KR20150103094A - 항-인테그린 β1 항체 조성물 및 이의 이용 방법 - Google Patents

항-인테그린 β1 항체 조성물 및 이의 이용 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인간 가변쇄 프레임워크 영역 및 프레임워크 영역을 포함하는 인간화된 항체를 제공하며, 상기 항체는 인테그린 β1에 특이적이다. 본 발명은 또한, 예를 들어 암과 같은 질환을 치료하기 위해 항체를 이용하기 위한 방법을 제공한다.

Description

항-인테그린 β1 항체 조성물 및 이의 이용 방법{ANTI-INTEGRIN β1 ANTIBODY COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF}
관련출원(들)과의 상호참조
본 출원은 2012년 12월 26일자로 출원된 미국 가출원 특허 제61/746,023호에 대해 미국 특허법(35 USC § 119(e)) 하에서 유익을 주장한다. 선행 출원의 개시내용은 본 출원의 개시내용의 부분으로 고려되며 본 출원의 개시내용에서 그의 전문이 참조로서 포함된다.
서열목록의 포함
수반하는 서열목록에서의 물질은 본 명세서에서 본 출원에 참고로 포함된다. 수반하는 서열목록 텍스트 파일(파일명: ONCO1100_1WO_Sequence_Listing)은 2013년 12월 23일 생성되었고, 81 KB이다. 상기 파일은 윈도 OS를 사용하는 컴퓨터 상에서 마이크로소프트 워드를 이용하여 평가할 수 있다.
본 발명의 기술분야
본 발명은 일반적으로 면역학 분야, 및 더 구체적으로는 항-인테그린 항체 및 이의 이용 방법에 관한 것이다.
암은 선진국에서 주된 사망 원인 중 하나이며, 미국에서만 연간 500,000명 이상의 사망을 야기한다. 미국에서 매년 1백만명 이상의 사람들이 암으로 진단되며, 전체적으로 3명 중 1명 초과의 사람들이 그들의 생애 동안 일부 암 형태가 발생하는 것으로 추정된다. 200종 초과의 상이한 유형의 암이 있지만, 그들 중 유방, 폐, 결장직장 및 전립선을 포함하는 4가지는 모든 새로운 사례의 절반 이상을 차지한다.
유방암은 여성에서 가장 흔한 암이며, 여성의 12%가 그들의 생애 동안 질환이 발생할 위험에 있는 것으로 추정된다. 더 조기의 검출 및 개선된 치료에 기인하여 사망률은 감소되었지만, 유방암은 중년 여성에서 주된 사망원인으로 남아있다. 더 나아가, 전이성 유방암은 여전히 난치병이다. 출현 시, 전이성 유방암을 지니는 대부분의 환자는 1 또는 2개의 기관계만이 병이 발생하지만, 질환이 진행됨에 따라, 보통 다수 부위가 연루된다. 가장 흔한 전이성 연루 부위는 흉벽의 피부 및 연조직에서 뿐만 아니라 겨드랑이 및 쇄골 영역에서의 국소국부 재발이다. 원위 전이에 대해 가장 흔한 부위는 뼈(원위 전이의 30 내지 40%), 다음에 폐 및 간이다. 새로 유방암으로 진단된 여성의 대략 1 내지 5%만이 진단 시 원위 전이를 지님에도 불구하고, 국소 질환을 지니는 환자의 대략 50%는 종국적으로 5년 내에 전이와 함께 재발된다. 현재, 원위 전이의 출현으로부터의 생존의 중앙값은 약 3년이다.
유방암을 진단 및 병기(staging)하는 현재의 방법은 미국공동암위원회(American Joint Committee on Cancer: AJCC) 문헌[Cancer Staging Manual. Philadelphia, Pa.: Lippincott-Raven Publishers, 5th ed., 1997, pp 171-180, 및 Harris, J R: "Staging of breast carcinoma", Harris, J. R., Hellman, S., Henderson, I. C, Kinne D. W. (eds.): Breast Diseases. Philadelphia, Lippincott, 1991]에 기재되어 있는 바와 같이, 종양 크기, 림프절 내 종양 존재 및 원위 전이의 존재에 의존하는 종양-결절-전이(tumor-node-metastasis: TNM) 시스템을 포함한다. 이들 파라미터는 진단을 제공하고 적절한 요법을 선택하기 위해 사용된다. 종양의 형태적 외관이 또한 평가될 수 있지만, 유사한 병리조직학적 외관을 지니는 종양이 상당한 임상적 가변성을 나타낼 수 있기 때문에, 이 접근은 심각한 제한을 가진다. 최종적으로, 세포 표면 마커에 대한 분석은 특정 종양 유형을 하위 부류로 나누기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 유방암의 예후 및 치료에서 고려되는 하나의 인자는 에스트로겐 수용기(estrogen receptor: ER)의 존재인데, ER-양성 유방암은 전형적으로 ER-음성 종양보다 타목시펜 또는 방향화 효소 저해제와 같은 호르몬 요법에 더 용이하게 반응하기 때문이다. 아직 이들 분석이 유용하기는 하지만, 유방암의 임상적 거동을 부분적으로만 예측하며, 현재의 진단 도구로 검출하지 못하고 현재의 요법으로 치료하지 못하는 유방암에 존재하는 많은 표현형적 다양성이 있다.
전립선암은 선진국의 남성에서 가장 흔한 암이며, 미국에서 모든 새로운 암 사례의 33% 추정을 나타내고, 두 번째로 빈번한 사망원인이다. 전립선 특이적 항원(prostate specific antigen: PSA) 혈액 검사의 도입 이후로, 전립선암의 조기 검출은 생존율을 극적으로 개선시켰고, 진단 시 국소 및 국부 병기 전립선 암을 지니는 환자에 대한 5년 생존율은 거의 100%이다. 아직 50% 초과의 환자는 종국적으로 국소적으로 진행된 또는 전이성 질환이 발생할 것이다.
현재 근치적 전립선적출술 및 방사선 요법은 대다수의 국소화된 전립선 종양에 대한 근치적 치료(curative treatment)를 제공한다. 그러나, 치료적 선택사항은 진행된 사례에 대해 매우 제한된다. 전이성 질환에 대해, 황체형성 호르몬-방출 호르몬(luteinising hormone-releasing hormone: LHRH) 작용물질 단독으로 또는 항-안드로겐과 병용하는 안드로겐 제거는 표준 치료이다. 또한 최대 안드로겐 차단에도 불구하고, 질환은 거의 항상 다수의 발생 중인 안드로겐-독립적 질환과 함께 진행한다. 존재 시, 호르몬 불응성 전립선암에 대해 균일하지 않게 허용되는 치료는 없으며, 화학치료요법이 통상적으로 사용된다.
폐암은 세계에서 가장 흔한 암이며, 미국에서 세 번째로 흔하게 진단되고, 단연코 가장 빈번한 암 사망의 원인이다. 흡연은 모든 폐암의 87%(추정)가 폐암을 가장 생명을 앗아가는 예방가능한 질환으로 만드는데 책임이 있는 것으로 믿어진다. 폐암은 모든 폐암의 90% 초과를 차지하는 2가지 주요 유형(소세포 폐암(small cell lung cancer: SCLC) 및 비-소세포 폐암(NSCLC))으로 나뉘어진다. SCLC는 사례의 15 내지 20%를 차지하며, 거대한 중심기도에서 그의 기점(origin) 및 작은 세포질을 지니는 소세포 시트의 조직학적 조성물을 특징으로 한다. SCLC는 NSCLC보다 더 공격적인데, 더 빨리 자라고 더 조기에 그리고 종종 전이된다. NSCLC는 모든 사례의 80 내지 85%를 차지하며, 조직학에 기반하여 3가지 주요 하위유형(선암종, 편평세포 암종(유표피암종) 및 거대세포 미분화 암종)으로 추가로 나뉘어진다.
폐암은 전형적으로 그의 과정에서 후기에 존재하며, 따라서, 진단 후 단지 6 내지 12개월의 중앙값 생존 및 단지 5 내지 10%의 전반적인 5년 생존율을 가진다. 수술은 최상의 치유 기회를 제공하지만, 소분획의 폐암 환자만이 가능하며, 대부분은 화학요법 및 방사선요법에 의존한다. 이들 요법의 시간 및 용량 강도를 조작하기 위한 시도에도 불구하고, 생존율은 지난 15년에 걸쳐 거의 증가되지 않았다.
결장직장암은 세 번째로 흔한 암이며, 전세계 암 사망의 네 번째로 빈번한 원인이다. 대략 5 내지 10%의 모든 결장직장암은 유전성이며, 주된 형태 중 하나는 약 80%의 병에 걸린 개체가 선종성 결장 용종증(adenomatous polyposis coli: APC) 유전자에서 생식세포계열 돌연변이를 함유하는 상염색체 우성질환인 가족성 선종성 용종증(FAP)이다. 결장직장 암종은 국소적으로 원주 성장에 의해 그리고 다른 곳에서 림프계, 조혈성, 경복막, 및 신경 주위 확산에 의해 침습하는 경향이 있다. 가장 흔한 외부림프계 연루 부위는 간이며, 폐는 가장 빈번하게 영향받는 복부 밖 기관이다. 다른 조혈성 퍼짐 부위는 뼈, 신장, 부신 및 뇌를 포함한다.
결장직장암에 대한 현재의 병기 시스템은 장벽을 통한 종양 침투 정도 및 결절 연루의 존재 또는 부재에 기반한다. 이 병기 시스템은 3가지 주된 듀크 분류(Duke's classification)에 의해 규정되며: 듀크 A 질환(Duke's A disease)은 결장 또는 직장의 점막하조직층으로 국한되고; 듀크 B 질환(Duke's B disease)은 고유근층을 침습하고 결장 또는 직장의 벽을 침투할 수 있는 종양을 가지며; 듀크 C 질환(Duke's C disease)은 국부적 림프절 전이를 지니는 장벽 침습의 임의의 정도를 포함한다. 수술적 절제가 초기 결장직장암에 대해 고도로 효과적이지만, 듀크 A 환자에서 95%의 치료율을 제공하며, 상기 비율은 듀크 B 환자에서 75%로 감소되고, 듀크 C 질환에서 양성 림프절의 존재는 5년 내에 60%의 재발 가능성을 예측한다. 수술후 과정의 화학요법에 의한 듀크 C 환자의 치료는 재발률을 40% 내지 50%로 감소시키며, 이는 이제 이들 환자에 대한 표준 기준이다.
두경부의 상피암종은 두경부 영역에서 점막 표면으로부터 생기며, 전형적으로 기점에서 편평세포이다. 이 범주는 부비강, 구강 및 인두, 구강인두, 하인두 및 후두의 종양을 포함한다.
미국에서 두경부암의 새로운 사례의 연간 건수는 연간 대략 40,000건이며, 성인 악성 종양의 약 5%를 차지한다. 두경부암은 일부 다른 국가에서 더 흔하며, 전세계 발생률은 아마도 연간 50만을 초과한다. 북미 및 유럽에서, 종양은 보통 구강, 구강인두 또는 후두로부터 생기는 반면, 비인두암은 지중해 국가 및 극동에서 더 흔하다.
전통적인 방식의 요법(방사선 요법, 화학요법 및 호르몬 요법)은 유용하지만, 치료-내성 암 세포의 출현에 의해 제한되었다. 분명하게, 두경부암 및 암을 일반적으로 치료하기 위한 표적을 확인하기 위한 새로운 접근이 필요로 된다.
췌장암은 췌장을 형성하는 조직에서 생기는 형질전환 세포로부터 유래된 악성신생물이다. 이들 종양의 95%를 차지하는 가장 흔한 유형의 췌장암은 췌장의 외분비 성분 내에서 생기는 선암종(광학 현미경 상에서 선상 구조(glandular architecture)를 나타내는 종양)이다. 소수는 섬 세포로부터 생기며, 신경 내분비 종양으로서 분류된다. 췌장암은 미국에서 4번째로 흔한 암 관련 사망 원인이며, 전세계에서는 8번째 사망 원인이다.
교모세포종(Glioblastoma multiforme: GBM)은 최대한의 요법을 이용하여 1년 미만의 중앙값 생존을 지니는 성인에서 가장 흔한 악성 뇌 종양이다. 지금까지, 3가지 약물만이 GBM 치료용으로 FDA에 의해 승인되었고, 전반적인 생존은 25년에 걸쳐 개선되지 않았다.
인테그린은 미세환경을 역학감지하는(mechanosensing) 것을 초래하고 정상상태와 염증 및 암과 같은 병리학적 상태 둘 다에서 세포밖 매트릭스(ECM)-유발 신호처리를 유발하는 세포-부착 분자이다. 중요하게는, 인테그린은 세포 및 미세환경의 계면에 놓이며, 종양 진행에서 중요한 역할을 하고, 성장 및 생존 경로를 조절한다. 다수 유형의 인테그린의 상향조절은 특히 침습, 전이 및 혈관신생의 과정 동안 상피 악성종양과 관련되었다. 중요하게는, 염증, 증식, 부착 및 침습과 같은 훨씬 더 넓은 기능적 활성을 조정하는 β1 인테그린은 최근에 다수의 고형암 모델 및 조혈 악성종양에서 치료적 내성에 연루되었다. 중요하게는, 이 β1 인테그린 매개 내성은 종양 세포 그 자체의 수준에서 생기는 것으로 생각된다. 상기에 추가로, β1 인테그린은 혈관내피세포의 이동을 촉진함으로써 종양 혈관생성, 예컨대 VEFG-의존적 및 VEFG-독립적 혈관신생 동안 중요한 기능을 가진다. β1 인테그린의 저해는 다수의 잠재적 메커니즘을 통해 신생혈관억제 요법에 대한 저항성을 극복한다: (1) 혈관 무단점용(vessel cooption)을 방지함(및/또는 임의의 고전적 ECM 기질에 대한 성장/침습); (2) 전리 방사선과 같은 손상 후에 종양 세포의 생존력을 감소시킴; (3) 종양 세포 증식을 직접적으로 저해함; (4) 혈관생성 과정을 직접적으로 저해함; 및 (5) 전형적으로 요법 내성의 확립 후에 보이는 구상(spheroidal) 성장을 비롯한 응집성 간충직 표현형을 저해함.
항-인테그린 β1 조성물, 예컨대 인테그린 β1 표적화된 항체는 또한 상기 논의한 바와 같은 더 넓은 기능성 활성에서 인테그린 β1의 역할이 주어진 면역학적/염증성 질환 및 장애에 대해 중요할 수 있다. 추가로, 인테그린 β1 경로를 통해 표적화될 수 있는 질환 및 장애는 다발성 경화증, 크론병, 류마티스 관절염, 염증성 장질환 등을 포함한다. 유사하게, 습성 연령-관련 황반변성(AMD)을 포함하는 특정 눈 관련 질환이 표적화될 수 있다는 것이 예상된다.
본 발명은 인테그린 β1에 특이적으로 결합하는 인간 프레임워크 서열을 갖는 인간화된 항체의 생성에 기반한다. 인테그린 β1은 고형 종양에서 과발현된 단백질이 되고, 따라서 암의 특성규명, 연구, 진단 및 치료에서 유용한 암 세포 마커가 되는 것으로 알려져 있다. 추가로, 인테그린 β1은 전통적인(예를 들어, 화학요법 및 전리 방사선) 및 종양 미세환경으로부터 성장 및 생존 신호를 조작하는 것에 의한 표적화된(예를 들어, 트라스투주맙, 베비시주맙, 라파티닙) 요법에 대해 암 내성을 구동하는 것으로 입증되었다. 인간화 노력은 과거에 이용가능한 인간 프레임워크의 수에 의해 제한되었다. 본 발명은 인테그린 β1에 특이적으로 결합하는 항체에 대한 추가적인 인간 프레임워크 서열에 대한 필요를 충족한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 인테그린 β1에 특이적으로 결합하는 인간화된 항체를 제공한다. 상기 항체는 중쇄 가변(VH) 영역 및 경쇄 가변(VL) 영역을 포함하되, 상기 VH 영역은 서열번호 2에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 VH 영역에 대해 약 97%, 96% 또는 95% 미만의 동일성을 가지고, VL 영역은 서열번호 4에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 VL 영역에 대해 약 97%, 96% 또는 95% 미만의 동일성을 가진다.
다른 실시형태에서, VH 영역은 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 29 내지 43 및 서열번호 91 내지 100에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 VH 영역에 대해 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 초과의 동일성을 가진다. 실시형태에서, VL 영역은 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 44 내지 57 및 서열번호 107 내지 116에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 VL 영역에 대해 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 초과의 동일성을 가진다.
다른 실시형태에서, 항체는 OS2966과 같은 공여체 항체로부터의 VH 및 VL 영역의 CDR을 가진다. 실시형태에서, VH 영역의 CDR은 서열번호 23, 서열번호 24 및 서열번호 25에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 가지고, VL 영역의 CDR은 서열번호 26, 서열번호 27 및 서열번호 28에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 가진다.
일 양태에서, 본 발명은 본 발명의 VH 및 VL 영역을 포함하는 항체를 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 항체를 암호화하는 핵산 분자를 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 벡터를 포함하는 단리된 숙주 세포를 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 약제학적 조성물을 제공한다. 일 실시형태에서, 약제학적 조성물은 본 발명의 항체 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 일 실시형태에서, 약제학적 조성물은 본 발명의 핵산 분자 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 검출과 관련된 본 발명의 항체 또는 치료적 모이어티를 포함하는 면역컨쥬게이트를 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 별개의 펩타이드, 예컨대 사이토카인에 작동가능하게 연결된 본 발명의 항체를 포함하는 키메라 단백질을 제공한다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 대상체에서 질병을 치료하는 방법을 제공한다. 실시형태에서, 상기 방법은 대상체에게 본 발명의 항체, 본 발명의 핵산 분자, 본 발명의 약제학적 조성물, 본 발명의 면역컨쥬게이트, 또는 본 발명의 키메라 단백질을 투여함으로써, 질환을 치료하는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 질환은 암과 같은 세포 증식성 장애이다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 대상체에서 질환을 검출하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 본 발명의 항체 또는 면역컨쥬게이트를 대상체로부터의 샘플과 접촉시키는 단계; 인테그린 β1과 특이적 결합을 통해 인테그린 β1의 수준을 검출하는 단계; 및 인테그린 β1의 검출된 수준을 정상 샘플 내 인테그린 β1의 수준과 비교하는 단계를 포함하되, 정상 샘플에 비해 대상체로부터의 샘플 내 인테그린 β1의 증가된 수준은 질환을 나타낸다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 29 내지 43 및 서열번호 91 내지 100에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 VH 영역에 대해 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 초과의 동일성을 갖는 VH 영역을 제공한다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 44 내지 57 및 서열번호 107 내지 116에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 VL 영역에 대해 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 초과의 동일성을 갖는 VL 영역을 제공한다.
도 1은 하이브리도마 OS2966에 의해 생성된 항체 OS2966의 VH 영역의 핵산 및 아미노산 서열을 도시하는 그림 표현을 도시한 도면.
도 2는 하이브리도마 OS2966에 의해 생성된 항체 OS2966의 VL 영역의 핵산 및 아미노산 서열을 도시하는 그림 표현을 도시한 도면.
도 3은 본 발명의 인간화된 VH쇄의 항체의 VH 및 VL 영역에서 이용되는 하이브리도마 OS2966에 의해 생성되는 항체 OS2966의 CDR 분석을 도시하는 그림 표현을 도시한 도면.
도 4는 본 발명의 항체의 VH 및 VL 영역에서 이용되는 하이브리도마에 의해 생성되는 항체 OS2966의 CDR의 아미노산 서열을 도시하는 그림 표현을 도시한 도면.
도 5는 일 실시형태에서 본 발명의 항체의 VH 영역의 핵산 및 아미노산 서열을 도시하는 그림 표현을 도시한 도면. 보존된 CDR은 밑줄 표시되어 있다.
도 6은 일 실시형태에서 본 발명의 항체의 VH 영역의 핵산 및 아미노산 서열을 도시하는 그림 표현을 도시한 도면. 보존된 CDR은 밑줄 표시되어 있다.
도 7는 일 실시형태에서 본 발명의 항체의 VH 영역의 핵산 및 아미노산 서열을 도시하는 그림 표현을 도시한 도면. 보존된 CDR은 밑줄 표시되어 있다.
도 8은 일 실시형태에서 본 발명의 항체의 VH 영역의 핵산 및 아미노산 서열을 도시하는 그림 표현을 도시한 도면. 보존된 CDR은 밑줄 표시되어 있다.
도 9는 일 실시형태에서 본 발명의 항체의 VH 영역의 핵산 및 아미노산 서열을 도시하는 그림 표현을 도시한 도면. 보존된 CDR은 밑줄 표시되어 있다.
도 10은 일 실시형태에서 본 발명의 항체의 VL 영역의 핵산 및 아미노산 서열을 도시하는 그림 표현을 도시한 도면. 보존된 CDR은 밑줄 표시되어 있다.
도 11은 일 실시형태에서 본 발명의 항체의 VL 영역의 핵산 및 아미노산 서열을 도시하는 그림 표현을 도시한 도면. 보존된 CDR은 밑줄 표시되어 있다.
도 12는 일 실시형태에서 본 발명의 항체의 VL 영역의 핵산 및 아미노산 서열을 도시하는 그림 표현을 도시한 도면. 보존된 CDR은 밑줄 표시되어 있다.
도 13은 일 실시형태에서 본 발명의 항체의 VL 영역의 핵산 및 아미노산 서열을 도시하는 그림 표현을 도시한 도면. 보존된 CDR은 밑줄 표시되어 있다.
도 14는 벡터의 개략적 다이어그램을 도시한 도면.
도 15는 항체 OS2966의 VH와 비교한 본 발명의 인간화된 VH 쇄의 서열 분석 및 정렬을 도시한 그림 표현을 도시한 도면(서열번호 2). 도 15의 서열은 다음과 같다: OS2966은 서열번호 2이며; 변이체 1은 서열번호 6이고; 변이체 2는 서열번호 8이며; 변이체 3은 서열번호 10이고; 변이체 4는 서열번호 12이며; 변이체 5는 서열번호 14이고; 변이체 6은 서열번호 29이며; 변이체 7은 서열번호 30이고; 변이체 8은 서열번호 31이며; 변이체 9는 서열번호 32이고; 변이체 10은 서열번호 33이며; 변이체 11은 서열번호 34이고; 변이체 12는 서열번호 35이며; 변이체 13은 서열번호 36이고; 변이체 14는 서열번호 37이며; 변이체 15는 서열번호 38이고; VH2는 서열번호 91이며; 변이체 16은 서열번호 92이고; VH4는 서열번호 93이며; 변이체 17은 서열번호 94이고; VH5는 서열번호 95이며; 변이체 18은 서열번호 96이고; VH6은 서열번호 97이며; 변이체 19는 서열번호 98이고; VH7은 서열번호 99이며; 변이체 20은 서열번호 100이다.
도 16은 도 15에 나타낸 정렬에 대응하는 본 발명의 인간화된 J 영역(VH)의 서열 분석 및 정렬을 도시하는 그림 표현을 도시한 도면. 서열은 다음과 같다: J1은 서열번호 101이고; J2는 서열번호 102; J3은 서열번호 103이고; J4는 서열번호 104; J5는 서열번호 105이고; J6은 서열번호 106이다.
도 17은 항체 OS2966의 VL에 비교한 본 발명의 인간화된 VL 쇄의 서열 분석 및 정렬을 도시하는 그림 표현을 도시한 도면(서열번호 4). 서열은 다음과 같다: OS2966은 서열번호 4이고; 변이체 1은 서열번호 16이며; 변이체 2은 서열번호 18이고; 변이체 3은 서열번호 20이며; 변이체 4는 서열번호 22이고; 변이체 5는 서열번호 44이며; 변이체 6은 서열번호 45이고; 변이체 7은 서열번호 46이며; 변이체 8은 서열번호 47이고; 변이체 9는 서열번호 48이며; 변이체 10은 서열번호 49이고; 변이체 11은 서열번호 50이며; 변이체 12는 서열번호 51이고; 변이체 13은 서열번호 52이며; VkI은 서열번호 107이고; 변이체 14는 서열번호 108이며; VkII는 서열번호 109이고; 변이체 15는 서열번호 110이며; VkIII은 서열번호 111이고; 변이체 16은 서열번호 112이며; VkIV는 서열번호 113이고; 변이체 17은 서열번호 114이며; VkVI은 서열번호 115이고; 변이체 18은 서열번호 116이다.
도 18은 도 17에 나타낸 정렬에 대응하는 본 발명의 인간화된 J 영역(카파 경쇄)의 서열 분석 및 정렬을 도시하는 그림 표현을 도시한 도면. 서열은 다음과 같다: J1은 서열번호 117이고; J2는 서열번호 118이며; J3은 서열번호 119이고; J4는 서열번호 120이고; J5는 서열번호 121이다.
도 19는 본 발명의 VH 및 VL 쇄의 코돈사용빈도(codon usage)를 도시한 그림 표현을 도시한 도면.
도 20은 본 발명의 복합 인간 항체 변이체의 상대적 친화도를 도시하는 그래프 표현을 도시한 도면(표 2에 나타낸 것).
도 21은 본 발명의 복합 인간 항체 변이체의 상대적 친화도를 도시하는 그래프 표현을 도시한 도면(표 2에 나타낸 것).
도 22는 본 발명의 복합 인간 항체 변이체의 상대적 친화도를 도시하는 그래프 표현을 도시한 도면(표 2에 나타낸 것).
도 23은 본 발명의 복합 인간 항체 변이체의 상대적 친화도를 도시하는 그래프 표현을 도시한 도면(표 2에 나타낸 것).
도 24는 본 발명의 복합 인간 항체 변이체의 상대적 친화도를 도시하는 그래프 표현을 도시한 도면(표 2에 나타낸 것).
도 25a 내지 도 25d는 본 발명의 복합 인간 항체 변이체의 세포외 기질(ECM)에서 기능성 확인을 도시한 일련의 표현을 도시한 도면. 본 발명의 복합 인간 항체 변이체를 지니는 인테그린 β1 서브유닛의 기능성 저해(표 2로부터)는 다수 ECM에 대한 그리고 다수 암세포주에서 부착 마이크로플레이트 분석으로 평가되었다. 도 25a는 PANC-1 인간 췌장암을 이용한다. 도 25b는 PANC-1 인간 췌장암을 이용한다. 도 25b는 PANC-1 인간 췌장암을 이용한다. 도 25c는 MDA-MB-231 인간 삼중 음성 유방암을 이용하였다. 도 25d는 AsPC-1 인간 췌장암을 이용한다.
도 26A 내지 도 26B는 본 발명의 복합 인간 항체 변이체의 세포외 기질(ECM) 이동 분석에서 기능성 확인을 도시한 일련의 그림 및 그래프 표현을 도시한 도면. 본 발명의 복합 인간 항체 변이체를 지니는 인테그린 β1 서브유닛의 기능성 저해(표 2로부터)를 인간 삼중 음성 유방암 세포(MDA-MB-231)를 지니는 ECM 구성성분 피브로넥틴에 대한 마이크로플레이트 "긁힘 손상" 이동 분석에서 평가하였다. 도 26A는 OS2966 및 복합 인간 변이체(H1, H2, H3) 처리 웰에서 상처 내로 이동의 약화를 입증하는 플레이트의 10x 배율에서의 일련의 영상이다. 도 26B는 각각의 조건에 대한 무세포 영역의 정량화(3회 중복 및 반복으로 수행)의 그래프이다.
도 27A 내지 도 27B는 본 발명의 복합 인간 항체 변이체의 인간 제대정맥 내피세포(HUVEC)를 이용한 관 형성 혈관신생 분석에서 기능성 확인을 도시한 일련의 그림 및 그래프 표현을 도시한 도면. 본 발명의 복합 인간 항체 변이체를 이용한 인테그린 β1 서브유닛의 기능성 저해(표 2로부터)는 혈관신생의 시험관내 모델; 인간 제대정맥 내피 세포(HUVEC)를 이용하는 관 형성 분석에서 평가되었다. 도 27A는 OS2966 및 복합 인간 변이체(H1, H2, H3) 처리 웰에서 혈관 형성의 약화를 입증하는 플레이트의 10x 배율에서의 일련의 영상이다. 도 27B는 각각의 조건에 대해 폐쇄 단위 형성의 정량화의 일련의 그래프이다(혈관내피 전구세포를 이용하여 적어도 3회 중복 및 반복으로 수행함).
도 28A 내지 도 28B는 본 발명의 복합 인간 항체 변이체의 삼중 음성 유방암의 인간 정위 이종이식(orthotopic xenograft)에서 기능성 확인을 도시한 일련의 그림 및 그래프 표현을 도시한 도면. 본 발명의 복합 인간 항체 변이체를 이용한 인테그린 β1 서브유닛의 기능성 저해(표 2로부터)를 MDA-MB-231 세포주를 이용하여 인간 삼중 음성 유방암의 생체내 모델에서 평가하였다. 도 28A는 시간 당 그룹 종양 평균 용적을 나타내는 그래프이다. 도 28B는 웨스턴 블롯의 영상이다.
도 29는 본 발명의 복합 인간 항체 변이체의 삼중 음성 유방암으로부터의 자발적 폐 전이의 인간 정위 이종이식 모델에서 기능성 확인을 도시한 일련의 그림 표현을 도시한 도면.
도 30a 내지 도 30c는 본 발명의 복합 인간 항체 변이체의 췌장암의 인간 이종이식 모델에서 기능성 확인을 도시하는 일련의 그림 및 그래프 표현을 도시한 도면. 본 발명의 복합 인간 항체 변이체를 이용한 인테그린 β1 서브유닛의 기능성 저해(표 2로부터)를 PANC1-GEMR 세포주를 이용하여 인간 겜시타빈 내성 췌장암의 생체내 모델에서 평가하였다. 도 30a는 시간 당 그룹 종양 평균 용적을 나타내는 그래프이다. 도 30b는 시간 당 그룹 종양 평균 용적을 나타내는 그래프이다. 도 30c는 웨스턴 블롯의 영상이다.
도 31A 내지 도 31B는 본 발명의 복합 인간 항체 변이체의 확립된 교모세포종의 인간 이종이식 모델에서 기능성 확인을 도시하는 일련의 그림 및 그래프 표현을 도시한 도면. 본 발명의 복합 인간 항체 변이체를 이용한 인테그린 β1 서브유닛의 기능성 저해(표 2로부터)를 U87MG 세포주를 이용한 확립된 인간 교모세포종의 생체내 모델에서 평가하였다. 도 31A는 시간당 그룹 종양 평균 용적을 나타내는 그래프이다. 도 3B는 블롯의 영상이다.
도 32A 내지 도 32B는 면역원성 선별 분석(에피스크린(EpiScreen)(상표명))의 결과를 도시한 도면. 도 32A는 히스토그램이다. 도 32B는 공여체 코호트에 대한 건강한 공여체 T 세포 증식 반응의 요약이다.
본 발명은 인간 VH 및 VL 프레임워크 서열 및 그들을 암호화하는 핵산 서열을 제공한다. 이러한 서열은, 예를 들어, 공여체 항체, 예를 들어 설치류 항체로부터 CDR을 접합하기 위한 프레임워크를 제공하기 위해 사용된다. 따라서, 공여체 항체의 결합 특이성을 지니는 본 발명의 VH 및/또는 VL 프레임워크를 포함하는 항체가 만들어질 수 있다.
본 발명은 또한 서열번호 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 29 내지 57, 91 내지 100 및 107 내지 116에서 제시되는 인간 VH 및 VL 프레임워크 영역에서 제공된 뮤린 OS2966의 CDR을 통해 OS2966으로 칭해지는 항체의 특이성, 예를 들어 인테그린 β1에 대한 특이적 결합을 갖는 인간화된 항체를 제공한다.
본 발명의 인간화된 항체는 본 명세서에 기재된 바와 같은 다양한 치료적 및 진단적 목적을 위해 사용된다. 용도는 암과 같은 질환을 진단 및 치료하는 것을 포함한다.
본 조성물 및 방법을 기재하기 전에, 본 발명은 기재된 특정 장치, 방법 및 실험 조건으로 제한되지 않는다는 것이 이해되어야 하는데, 이러한 장치, 방법 및 조건은 다를 수 있기 때문이다. 또한 본 명세서에서 사용되는 용어는 단지 특정 실시형태를 기재하는 목적을 위한 것이며, 제한하는 것으로 의도되지 않는다는 것이 이해되어야 하는데, 본 발명의 범주는 단지 첨부하는 특허청구범위에 의해서만 제한될 것이기 때문이다.
본 명세서 및 첨부하는 특허청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태는 달리 명확하게 지시되지 않는 한, 복수의 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어 "조성물" 또는 "방법"에 대한 언급은 본 명세서 등을 읽을 때 당업자에게 명백할 본 명세서에 기재된 유형의 하나 이상의 조성물 및 방법, 및/또는 단계를 포함한다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 명세서에 기재된 것과 유사 또는 동일한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 실행 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 재료가 이제 기재된다.
용어 "인테그린 β1"은 CD29와 동의어이며, ITGB1 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대한 언급을 포함한다. 인테그린 β1은 마지막 항원 수용기와 결합되고, 알파-1 내지 알파-9를 포함하는 다수의 알파 서브유닛과 결합하는 것으로 알려져 있는데, 예를 들어, 알파-3 서브유닛에 대한 복합체화는 네트린-1(netrin-1) 및 릴린(reelin)과 같은 분자와 반응하는 α3β1 복합체를 생성한다.
항체와 관련하여 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "항-인테그린 β1"은 인테그린 β1과 특이적으로 결합하는 항체를 지칭한다.
용어 "항체"는 항원에 특이적으로 결합하고 항원을 인식하는 면역글로불린 유전자 또는 이의 기능성 단편에 의해 암호화된 폴리펩타이드를 지칭한다. 인식된 면역글로불린 유전자는 카파, 람다, 알파, 감마, 델타, 엡실론 및 뮤 불변 영역 유전자뿐만 아니라 무수한 면역글로불린 가변 영역 유전자를 포함한다. 경쇄는 카파 또는 람다 중 하나로서 분류된다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 엡실론으로서 분류되는데, 이는 결국 면역글로불린 부류, IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE를 각각 정의한다.
예시적 면역글로불린(항체) 구조적 단위는 테트라머를 포함한다. 각각의 테트라머는 2개의 동일한 쌍의 폴리펩타이드 쇄로 구성되는데, 각각의 쌍은 하나의 "경"쇄(약 25 kDa) 및 하나의 "중"쇄(약 50 내지 70 kDa)를 가진다. 각각의 쇄의 N-말단은 주로 항원 인식에 책임이 있는 약 100 내지 110개 또는 그 이상의 아미노산의 가변 영역을 정한다. 용어 가변 경쇄(VL) 및 가변 중쇄(VH)는 이들 경쇄 및 중쇄를 각각 지칭한다.
항체 기능성 단편의 예는 완전 항체 분자, 항체 단편, 예컨대 Fv, 단일쇄 Fv(scFv), 상보성 결정 영역(CDR), VL(경쇄 가변 영역), VH(중쇄 가변 영역), Fab, F(ab)2' 및 이들의 임의의 조합 또는 표적 항원과 결합할 수 있는 면역글로불린 펩타이드의 임의의 다른 기능성 부분을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다(예를 들어, 문헌[Fundamental Immunology (Paul ed., 3d ed. 1993)] 참조). 당업자에 의해 인식되는 바와 같이, 다양한 항체 단편은 다양한 방법, 예를 들어 펩신과 같은 효소를 이용하는 무결함 항체의 분해; 또는 드노보(de novo) 합성에 의해 얻어질 수 있다. 항체 단편은 종종 화학적으로 또는 재조합 DNA 방법을 사용함으로써 드노보로 합성된다. 따라서, 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 항체는 전체 항체의 변형에 의해 생성되는 항체 단편, 또는 재조합 DNA 방법을 사용하여 드노보로 합성되는 것(예를 들어, 단일쇄 Fv) 또는 파지 디스플레이 라이브러리를 사용하여 동정되는 것을 포함한다. 용어 항체는 또한 2가 또는 2중 특이성 분자, 다이아바디(diabody), 트라이아바디(triabody) 및 테트라바디(tetrabody)를 포함한다. 2가 및 2중 특이성 분자는 당업계에 잘 공지되어 있다.
"VH" 또는 "VH"에 대한 언급은 Fv, scFv, 이황화물-안정화된 Fv(dsFv) 또는 Fab을 포함하는 면역글로불린 중쇄의 가변 영역을 지칭한다. "VL" 또는 "VL"에 대한 언급은 Fv, scFv, dsFv 또는 Fab을 포함하는 면역글로불린 경쇄의 가변 영역을 지칭한다.
CDR은 주로 항원의 에피토프에 대한 결합에 책임이 있다. 각각의 쇄의 CDR은 전형적으로 CDR1, CDR2 및 CDR3으로서 지칭되며, N-말단으로부터 순차적으로 출발해서 넘버링되고, 또한 특정 CDR이 위치되는 쇄에 의해 전형적으로 동정된다. 따라서, VH CDR3은 그것이 발견된 항체의 중쇄의 가변 도메인에 위치되는 반면, VL CDR1은 그것이 발견되는 항체의 경쇄의 가변 도메인으로부터의 CDR1이다. 본 명세서에 기재된 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 넘버링은 달리 표시되지 않는 한, 카바트에 따른다(예를 들어, 문헌[Johnson et al., (2001) "Kabat Database and its applications: future directions" Nucleic Acids Research, 29: 205-206; 및 the Kabat Database of Sequences of Proteins of Immunological Interest, Feb. 22, 2002 Dataset] 참조).
CDR 및 프레임워크 영역의 위치는 당업계에서 다양한 잘 공지된 정의, 예를 들어 카바트, 코티아(Chothia), 국제 면역유전학 데이터베이스(international ImMunoGeneTics database: IMGT) 및 AbM을 사용하여 결정될 수 있다(예를 들어, 문헌[Johnson et al., 상기 참조; Chothia & Lesk, 1987, Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins. J. Mol. Biol. 196, 901-917; Chothia C. et al., 1989, Conformations of immunoglobulin hypervariable regions. Nature 342, 877-883; Chothia C. et al., 1992, structural repertoire of the human VH segments J. Mol. Biol. 227, 799-817; Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol 1997, 273(4)] 참조). 항원 결합 부위의 정의는 또한 다음에 기재되어 있다: 문헌[Ruiz et al., IMGT, the international ImMunoGeneTics database. 핵산s Res., 28, 219-221 (2000); 및 Lefranc,M.-P. IMGT, the international ImMunoGeneTics database. 핵산s Res. Jan 1;29(l):207-9 (2001); MacCallum et al, Antibody-antigen interactions: Contact analysis and binding site topography, J Mol. Biol., 262 (5), 732-745 (1996); 및 Martin et al, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 86, 9268-9272 (1989); Martin, et al, Methods Enzymol., 203, 121-153, (1991); Pedersen et al, Immunomethods, 1, 126, (1992); 및 Rees et al, In Sternberg M. J. E. (ed.), Protein Structure Prediction. Oxford University Press, Oxford, 141-172 1996] 참조).
본 명세서에 개시된 인간 VH 및 VL 영역에 대한 예시적 프레임워크 및 CDR 서열을 도 4에 나타낸다.
"OS2966"은 인간 인테그린 β1에 특이적으로 결합하는 뮤린 IgG1 항체를 지칭한다. OS2966은 몇몇 공급원, 예컨대 아이오와 유니버시티의 개발 연구 하이브리도마 뱅크(Developmental Studies Hybridoma Bank of the University of Iowa)로부터 (상이한 표기 하에) 상업적으로 입수가능하다. OS2966의 중쇄 및 경쇄는 클로닝되었다. OS2966 VH 영역의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열은 각각 서열번호 1 및 서열번호 2에서 제시된다. OS2966 VL 영역의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열은 각각 서열번호 3 및 서열번호 4에 제시된다. 본 명세서에 기재된 예시적 인간화된 항체에 대해 표기되는 바와 같은 OS2966 CDR은 서열번호 23 내지 28에서 제시되며, 도 4에 나타낸다.
"인간화된 항체"는 공여체 항체 결합 특이성, 즉, 인간 프레임워크 서열 상에 접합된 공여체 항체, 전형적으로 마우스 단클론성 항체의 CDR 영역을 포함하는 항체를 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "인간화된 항체"는 공여체 항체와 동일한 에피토프에 결합하고, 전형적으로 적어도 25%의 결합 친화도를 가진다. 결합 친화도에 대한 예시적 분석은 실시예 5에 기재되어 있다. 항체가 동일 에피토프에 결합되는지 여부를 결정하기 위한 방법은 당업계에 잘 공지되어 있으며, 예를 들어, 에피토프 맵핑에 대한 기법 또는 대안적으로 항체가 공여체 항체와 동일한 에피토프에 결합하는지 여부를 결정하기 위한 경쟁 실험을 개시하는 문헌[Harlow & Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999]을 참조한다. 신규한 프레임워크 영역을 포함하는 인간화된 항체는 본 발명에 제공된다.
본 발명의 "VH" 또는 "VL" "영역" 또는 "프레임워크"는 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 29 내지 57, 서열번호 91 내지 100, 또는 서열번호 107 내지 116에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 동일성, 종종 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 VH 또는 VL 아미노산 서열을 지칭한다. VH 또는 VL 쇄의 "프레임워크"는 CDR을 포함하지 않는 쇄의 프레임워크 영역을 지칭한다. 각각의 쇄에 적용된 바와 같은 용어는 모든 프레임워크 영역을 포함한다.
"인간화된 항-인테그린 β1 항체"는 해당 프레임워크에 접합된 뮤린 OS2966의 결합 특이성을 갖는 인간 프레임워크 서열을 포함하는 인간화된 항체를 지칭한다. 본 발명의 인간화된 항-인테그린 β1 항체의 CDR은 서열번호 2 및 서열번호 4에서 각각 제시된 중쇄 및 경쇄 서열의 CDR에 대해 적어도 85%, 더 전형적으로는 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 가진다. VH 영역의 CDR은 서열번호 23, 서열번호 24 및 서열번호 25에서 제시된다. VH 영역의 CDR은 서열번호 26, 서열번호 27 및 서열번호 28에서 제시된다.
일 양태에서, 본 발명은 복합 인간화된 항체를 제공한다. 복합 인간 항체 기법은 가변 영역(V 영역) 서열(EP2,388,871)에서 T 세포 에피토프(탈면역화)를 회피함으로써 인간화된 비-면역원성 항체를 생성한다. 시작 항체(전형적으로 뮤린)로부터의 상보성-결정 영역(CDR)에 대한 '수용체(acceptor)'로서 단일 인간 V 영역 프레임워크를 사용하는 다른 인간화 기법과 달리, 복합 인간 항체(Composite Human Antibodies)(상표명)는 관련없는 인간 항체의 V 영역으로부터 유래된 다수의 서열 세그먼트('복합체')를 포함한다. 복합 인간 항체의 중요한 특성은 다음과 같다:
관련없는 인간 V 영역의 데이터베이스로부터 유래된 서열 세그먼트는 항원 결합에 결정적으로 생각되는 아미노산을 결정한 후에 선택된다. 인간 V 영역 데이터베이스로부터 유래된 모든 선택된 서열 세그먼트는 안티토프 인실리코(Antitope's in silico) 툴을 사용하여 잠재적 T 세포 에피토프의 존재에 대해 필터링된다. 복합 인간 항체(상표명)는 시작 항체 V 영역의 모든 부문을 지니는 인간 서열 세그먼트의 꼭 끼워맞춤(close fit)에 기인하여 표준 인간화된 항체보다 더 양호한 친화도 및 특이성을 보유한다. 복합 인간 항체(상표명)는 T 세포 에피토프가 없으며, 따라서 인간화되고 탈면역화되는 것으로 고려된다.
일 실시형태에서, 본 발명의 항체는 T 세포 에피토프 내의 특이적 부위에서 돌연변이될 프레임워크 영역에서 후보 잔기를 동정함으로써 제조된다. 본 발명의 항체는 공여체 항체에 비해 변용된 결합 친화도 및/또는 변용된 면역원성을 나타낼 수 있다.
당업계에 공지된 방법은 단백질 서열 내에서 T 세포 에피토프를 맵핑하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 에피스크린(EpiScreen)(상표명)(영국 안티토프사(Antitope) 제의 EP1989544)은 서열 내에서 T 세포 에피토프의 수 및 효능에 기반하여, 면역원성에 대한 가능성을 결정하기 위해 단백질 서열 내에서 T 세포 에피토프를 맵핑하는데 사용된다. 에피스크린(상표명) T 세포 에피토프 맵핑은 전형적으로 최소 50개의 HLA-형 공여체(관심 대상의 인간 집단을 나타내기 위해 선택됨)로부터의 CD8+ T 세포 고갈 PBMC를 사용한다. 전형적으로, 단백질 서열에 걸쳐있는 12개 아미노산 중복을 지니는 15량체 펩타이드는 3H TdR 혼입에 의한 시험관내 CD4+ T 세포 자극에 대해 매우 다수의 복제 배양물 중에서 분석된다. CD4+ T 세포 자극은 종종 2 또는 3개의 인접한 그리고 중복된 펩타이드에서 검출되는데, MHC 클래스 II 결합 그루브와 결합하는 코어 9량체가 하나 이상의 펩타이드 서열에 존재할 것이기 때문이다. 시험관내 CD4+ T 세포를 자극하는 펩타이드의 정확한 동정 후에, 코어 9량체 서열의 정확한 위치 및 중요 MHC 클래스 II 고정 잔기(anchor residue)의 위치를 결정함으로써 에피토프-고갈(탈면역)을 설계하기 위해 인실리코 기법이 사용될 수 있다.
어구 "단일쇄 Fv" 또는 "scFv"는 전통적인 2쇄 항체의 중쇄의 가변 도메인 및 경쇄의 가변 도메인이 결합되어 하나의 쇄를 형성하는 항체를 지칭한다. 전형적으로, 링커 펩타이드는 적절한 폴딩 및 활성 결합 부위의 생성을 방해하는 일 없이 가변 도메인을 안정화시키기 위해 2개의 쇄 사이에 삽입된다. 본 발명의 단일쇄 인간화된 항체, 예를 들어, 인간화된 항-인테그린 β1 항체는 단량체로서 결합될 수 있다. 다른 예시적 단일쇄 항체는 다이아바디, 트라이아바디 및 테트라바디를 형성할 수 있다. (예를 들어, 문헌[Hollinger et al., 1993] 상기 참조). 추가로 본 발명의 인간화된 항체, 예를 들어 인간화된 항-인테그린 β1 항체는 또한 "재구성된" 항체 또는 항체 단편 중 하나의 성분, 예를 들어, Fab, Fab' 단량체, F(ab)'2 이량체, 또는 전체 면역글로불린 분자를 형성할 수 있다. 따라서, 인간화된 본 발명의 항체는 인간 Fc 영역을 추가로 포함할 수 있다.
"결합" 또는 "연결" 또는 "컨쥬게이트"는 개재(intervening) 도메인, 인테인(intein)-매개 융합, 비공유 결합 및 공유 결합, 예를 들어 이황화 결합, 펩타이드 결합; 수소 결합; 정전기적 결합; 및 입체배좌 결합, 예를 들어 항체-항원, 및 바이오틴-아비딘 결합과 함께 또는 이들 없이 재조합 융합을 포함하지만, 이것으로 제한되지 않는 기능적으로 연결되는 단백질 도메인에 대한 임의의 공지된 방법을 지칭한다. 본 발명의 내용에서, 상기 용어는 효과기 분자(effector molecule: EM)에 항체 모이어티를 결합하는 것의 언급을 포함한다. 결합은 화학적 또는 재조합 수단에 의할 수 있다. 화학적 수단은 하나의 분자를 형성하기 위해 두 분자 사이에 공유 결합이 형성되는 항체 모이어티와 효과기 분자 사이의 반응을 지칭한다.
용어 "효과기 모이어티"는 표적 모이어티에 의해 표적화된 세포 상에서 효과를 가지도록 또는 면역 컨쥬게이트의 존재를 동정하도록 의도된 면역컨쥬게이트의 부분을 의미한다. 따라서, 효과기 모이어티는, 예를 들어, 치료적 모이어티, 예컨대 세포독성제 또는 약물, 또는 검출가능한 모이어티, 예컨대 형광 표지일 수 있다.
"치료적 모이어티"는 치료제로서 작용하는 것으로 의도되는 면역컨쥬게이트의 부분이다.
용어 "치료제"는 화학치료제, 항-신생물 화합물, 항-염증 화합물, 항-감염성 화합물, 효소 활성체 또는 저해제, 알로스테릭 변형제, 항생물질 또는 환자에서 목적으로 하는 치료효과를 유도하기 위해 투여된 다른 작용제(agent)로서 작용하는 것으로 현재 공지되어 있거나 이후에 개발되는 다수의 화합물을 포함한다. 치료제는 또한, 의도된 치료 효과가, 예를 들어 암세포의 사멸인 경우, 독소 또는 방사성동위원소일 수 있다.
용어 "유효량" 또는 "에 대해 유효한 양" 또는 "치료적 유효량"은 대상체에서 검출가능한 치료적 반응을 유도하는데 충분한 양을 지칭한다. 바람직하게는, 치료적 반응은 암세포의 증식을 감소시키거나 또는 대상체에 존재하는 암 세포의 성장을 저해함에 있어 효과적이다. 치료 반응을 결정하기 위한 분석은 당업계에 잘 공지되어 있다.
용어 "면역컨쥬게이트"는 검출가능한 표지 또는 효과기 분자와 같은 제2 분자에 연결된 항체를 포함하는 조성물을 지칭한다. 종종, 항체는 공유 결합에 의해 제2 분자에 연결된다.
면역컨쥬게이트와 관련하여, "검출가능한 표지" 또는 "검출가능한 모이어티"는 그의 존재를 검출가능하게 제공하는 특성을 갖는 면역컨쥬게이트의 부분을 지칭한다. 예를 들어, 면역컨쥬게이트는 면역컨쥬게이트가 면역조직화학적 분석에서 검출되도록 존재하는 세포를 허용하는 방사성 동위원소로 표지될 수 있다. "검출가능한 표지" 또는 "검출가능한 모이어티"는 분광분석, 광화학적, 생화학적, 면역화학적, 화학적 또는 다른 물리적 수단에 의해 검출가능한 조성물이다. 예를 들어, 유용한 표지는 방사성 동위원소(예를 들어, 3H, 35S, 32P, 51Cr 또는 125I), 형광 염료, 고전자밀도 시약, 효소(예를 들어, 알칼린 포스파타제, 호스래디쉬 페록시다제, 또는 ELISA에서 통상적으로 사용되는 다른 것), 바이오틴, 디곡시게닌, 또는 합텐 및, 예를 들어 펩타이드 내로 방사성 표지를 혼입함으로써 검출가능하게 생성될 수 있거나, 또는 펩타이드와 특이적으로 반응하는 항체를 검출하기 위해 사용될 수 있는 단백질을 포함한다.
용어 "면역학적으로 반응성인 조건"은 실질적으로 모든 다른 에피토프에 대한 결합보다 검출가능하게 큰 정도로 및/또는 모든 다른 에피토프에 대한 결합을 실질적으로 제외하고 해당 에피토프에 결합하는 특정 에피토프에 대해 항체가 생기게 하는 조건에 대한 언급을 포함한다. 면역학적으로 반응성인 조건은 항체 결합 반응의 형식에 의존하며, 전형적으로 면역분석 프로토콜에서 또는 생체내에서 접하는 해당 조건에서 이용되는 것이다. 문헌[Harlow & Lane, 상기 참조, for a description of immunoassay formats and conditions] 참조. 바람직하게는, 본 발명의 방법에서 사용되는 면역학적으로 반응성인 조건은 살아있는 포유류 또는 포유류 세포 내에서 전형적인 조건(예를 들어, 온도, 삼투압몰농도, pH)에 대한 언급을 포함하는 "생리학적 조건"이다. 일부 기관에 극도의 조건이 실시된다는 것이 인식되지만, 유기체내 및 세포내 환경은 정상적으로는 약 pH 7에 놓이며(즉, pH 6.0 내지 pH 8.0, 더 전형적으로는 pH 6.5 내지 7.5), 우세한 용매로서 물을 함유하고, 0℃ 초과 및 50℃ 미만의 온도에서 존재한다. 삼투압몰농도는 세포 생존력 및 증식을 지지하는 범위 내에 있다.
용어 "특이적으로 결합하는", "결합 특이성", "항체에 특이적으로 결합하는" 또는 "와 특이적으로 면역반응성인"은 에피토프를 지칭할 때, 단백질 및 다른 생물학적 물질의 이질적 집단에서 에피토프 존재에 결정적인 결합 반응을 지칭한다. 따라서, 지정된 면역분석 조건 하에서, 구체화된 항체는 백그라운드의 적어도 2배로, 더 전형적으로는 백그라운드의 10 내지 100배 초과로 특정 에피토프에 결합한다. 특정 단백질 또는 탄수화물과 특이적으로 면역반응성인 항체를 선택하기 위한 다양한 면역분석 형식이 사용될 수 있다. 예를 들어, 고체상 ELISA 면역분석은 단백질 또는 탄수화물과 특이적으로 면역반응성인 항체를 선택하기 위해 일상적으로 사용된다. 특이적 면역반응성을 결정하기 위해 사용될 수 있는 면역분석 형식 및 조건의 설명에 대해, 문헌[Harlow & Lane, ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Press, New York (1988) 및 Harlow & Lane, USING ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Press, New York (1999)] 참조. 본 명세서에 사용되는 바와 같은, "특이적으로 결합하는"은 항체가 적어도 약 0.1 mM, 적어도 약 1 ㎛, 적어도 약 0.1 ㎛ 이상, 또는 0.01 ㎛ 이상의 Kd로 단백질에 결합된다는 것을 의미한다.
"핵산" 및 "폴리뉴클레오타이드"는 단일- 또는 이중-가닥 형태 중 하나로 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드 및 이들의 중합체를 지칭하기 위해 본 명세서에서 상호호환적으로 사용된다. 상기 용어는 합성인, 자연적으로 생기는, 및 비자연적으로 생기는, 기준 핵산과 유사한 결합 특성을 갖는, 기준 뉴클레오타이드와 유사한 결합 특성을 갖는, 그리고 기준 뉴클레오타이드와 유사한 방식으로 대사되는, 공지된 뉴클레오타이드 유사체 또는 변형된 백본 잔기 또는 결합을 함유하는 핵산을 포함한다. 이러한 유사체의 예는, 포스포로티오에이트, 포스포르아미데이트, 메틸 포스포네이트, 카이랄-메틸 포스포네이트, 2-O-메틸 리보뉴클레오타이드, 펩타이드-핵산(PNA)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 당업자에 의해 인식되는 바와 같이, 핵산 서열의 상보체는 다른 가닥의 서열로부터 용이하게 결정될 수 있다. 따라서, 본 명세서에 제시된 임의의 특정 핵산 서열은 또한 상보적 가닥을 개시한다.
"폴리펩타이드", "펩타이드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하기 위해 본 명세서에서 상호호환적으로 사용된다. 상기 용어는 자연적으로 생기는 아미노산 중합체뿐만 아니라 하나 이상의 아미노산 잔기가 대응하는 자연적으로 생기는 아미노산의 인공적인 화학적 모방체인 아미노산 중합체에 적용된다.
"아미노산"은 자연적으로 생기는 아미노산 및 합성 아미노산뿐만 아니라 자연적으로 생기는 아미노산과 유사한 방식으로 작용하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 지칭한다. 자연적으로 생기는 아미노산은 유전자 암호에 의해 암호화되는 것뿐만 아니라 이후에 변형되는 해당 아미노산, 예를 들어, 하이드록시프롤린, 감마-카복시글루타메이트 및 O-포스포세린이다. "아미노산 유사체"는 자연적으로 생기는 아미노산과 동일한 기본적 화학 구조, 즉, 수소, 카복실기, 아미노기 및 R 기, 예를 들어, 호모세린, 노르류신, 메티오닌, 설폭사이드, 메티오닌 메틸 설포늄에 결합된 알파 탄소를 갖는 화합물을 지칭한다. 이러한 유사체는 변형된 R기(예를 들어, 노르류신) 또는 변형된 펩타이드 백본을 갖지만, 자연적으로 생기는 아미노산과 동일한 기본적 화학적 구조를 보유한다. "아미노산 모방체"는 아미노산의 일반적 화학적 구조와 상이하지만, 자연적으로 생기는 아미노산과 유사한 방식으로 작용하는 구조를 갖는 화학적 화합물을 지칭한다. 아미노산은 공지된 3글자 기호에 의해 또는 IUPAC-IUB 생화학 명명 위원회(Biochemical Nomenclature Commission)에 의해 권고되는 1글자 기호에 의해 본 명세서에서 지칭될 수 있다.
"보존적으로 변형된 변이체"는 핵산과 아미노산 서열 둘 다에 적용된다. 특정 핵산 서열에 관해, 보존적으로 변형된 변이체는 동일한 또는 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 해당 핵산, 또는 핵산이 본질적으로 동일한 서열에 대해 아미노산 서열을 암호화하지 않는 경우를 지칭한다. 유전자 암호의 축퇴 때문에, 매우 다수의 기능적으로 동일한 핵산은 임의의 주어진 단백질을 암호화한다. 예를 들어, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU는 모두 아미노산 알라닌을 암호화한다. 따라서 알라닌이 코돈에 의해 구체화되는 모든 위치에서, 코돈은 암호화된 폴리펩타이드를 변용시키는 일 없이 기재된 임의의 대응하는 코돈에 대해 변용될 수 있다. 이러한 핵산 변이는 보존적으로 변형된 변이의 한 종인 "침묵 변이"이다. 폴리펩타이드를 암호화하는 모든 핵산 서열은 또한 핵산의 모든 가능한 침묵 변이를 기재한다. 당업자는 핵산 내 각각의 코돈(보통 메티오닌에 대해 유일한 코돈인 AUG, 및 보통 트립토판에 대해 유일한 코돈인 TGG를 제외)은 기능적으로 동일한 분자를 수득하도록 변형될 수 있다는 것이 인식될 것이다. 따라서, 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 각각의 침묵 변이는 각각의 기재된 서열에 내포되어 있다.
아미노산 서열에 관해, 당업자는 변용이 아미노산의 화학적으로 유사한 아미노산으로 치환을 야기하는 경우, 암호화된 서열 내 단일 아미노산 또는 적은 백분율의 아미노산을 변용, 첨가 또는 결실시키는 핵산, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질 서열에 대한 개개의 치환, 결실 또는 첨가가 "보존적으로 변형된 변이체"라는 것을 인식할 것이다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환표는 당업계에 잘 공지되어 있다. 이러한 보존적으로 변형된 변이체는 추가되며, 다형성 변이체, 종간 동족체 및 본 발명의 대립유전자를 제외하지 않는다.
예를 들어, 치환이 만들어질 수 있되, 지방족 아미노산(G, A, I, L 또는 V)은 그룹의 다른 구성원으로 치환되거나, 또는 예를 들어, 하나의 극성 잔기의 다른 것으로 치환, 예컨대 아르기닌의 라이신으로 치환, 글루탐산의 아스팔트산으로 치환, 또는 글루타민의 아스파라긴으로 치환된다. 각각의 다음의 8개 그룹은 서로 보존적 치환인 다른 예시적 아미노산을 포함한다: 1) 알라닌 (A), 글라이신 (G); 2) 아스팔트산 (D), 글루탐산 (E); 3) 아스파라긴 (N), 글루타민 (Q); 4) 알기닌 (R), 라이신 (K); 5) 아이소류신 (I), 류신 (L), 메티오닌 (M), 발린 (V); 6) 페닐알라닌 (F), 타이로신 (Y), 트립토판 (W); 7) 세린 (S), 트레오닌 (T); 및 8) 시스테인 (C), 메티오닌 (M)(예를 들어, 문헌[Creighton, Proteins (1984)] 참조).
폴리펩타이드 구조와 같은 거대 분자 구조는 다양한 수준의 조직화에 대해 기재될 수 있다. 이 조직화의 일반적 논의를 위해, 예를 들어, 문헌[Alberts et al., Molecular Biology of the Cell (3rd ed., 1994) 및 Cantor and Schimmel, Biophysical Chemistry Part I. The Conformation of Biological Macromolecules (1980)]을 참조한다. "1차 구조"는 특정 펩타이드의 아미노산 서열을 지칭한다. "2차 구조"는 폴리펩타이드 내에서 국소로 정돈된, 3차원 구조를 지칭한다. "3차 구조"는 폴리펩타이드 단량체의 완전한 3차원 구조를 지칭한다. 도메인은 빽빽한 단위의 폴리펩타이드를 형성하는 폴리펩타이드의 일부이며, 전형적으로 50 내지 350개의 아미노산 길이이다. 전형적인 도메인은 β-시트 및 α-나선구조의 신장과 같은 더 적은 조직화 부문으로 구성된다. "4차 구조"는 독립적 3차 단위의 비공유 결합에 의해 형성된 3차원 구조를 지칭한다.
핵산 또는 단백질에 적용될 때, 용어 "단리된" 또는 "실질적으로 정제된"은 핵산 또는 단백질이 천연 상태에서 결합된 다른 세포 구성성분이 본질적으로 없다는 것을 의미한다. 건조 또는 수용액 중 하나일 수 있지만, 균질한 상태가 바람직하다. 순도 및 균질성은 전형적으로 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동 또는 고성능 액체 크로마토그래피와 같은 분석 화학 기법을 사용하여 결정된다. 제제에 존재하는 우세한 종인 단백질은 실질적으로 정제된다.
2 이상의 핵산 또는 폴리펩타이드 서열과 관련하여 용어 "동일한" 또는 "동일성" 백분율은 이하에 기재하는 디폴트 파라미터를 지니는 BLAST 또는 BLAST 2.0 서열 비교 알고리즘을 사용하거나, 또는 수동 정렬 및 시각적 조사에 의해 측정되는 바와 동일한(즉, 비교창 또는 지정 영역에 걸쳐 최대 대응도로 비교되고 정렬될 때, 구체화된 영역에 걸쳐 약 60% 동일성, 바람직하게는 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 동일성) 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드의 구체화된 백분율을 갖거나 또는 동일한 2 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다. 이어서, 이러한 서열은 "실질적으로 동일한" 것으로 언급된다. 이 정의는 또한 시험 서열의 상보체를 지칭하거나, 또는 상보체에 적용될 수 있다. 상기 정의는 또한 결실 및/또는 첨가를 갖는 서열뿐만 아니라 치환을 갖는 서열을 포함한다. 이하에 기재하는 바와 같이, 바람직한 알고리즘은 갭 등을 설명할 수 있다. 바람직하게는, 동일성은 길이로 적어도 약 25개의 아미노산 또는 뉴클레오타이드인 영역에 걸쳐, 또는 더 바람직하게는 길이로 50 내지 100개 아미노산 또는 뉴클레오타이드인 영역에 걸쳐 존재한다.
서열 비교를 위해, 전형적으로 하나의 서열은 시험 서열과 비교하는 기준 서열로서 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 사용할 때, 시험 서열과 기준 서열은 컴퓨터에 입력되고, 필요하다면 하위 서열 조정이 지정되고, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터가 지정된다. 바람직하게는, 디폴트 프로그램 파라미터가 사용될 수 있거나, 또는 대안적 파라미터가 지정될 수 있다. 이어서, 서열 비교 알고리즘은 프로그램 파라미터에 기반하여 기준 서열에 비한 시험 서열에 대한 서열 동일성%를 계산한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "비교창"은 20 내지 600으로 이루어진 군으로부터 선택되는 인접한 위치의 수 중 어느 하나, 보통 약 50 내지 약 200 더 보통으로는 약 100 내지 약 150의 세그먼트에 대한 기준을 포함하며, 이때 서열은 두 서열이 최적으로 정렬된 후에 인접한 위치의 동일한 수의 기준 서열과 비교될 수 있다. 비교를 위한 서열의 정렬 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은, 예를 들어 문헌[Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)]의 국소 정렬 알고리즘에 의해, 문헌[Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)]의 전체 정렬 알고리즘에 의해, 문헌[Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)]의 유사성 방법을 위한 검색에 의해, 이들 알고리즘의 컴퓨터화된 실행(위스콘신주 메디슨 사이언스 드라이머 575에 소재한 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group)의 위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지(Wisconsin Genetics Software Package)의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA)에 의해, 또는 수동 정렬 및 시각적 조사에 의해(예를 들어, 문헌[Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1995 supplement)] 참조)수행될 수 있다. 디폴트 파라미터에 의한 스미스 앤 워터만(Smith & Waterman) 정렬은 종종 본 명세서에 기재된 바와 같은 서열을 비교할 때 사용된다.
서열 동일성 및 서열 유사성 백분율을 결정하기 위한 적합한 알고리즘의 다른 예는 문헌[Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 (1977) 및 Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403410 (1990)]에 각각 기재되어 있는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이다. BLAST 및 BLAST 2.0은 본 발명의 핵산 및 단백질에 대한 서열 동일성 백분율을 결정하기 위해 전형적으로 디폴트 파라미터와 함께 사용된다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 미국 국가생물공학센터(National Center for Biotechnology Information)를 통해 공공연하게 이용가능하다. 이 알고리즘은 처음에 데이터베이스 서열에서 동일한 길이의 단어로 정렬될 때 일부 양의 값 역치 스코어를 매칭 또는 만족시키는 질의 서열로 길이 W의 짧은 단어를 동정함으로써 높은 스코어링 서열쌍(high scoring sequence pair: HSP)을 동정하는 것을 수반한다. T는 이웃 단어 스코어 역치로서 지칭된다. 이들 초기 이웃 단어 히트(hit)는 그들을 포함하는 더 긴 HSP를 발견하기 위한 검색을 개시하기 위한 씨드로서 작용한다. 단어 히트는 누적 정렬 스코어가 증가될 수 있는 한 각각의 서열을 따라 양 방향으로 연장된다. 누적 스코어 뉴클레오타이드 서열에 대해, 파라미터 M(매칭 잔기의 쌍에 대한 보상 스코어; 항상 > 0) 및 N(미스매칭 잔기에 대한 페널티 스코어; 항상 < 0)을 사용하여 계산된다. 아미노산 서열에 대해, 누적 스코어를 계산하기 위해 스코어링 매트릭스가 사용된다. 각각의 방향에서 워드 히트의 연장은: 누적 정렬 스코어가 그의 최대 달성 값으로부터 양 X만큼 떨어질 때; 누적 스코어가 하나 이상의 음의 스코어링 잔기 정렬의 축적에 기인하여 0 이하로 진행할 때; 또는 서열 중 하나의 끝에 도달할 때 중단된다. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T 및 X는 감도 및 정렬 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램(뉴클레오타이드 서열용)은 디폴드로서 단어 길이(W) 11, 예상치(E) 10, 컷오프 100, M=5, N=-4, 및 양 가닥의 비교를 사용한다. 아미노산(단백질) 서열에 대해, BLASTP 프로그램은 단어길이(W) 3, 예상치(E) 10 및 BLOSUM62 스코어링 매트릭스(문헌[Henikoff& Henikoff(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915)] 참조)를 사용한다. 본 발명의 목적을 위해, BLAST2.0 알고리즘은 디폴트 파라미터와 함께 사용된다.
"파지 디스플레이 라이브러리"는 표면 상에서 외인성 펩타이드 또는 단백질이 발현된 박테리오파지의 "라이브러리"를 지칭한다. 외래 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 파지 캡시드 외면 상에 나타난다. 외래 펩타이드는 파지 피막 단백질의 부분으로서 혼입된 재조합 융합 단백질로서, 정상적으로 파지 피막 단백질은 아니지만, 캡시드 외면에 혼입될 수 있는 재조합 융합 단백질로서, 또는 이러한 단백질에 공유적으로 또는 비공유적으로 연결되는 단백질 또는 펩타이드로서 나타날 수 있다. 이는 파지 입자에 패키징될 수 있는 핵산 내로 외인성 핵산 서열을 삽입함으로써 수행된다. 이러한 외인성 핵산 서열은, 예를 들어 파지 코트 단백질 유전자의 암호 서열 내로 삽입될 수 있다. 외래 서열이 프레임에서 클로닝된다면, 그것이 암호화하는 단백질은 피막 단백질의 부분으로서 발현될 것이다. 따라서, 하나 이상의 개체의 전체 B 세포 레퍼토리를 암호화하는 유전자 세그먼트로부터 만들어진 항체 레퍼토리의 라이브러리와 같은 핵산 서열의 라이브러리는 "파지 라이브러리"를 만들기 위해 파지 내로 그렇게 삽입될 수 있다. 핵산 라이브러리에 의해 암호화된 것을 나타내는 펩타이드 및 단백질은 파지에 의해 나타나기 때문에, "펩타이드-디스플레이 라이브러리"가 생성된다. 다양한 박테리오파지가 이러한 라이브러리 구성에서 사용되지만, 전형적으로 섬유성 파지가 사용된다(Dunn (1996) Curr. Opin. Biotechnol. 7:547-553). 예를 들어, 이하의 파지 디스플레이 라이브러리에 대한 설명을 참조한다.
용어 "키메라 항체"는 면역글로불린 분자의 아미노산 서열이 2 이상의 종으로부터 유래된 항체를 지칭한다. 전형적으로, 경쇄와 중쇄 둘 다의 가변 영역은 목적으로 하는 특이성, 친화도 및 능력을 지니는 포유류(예를 들어, 마우스, 래트, 토끼 등)의 한 종으로부터 유래된 항체의 가변 영역에 대응하는 한편, 불변 영역은 해당 종에서 면역 반응을 유발하는 것을 회피하기 위해 다른 것(보통 인간)으로부터 유래된 항체 내 서열에 상동성이다.
용어 "에피토프" 또는 "항원성 결정소" 또는 "항원 결정 영역"은 본 명세서에서 상호호환적으로 사용되며, 특정 항체에 의해 인식되고 특이적으로 결합될 수 있는 항원의 해당 부분을 지칭한다. 항원이 폴리펩타이드일 때, 에피토프는 단백질의 3차 폴딩에 의해 나란히 놓인 인접 아미노산과 비인접 아미노산 둘 다로부터 형성될 수 있다. 인접 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 전형적으로 단백질 변성 시 유지되는 반면, 3차 폴딩에 의해 형성된 에피토프는 전형적으로 단백질 변성 시 상실된다. 에피토프는 전형적으로 독특한 공간 구조에서 적어도 3, 및 더 보통으로는, 적어도 5 또는 8 내지 10개의 아미노산을 포함한다. 항원 결정소는 항체에 결합을 위해 무결함 항원(즉, 면역 반응을 유발하기 위해 사용되는 "면역원")과 경쟁할 수 있다.
항체 사이의 경쟁은 시험하의 면역글로불린이 통상의 항원에 대한 기준 항체의 특이적 결합을 저해하는 분석에 의해 결정된다. 수많은 유형의 경쟁적 결합 분석은, 예를 들어: 고체상 직접 또는 간접 방사면역측정법(radioimmunoassay: RIA), 고체상 직접 또는 간접 효소 면역분석(EIA), 샌드위치 경쟁 분석(문헌[Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242-253 (1983)] 참조); 고체상 직접 바이오틴-아비딘 EIA(문헌[Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614-3619 (1986)] 참조); 고체상 직접 표지 분석, 고체상 직접 표지 샌드위치 분석(문헌[Harlow and Lane, "Antibodies, A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Press (1988)] 참조); 1-125 표지를 사용하는 고체상 직접 표지 RIA(문헌[Morel et al., Molec. Immunol. 25(1):7-15 (1988)] 참조); 고체상 직접 바이오틴-아비딘 EIA(Cheung et al., Virology 176:546-552 (1990)); 및 직접 표지된 RIA(Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77-82 (1990))가 공지되어 있다. 전형적으로, 이러한 분석은 이들, 미표지 시험 면역글로불린 및 표지 기준 면역글로불린 중 하나를 보유하는 고체 표면 또는 세포에 결합된 정제된 항원의 사용을 수반한다. 경쟁적 저해는 시험 면역글로불린의 존재에서 고체상 또는 세포에 결합된 표지의 양을 결정함으로써 측정된다. 보통 시험 면역글로불린은 과량으로 존재한다. 경쟁 분석에 의해 동정된 항체(경쟁 항체)는 기준 항체와 동일한 에피토프에 대한 항체 결합 및 입체 장애가 생기는 기준 항체에 의해 결합된 에피토프에 충분히 근접한 인접 에피토프에 대한 항체 결합을 포함한다. 보통, 경쟁 항체가 과량으로 존재할 때, 적어도 50 또는 75%만큼 통상의 항원에 대한 기준 항체의 특이적 결합을 저해할 것이다.
본 발명의 항체, 예를 들어, VH 폴리펩타이드, VL 폴리펩타이드, 또는 단일쇄 항체는 재조합 유전자 분야에서 일상적인 기법을 사용하여 생성될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 일반적 방법을 개시하는 기본적 교재는 문헌[Sambrook & Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3d ed. 2001) 및 Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1999)]을 포함한다.
본 발명의 인간화된 항체는 특이성, 즉, 인간 프레임워크에 대해 공여체 항체, 전형적으로 뮤린 항체의 항원 결합 루프를 접합시킴으로써 생성될 수 있다. 본 명세서에 제공된 인간 경쇄 및 중쇄의 프레임워크 영역은 실행자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 중쇄 및 경쇄의 위치 번호는 통상적인 넘버링 계획, 예를 들어 카바트 및 코티아 넘버링 계획에 따라 지정된다. 코티아 넘버링 계획은 카바트 계획과 동일하지만, 구조적으로 상이한 위치에서 CDR-L1 및 CDR-H1 내 삽입을 위치 시킨다. 달리 표시되지 않는 한, 카바트 넘버링 계획이 서열 위치에 관해 본 명세서에서 사용된다. 특정 VH 또는 VL 서열에서 아미노산 잔기의 위치는 특정 서열 내 아미노산의 수를 지칭하지 않지만, 오히려 넘버링 계획에 관해 지정된 바와 같은 위치를 지칭한다.
CDR의 위치 및 그에 따른 인간 중쇄 및 경쇄의 프레임워크 영역의 위치는 해당 분야에서 표준인 정의를 사용하여 결정된다. 예를 들어, 다음의 4개 정의가 통상적으로 사용된다. 카바트 정의는 서열 가변성에 기반하며, 가장 통상적으로 사용된다. 코티아 정의는 구조적 루프 영역의 위치에 기반한다. AbM 정의는 옥스포드 몰레큘러 AbM(Oxford Molecular's AbM) 항체 모델링 소프트웨어에 의해 사용되는 둘 사이의 절충이다. 접촉 정의는 최근에 도입되었고, 이용가능한 복잡한 결정 구조의 분석에 기반한다. 다음은 4가지 상이한 정의를 사용하는 루프 위치, 즉, CDR이다.
본 발명의 VH 또는 VL 서열은 서열번호 5 내지 22, 29 내지 57, 91 내지 100 또는 107 내지 116에 의해 포함되는 서열에 대해 전형적으로 적어도 70% 동일성, 더 전형적으로는 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 중쇄 또는 경쇄를 포함한다.
더 나아가, 다수의 중요한 잔기는 인간화된 VH 및 VL 쇄에서 바람직하게 이용되는 OS2966의 CDR의 외부에서 동정되었다. 예를 들어, 일 실시형태에서, VH 쇄 내의 하나 이상의 아미노산 잔기는 잔기 48, 67, 69, 73, 76, 80, 89, 91 및 93을 포함하는 OS2966(서열번호 2)의 아미노산 잔기와 동일하다. 일 실시형태에서, VL 쇄 내의 하나 이상의 아미노산 잔기는 잔기 36 및 71을 포함하는 OS2966(서열번호 4)의 아미노산 잔기와 동일하다.
본 발명의 인간화된 항체는 공여체 항체와 동일한 에피토프에 결합하고, 예를 들어, 동일한 인테그린 β1 에피토프에 결합하거나, 또는 예를 들어 OS2966이 결합한 동일 인테그린 β1 에피토프에 결합을 위해 경쟁한다. 항체가 동일한 에피토프에 결합할지 여부를 결정하기 위한 방법은 당업계에 잘 공지되어 있으며, 예를 들어, 항체가 공여체 항체와 동일한 에피토프에 결합하는지 여부를 결정하기 위해 에피토프 맵핑 또는 대안적으로 경쟁 실험에 대한 기법을 개시하는 문헌[Harlow & Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999]을 참조한다.
본 발명의 안정한 인간화된 항체는 공여체 항체와 비교할 때 변용된 친화도를 나타낼 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 단일쇄 인간화된 항-인테그린 β1의 친화도는, 예를 들어 OS2966 VH 및 VL 영역을 포함하는 단일쇄 항체에 비해 감소될 수 있다. 이러한 감소는 비교시 10배만큼 많을 수 있지만, 전형적으로 본 발명의 인간화된 항체는 비슷한 야생형 항체의 친화도의 적어도 25%, 더 종종은 적어도 50%인 친화도를 가진다. ("비슷한 야생형 항체"는 동일 실시형태의 항체, 예를 들어, 공여체 항체 VH 및 VL 영역을 포함하는 scFv를 지칭한다). 일부 실시형태에서, 에피토프에 대한 친화도는 본 발명의 인간화된 항체가 비슷한 야생형 항체의 친화도의 2배 및 때때로 5, 10, 50 또는 100배인 친화도를 가지도록 증가된다.
본 발명의 중쇄 및 경쇄 영역은 전형적으로 재조합 DNA 기법을 사용하여 얻어진다. 이를 수행하기 위해 통상적으로 사용되는 재조합 DNA 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 전형적으로, 공여체 항체의 프레임워크 및 CDR을 암호화하는 핵산 서열은 PCR에 의해, 예를 들어 중복 연장에 의해 생성된다. 이 기법에서, 공여체 항체의 항원 결합 서열은 전형적으로 목적으로 하는 서열을 올리고뉴클레오타이드에 혼입함으로써, 그리고 목적으로 하는 공여체 및 인간 서열을 포함하는 PCR을 사용하여 일련의 생성물을 생성함으로써 인간 프레임워크 영역에 결합된다. 이어서, 생성물은 전형적으로 추가적인 PCR 반응을 사용하여 공여체 항체 CDR과 함께 인간 프레임워크 영역을 포함하는 VH 및 VL 쇄를 생성하기 위한 적절한 배향으로 결합될 수 있다. VL 및 VH DNA 서열은 당업자에게 잘 공지된 기법을 사용하여 펩타이드 링커를 암호화하는 DNA 서열을 통해 또는 직접적으로 함께 결찰될 수 있다. 이들 기법은 PCR뿐만 아니라 시험관내 결찰과 같은 기법을 포함한다. VL 및 VH 서열은 배향 중 하나로 연결될 수 있다.
시험관내 증폭 방법을 통해 당업자에게 지시하기에 충분한 기법의 예는 당업계에 잘 공지되어 있다.
상업적으로 입수가능하지 않은 올리고뉴클레오타이드는 문헌[Van Devanter et. al., Nucleic Acids Res. 12:6159-6168 (1984)]에 기재되어 있는 바와 같은 자동 합성기를 사용하여, 문헌[Beaucage & Caruthers, Tetrahedron Letts. 22:1859-1862 (1981)]에 처음 기재된 고체상 포스포르아미다이트 트라이에스터 방법에 따라 화학적으로 합성될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드의 정제는 본래의 아크릴아마이드 겔 전기영동에 의하거나 또는 문헌[Pearson & Reanier, J. Chrom. 255:137-149 (1983)]에 기재되어 있는 바와 같은 음이온 교환 HPLC에 의한다.
클로닝된 유전자 및 합성 올리고뉴클레오타이드의 서열은, 예를 들어, 서열화를 사용하여 클로닝 후에 확인될 수 있다.
PCR 산물은 당업자에게 잘 공지되어 있고 상업적으로 입수가능한 적합한 클로닝 벡터 내로 서브클로닝된다. 이어서, 중쇄 또는 경쇄 암호 영역의 뉴클레오타이드 서열이 결정된다.
당업자는 가변 영역을 제공하는 서열 정부를 이용하여 이들 서열을 암호화하는 핵산이 당업자에게 잘 공지된 다수의 추가적인 방법을 사용하여 얻어진다는 것을 인식할 것이다. 따라서, Fv 영역을 암호화하는 DNA는, 예를 들어 리가제연쇄반응(LCR), 전사 증폭, 및 자립(self-sustained) 서열 복제, 또는 적절한 서열의 클로닝 및 제한과 같은 다른 증폭 기법을 포함하는, 임의의 적합한 방법에 의해 제조된다.
본 발명의 항체 및 항체 단편을 암호화하는 핵산은 또한 포스포트라이에스터 방법; 포스포다이에스터 방법; 다이에틸포스포르아미다이트 방법; 및 미국 특허 제4,458,066호의 고체 지지 방법과 같은 방법을 사용하여 직접 화학적 합성에 의해 생성될 수 있다. DNA 서열이 화학적으로 합성된다면, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드가 얻어질 것이다. 이는 상보적 서열과의 혼성화에 의해, 또는 주형으로서 단일 가닥을 사용하여 DNA 중합효소를 이용한 중합에 의해 이중 가닥 DNA로 전환될 수 있다. 전체 단일쇄 Fv 영역을 화학적으로 합성할 수 있지만, 예를 들어 중복 연장 PCR을 사용하여 전형적으로 이후에 함께 스플라이싱되는 다수의 더 짧은 서열(약 100 내지 150개 염기)을 합성하는 것이 바람직할 수 있다.
핵산에 대해, 크기는 킬로베이스(kb) 또는 염기쌍(bp)으로 주어진다. 이들은 아가로스 또는 아크릴아마이드 겔 전기영동으로부터, 서열화된 핵산으로부터, 또는 공개된 DNA서열로부터 유래된 추정값이다. 단백질에 대해, 크기는 킬로달톤(kDa)으로 또는 아미노산 잔기수로 주어진다. 단백질 크기는 겔 전기영동으로부터, 서열화된 단백질로부터, 유래된 아미노산 서열로부터, 또는 공개된 단백질 서열로부터 추정된다.
본 발명의 항체의 VH 및 VL 도메인은 직접 연결될 수 있거나 또는, 예를 들어 각각 경쇄 및 중쇄의 가변 항체 도메인을 안정화시키기 위해 링커에 의해 분리될 수 있다. 적합한 링커는 당업자에게 잘 공지되어 있고, 잘 공지된 GlyGlyGlyGlySer(서열번호 122) 링커 또는 이의 변이체를 포함한다. 예를 들어, 전형적인 링커는 (Gly4Ser)3(서열번호 123)이다. 본 발명에서 사용될 수 있는 힌지 영역을 포함하는 다른 링커는, 예를 들어 문헌[Alfthan et al, Protein Eng. 8(7), 725-31; Choi et al, Eur. J Immunol. 31(1), 94-106; Hu et al, Cancer Res. 56(13), 3055-61; Kipriyanov, et al, Protein Eng. 10(4), 445-53; Pack, et al, Biotechnology (N Y) 11(11), 1271-7; 및 Roovers, et al, Cancer Immunol. Immunother. 50(l):51-9]에 기재된 것을 포함한다.
인간화된 항체, 예를 들어 본 발명의 인간화된 항체, 또는 본 발명의 인간화된 항체를 포함하는 면역컨쥬게이트 또는 키메라 항체를 암호화하는 해당 cDNA와 같은 클로닝된 유전자 또는 핵산의 고수준 발현을 얻기 위해, 전형적으로 전사를 지시하는 적절한 프로모터, 전사/번역 종결자, 및 단백질을 암호화하는 핵산에 대해서라면, 번역 개시를 위한 리보솜 결합 부위를 함유하는 발현 벡터 내로 항체 또는 면역컨쥬게이트를 암호화하는 핵산을 서브클로닝한다. 적합한 박테리아 프로모터는 당업계에 잘 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌[Sambrook et al. and Ausubel et al.]에 기재되어 있다. 단백질을 발현시키기 위한 박테리아 발현 시스템은, 예를 들어, 문헌[E. coli, Bacillus sp., and Salmonella (Palva et al., Gene 22:229-235 (1983); Mosbach et al., Nature 302:543-545 (1983)]에서 이용가능하다. 이러한 발현 시스템용 키트는 상업적으로 입수가능하다. 포유류 세포, 효모 및 곤충 세포에 대한 진핵세포 발현 시스템은 당업계에 잘 공지되어 있으며, 또한 상업적으로 입수가능하다.
종종, 세포에서 고수준으로 단백질을 발현시키기 위해, 발현 시스템에 대한 코돈 선호도는 발현될 핵산 서열을 구성하는데 고려된다. 따라서, 한 유기체, 예를 들어 인간 또는 마우스로부터의 핵산은 발현 시스템의 코돈 선호도를 수용하도록 유전자 조작될 수 있다.
이종성 핵산의 발현을 지시하기 위해 사용되는 프로모터는 특정 적용에 의존한다. 프로모터는 이종성 전사 시작 부위로부터 거의 동일한 거리에 선택적으로 위치되는데, 그것이 그의 천연 환경에서 전사 시작 부위에 있기 때문이다. 그러나 당업계에 공지된 바와 같이, 이 거리에서 일부 변형은 프로모터 기능의 손실 없이 수용될 수 있다.
프로모터에 추가로, 발현 벡터는 전형적으로 숙주 세포 내 단백질 암호화핵산의 발현에 필요한 모든 추가적인 구성요소를 함유하는 전사 단위 또는 발현 카세트를 함유한다. 따라서 전형적인 발현 카세트는 발현될 단백질을 암호화하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결되는 프로모터 및 전사체의 효율적 폴리아데닐화에 필요한 신호, 리보솜 결합 부위 및 번역 종결을 포함한다. 단백질을 암호화하는 핵산 서열은 전형적으로 형질전환 세포에 의해 암호화된 단백질의 분비를 촉진시키기 위해 절단가능한 신호 펩타이드 서열에 연결될 수 있다. 이러한 신호 펩타이드는 특히, 조직 플라스미노겐 활성체, 인슐린 및 뉴런 성장 인자 및 헬리오씨스 바이레신스(Heliothis virescens)의 유충 호르몬 에스터라제로부터의 신호 펩타이드를 포함한다. 카세트의 추가적인 구성요소는 인핸서를 포함할 수 있으며, 게놈 DNA가 구조적 유전자로서 사용된다면, 기능성을 지니는 인트론은 공여체 및 수용체 부위를 스플라이스한다.
프로모터 서열에 추가로, 발현 카세트는 또한 효율적 종결을 제공하기 위해 구조적 유전자 하류의 전사 종결 영역을 함유하여야 한다. 종결 영역은 프로모터 서열과 동일한 유전자로부터 얻어질 수 있거나, 또는 상이한 유전자로부터 얻어질 수 있다.
특정 숙주 세포에서 사용에 적합한 발현 제어 서열은 종종 해당 세포에서 발현되는 유전자를 클로닝함으로써 얻어진다. 리보솜 결합 부위 서열과 마찬가지로 전사 개시를 위한 프로모터를, 선택적으로 오퍼레이터와 함께 포함하기 위해 본 명세서에서 정의되는 통상적으로 사용되는 원핵 제어 서열은 베타-락타마제(페니실리나제) 및 락토스(lac) 프로모터 시스템(Change et al., Nature (1977) 198: 1056), 트립토판(trp) 프로모터 시스템(Goeddel et al., Nucleic Acids Res. (1980) 8: 4057), tac 프로모터(DeBoer, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1983) 80:21-25); 및 람다-유래 PL 프로모터 및 N-유전자 리보솜 결합 부위(Shimatake et al., Nature (1981) 292: 128)로서 이러한 통상적으로 사용되는 프로모터를 포함한다. 특정 프로모터 시스템은 본 발명에 중요하지 않으며, 원핵생물에서 기능하는 임의의 이용가능한 프로모터가 사용될 수 있다.
표준 박테리아 발현 벡터는 pBR322-기반 플라스미드, 예를 들어, pBLUESCRIPT(상표명), pSKF, pET23D, λ-파지 유래 벡터, 및 융합 발현 시스템, 예컨대 GST 및 LacZ와 같은 플라스미를 포함한다. 에피토프 태그는 또한 편리한 단리 방법을 제공하기 위해 재조합 단백질, 예를 들어, c-myc, HA-태그, 6-His 태그(서열번호 124), 말토스 결합 단백질, VSV-G 태그, 항-DYKDDDDK 태그(서열번호 125), 또는 임의의 이러한 태그, 당업자에게 잘 공지된 매우 다수에 첨가될 수 있다.
포유류 세포, 효모 및 곤충 세포에 대한 진핵생물 발현 시스템은 당업계에 잘 공지되어 있으며, 또한 상업적으로 입수가능하다. 효모에서, 벡터는 효모 통합 플라스미드(예를 들어, YIp5) 및 효모 복제 플라스미드(YRp 계열 플라스미드) 및 pGPD-2를 포함한다. 진핵생물 바이러스로부터 조절 구성요소를 함유하는 발현 벡터는 전형적으로 진핵생물 발현 벡터, 예를 들어, SV40 벡터, 유두종 바이러스 벡터, 및 엡스타인-바르 바이러스로부터 유래된 벡터에서 사용된다. 다른 예시적 진핵생물 벡터는 pMSG, pAV009/A+, pMTO10/A+, pMAMneo-5, 바큘로바이러스 pDSVE, 및 CMV 프로모터, SV40 초기 프로모터, SV40 후기 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 뮤린 유방종양 바이러스 프로모터, 라우스 육종 바이러스 프로모터, 폴리헤드린 프로모터, 또는 진핵생물 세포에서 발현에 효과적인 것으로 나타난 다른 프로모터의 지시 하에서 단백질을 발현시키는 임의의 다른 벡터를 포함한다.
일부 발현 시스템은 티미딘 키나제, 하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제, 및 다이하이드로폴레이트 환원효소와 같은 유전자 증폭을 제공하는 마커를 가진다. 대안적으로, 유전자 증폭을 수반하지 않는 고 수율 발현 시스템, 예컨대 폴리헤드린 프로모터 또는 다른 강한 바큘로바이러스 프로모터 하에서 GPCR-암호화 서열을 지니는 곤충 세포 내 바클로바이러스 벡터를 사용하는 것이 또한 적합하다.
전형적으로 발현 벡터에 포함된 구성요소는 또한 이콜라이(E. coli)에서 기능하는 레플리콘, 재조합 플라스미드를 보유하는 박테리아를 선택하게 하는 항생제 내성을 암호화하는 유전자, 및 진핵생물 서열을 삽입하게 하는 플라스미드의 비필수 영역에서 독특한 제조 부위를 포함한다. 선택된 특정 항생제 내성 유전자는 중요하지 않으며, 당업계에 공지된 임의의 다수의 내성 유전자가 적합하다. 원핵생물 서열은, 필요하다면 그들이 진핵생물 세포 내 DNA의 복제를 방해하지 않도록 선택적으로 선택된다.
표준 형질감염 방법은 다량의 단백질을 발현시키는 박테리아, 포유류, 효모 또는 곤충 세포주를 생성하기 위해 사용되며, 이어서, 표준 기법을 사용하여 정제된다(예를 들어, 문헌[Colley et al., J. Biol. Chem. 264:17619-17622 (1989); Guide to Protein Purification, in Methods in Enzymology, vol. 182 (Deutscher, ed., 1990)] 참조). 진핵생물 및 원핵생물 세포의 형질감염은 표준 기법에 따라 수행된다(예를 들어, 문헌[Morrison, J. Bact. 132:349-351 (1977); Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology 101:347-362 (Wu et al., eds, 1983)] 참조).
숙주 세포 내로 외래 뉴클레오타이드 서열을 도입하기 위한 임의의 잘 공지된 절차가 사용될 수 있다. 이들은 인산칼슘 형질감염, 폴리브렌, 프로토플라스트 융합, 전기천공법, 리포좀, 미세주입, 플라스마 벡터, 바이러스 벡터, 및 클로닝된 게놈 DNA, cDNA, 합성 DNA 또는 다른 외래 유전자 물질을 숙주 세포 내로 도입하기 위한 임의의 다른 잘 공지된 방법의 사용을 포함한다(예를 들어, 문헌[Sambrook and Russell] 참조, 상기 참조). 이는 단지 사용된 특정 유전자 조작 절차가 본 발명의 폴리펩타이드를 발현시킬 수 있는 숙주 세포 내로 적어도 하나의 유전자를 성공적으로 도입할 수 있는데 필수적이다.
발현 벡터가 세포 내로 도입된 후에, 형질감염 세포는 이하에 동정되는 표준 기법을 사용하여 배양물로부터 회수되는 단백질의 발현에 바람직한 조건 하에서 배양된다.
당업자는 변형이 그의 생물학적 활성을 감소시키는 일 없이 본 발명의 폴리펩타이드(즉, 항체, 표지 또는 효과기, 항체를 사용하여 형성된 면역컨주게이트)를 암호화하는 핵산으로 만들어질 수 있다는 것을 인식할 것이다. 일부 변형은 융합 단백질 내로 표적 분자의 클로닝, 발현 또는 혼입을 용이하게 하도록 만들어질 수 있다. 이러한 변형은 당업자에게 잘 공지되어 있으며, 예를 들어, 종결 코돈, 개시를 제공하기 위해 아미노 말단에 첨가된 메티오닌, 부위, 편리하게 위치된 제한 부위를 생성하기 위해 말단에 위치된 추가적인 아미노산 또는 정제 단계에 도움을 주기 위한 추가적인 아미노산(예컨대 폴리 His)을 포함한다.
일단 발현되면, 본 발명의 재조합 항체, 면역컨쥬게이트, 및/또는 효과기 분자는 황산암모늄 침전, 친화도 칼럼, 칼럼 크로마토그래피 등을 포함하는 당업계의 표준 절차에 따라 정제될 수 있다(일반적으로, 문헌[R. Scopes, PROTEIN PURIFICATION, Springer-Verlag, N.Y. (1982)] 참조). 적어도 약 90 내지 95% 균질성의 실질적으로 순수한 조성물이 바람직하며, 약제학적 용도에 대해 98 내지 99% 이상의 균질성이 가장 바람직하다. 일단 정제되면, 부분적으로 또는 목적으로 하는 바와 같은 균질성에 대해, 치료적으로 사용된다면, 폴리펩타이드는 엔도톡신이 실질적으로 없어야 한다.
단일쇄 항체의 발현 및/또는 이콜라이와 같은 박테리아로부터 단일쇄 항체를 포함하는 적절한 활성 형태로 재폴딩을 위한 방법이 기재되었고, 잘 공지되어 있으며, 본 발명의 항체에 적용가능하다. 문헌[Buchner, et al., Anal Biochem. 205:263-270 (1992); Pluckthun, Biotechnology 9:545 (1991); Huse, et al., Science 246:1275 (1989) 및 Ward, et al., Nature 341:544 (1989)]을 참조하며, 모두 본 명세서에 참고로 포함된다.
종종, 이콜라이 또는 다른 박테리아로부터의 기능성 이종성 단백질은 봉입체로부터 단리되며, 강한 변성제를 사용하는 가용화 및 후속적 재폴딩을 필요로 한다. 당업계에 잘 공지되어 있는 바와 같이 가용화 단계 동안, 환원제는 이황화 결합을 분리시키기 위해 존재하여야 한다. 환원제를 지니는 예시적 완충제는 0.1 M 트리스 pH 8, 6M 구아니딘, 2mM EDTA, 0.3M DTE(다이티오에리트리톨)이다. 이황화 결합의 재산화는 본 명세서에 참고로 포함되는 문헌[Saxena, et al., Biochemistry 9: 5015-5021 (1970)]에서 기재되는 바와 같이, 그리고 특히 문헌[Buchner, et al., 상기 참조]에 기재되는 바와 같이, 환원 형태 및 산화 형태로 저분자량 티올 시약의 존재 하에 생길 수 있다.
재생은 전형적으로 재폴딩 완충제 내로 변성 및 환원된 단백질의 희석(예를 들어, 100배)에 의해 수행된다. 예시적 완충제는 0.1M 트리스, pH 8.0, 0.5M L-알기닌, 8mM 산화 글루타티온(GSSG) 및 2mM EDTA이다.
2쇄 항체 정제 프로토콜에 대한 변형으로서, 중쇄 및 경쇄 영역은 별개로 가용화되고 환원된 다음, 재폴딩 용액 중에서 조합된다. 하나의 단백질이 다른 것의 5몰 과량을 초과하지 않는 몰비로 이들 두 단백질이 혼합될 때, 바람직한 수율이 얻어진다. 산화환원-셔플링(shuffling)이 완료된 후에 재폴딩 용액에 과량의 산화된 글루타티온 또는 저분자량 화합물을 산화시키는 다른 것을 첨가하는 것이 바람직하다.
재조합 방법에 추가로, 본 발명의 항체 및 면역컨쥬게이트는 또한 표준 펩타이드 합성을 사용하여 전체적으로 또는 부분적으로 구성될 수 있다. 길이로 약 50개 미만의 아미노산의 본 발명의 폴리펩타이드의 고체상 합성은 불용성 지지체에 서열의 C-말단 아미노산을 첨가한 다음 서열 내 남아있는 아미노산을 순차적으로 첨가함으로써 수행될 수 있다. 고체상 합성을 위한 기법은 문헌[Barany & Merrifield, THE PEPTIDES: ANALYSIS, SYNTHESIS, BIOLOGY. VOL. 2: SPECIAL METHODS IN PEPTIDE SYNTHESIS, PART A. pp. 3-284; Merrifield, et al. J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2156 (1963), 및 Stewart, et al., SOLID PHASE PEPTIDE SYNTHESIS, 2ND ED., Pierce Chem. Co., Rockford, Ill. (1984)]에 기재되어 있다. 더 큰 길이의 단백질은 더 짧은 단편의 아미노 및 카복실 말단의 축합에 의해 합성될 수 있다. 카복실 말단 단부의 활성화에 의해(예를 들어, 결합 시약 N,N'-다이사이클로헥실카보다이이미드) 펩타이드 결합을 형성하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다.
본 발명의 항체의 보존적으로 변형된 변이체는 아미노산 수준에서 본 발명의 인간화된 항체와 같은 관심 대상의 단백질과 적어도 80% 서열 유사성, 종종 적어도 85% 서열 유사성, 90% 서열 유사성, 또는 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 유사성을 가진다.
주목한 바와 같이, 용어 "보존적으로 변형된 변이체"는 아미노산과 핵산 서열 둘 다에 적용될 수 있다. 특정 핵산 서열에 관해, 보존적으로 변형된 변이체는 동일한 또는 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 해당 핵산 서열을 지칭하거나, 또는 핵산이 아미노산 서열을 암호화하지 않는다면, 본질적으로 동일한 핵산 서열을 지칭한다. 유전자 암호의 축퇴 때문에, 매우 다수의 기능적으로 동일한 핵산은 임의의 주어진 폴리펩타이드를 암호화한다. 예를 들어, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU는 모두 아미노산 알라닌을 암호화한다. 따라서, 알라닌이 코돈에 의해 구체화되는 모든 위치에서, 코돈은 암호화된 폴리펩타이드를 변용하는 일 없이 기재된 임의의 대응하는 코돈으로 변용될 수 있다. 이러한 핵산 변이는 보존적으로 변형된 변이의 한 종인 "침묵 변이"이다. 폴리펩타이드를 암호화하는 본 명세서의 모든 핵산 서열은 또한 핵산의 모든 가능한 침묵 변이를 기재한다. 당업자는 핵산 내 각각의 코돈(보통 메티오닌에 대한 유일한 코돈인 AUG를 제외)이 기능적으로 동일한 분자를 수득하기 위해 변형될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 따라서, 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 각각의 침묵 변이는 각각 기재된 서열에 연루된다.
아미노산 서열에 관해, 당업자는 변용이 아미노산의 화학적으로 유사한 아미노산으로의 치환을 야기하는 경우, 암호화된 서열에서 단일 아미노산 또는 소 백분율의 아미노산을 변용, 첨가 또는 결실시키는 개개 치환, 결실 또는 첨가가 "보존적으로 변형된 변이체"라는 것을 인식할 것이다.
본 발명의 일 실시형태는 효과기 분자 또는 검출가능한 표지에 연결된 본 발명의 인간화된 항체를 포함하는 면역컨쥬게이트를 제공한다. 바람직하게는, 효과기 분자는, 예를 들어, 독소, 화학치료제, 소분자, 사이토카인, 케모카인, 효소, 또는 방사성표지와 같은 치료 분자이다. 예시적 독소는, 슈도모나스(Pseudomonas) 외독소 또는 디프레티아 독소를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 적합한 독소는, 예를 들어, 문헌[Chaudhary, et al. (1987) Proc Natl Acad Sci US A 84:4538, Chaudhary, et al. (1989) Nature 339:394, Batra, et al. (1991) Mol Cell Biol 11:2200. Brinkmann, et al. (1991) Proc Natl Acad Sci USA 88:8616, Siegall, (1995) Semin Cancer Biol 6:289]에 기재되어 있다. 소분자의 예는, 화학치료제 화합물, 예컨대 탁솔, 독소루비신, 에토포사이드 및 블레이오마이신을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 예시적인 사이토카인은 IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6 및 IL-12를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 적합한 사이토카인 및 케모카인은, 예를 들어, 문헌[Rosenblum et al. (2000) Int J Cancer 88:267 및 Xu et al. (2000) Cancer Res 60:4475 및 Biragyn et al. (1999) Nat Biotechnol 17:253]에 기재되어 있다. 예시적인 효소는, RNAses, DNAses, 프로테아제, 키나제, 및 카스파제를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 적합한 프로테아제는, 예를 들어, 문헌[Bosslet et al. (1992) Br J Cancer 65:234, Goshom et al. (1993) Cancer Res 53:2123, Rodrigues et al. (1995) Cancer Res 55:63, Michael et al. (1996) Immunotechnology 2:47, Haisma et al. (1998) Blood 92:184]에 기재되어 있다. 예시적 방사성동위원소는 32P 및 125I를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 적합한 방사성핵종은 또한, 예를 들어, 문헌[Colcher et al. (1999) Ann N Y Acad Sci 880:263]에 기재되어 있다. 추가적인 예시적 효과기 모이어티는, 예를 들어 상동성 또는 이종성 항체로부터의 Fc 단편이다.
임의의 단백질 효과기 분자의 서열이 효과기 단백질의 기능적 이점에 실질적으로 영향을 미치지 않는 방식으로 변용될 수 있다는 것이 당업자에 의해 인식될 것이다. 예를 들어, 글라이신 및 알라닌은 전형적으로 아스팔트산 및 글루탐산 및 아스파라긴 및 글루타민과 상호호환가능한 것으로 고려된다. 당업자는 효과기 서열의 다수의 상이한 변형이 본래 효과기와 거의 동일한 활성을 지니는 효과기를 암호화할 것이라는 것을 인식할 것이다.
효과기 분자 및 항체는 상기 기재한 바와 같은 화학적 또는 재조합 수단에 의해 컨쥬게이트될 수 있다. 화학적 변형은, 예를 들어 효과기 분자 및 서로에 대한 항체를 직접적으로 또는 연결 화합물을 통해, 단백질 화학 분야에서 잘 공지되어 있는 방법에 의해 연결하는 목적을 위한 유도체화를 포함한다. 공유적 부착 수단과 비공유적 부착 수단은 둘 다 본 발명의 인간화된 항체와 함께 사용될 수 있다.
항체에 효과기 분자를 부착하기 위한 절차는 항체에 부착된 모이어티의 화학적 구조에 따라 다를 것이다. 폴리펩타이드는 전형적으로 다양한 작용기; 예를 들어, 카복실산(COOH), 유리 아민(--NH2) 또는 설프하이드릴(--SH) 기를 함유하며, 이는 항체 상의 적합한 작용기와 반응을 위해 이용가능하여 효과기 분자의 결합을 초래한다.
대안적으로, 항체는 추가적인 반응 작용기에 노출 또는 부착을 위해 유도체화된다. 유도체화는 일리노이주 록퍼드에 소재한 피어스 케미컬 컴퍼니(Pierce Chemical Company)로부터 이용가능한 것과 같은 다수의 링커 분자의 부착을 수반할 수 있다.
링커는 항체에 그리고 효과기 분자에 대한 공유 결합을 형성할 수 있다. 적합한 링커는 당업자에게 잘 공지되어 있고, 직쇄 또는 분지쇄 탄소 링커, 헤테로환식 탄소 링커 또는 펩타이드 링커를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 항체 및 효과기 분자가 폴리펩타이드인 경우, 링커는 그들의 측기를 통해(예를 들어, 시스테인에 대한 이황화 결합을 통해) 구성 아미노산에 결합될 수 있다. 그러나, 바람직한 실시형태에서, 링커는 말단 아미노산의 알파 탄소 아미노 및 카복실기에 결합될 것이다.
일부 상황에서, 면역컨쥬게이트가 그의 표적 부위에 도달되었을 때, 항체로부터 효과기 분자를 유리시키는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 이들 상황에서, 면역컨쥬게이트는 표적 부위 근처에서 절단될 수 있는 결합을 포함할 것이다. 항체로부터 효과기 분자를 방출하기 위한 링커의 절단이, 면역컨쥬게이트에 대해 표적 세포 내에서 또는 표적 부위 근처에서 실시되는 효소적 활성 또는 조건에 의해 촉진될 수 있다. 표적 부위가 종양일 때, 종양 부위에 존재하는 조건 하에서(예를 들어, 종양 결합 효소 또는 산성 pH에 노출될 때) 절단가능한 링커가 사용될 수 있다.
본 발명에서 바람직한 화학적 컨쥬게이션 실시형태에서, 효과기 분자 및 항체를 연결하는 수단은 효과기 분자와 항체 사이의 분자간 이황화 결합의 형성에 궁극적으로 기여하는 헤테로2작용성 결합 시약을 포함한다. 본 발명에 대해 이 능력에서 유용한 다른 유형의 결합 시약은, 예를 들어 미국 특허 제4,545,985호에 기재되어 있다. 대안적으로, 분자간 이황화 결합은 자연적으로 생기거나 또는 유전자 조직에 의해 삽입된 효과기 분자 내 시스테인과 항체 사이에 편리하게 형성될 수 있다. 효과기 분자와 항체를 연결하는 수단은 또한 헤테로2작용성 가교 시약 또는 특이적 저 pH 절단가능한 가교제 또는 특이적 프로테아제 절단가능한 링커 또는 다른 절단가능한 또는 절단가능하지 않은 화학적 결합 사이에 티오에터 결합을 사용할 수 있다. 효과기 분자와 항체를 연결하는 수단은 또한 표준 펩타이드 합성 화학 또는 재조합 수단에 의해 별개로 합성되는 효과기 분자와 항체 사이에 형성된 펩티딜 결합을 포함할 수 있다.
본 발명의 효과기 분자와 항체의 예시적 화학적 변형은 또한 잘 공지된 방법에 따라 순환계에서 체류 시간을 연장시키고, 면역원성을 감소시키기 위해 폴리에틸렌 글라이콜(PEG)을 이용한 유도체화를 포함한다(예를 들어, 문헌[Lisi, et al., Applied Biochem. 4:19 (1982); Beauchamp, et al., Anal Biochem. 131:25 (1982); 및 Goodson, et al., Bio/Technology 8:343 (1990)] 참조).
본 발명의 항체는 선택적으로 검출가능한 표지에 공유저긍로 또는 비공유적으로 연결될 수 있다. 이러한 용도에 적합한 검출가능한 표지는 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적, 전기적, 광학적 또는 화학적 수단에 의해 검출가능한 임의의 조성물을 포함한다. 본 발명에서 유용한 표지는 자기 비드(예를 들어, 다이나비즈(DYNABEADS)), 형광 염료(예를 들어, 플루오레세인 아이소티오사이아네이트, 텍사스 레드, 로다민, 녹색 형광 단백질 등), 방사성표지(예를 들어, 3H, 125I, 35S, 14C 또는 32P), 효소(예를 들어, 호스 래디쉬 페록시다제, 알칼린 포스파타제 및 ELISA에서 통상적으로 사용되는 다른 것), 및 비색 표지, 예컨대 콜로이드 금 또는 착색 유리 또는 플라스틱(예를 들어, 폴리스타이렌, 폴리프로필렌, 라텍스 등) 비드를 포함한다.
이러한 표지를 검출하는 수단은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 따라서, 예를 들어, 방사성표지는 사진 필름 또는 신틸레이션 계수기를 사용하여 검출될 수 있고, 형광 마커는 방출된 발광을 검출하기 위해 광검출기를 사용하여 검출될 수 있다. 효소 표지는 전형적으로 기질과 함께 효소를 제공함으로써 그리고 기질 상에서 효소의 작용에 의해 생성된 반응 생성물을 검출함으로써 검출되고, 비색 표지는 단순히 착색 표지를 시각화함으로써 검출된다.
본 발명의 항체 및/또는 면역컨쥬게이트 조성물은 비경구 투여, 예컨대 정맥내 투여 또는 체강 내로 투여에 특히 유용하다.
투여를 위한 조성물은 통상적으로 약제학적으로 허용가능한 담체, 바람직하게는 수성 담체 중에 용해된 항체 및/또는 면역컨쥬게이트의 용액을 포함할 것이다. 다양한 수성 담체, 예를 들어 완충 식염수 등이 사용될 수 있다. 이들 용액은 멸균이며 일반적으로 바람직하지 않은 물질이 없다. 이들 조성물은 전통적인 잘 공지된 멸균 기법에 의해 멸균될 수 있다. 조성물은 pH 조절제 및 완충제, 독성 조절제 등과 같은 생리적 조건에 근접하는데 필요한 약제학적으로 허용가능한 보조 물질, 예를 들어 아세트산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 락트산나트륨 등을 함유할 수 있다. 이들 제형 내 융합 단백질의 농도는 크게 다를 수 있으며, 선택된 특정 투여 방식 및 환자의 필요에 따라 유체 용적, 점성도, 체중 등에 주로 기반하여 선택될 것이다.
따라서, 정맥내 투여를 위한 본 발명의 전형적인 약제학적 조성물은 약 0.1 내지 10㎎/환자/일일 것이다. 0.1 내지 약 100㎎/환자/일의 투약량이 사용될 수 있다. 투여가능한 조성물을 제조하기 위한 실제 방법은 당업자에게 공지되거나 또는 명백할 것이며, 문헌[REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE, 19TH ED., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1995)]과 같은 이러한 간행물에 더욱 상세하게 기재되어 있다.
본 발명의 조성물은 치료적 치료를 위해 투여될 수 있다. 치료적 적용에서, 조성물은 질환으로 고통받는 환자에게 질환 및 그의 합병증을 치유 또는 적어도 부분적으로 저지시키기에 충분한 양으로 투여된다. 이를 달성하기에 적합한 양은 "치료적 유효량"으로서 정의된다. 이 용도를 위한 유효한 양은 질환의 중증도 및 환자 건강의 일반적 건강상태에 의존할 것이다. 화합물의 유효량은 임상의 또는 다른 자격 있는 관찰자에 의해 언급되는 바와 같은 증상(들)의 주관적 경감 또는 객관적으로 동정가능한 개선을 제공하는 것이다.
조성물의 단일 또는 다회 투여는 환자에 의해 필요로 되고 용인되는 바와 같은 투약량 및 빈도에 따라서 투여된다. 임의의 사건에서, 조성물은 환자를 효과적으로 치료하기 위해 충분한 양의 본 발명의 단백질을 제공하여야 한다. 바람직하게는, 투약량은 1회 투여되지만, 치료 결과가 달성될 때까지, 또는 부작용이 요법의 중단을 정당하게 할 때까지 주기적으로 적용될 수 있다. 일반적으로, 용량은 환자에 대해 허용가능하지 않은 독성을 생성하는 일 없이 질환의 증상 또는 징후를 치료 또는 개선시키는데 충분하다.
본 발명의 면역컨쥬게이트 조성물의 제어 방출 비경구 제형은 이식물, 유성 주사제, 또는 미립자 시스템으로서 만들어질 수 있다. 단백질 전달 시스템의 넓은 검토를 위해, 본 명세서에 참고로 포함되는 문헌[Banga, A. J., THERAPEUTIC PEPTIDES AND PROTEINS: FORMULATION, PROCESSING, AND DELIVERY SYSTEMS, Technomic Publishing Company, Inc., Lancaster, Pa., (1995)]을 참조한다. 미립자 시스템은 미소구체, 마이크로입자, 마이크로캡슐, 나노캡슐, 나노구체 및 나노입자를 포함한다. 마이크로캡슐은 중심 코어로서 치료 단백질을 함유한다. 미소구체에서, 치료제는 입자 전체적으로 분산된다. 1㎛보다 작은 입자, 미소구체 및 마이크로캡슐은 일반적으로 각각 나노입자, 나노구체 및 나노캡슐로서 지칭된다. 모세관은 대략 5㎛의 직경을 가지며, 따라서 나노입자 만이 정맥내로 투여된다. 마이크로입자는 전형적으로 직경이 약 100㎛이며, 피하로 또는 근육내로 투여된다. 예를 들어, 본 명세서에 참고로 포함된 문헌[Kreuter, J., COLLOIDAL DRUG DELIVERY SYSTEMS, J. Kreuter, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., pp. 219-342 (1994); 및 Tice & Tabibi, TREATISE ON CONTROLLED DRUG DELIVERY, A. Kydonieus, ed., Marcel Dekker, Inc. New York, N.Y., pp.315-339, (1992)]을 참조한다.
중합체는 본 발명의 면역컨쥬게이트 조성물의 이온-제어 방출을 위해 사용될 수 있다. 제어 약물 전달에서 사용을 위한 다양한 분해가능한 및 분해가능하지 않은 중합체 매트릭스는 당업계에 공지되어 있다(Langer, R., Accounts Chem. Res. 26:537-542 (1993)). 예를 들어, 블록 공중합체, 폴록사머 407은 저온에서 점성의 아직 이동성인 액체로서 존재하지만, 체온에서 반고체 겔을 형성한다. 이는 재조합 인터류킨-2 및 유레아제의 제형화 및 지속 전달을 위한 효과적인 비히클이 되는 것으로 나타났다(문헌[Johnston, et al., Pharm. Res. 9:425-434 (1992); 및 Pec, et al., J. Parent. Sci. Tech. 44(2):58-65 (1990)]). 대안적으로, 수산화인회석이 단백질의 제어 방출을 위한 마이크로담체로서 사용되었다(Ijntema, et al., Int. J. Pharm. 112:215 내지 224 (1994)). 또 다른 양태에서, 리포좀은 제어 방출뿐만 아니라 액체-캡슐 약물의 약물 표적화를 위해 사용된다(Betageri, et al., LIPOSOME DRUG DELIVERY SYSTEMS, Technomic Publishing Co., Inc., Lancaster, Pa. (1993)). 치료적 단백질의 제어된 전달을 위한 수많은 추가적인 시스템은 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,055,303호, 제5,188,837호, 제4,235,871호, 제4,501,728호, 제4,837,028호 제4,957,735호 및 제5,019,369호, 제5,055,303호; 제5,514,670호; 제5,413,797호; 제5,268,164호; 제5,004,697호; 제4,902,505호; 제5,506,206호, 제5,271,961호; 제5,254,342호 및 제5,534,496호를 참조하며, 이들 각각은 본 명세서에 참고로 포함된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "암" 및 "암성"은 세포 집단이 조절되지 않은 세포 성장을 특징으로 하는 포유류에서의 생리적 조건을 지칭하거나 또는 설명한다. 암의 예는, 암종, 림프종, 아세포종, 육종, 백혈병, 양성 또는 악성 종양을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 이러한 암의 더 특별한 예는 편평세포암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암종, 폐의 편평암종, 복막암, 간세포암, 위장암, 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포암, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막암 또는 자궁암종, 침샘 암종, 신장암, 간암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 뇌, 간 암종 및 다양한 유형의 두경부암, 신경섬유종증 I형 또는 II형을 포함한다. 이러한 암의 다른 예는 치료 내성, 난치성 또는 전이성인 것을 포함한다.
치료될 수 있는 다른 질환 또는 장애는 "염증성 질환 또는 장애"를 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "염증성 질환 또는 장애"는 가려움증, 피부 염증, 건선, 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 골관절염, 전신 홍반 루푸스, 하시모토 갑상선염, 중증 근무력증, I형 또는 II형 당뇨병, 천식, 염증성 폐 손상, 염증성 간 손상, 염증성 사구체 손상, 아토피 피부염, 알레르기성 접촉피부염, 자극성 접촉 피부염, 지루성 피부염, 쇼그렌 증후군, 각결막염, 포도막염, 염증성 장질환, 크론병, 궤양성 대장염, 관절, 피부 또는 근육의 염증성 질환, 급성 또는 만성 특발성 염증성 관절염, 근염, 탈수초성 질환, 만성 폐쇄성 폐질환, 간질성 폐 질환, 간질성 신염 및 만성 활성 간염을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "전이"는 새로운 위치에서 유사한 암성 병변의 발생과 함께 신체의 기점 부위로부터 다른 영역까지 암이 퍼지고 전달되는 과정을 지칭한다. "전이성" 또는 "전이되는" 세포는 이웃하는 세포와의 부착 접촉을 상실하고, 이웃하는 신체 구조를 침습하기 위해 질환의 주요 부위로부터 혈류 또는 림프를 통해 이동하는 세포이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "대상체"는 특정 치료의 수용자가 되는 인간, 비인간 영장류, 설치류 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 임의의 동물(예를 들어, 포유류)을 지칭한다. 전형적으로, 용어 "대상체" 및 "환자"는 인간 대상체에 대해 본 명세서에서 상호호환적으로 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "암을 갖는 것으로 의심되는 대상체"는 암을 나타내는 하나 이상의 증상(예를 들어, 현저한 응어리 또는 덩어리)이 존재하거나 암에 대해(예를 들어, 일상적 신체활동 동안) 선별된 대상체를 지칭한다. 암으로 의심되는 대상체는 또한 하나 이상의 위험 인자를 가질 수 있다. 암을 갖는 것으로 의심되는 대상체는 일반적으로 암에 대해 검사된 적이 없다. 그러나, "암을 갖는 것으로 의심되는 대상체"는 처음 진단을 받았지만 암의 병기가 알려지지 않은 개체를 포함한다. 상기 용어는 일단 암을 갖는 사람들(예를 들어, 관해에 있는 개체)을 추가로 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "암에 대한 위험에 있는 대상체"는 특이적 암이 진행할 하나 이상의 위험 인자를 지니는 대상체를 지칭한다. 위험 인자는, 성별, 연령, 유전자 성향, 환경적 노출, 이전의 암 사건, 기존의 암이 아닌 질환 및 생활양식을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "대상체에서 암을 특징으로 하는"은 양성, 전암성 또는 암성 조직의 존재, 암의 병기, 대상체의 예후를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 대상체에서 암 샘플의 하나 이상의 특성의 동정을 지칭한다. 암은 본 명세서에 개시된 암 마커를 포함하지만, 이것으로 제한되지 않는 하나 이상의 암 마커 유전자 발현의 동정을 특징으로 할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "세포암 마커(들)", "암세포 마커(들)", "종양 세포 마커(들)", 또는 "고형종양 세포 마커(들)"는 유전자 또는 유전자들, 또는 발현 수준이 단독으로 또는 다른 유전자와 조합되는 유전자 또는 유전자들에 의해 발현되는 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 지칭하며, 인테그린 β1과 같은 비-종양형성 세포에 비해 종양형성 암 세포의 존재와 상호관련된다. 상관관계는 유전자의 증가 또는 감소된 발현와 관련될 수 있다(예를 들어, 유전자에 의해 암호화된 mRNA 또는 펩타이드의 증가 또는 감소된 수준).
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "비암성 대조군에 대해 감소 또는 증가된 발현을 검출하는 것"은 비암성 대조군 샘플에서 수준에 비한 유전자의 발현 수준(예를 들어, mRNA 또는 단백질의 수준)을 측정하는 것을 지칭한다. 유전자 발현은 본 명세서에 기재된 것을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 임의의 적합한 방법을 사용하여 측정될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "상기 시험 화합물이 없을 때에 비해 상기 시험 화합물의 존재 하에 세포 샘플 중의 유전자 발현의 변화를 검출하는 것"은 시험 화합물이 없을 때에 비해 시험 화합물의 존재 하에 변용된 발현 수준(예를 들어, 증가 또는 감소됨)을 측정하는 것이다. 유전자 발현은 임의의 적합한 방법을 사용하여 측정될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "상기 대상체에서 암을 검출하기 위해 상기 키트를 사용하기 위한 설명서"는 대상체로부터 샘플 내 암의 검출 및 특성규명을 위한 키트에 포함된 시약을 사용하기 위한 설명서를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "진단을 제공하는" 또는 "진단적 정보"는 환자가 질병 또는 질환을 갖는지 여부를 결정함에 있어서 및/또는 질환 또는 병태를 표현형 범주로 또는 질환 또는 병태의 치료(일반적 치료 또는 임의의 특정 치료)의 예후에 관해 또는 치료에 대한 가능성 있는 반응에 관해 중요성을 갖는 임의의 범주로 분류함에 있어서 유용한 임의의 정보를 지칭한다. 유사하게, 진단은 대상체가 병태(예컨대, 종양)를 가질 가능성이 있는지 여부, 예를 들어 고위험 종양 또는 저위험 종양으로서 종양의 특성 또는 분류에 관한 정보, 적절한 치료를 선택하는데 유용한 예후 및/또는 정보와 관련된 정보를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 임의의 유형의 진단 정보를 제공하는 것을 지칭한다. 치료의 선택은 특정 화학치료제 또는 다른 치료 양상, 예컨대 수술 또는 방사선의 선택 또는 요법을 보류 또는 전달할지 여부에 관한 선택을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "예후를 제공하는", "예후 정보", 또는 "예측 정보"는 대상체의 미래 건강(예를 들어 예측 이환률 또는 사망률 또는 암을 얻을 가능성, 및 전이의 위험)에 대한 암 존재(예를 들어, 본 발명의 진단 방법에 의해 결정되는 바와 같음)의 영향에 관한 정보를 제공하는 것을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "수술 후 종양 조직"은 (예를 들어, 수술 동안) 대상체로부터 제거된 암성 조직(예를 들어, 생검 조직)을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "암으로 진단된 대상체"는 암성 세포를 갖는 것으로 시험되고 발견된 대상체를 지칭한다. 암은 생검, x-선, 혈액검사 및 본 발명의 진단 방법을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 임의의 적합한 방법을 사용하여 진단될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "생검 조직", "환자 샘플", "종양 샘플", 및 "암 샘플"은 샘플이 암세포를 포함하는 암성 세포를 함유하는지 여부를 결정하거나, 또는 해당 암성 조직의 유전자 발현 프로파일을 결정하기 위한 목적을 위해 대상체로부터 제거되는 세포, 조직 또는 유체의 샘플을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 생검 조직 또는 유체는 대상체가 암을 갖는 것으로 의심되기 때문에 얻어진다. 이어서, 생검 조직 또는 유체는 암, 암세포 및/또는 암세포 유전자 서명 발현의 존재 또는 부재에 대해 시험된다.
본 발명의 특정 실시형태에서, 암세포 발현, 예컨대, 췌장, 결장, 유방, 간, 신장, 뇌, GBM 등은 비-종양성 결장 종양 세포에 비해 상승된 수준의 인테그린 β1을 포함한다. 인테그린은 상이한 인테그린을 형성하기 위해 다양한 상대와 결합되는 쇄를 지니는 알파쇄와 베타쇄 둘 다로 이루어진 이형이합체 세포외 기질(ECM) 세포-표면 단백질이다. 인테그린은 세포외 기질에 또는 다른 세포 상의 수용기에 세포를 가역적으로 연결하기 위한 세포 부착 및 이동에서 작용하며, 따라서 암 침범 및 전이에서 중요한 역할을 할 수 있다. 인테그린-매개 부착은 또한 세포내 신호처리에 영향을 미치며, 따라서 세포 생존, 증식 및 분화를 조절할 수 있다.
인테그린 베타 1은 가장 큰 다양성의 공지된 알파 인테그린을 지니는 기능성 수용기를 형성할 수 있으며, 다양한 ECM 환경과 상호작용하는 능력을 생성하고, 암에 연루되었다. 예를 들어, 증가된 베타 1 인테그린 신호처리는 임상적으로 그리고 유방암 세포주에서 유방암의 악성 진행과 관련된다.
인테그린 β1은 종양 성장을 직접적으로 달성하는 것으로 동정되었다. 구체적으로, 항-인테그린 β1 항체를 이용하는 종양 세포의 치료는 종양 크기를 감소시키고, 전이를 저해한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 암에 대한 마커로서 인테그린 β1의 발현의 검출을 위한 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 발현은 직접적으로(예를 들어, 단백질 수준에서) 측정되고, 일부 실시형태에서, 발현은 조직 샘플(예를 들어, 생검 조직)에서 검출된다. 다른 실시형태에서, 발현은 체액 중에서 검출된다(예를 들어, 혈장, 혈청, 전혈, 점액 및 소변을 포함하지만, 이들로 제한되지 않음). 본 발명은 추가로 마커의 검출을 위한 키트를 제공하며, 일부 실시형태에서, 세포암 마커의 존재는 대상체에게 예후를 제공하기 위해 사용된다. 제공되는 정보는 또한 치료 과정을 지시하기 위해 사용된다. 예를 들어, 대상체가 고형종양 세포를 나타내는 마커를 갖는 것으로 발견되면, 추가적인 요법(예를 들어, 호르몬 또는 방사선 요법)은, 그들이 더 유효하게 될 가능성이 있을 때(예를 들어, 전이 전에), 더 이른 시점에 시작될 수 있다. 추가로, 대상체가 호르몬 요법에 반응하지 않는 종양을 갖는 것으로 발견된다면, 이러한 요법의 비용 및 불편함을 회피할 수 있다.
실시형태에서, 인테그린 β1의 유전자 발현은 단백질의 수준을 측정함으로써 검출된다. 단백질 발현은 임의의 적합한 방법에 의해 검출될 수 있다. 일부 실시형태에서, 단백질은 본 명세서에 기재된 항체를 이용하는 면역조직화학에 의해 검출된다.
항체 결합은 당업계에 공지된 기법(예를 들어, 방사면역측정법, ELISA(효소결합 면역흡착 분석), "샌드위치" 면역분석법, 면역방사계측법, 겔 침윤 침전 반응, 면역확산분석법, 인시추(in situ) 면역분석법(예를 들어, 콜로이드 금, 효소 또는 방사성 동위원소 표지를 사용), 웨스턴 블롯, 침강 반응, 응집 분석(예를 들어, 겔 응집 분석, 적혈구응집 분석 등), 상보체 고정 분석, 면역형광분석, 단백질 A 분석 및 면역전기영동 분석 등에 의해 검출된다.
일 실시형태에서, 항체 결합은 1차 항체 상에서 표지를 검출함으로써 검출된다. 다른 실시형태에서, 1차 항체는 2차 항체의 결합 또는 1차 항체에 대한 시약을 검출함으로써 검출된다. 추가 실시형태에서, 2차 항체는 표지된다. 다수의 방법이 면역분석법에서 결합을 검출하는 것에 대해 당업계에 공지되어 있으며, 본 발명의 범주 내에 있다.
일부 실시형태에서, 자동 검출 분석이 이용된다. 면역분석의 자동화를 위한 방법은 미국 특허 제5,885,530호, 제4,981,785호, 제6,159,750호 및 제5,358,691호에 기재된 것을 포함하며, 이들 각각은 본 명세서에 참고로 포함된다. 일부 실시형태에서, 결과의 분석 및 제시는 또한 자동화된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 암 마커에 대응하는 일련의 단백질의 존재 또는 부재에 기반한 예후를 생성하는 소프트웨어가 이용된다.
다른 실시형태에서, 미국 특허 제5,599,677호 및 제5,672,480호에 기재된 면역분석(이들 각각은 본 명세서에 참고로 포함됨)이 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 검출 분석에 의해 생성된 원 데이터(예를 들어, 주어진 마커 또는 마커들의 존재, 부재 또는 양)를 임상의를 위한 예측값의 데이터로 번역하기 위해 컴퓨터 기반 분석 프로그램이 사용된다. 임상의는 임의의 적합한 수단을 사용하여 예측 데이터에 접근할 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본 발명은 유전학 또는 분자생물학에 숙달되어 있지 않을 수 있는 임상의가 원 데이터를 이해할 필요가 없다는 추가적인 이점을 제공한다. 데이터는 그것의 가장 유용한 형태로 임상의에게 직접 제시된다. 이어서, 임상의는 대상체의 치유를 최적화하기 위해 정보를 즉시 이용할 수 있다.
본 발명은 분석을 수행하는 연구질, 정보 제공자, 의료인 및 대상체에 대해 그리고 이들로부터 정보를 수용, 처리 및 전달할 수 있는 임의의 방법을 상정한다. 예를 들어, 본 발명의 일부 실시형태에서, 샘플(예를 들어, 생검 또는 혈청 또는 소변 샘플)은 대상체로부터 얻어지고 프로파일링 서비스(예를 들어, 의료 시설의 임상 연구실, 게놈 프로파일링 사업 등)에 제출되며, 원 데이터를 생성하기 위해 전 세계 어느 곳에나(예를 들어, 대상체가 거주하는 국가 또는 정부가 궁극적으로 사용되는 국가와 상이한 국가에) 위치된다. 샘플이 조직 또는 다른 생물학적 샘플을 포함하는 경우, 대상체는 얻어진 샘플을 갖기 위해 의료 센터를 방문하고 프로파일링 센터에 보낼 수 있으며, 또는 대상체는 샘플 그 자체를 수집하고 그것을 프로파일링 센터에 직접 보낼 수 있다. 샘플이 이전에 결정된 생물학적 정보를 포함하는 경우, 정보는 대상체에 의해 프로파일링 서비스에 직접 보내질 수 있다(예를 들어, 정보를 함유하는 정보 카드는 컴퓨터에 의해 스캔되고, 데이터는 전자 통신 시스템을 사용하여 프로파일링 센터의 컴퓨터에 전송될 수 있다). 일단 프로파일링 서비스에 의해 수신되면, 샘플은 처리되고, 대상체에 대해 요망되는 진단적 또는 예후적 정보에 특이적인 프로파일(예를 들어, 발현 데이터)이 생성된다.
이어서, 프로파일 데이터는 치료 임상의에 의한 해석에 적합한 형식으로 준비된다. 예를 들어, 원 발현 데이터를 제공하기보다는, 준비된 형식은 특정 치료 선택사항에 대한 권고사항과 함께 진단 또는 위험 평가를 나타낼 수 있다. 데이터는 임의의 적합한 방법에 의해 임상의에게 표시될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 프로파일링 서비스는 임상의를 위하여 (예를 들어, 치료 시점에서) 인쇄할 수 있거나 또는 컴퓨터 모니터 상에서 임상의에게 표시될 수 있는 보고서를 생성한다.
일부 실시형태에서, 정보는 치료 시점에 또는 지역적 시설에서 처음으로 분석된다. 이어서, 원 데이터는 추가 분석을 위해 중앙 처리 시설로 보내지고/지거나 원데이터를 임상의 또는 환자에게 유용한 정보로 전환한다. 중앙 처리 시설은 프라이버시(모든 데이터는 획일적 보안 프로토콜을 지니는 중앙 시설에 저장됨), 속도 및 데이터 분석의 균일성의 이점을 제공한다. 이어서, 중앙 처리 시설은 대상체의 치료 후에 데이터의 운명을 제어할 수 있다. 예를 들어, 전자 통신 시스템을 사용하여, 중앙 시설은 임상의, 대상체 또는 연구자에게 데이터를 제공할 수 있다.
일부 실시형태에서, 대상체는 전자 통신 시스템을 사용하여 데이터에 직접 접근할 수 있다. 대상체는 결과에 기반한 추가 조정 또는 상담을 추가로 선택할 수 있다. 일부 실시형태에서, 데이터는 연구 목적을 위해 사용된다. 예를 들어, 데이터는 질환의 특정 병태 또는 병기의 유용한 지표로서 마커의 포함 또는 제거를 추가로 최적화하기 위해 사용될 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 암의 검출 및 특성규명을 위한 키트를 제공한다. 일부 실시형태에서, 키트는 검출 시약 및 완충제에 추가로 본 발명의 항체와 같은 암 마커에 특이적인 항체를 함유한다. 다른 실시형태에서, 키트는 mRNA 또는 cDNA(예를 들어, 올리고뉴클레오타이드 프로브 또는 프라이머)의 검출에 특이적인 시약을 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 모든 대조군, 분석을 수행하기 위한 지침, 및 결과의 분석 및 제시를 위한 임의의 필요한 소프트웨어를 포함하는 검출 분석을 수행하기 위해 필요한 및/또는 충분한 모든 성분을 포함한다.
본 발명의 다른 실시형태는, 예를 들어, 조직 샘플 중에서 또는 체액 중에서 인테그린 β1과 같은 단백질의 존재에 대해 시험하기 위한 키트를 포함한다. 키트는, 예를 들어 폴리펩타이드의 검출을 위한 항체를 포함할 수 있다. 추가로, 키트는 기준 또는 대조군 샘플; 샘플을 처리하고 시험을 수행하며, 결과를 해석하기 위한 설명서; 및 완충제 및 시험을 수행하기 위해 필요한 다른 시약을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 생체내 영상화 기법은 동물(예를 들어, 인간 또는 비인간 포유류)에서 암 마커의 발현을 시각화하기 위해 사용된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 인테그린 β1은 본 발명의 표지된 항체를 사용하여 표지된다. 특이적으로 결합되고 표지된 항체는, 방사성핵종 영상화, 양전자방출단층촬영술, 컴퓨터 단층 촬영, X-선 또는 자기 공명 영상화 방법, 형광 검출, 및 화학발광 검출을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 생체내 영상화 방법을 사용하여 개체에서 검출될 수 있다.
본 발명의 생체내 영상화 방법은 (예를 들어, 유방암에서) 본 발명의 고형종양 세포 암 마커를 발현시키는 암의 진단에서 유용하다. 생체내 영상화는 암을 나타내는 마커의 존재를 시각화하기 위해 사용된다. 이러한 기법은 불쾌한 생검을 사용하는 일 없이 진단하게 한다. 본 발명의 생체내 영상화 방법은 또한 암 환자의 예후를 제공하는데 유용하다. 예를 들어, 암세포를 나타내는 마커의 존재가 검출될 수 있다. 생체내 영상화에서 본 발명의 방법은 신체의 다른 부분에서 전이성 암을 검출하기 위해 추가로 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 암 마커에 특이적인 시약(예를 들어, 항체)은 형광으로 표지된다. 표지된 항체는 대상체에 (예를 들어, 경구로 또는 비경구로) 도입된다. 형광으로 표지된 항체는 임의의 적합한 방법을 사용하여(예를 들어, 본 명세서에 포함된 미국 특허 제6,198,107호에 기재된 장치를 사용하여) 검출된다.
다른 실시형태에서, 항체는 방사성 표지된다. 생체내 진단을 위한 항체의 용도는 당업계에 잘 공지되어 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 상기 논의한 바와 같은 더 넓은 기능적 활성에서 인테그린 β1의 역할이 주어진 면역학적/염증성 질환 및 장애를 포함하는 질환 및 장애에 대한 요법을 제공한다. 추가로, 본 발명의 조성물에 의해 표적화될 수 있는 질환 및 장애는 다발성 경화증, 크론병, 류마티스 관절염, 염증성 장질환 등을 포함한다. 유사하게, 습성 연령-관련 황반변성(AMD)을 포함하는 특정 눈 관련 질환이 표적화될 수 있는 것으로 예상된다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 암, 예를 들어, 유방, 뇌, 전립선 및 결장암과 같은 질환에 대한 요법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 요법은 인테그린 β1과 같은 암 마커를 표적화한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 세포암 마커, 예를 들어, 인테그린 β1을 발현시키는 종양을 표적화하는 항체를 제공한다.
일부 실시형태에서, 치료적 항체는 상기 논의한 바와 같은 세포독성제에 컨쥬게이트된 본 발명의 항체를 포함한다.
다음의 예는 본 발명의 이점 및 특징을 추가로 예시하기 위해 제공되지만, 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 그들은 전형적으로 사용될 수 있는 것이지만, 당업자에게 공지된 다른 절차, 방법 또는 기법이 대안적으로 사용될 수 있다.
실시예 1
가변 영역 유전자 서열화
OS2966 항-인간 인테그린 β1 단클론성 항체를 암호화하는 유전자에 가변(V)-영역 서열 분석을 실시하였다. RNA큐어스-4PCR 키트(RNAqueous-4PCR Kit)(상표명)(영국 워링턴에 소재한 앰비온(Ambion))을 사용하여 3 내지 10x106개 하이브리도마 세포로부터 전체 RNA를 추출하고 나서 cDNA를 합성하기 위해 사용하였다. 표 1에 나타낸 바와 같은 축퇴 마우스 리더 서열 프라이머(시그마(Sigma)) 및 독특한 불변 도메인 프라이머(시그마)를 사용하여 PCR에 의해 뮤린 면역글로불린 중쇄 및 카파 경쇄 V-영역 단편을 증폭시켰다. 얻어진 PCR 단편을 pGEM-T 이지 I(pGEM-T Easy I)(상표명) 벡터 시스템(영국 사우스햄프턴에 소재한 프로메가(Promega)) 내로 서브클로닝하고 나서, 삽입물을 벡터-특이적 프라이머인 M13포워드(M13Forward)(시그마)를 사용하여 서열화시켰다. 모든 DNA 서열화를 영국 캠브릿지에 소재한 진서비스 엘티디(Geneservice Ltd)에 의해 수행하였다. 독특한 V-영역 뉴클레오타이드 서열을 OS2966(서열번호 1(VH) 및 3(VL))에 대해 얻었다.
서열 명칭-풀 서열번호
ATGRASTTSKGGYTMARCTKGRTTT MuIgVH5'-A 58
ATGRAATGSASCTGGGTYWTYCTCTT MuIgVH5'-B 59
ATGGACTCCAGGCTCAATTTAGTTTTCCT MuIgVH5'-C 60
ATGGCTGTCYTRGBGCTGYTCYTCTG MuIgVH5'-C 61
ATGGVTTGGSTGTGGAMCTTGCYATTCCT MuIgVH5'-C 62
ATGAAATGCAGCTGGRTYATSTTCTT MuIgVH5'-D 63
ATGGRCAGRCTTACWTYYTCATTCCT MuIgVH5'-D 64
ATGATGGTGTTAAGTCTTCTGTACCT MuIgVH5'-D 65
ATGGGATGGAGCTRTATCATSYTCTT MuIgVH5'-E 66
ATGAAGWTGTGGBTRAACTGGRT MuIgVH5'-E 67
ATGGRATGGASCKKIRTCTTTMTCT MuIgVH5'-E 68
ATGAACTTYGGGYTSAGMTTGRTTT MuIgVH5'-F 69
ATGTACTTGGGACTGAGCTGTGTAT MuIgVH5'-F 70
ATGAGAGTGCTGATTCTTTTGTG MuIgVH5'-F 71
ATGGATTTTGGGCTGATTTTTTTTATTG MuIgVH5'-F 72
CCAGGGRCCARKGGATARACIGRTGG MuIgGVH3'-2 73
ATGRAGWCACAKWCYCAGGTCTTT MuIgkVL5'-A 74
ATGGAGACAGACACACTCCTGCTAT MuIgkVL5'-B 75
ATGGAGWCAGACACACTSCTGYTATGGGT MuIgkVL5'-C 76
ATGAGGRCCCCTGCTCAGWTTYTTGGIWTCTT MuIgkVL5'-D 77
TGGGCWTCAAGATGRAGTCACAKWYYCWGG MuIgkVL5'-D 78
ATGAGTGTGCYCACTCAGGTCCTGGSGTT MuIgkVL5'-E 79
ATGTGGGGAYCGKTTTYAMMCTTTTCAATTG MuIgkVL5'-E 80
ATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCC MuIgkVL5'-E 81
ATGAGIMMKTCIMTTCAITTCYTGGG MuIgkVL5'-F 82
ATGAKGTHCYCIGCTCAGYTYCTIRG MuIgkVL5'-F 83
ATGGTRTCCWCASCTCAGTTCCTTG MuIgkVL5'-F 84
ATGTATATATGTTTGTTGTCTATTTCT MuIgkVL5'-F 85
ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCT MuIgkVL5'-G 86
ATGGATTTWCARGTGCAGATTWTCAGCTT MuIgkVL5'-G 87
ATGGTYCTYATVTCCTTGCTGTTCTGG MuIgkVL5'-G 88
ATGGTYCTYATVTTRCTGCTGCTATGG MuIgkVL5'-G 89
ACTGGATGGTGGGAAGATGGA MuIgkVL3'-1 90
실시예 2
키메라 항체의 생성
OS2966 단클론성 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 서열을 PCR 증폭시키고 나서, pANT 항체 발현 벡터(도 14) 내로 서브클로닝하고, 중쇄 및 경쇄 V-영역을 각각 pANT17 및 pANT13 내로 클로닝하였다. 중쇄 V-영역 유전자를 인간 χ1 중쇄 유전자(G1m3 (G1m(f)) 동종이인자형(allotype)) 또는 인간 χ4 중쇄 유전자 중 하나를 지니는 프레임에서 MluI 및 HindIII 부위를 통해 pANT17 내로 클로닝하고 나서, 경쇄 V-영역 유전자를 인간 카파 경쇄 불변 영역 유전자(Km3 동종이인자형)를 지니는 프레임에서 BssHII 및 BamHI 부위를 통해 pANT13 내로 클로닝하였다. 중쇄 유전자와 경쇄 유전자 둘 다의 전사는 CMV I/E 프로모터(미국 특허 제5168062호 및 미국 특허 제5385839호, 아이오와 유니버시티)의 제어 하에 있으며, pANT17 플라스미드는 진핵생물 세포의 선택을 위해 SV40 프로모터 및 폴리A 서열의 제어 하에서 돌연변이체 dhfr 미니유전자(Simonsen & Levinson 1983, PNAS 80:2495-2499)를 함유하였다. pANT17과 pANT13은 둘 다 원핵생물 선택을 위한 β-락타마제(ApR) 유전자 및 원핵생물 세포에서 증식을 위한 pMB1 복제기점을 함유하였다. 모든 플라스미드를 이콜라이 XL1-블루(스트라타겐(Stratagene) 카탈로그 번호 200130)에서 증식시켰다.
이어서 중쇄 및 경쇄 발현 작제물을 인산칼슘-기반 형질감염에 의해 HEK293 세포 내로 일시적으로 공동형질감염시키거나 또는 전기천공법에 의해 NS0 세포 내로 안정하게 형질감염시켰다. 선택한 항체를 단백질 A 크로마토그래피에 의해 세포 배양물 상청액으로부터 정제하였다.
실시예 3
인간화된 항체의 생성
EP1844074(안티토프 엘티디(Antitope Ltd))에 기재된 방법을 사용하여 인간화된 항체를 생성하였다. 스위스(Swiss) PDB를 사용하여 마우스 V-영역의 구조적 모델을 생성하고 나서, 항체의 인테그린 β1 결합 특성에 중요하게 될 가능성이 있는 OS2966 V-영역으로부터의 중요한 아미노산('제한하는 잔기')을 동정하기 위해 분석하였다. 인간 V-영역 서열의 데이터베이스를 사용하여 인간화된 항체의 설계에 사용되는 각각의 제한하는 잔기를 함유하는 인간 V-영역 서열의 세그먼트를 동정하였다. 전형적으로 2 이상의 대안의 V-영역 서열 세그먼트를 사용하여 인간화된 항-인테그린 Β1 V-영역 서열의 다수의 가능한 서열을 야기하는 각각의 제한하는 잔기를 제공하였다. 이어서, 이들 서열을 포더길(Fothergill) 등(WO9859244, 양수인 에클라겐 엘티디(Eclagen Ltd))에 기재된 바와 같은 인실리코 분석에 의해 비-생식계열 MHC 클래스 II 펩타이드의 예측에 대해 분석하였고, 또한 공지된 CD4+ T-세포 에피토프에 대해, 예측되는 비-생식계열 MHC 클래스 II 결합 펩타이드를 지니거나 또는 T 세포 에피토프 데이터베이스에 대해 상당한 히트를 지니는 URL:immuneepitope.org/.V-region sequences에서 월드 와이드 웹 상에서 이용가능한 "면역 에피토프 데이터베이스 및 분석 소스(The Immune Epitope Database and Analysis Resource)"를 포함하는 데이터베이스를 사용하여 버렸다. 이는 감소된 세트의 V-영역 서열을 야기하였다. 이어서, V-영역 서열 세그먼트의 선택 조합을 인간화된 중쇄 및 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 생성하기 위해 합하였다. 5개의 중쇄 및 4개의 경쇄 서열(각각 VH1 내지 VH5, 및 Vκ1 내지 Vκ4를 지정)을 유전자 합성을 위해 선택하였다(서열번호 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22). 추가로, 중쇄 및 경쇄 V-영역 서열의 추가 세트(각각 VH6 내지 VH15, 및 Vκ5 내지 Vκ13을 지정)를 지정하였다(각각 서열번호 29 내지 38 및 44 내지 52).
상기에 추가로, 윈터(Winter), 카르(Carr), 해리스(Harris)(유럽 특허 제0629240B1호)에서 변형된 바와 같은 윈터(미국 특허 제6,548,640B2호)의 일반적 방법을 사용하여 인간화된 항체를 지정하였고, 이에 의해 OS2966의 CDR 서열(서열번호 23 내지 28)을 사용하여 서열을 지정하여서 인간 J 영역 서열의 첨가에 함께 인간 생식계열 V-영역 서열의 세트에서 CDR을 대체하였다. 추가로, 상기 단락의 인간화된 항체에서 사용한 바와 같은 제한하는 잔기를 생식계열 V-영역 프레임워크 서열에 도입하였다. 중쇄 및 경쇄 V-영역에 대해 얻어진 서열은 VH16 내지 VH20, 및 Vκ14 내지 Vκ18을 각각 지정하였고, 서열번호 39 내지 43 및 53 내지 57로서 열거한다.
상기에 추가로, 탈면역화한 항체를 카르(Carr) 등(미국 특허 제7465572 B2호)의 일반적 방법을 사용하여 지정하였고, 이에 의해 OS2966의 V-영역 서열(서열번호 2 및 4) 내의 CD4+ T 세포 에피토프를 동정하고, 이들 에피토프 중 하나 이상을 잠재적으로 제거하기 위해 돌연변이를 도입하였다.
인간화된 OS2966 변이체 V-영역을 암호화하는 DNA를 합성하고 나서 실시예 2에 기재한 바와 같은 발현 벡터 pANT17 및 pANT13 내로 서브클로닝하였다. 인간화된 VH 및 Vκ 쇄의 모든 조합(즉, VH1 내지 VH5, 및 Vκ1 내지 Vκ4의 조합(즉, 총 20쌍))을 HEK293 내로 일시적으로 형질감염시키고 나서, 또한 NS0 세포 내로 형질감염시키고, 항체를 실시예 2에 기재한 바와 같은 배양 상청액으로부터 단백질 A 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
실시예 4
인간화된 항체의 분석
인간 인테그린 β1에 대한 HEK-유래 및 NS0-유래 OS2966 인간화된 변이체의 결합을 실시예 2로부터의 키메라 항체에 대한 경쟁 ELISA에서 평가하였다. OS2966 키메라 항체를 바이오틴 태그(Biotin Tag)(상표명) 마이크로 바이오티닐화 키트(Micro Biotinylation kit)(시그마-알드리치(Sigma-Aldrich))를 사용하여 바이오티닐화하였다. 96 웰 맥시소프(MaxiSorp) 플레이트(눈크(Nunc))를 4℃에서 밤새 0.5㎍/㎖ 인간 인테그린 β1(100㎕ 최종 용적)로 코팅하였다. 플레이트를 세척 완충제(둘베코-PBS 중에서 0.05% 트윈20(Tween20))로 세척하고 나서, 실온에서 1시간 동안 둘베코 PBS-2% BSA로 차단시켰다. 이어서, 플레이트를 세척 완충제로 3회 세척하였다. 다양한 농도에서 시험 인간화 항체를 바이오티닐화된 키메라 항체(0.02㎍/㎖ 최종 농도)와 함께 사전혼합한 다음, 인간 인테그린 β1-코팅 플레이트(100㎕ 최종 용적)에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시키고 나서, 세척 완충제를 이용하여 3회 세척하였다. 스트렙타비딘 HRP(시그마-알드리치)의 500 중 1의 희석 100㎕를 첨가하고 나서, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 플레이트를 세척 완충제로 3회 세척하고 나서, 100㎕의 시그마패스트(SigmaFast) OPD 기질(시그마-알드리치, 카탈로그 번호 P9187)을 첨가하고, 실온에서 암실에서 4분 동안 인큐베이션시켰다. 50㎕의 3M HCl을 첨가함으로써 반응을 중단시켰다. 다이넥스(Dynex) 플레이트 판독기를 사용하여 490㎚에서 플레이트를 판독하였다.
실시예 5
scFv 및 Fab 의 생성
실시예 3으로부터의 인간화된 OS2966 항-인간 인테그린 변이체를 scFv로 전환시키고 나서, pCANTAB5E 벡터 RPAS 발현 모듈(영국 리틀 찰폰트에 소재한 아머샴 파마시아 바이오테크(Amersham Pharmacia Biotech))을 사용하여 문헌[Benhar I. and Reiter Y., Current Protocols in Immunology, Unit 10.19B, Wiley Online Library, May 2002(URL: currentprotocols.com/protocol/im1019b에서 월드 와이드 웹 상에서 이용가능)]에 기재된 바와 같은 M13 파지 디스플레이 벡터 내로 클로닝하였다. 말단 SfiI 및 NotI 제한 부위, 삽입 Gly4Ser 링커 및 C 말단 his6 태그를 제공한 프라이머를 사용하여 인간화된 VH 및 VK 유전자를 증폭시켰다. scFv 작제물을 SfiI-NotI 단편으로서 pCANTAB5E 벡터 내로 삽입하고 나서, 이콜라이 HB2151로 형질전환시켜 scFv가 주변세포질에 그리고 부분적으로 성장 배지에 노출되게 하였다. HIS-셀렉트(HIS-Select) HF 카트리지(시그마-알드리치)를 사용하는 니켈-킬레이트 친화도 크로마토그래피에 의해 성장 배지로부터 scFv를 정제하였다. 실시예 4에 상세하게 설명된 바와 같은 경쟁 분석에서 정제된 scFv를 시험하였다. 증폭된 인간화된 VH 및 VK 유전자가 이시스트론성(dicistronic) Fab 유전자를 야기하는 상류의 VH-CH1과 하류의 VK-Cκ 사이에 22개의 아미노산 pelB 리더 서열을 지니는 이들 단편을 결합시키기 위해 프라이머를 이용하여 추가로 증폭될 수 있는 VH-CH1 및 VK-Cκ 단편을 형성하기 위해(Lei S.P., Lin H.C., Wang S.S., Callaway J., and Wilcox G., J Bacteriol. 169 (1987) p4379-4383) CH1 및 Cκ 불변 영역 유전자를 이용하여 추가로 증폭되는 것을 제외하고 scFv에 대해 사용한 방법을 사용하여 실시예 3으로부터의 인간화된 OS2966 변이체를 또한 Fab로 전환시켰다. 인간화된 항체 변이체로부터의 Fab를 생성하고 나서 scFv에 대해 상기와 같이 정제하고, 실시예 4에 상세히 설명한 바와 같은 인간 인테그린 β1 경쟁 분석에서 시험하였다.
실시예 6
CD4 + T 세포 반응의 분석
실시예 3 및 5로부터의 인간화된 항체의 면역원성 가능성을 인간화된 항-인간 인테그린 β1 K20과 비교하여 수행하였다(Poul et al., Molecular Immunology 32 (1995) p102-116). PBMC(말초혈액단핵세포(peripheral blood mononuclear cell))를 영국 국립 수혈 서비스(UK National Blood Transfusion Service)(영국 캠브릿지에 소재한 아덴브룩 호스피탈(Addenbrooke's Hospital))로부터 그리고 아덴브룩 호스피탈 국소 연구 윤리 위원회에 따라 얻은 건강한 공동체 연층으로부터 (24시간 내에 회수한 혈액으로부터) 단리시켰다. PBMC를 림포프렙(Lymphoprep)(영국 던디에 소재한 액시스-쉴드(Axis-shield)) 밀도 원심분리에 의해 연층으로부터 단리시키고 나서, CD8+ T 세포를 CD8+ 로제트셉(RosetteSep)(상표명)(영국 런던에 소재한 스템셀 테크놀로지 인코포레이티드(StemCell Technologies Inc))를 사용하여 고갈시켰다. HLA SSP-PCR 기반 조직-타이핑 키트(SSP-PCR based tissue-typing kit)(영국 솔리헐에 소재한 바이오테스트(Biotest))를 사용하여 HLA-DR 단상형을 동정함으로써 공여체를 특성규명하였다. 회상항원(recall antigen) 파상풍 독소를 포함하는 항원을 제어하기 위한 T 세포 반응을 또한 결정하였다(영국 크래믈링톤에 소재한 KLH 피어스(KLH Pierce), 인플루엔자 A 및 엡스타인 바르 바이러스로부터 유래된 펩타이드). 이어서, PBMC를 냉동시키고 나서, 필요할 때까지 액체 질소에 저장하였다.
단핵구 유래 수지상 세포(dendritic cell: DC)를 준비하기 위해, 50개의 상이한 공여체 PBMC를 선택하여 전세계 집단에서의 빈도와 유사한 HLA-DR 및 HLA-DQ 동종이인자형의 빈도를 지니는 분포를 제공하였다. PBMC는 AIM-V(등록상표) 배양 배지에서 되살아났고, 밀텐이(Miltenyi) CD14 마이크로비드 및 LS 칼럼(영국 옥스포드에 소재한 밀텐이 바이오텍(Miltenyi Biotech))을 사용하여 CD14+ 세포를 단리시켰다. 단핵구를 1000U/㎖ IL-4 및 1000U/㎖ GM-CSF ("DC 배양 배지")로 4 내지 6x106 PBMC/㎖까지 보충한 AIM-V(등록상표) 중에서 재현탁시키고 나서, 24웰 플레이트(2㎖ 최종 배양물 용적) 중에서 분포시켰다. 절반 용적의 DC 배양 배지 변화에 의해 제2일에 세포를 공급하였다. 제3일까지, 단핵구를, 40㎍/㎖의 시험 인간화된 항체 또는 키메라 항체 중 하나, 100㎍/㎖ KLH 또는 배지와 함께 사전인큐베이션시킨 절반-성숙 DC로 분화시켰다. 절반-성숙 DC를 24시간 동안 항원과 함께 인큐베이션시키고, 이후에 세포를 2회 세척함으로써 그리고 50ng/㎖ TNF-α(영국 런던에 소재한 페프로테크(Peprotech))로 보충한 DC 배양 배지 중에서 재현탁시킴으로써 과량의 항체를 제거하였다. DC를 제7일에 절반 용적의 DC 배양 배지(50ng/㎖ TNFα로 보충함) 변화에 의해 공급한 후에 제8일에 성숙 DC를 채취하였다. 채취한 성숙 DC를 계수화하고, 트리판 블루 염료 배제를 사용하여 생존력을 평가하였다. 이어서, DC에 γ-조사하고(4000 rads) AIM-V 배지 내에서 ㎖ 당 2x105개 세포에서 재현탁시킨 후에 ELISpot 및 증식 분석에서 사용하였다. 추가적으로, 제8일에, 새로운 CD4+ T 세포를 또한 준비하였다. CD4+ T 세포를 정제하기 위해, PBMC를 AIM-V(등록상표) 배양 배지에서 되살아나게 하였고, 밀텐이 CD4 마이크로비드 및 LS 칼럼(영국 옥스포드에 소재한 밀텐이 바이오테크)을 사용하여 CD4+ 세포를 단리시키고 나서, AIM-V(등록상표) 배지 중에서 2x106개 세포/㎖로 재현탁시켰다.
제8일에, T 세포 증식 분석을 확립함으로써 1x105개 자기유래 CD4+ T 세포를 96웰 U-형 바닥 플레이트 내 1x104개의 인간화된 항체 또는 키메라 항체 부하 DC(10:1의 비)에 첨가하였고, AIM-V(등록상표) 배지를 최대 용적 200㎕/웰에 첨가하였다. 제14일에, 분석 플레이트를 6시간 동안 25ul AIMV 중에서 웰 당 1uCi [3H](영국 비콘스필드에 소재한 퍼킨 엘머(Perkin Elmer))로 펄싱한 후에 톰테크 마하 III(TomTec Mach III)(미국 코네티컷주 햄든에 소재) 세포 회수기를 사용하여 필터 매트(퍼킨 엘머) 상에 채취하였다. 모든 항체 제제를 6개 배양물 중에서 시험하였다. 각각의 웰에 대한 분 당 계수(Counts per minute: cpm)를 파라룩스(paralux), 저백그라운드 계수장치 내 1450 마이크로베타 왈락 트라이룩스 액체 신틸레이션 계수기(Microbeta Wallac Trilux Liquid Scintillation Counter)(퍼킨 엘머)에 의해 결정하였다. 각각의 항체 샘플에 대한 분 당 계수를 배지만의 대조군에 대해 정규화시켰다.
엘리스팟(ELISpot) 분석을 위해, 엘리스팟 플레이트(영국 왓포드에 소재한 밀리포어(Millipore))를 PBS 중의 100㎕/웰 IL-2 포획 항체(영국 애빙던에 소재한 R&D 시스템즈(R&D Systems))로 코팅하였다. 이어서, 플레이트를 PBS 중에서 2회 세척하고 나서, 차단 완충제(PBS 중의 1% BSA(시그마)) 중에서 밤새 인큐베이션시키고, AIM V(등록상표) 배지 중에서 세척하였다. 제8일에, 1x105개 자가유래 CD4+ T 세포를 96웰 엘리스팟 플레이트 내에서 1x104개 항원 부하 DC(10:1의 비)에 첨가하였다. 모든 항체 제제를 6개 배양물 중에서 시험하였다. 각각의 공여체 PBMC에 대해, 음성 대조군(AIM V(등록상표) 배지 단독), 세포가 없는 대조군 및 PHA(10㎍/㎖) 양성 대조군을 또한 포함하였다.
추가 7일 인큐베이션 기간 후에, 엘리스팟 플레이트를 dH2O 및 PBS 중에서 3회 연속 세척에 의해 진행한 후에 PBS/1% BSA 중에서 100㎕ 여과 바이오티닐화된 검출 항체(영국 애빙던에 소재한 R&D 시스템즈)를 첨가하였다. 37℃에서 1.5시간 동안 인큐베이션시킨 후에, 플레이트를 PBS 중에서 추가 3회 세척하고, PBS/1% BSA 중의 100㎕ 여과 스트렙타비딘-AP(R&D Systems)를 1시간 동안(실온에서 인큐베이션) 첨가하였다. 스트렙타비딘-AP를 버리고 나서, 플레이트를 PBS 중에서 4회 세척하였다. BCIP/NBT(R&D 시스템즈)를 각각의 웰이 첨가하고 나서, 실온에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 웰을 세척함으로써 스팟 진행을 중단하고, 웰의 뒷면을 dH2O로 3회 세척하였다. 건조시킨 플레이트를 이뮤노스캔(Immunoscan)(상표명) 분석기 상에서 스캔하고 나서, 웰 당 스팟(spots per well: spw)을 이뮤노스캔(상표명) 버전 4 소프트웨어를 사용하여 결정하였다.
증식과 IL-2 엘리스팟 분석 둘 다에 대해, 결과를, 양성 T 세포 반응에 대해 2 이상(SI≥2.0)의 SI 역치를 사용하여 배지만의 대조군에 대한 시험 항체에 대해 cpm(증식 분석) 또는 스팟(엘리스팟 분석)의 비로서 정의한 자극 지수(Stimulation Index: SI)로서 표현하였다.
실시예 7
종양 동물 모델
종양 성장을 저해함에 있어 인간화된 항-인테그린 β1 항체의 생체내 분석에 대해 종양 동물 모델을 사용할 수 있다. 예를 들어, MDA-MB-231 세포를 사용하는 정위 유방암 모델을 인간 인테그린 β1 녹인 마우스 또는 면역 결핍 마우스(예를 들어, nu/nu, 중증의 복합형 면역 부전증[SCID])에서 1차 종양 성장 및 자발적 전이 모델로서 사용할 수 있다.
인테그린 β1 녹인 마우스(7 내지 10주령, 그룹에 걸쳐 동일하게 분포된 수컷 및 암컷)를 0.1㎖ 용적 중의 MDA-MB-231 세포를 지니는 유방 지방 패트 내로 피하로 주사할 수 있다. 본 발명의 항-인테그린 β1 항체인 OS2966 또는 아이소타입 매칭 대조군 항체를 종양 세포 투여 다음 날(제2일)부터 또는 종양이 만져지고 평균 종양 용적이 대략 100㎣일 때 시작해서 매주 1㎎/㎏ 내지 20㎎/㎏, 예컨대 5㎎/㎏ 또는 10㎎/㎏ 용량(용량 용적 10㎖/㎏)로 주사할 수 있다. 캘리퍼 측정에 의해 실험 과정 동안 2주마다 종양 측정을 할 수 있다. 동물을 결과를 결정하는 것에 따르게 할 수 있다.
실시예 8
서열 분석
인간화된 서열에 바람직하게 포함된 OS2966 서열로부터의 CDR 외부의 중요한 VH 및 VL 아미노산 잔기를 결정하기 위해 실시예에서 생성한 중쇄 및 경쇄에 대한 서열 분석을 수행하였다. 이러한 잔기는 CDR의 잔기에 추가로 OS2966의 잔기와 동일하다. 이러한 잔기를 도 15 및 16에서 "c" 잔기로서 동정한다. 나타낸 바와 같이, VH 쇄에 대해 잔기 48, 67, 69, 73, 76, 80, 89, 91 및 93은 바람직하게는 OS2966(서열번호 2)의 대응하는 잔기와 동일하다. 또한 VL 쇄에 대해, 잔기 36 및 71은 바람직하게는 OS2966의 대응하는 잔기와 동일하다(서열번호 4).
VH 및 VL 서열에 대응하는 코돈사용빈도를 도 17에 제공하는 한편, 도 18은 VH 및 VL 쇄의 아미노산 서열의 요약을 제공한다.
실시예 9
인테그린 β1의 저해에 의해 방사선 감도를 증가시키는 방법
본 발명의 인간화된 항체를 미국 특허 출원 공개 제20070237711호, 문헌[Park et al., Cancer Res 2008; 68:(11)4398, 및 Yao et al., Cancer Res 2007; 67:(2)659](모두 본 명세서에 전문이 참고로 포함됨)에 개시되어 있는 바와 같은 인테그린 β1의 저해에 의해 방사선 감도를 증가시키기 위해 이용할 수 있다. 본 발명의 항체를, 종양 세포 중에서 증가된 세포자멸사를 야기하는 전리방사선과 조합하여, 특히 유방암 종양 세포에서 항체 또는 본 명세서에 기재된 조성물을 함유하는 항체의 공동투여 방법에서 이용할 수 있다.
실시예 10
복합 인간 항체 변이체의 확인 및 분석
복합 인간화된 항체를 실시예 3에 논의한 바와 같이 생성하였다. 표 2는 VH 및 Vk 서열을 이용하였음을 나타내는 생성된 다양한 항체의 목록을 제공한다.
V 영역 ID 에 따른 변이체 지정
인간화된 변이체 기준 번호 V 영역 ID 대응하는 VH 및 VK 서열번호
H1 VH5VK3 14, 20
H2 VH3VK1 10, 16
H3 VH4VK4 12, 22
H4 VH5VK4 14, 22
H5 VH5VK2 14, 18
H6 VH5VK1 14, 16
H7 VH4VK3 12, 20
H8 VH4VK2 12, 18
H9 VH4VK1 12, 16
H10 VH3VK4 10, 22
H11 VH3VK3 10, 20
H12 VH3VK2 10, 18
H13 VH2VK4 8, 22
H14 VH2VK3 8, 20
H15 VH2VK2 8, 18
H16 VH2VK1 8, 16
H17 VH1VK3 6, 20
H18 VH1VK2 6, 18
H19 VH1VK1 6, 16
복합 인간 항체 변이체(표 2로부터)의 결합을 OS2966 뮤린 키메라 항체(인간 Fc에 대해 슬라이싱된 뮤린 OS2966 Fab)를 이용하는 경쟁 FACS 분석에서 평가하였다. 간단히 말해서, 25.0㎍/㎖로부터 시작하여 키메라 또는 인간화된 항체의 단계희석(3배)을 FACS 완충제(1x PBS 중의 1% BSA, pH 7.4) 중에서 일정한 농도의 뮤린 OS2966(0.1875㎍/㎖)과 사전혼합한 후에, 3x105개 주르카트(Jurkat) 세포와 혼합하였다. 1시간 동안 얼음 상에서 인큐베이션한 후에, 세포를 세척하고 나서, PE 표지 염소 항-뮤린 Fc(잭슨 이뮤노리서치(Jackson ImmunoResearch), 카탈로그 번호 115-116-071)를 이용하여 뮤린 OS2966의 결합을 검출하였다. 45분 동안 얼음 상에서 인큐베이션한 후에, 세포를 세척하고 나서, 300㎕ FACS 완충제 중에서 재현탁시키고, 벡톤 딕킨슨 유세포분석기(Beckton Dickinson FACScalibur)(상표명) 상에서 분석하였다. 형광 강도의 기하 평균을 항체 농도에 대해 플롯팅하였다(도 20 내지 24). 이들 데이터를 사용하여 각각의 항체에 대한 IC50 값을 계산하고 나서, 이들 값을 각각의 FACS 분석에 포함된 키메라 항체의 IC50에 대해 정규화하였다(표 3).
표 3. 인간 변이체 상대적 친화도. 시험 항체의 IC50을 동일 분석에서 분석한 키메라 항체의 IC50으로 나눔으로써 상대적 IC50을 계산하였다.
변이체 상대적 친화도( IC50 )
H1 0.88
H2 0.97
H3 2.70
H4 3.26
H5 0.85
H6 1.24
H7 1.76
H8 1.18
H9 1.34
H10 2.76
H11 1.58
H12 1.15
H13 2.00
H14 1.17
H15 1.32
H16 1.08
H17 1.35
H18 1.20
H19 1.13
3종의 변이체(H1, H2, H5)는 약간 더 큰 상대적 친화도를 입증하였고, 4종의 변이체(H3, H4, H10, H13)는 뮤린 OS2966 항체보다 약간 더 낮은 상대적 친화도를 가졌다.
인간 변이체 항체에 의한 인테그린 β1 서브유닛의 기능성 저해를 다중 ECM 상의 부착 마이크로플레이트 분석에서 그리고 다중암 세포주 PANC-1 인간 췌장암(도 25a 및 도 25b), MDA-MB-231 인간 삼중 음성 유방암(도 25c), 및 AsPC-1 인간 췌장암(도 25d)에서 평가하였다. 간단히 말해서, 10㎍/㎖ ECM 구성성분 또는 BSA(대조군)를 이용하여 ECM 부착 분석을 수행하였다. 세포를 30분 동안 무혈청 DMEM/F12 배지에서 10㎍/㎖ 항체와 함께 사전 인큐베이션시켰다. 30분 내지 1시간 동안 부착을 시험하였다. 접시로부터 미부착 세포를 제거하고 나서, 세포를 1% 파라폼알데하이드를 이용하여 고정시키고, 플레이트를 30분 동안 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 광범위 린스 후에, 크리스탈 바이올렛을 1시간 동안 트리톤(Triton) X-100 중에 용해시키고, 플레이트를 A590에서의 흡광도에서 판독하였다.
모든 19개의 인간 변이체는 ECM 단백질 및 세포주에 따라서 일부 상당한 변이와 함께 모든 ECM에 대한 세포 부착을 약화시키는데 기능적으로 활성이었다. 상대 친화도(표 3)는 ECM 유형 또는 세포주와 상관없이 이 분석에서 작용에 대해 분명한 상관관계를 입증하지 못한다. 이들 데이터를 IgG 음성 대조군에 대해 정규화시켰다(BSA, 음성 대조군으로서 소 혈청 알부민; IgG, 아이소타입 대조군; OS2966, 뮤린 OS2966; TS2/16, 양성 대조군 인테그린 β1 활성화 항체; FN, 피브로넥틴; LN, 라미닌; C1, 콜라겐 I형; C4, 콜라겐 IV형).
인간 변이체 항체를 지니는 인테그린 β1 서브유닛의 기능적 저해를 인간 삼중 음성 유방암 세포(MDA-MB-231)를 지니는 ECM 피브로넥틴 상에서 마이크로플레이트 "긁힘 손상" 이동 분석으로 평가하였다. 간단히 말해서, 플레이트를 10㎍/㎖ 피브로넥틴으로 코팅하고 나서, 종양 세포로 파종하였다. 황색 피펫 팁을 사용하여 합류 세포의 단일층을 긁고, 언급한 항체 10㎍/㎖를 포함하는 배지를 대체하였다. 37℃에서 8시간 인큐베이션 후에 플레이트를 고정시키고, 영상화하였다. 플레이트의 10x 배율 영상은 OS2966 및 복합 인간 변이체(H1, H2, H3) 처리 웰 내의 손상에 대한 이동의 약화를 입증한다(도 26A). 각각의 조건에 대한 무세포 영역의 정량화(3회 수행하고 반복함)를 도 26B에 나타낸다.
삼중 음성 유방암 세포의 이동은 OS2966 복합 인간 변이체를 이용한 처리에 의해 상당히 약화되었다.
인간 변이체 항체를 이용하는 인테그린 β1 서브유닛의 기능적 저해를 혈관신행의 시험관내 모델; 인간 제대정맥 내피 세포(HUVEC)를 이용하는 관 형성 분석에서 평가하였다. 간단히 말해서, 플레이트를 매트리겔(Matrigel) ECM으로 코팅하였고, HUVEC 세포로 파종하였다. 37℃에서 8시간 후에 플레이트를 영상화하고 나서 혈관 형성을 정량화하였다(폐쇄 단위 형성). 플레이트의 10x 배율 영상화는 OS2966 및 복합 인간 변이체(H1, H2, H3) 처리 웰에서 혈관 형성의 약화를 입증한다(도 27A). 각각의 조건에 대한 폐쇄 단위 형성의 정량화(적어도 3회 중복으로 수행하고 혈관내피 전구세포를 이용하여 반복함)를 도 27B에 나타낸다.
복합 인간 변이체는 시험관내 관 형성 분석에서 혈관신생을 완전히 차단하였다.
인간 변이체 항체를 이용하는 인테그린 β1 서브유닛의 기능성 저해를 MDA-MB-231 세포주를 지니는 인간 삼중 음성 유방암의 생체내 모델에서 평가하였다. 간단히 말해서, 106개 세포를 5- 내지 6-주령 암컷 누드 무흉선 nu/nu 마우스에서 4번째 유방 지방 패드에 주사하였다. 종양을 확립한 후에(평균 피하 용적 = 80 내지 100㎣) 마우스를 처리군으로 무작위화하였다. 대조군 및 실험군 항체를 1주 2회 5㎎/㎏에서 복강내로(IP) 투여하였다. 동일 용량에서 인간 IgG는 대조군(시그마)으로서 작용한다. 1주 2회 캘리퍼스를 이용하여 정위 종양을 측정하였다. 도 28A에 나타내는 바와 같이, 인간 변이체 H1 내지 H3은 IgG 대조군에 비해 생체내 MDA-MB-231 종양의 성장을 상당히 약화시켰다. 복합 인간 변이체에 대해 우수한 효능에 대한 경향은 뮤린 OS2966에 비해, 특히 H3에 대해 명확하였다. 웨스턴 블롯 분석은 대조군에 비해 처리된 종양에서의 중요한 성장전 신호처리경로(인산화된 세포밖-관련 키나제, ERK 및 인산화된 중심 부착 키나제, FAK)에서 활성의 감소를 입증하였는데, 이는 감소된 증식 및 세포자멸사의 상승에 기여할 수 있다(도 28B).
인간 변이체 항체를 이용하는 인테그린 β1 서브유닛의 기능성 저해를 MDA-MB-231 세포주를 지니는 인간 삼중 음성 유방암을 이용하는 자발적 폐 전이의 생체내 모델에서 평가하였다. 간단히 말해서, 106개 세포를 5- 내지 6-주령 암컷 누드 무흉선 nu/nu 마우스에서 4번째 유방 지방 패드에 주사하였다. 종양을 확립한 후에(평균 피하 용적 = 80 내지 100㎣) 마우스를 처리군으로 무작위화하였다. 대조군 및 실험군 항체를 1주 2회 5㎎/㎏에서 복강내로(IP) 투여하였다. 동일 용량에서 인간 IgG는 대조군(시그마)으로서 작용한다. 7주 후에, 마우스를 관류시키고 나서, 폐를 수집하고, H&E 분석을 위해 두정으로 절개하였다. IgG 대조군 항체를 제공한 마우스의 50%(6마리 중 3마리)에서 자발적 폐 전이를 관찰하였다. OS2966 또는 복합 인간 변이체 H1 내지 H3(0%, 0/28 마우스)을 제공한 임의의 마우스에서 자발적 폐전이는 관찰되지 않았다. 결과를 도 29에 나타낸다.
복합 인간 변이체는 삼중 음성 유방암의 정위 모델에서 자발적 폐 전이를 완전히 예방하였다.
인간 변이체 항체를 이용하는 인테그린 β1 서브유닛의 기능성 저해를 PANC1-GEMR 세포주를 이용하는 인간 겜시타빈 내성 췌장암의 생체내 모델에서 평가하였다. 간단히 말해서, 106개 세포를 5- 내지 6-주령 수컷 누드 무흉선 nu/nu 마우스에서 피하로 주사하였다. 종양을 확립한 후에(평균 피하 용적 = 80 내지 100㎣) 마우스를 처리군으로 무작위화하였다. 대조군 및 실험군 항체를 1주 2회 5㎎/㎏에서 또는 겜시타빈을 50㎎/㎏에서 복강내로(IP) 투여하였다. 동일 용량에서 인간 IgG는 대조군(시그마)으로서 작용한다. 1주 2회 캘리퍼스를 이용하여 피하 종양을 측정하였다. 도 30a는 PANC1-GEMR 계통에서 겜시타빈 내성의 생체내 확인을 나타낸다. 도 30b는 복합 인간 변이체 H3이 IgG 대조군에 비해 생체내 PANC1-GEMR 종양의 성장을 상당히 약화시켰다는 것을 나타낸다. 도 30c는 대조군에 비해 처리된 종양에서의 중요한 성장 전 신호처리경로(인산화된 세포밖-관련 키나제, ERK 및 인산화된 중심 부착 키나제, FAK)의 약역학적 웨스턴 블롯 분석을 나타내는데, 이는 감소된 증식 및 세포자멸사의 상승에 기여할 수 있다.
인간 변이체 항체를 이용하는 인테그린 β1 서브유닛의 기능성 저해를 U87MG 세포주를 지니는 확립된 인간 교모세포종의 생체내 모델에서 평가하였다. 간단히 말해서, 107개 세포를 5- 내지 6-주령 수컷 누드 무흉선 nu/nu 마우스에서 피하로 주사하였다. 종양을 잘 확립한 후에(평균 피하 용적 = ~200 내지 250㎣) 마우스를 처리군으로 무작위화하였다. 대조군 및 실험군 항체를 1주 2회 5㎎/㎏에서 복강내로(IP) 투여하였다. 동일 용량에서 인간 IgG는 대조군(시그마)으로서 작용한다. 1주 2회 캘리퍼스를 이용하여 피하 종양을 측정하였다. 도 31A은 복합 인간 변이체 H3이 IgG 대조군에 비해 생체내에서 확립된 교모세포종의 성장을 약화시켰다는 것을 입증한다. H3의 효능은 뮤린 OS2966과 동일하였다. 약역학적 웨스턴 블롯 분석은 대조군에 비해 H3 처리 종양에서 중요한 성장전 신호처리 경로(인산화된 세포밖-관련 키나제, ERK 및 인산화된 중심 부착 키나제, AkT)에서의 활성의 감소를 입증하였는데, 이는 도 31B에 나타낸 바와 같이 감소된 증식 및 세포자멸사의 상승에 기여할 수 있다.
에피스크린(EpiScreen)(상표명) 시간 과정 T 세포 증식 분석을 사용하여 항체 변이체 H3의 임상적 면역원성에 대한 가능성을 결정하였다. 완전히 인간화된 항체 및 키메라 항체를 12 HLA-유형 공여체의 패널에 대한 증식에 의해 측정하는 바와 같이 CD4+ T 세포 반응을 유도하는 그들의 능력에 대해 시험하였다. 키메라(뮤린/인간) OS2966 항체, 인간화된 H3 항체 및 양성 대조군 인간화된 항체에 대한 건강한 공여체 T 세포 증식 반응을 도 32A에 나타낸다. CD4+ T 세포를 샘플과 함께 부하한 자기 유래 성숙 DC와 함께 인큐베이션시키고 나서, 7일 인큐베이션 후에 증식에 대해 평가하였다. 짝지어 지지 않은 두 샘플의 스튜던트 t 검정을 사용하여 유의한(p<0.05) 2.00 이상의 SI(빨간 점선으로 표시)를 지니는 증식 반응을 양성으로 고려하였다. 도 32B는 공여체 코호트에 대한 건강한 공여체 T 세포 증식 반응의 요약을 제공한다. 증식("P")에 대한 양성(SI≥2.00, 유의수준 p<0.05) T 세포 반응을 나타낸다. 경계선상의 반응(유의수준 p<0.05, SI≥1.90)을 나타낸다(*). 증식 분석에 대한 양성 반응의 빈도를 칼럼 하부에서 백분율로서 나타낸다. A33(인간화된 A33)은 임상에서 고수준의 면역원성을 나타내고 에피스크린 분석에서 20 내지 30% T 세포 반응을 일상적으로 유발하는 임상 벤치마크 대조군 mAb이다. 각각의 공여체에 대해, 면역원성 재현성 대조군(100㎍/㎖ KLH와 함께 인큐베이션시킨 세포)을 또한 포함하였다.
복합 인간 변이체 H3은 OS2966 뮤린/인간 키메라(25% 반응)에 비해 상당히 감소된 면역원성(0% 반응)을 입증하였다. 인간 항체 H3은, 안티토프 복합 인간 항체 기법(Antitope Composite Human Antibody technology)의 결과로서 감소된 면역원성의 확인을 제공하는 에피스크린(EpiScreen)(상표명)으로부터 임상적으로 허용가능한 면역원성 프로파일을 나타낸다는 결론을 내린다.
본 발명은 상기 실시예를 참고로 하여 기재되었지만, 변형 및 변화가 본 발명의 정신과 범주 내에 포함된다는 것이 이해될 것이다. 따라서, 본 발명은 다음의 특허청구범위에 의해서만 제한된다.
<110> ONCOSYNERGY, INC. <120> ANTI-INTEGRIN β1 ANTIBODY COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF <130> IPA150721-US <150> US 61/746,023 <151> 2012-12-26 <160> 125 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 1 gaagtccagc tgcagcagtc tgggcctgag gttgggaggc ctgggtcctc agtcaagatt 60 tcttgcaagg cttctggcta cacctttacc gggtacattt tgagctgggt gaagcagagt 120 cctggacagg ggctggaatg gataggatgg gttgatcctg aatatggtag tactgattct 180 gctgagaagt tcaaaaagag ggccacactg actgcagata tatcctccaa cacagcctac 240 atccagctta gcagcctgac atctgaggac acagccacct atttttgtac tagatattat 300 gatggttatt atcgccggtg gtttgcttac tggggccaag gcactctggt cactgtctct 360 tca 363 <210> 2 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 2 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Val Gly Arg Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Ile Leu Ser Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Gln Gly Leu Glu 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Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Gly Arg Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Ile Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Val Asp Pro Glu Tyr Gly Ser Thr Asp Ser Ala Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Lys Arg Ala Thr Leu Ser Ala Asp Ile Ser Val Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Cys Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Tyr Tyr Asp Gly Tyr Tyr Arg Arg Trp Phe Ala Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 101 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 101 Ala Glu Tyr Phe Gln His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 1 5 10 15 Ser <210> 102 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 102 Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 1 5 10 15 Ser <210> 103 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 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Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Cys Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Phe Pro Ile 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 108 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 108 Val Ile Trp Met Thr Gln Ser Pro Ser Leu Leu Ser Ala Ser Thr Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Leu Ala Ser Glu Gly Ile Ser Asn Asn 20 25 30 Leu Ala Trp His Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Glu Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala His Ser Leu His Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Cys Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Lys Tyr Pro Ile 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 109 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 109 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asp Gly Asn Thr Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Arg Arg Leu Ile 35 40 45 Tyr Lys Val Ser Asn Trp Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala 65 70 75 80 Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly Thr His Trp Pro Ile 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 110 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 110 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Pro Gln Val Ser Ile Ser Cys Leu Ala Ser Glu Gly Ile Ser Asn Asn 20 25 30 Leu Ala Trp His Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Gln Arg Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala His Ser Leu His Asp Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala 65 70 75 80 Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Lys Tyr Pro Ile 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 111 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 111 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Val Ser Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Ile 85 90 95 Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 100 105 <210> 112 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 112 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Leu Ala Ser Glu Gly Ile Ser Asn Asn 20 25 30 Leu Ala Trp His Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Gln Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala His Ser Leu His Asp Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Lys Tyr Pro Ile 85 90 95 Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 100 105 <210> 113 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 113 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Asn Asn Lys Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Ile 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 114 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 114 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Lys Ala Thr Ile Asn Cys Leu Ala Ser Glu Gly Ile Ser Asn Asn 20 25 30 Leu Ala Trp His Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Gln Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala His Ser Leu His Asp Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Lys Tyr Pro Ile 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 115 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 115 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Gly Ile Gly Asn Tyr 20 25 30 Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Lys His Pro Ile 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 116 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 116 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Glu Gly Ile Ser Asn Asn 20 25 30 Leu Ala Trp His Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala Pro Gln Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala His Ser Leu His Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Lys Tyr Pro Ile 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 117 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 117 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 118 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 118 Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 119 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 119 Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 1 5 10 <210> 120 <211> 12 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Claims (55)

  1. 중쇄 가변(VH) 영역 및 경쇄 가변(VL) 영역을 포함하는 인테그린 β1에 특이적으로 결합하는 인간화된 항체로서, 상기 VH 영역은 서열번호 2에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 VH 영역에 대해 약 97%, 96% 또는 95% 미만의 동일성을 가지고, 상기 VL 영역은 서열번호 4에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 VL 영역에 대해 약 97%, 96% 또는 95% 미만의 동일성을 갖는, 항체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 VH 영역은 서열번호 2에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 VH 영역에 대해 90%, 85%, 80% 또는 75% 미만의 동일성을 갖는, 항체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 VL 영역은 서열번호 4에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 VL 영역에 대해 90%, 85%, 80% 또는 75% 미만의 동일성을 갖는, 항체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 VH 영역은 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 29 내지 43, 서열번호 91 내지 99 및 서열번호 100으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VH 영역에 대해 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 초과의 동일성을 갖는, 항체.
  5. 제1항에 있어서, 상기 VL 영역은 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 44 내지 57, 서열번호 107 내지 115 및 서열번호 116으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VL 영역에 대해 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 초과의 동일성을 갖는, 항체.
  6. 제1항에 있어서, 상기 VH 영역 프레임워크는 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 29 내지 43, 서열번호 91 내지 99 및 서열번호 100으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VH 영역 프레임워크에 대해 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 초과의 동일성을 갖되, 상기 VH 영역의 상보성 결정 영역(complementarity determining region: CDR)은 서열번호 23, 서열번호 24 및 서열번호 25에서 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는, 항체.
  7. 제1항에 있어서, 상기 VL 영역 프레임워크는 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 44 내지 57, 서열번호 107 내지 115 및 서열번호 116으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 VL 영역 프레임워크에 대해 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 초과의 동일성을 가지되, 상기 VL 영역의 CDR은 서열번호 26, 서열번호 27 및 서열번호 28에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는, 항체.
  8. 제1항에 있어서, 상기 VH 영역은 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 29 내지 43, 서열번호 91 내지 99 및 서열번호 100으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지고, 상기 VL 영역은 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 44 내지 57 및 서열번호 107 내지 116으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는, 항체.
  9. 제1항에 있어서, 상기 VH 및 VL 영역의 CDR은 공여체 항체로부터 유래된, 항체.
  10. 제9항에 있어서, 상기 VH 영역의 상기 CDR은 서열번호 23, 서열번호 24 및 서열번호 25에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는, 항체.
  11. 제9항에 있어서, 상기 VL 영역의 상기 CDR은 서열번호 26, 서열번호 27 및 서열번호 28에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는, 항체.
  12. 제9항에 있어서, 상기 공여체는 OS2966인, 항체.
  13. 제1항에 있어서, 상기 항체는 Fc 영역을 포함하는, 항체.
  14. 제13항에 있어서, 상기 Fc 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 또는 이들의 변이체를 갖는, 항체.
  15. 제14항에 있어서, 상기 Fc 영역은 인간 IgG1 또는 IgG4인, 항체.
  16. 제1항에 있어서, 상기 항체는 경쇄 불변 영역을 포함하는, 항체.
  17. 제16항에 있어서, 상기 경쇄 불변 영역은 아이소타입 카파(isotype kappe)를 갖는, 항체.
  18. 제1항에 있어서, 상기 항체는 scFv 또는 Fab인, 항체.
  19. 제1항에 있어서, 상기 항체는 인간화된 항체인, 항체.
  20. 제1항에 있어서, 상기 항체는 키메라 항체인, 항체.
  21. 제1항에 있어서, 상기 항체는 단클론성 항체인, 항체.
  22. 제1항에 있어서, 상기 항체는 인테그린 β1에 특이적 결합을 위해 OS2966과 경쟁하는, 항체.
  23. 제1항에 있어서, 상기 항체는 적어도 10-2M, 10-3M, 10-4M, 10-5M, 10-6M, 10-7M, 10-8M, 10-9M 또는 10-10M의 평형해리상수(Kd)로 인테그린 β1에 결합하는, 항체.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 집단으로부터의 HLA-DR 동종이인자형(allotype)의 분포를 지니는 혈액 샘플 중의 CD4+ 헬퍼 T 세포 반응의 유도를 위해 시험관내에서 시험하였을 때, 10% 미만의 T 세포 반응이 생기는, 항체.
  25. 제24항에 있어서, 시험하였을 때, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5% 또는 0.1% 미만의 T 세포 반응이 일어나는, 항체.
  26. 제1항 내지 제24항 중 하나 이상의 항체를 포함하는 다중-특이성 항체.
  27. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 항체를 암호화하는 핵산 분자.
  28. 제27항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  29. 제28항에 있어서, 상기 벡터는 발현 벡터인, 벡터.
  30. 제28항 또는 제29항의 벡터를 포함하는 단리된 숙주 세포.
  31. 제30항에 있어서, 상기 숙주는 원핵생물 또는 진핵생물인, 숙주 세포.
  32. 제30항에 있어서, 상기 세포는 포유류인, 숙주 세포.
  33. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 항체 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  34. 제27항의 핵산 분자 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  35. 검출가능한 또는 치료적 모이어티에 연결되는 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는 면역컨쥬게이트.
  36. 제35항에 있어서, 상기 치료적 모이어티는 세포독성 모이어티인, 면역컨쥬게이트.
  37. 제35항에 있어서, 상기 치료적 모이어티는 화학치료제인, 면역컨쥬게이트.
  38. 제35항에 있어서, 상기 검출가능한 모이어티는 형광 모이어티인, 면역컨쥬게이트.
  39. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 항체, 제27항의 핵산, 제33항 내지 제34항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물 또는 제35항 내지 제38항 중 어느 한 항의 면역컨쥬게이트를 대상체에 투여함으로써 질환을 치료하는 단계를 포함하는, 대상체에서 질환을 치료하는 방법.
  40. 제39항에 있어서, 상기 질환은 세포 증식성 장애인, 방법.
  41. 제40항에 있어서, 상기 세포 증식성 장애는 암인, 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 암은 요법 내성, 난치성 또는 전이성인, 방법.
  43. 제40항에 있어서, 상기 세포 증식성 장애는 양성 또는 악성 종양인, 방법.
  44. 제43항에 있어서, 상기 세포 증식성 장애는 신경섬유종증 I형 또는 II형인, 방법.
  45. 제39항에 있어서, 상기 질환은 염증성 질환인, 방법.
  46. 제41항에 있어서, 화학치료제를 공동투여하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  47. 대상체에서 질환을 검출하는 방법으로서,
    a) 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 항체를 상기 대상체로부터의 샘플과 접촉시키는 단계;
    b) 인테그린 β1과 상기 항체의 특이적 결합을 통해 인테그린 β1의 수준을 검출하는 단계; 및
    c) 인테그린 β1의 상기 검출 수준을 정상 샘플 내 인테그린 β1의 검출 수준과 비교하는 단계를 포함하되, 상기 정상 샘플에 비해 상기 대상체로부터의 상기 샘플 내 인테그린 β1의 증가된 수준은 질환을 나타내는, 방법.
  48. 제47항에 있어서, 상기 질환은 세포 증식성 장애인, 방법.
  49. 제48항에 있어서, 상기 세포 증식성 장애는 암인, 방법.
  50. 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 29 내지 43, 서열번호 91 내지 99 및 서열번호 100으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VH 영역에 대해 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 초과의 동일성을 갖는 VH 영역.
  51. 제50항에 있어서, 상기 VH 영역은 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 29 내지 43, 서열번호 91 내지 99 및 서열번호 100으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VH 영역.
  52. 제50항 및 제51항 중 어느 한 항의 상기 VH 영역을 암호화하는 핵산 분자.
  53. 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 44 내지 57, 서열번호 107 내지 115 및 서열번호 116으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VL 영역에 대해 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 초과의 동일성을 갖는, VL 영역.
  54. 제49항에 있어서, 상기 VL 영역은 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 44 내지 57, 서열번호 107 내지 115 및 서열번호 116으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는, VL 영역.
  55. 제53항 및 제54항 중 어느 한 항의 VL 영역을 암호화하는 핵산 분자.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2020145669A1 (ko) * 2019-01-10 2020-07-16 에스지메디칼 주식회사 항 베타 1 인테그린 인간화 항체 및 이를 포함하는 암치료용 약학 조성물
CN113330035A (zh) * 2019-01-10 2021-08-31 Sg医疗株式会社 抗β1整合素人源化抗体以及包含其的用于治疗癌症的药学组合物

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6502856B2 (ja) * 2012-12-26 2019-04-17 オンコシナジー インコーポレイテッド 抗インテグリンβ１抗体組成物及びその使用方法
KR101671069B1 (ko) 2014-10-24 2016-10-31 충북대학교 산학협력단 베타1 인테그린을 특이적으로 인지하는 항체 및 이의 용도
AU2018277083A1 (en) * 2017-05-30 2019-12-05 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Treatment of neuroinflammatory disease
MX2021005761A (es) 2018-11-15 2021-08-11 Byondis Bv Anticuerpos anti-proteína alfa reguladora de señal (anti-sirpalfa) humanizados.
JP7310764B2 (ja) 2020-09-11 2023-07-19 トヨタ自動車株式会社 配車システム、配車サーバ、及び配車方法
JP7251535B2 (ja) 2020-09-11 2023-04-04 トヨタ自動車株式会社 配車システム、配車サーバ、及び配車方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009009114A2 (en) * 2007-07-12 2009-01-15 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating and diagnosing cancer
KR20090027218A (ko) * 2006-05-24 2009-03-16 바이엘 쉐링 파마 악티엔게젤샤프트 면역원성이 감소된, 고친화도 인간 및 인간화된 항-α5β1 인테그린 작용 블로킹 항체

Family Cites Families (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4235871A (en) 1978-02-24 1980-11-25 Papahadjopoulos Demetrios P Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles
US4458066A (en) 1980-02-29 1984-07-03 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
US4501728A (en) 1983-01-06 1985-02-26 Technology Unlimited, Inc. Masking of liposomes from RES recognition
US4545985A (en) 1984-01-26 1985-10-08 The United States Of America As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services Pseudomonas exotoxin conjugate immunotoxins
US4957735A (en) 1984-06-12 1990-09-18 The University Of Tennessee Research Corporation Target-sensitive immunoliposomes- preparation and characterization
US5019369A (en) 1984-10-22 1991-05-28 Vestar, Inc. Method of targeting tumors in humans
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
US6548640B1 (en) * 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
US4902505A (en) 1986-07-30 1990-02-20 Alkermes Chimeric peptides for neuropeptide delivery through the blood-brain barrier
US4837028A (en) 1986-12-24 1989-06-06 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5004697A (en) 1987-08-17 1991-04-02 Univ. Of Ca Cationized antibodies for delivery through the blood-brain barrier
US4981785A (en) 1988-06-06 1991-01-01 Ventrex Laboratories, Inc. Apparatus and method for performing immunoassays
US5530101A (en) * 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5055303A (en) 1989-01-31 1991-10-08 Kv Pharmaceutical Company Solid controlled release bioadherent emulsions
US5271961A (en) 1989-11-06 1993-12-21 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Method for producing protein microspheres
US5188837A (en) 1989-11-13 1993-02-23 Nova Pharmaceutical Corporation Lipsopheres for controlled delivery of substances
US5859205A (en) * 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
US5268164A (en) 1990-04-23 1993-12-07 Alkermes, Inc. Increasing blood-brain barrier permeability with permeabilizer peptides
US5254342A (en) 1991-09-30 1993-10-19 University Of Southern California Compositions and methods for enhanced transepithelial and transendothelial transport or active agents
GB9203459D0 (en) * 1992-02-19 1992-04-08 Scotgen Ltd Antibodies with germ-line variable regions
JPH07507768A (ja) 1992-03-12 1995-08-31 アルカーメス　コントロールド　セラピューティクス，インコーポレイテッド Ａｃｔｈ含有マイクロスフェアの制御放出
US5376313A (en) 1992-03-27 1994-12-27 Abbott Laboratories Injection molding a plastic assay cuvette having low birefringence
US5534496A (en) 1992-07-07 1996-07-09 University Of Southern California Methods and compositions to enhance epithelial drug transport
US5514670A (en) 1993-08-13 1996-05-07 Pharmos Corporation Submicron emulsions for delivery of peptides
US5599677A (en) 1993-12-29 1997-02-04 Abbott Laboratories Immunoassays for prostate specific antigen
GB9412230D0 (en) 1994-06-17 1994-08-10 Celltech Ltd Interleukin-5 specific recombiant antibodies
FR2724393A1 (fr) 1994-09-12 1996-03-15 Inst Nat Sante Rech Med Obtention d'un anticorps monoclonal recombinant humanise a partir d'un anticorps monoclonal murin, sa production en cellules d'insecte, et ses utilisations
JP2000502450A (ja) 1995-12-22 2000-02-29 アボツト・ラボラトリーズ 蛍光偏光免疫アッセイによる診断法
US5885529A (en) 1996-06-28 1999-03-23 Dpc Cirrus, Inc. Automated immunoassay analyzer
ATE363652T1 (de) 1997-03-07 2007-06-15 Clare Chemical Res Inc Fluorometrischer nachweis mit sichtbarem light
EP1724282B1 (en) 1997-05-21 2013-05-15 Merck Patent GmbH Method for the production of non-immunogenic proteins
GB9712892D0 (en) 1997-06-20 1997-08-20 Eclagen Ltd Identification of mhc binding peptides
CA2327505A1 (en) 1998-04-28 1999-11-04 Smithkline Beecham Corporation Monoclonal antibodies with reduced immunogenicity
WO2004006955A1 (en) 2001-07-12 2004-01-22 Jefferson Foote Super humanized antibodies
US20040030096A1 (en) 2001-08-02 2004-02-12 Linda Gorman Novel human proteins, polynucleotides encoding them and methods of using the same
JP4741242B2 (ja) * 2002-11-26 2011-08-03 アボット バイオセラピューティクス コーポレイション 新脈管形成を調節するα５β１インテグリンへのキメラ及びヒト化抗体
US20080070835A1 (en) * 2003-11-05 2008-03-20 International Institute Of Cancer Immunology, Inc Hla-Dr-Binding Antigen Peptide Derived From Wt1
US7618627B2 (en) 2004-06-03 2009-11-17 The Regents Of The University Of California Method of increasing radiation sensitivity by inhibition of beta one integrin
CA2577370A1 (en) 2004-08-16 2006-03-02 Medimmune, Inc. Integrin antagonists with enhanced antibody dependent cell-mediated cytotoxicity activity
AU2006210724A1 (en) 2005-02-03 2006-08-10 Antitope Limited Human antibodies and proteins
PT1989544E (pt) 2006-03-02 2011-09-26 Antitope Ltd Ensaios com células t
TWI547503B (zh) 2007-09-26 2016-09-01 建南德克公司 抗α5β1抗體、編碼其之核酸、包含其之組合物及其製造及使用方法
EP2352764B1 (en) * 2008-10-14 2018-03-28 Ablynx N.V. AMINO ACID SEQUENCES TARGETING HUMAN CD4 and CXCR4, CCR5, TLR4, ALPHAV INTEGRIN, BETA3-INTEGRIN,BETA1-INTEGRIN, HUMAN ALPHA2-INTEGRIN, CD81, SR-BI, CLAUDIN-1, CLAUDIN-6 AND/OR CLAUDIN-9, RESPECTIVELY, AND NEUTRALIZING VIRAL ENTRY
EP2388871B1 (en) 2009-06-17 2020-11-18 Fujikura Ltd. Multiclad optical fiber, optical fiber module, fiber laser, and fiber amplifier
WO2011149461A1 (en) * 2010-05-27 2011-12-01 Medtronic, Inc. Anti-amyloid beta antibodies conjugated to sialic acid-containing molecules
ES2699532T3 (es) 2011-03-23 2019-02-11 Univ California Métodos y composiciones para mejorar la terapia antiangiogénica con anti-integrinas
JP6502856B2 (ja) * 2012-12-26 2019-04-17 オンコシナジー インコーポレイテッド 抗インテグリンβ１抗体組成物及びその使用方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20090027218A (ko) * 2006-05-24 2009-03-16 바이엘 쉐링 파마 악티엔게젤샤프트 면역원성이 감소된, 고친화도 인간 및 인간화된 항-α5β1 인테그린 작용 블로킹 항체
WO2009009114A2 (en) * 2007-07-12 2009-01-15 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating and diagnosing cancer

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020145669A1 (ko) * 2019-01-10 2020-07-16 에스지메디칼 주식회사 항 베타 1 인테그린 인간화 항체 및 이를 포함하는 암치료용 약학 조성물
CN113330035A (zh) * 2019-01-10 2021-08-31 Sg医疗株式会社 抗β1整合素人源化抗体以及包含其的用于治疗癌症的药学组合物

Also Published As

Publication number Publication date
US20180312591A1 (en) 2018-11-01
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