維腫症が挙げられる。そのような癌の他の例には、治療に耐性である、難治性であるまたは転移性であるものが挙げられる。
治療され得る他の疾患または障害には「炎症性の疾患または障害」が挙げられる。本明細書で使用されるような「炎症性の疾患または障害」には、掻痒症、皮膚の炎症、乾癬、多発性硬化症、関節リウマチ、変形性関節症、全身性エリテマトーデス、ハシモト甲状腺炎、重症筋無力症、Ｉ型またはＩＩ型の糖尿病、喘息、炎症性肺損傷、炎症性肝臓損傷、炎症性糸球体損傷、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、刺激性接触皮膚炎、脂漏性皮膚炎、シェーグレン症候群、角結膜炎、ブドウ膜炎、炎症性大腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、関節、皮膚または筋肉の炎症性疾患、急性または慢性の特発性炎症性関節炎、筋炎、脱髄疾患、慢性閉塞性肺疾患、間質性肺疾患、間質性腎炎及び慢性活動性肝炎が挙げられるが、これらに限定されない。
「転移」は本明細書で使用されるとき、新しい位置での類似の癌性病変の発生を伴って癌が起源の部位から体の他の領域に広がるまたは移動する過程を指す。「転移性の」または「転移する」細胞は、近隣の細胞との接着性接触を失い、血流またはリンパを介して疾患の原発部位から移動し、近隣の体構造に浸潤するものである。
本明細書で使用されるとき、用語「対象」は、特定の治療のレシピエントとなる、ヒト、非ヒト霊長類、齧歯類等を含むが、これらに限定されない任意の動物（たとえば、哺乳類）を指す。通常、用語「対象」及び「患者」はヒト対象に関して本明細書では互換的に使用される。
本明細書で使用されるとき、用語「癌を有することが疑われる対象」は、癌を示す１つ以上の症状（たとえば、目立つしこりまたは塊）が見つかっているまたは癌のスクリーニングを受けている（たとえば、定期検診の間）対象を指す。癌を有することが疑われる対象は１つ以上のリスク因子も有し得る。癌を有することが疑われる対象は一般に癌について調べられていない。しかしながら、「癌を有することが疑われる対象」には、初期診断を受けたが、癌の病期が分からない個体も包含される。用語にはさらに、一度癌を有した人々（たとえば、再発の個体）も含まれる。
本明細書で使用されるとき、用語「癌のリスクがある対象」は特定の癌を発症する１つ以上のリスク因子を持つ対象を指す。リスク因子には、性別、年齢、遺伝的素質、環境曝露、癌の以前の発症、既存の非癌性疾患及びライフスタイルが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用されるとき、用語「対象における癌を特徴付けること」は、良性、前癌性または癌性の組織の存在、癌の病期及び対象の予後を含むがこれらに限定されない、対象における癌試料の１つ以上の特性の特定を指す。癌は、本明細書で開示される癌マーカーを含むがこれらに限定されない、１つ以上の癌マーカー遺伝子の発現の特定によって特徴付けることができる。
本明細書で使用されるとき、用語「細胞癌マーカー」、「癌細胞マーカー」、「腫瘍細胞マーカー」または「固形腫瘍細胞マーカー」は、その発現レベルが単独でまたは他の遺伝子と組み合わせて非腫瘍形成性細胞と比べて腫瘍形成性癌細胞の存在と相関する、インテグリンβ１のような１つ若しくは複数の遺伝子、または前記１つ若しくは複数の遺伝子によって発現されるタンパク質、ポリペプチド若しくはペプチドを指す。相関は、遺伝子の発現の上昇または低下（たとえば、遺伝子によってコードされるｍＲＮＡまたはペプチドのレベルの上昇または低下）に関連し得る。
本明細書で使用されるとき、用語「非癌性対照に比べて低下または上昇した発現を検出すること」は、非癌性対照試料におけるレベルと比べた遺伝子の発現のレベル（たとえば、ｍＲＮＡまたはタンパク質のレベル）を測定することを指す。遺伝子発現は、本明細書で記載されるものを含むがこれらに限定されない、好適な方法を用いて測定することができる。
本明細書で使用されるとき、用語「前記試験化合物の非存在下に比べて前記試験化合物の存在下での細胞試料における遺伝子発現の変化を検出すること」は、試験化合物の非存在下と比べて試験化合物の存在下で変化した発現レベル（たとえば、上昇または低下した）を測定することを指す。遺伝子発現は好適な方法を用いて測定することができる。
本明細書で使用されるとき、用語「前記対象において癌を検出するための前記キットを使用するための指示書」は、対象に由来する試料において癌の検出及び特徴付けのためのキットに含有される試薬を使用するための指示書を指す。
本明細書で使用されるとき、「診断を提供すること」または「診断情報」は、患者が疾患若しくは状態を有するかどうかを決定すること、及び／または疾患若しくは状態を表現型カテゴリーに分類すること、または疾患若しくは状態の治療（一般的な治療若しくは特定の治療）の予後若しくは考えられる応答に関して意味を有するカテゴリーに分類することにおいて有用である情報を指す。同様に、診断は、対象が（腫瘍のような）状態を有していそうであろうとなかろうと、たとえば高リスクの腫瘍若しくは低リスクの腫瘍としての腫瘍の性質若しくは分類に関する情報、予後に関する情報及び／または適当な治療を選択するのに有用な情報を含むが、これらに限定されないいずれかの種類の診断情報を提供することを指す。治療の選択には、特定の化学療法剤または手術若しくは放射線のような他の治療法の選択、または治療法を保留する若しくは送達するかどうかの選択が含まれ得る。
本明細書で使用されるとき、用語「予後診断を提供すること」、「予後情報」または「予測情報」は、対象の将来の健康（たとえば、予想される罹患率または死亡率、癌になる可能性及び転移のリスク）に対する癌の存在の影響（たとえば、本発明の診断法によって決定されるような）に関する情報を提供することを指す。
本明細書で使用されるとき、「術後腫瘍組織」は、対象から取り除かれた（たとえば、手術の間に）癌性組織（たとえば、生検組織）を指す。
本明細書で使用されるとき、用語「癌と診断された対象」は、調べられて、癌性細胞を有することが見いだされた対象を指す。生検、x線、血液検査及び本発明の診断法を含むが、これらに限定されない好適な方法を用いて癌を診断することができる。
本明細書で使用されるとき、用語「生検組織」、「患者の試料」、「腫瘍試料」及び「癌試料」は、試料が癌細胞を含む癌性組織を含有するかどうかを決定する目的で、またはその癌性組織の遺伝子発現プロファイルを決定するために対象から取り出される細胞、組織または流体の試料を指す。一部の実施形態では、生検の組織または流体は対象が癌を有することが疑われるために得られる。生検の組織または流体は次いで癌、癌細胞及び／または癌細胞遺伝子の特徴的発現の存在または非存在について調べられる。
本発明の特定の実施形態では、たとえば、膵臓、結腸、乳房、肝臓、腎臓、脳、ＧＢＭ等のような癌細胞の発現は、非腫瘍形成性の結腸腫瘍細胞と比べて高いレベルのインテグリンβ１含む。インテグリンは、α鎖とβ鎖から成るヘテロ二量体の細胞外マトリクス（ＥＣＭ）細胞表面タンパク質であり、鎖は複数の相手と会合して異なるインテグリンを形成する。インテグリンは細胞性の接着及び移動において機能し、細胞を細胞外マトリクスまたは他の細胞の受容体に可逆的に接続するので、癌の浸潤及び転移で重要な役割を担う。インテグリンが介在する接着は細胞内シグナル伝達にも影響を及ぼすので細胞の生存、増殖及び分化を調節することができる。
インテグリンβ１は、最も多様な既知のαインテグリンと共に機能的な受容体を形成することができ、多様な範囲のＥＣＭ環境と相互作用する能力を生じ、癌に関わっている。たとえば、インテグリンβ１のシグナル伝達の増加は、臨床的に及び乳癌細胞株の双方で乳癌の悪性進行に関連する。
インテグリンβ１は腫瘍増殖に直接影響すると特定されている。具体的には、抗インテグリンβ１抗体による腫瘍の治療は腫瘍のサイズを小さくし、転移を阻害する。
一部の実施形態では、本発明は癌のマーカーとしてのインテグリンβ１の発現の検出方法を提供する。一部の実施形態では、発現は直接測定され（たとえば、タンパク質レベル）、一部の実施形態では、発現は組織試料（たとえば、生検試料）にて検出される。他の実施形態では、発現は体液（たとえば、血漿、血清、全血、粘液及び尿を含むが、これらに限定されない）にて検出される。本発明はさらにマーカーの検出のためのキットを提供し、一部の実施形態では、癌細胞マーカーの存在を用いて対象に予後診断を提供する。提供される情報も用いて治療の方向を指示する。たとえば、対象が固形腫瘍細胞を示すマーカーを有することが見いだされれば、それらが有効である可能性が高い早い時点で（たとえば、転移の前に）追加の治療（たとえば、ホルモン療法または放射線療法）を開始することができる。加えて、対象がホルモン療法に応答しない腫瘍を有することが見いだされれば、そのような治療法の費用及び不都合を回避することができる。
実施形態では、インテグリンβ１の遺伝子発現はタンパク質のレベルを測定することによって検出される。タンパク質の発現は好適な方法によって検出することができる。一部の実施形態では、タンパク質は本明細書で記載される抗体を利用する免疫組織化学法によって検出される。
抗体結合は、当該技術分野で既知の技法、たとえば、放射性免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫放射測定アッセイ、ゲル拡散沈殿反応、免疫拡散アッセイ、ｉｎ ｓｉｔｕ免疫アッセイ（たとえば、コロイド状金、酵素または放射性同位元素標識を用いる）、ウエスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ（たとえば、ゲル凝集アッセイ、赤血球凝集アッセイ等）、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインＡアッセイ及び免疫電気泳動アッセイ等によって検出される。
一実施形態では、抗体結合は一次抗体上の標識を検出することによって検出される。別の実施形態では、一次抗体は、一次抗体に対する二次抗体または試薬の結合を検出することによって検出される。さらなる実施形態では、二次抗体が標識される。免疫アッセイにおいて結合を検出するための多数の方法が当該技術分野で既知であり、本発明の範囲内にある。
一部の実施形態では、自動検出アッセイが利用される。免疫アッセイの自動化の方法には、それぞれ参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第５，８８５，５３０号、同第４，９８１，７８５号、同第６，１５９，７５０号及び同第５，３５８，６９１号に記載されたものが挙げられる。一部の実施形態では、結果の解析及び提示も自動化される。たとえば、一部の実施形態では、癌マーカーに対応する一連のタンパク質の存在または非存在に基づいて予後診断を生成するソフトウエアが利用される。
他の実施形態では、それぞれ参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第５，５９９，６７７号及び同第５，６７２，４８０号に記載された免疫アッセイを使用することができる。
一部の実施形態では、コンピュータに基づく解析プログラムを用いて検出アッセイで生成された生データ（たとえば、所与の１つまたは複数のマーカーの存在、非存在または量）を臨床医のための予測値のデータに変換する。臨床医は好適な手段を用いて予測データを評価することができる。従って、一部の実施形態では、本発明は、遺伝学または分子生物学で訓練されていそうにない臨床医が生データを理解する必要がないというさらなる利益を提供する。データは最も有用な形態で直接臨床医に提示される。臨床医は次いで対象のケアを最適化するために直ちに情報を利用することができる。
本発明は、アッセイを行う実験室、情報の提供者、医療関係者及び対象への情報またはそれから情報を受け取る、処理する及び伝達することが可能である方法を熟考する。たとえば、本発明の一部の実施形態では、試料（たとえば、生検材料または血清若しくは尿の試料）は対象から得られ、世界の任意の地域（たとえば、対象が居住するまたは情報が最終的に利用される国とは異なる国）に位置するプロファイリングサービス（たとえば、医療施設の臨床検査室、ゲノムプロファイリングビジネス等）に提出され、生データを生成する。試料が組織または他の生物試料を含む場合、対象は病院を訪ね、得られ、プロファイリングセンターに送付された試料を有することができ、または対象は試料自体を採取し、それを直接プロファイリングセンターに送付することができる。試料が以前決定された生物情報を含む場合、情報は対象によって直接プロファイリングサービスに送付され得る（たとえば、情報を含有する情報カードがコンピュータによって走査され、電子伝達システムによってプロファイリングセンターのコンピュータにデータが伝達され得る）。プロファイリングサービスによっていったん受け取られると、試料は処理され、対象について所望される診断または予後診断の情報に特異的なプロファイルが作製される（たとえば、発現データ）。
次いで治療する臨床医による解釈に好適な形式でプロファイルデータが作成される。たとえば、生の発現データを提供することよりはむしろ、作成された形式が特定の治療選択肢の推奨と共に、対象のための診断またはリスク評価を提示する。好適な方法によってデータを臨床医に表示することができる。たとえば、一部の実施形態では、プロファイリングサービスは臨床医（たとえば、ケアの地点で）のため印刷することができるまたはコンピュータモニター上で臨床医に表示することができる報告を生成する。
一部の実施形態では、情報は先ず、ケアの地点でまたは地域の施設で解析される。次いでさらなる解析のために及び／または生データを臨床医若しくは患者にとって有用な情報に変換するために生データが中央処理施設に送付される。中央処理施設は、プライバシー（データはすべて均一なセキュリティプロトコールによって中央施設に保管される）、速度及びデータ解析の均一性の利点を提供する。中央処理施設は次いで対象の治療の後のデータの運命を制御することができる。たとえば、電子伝達システムを用いて、中央施設はデータを臨床医、対象または研究者に提供することができる。
一部の実施形態では、対象は電子伝達システムを用いてデータに直接アクセスすることができる。対象は結果に基づいてさらなる介入またはカウンセリングを選択することができる。一部の実施形態では、データは研究目的に使用される。たとえば、データを用いて、疾患の特定の状態または病期の有用な指標としてのマーカーの包含または排除をさらに最適化することができる。
さらに他の実施形態では、本発明は癌の検出及び特徴付けのためのキットを提供する。一部の実施形態では、キットは検出試薬及び緩衝液に加えて、本発明の抗体のような癌マーカーに特異的な抗体を含有する。他の実施形態では、キットはｍＲＮＡまたはｃＤＮＡの検出に特異的な試薬（たとえば、オリゴヌクレオチドのプローブまたはプライマー）を含有する。一部の実施形態では、キットは、すべての対照、アッセイを行うための指示書並びに結果の解析及び説明のためのソフトウエアを含む、検出アッセイを行うのに必要な及び／または十分な成分のすべてを含有する。
本発明の別の実施形態は、たとえば組織試料または体液において、インテグリンβ１のようなタンパク質の存在を調べるためのキットを含む。キットは、たとえば、ポリペプチドの検出のための抗体を含むことができる。加えてキットは、参照試料または対照試料；試料を処理し、試験を行い、結果を解釈するための指示書；並びに試験を行うのに必要な緩衝液及び試薬を含むことができる。
一部の実施形態では、生体内画像化技法を用いて動物（たとえば、ヒトまたは非ヒト哺乳類）における癌マーカーの発現を視覚化する。たとえば、一部の実施形態では、本発明の標識された抗体を用いてインテグリンβ１が標識される。放射性核種画像診断、ポジトロン放出断層撮影、コンピュータ体軸断層撮影、Ｘ線または磁気共鳴画像診断法、蛍光検出及び化学発光検出を含むが、これらに限定されない生体内画像診断法を用いて、特異的に結合し、標識された抗体を個体において検出することができる。
本発明の生体内画像診断法は、本発明の固形腫瘍細胞癌マーカーを発現する癌（たとえば、乳癌において）の診断において有用である。生体内画像診断法を用いて癌を示すマーカーの存在を視覚化する。そのような技法は不愉快な生検を使用しないで診断を可能にする。本発明の生体内画像診断法は癌患者の予後診断を提供するのにも有用である。たとえば、癌細胞を示すマーカーの存在を検出することができる。本発明の生体内画像診断法をさらに使用して体の他の部分で転移癌を検出することができる。
一部の実施形態では、本発明の癌マーカーに特異的な試薬（たとえば、抗体）は蛍光で標識される。標識された抗体は対象に導入される（たとえば、経口または非経口で）。蛍光で標識された抗体は好適な方法を用いて（たとえば、参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第６，１９８，１０７号に記載された装置を用いて）検出される。
他の実施形態では、抗体は放射性物質で標識される。生体内診断のための抗体の使用は当該技術分野で周知である。
一部の実施形態では、本発明は、上述のような広い機能的な活性でのインテグリンβ１の役割を考慮した、免疫性／炎症性の疾患及び障害を含む疾患及び障害のための治療法を提供する。さらに、本発明の組成物が標的とし得る疾患及び障害には、多発性硬化症、クローン病、関節リウマチ、炎症性大腸疾患等が挙げられる。同様に、湿潤型加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）を含む特定の眼に関する疾患が標的とされ得ることが期待できる。
一部の実施形態では、本発明は癌、たとえば、乳癌、脳癌、前立腺癌及び結腸癌のような疾患の治療法を提供する。一部の実施形態では、治療法はインテグリンβ１のような癌マーカーを標的とする。
一部の実施形態では、本発明は細胞癌マーカー、たとえば、インテグリンβ１を発現する腫瘍を標的とする抗体を提供する。
一部の実施形態では、治療用抗体は上記で議論されたような細胞傷害性の剤にコンジュゲートされた本発明の抗体を含む。
以下の実施例は本発明の利点及び特徴をさらに説明するために提供されるが、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。それらは使用され得るものの典型である一方で、当業者に既知の他の手順、方法または技法が代わりに使用され得る。
実施例１
可変領域遺伝子の配列決定
ＯＳ２９６６抗ヒトインテグリンβ１モノクローナル抗体をコードする遺伝子を可変（Ｖ）領域配列の解析に供した。ＲＮＡｑｕｅｏｕｓ−４ＰＣＲキット（商標）（Ａｍｂｉｏｎ， Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ， ＵＫ）を用いて３〜１０×１０６個のハイブリドーマ細胞から全ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成するのに使用した。表１に示す縮重マウスリーダー配列プライマー（Ｓｉｇｍａ）と特有の定常ドメインプライマー（Ｓｉｇｍａ）を用いたＰＣＲによってマウスの免疫グロブリンの重鎖及びκ軽鎖のＶ領域断片を増幅した。得られたＰＣＲ断片をｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙI（商標）ベクター系（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ， ＵＫ）にサブクローニングし、ベクター特異的なプライマーＭ１３Ｆｏｒｗａｒｄ（Ｓｉｇｍａ）を用いて挿入物を配列決定した。ＤＮＡの配列決定はすべてＧｅｎｅｓｅｒｖｉｃｅ社Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＵＫによって行われた。ＯＳ２９６６（配列番号１（ＶＨ）及び３（ＶＬ））について特有のＶ領域のヌクレオチド配列が得られた。
（表１）
Figure 0006502856
実施例２
キメラ抗体の生成
ＯＳ２９６６モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメインをＰＣＲで増幅し、ｐＡＮＴ抗体発現ベクターにサブクローニングし（図１４）、重鎖及び軽鎖のＶ領域はそれぞれｐＡＮＴ１７及びｐＡＮＴ１３にクローニングした。重鎖Ｖ領域遺伝子を、ヒトχ１重鎖遺伝子（Ｇ１ｍ３（Ｇ１ｍ（ｆ））アロタイプ）またはヒトχ４重鎖遺伝子とインフレームでＭｌｕＩ及びＨｉｎｄＩＩＩの部位を介してｐＡＮＴ１７にクローニングし、軽鎖Ｖ領域遺伝子を、ヒトκ軽鎖定常領域遺伝子（Ｋｍ３アロタイプ）とインフレームでＢｓｓＨＩＩ及びＢａｍＨＩの部位を介してｐＡＮＴ１３にクローニングした。重鎖及び軽鎖の遺伝子の転写はＣＭＶ Ｉ／Ｅプロモータ（ＵＳ５１６８０６２及びＵＳ５３８５８３９、アイオワ大学）の制御下にあり、ｐＡＮＴ１７プラスミドは、真核細胞における選択のためのＳＶ４０プロモータ及びポリＡ配列の制御下にある変異ｄｈｆｒミニ遺伝子（Ｓｉｍｏｎｓｅｎ ＆ Ｌｅｖｉｎｓｏｎ １９８３， ＰＮＡＳ ８０：２４９５−２４９９）を含有した。ｐＡＮＴ１７及びｐＡＮＴ１３は双方とも原核細胞での選択のためのβ−ラクタマーゼ（ＡｐＲ）遺伝子及び原核細胞における増殖のためのｐＭＢ１複製開始点を含有した。プラスミドはすべて大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃａｔ． Ｎｏ． ２００１３０）にて増やした。
次いで、重鎖及び軽鎖の発現構築物を、リン酸カルシウムに基づく形質移入によってＨＥＫ２９３細胞に一時的に、またはエレクトロポレーションによってＮＳ０細胞に安定的に同時形質移入した。分泌された抗体をプロテインＡクロマトグラフィによって細胞培養上清から精製した。
実施例３
ヒト化抗体の生成
ＥＰ１８４４０７４（Ａｎｔｉｔｏｐｅ社）に記載された方法を用いてヒト化抗体を生成した。スイスＰＤＢを用いてマウスＶ領域の構造モデルを作製し、抗体のインテグリンβ１の結合特性に重要である可能性があるＯＳ２９６６Ｖ領域の重要なアミノ酸（「拘束残基」）を特定するために解析した。ヒトのＶ領域配列のデータベースを用いて、ヒト化抗体の設計で使用される拘束残基のそれぞれを含有するヒトＶ領域配列のセグメントを特定した。通常、２つ以上の代替的なＶ領域配列セグメントを用いて各拘束残基を提供し、その結果、ヒト化抗インテグリンＢ１Ｖ領域配列についての広範な可能な配列を生じた。次いでＦｏｔｈｅｒｇｉｌｌら（ＷＯ９８５９２４４， ａｓｓｉｇｎｅｅ Ｅｃｌａｇｅｎ Ｌｔｄ）にて記載されたようなインシリコの解析による非生殖細胞系列のＭＨＣクラスＩＩのペプチド結合の予測について、及びＵＲＬ：ｉｍｍｕｎｅｅｐｉｔｏｐｅ．ｏｒｇ／でワールド・ワイド・ウェブにて利用可能な「免疫エピトープデータベース及び分析資源」を含むデータベースを用いて既知のＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープについて、これらの配列を解析した。非生殖細胞系列のＭＨＣクラスＩＩ結合性の予測されたペプチドを有する、またはＴ細胞エピトープデータベースに対する十分なヒットを有するＶ領域配列を捨てた。これによってＶ領域配列のセットを減らした。次いで、Ｖ領域配列セグメントの選択された組合せを組み合わせてヒト化重鎖及び軽鎖の可変領域アミノ酸配列を作製した。５つの重鎖配列及び４つの軽鎖配列（それぞれ、ＶＨ１〜ＶＨ５及びＶκ１〜Ｖκ４と名付けた）を遺伝子合成のために選択した（配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２）。加えて、さらなるセットの重鎖及び軽鎖のＶ領域配列（それぞれ、ＶＨ６〜ＶＨ１５及びＶκ５〜Ｖκ１３と名付けた）を設計した（それぞれ、配列番号２９〜３８及び４４〜５２）。
上記に加えて、Ｗｉｎｔｅｒ，Ｃａｒｒ，Ｈａｒｒｉｓ（ＥＰ０６２９２４０Ｂ１）にて改変されたようなＷｉｎｔｅｒ（米国特許第６，５４８，６４０Ｂ２号）の一般的な方法を用いてヒト化抗体を設計し、ＯＳ２９６６のＣＤＲ配列（配列番号２３〜２８）を用いて、ヒトＪ領域配列の付加と共にヒト生殖細胞系列のＶ領域配列の１セットにおいてＣＤＲを置き換えるように、配列を設計した。加えて、上記段落のヒト化抗体で使用したような拘束残基を生殖細胞系列のＶ領域フレームワーク配列に導入した。重鎖及び軽鎖のＶ領域について得られた配列をそれぞれＶＨ１６〜ＶＨ２０及びＶκ１４〜Ｖκ１８と名付け、配列番号３９〜４３及び５３〜５７として載せた。
上記に加えて、Ｃａｒｒら（ＵＳ７４６５５７２ Ｂ２）の一般的な方法を用いて脱免疫化抗体を設計し、ＯＳ２９６６のＶ領域配列（配列番号２及び４）内のＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを特定し、これらのエピトープのうちの１つ以上を潜在的に取り除くために変異を導入した。
ヒト化ＯＳ２９６６変異体のＶ領域をコードするＤＮＡを合成し、実施例２にて記載したように発現ベクターｐＡＮＴ１７及びｐＡＮＴ１３にサブクローニングした。ヒト化ＶＨ鎖とＶκ鎖の組合せすべて（すなわち、ＶＨ１〜ＶＨ５及びＶκ１〜Ｖκ４の組合せ（すなわち、合計２０種の対合））をＨＥＫ２９３細胞に一時的に形質移入し、ＮＳ０細胞にも形質移入し、抗体を実施例２にて記載したように培養上清からプロテインＡクロマトグラフィによって精製した。
実施例４
ヒト化抗体の解析
ＨＥＫ由来の及びＮＳ０由来のＯＳ２９６６ヒト化変異体のヒトインテグリンβ１への結合を実施例２に由来するキメラ抗体に対する競合ＥＬＩＳＡにおいて評価した。ビオチンＴａｇ（商標）マイクロビオチン化キット（Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いてＯＳ２９６６キメラ抗体をビオチン化した。９６穴のＭａｘｉＳｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ）を０．５μｇ／ｍＬのヒトインテグリンβ１（１００μＬの最終容量）で４℃にて一晩コーティングした。プレートを洗浄緩衝液（ダルベッコＰＢＳ中０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）で洗浄し、ダルベッコＰＢＳ−２％ＢＳＡで室温にて１時間ブロッキングした。次いでプレートを洗浄緩衝液で３回洗浄した。種々の濃度の試験ヒト化抗体をビオチン化キメラ抗体（０．０２μｇ／ｍＬの最終濃度）と予備混合し、次いでヒトインテグリンβ１をコーティングしたプレートに加えた（１００μＬの最終容量）。プレートを室温で１時間インキュベートし、洗浄緩衝液で３回洗浄した。１：５００希釈のストレプトアビジンＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）１００μＬを加え、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄し、１００μＬのＳｉｇｍａＦａｓｔＯＰＤ基質（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｃａｔ＃ Ｐ９１８７）を加え、室温にて暗所で４分間インキュベートした。５０μＬの３Ｍ ＨＣｌを加えることによって反応を止めた。Ｄｙｎｅｘプレートリーダーを用いて４９０ｎｍにてプレートを読み取った。
実施例５
ｓｃＦｖ及びＦａｂの生成
実施例３に由来するヒト化ＯＳ２９６６抗ヒトインテグリン変異体をｓｃＦｖへと変換し、ｐＣＡＮＴＡＢ５ＥベクターＲＰＡＳ発現モジュール（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ， ＵＫ）を用いて、Ｂｅｎｈａｒ，Ｉ．及びＲｅｉｔｅｒ，Ｙ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｔ，１０．１９Ｂ，Ｗｉｌｅｙ Ｏｎｌｉｎｅ Ｌｉｂｒａｒｙ，Ｍａｙ，２００２（ＵＲＬ：ｃｕｒｒｅｎｔｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．ｃｏｍ／ｐｒｏｔｏｃｏｌ／ｉｍ１０１９ｂにてワールド・ワイド・ウェブで利用可能）に記載されたようにＭ１３ファージディスプレイベクターにクローニングした。末端ＳｆｉＩ及びＮｏｔＩ制限部位、内部Ｇｌｙ４Ｓｅｒリンカー及びＣ末端ｈｉｓ６タグを提供するプライマーを用いてヒト化ＶＨ及びＶＫの遺伝子を増幅した。ｓｃＦｖ構築物をＳｆｉＩ−ＮｏｔＩ断片としてｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅベクターに挿入し、大腸菌ＨＢ２１５１を形質転換し、ペリプラズム及び部分的には増殖培地に運び出されるｓｃＦｖを得た。ＨＩＳ選択ＨＦカートリッジ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いたニッケルキレート親和性クロマトグラフィによって増殖培地からｓｃＦｖを精製した。精製したｓｃＦｖを実施例４で詳述されたような競合アッセイにおいて調べた。ヒト化ＶＨ及びＶＫの遺伝子をさらにＣＨ１及びＣκの定常領域遺伝子と共に増幅してＶＨ−ＣＨ１及びＶＫ−Ｃκ断片を形成し、これらをプライマーでさらに増幅して上流のＶＨ−ＣＨ１と下流のＶＫ−Ｃκの遺伝子断片の間でこれらの断片を２２アミノ酸のｐｅｌＢリーダー配列（Ｌｅｉ Ｓ．Ｐ．， Ｌｉｎ Ｈ．Ｃ．， Ｗａｎｇ Ｓ．Ｓ．， Ｃａｌｌａｗａｙ Ｊ．， ａｎｄ Ｗｉｌｃｏｘ Ｇ．， Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １６９ （１９８７） ｐ４３７９-４３８３）と連結して２シストロン性のＦａｂ遺伝子を得た以外は、ｓｃＦｖで使用した方法を用いて、実施例３に由来するヒト化ＯＳ２９６６変異体をＦａｂへと変換した。ヒト化抗体変異体に由来するＦａｂを生成し、ｓｃＦｖについて上記したように精製し、実施例４で詳述されたようにヒトインテグリンβ１競合アッセイにおいて調べた。
実施例６
ＣＤ４＋Ｔ細胞応答の解析
実施例３及び５に由来するヒト化抗体の免疫原性の潜在力をヒト化抗ヒトインテグリンβ１Ｋ２０（Ｐｏｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３２ （１９９５） ｐ１０２−１１６）と比較した。英国国立輸血サービス（Ａｄｄｅｎｂｒｏｏｋｅ'ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＵＫ）から得た健常集団のドナーのバフィコート（２４時間以内に採血）からＡｄｄｅｎｂｒｏｏｋｅ'ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌの地域研究倫理委員会によって承諾された認可に従って、ＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）を単離した。Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ａｘｉｓ−ｓｈｉｅｌｄ， Ｄｕｎｄｅｅ， ＵＫ）密度遠心分離によってバフィコートからＰＢＭＣを単離し、ＣＤ８＋ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（商標）（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ， Ｌｏｎｄｏｎ， ＵＫ）を用いてＣＤ８＋Ｔ細胞を取り除いた。ＨＬＡ ＳＳＰ−ＰＣＲに基づく組織タイピングキット（Ｂｉｏｔｅｓｔ， Ｓｏｌｉｈｕｌｌ， ＵＫ）を用いてＨＬＡ−ＤＲのハプロタイプを特定することによってドナーを特徴付けた。リコール抗原破傷風毒素を含む対照抗原に対するＴ細胞の応答も測定した（ＫＬＨ Ｐｉｅｒｃｅ， Ｃｒａｍｌｉｎｇｔｏｍ， ＵＫ、並びにインフルエンザＡウイルス及びエプスタインバーウイルスに由来するペプチド）。次いでＰＢＭＣを凍結し、必要とされるまで液体窒素中に保管した。
単球由来の樹状細胞（ＤＣ）を調製するために、５０の異なるドナーのＰＢＭＣを選択して世界の人口全体における頻度に類似するＨＬＡ−ＤＲ及びＨＬＡ−ＤＱのアロタイプの頻度を有する分布を提供した。ＡＩＭ−Ｖ（登録商標）培養培地にてＰＢＭＣを復活させ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＣＤ１４マイクロビーズ及びＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｏｘｆｏｒｄ， ＵＫ）を用いてＣＤ１４＋細胞を単離した。４〜６×１０６個のＰＢＭＣ／ｍＬに対して１０００Ｕ／ｍｌのＩＬ−４及び１０００Ｕ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦを補充したＡＩＭ−Ｖ（登録商標）（「ＤＣ培養培地」）中で単球を再懸濁し、次いで２４穴プレートに分配した（２ｍＬの最終培養容量）。２日目にＤＣ培養培地の半分容量を交換することによって細胞を培養した。３日目までに単球は半成熟したＤＣに分化し、これを４０μｇ／ｍＬの試験ヒト化抗体若しくはキメラ抗体、１００μｇ／ｍＬのＫＬＨまたは培地のみと共に予備インキュベートした。半成熟したＤＣを抗原と共に２４時間インキュベートし、その後、細胞を２回洗浄し、５０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦα（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ， Ｌｏｎｄｏｎ， ＵＫ）を補充したＤＣ培養培地に再懸濁することによって過剰な試験抗体を取り除いた。７日目にＤＣ培養培地（５０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦαを補充した）の半分容量を交換することによってＤＣを培養し、その後、８日目に成熟ＤＣを回収した。回収した成熟ＤＣを数え、トリパンブルー色素排除を用いて生存率を評価した。次いでＤＣにγ線照射し（４０００ラド）、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ及び増殖アッセイに用いる前にＡＩＭ−Ｖ培地に２×１０５個／ｍＬで再懸濁した。さらに、８日目に新鮮なＣＤ４＋Ｔ細胞も調製した。ＣＤ４＋Ｔ細胞を精製するために、ＡＩＭ−Ｖ（登録商標）培養培地でＰＢＭＣを復活させ、ＭｉｌｔｅｎｙｉＣＤ４マイクロビーズ及びＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｏｘｆｏｒｄ， ＵＫ）を用いてＣＤ４＋細胞を単離し、ＡＩＭ−Ｖ（登録商標）培地に２×１０６個／ｍＬで再懸濁した。
８日目にＴ細胞増殖アッセイを設定し、９６穴Ｕ底プレートにて１×１０５個の自己ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ヒト化抗体またはキメラ抗体を負荷した１×１０４個のＤＣに加え（１０：１の比）、ＡＩＭ−Ｖ（登録商標）培地を最終容量２００ｕＬ／ウェルまで加えた。１４日目に２５ｕＬのＡＩＭ−Ｖにおけるウェル当たり１ｕＣｉの［３Ｈ］（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ， Ｂｅａｃｏｎｓｆｉｅｌｄ， ＵＫ）で６時間、アッセイプレートをパルスし、その後、ＴｏｍＴｅｃ Ｍａｃｈ ＩＩＩ（Ｈａｍｄｅｎ ＣＴ， ＵＳＡ）細胞ハーベスタを用いて細胞をフィルターマット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）に回収した。抗体調製物はすべて６つ組の培養で調べた。パララックス低バックグランドカウントにて１４５０Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ Ｗａｌｌａｃ Ｔｒｉｌｕｘ液体シンチレーションカウンタ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）でのＭｅｌｔｉｌｅｘ（商標）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）シンチレーションカウンタによって各ウェルのカウント毎分（ｃｐｍ）を測定した。各抗体試料についてのカウント毎分を培地のみの対照に対して正規化した。
ＥＬＩＳｐｏｔアッセイについては、ＰＢＳ中１００ｕＬ／ウェルのＩＬ−２捕捉抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ａｂｉｎｇｄｏｎ， ＵＫ）によってＥＬＩＳｐｏｔプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ， Ｗａｔｆｏｒｄ， ＵＫ）をコーティングした。次いでプレートをＰＢＳで２回洗浄し、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中１％のＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ））にて一晩インキュベートし、ＡＩＭ−Ｖ（登録商標）培地で洗浄した。８日目に９６穴ＥＬＩＳｐｏｔプレートにて１×１０５個の自己ＣＤ４＋Ｔ細胞を、抗原を負荷した１×１０４個のＤＣに加えた（１０：１の比）。抗体調製物はすべて６つ組の培養で調べた。各ドナーＰＢＭＣについて、陰性対照（ＡＩＭ−Ｖ（登録商標）培地のみ）、無細胞対照及びＰＨＡ（１０ｕｇ／ｍＬ）陽性対照も含めた。
さらに７日間のインキュベート期間の後、ＥＬＩＳｐｏｔプレートを、ｄＨ２ＯとＰＢＳにおける３回の順次洗浄、その後の、ＰＢＳ／１％ＢＳＡ中のフィルターをかけたビオチン化検出抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ａｂｉｎｇｄｏｎ， ＵＫ）１００ｕＬの添加によって発色させた。３７℃での１．５時間のインキュベートの後、プレートをさらにＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳ／１％ＢＳＡ中のフィルターをかけたストレプトアビジン−ＡＰ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）１００ｕＬを１時間加えた（室温でのインキュベート）。ストレプトアビジン−ＡＰを捨て、プレートをさらにＰＢＳで４回洗浄した。ＢＣＩＰ／ＮＢＴ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を各ウェルに加え、室温で３０分間インキュベートした。ウェルおよびウェルの背面をｄＨ２Ｏで３回洗浄することによってスポットの発色を止めた。乾燥させたプレートをＩｍｍｕｎｏｓｃａｎ（商標）アナライザで走査し、ウェル当たりのスポット（ｓｐｗ）をＩｍｍｕｎｏｓｃａｎ（商標）バージョン４のソフトウエアで測定した。
増殖アッセイ及びＩＬ−２ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイの双方について、結果は、培地のみの対照に対する試験抗体についてのｃｐｍ（増殖アッセイ）またはスポット（ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ）の比として定義される刺激指数（ＳＩ）として、陽性Ｔ細胞応答について２以上のＳＩ（ＳＩ≧２．０）の閾値を用いて表した。
実施例７
腫瘍動物モデル
腫瘍増殖の阻害におけるヒト化抗インテグリンβ１抗体のインビボ解析に腫瘍動物モデルを使用することができる。たとえば、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を用いた同所性の乳癌モデルはヒトインテグリンβ１ノックインマウスまたは免疫不全マウス（たとえば、ｎｕ／ｎｕ、重症複合免疫不全症［ＳＣＩＤ］）における原発性腫瘍増殖及び自然転移のモデルとして使用され得る。
インテグリンβ１ノックインマウス（７〜１０週齢、群にわたって均等に分布するオス及びメス）において乳腺脂肪体に０．１ｍＬ容量のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞が皮下注射され得る。本発明の抗インテグリンβ１抗体、ＯＳ２９６６またはアイソタイプが一致した対照抗体を、１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、たとえば５ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇ用量（投薬容量１０ｍＬ／ｋｇ）で毎週注射してもよく、これは、腫瘍投与の翌日（「２日目」）から、または腫瘍が触診可能で平均腫瘍体積が約１００ｍｍ３であるときに開始し得る。腫瘍の測定は、ノギス測定によって実験の経過中、２週に１回行い得る。動物を経過観察して結果を判定する。
実施例８
配列解析
実施例で生成された重鎖及び軽鎖について配列解析を行い、ヒト化配列に好ましくは含められるＯＳ２９６６配列に由来するＣＤＲの外側の重要なＶＨ及びＶＬのアミノ酸残基を決定した。そのような残基は、ＣＤＲの残基に加えてＯＳ２９６６の残基と同一である。そのような残基は図１５及び１６において「ｃ」残基として特定される。示されるように、ＶＨ鎖については、残基４８、６７、６９、７３、７６、８０、８９、９１及び９３は好ましくはＯＳ２９６６（配列番号２）の対応する残基と同一である。また、ＶＬ鎖については、残基３６及び７１は好ましくはＯＳ２９６６（配列番号４）の対応する残基と同一である。
ＶＨ及びＶＬの配列に対応するコドン使用頻度は図１７にて提供される一方で、図１８はＶＨ鎖及びＶＬ鎖のアミノ酸配列の要約を提供する。
実施例９
インテグリンβ１の阻害によって放射線感受性を高める方法
すべての全体が参照によって本明細書に組み入れられる米国特許出願番号２００７０２３７７１１、Ｐａｒｋら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００８；６８：（１１）４３９８及びＹａｏら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００７；６７：（２）６５９にて開示されたように、インテグリンβ１の阻害によって放射線感受性を高めるために本発明のヒト化抗体が利用され得る。腫瘍細胞、特に乳癌腫瘍細胞におけるアポトーシスの増加を引き起こす電離放射線と併用して、本明細書で記載される抗体または抗体を含有する組成物の同時投与法において本発明の抗体が利用され得る。
実施例１０
複合ヒト抗体変異体の検証及び解析
実施例３にて議論したように複合ヒト化抗体を生成した。表２は、どのＶＨ及びＶｋの配列が利用されたかを示す生成された種々の抗体のリストを提供する。
（表２）Ｖ領域のＩＤに従った変異体の命名。
Figure 0006502856
ＯＳ２９６６マウスキメラ抗体（ヒトＦｃを切り落としたマウスＯＳ２９６６Ｆａｂ）との競合ＦＡＣＳアッセイにおいて複合ヒト抗体変異体（表２から）の結合を評価した。手短には、２５．０μｇ／ｍＬから出発して連続希釈（３倍）したキメラ抗体またはヒト化抗体を、ＦＡＣＳ緩衝液（１×ＰＢＳ中１％ＢＳＡ、ｐＨ７．４）中一定濃度のマウスＯＳ２９６６（０．１８７５μｇ／ｍＬ）と事前に混合し、その後３×１０５個のＪｕｒｋａｔ細胞と混合した。氷上で１時間インキュベートした後、細胞を洗浄し、ＰＥ標識したヤギ抗マウスＦｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ， Ｃａｔ． Ｎｏ． １１５−１１６−０７１）によってマウスＯＳ２９６６の結合を検出した。氷上で４５分間インキュベートした後、細胞を洗浄し、３００μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（商標）にて解析した。幾何平均蛍光強度を抗体濃度に対してプロットした（図２０〜２４）。これらのデータを用いて各抗体についてのＩＣ５０を算出し、各ＦＡＣＳアッセイに含められたキメラ抗体のＩＣ５０に対して正規化した（表３）。
（表３）ヒト変異体の相対的な親和性。試験抗体のＩＣ５０を、同じアッセイで測定したキメラ抗体のＩＣ５０で割ることによって相対的ＩＣ５０を算出した。
Figure 0006502856
３つの変異体（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５）はマウスＯＳ２９６６抗体よりもやや高い相対親和性を実証し、４つの変異体（Ｈ３、Ｈ４、Ｈ１０、Ｈ１３）は有意に低い相対親和性を有した。
複数のＥＣＭ及び複数の癌細胞株、ＰＡＮＣ−１ヒト膵臓癌（図２５Ａ及び２５Ｂ）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト三重陰性乳癌（図２５Ｃ）、及びＡｓＰＣ−１ヒト膵臓癌（図２５Ｄ）における接着マイクロプレートアッセイにおいてヒト変異体抗体によるインテグリンβ１サブユニットの機能的阻害を評価した。手短には、ＥＣＭ接着アッセイは１０μｇ／ｍＬのＥＣＭ成分またはＢＳＡ（対照）で行った。無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地において１０μｇ／ｍＬの抗体と共に細胞を３０分間予備インキュベートした。３０分〜１時間、接着を調べた。非接着細胞をディッシュから取り除き、細胞を１％パラホルムアルデヒドで固定し、プレートをクリスタルバイオレットで３０分間染色した。十分にすすいだ後、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で１時間クリスタルバイオレットを可溶化し、Ａ５９０での吸光度についてプレートを読み取った。
１９種のヒト変異体はすべて、ＥＣＭタンパク質と細胞株に応じたいくらかの有意な変動を伴って、ＥＣＭすべてに対する細胞接着を減衰させることにおいて機能的に活性であった。相対親和性（表３）は、ＥＣＭの型または細胞株に関わりなく、このアッセイでは機能に対する明らかな相関を示さない。これらのデータをＩｇＧ陰性対照に対して正規化した（ＢＳＡ、陰性対照としてのウシ血清アルブミン；ＩｇＧ、アイソタイプ対照；ＯＳ２９６６、マウスＯＳ２９６６；ＴＳ２／１６、陽性対照インテグリンβ１活性化抗体；ＦＮ、フィブロネクチン；ＬＮ、ラミニン；Ｃ１、コラーゲンＩ型；Ｃ４、コラーゲンＩＶ型）。
ヒト三重陰性乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）を用いたＥＣＭ成分フィブロネクチン上でのマイクロプレート「引っ掻き傷」移動アッセイにおいてヒト変異体抗体のインテグリンβ１サブユニットの機能的阻害を評価した。手短には、１０μｇ／ｍＬのフィブロネクチンでプレートをコーティングし、腫瘍細胞を播いた。黄色いピペットチップを用いてコンフルエントな細胞の単層を引っ掻き、１０μｇ／ｍＬの規定の抗体を含む培地に置き換えた。３７Ｃで８時間インキュベートした後、プレートを固定し、画像化した。プレートの１０×拡大の画像は、ＯＳ２９６６及び複合ヒト変異体（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）で処理したウェルにおける傷への移動の減衰を示す（図２６Ａ）。各条件について細胞のない面積の定量（３つ組で行い、反復した）を図２６Ｂに示す。
三重陰性乳癌細胞の移動はＯＳ２９６６複合ヒト変異体による処理によって有意に減衰された。
血管形成のインビトロモデル：ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）による管形成アッセイにおいてヒト変異体抗体のインテグリンβ１サブユニットの機能的阻害を評価した。手短には、プレートをマトリゲルＥＣＭでコーティングし、ＨＵＶＥＣ細胞を播いた。３７Ｃで８時間インキュベートした後、プレートを画像化し、血管形成（閉鎖ユニット形成）について定量した。プレートの１０×拡大の画像はＯＳ２９６６及び複合ヒト変異体（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）で処理した細胞における血管形成の減衰を示す（図２７Ａ）。各条件についての閉鎖ユニット形成の定量（少なくとも３つ組で行い、内皮前駆細胞によって反復した）を図２７Ｂに示す。
複合ヒト変異体はインビトロでの管形成アッセイにおいて血管形成を完全に阻止した。
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞によるヒト三重陰性乳癌のインビボモデルにおいてヒト変異体抗体のインテグリンβ１サブユニットの機能的阻害を評価した。手短には、５〜６週齢のヌード無胸腺メスｎｕ／ｎｕマウスにおける第４乳腺脂肪体に１０６個の細胞を注入した。腫瘍が樹立された（平均皮下体積＝８０〜１００ｍｍ３）後、マウスを処理群へと無作為化した。週２回、対照抗体及び実験抗体を５ｍｇ／ｋｇで腹腔内投与（ＩＰ）した。同等の用量でのヒトＩｇＧが対照として役立った（Ｓｉｇｍａ）。同所性の腫瘍を週２回ノギスで計測した。図２８Ａに示すように、ヒト変異体Ｈ１〜Ｈ３はＩｇＧ対照に比べてインビボでのＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍の増殖を有意に減衰させた。複合ヒト変異体についての優れた有効性への傾向はマウスＯＳ２９６６に比べて特にＨ３について明らかだった。薬力学的ウエスタンブロット解析は、対照に比べて処理された腫瘍において、増殖の低下及びアポトーシスの増大に寄与し得た、重要な増殖促進性シグナル伝達経路（リン酸化された細胞外関連キナーゼ、ＥＲＫ及びリン酸化された焦点接着キナーゼ、ＦＡＫ）における活性の低下を実証した（図２８Ｂ）。
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞によるヒト三重陰性乳癌による自然肺転移のインビボモデルにおいてヒト変異体抗体のインテグリンβ１サブユニットの機能的阻害を評価した。手短には、５〜６週齢のヌード無胸腺メスｎｕ／ｎｕマウスにおける第４乳腺脂肪体に１０６個の細胞を注入した。腫瘍が樹立された（平均皮下体積＝８０〜１００ｍｍ３）後、マウスを処理群へと無作為化した。週２回、対照抗体及び実験抗体を５ｍｇ／ｋｇで腹腔内投与（ＩＰ）した。同等の用量でのヒトＩｇＧが対照として役立った（Ｓｉｇｍａ）。７週後、マウスを潅流し、肺を回収し、Ｈ＆Ｅ分析のために冠状に切片にした。自然肺転移はＩｇＧ対照抗体を与えたマウスの５０％（６匹のうち３匹）に認められた。自然肺転移はＯＳ２９６６または複合ヒト変異体Ｈ１〜Ｈ３を与えたマウスでは認められなかった（０％、０／２８マウス）。結果を図２９に示す。
複合ヒト変異体は三重陰性乳癌の同所性モデルにおいて自然肺転移を完全に防いだ。
ＰＡＮＣ１−ＧＥＭＲ細胞株によるゲムシタビン耐性ヒト膵臓癌のインビボモデルにおいてヒト変異体抗体のインテグリンβ１サブユニットの機能的阻害を評価した。手短には、５〜６週齢のヌード無胸腺オスｎｕ／ｎｕマウスの皮下に１０６個の細胞を注入した。腫瘍が樹立された（平均皮下体積＝８０〜１００ｍｍ３）後、マウスを処理群へと無作為化した。週２回、対照抗体及び実験抗体を５ｍｇ／ｋｇでまたはゲムシタビンを５０ｍｇ／ｋｇで腹腔内に投与（ＩＰ）した。同等の用量でのヒトＩｇＧが対照として役立った（Ｓｉｇｍａ）。週２回ノギスによって皮下の腫瘍を計測した。図３０ＡはＰＡＮＣ１−ＧＥＭＲ株におけるゲムシタビン耐性のインビボでの検証を示す。図３０Ｂは複合ヒト変異体Ｈ３がＩｇＧ対照に比べてインビボでＰＡＮＣ１−ＧＥＭＲ腫瘍の増殖を有意に減衰させたことを示す。図３０Ｃは、対照に比べて処理された腫瘍において、増殖の低下及びアポトーシスの増大に寄与し得た、重要な増殖促進性シグナル伝達経路（リン酸化された細胞外関連キナーゼ、ＥＲＫ及びリン酸化された焦点接着キナーゼ、ＦＡＫ）の薬力学的ウエスタンブロット解析を示す。
Ｕ８７ＭＧ細胞株による樹立されたヒト膠芽細胞腫のインビボモデルにおいてヒト変異体抗体のインテグリンβ１サブユニットの機能的阻害を評価した。手短には、５〜６週齢のヌード無胸腺オスｎｕ／ｎｕマウスの皮下に１０７個の細胞を注入した。腫瘍が樹立された（平均皮下体積＝約２００〜２５０ｍｍ３）後、マウスを処理群へと無作為化した。週２回、対照抗体及び実験抗体を５ｍｇ／ｋｇで腹腔内投与（ＩＰ）した。同等の用量でのヒトＩｇＧが対照として役立った（Ｓｉｇｍａ）。週２回ノギスによって皮下の腫瘍を計測した。図３１Ａは、複合ヒト変異体Ｈ３がＩｇＧ対照に比べてインビボで樹立された膠芽細胞腫の腫瘍の増殖を有意に減衰させたことを示す。Ｈ３の有効性はマウスＯＳ２９６６と同等だった。薬力学的ウエスタンブロット解析は図３１Ｂに示すように、対照に比べてＨ３で処理された腫瘍において、増殖の低下及びアポトーシスの増大に寄与し得た、重要な増殖促進性シグナル伝達経路（リン酸化された細胞外関連キナーゼ、ＥＲＫ及びリン酸化されたＡｋＴ）における活性の低下を実証した。
ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）経時変化Ｔ細胞増殖アッセイを用いて抗体変異体Ｈ３の臨床的な免疫原性の潜在力を判定した。ＨＬＡ型を決定した１２のドナーのパネルに対する増殖によって測定されるＣＤ４＋Ｔ細胞応答を誘導する能力について、完全ヒト化抗体及びキメラ抗体を調べた。キメラ（マウス／ヒト）ＯＳ２９６６抗体、ヒト化Ｈ３抗体及び陽性対照ヒト化抗体に対する健常ドナーのＴ細胞増殖応答を図３２Ａに示す。試料を負荷した自己の成熟ＤＣと共にＣＤ４＋Ｔ細胞をインキュベートし、７日間のインキュベートの後、増殖について評価した。対応のない２試料スチューデントｔ検定を用いて有意であった（ｐ＜０．０５）ＳＩ≧２．００（赤い点線で示す）の増殖応答を陽性と見なした。図３２Ｂはドナーコホートに対する健常ドナーのＴ細胞増殖応答の要約を提供する。増殖について陽性（ＳＩ≧２．００、有意ｐ＜０．０５）のＴ細胞応答（「Ｐ」）を示す。ボーダーライン応答（ＳＩ≧１．９０を伴う有意ｐ＜０．０５）を示す（＊）。増殖アッセイについて陽性の応答の頻度を、比率として欄の一番下に示す。Ａ３３（ヒト化Ａ３３）は、外来で高いレベルの免疫原性を示す臨床的な基準対照ｍＡｂであり、ＥｐｉＳｃｒｅｅｎアッセイにおいて２０〜３０％のＴ細胞応答を通常誘導する。各ドナーについては、免疫原性再現性対照（１００μｇ／ｍＬのＫＬＨと共にインキュベートした細胞）も含めた。
複合ヒト変異体Ｈ３はＯＳ２９６６マウス／ヒトキメラ（２５％応答）に比べて有意に低下した免疫原性を示した（０％応答）。ヒト抗体Ｈ３はＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）アッセイから臨床的に受け入れ可能な免疫原性プロファイルを呈し、Ａｎｔｉｔｏｐｅの複合ヒト抗体技術の結果としての低下した免疫原性の確認を提供すると結論付けられる。
上記の実施例を参照して本発明を記載してきたが、改変及び変更は本発明の精神及び範囲の中に包含されることが理解されるであろう。従って、本発明は添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。

Claims (52)

  1. 重鎖可変（ＶＨ）領域と軽鎖可変（ＶＬ）領域を含み、インテグリンβ１に特異的に結合するヒト化抗体であって、前記ＶＨ領域および前記ＶＬ領域が、配列番号10および16、配列番号12および22、ならびに配列番号14および20で示されるアミノ酸配列を有する、ヒト化抗体。
  2. 前記ＶＨ領域及び前記ＶＬ領域のＣＤＲがドナー抗体に由来する、請求項１に記載の抗体。
  3. 前記ドナーがＯＳ２９６６である、請求項２に記載の抗体。
  4. Ｆｃ領域を含む、請求項１に記載の抗体。
  5. 前記Ｆｃ領域がＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはそれらの変異体のものである、請求項４に記載の抗体。
  6. 前記Ｆｃ領域がヒトのＩｇＧ１またはＩｇＧ４である、請求項５に記載の抗体。
  7. 軽鎖定常領域を含む、請求項１に記載の抗体。
  8. 前記軽鎖定常領域がアイソタイプκのものである、請求項７に記載の抗体。
  9. ｓｃＦｖまたはＦａｂである、請求項１に記載の抗体。
  10. モノクローナル抗体である、請求項１に記載の抗体。
  11. インテグリンβ１への特異的結合についてＯＳ２９６６と競合する、請求項１に記載の抗体。
  12. 少なくとも１０−２ Ｍの平衡解離定数（Ｋｄ）でインテグリンβ１に結合する、請求項１に記載の抗体。
  13. 少なくとも１０ −３ Ｍの平衡解離定数（Ｋｄ）でインテグリンβ１に結合する、請求項１２に記載の抗体。
  14. 少なくとも１０ −４ Ｍの平衡解離定数（Ｋｄ）でインテグリンβ１に結合する、請求項１３に記載の抗体。
  15. 少なくとも１０ −５ Ｍの平衡解離定数（Ｋｄ）でインテグリンβ１に結合する、請求項１４に記載の抗体。
  16. 少なくとも１０ −６ Ｍの平衡解離定数（Ｋｄ）でインテグリンβ１に結合する、請求項１５に記載の抗体。
  17. 少なくとも１０ −７ Ｍの平衡解離定数（Ｋｄ）でインテグリンβ１に結合する、請求項１６に記載の抗体。
  18. 少なくとも１０ −８ Ｍの平衡解離定数（Ｋｄ）でインテグリンβ１に結合する、請求項１７に記載の抗体。
  19. 少なくとも１０ −９ Ｍの平衡解離定数（Ｋｄ）でインテグリンβ１に結合する、請求項１８に記載の抗体。
  20. 少なくとも１０ −１０ Ｍの平衡解離定数（Ｋｄ）でインテグリンβ１に結合する、請求項１９に記載の抗体。
  21. ヒト集団に由来するＨＬＡ−ＤＲアロタイプの分布を有する血液試料においてＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞応答の誘導についてインビトロで調べると、１０％未満のＴ細胞応答を生じる、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の抗体。
  22. 調べると、５％未満のＴ細胞応答を生じる、請求項２１に記載の抗体。
  23. 調べると、４％未満のＴ細胞応答を生じる、請求項２２に記載の抗体。
  24. 調べると、３％未満のＴ細胞応答を生じる、請求項２３に記載の抗体。
  25. 調べると、２％未満のＴ細胞応答を生じる、請求項２４に記載の抗体。
  26. 調べると、１％未満のＴ細胞応答を生じる、請求項２５に記載の抗体。
  27. 調べると、０．５％未満のＴ細胞応答を生じる、請求項２６に記載の抗体。
  28. 調べると、０．１％未満のＴ細胞応答を生じる、請求項２７に記載の抗体。
  29. 請求項１〜２１に記載の１つまたは複数の抗体を含む多重特異性抗体。
  30. 請求項１〜２８のいずれか一項に記載の抗体をコードする核酸分子。
  31. 請求項３０に記載の核酸分子を含むベクター。
  32. 発現ベクターである、請求項３１に記載のベクター。
  33. 請求項３１または３２に記載のベクターを含む単離された宿主細胞。
  34. 原核細胞または真核細胞である、請求項３３に記載の宿主細胞。
  35. 哺乳類細胞である、請求項３３に記載の宿主細胞。
  36. 請求項１〜２８のいずれか一項に記載の抗体と薬学的に許容可能なキャリアとを含む医薬組成物。
  37. 請求項３０に記載の核酸分子と薬学的に許容可能なキャリアとを含む医薬組成物。
  38. 検出可能な部分または治療用部分に連結された請求項１〜２８のいずれか一項に記載の抗体を含むイムノコンジュゲート。
  39. 前記治療用部分が細胞傷害性部分である、請求項３８に記載のイムノコンジュゲート。
  40. 前記治療用部分が化学療法剤である、請求項３８に記載のイムノコンジュゲート。
  41. 前記検出可能な部分が蛍光部分である、請求項３８に記載のイムノコンジュゲート。
  42. 疾患を治療するための医薬の製造における、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の抗体、請求項３０に記載の核酸分子、請求項３６〜３７のいずれか一項に記載の医薬組成物または請求項３８〜４１のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲートの使用。
  43. 前記疾患が細胞増殖性障害である、請求項４２に記載の使用。
  44. 前記細胞増殖性障害が癌である、請求項４３に記載の使用。
  45. 前記癌が、治療に耐性であるか、難治性であるか、または転移性である、請求項４４に記載の使用。
  46. 前記細胞増殖性障害が良性または悪性の腫瘍である、請求項４３に記載の使用。
  47. 前記細胞増殖性障害が神経線維腫症Ｉ型またはＩＩ型である、請求項４６に記載の使用。
  48. 前記疾患が炎症性疾患である、請求項４２に記載の使用。
  49. 同時投与のための化学療法剤をさらに含む、請求項４４に記載の使用。
  50. 対象において疾患を検出する方法であって、
    （ａ）請求項１〜２８のいずれか一項に記載の抗体を前記対象に由来する試料に接触させることと、
    （ｂ）インテグリンβ１との前記抗体の特異的な結合を介してインテグリンβ１のレベルを検出することと、
    （ｃ）正常な試料におけるインテグリンβ１のレベルとインテグリンβ１の検出されたレベルを比較することであって、前記正常な試料と比較して前記対象に由来する試料におけるインテグリンβ１のレベルの上昇が疾患を示す、ことと
    を含む、方法。
  51. 前記疾患が細胞増殖性障害である、請求項５０に記載の方法。
  52. 前記細胞増殖性障害が癌である、請求項５１に記載の方法。
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