ES2873379T3 - Proteína de fusión que comprende un dominio de unión a ligando de VEGF y PDGF - Google Patents
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Abstract
Una proteína de fusión que comprende: a. un primer péptido que comprende un dominio de unión al ligando extracelular de un receptor de VEGF, en donde el dominio de unión al ligando extracelular del receptor de VEGF consiste de un dominio similar a Ig D2 de un VEGFR1 y un dominio similar a IG D3 de un VEGFR2, b. una región Fc de un anticuerpo, en donde la región Fc del anticuerpo consiste de una región CH2 y una CH3 de IgG1, y c. un segundo péptido que comprende un dominio de unión al ligando extracelular de un receptor de PDGF, en donde el dominio de unión al ligando extracelular del receptor de PDGF consiste de dominios similares a Ig D1 a D3 de un PDGFRβ; en donde la proteína de fusión está dispuesta desde el extremo N-terminal al extremo C-terminal en el orden de (c)-(b)-(a); en donde la proteína de fusión comprende además un primer péptido conector entre la región Fc y el primer o segundo péptido en el extremo C-terminal de la proteína de fusión, en donde el primer péptido conector comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 20 o 24; y en donde la proteína de fusión es capaz de unirse a un VEGF y un PDGF e inhibir la actividad del VEGF y la actividad del PDGF.
Description
DESCRIPCIÓN
Proteína de fusión que comprende un dominio de unión a ligando de VEGF y PDGF
REFERENCIA CRUZADA A APLICACIÓN RELACIONADA
Esta solicitud tiene derecho de prioridad en conformidad con la 35 U.S.C. § 119(e) para la Solicitud Provisional de Estados Unidos N° 62/131.261, presentada el 11 de marzo de 2015.
REFERENCIA A LISTADO DE SECUENCIAS ENVIADO ELECTRÓNICAMENTE
Esta aplicación contiene un listado de secuencias, que se envía electrónicamente a través de EFS-Web como un listado de secuencias con formato ASCII con un nombre de archivo "688947-3WO_ST25", fecha de creación del 3 de marzo de 2016 y un tamaño de aproximadamente 88,9 k bytes.
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La invención se refiere a proteínas de fusión que comprenden una parte de unión a PDGF, una parte de unión a VEGF y una región de anticuerpo Fc, ácidos nucleicos y vectores de expresión que codifican las proteínas de fusión, células recombinantes de las mismas y composiciones que comprenden las proteínas de fusión. También se proporcionan métodos para usar las proteínas de fusión para inhibir las funciones de PDGF y VEGF.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La angiogénesis, la formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de vasos sanguíneos preexistentes, es un proceso normal y vital implicado en el desarrollo fetal y la reparación de tejidos. La angiogénesis está altamente regulada por factores tanto angiogénicos como antiangiogénicos, e implica la migración y proliferación de células endoteliales, la maduración y remodelación de los vasos, y la degradación de la matriz extracelular. Aunque es un proceso importante en el crecimiento y desarrollo normales, la angiogénesis también desempeña un papel clave en el crecimiento tumoral, la isquemia y la inflamación.
Durante la angiogénesis ocular rápida descontrolada, aumenta la permeabilidad vascular, lo que lleva a la fragilidad vascular y la filtración que da como resultado hemorragia y acumulación de fluidos y exudados de proteínas y, en última instancia, da como resultado insuficiencia vascular o sobrecrecimiento vascular. La angiogénesis ocular puede producirse en un espectro de trastornos oculares como la degeneración macular relacionada con la edad (AMD), la neuropatía diabética proliferativa (PDR) y la neovascularización corneal. Tanto la AMD como la PDR pueden provocar un deterioro de la estructura y función de las neuronas de la retina, provocando en última instancia pérdida de la visión. Si no se tratan, los vasos sanguíneos anormales pueden provocar cicatrices fibrosas, provocando un daño irreversible a la función de la retina que eventualmente puede resultar en ceguera (Zhang y Ma, Prog Retin Eye Res. enero 2007; 26(1):1-37). La neovascularización corneal puede llevar de manera similar a una reducción de la transparencia de la córnea y pérdida de visión.
El factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) desempeña un papel importante en la angiogénesis. La familia de VEGF humano contiene 6 miembros: VEGF-A, VEGF-B, VEg F-C, VeGF-D, VEGF-E y factor de crecimiento placentario (PlGF). Además, se generan múltiples isoformas de VEGF-A, VEGF-B y PlGF mediante corte y empalme alternativo de ARN (Sullivan y Brekken, MAbs. Mar-Abr2010; 2(2):165-75). VEGF-A es el miembro prototípico de la familia y es el mejor caracterizado. Se ha demostrado que VEGF-A sirve como factor mitogénico para las células endoteliales, promueve la supervivencia y proliferación de las células endoteliales, induce la migración celular y aumenta la permeabilidad microvascular. La familia VEGF de proteínas activa la vía de señalización de VEGF al unirse a la región extracelular de los receptores de VEGF de la superficie celular (VEGFR) para activar la vía de señalización de VEGF.
Hay tres tipos de proteínas VEGFR: VEGFR1, VEGFR2 y VEGFR3, y cada una contiene una región extracelular que comprende siete dominios similares a inmunoglobulina (Ig). Las regiones extracelulares de VEGFR se unen a diferentes proteínas VEGF. Por ejemplo, VEGFR-1 (Flt-1) se une a VEGF-A, VEGF-B y PlGF, y puede funcionar como receptor señuelo para VEGF o como regulador de VEGFR-2. VEGFR-2 (KDR/Flk-1) se une a todas las isoformas de VEGF y es el mediador predominante de la señalización de angiogénesis inducida por VEGF. VEGFR-3 (Flt-4) se une a VEGF-C y VEGF-D, pero no a VEGF-A, y funciona como mediador de la linfangiogénesis.
Las variantes de alto peso molecular VEGF206 y VEGF189K están estrechamente unidas a la membrana extracelular y no interactúan con los receptores de VEGF. Mientras que VEGF165 es la variante soluble predominante, VEGF121 y VEGF145 también son variantes solubles que se unen a los receptores VEGFR1 y VEGFR2, al igual que el producto de degradación VEGF110 (Bhisitkuk, Br J Ophthalmol. diciembre 2006; 90(12):1542- 7).
El bloqueo de la actividad de VEGF con anticuerpos, receptores de VEGF solubles o inhibidores de la actividad de tirosina quinasa de VEGF son estrategias que se han usado para tratar trastornos de tipo angiogénico, como la AMD Aunque la terapia anti-VEGF generalmente estabiliza o mejora la función visual, se ha informado que la cicatrización subretiniana, o fibrosis, se desarrolla en aproximadamente la mitad de todos los ojos tratados en el plazo de años del tratamiento anti-VEGF (Daniel et al., Ophthalmology. marzo 2014; 121(3):656-66). Además, apuntar solo a VEGF previene la formación de nuevas vesículas sanguíneas, pero no tiene ningún efecto sobre los vasos sanguíneos recién establecidos.
Los datos recientes sugieren que los pericitos pueden desempeñar un papel en la resistencia anti-VEGF, la estabilización de nuevos vasos y la formación de cicatrices. Los pericitos interactúan con las células endoteliales y contribuyen al establecimiento de la barrera hemato-retiniana. Es importante destacar que los pericitos proporcionan señales de supervivencia a las células endoteliales neovasculares, haciéndolas resistentes a la terapia de depleción de VEGF (Benjamin et al., Development. mayo 1998; 125(9): 1591-8; Patel, Retina. junio 2009; 29(6 Suppl):S45-8). El factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) controla los pericitos, impulsa su reclutamiento, proliferación y supervivencia, y regula la maduración de nuevos vasos.
La familia de PDGF humano contiene cuatro miembros: PDGF-A, PDGF-B, PDGF-C y PDGF-D. Las cuatro proteínas de PDGF forman u homo- o heterodímeros (por ejemplo, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PDGF-CC y PDGF-DD) y son inactivas en sus formas monoméricas. Las proteínas diméricas se unen a la región extracelular de los receptores de PDGF de la superficie celular (PDGFR) para activar la vía de señalización de PDGF.
Hay dos tipos de receptores de PDGF, PDGFR-a y PDGFR-p que forman homo- o heterodímeros (por ejemplo, PDGFR-aa, PDGFR-pp y PDGFR-ap) y contienen regiones extracelulares que comprenden cinco dominios similares a Ig. Los sitios de unión al ligando de los receptores están localizados en los primeros tres dominios similares a Ig (D1 a D3).
Las regiones extracelulares de los dímeros de PDGFR se unen a diferentes proteínas de PDGF. Por ejemplo, PDGFR-aa interactúa específicamente con PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB y PDGF-CC. PDGFR-ap interactúa específicamente con PDGF-AB, PDGF-BB, PDGF-CC y PDGF-DD. PDGFR-pp interactúa específicamente con PDGF-BB y PDGF-DD. Se ha demostrado que PDGF-BB, el único PDGF que puede unirse a las tres formas de dímero del receptor con alta afinidad, puede inducir la proliferación y migración de pericitos tanto in vitro como in vivo. Se ha demostrado anteriormente que una región extracelular que consiste de los cinco dominios similares a Ig de PDGFR-p (D1 a D5) antagoniza las respuestas estimuladas por PDGF-B (Duan et al., J Biol Chem. 5 de enero de 1991; 266(1):413-8; Ueno et al., Science. 10 de mayo de 1991; 252(5007):844-8). Los estudios que usan proteínas quiméricas de PDGFRp-Fc demostraron que D1 a D3 de PDGFR-p humano son suficientes para la unión del ligando de PDGF-B de alta afinidad (Heidaran et al., FASEB J. enero de 1995; 9(1):140-5; Lokker et al., J Biol Chem. 26 de diciembre de 1997; 272(52):33037-44). Además, la predimerización de D1 a D3 de PDGFR-p fusionado a glutatión S-transferasa (GST) mejoró la afinidad de unión al ligando de PDGF-BB en comparación con la proteína PDGFR-p D1-D3 recombinante (Leppanen et al., Biochemistry. 7 de marzo de 2000; 39(9):2370-5).
Aunque las terapias anti-VEGF actuales son altamente efectivas, se requiere una monitorización intensiva del paciente y un tratamiento frecuente para lograr resultados óptimos. Además, como estos agentes se dirigen a los síntomas de la enfermedad y no a la causa subyacente, el tratamiento debe continuar indefinidamente. Con un tratamiento subóptimo, las lesiones neovasculares coroideas (NVC) existentes continuarán creciendo y eventualmente madurarán hasta convertirse en cicatrices fibróticas que llevarán a una pérdida de visión irreversible (Martin et al., Ophthalmology 2012; 119: 1388-1398; Bloch et al., Am J Ophthalmol. julio de 2013; 156(1):116-124; Daniel et al., Ophthalmology. marzo de 2014; 121(3):656-66). Los agentes que pueden bloquear la neovascularización y provocar la involución de la vasculatura inmadura dentro de las lesiones coroideas neovasculares tienen el potencial de eliminar la fuente de la fuga vascular y la fibrosis, reduciendo o eliminando la necesidad de una monitorización intensiva del paciente y un tratamiento continuo.
Recientemente, se ha descrito una proteína de fusión que comprende, desde el extremo N-terminal al extremo C-terminal, una parte extracelular de un receptor de PDGF, una parte extracelular de un receptor de VEGF y un dominio de multimerización (Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos N° 2014/0315804). La proteína de fusión se une tanto a PDGF como a VEGF e inhibe sus actividades. La WO 2014/160507 A1 divulga proteínas de fusión que comprenden porciones de unión a PDGF y VEGF, y partículas víricas recombinantes que codifican las proteínas de fusión. También se proporcionan composiciones que comprenden las proteínas de fusión y las partículas virales, así como los métodos para usar las mismas. La US 2006/234347 A1 divulga proteínas receptoras solubles multivalentes que se unen a más de un factor angiogénico. También se describen secuencias de nucleótidos y vectores que codifican la proteína receptora soluble multivalente, así como las células huésped que las comprenden y los métodos para elaborarlas y usarlas. Los vectores que las codifican encuentran utilidad en el tratamiento del cáncer y otras enfermedades asociadas con la angiogénesis. La CN 102311502 A divulga una proteína de fusión usada para inhibir la regeneración o el crecimiento de vasos sanguíneos y aplicaciones medicinales o preparaciones farmacéuticas de la misma. La proteína de fusión es capaz de inhibir PDGF y VEGF al
mismo tiempo y tratar las diferentes enfermedades provocadas por la regeneración y el crecimiento de vasos sanguíneos como tumores, enfermedades oculares y similares.
A pesar del progreso descrito en la técnica de los inhibidores duales de PDGF y VEGF, hay una necesidad en la técnica de formulaciones y tratamientos mejorados de trastornos de tipo angiogénico.
BREVE RESUMEN DE LA INVENCIÓN
La invención satisface esta necesidad proporcionando proteínas de fusión novedosas que se unen simultáneamente tanto a VEGF como a PDGF, dirigiéndose a ambas vías de señalización al mismo tiempo. Las proteínas de fusión se han generado fusionando dominios de unión de ligandos extracelulares derivados de los receptores de VEGF y PDGF con un dominio Fc que prolonga la vida media de IgG1. En realizaciones específicas de la invención, todos los componentes de las proteínas de fusión son de origen humano y, por lo tanto, se espera que sean útiles como agentes terapéuticos no inmunogénicos en humanos. Las proteínas de fusión pueden inhibir el crecimiento celular dependiente de VEGF y PDGF in vitro, y pueden reducir la pérdida retiniana inducida por VEGF en un modelo animal.
Hay una evidencia creciente de que la angiogénesis puede producirse en ausencia de señalización de VEGF, y que los pericitos suministran VEGF y otros factores de supervivencia celular a las células endoteliales en proliferación, lo que confiere resistencia a anti-VEGF (Reinmuth et al., FASEB J. mayo de 2001; 15(7): 1239-41). También se ha sugerido un origen pericito para los miofibroblastos en tejido cicatricial y tumores. La vía de señalización de PDGF es responsable del reclutamiento, supervivencia y maduración de pericitos (Andrae et al., Genes Dev. 15 de mayo de 2008; 22(10):1276-312). Se demostró que la inhibición de la señalización del receptor de PDGF por anticuerpos mejora el efecto terapéutico del tratamiento anti-VEGF en múltiples modelos de ratón de neovascularización ocular (Jo et al., Am J Pathol. junio de 2006; 168(6):2036-53). Un gran ensayo clínico de fase 2 del agente anti-PDGF E10030 en combinación con un agente anti-VEGF mostró resultados superiores sobre la monoterapia anti-VEGF (Dugel, Retina Today, marzo de 2013, 65-71). Por tanto, las proteínas de fusión de la invención son eficaces en el tratamiento de trastornos de tipo angiogénico, como AMD y cáncer. Un beneficio adicional de las proteínas de fusión es que no hay necesidad de inyectar dos composiciones separadas, es decir, un agente anti-PDGF y un agente anti-VEGF. En cambio, una única composición que comprende una proteína de fusión de ambos agentes permite una única inyección, disminuyendo de este modo el riesgo de infecciones y traumatismos por inyección para los pacientes.
En un aspecto general, la invención se refiere a una proteína de fusión que comprende (a) un primer péptido que comprende un dominio de unión al ligando extracelular de un receptor de VEGF que consiste de un dominio similar a Ig D2 de un VEGFR1 y un dominio similar a Ig D3 de un VEGFR2, (b) una región Fc de un anticuerpo que consiste de una región CH2 y una región CH3 de IgG1, y (c) un segundo péptido que comprende un dominio de unión al ligando extracelular de un receptor de PDGF que consiste de dominios similares a Ig D1 a D3 de un PDGFRp. La proteína de fusión se organiza desde el extremo N-terminal al extremo C-terminal en el orden de (c)-(b)-(a). La proteína de fusión comprende además un primer péptido conector entre la región Fc y el primer o el segundo péptido en el extremo C-terminal de la proteína de fusión, en donde el primer péptido conector comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 20 o 24. Además, la proteína de fusión es capaz de unirse a un VEGF y un PDGF inhibiendo la actividad del VEGFR y la actividad del p Dg F.
En una realización de la invención, el dominio de unión al ligando extracelular del receptor de VEGF comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 7. Más preferiblemente, el dominio de unión al ligando extracelular del receptor de VEGF comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NO: 7 y 10.
En una realización, el dominio de unión al ligando extracelular del receptor de PDGF comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2. Más preferiblemente, el dominio de unión al ligando extracelular del receptor de PDGF presente comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NO: 2 y 5.
En una realización de la invención, la región Fc del anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 12.
Más preferiblemente, la región Fc del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NO: 12 y 15.
En una realización de la invención, la proteína de fusión comprende además un segundo péptido conector entre el segundo o el primer péptido en el extremo N-terminal de la proteína de fusión y la región Fc.
En una realización de la invención, la proteína de fusión comprende además un péptido señal enlazado operativamente al extremo N-terminal de la proteína de fusión.
En otro aspecto general, la invención se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una proteína de fusión de la invención.
En otro aspecto general, la invención se refiere a una célula huésped recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión de la invención.
En otro aspecto general, la invención se refiere a un método para obtener una proteína de fusión de la invención. El método comprende: (1) cultivar una célula huésped que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión bajo la condición de que se produzca la proteína de fusión; y (2) recuperar la proteína de fusión producida por la célula huésped.
En otro aspecto general, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende una proteína de fusión de la invención y un portador farmacéuticamente aceptable.
En otro aspecto general, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión de la invención y un portador farmacéuticamente aceptable.
En otro aspecto general, la divulgación se refiere a un método para reducir la actividad del VEGFR y la actividad del PDGFR, el método comprendiendo administrar a un sujeto con necesidad de ello una cantidad eficaz de una proteína de fusión de la invención.
En otro aspecto general, la invención se refiere a una proteína de fusión de la presente invención para su uso en el tratamiento o prevención de una afección clínica seleccionada del grupo que consiste de vascularización tisular, permeabilidad vascular, edema e inflamación.
En otro aspecto general, la invención se refiere a una proteína de fusión de la presente invención para su uso en el tratamiento o prevención de una afección clínica seleccionada del grupo que consiste de neovascularización coroidea (CNV), degeneración macular húmeda relacionada con la edad (AMD) y atrofia geográfica.
La proteína de fusión puede administrarse como una proteína aislada o como un vector de expresión. La afección clínica puede seleccionarse del grupo que consiste de neovascularización o permeabilidad vascular, edema, inflamación, neovascularización coroidea (CNV), degeneración macular húmeda relacionada con la edad (AMD) y atrofia geográfica.
Otros aspectos, características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente divulgación, incluyendo la descripción detallada de la invención y sus realizaciones preferidas y las reivindicaciones adjuntas.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
El resumen anterior, así como la siguiente descripción detallada de la invención, se comprenderán mejor cuando se lean junto con los dibujos adjuntos. Debe entenderse que la invención no se limita a las realizaciones precisas mostradas en los dibujos.
En los dibujos:
La Figura 1 muestra el diseño estructural de proteínas de fusión bifuncionales ejemplares de acuerdo con las realizaciones de la invención, La Proteína de Fusión 2 (arriba) y Proteína de Fusión 1 (abajo), diseñadas para inhibir tanto las vías de PDGF como de VEGF simultáneamente: dominio extracelular similar a Ig de PDGFR (PID) representa los dominios extracelulares similares a Ig D1 a D3 de PDGFRp; Fc representa los dominios CH2 y CH3 de IgG1; El dominio extracelular similar a Ig (VID) de VEGFR representa el dominio extracelular similar a Ig D2 de VEGFR1 y el dominio extracelular similar a Ig D3 de VEGFR2;
La Figura 2A y Figura 2B muestran el análisis en gel SDS-PAGE de las Proteínas de Fusión Fc bifuncionales purificadas 1 y 2, respectivamente; La Figura 2C muestra el análisis en gel SDS-PAGE de las proteínas de fusión Fc bifuncionales purificadas no reducidas y reducidas, respectivamente: Hilera M = marcador, Hileras 1 (no reducidas) y 2 (reducidas) = Control Positivo 2; Hileras 3 (no reducidas) y 4 (reducidas) = Proteína de fusión 5; Hileras 5 (no reducidas) y 6 (reducidas) = Proteína de fusión 3;
La Figura 3 muestra los resultados de un ensayo de unión directa a ligandos de tres muestras de prueba: Control positivo purificado 1 (•), Proteína de fusión 3 (▲) y Proteína de fusión 5 (■) contra VEGF165. Los pocillos se recubrieron previamente con VEGF165 y se incubaron con varias concentraciones de muestras de prueba; la cantidad de muestra de prueba unida se detectó usando anticuerpo específico de Fc de IgG1 anti-humano de
cabra conjugado con HRP, y las lecturas de OD450 se representaron gráficamente frente a las concentraciones de la muestra de prueba;
La Figura 4 muestra los resultados de un ensayo de unión directa de ligandos de tres muestras de prueba: Control positivo purificado 2 (•), Proteína de fusión 3 (A ) y Proteína de fusión 5 (■) contra PDGF-Bb . Los pocillos se recubrieron previamente con PDGF-BB y se incubaron con varias concentraciones de muestra de prueba; la cantidad de muestra de prueba se detectó usando anticuerpo específico de Fc de IgG1 antihumano de cabra conjugado con HRP, y las lecturas de OD450 se representaron gráficamente frente a las concentraciones de la muestra de prueba;
La Figura 5A y la Figura 5B muestran la evaluación de la afinidad de la Proteína de fusión 1 contra VEGF165 y PDGF-BB en solución, respectivamente, en un ensayo de unión competitiva. Se incubaron varias concentraciones de Proteína de fusión 1 durante la noche en solución con una concentración fija de VEGF165 o PDGF-BB, las concentraciones de VEGF165 o PDGF-BB libres se determinaron usando un ensayo de inmunoensayo cuantitativo ligado a enzimas (ELISA) en sándwich y se representaron gráficamente frente a concentraciones de Proteína de fusión 1;
La Figura 6A y la Figura 6B muestran la evaluación de la afinidad de la Proteína de fusión 2 contra VEGF165 y PDGF-BB en solución, respectivamente, en un ensayo de unión competitiva. Se incubaron varias concentraciones de Proteína de fusión 2 durante la noche en solución con una concentración fija de VEGF165 o PDGF-BB; las concentraciones de VEGF165 o PDGF-BB libres se determinaron usando un ensayo ELISA de sándwich cuantitativo y se representaron gráficamente frente a las concentraciones de la Proteína de fusión 2; La Figura 7 muestra el efecto inhibidor del Control positivo 1 (•), la Proteína de fusión 3 (A) y la Proteína de fusión 5 (■) sobre el crecimiento dependiente de VEGF de las células HUVEC. Las lecturas de OD490 se representaron gráficamente frente a las concentraciones de la muestra de prueba; y
La Figura 8 muestra el efecto inhibidor del Control positivo 2 (•), la Proteína de fusión 3 (▲) y la Proteína de fusión 5 (■) sobre el crecimiento dependiente de PDGF de células BALB/3T3; Las lecturas de OD490 se representaron gráficamente frente a las concentraciones de la muestra de prueba.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Varias publicaciones, artículos y patentes se citan o describen en los antecedentes y a lo largo de la memoria descriptiva. El análisis de documentos, actos, materiales, dispositivos, artículos o similares que se han incluido en la presente memoria descriptiva tiene el propósito de proporcionar un contexto para la invención. Tal análisis no es una admisión de que cualquiera o todas estas materias formen parte del estado de la técnica con respecto a cualquier invención divulgada o reivindicada.
A menos que se indique lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado comúnmente entendido por un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. De lo contrario, ciertos términos usados en la presente tienen los significados expuestos en la memoria descriptiva. Debe tenerse en cuenta que, como se usa en la presente y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "uno" y "el" incluyen la referencia en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
La invención se refiere a una proteína de fusión que comprende (a) un primer péptido que comprende un dominio de unión al ligando extracelular de un receptor de VEGF que consiste de un dominio similar a Ig D2 de un VEGFR1 y un dominio similar a Ig D3 de un VEGFR2, (b) una región Fc de un anticuerpo que consiste de una región CH2 y una CH3 de IgG1, y (c) un segundo péptido que comprende un dominio de unión al ligando extracelular de un receptor de PDGF que consiste de dominios similares a Ig D1 a D3 de un PDGFRp; en donde la proteína de fusión está dispuesta desde el extremo N-terminal al extremo C-terminal en el orden de (c)-(b)-(a). La proteína de fusión comprende además un primer péptido conector entre la región Fc y el primer o segundo péptido en el extremo C-terminal de la proteína de fusión, en donde el primer péptido conector comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 20 o 24. La proteína de fusión es capaz de unirse a un VEGF y un PDGF e inhibir la actividad del VEGF, VEGFR2 y la actividad del PDGF.
Sorprendentemente se descubre durante la presente invención que la orientación de los dominios de unión a ligandos extracelulares de los receptores de VEGF y PDGF con respecto a los otros componentes de la proteína de fusión, como la región Fc del anticuerpo, tiene un impacto sobre la afinidad de unión de la proteína de fusión para los ligandos de VEGF y PDGF. Una proteína de fusión de acuerdo con una realización de la invención tiene una afinidad optimizada de la proteína de fusión por ambos ligandos y puede tener una eficacia aumentada de las proteínas de fusión.
Como se usa en la presente, la frase "proteína de fusión" se refiere a una proteína que tiene dos o más porciones enlazadas covalentemente, donde cada una de las porciones se deriva de proteínas diferentes.
Como se usa en la presente, el término "VEGF" se refiere a cualquier proteína del factor de crecimiento endotelial vascular que regula la vía de señalización de VEGF. Por tanto, el término VEGF puede referirse a VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, PlGF o isoformas de los mismos.
Como se usa en la presente, los términos "receptor de VEGF" y "VEGFR" se refieren a cualquier receptor que se une a un ligando de VEGF. Por tanto, el término receptor de VEGF puede referirse a un VEGFR1, VEGFR2 o VEGFR3.
Como se usa en la presente, la frase "dominio de unión al ligando extracelular" se refiere a cualquier región de una proteína receptora que se encuentra en el exterior de la célula y es capaz de unirse a su ligando.
El dominio de unión al ligando extracelular del receptor de VEGF que está presente en una proteína de fusión es de VEGFR1 y VEGFR2. Los siete dominios extracelulares similares a IgG de las proteínas VEGFR se numeran 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7, desde el extremo N-terminal a C-terminal de la región extracelular, y alternativamente se denominan D1, D2, D3, D4, D5, D6 y D7. Un dominio de unión al ligando extracelular de un VEGFR presente en una proteína de fusión puede comprender uno o más de cualquiera de los siete dominios similares a IgG de la región extracelular de una o más de cualquier proteína VEGFR. Por ejemplo, el dominio de unión al ligando extracelular de un receptor de VEGF que está presente en una proteína de fusión puede ser uno o más de D1, D2, D3, D4, D5, D6 o D7 de uno o más de VEGFR1, VEGFR2 o VEGFR3.
De acuerdo con la presente invención, el dominio de unión al ligando extracelular del receptor de VEGF que está presente en la proteína de fusión comprende un dominio similar a Ig D2 de un VEGFR1 y un dominio similar a Ig D3 de un VEGFR2. Los dominios de unión al ligando extracelular del VEGFR pueden comprender una o más mutaciones que aumentan su unión a un VEGF. En una realización más preferida, el dominio de unión al ligando extracelular del receptor de VEGF que está presente en la proteína de fusión comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 90% de identidad con la SEQ ID NO: 7. En una realización aún más preferida, el dominio de unión al ligando extracelular del receptor de VEGF que está presente en la proteína de fusión comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 7 y 10.
El dominio de unión al ligando extracelular del receptor de VEGF que está presente en la proteína de fusión de la invención puede ser de cualquier animal, como un humano u otro mamífero adecuado, como un ratón, conejo, rata, cerdo, perro o primate. En una realización preferida, el VEGFR es de un humano.
Como se usa en la presente, el término "PDGF" se refiere a cualquier proteína del factor de crecimiento derivada de plasma que regula la vía de señalización de PDGF. Por tanto, el término PDGF puede referirse a PDGF-A, PDGF-B, PDGF-C o PDGF-D.
Como se usa en la presente, los términos "receptor de PDGF" y "PDGFR" se refieren a cualquier receptor que se una a un ligando de PDGF.
El dominio de unión al ligando extracelular del receptor de PDGF que está presente en la proteína de fusión de la invención es de PDGFR-p. Los cinco dominios extracelulares similares a IgG de las proteínas PDGFR se numeran 1, 2, 3, 4 y 5, desde el extremo N-terminal a C-terminal de la región extracelular y se denominan alternativamente D1, D2, D3, D4 y D5. El dominio de unión al ligando extracelular de un PDGFR que está presente en una proteína de fusión puede ser uno o más de cualquiera de los cinco dominios similares a IgG de la región extracelular de una o más de cualquier proteína de PDGFR.
De acuerdo con la presente invención, el dominio de unión al ligando extracelular del receptor de PDGF que está presente en la proteína de fusión comprende los dominios similares a IG D1 a D3 de un PDGFRp. Los dominios de unión al ligando extracelular del PDGFR pueden comprender una o más mutaciones que aumentan su unión a un PDGF. En una realización más preferida, el dominio de unión al ligando extracelular del receptor de PDGF que está presente en la proteína de fusión comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 90% de identidad con la SEQ ID NO: 2. En una realización incluso más preferida, el dominio de unión al ligando extracelular del receptor de PDGF que está presente en la proteína de fusión comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 2 y 5.
El dominio de unión al ligando extracelular del receptor de PDGF que está presente en la proteína de fusión de la invención puede ser de cualquier animal, como un humano u otro mamífero adecuado, como un ratón, conejo, rata, cerdo, perro o primate. En una realización preferida, el PDGFR es de un humano.
Como se usa en la presente, el término "región Fc" de un anticuerpo se refiere a la región de "fragmento cristalizable" de un anticuerpo que está compuesto por dos cadenas pesadas que comprenden dos o tres dominios constantes, dependiendo de la clase del anticuerpo. El término se usa para definir una región C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina que contiene por lo menos una porción de la región constante. El término incluye regiones Fc tanto nativas como variantes. La región Fc de un anticuerpo puede servir como dominio de multimerización, que es un dominio que promueve la asociación de subunidades en multímeros, como dímeros, trímeros, tetrámeros, etc. La región Fc puede comprender una o más mutaciones que promueven la asociación de subunidades en multímeros.
De acuerdo con la invención, la región Fc de un anticuerpo que está presente en la proteína de fusión de la invención comprende una región CH2 y CH3 de IgG1. En una realización más preferida, la región Fc de un anticuerpo que está presente en la proteína de fusión de la invención comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 90% de identidad con la SEQ ID NO: 12. En una realización incluso más preferida, la región Fc de un anticuerpo que está presente en la proteína de fusión de la invención comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 12 y 15.
La región Fc de un anticuerpo que está presente en la proteína de fusión de la invención puede ser de cualquier animal, como un humano u otro mamífero adecuado, como un ratón, conejo, rata, cerdo, perro o primate. En una realización preferida, la región Fc es de un anticuerpo humano.
Los componentes de la proteína de fusión pueden unirse mediante una fracción de enlace como un conector peptídico. El conector puede aumentar la flexibilidad de los componentes de la proteína de fusión, ayuda a asegurar el plegado correcto, minimiza el impedimento estérico y no interfiere significativamente con la estructura de cada componente funcional dentro de la proteína de fusión. El conector peptídico puede comprender de 2 a 20 aminoácidos El conector peptídico puede comprender 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 aminoácidos. De acuerdo con la invención, la proteína de fusión comprende un primer péptido conector entre la región Fc y el primer o segundo péptido en el extremo C-terminal de la proteína de fusión, y opcionalmente un segundo péptido conector entre el segundo o primer péptido en el extremo N-terminal de la proteína de fusión y la región Fc. De acuerdo con la invención, el primer péptido conector comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 20 o 24. El segundo péptido conector puede comprender una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 18.
De acuerdo con realizaciones de la invención, la proteína de fusión comprende además un péptido señal enlazado al extremo N-terminal de la proteína de fusión para asegurar la secreción de la proteína de fusión de la célula. Puede usarse cualquier péptido señal que sea reconocido y procesado por las células huésped. En realizaciones preferidas, el péptido señal incluye, pero no se limita a, una secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 34 o 36.
En una realización preferida, la proteína de fusión de la invención comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 90% de identidad con la SEQ ID NO: 40, preferiblemente por lo menos un 90% de identidad con los aminoácidos número 20 a 766 de la SEQ ID NO: 42, amino ácidos número 21 a 769 de la SEQ ID NO: 44 o aminoácidos número 20 a 768 de la SEQ ID NO: 50. La proteína de fusión puede incluir una o más mutaciones o polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) en los dominios del receptor de VEGF y/o dominios del receptor de p Dg F. También puede incluir una o más mutaciones o SNP que se producen en la región Fc de un anticuerpo de acuerdo con las realizaciones de la invención.
En una realización más preferida, la proteína de fusión de la invención comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NO: 40, aminoácidos 20-766 de la SEQ ID NO: 42 y aminoácidos 21-769 de la SEQ ID. NO: 44 y aminoácidos 20-768 de la SEQ ID NO: 50.
En un aspecto general, la proteína de fusión de la invención se une a un VEGF y un PDGF e inhibe la actividad de los receptores de VEGF y PDGF. Como se usa en la presente, el término "se une a" se refiere a la unión de un dominio extracelular de una proteína receptora a un ligando que da como resultado uno o más de inhibir, bloquear, neutralizar, reducir, anular o interferir con las actividades del ligando. En ciertas realizaciones, el dominio extracelular de una proteína receptora de VEGF o PDGF inhibe las actividades del ligando uniéndose al ligando, es decir, VEGF o PDGF, respectivamente, y secuestrando el ligando para que no se una a otras moléculas, como otros receptores de VEGF y receptores de p Dg F. En ciertas otras realizaciones, el dominio extracelular de una proteína receptora de VEGF o PDGf inhibe las actividades del ligando uniéndose al ligando, es decir, VEGF o PDGF, respectivamente, y evitando que el ligando desencadene los eventos de señalización en sentido descendente en las células.
Como se usa en la presente, el término "inhibición" o "inhibir" en el contexto de la actividad de ligandos como se usa en la presente se refiere a una propiedad de un dominio extracelular de una proteína receptora que reduce la actividad del ligando como se analiza mediante varios ensayos funcionales, que incluyen pero no se limitan a, ensayos de unión, ensayos de crecimiento celular, ensayos de unión competitiva y ensayos in vivo.
Las proteínas de fusión o los componentes de la proteína de fusión divulgados en la presente pueden caracterizarse o evaluarse en cuanto a actividades biológicas que incluyen, pero no se limitan a, la afinidad por una pareja de unión objetivo (por ejemplo, una proteína de la familia de PDGF y/o VEGF), unión competitiva (por ejemplo, bloqueo de un PDGF o VEGF para que no se una a un PDGFR o VEGFR), actividad inhibidora (por ejemplo, inhibiendo la activación de vías de señalización de PDGF o VEGF), inhibición de la proliferación celular, inhibición del crecimiento tumoral, e inhibición de la angiogénesis (por ejemplo, inhibición de la neovascularización coroidea). Las proteínas de fusión o los componentes de la proteína de fusión divulgados en la presente pueden evaluarse para determinar la actividad biológica in vivo o in vitro.
La invención también proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una proteína de fusión que comprende (a) un primer péptido que comprende un dominio de unión al ligando extracelular de un receptor de VEGf que consiste de un dominio similar a Ig D2 de un VEGFR1 y un dominio similar a Ig D3 de un VEGFR2, (b) una región Fc de un anticuerpo que consiste de una región CH2 y una CH3 de IgG1, y (c) un segundo péptido que comprende un dominio de unión al ligando extracelular de un receptor de PDGF que consiste de dominios similares a Ig D1 a D3 de un PDGFRp; en donde la proteína de fusión está dispuesta desde el extremo N-terminal al extremo C-terminal en el orden (c)-(b)-(a). La proteína de fusión comprende además un primer péptido conector entre la región Fc y el primer o segundo péptido en el extremo C-terminal de la proteína de fusión, en donde el primer péptido conector comprende la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 20 o 24. Además, la proteína de fusión es capaz de unirse a un VEGF y a un PDGF inhibiendo la actividad del VEGF y la actividad del PDGF La molécula de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión puede optimizarse por codones para la expresión en un tipo particular de célula huésped, como células de ovario de hámster chino. La molécula de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión puede comprender una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 37, 39, 41, 43 y 49.
De acuerdo con otras realizaciones de la invención, la molécula de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión puede estar en un vector de expresión. Los vectores de expresión incluyen, pero no se limitan a, vectores para la expresión de proteínas recombinantes y vectores para la administración de ácidos nucleicos en un sujeto para la expresión en un tejido del sujeto, como vectores virales. Los ejemplos de vectores virales adecuados para su uso con la invención incluyen, pero no se limitan a, vectores adenovirales, vectores de virus adenoasociados, vectores lentivirales, etc. El vector también puede ser un vector no viral. Los ejemplos de vectores no virales incluyen, pero no se limitan a, plásmidos, cromosomas artificiales bacterianos, cromosomas artificiales de levadura, bacteriófagos, etc. El vector puede incluir cualquier elemento para establecer una función convencional de un vector de expresión, por ejemplo, un promotor, elemento de unión a ribosomas, terminador, potenciador, marcador de selección, o un origen de replicación
La molécula de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión puede optimizarse por codones para una expresión recombinante mejorada a partir de una célula huésped deseada usando métodos conocidos en la técnica en vista de la presente divulgación.
La invención también proporciona una célula huésped que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión que comprende (a) un primer péptido que comprende un dominio de unión al ligando extracelular de un receptor de VEGF que consiste de un dominio similar a Ig D2 de un VEGFR1 y un dominio similar a Ig D3 de un VEGFR2, (b) una región Fc de un anticuerpo que consiste de una región CH2 y c H3 de IgG1, y (c) un segundo péptido que comprende un dominio de unión al ligando extracelular de un receptor de PDGF que consiste de dominios similares a Ig D1 a D3 de un PDGFRp; en donde la proteína de fusión está dispuesta desde el extremo N-terminal al extremo C-terminal en el orden de (c)-(b)-(a). Las células huésped incluyen, pero no se limitan a, células huésped para la expresión de proteínas recombinantes y células huésped para la administración del ácido nucleico a un sujeto para su expresión en un tejido del sujeto. Los ejemplos de células huésped adecuadas para su uso con la invención incluyen, pero no se limitan a, células de ovario de hámster chino (CHO), 293 de riñón embrionarias humanas (HEK-293), etc.
La invención también proporciona un método para producir una proteína de fusión que comprende (a) un primer péptido que comprende un dominio de unión al ligando extracelular de un receptor de VEGF que consiste de un dominio similar a Ig D2 de un VEGFR1 y un dominio similar a Ig D3 de un VEGFR2, (b) una región Fc de un anticuerpo que consiste una región de CH2 y una CH3 de IgG1, y (c) un segundo péptido que comprende un dominio de unión al ligando extracelular de un receptor de PDGF que consiste de dominios similares a Ig D1 a D3 de un PDGFRp; en donde la proteína de fusión está dispuesta desde el extremo N-terminal al extremo C-terminal en el orden de (c)-(b)-(a). La proteína de fusión comprende además un primer péptido conector entre la región Fc y el primer o segundo péptido en el extremo C-terminal de la proteína de fusión, en donde el primer péptido conector comprende la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 20 o 24. Además, la proteína de fusión es capaz de unirse a un VEGF y un PDGF inhibiendo la actividad del VEGFR y la actividad del PDGF. En un aspecto general, el método comprende (1) cultivar una célula huésped que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión bajo la condición de que se produzca la proteína de fusión; y (2) recuperar la proteína de fusión producida por la célula huésped. La proteína de fusión puede purificarse adicionalmente usando métodos conocidos en la técnica.
La proteína de fusión puede expresarse en células huésped y purificarse a partir de ellas usando una combinación de una o más técnicas de purificación estándar, que incluyen, pero no se limitan a, cromatografía de afinidad de proteína A, cromatografía de afinidad de proteína G, intercambio de tampón, cromatografía de exclusión por tamaño, ultrafiltración y diálisis.
La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende una proteína de fusión que comprende (a) un primer péptido que comprende un dominio de unión al ligando extracelular de un receptor de
VEGF que consiste de un dominio similar a Ig D2 de un VEGFR1 y un dominio similar a Ig D3 de un VEGFR2, (b) una región Fc de un anticuerpo que consiste de una región CH2 y una CH3 de IgG1, y (c) un segundo péptido que comprende un dominio de unión al ligando extracelular de un receptor de PDGF que consiste de dominios similares a Ig D1 a D3 de un PDGFRp; en donde la proteína de fusión está dispuesta desde el extremo N-terminal al extremo C-terminal en el orden de (c)-(b)-(a). Las composiciones de la invención comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína de fusión.
El término "cantidad terapéuticamente eficaz" significa una cantidad de un compuesto terapéuticamente activo necesaria para provocar el efecto biológico o clínico deseado. De acuerdo con realizaciones de la invención, "una cantidad terapéuticamente eficaz" es una cantidad suficiente para lograr resultados beneficiosos o deseados, incluyendo resultados clínicos. Una cantidad terapéuticamente eficaz puede administrarse en una o más administraciones. En términos de un estado de enfermedad, una cantidad eficaz es una cantidad suficiente para mejorar, estabilizar o retrasar el desarrollo de una enfermedad. Una cantidad terapéuticamente eficaz es una cantidad de una proteína de fusión necesaria para tratar o prevenir un trastorno caracterizado por una angiogénesis anormal, como una enfermedad caracterizada por permeabilidad vascular, edema, inflamación, retinopatías, fibrosis o cáncer.
La composición farmacéutica puede comprender una proteína de fusión que comprende una proteína de fusión formulada en un tampón a una concentración de proteína de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 100 mg/ml, preferiblemente de aproximadamente 40 a aproximadamente 80 mg/ml, como aproximadamente 40, 50, 60, 70 o 80 mg/ml, lo más preferiblemente aproximadamente 40 ± aproximadamente 5 mg/ml. La proteína de fusión puede formularse en un tampón a una concentración de proteína de más de aproximadamente 40 mg/ml, preferiblemente aproximadamente 80 ± aproximadamente 10 mg/ml.
En particular, el tampón puede ser un tampón de fosfato con un pH de aproximadamente 6,5 a 8, más preferiblemente de aproximadamente 7 a 7,5, incluso más preferiblemente de aproximadamente 7,2. El tampón de fosfato comprende de aproximadamente 5 a 20 mM de fosfato de sodio, como 5, 10, 15 o 20 mM de fosfato de sodio, más preferiblemente aproximadamente 10 mM de fosfato de sodio; aproximadamente de 20 a 60 mM de cloruro de sodio, más preferiblemente aproximadamente 40 mM de cloruro de sodio; aproximadamente del 1 al 10% en peso por volumen (p/v) de sacarosa, más preferiblemente aproximadamente el 5% p/v de sacarosa; y aproximadamente del 0,01 al 0,05% p/v de un surfactante, más preferiblemente aproximadamente el 0,03% p/v de polisorbato 20.
El tampón también puede ser un tampón de histidina con un pH de aproximadamente 5 a 8, más preferiblemente de aproximadamente 6 a 7, lo más preferible de aproximadamente 6,8. El tampón de histidina comprende histidina de aproximadamente 10 a 50 mM, como 10, 20, 30, 40 o 50 mM de histidina, más preferiblemente aproximadamente 25 mM de histidina; aproximadamente de 10 a 30 mM de cloruro de sodio, como 10, 20 o 30 mM de cloruro de sodio, más preferiblemente aproximadamente 20 mM de cloruro de sodio; aproximadamente del 1 al 10% p/v de sacarosa, como 1, 2, 4, 6, 8 o 10% p/v de sacarosa, más preferiblemente aproximadamente un 6% p/v de sacarosa; y aproximadamente del 0,01 al 0,05% p/v de un surfactante, más preferiblemente aproximadamente el 0,03% p/v de polisorbato 20.
La invención también proporciona una composición que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión que comprende (a) un primer péptido que comprende un dominio de unión al ligando extracelular de un receptor de VEGF que consiste de un dominio similar a Ig D2 de un VEGFR1 y un dominio similar a Ig D3 de un VEGFR2, (b) una región Fc de un anticuerpo que consiste de una región CH2 y c H3 de IgG1, y (c) un segundo péptido que comprende un dominio de unión al ligando extracelular de un receptor de PDGF que consiste de dominios similares a Ig D1 a D3 de un PDGFRp; en donde la proteína de fusión está dispuesta desde el extremo N-terminal al extremo C-terminal en el orden de (c)-(b)-(a). La proteína de fusión comprende además un primer péptido conector entre la región Fc y el primer o segundo péptido en el extremo C-terminal de la proteína de fusión, en donde el primer péptido conector comprende la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 20 o 24. Además la proteína de fusión es capaz de unirse a un VEGF y un PDGF inhibiendo la actividad del VEGF y la actividad del PDGF.
Las composiciones que comprenden una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión de la invención pueden comprender un vehículo de administración para la introducción de la molécula de ácido nucleico en una célula para la expresión de la proteína de fusión. Ejemplos de vehículos de administración de ácidos nucleicos incluyen liposomas, polímeros biocompatibles, incluyendo polímeros naturales y polímeros sintéticos, lipoproteínas, polipéptidos, polisacáridos, lipopolisacáridos, envolturas virales artificiales, partículas metálicas y bacterias, virus como baculovirus, adenovirus y retrovirus, bacteriófagos, cósmidos, plásmidos, vectores fúngicos y otros vehículos de recombinación usados típicamente en la técnica que se han descrito para la expresión en una variedad de huéspedes eucariotas.
La invención también se refiere a las composiciones farmacéuticas descritas en la presente para su uso en el tratamiento o prevención de una afección, enfermedad o trastorno caracterizado por neovascularización o
permeabilidad vascular, edema, inflamación, neovascularización conoidea (CNV), degeneración macular húmeda relacionada con la edad (AMD) y atrofia. Cualquiera de las composiciones farmacéuticas descritas en la presente puede usarse en un método de la invención, incluyendo las composiciones farmacéuticas que comprenden la proteína de fusión o las composiciones farmacéuticas que comprenden un ácido nucleico que codifica la proteína de fusión. Una composición farmacéutica de la invención puede administrarse a un sujeto a través del vítreo, conjuntiva, espiga, retrobulbar o esclerótica para enfermedades relacionadas con la oftalmología, y en sangre o tejidos para enfermedades sistémicas.
Como se usa en la presente, "sujeto" significa cualquier animal, preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un humano, que será o ha sido tratado por un método de acuerdo con una realización de la invención. El término "mamífero", como se usa en la presente, abarca cualquier mamífero. Los ejemplos de mamíferos incluyen, pero no se limitan a, vacas, caballos, ovejas, cerdos, gatos, perros, ratones, ratas, conejos, cobayas, primates no humanos (NHP) como monos o simios, humanos, etc. más preferiblemente un humano.
Los términos "tratar", "tratando" y "tratamiento" como se usan en la presente se refieren a administrar una composición a un sujeto para lograr un resultado terapéutico o clínico deseado en el sujeto. Los términos "tratar", "tratando" y "tratamiento" pueden referirse a la administración de una composición farmacéutica de la invención para reducir, aliviar o ralentizar la progresión o el desarrollo de un trastorno de tipo angiogénico, como permeabilidad vascular, edema o inflamación. Los términos "tratar", "tratando" y "tratamiento" también pueden referirse a la administración de una composición farmacéutica de la invención para inhibir o reducir la neovascularización corneal y/o la vasculatura con fugas en el ojo. Los términos "tratar", "tratando" y "tratamiento" pueden referirse además a la administración de una composición farmacéutica de la invención para ralentizar la progresión o el desarrollo de nuevos vasos sanguíneos en la córnea (es decir, neovascularización corneal) o en el sitio de interés. Cuando se usan con referencia a AMD, los términos "tratar", "tratando" y "tratamiento" pueden referirse a prevenir o reducir la fuga retiniana inducida por VEGF y a prevenir o reducir la cicatrización ocular y la fibrosis relacionada con la angiogénesis. Cuando se usan con referencia al cáncer, los términos "tratar", "tratando" y "tratamiento" también pueden referirse a reducir la proliferación, desdiferenciación o diseminación de células cancerosas. El tratamiento de un tumor puede incluir una reducción del tamaño del tumor, una reducción del crecimiento tumoral y una reducción de la metástasis del tumor. Como se usa en la presente, el término "tumor" se refiere a masas de tejido anormales, e incluye masas tanto benignas como malignas.
Una composición farmacéutica puede administrarse mediante cualquier método conocido por los expertos en la técnica en vista de la presente divulgación, como mediante administración tópica, inyección intravítrea, inyección supracoroidea o subconjuntival. La formulación oftálmica puede administrarse por vía intravítrea. La composición farmacéutica puede administrarse a cualquier parte del ojo y preferiblemente se administra al vítreo del ojo para el tratamiento de trastornos de tipo angiogénico. La composición farmacéutica puede administrarse a cualquier parte del cuerpo y preferiblemente se administra a la sangre o tejido/órgano para el tratamiento de trastornos de tipo angiogénico.
Los parámetros como la cantidad de dosificación, la frecuencia de administración y la duración de la administración de una composición farmacéutica a un sujeto no están limitados de ninguna manera en particular. Los valores óptimos de tales parámetros pueden depender de una variedad de factores, como el sujeto a tratar, la enfermedad de tipo angiogénica particular a tratar, la gravedad de la enfermedad, etc., y un experto en la técnica será capaz de determinar los valores óptimos para tales parámetros para lograr el resultado clínico o terapéutico deseado. Por ejemplo, una composición farmacéutica puede administrarse una vez al día, o más de una vez al día, como dos, tres, cuatro veces, etc. Un régimen de dosificación ejemplar y no limitativo comprende administrar una composición farmacéutica por vía intravítrea una vez durante un tiempo de un mes.
La invención puede administrarse junto con otros agentes anti-angiogénicos, como anti-factor de crecimiento hepatocitos (HGF), anti-receptor HGF (HGFR), anti-factor de crecimiento fibroblastos (FGF), anti receptor FGF (FGFR), anti-inflamatorios (corticosteroides, fármacos antiinflamatorios no esteroideos), inmunomoduladores, antibióticos y anticancerígenos.
La invención también puede proporcionar un antagonista dimérico para PDGF y VEGF que comprende la proteína de fusión de la invención. Cada proteína de fusión en el dímero comprende cualquier proteína de fusión divulgada en la presente. La proteína de fusión dimérica puede comprender dos proteínas de fusión idénticas de la invención. La proteína de fusión dimérica también puede comprender dos proteínas de fusión diferentes de la invención. La proteína de fusión dimérica puede comprender además por lo menos una proteína de fusión que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NO: 40, aminoácidos 20- 766 de la SEQ ID NO: 42, aminoácidos 21-769 de la SEQ ID NO: 44 y aminoácidos 20-768 de la SEQ ID NO: 50, o una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 90% de identidad con la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de la s Eq ID NO: 40, aminoácidos 20-766 de la SEQ ID NO: 42, aminoácidos 21- 769 de la SEQ ID NO: 50.
Realizaciones
La realización 1 es una proteína de fusión que comprende (a) un primer péptido que comprende un dominio de unión al ligando extracelular de un receptor de VEGF que consiste de un dominio similar a Ig d2 de un VEGFR1 y un dominio similar a Ig D3 de un VEGFR2, (b) una región Fc de un anticuerpo que consiste de una región CH2 y una CH3 de IgG1, y (c) un segundo péptido que comprende un dominio de unión al ligando extracelular de un receptor de PDGF que consiste de dominios similares a Ig D1 a D3 de un PDGFRp; en donde la proteína de fusión está dispuesta desde el extremo N-terminal al extremo C-terminal en el orden de (c)-(b)-(a). La proteína de fusión comprende además un primer péptido conector entre la región Fc y el primer o segundo péptido en el extremo C-terminal de la proteína de fusión, en donde el primer péptido conector comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 20 o 24. La proteína de fusión es capaz además de unirse a un VEGF y un PDGF e inhibir la actividad del VEGF y la actividad del PDGF.
La realización 2 es una proteína de fusión de acuerdo con la realización 1, en donde: (a) el dominio de unión al ligando extracelular del receptor de VEGF comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 90% de identidad con la SEQ ID NO: 7; (b) la región Fc del anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 90% de identidad con la SEQ ID NO: 12; y (c) el dominio de unión al ligando extracelular del receptor de PDGF comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 90% de identidad con la SEQ ID NO: 2.
La realización 3 es una proteína de fusión de acuerdo con la realización 2, en donde: (a) el dominio de unión al ligando extracelular del receptor de VEGF comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 7 y 10; (b) la región Fc del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 12 y 15; y (c) el dominio de unión al ligando extracelular del receptor de PDGF comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 2 y 5.
La realización 4 es una proteína de fusión de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 1 a 3, que comprende además un segundo péptido conector entre el segundo o el primer péptido en el extremo N-terminal de la proteína de fusión y la región Fc.
La realización 5 es una proteína de fusión de acuerdo con las realizaciones 1 a 4, en donde la proteína de fusión comprende además un péptido señal unido al extremo N-terminal de la proteína de fusión.
La realización 6 es una proteína de fusión que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 90% de identidad con la SEQ ID NO: 40 o que tiene por lo menos un 90% de identidad con los aminoácidos 20-766 de la SEQ ID NO: 42, los aminoácidos 21-769 de la SEQ ID NO: 44 o los aminoácidos 20-768 de la SEQ ID NO: 50.
La realización 7 es una proteína de fusión de acuerdo con la realización 6, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NO: 40, aminoácidos 20-766 de la SEQ ID NO: 42, aminoácidos 21-769 de la SEQ ID NO: 44 y aminoácidos 20-768 de la SEQ ID NO: 50.
La realización 8 es una molécula de ácido nucleico aislada que codifica la proteína de fusión de cualquiera de las realizaciones 1 a 6.
La realización 9 es una célula huésped que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de cualquiera de las realizaciones 1 a 7.
La realización 10 es un método para producir la proteína de fusión de cualquiera de las realizaciones 1 a 7, que comprende: (1) cultivar una célula huésped que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de cualquiera de las realizaciones 1 a 7 bajo la condición de que se produzca la proteína de fusión; y (2) recuperar la proteína de fusión producida por la célula huésped.
La realización 11 es una composición farmacéutica que comprende la proteína de fusión de cualquiera de las realizaciones 1 a 7 y un portador farmacéuticamente aceptable.
La realización 12 es una composición farmacéutica que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de cualquiera de las realizaciones 1 a 7 y un portador farmacéuticamente aceptable como un portador lipídico (por ejemplo, lipofectamina), productos químicos (por ejemplo, polietilenimina) o un tampón de electroporación.
La realización 13 es la proteína de fusión de acuerdo con las realizaciones 1 a 7 para su uso en el tratamiento o prevención de una afección clínica seleccionada del grupo que consiste de neovascularización, permeabilidad vascular, edema e inflamación, neovascularización coroidea (CNV), degeneración macular húmeda relacionada con la edad (AMD) y atrofia geográfica.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos de la invención son para ilustrar adicionalmente la naturaleza de la invención. Debe entenderse que los siguientes ejemplos no limitan la invención y que el alcance de la invención se determinará por las reivindicaciones adjuntas.
Ejemplo 1 - Generación, expresión y purificación y análisis de proteínas de fusión
Un dominio similar a Ig extracelular de PDGFR (PID) (SEQ ID NO: 2) (Heidaran et al., FASEB J. enero de 1995; 9(1):140-5; Lokker et al., J Biol Chem. 26 de diciembre de 1997; 272(52):33037-44) que tiene los dominios similares a Ig D1-D3 de PDGFRp, y un dominio extracelular similar a Ig de VeGfR (VID) (SEQ ID NO: 7) que tiene el dominio similar a Ig D2 de VEGFR- 1 (VEGFR-1_D2) y el dominio similar a Ig D3 de VEGFR-2 (VeGf R-2_D3) (Holash, J., et al, PNAS, 2002, 99(17):11393-98) se incorporaron en proteínas de fusión. Se colocó un conector peptídico flexible corto, GGGGGS (SeQ ID NO: 20) entre el extremo C-terminal de la región Fc (SEQ ID NO: 12) y el módulo N-terminal (ya sea PID o VID) para asegurar el plegado correcto y minimizar el impedimento estérico. Se incluyó un péptido señal (por ejemplo, SEQ ID NO: 34 o SEQ ID NO: 36) para asegurar que se secretaría la Proteína de fusión 2 o la Proteína de fusión 1 producida. La región Fc de IgG1 humana se incorporó para provocar la dimerización de la proteína de fusión, imitando la dimerización del receptor in vivo y para permitir una fácil purificación de las proteínas de fusión expresadas.
Las secuencias codificantes de las Proteínas de fusión 1 y 2 que tienen las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 38 y 40, respectivamente, se transfectaron y expresaron en la línea celular de riñón embrionario humano (HEK293F). Las proteínas de fusión secretadas se purificaron del sobrenadante del cultivo celular usando cromatografía de proteína G de un paso. Las proteínas se capturaron mediante una columna de afinidad de Proteína G (Thermo-Fisher Scientific), se eluyeron con tampón de pH bajo (3,5) y se neutralizaron con Tris-HCl. Como se muestra en las Figuras 2A-2C se logró una pureza superior al 90% usando el método de purificación de un solo paso. Las Figuras 2A-2C también muestran que las Proteínas de fusión 1, 2, 3 y 5 purificadas tienen el peso previsto (PM ~ 180 kDa) y se dimerizan adecuadamente cuando se expresan en células de mamíferos.
Durante el desarrollo, la secuencia codificante de la Proteína de fusión 1, SEQ ID NO: 37, se incorporó a un vector de expresión. Los resultados de los ensayos de unión competitiva de la Proteína de fusión 1 purificada frente a PDGF y de un ensayo de inhibición del crecimiento celular de BALB/3T3 dependiente de PDGF de la Proteína de fusión 1 indican que existe un efecto posicional sobre la capacidad de unión de la Proteína de fusión 1, por ejemplo, se une a PDGF-BB con mucho menor afinidad (ver, por ejemplo, las Tablas 4 y 6).
Por lo tanto, la Proteína de fusión 2 se construyó reordenando la orientación de VID y PID. La secuencia codificante de la Proteína de fusión 2, SEQ ID NO 39, se incorporó a un vector de expresión. Se transfectaron células huésped HEK293F con el vector de expresión usando una cantidad adecuada de ADN del vector de expresión. Se seleccionó un clon estable en base a los niveles de expresión de proteínas evaluados mediante un ELISA anti-Fc, y se generó un banco de células de investigación (RCB) a partir del clon con los niveles óptimos de expresión de proteínas de fusión. Se usó la Proteína de fusión 2 RCB para la producción de proteínas en matraces agitados, y la proteína se purificó del sobrenadante del cultivo usando resina de afinidad para Proteína A. La proteína se cambió de tampón a tampón fosfato con excipientes. La concentración final de la Proteína de fusión 2 purificada fue de aproximadamente 20 mg/ml.
Se realizó mutagénesis de la Proteína de fusión 2 para generar una variante de la Proteína de fusión 2, es decir, la Proteína de fusión 3, que comprende un residuo de lisina eliminado (K528) en el extremo C-terminal de IgG1 Fc y una mutación de fenilalanina a serina (F150S) en el PID de la Proteína de fusión 2. Se usó un método de mutagénesis por PCR de 2 pasos para eliminar primero la lisina y luego cambiar la fenilalanina a serina. EL constructo final comprende una secuencia codificante de la SEQ ID NO 43. Se transfectaron células huésped CHO-S con el vector de expresión usando una cantidad adecuada de ADN del vector de expresión. Se seleccionó un primer clon estable basándose en los niveles de expresión de proteínas evaluados mediante un ELISA anti-Fc. Esto se usó para producir la Proteína de fusión 3 que tiene la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 21-769 de las SEQ ID NO: 44 (aminoácidos 1-20 de la SEQ ID NO: 44 es una secuencia de péptido señal que se escindió durante la síntesis de proteínas). FACS detectó problemas de monoclonalidad, por lo que se realizó una ronda de clonación. Se seleccionó un segundo clon estable en base a los niveles de expresión, y el clon se usó para generar una Proteína de fusión 4 RCB. La Proteína de fusión 4 RCB se usó tanto para estudios en matraces agitados como para producción de biorreactores. Se descongeló un vial de Proteína de fusión 4 RCB y se expandió en un matraz de agitación de 1 l para producir la Proteína de fusión 4, que tiene la misma secuencia de aminoácidos que la Proteína de fusión 3. Se prepararon seis lotes de proteína purificada usando resina de afinidad de Proteína A (purificación en un paso). La proteína se cambió de tampón a tampón de histidina con excipientes. La concentración final de la Proteína de fusión 4 fue de aproximadamente 20 mg/ml.
Para obtener una cantidad suficiente de Proteína de fusión 4, se hizo funcionar un biorreactor (BR) de 7L
con un volumen de trabajo final de aproximadamente 5 l. Se usaron procedimientos de operación de plataforma, ajustes de parámetros y estrategias de control, y se siguieron el programa de tipo de medio y de alimentación. El título de producto final fue de 0,21 g/l.
Las muestras de proteínas de fusión purificadas se procesaron adicionalmente mediante clarificación, cromatografía de afinidad de proteína A, un primer paso de ultrafiltración, cromatografía de exclusión por tamaño, un segundo paso de ultrafiltración, diálisis y un tercer paso de ultrafiltración para obtener el producto final.
Para generar la Proteína de fusión 5, que tiene la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 20-768 de la SEQ ID NO: 50 (los aminoácidos 1-19 de la SEQ ID NO: 50 son una secuencia de péptido señal que se escindió durante la síntesis de proteínas), la secuencia de ADN que codifica la proteína de fusión 5 se optimizo con codones para la expresión en células CHO. El ADN optimizado con codones sintetizado, con una secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 49, se clonó en un vector de expresión. Se sembraron células huésped CHO K1 a 2 x 105 células/ml en CD CHO (Gibco 12490-003) que contenía glutamina 4 mM (J.T Baker 2078-06) y suplemento HT al 1% (Gibco 11067-030) 72 horas antes de la transfección. Las células huésped se incubaron en un agitador Infors (36,5° C, 75% de humedad, 6% de CO2, 110 RPM) y se contaron para determinar la densidad celular antes de su uso. Se añadió una cantidad adecuada de ADN plasmídico de expresión a las células huésped (volumen de trabajo de 1 l o 5 l), y se añadió reactivo de transfección a base de polímeros. Los cultivos transfectados se incubaron en un agitador Infors (36,5° C, 75% de humedad, 6% de CO2, 110 RPM) durante 4 horas y se añadió una solución de alimentación patentada. Luego, los cultivos transfectados se incubaron en un agitador Infors (32° C, 75% de humedad, 6% de CO2, 110 RPM). Los cultivos transfectados se recogieron el día 10 después de la transfección. Los sobrenadantes se purificaron para la generación de materiales de investigación. El proceso de purificación incluyó clarificación, cromatografía de afinidad de proteína A, concentración por Amicon Ultracel, cromatografía de exclusión por tamaño, diálisis por Slide-A-Lyzer y concentración final por Amicon Ultracel en el tampón de formulación.
La Proteína de fusión 6, que tiene los aminoácidos 20-766 de la SEQ ID NO: 42, se derivó de la Proteína de fusión 5 eliminando los dos primeros aminoácidos (QG) de la Proteína de fusión 5, en donde los aminoácidos 1-19 de la SEQ ID NO: 42 son una secuencia de péptido señal que se escindió durante la síntesis de proteínas. El inserto de ADN se generó mediante PCR usando el vector de expresión de la Proteína de fusión 5 como plantilla, y se clonó la secuencia de ADN que codifica la Proteína de fusión 6, con una secuencia de ácidos nucleicos de la s Eq ID NO: 41, en un vector de expresión. Los procedimientos de cultivo y purificación fueron los mismos que para la Proteína de fusión 5. La concentración final de la Proteína de fusión 6 fue de aproximadamente 80 mg/ml en el tampón de formulación designado (en base a la absorción a 280 nm).
En conjunto, estos datos indican que se han construido, expresado, purificado y caracterizado proteínas de fusión que tienen actividades anti-VEGF y anti-PDGF simultáneas.
Ejemplo 2 : Afinidad de unión de las proteínas de fusión a VEGF165
Se usó un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) de unión directa para medir la afinidad de unión de las proteínas de fusión de la invención a VEGF165, una variante de corte y empalme de VEGF-A. Se usó un VEGF Trap sintetizado como Control positivo 1.
VEGF Trap es un receptor de VEGF soluble que fue diseñado para uso terapéutico y actualmente está aprobado por la fDa para tratar AMD. VEGF Trap contiene el segundo dominio similar a Ig (D2) de VEGFR1 fusionado al tercer dominio similar a Ig (D3) de VEGFR2 fusionado a la región Fc de IgG1 humana (Holash, J. y col., Proc Natl Acad Sci USA. 20 de agosto de 2002; 99(17):11393-8). VEGF Trap se dirige a VEGF-A, VEGF-By P1GF.
Se añadieron 100 pl de una solución de recubrimiento (1 pg/ml de VEGF165 en 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,2) a cada pocillo de una placa ELISA de 96 pocillos y la placa se incubó durante la noche a 4°C. Los pocillos se lavaron dos veces con 400 pl de tampón PBS 1x y el exceso de líquido se eliminó cuidadosamente con una toalla de papel.
Se añadieron 400 pl de una solución de bloqueo (5 g de leche desnatada no grasa en 100 ml de PBS 1x) a cada pocillo y la placa se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Los pocillos se lavaron dos veces con tampón PBS 1x.
La proteína de fusión y las muestras de control se diluyeron en serie tres veces en solución de bloqueo, con una concentración de proteína más alta de 10 mM. Se añadieron 100 pl de las muestras diluidas en serie a cada pocillo. La placa se cubrió y se incubó en un agitador de placas (~100 rpm) durante 1 hora a temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron tres veces con tampón de lavado (1x PBS, Tween-20 al 0,05%).
Se añadieron a cada pocillo 100 pl de anticuerpos específicos Fc de IgG anti-humanos de cabra conjugados con peroxidasa de rábano picante diluidos a 1:2500 en solución de bloqueo. Las placas se sellaron y se incubaron en un agitador de placas durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron tres veces con
tampón de lavado.
Se añadieron 100 |jl de 3,5,3',5'-tetrametilbencidina (TMB) a cada pocilio y las placas se incubaron durante de 3 a 5 minutos para permitir que tuviera lugar la reacción. Para detener la reacción, se añadieron a cada pocillo 100 j l de solución de parada (HCl 1 N).
La densidad óptica (OD) de cada pocillo se determinó usando un lector de placas ELISA a una longitud de onda de absorbancia de 450 nm. Se representó gráficamente la absorbancia frente a la concentración de proteína de la proteína de fusión o el control, y se determinó la concentración a la que la señal era la mitad de la concentración efectiva máxima (EC50).
La afinidad de unión, expresada como el valor de EC50, fue de entre 0,22 y 0,93 nM para las proteínas de fusión de la invención probadas. Los resultados de ELISA se muestran en la Tabla 1.
Tabla 1
Los resultados de este ejemplo mostraron que las proteínas de fusión de acuerdo con las realizaciones de la invención, como las Proteínas de fusión 1 a 5, se unen a VEGF165 con una alta afinidad. Ver también la Figura 3.
Ejemplo 3 - Afinidad de unión de las proteínas de fusión a PDGF
Se usó un ELISA de unión directa para medir la afinidad de unión de las proteínas de fusión de la invención a PDGF. Se usó un PDGF Trap sintetizado como Control positivo 2.
El PDGF Trap es un receptor de PDGF soluble que se diseñó para su uso como control positivo. El PDGF Trap contiene el segundo dominio similar a Ig (D1 a D3) de PDGFRp fusionado a la región Fc de IgG1 humana. (Lu y col. Am J Obstet Gynecol., 2008, 198(4): 477.e1-e10). El PDGF Trap se dirige a PDGF-BB, PDGF-DD y PDGF-AB.
Se añadieron 100 j l de una solución de recubrimiento (1 jg/ml de PDGF-BB en solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x, pH 7,2) a cada pocillo de una placa ELISA de 96 pocillos y la placa se incubó durante la noche a 4° C. Los pocillos se lavaron dos veces con 400 j l de tampón PBS 1x y el exceso de líquido se eliminó cuidadosamente con una toalla de papel.
Se añadieron 400 j l de una solución de bloqueo (1 g de albúmina de suero bovino en 100 ml de PBS 1x) a cada pocillo y la placa se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Los pocillos se lavaron dos veces con tampón PBS 1x.
La proteína de fusión y las muestras de control se diluyeron en serie tres veces en solución de bloqueo, con una concentración de proteína más alta de 10 mM. Se añadieron 100 j l de las muestras diluidas en serie a cada pocillo. La placa se cubrió y se incubó en un agitador de placas (~100 rpm) durante 1 hora a temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron tres veces con tampón de lavado (PBS 1x, Tween-20 al 0,05%).
Se añadieron a cada pocillo 100 pl de anticuerpos específicos Fc de IgG anti-humanos de cabra conjugados con peroxidasa de rábano picante diluidos a 1:2500 en solución de bloqueo. Las placas se sellaron y se incubaron en un agitador de placas durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron tres veces con tampón de lavado.
Se añadieron 100 j l de 3,5,3',5'-tetrametilbencidina (TMB) a cada pocillo y las placas se incubaron durante de 3 a 5 minutos para permitir que tuviera lugar la reacción. Para detener la reacción, se añadieron a cada pocillo 100 j l de solución de parada (HCl 1 N).
La densidad óptica (OD) de cada pocillo se determinó usando un lector de placas ELISA a una longitud de onda de absorbancia de 450 nm. Se representó gráficamente la absorbancia frente a la concentración de proteína de la proteína de fusión o el control, y se determinó la concentración de la proteína de fusión a la que la señal era la mitad de la concentración efectiva máxima (EC50).
La afinidad de unión, expresada como el valor de EC50, fue de aproximadamente 0,16 a 2,5 nM para las proteínas de fusión de la invención probadas. Los resultados de ELISA se muestran en la Tabla 2.
Tabla 2
Los resultados de este ejemplo mostraron que las proteínas de fusión de la invención, por ejemplo, las Proteínas de fusión 1 a 5, se unen a PDGF con una alta afinidad. Ver también la Figura 4.
Ejemplo 4 - Unión competitiva de las proteínas de fusión a VEGF165
Se usó un ensayo de unión competitiva para evaluar la afinidad de unión de las proteínas de fusión de la invención a VEGF165. Se usó un VEGF Trap sintetizado como Control positivo 1.
La proteína de fusión y las muestras de control se diluyeron en serie tres veces en solución de bloqueo, con una concentración de proteína más alta de 10 mM. Se incubaron volúmenes iguales de las muestras diluidas con 10 pM de VEGF165 para una concentración final de 5 pM de VEGF-A (R&D System) durante la noche a temperatura ambiente.
Se añadieron 50 pl de diluyente de ensayo del kit Quantikine ELISA Human VEGF (R&D Systems, Inc.) a cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Se añadieron 200 pl de los estándares, controles o proteínas de fusión a los pocillos apropiados por duplicado. Las placas se sellaron y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente y luego se lavaron tres veces con tampón de lavado.
Se añadieron a cada pocillo 200 pl del conjugado de VEGF165 proporcionado en el kit, y las placas se sellaron e incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente. Las placas se lavaron tres veces.
Se añadieron a cada pocillo 200 pl de la solución de sustrato proporcionada en el kit, y las placas se sellaron y se incubaron durante 20 minutos a temperatura ambiente. Para detener la reacción, se añadieron a cada pocillo 50 pl de la solución de parada proporcionada en el kit.
La OD de cada pocillo se determinó usando un lector de placas ELISA a una longitud de onda de absorbancia de 450 nm y 540 nm (o 570 nm). La concentración de VEGF165 no unido (VEGF165 libre) se representó gráficamente frente a la concentración de proteína de la proteína de fusión o el control, y se determinó la concentración de la proteína de fusión en la que la señal del VEGF165 libre se redujo en un 50% (IC50).
Se determinó que el valor de IC50 de la proteína de fusión de la invención era de aproximadamente 3,78 a 4,67 pM. Los resultados del ensayo de unión competitiva se muestran en la Tabla 3.
Tabla 3
Los resultados de este ejemplo confirmaron que las proteínas de fusión de la invención, por ejemplo, las Proteínas de fusión 1, 2 y 3, se unen a VEGF165 con una alta afinidad. Ver también las Figuras 5A y 6A.
Ejemplo 5 - Unión competitiva de las proteínas de fusión a PDGF-BB
Se usó un ensayo de unión competitiva para evaluar la afinidad de unión de las proteínas de fusión de la invención a PDGF-BB. Se usó un PDGF Trap sintetizado como Control positivo 2.
La proteína de fusión y las muestras de control se diluyeron en serie tres veces en solución de bloqueo, con
una concentración de proteína más alta de 10 mM. Se incubaron volúmenes iguales de las muestras diluidas con 20 pM de PDGF-BB para una concentración final de 10 pM durante la noche a temperatura ambiente.
Se añadieron 100 j l de diluyente de ensayo del kit Quantikine ELISA Human PDGF-BB a cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Se añadieron 100 j l de los estándares, controles o proteínas de fusión a los pocillos apropiados por duplicado. Las placas se sellaron y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente y luego se lavaron cuatro veces con tampón de lavado.
Se añadieron a cada pocillo 200 j l del conjugado PDGF-BB proporcionado en el kit, y las placas se sellaron e incubaron durante 1,5 horas a temperatura ambiente. Las placas se lavaron cuatro veces.
Se añadieron a cada pocillo 200 j l de la solución de sustrato proporcionada en el kit, y las placas se sellaron y se incubaron durante 20 minutos a temperatura ambiente. Para detener la reacción, se añadieron a cada pocillo 50 j l de la solución de parada proporcionada en el kit.
La OD de cada pocillo se determinó usando un lector de placas ELISA a una longitud de onda de absorbancia de 450 nm y 540 nm (o 570 nm). Se representó el PDGF-BB libre frente a la concentración de proteína de la proteína de fusión o el control, y se determinó la concentración de la proteína de fusión en la que la señal de PDGF-BB libre se redujo en un 50% (IC50).
Se determinó que el valor de IC50 de la proteína de fusión de la invención era de aproximadamente 0,125 a 200 nM. Los resultados del ensayo de unión competitiva se muestran en la Tabla 4.
Tabla 4
Los resultados de Este ejemplo confirmaron que las proteínas de fusión de la invención, por ejemplo, las Proteínas de fusión 2 y 3, se unen a PDGF con una alta afinidad. Ver también las Figuras 5B y 6B.
Ejemplo 6 - Inhibición de la proliferación de HUVEC por las proteínas de fusión
Se llevó a cabo un ensayo de proliferación de células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) para probar la funcionalidad de las proteínas de fusión de la invención. Se usó un VEGF Trap sintetizado como Control positivo 1.
Se añadieron 100 j l de una solución de revestimiento (gelatina al 1% en agua bidestilada) a cada pocillo de una placa ELISA de 96 pocillos y la placa se incubó durante 2 horas o durante la noche a 37° C. Los pocillos se lavaron dos veces con tampón p Bs 1x.
Se añadieron a cada pocillo 3500 recuentos de células endoteliales de vena umbilical humana en medio de crecimiento de células endoteliales, y la placa se incubó durante la noche a 37° C.
Las muestras de proteína de fusión se diluyeron en tampón de ensayo (Medio 1991x Sales de Earle, suero bovino fetal al 10%, HEPES 10 mM, 1x antibiótico/antimicótico), con una concentración de proteína más alta de 300 nM. Las muestras de proteína de fusión se mezclaron con VEGF165 (8 ng/ml) y las mezclas se incubaron durante la noche a temperatura ambiente. Luego, los pocillos se lavaron con 200 j l de PBS 1x.
Se añadieron 100 j l de la mezcla de VEGFWmuestra a cada pocillo, y las placas se incubaron durante 72 horas a 37° C con 5% de CO2. Después de la incubación, se añadieron 10 j l de reactivo de detección MTS (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio) metosulfato de fenazina en PBS destilado) a cada pocillo, y las placas se incubaron a 37° C durante 2,5 horas..
La OD de cada pocillo se determinó usando un lector de placas ELISA a una longitud de onda de absorbancia de 490 nm. La absorbancia se representa frente a la concentración de proteína de la proteína de fusión o el control, y se determinó la concentración a la que la proliferación celular se inhibió en un 50% (IC50).
Se determinó que la inhibición de la proliferación celular (IC50) era entre 0,058 y 0,285 nM para las proteínas de fusión de la invención ensayados. Los resultados del ensayo de proliferación se muestran en la Tabla 5.
Tabla 5
Los resultados de este ejemplo mostraron que las proteínas de fusión de la invención, por ejemplo, las Proteínas de fusión 1 a 5, inhibían el crecimiento de células HUVEC dependiente de VEGF. Ver también la Figura 7.
Ejemplo 7 - Inhibición de la proliferación de BALB/3T3 por las proteínas de fusión
Se llevó a cabo un ensayo de proliferación celular usando fibroblastos 3T3 derivados de ratones BALB para probar la funcionalidad de las proteínas de fusión de la invención. Se usó un PDGF Trap sintetizado como Control positivo 2.
Se añadieron 4000 recuentos de células de fibroblastos 3T3 de ratón en DMEM (piruvato de sodio 1 mM, L-glutamina 4 mM, albúmina de suero bovino al 10%, 1x antibiótico/antimicótico) a cada pocillo, y la placa se incubó durante la noche a 37° C.
Las muestras de proteínas de fusión se diluyeron en tampón de ensayo (piruvato de sodio 1 mM, L-glutamina 4 mM, albúmina de suero bovino al 0,5%, 1x antibiótico/antimicótico), con una concentración de proteína más alta de 300 nM. Las muestras de proteína de fusión se mezclaron con PDGF (8 ng/ml) y las mezclas se incubaron durante la noche a temperatura ambiente. Luego, los pocillos se lavaron con 200 pl de p Bs 1x.
Las células se privaron de alimento con tampón de ensayo a 37° C con 5% de CO2 durante 4 horas. Se añadieron 100 pl de la mezcla de PDGF/muestra a cada pocillo, y las placas se incubaron durante 72 horas a 37° C con 5% de CO2. Después de la incubación, se añadieron 10 pl de reactivo de detección MTS a cada pocillo y las placas se incubaron a 37° C durante 2,5 horas.
Se determinó la OD de cada pocillo usando un lector de placas ELISA a una longitud de onda de absorbancia de 490 nm. La absorbancia se representa frente a la concentración de proteína de la proteína de fusión o el control, y se determinó la concentración a la que la proliferación celular se inhibió en un 50% (IC50).
Se calculó que la IC50 estaba entre 0,45 y 1000 nM para las proteínas de fusión probadas de la invención. Los resultados del ensayo de proliferación se muestran en la Tabla 6.
Tabla 6
Los resultados de este ejemplo mostraron que las fusiones de la invención, por ejemplo, las Proteínas de fusión 1 a 5, inhibían el crecimiento dependiente de PDGF de las células BALB/3T3. Ver también la Figura 8.
Ejemplo 8 - Inhibición de fugas inducidas por VEGF en conejos Dutch Belted por las proteínas de fusión Las proteínas de fusión de la invención se probaron en un modelo in vivo de neovascularización retiniana para determinar su eficacia en la prevención de fugas vasculares. En este modelo, el VEGF se inyecta por vía intravítrea en el vítreo de los ojos del conejo para inducir una neovascularización incontrolada de la retina y la fuga posterior. Se usaron Avastin®, un anticuerpo monoclonal humanizado recombinante que bloquea la angiogénesis mediante la inhibición de VEGF-A, y Eylea, una proteína de fusión recombinante que consiste de porciones de VEGFR1 y VEGFR2 humanos fusionados a la porción Fc de IgG1 humana, como Controles Positivos 3 y 4.
Se anestesiaron conejos Dutch Belted usando isoflurano (3-5%) y se trataron sus ojos con solución oftálmica de Betadine. Luego, se lavaron los ojos de los conejos con solución salina estéril y se aplicó a la superficie ocular clorhidrato de lidocaína (inyectable al 2%) o proparacaína (0,5%).
El día 1, se inyectaron intravítreamente a conejos Dutch Belted proteínas de fusión de la invención, control de vehículo (negativo) o controles de referencia (positivos) a dosis predeterminadas usando una jeringuilla de insulina BD 300 pl (31 ga x 5/16 pulgadas). La aguja se insertó a través del cuadrante dorsotemporal del ojo, aproximadamente 3-4 mm posterior a la extremidad y 3-4 mm lateral a los músculos rectos dorsales, y se administraron 50 pl de solución. El día 3, se inyectó VEGF165 en los mismos ojos.
Se realizaron angiogramas con fluoresceína (FA) en todos los grupos de dosificación 3 días después de la inducción de VEGF (día 6) para evaluar la filtración y la tortuosidad usando una escala de 0 (normal) a 4 (grave).
Los signos de irritación ocular se puntuaron usando el sistema de puntuación Draize antes de la dosificación de la proteína de fusión, antes de la inducción de VEGF y antes de las evaluaciones de FA. De acuerdo con el análisis de Draize, todos los ojos de los conejos eran normales antes del inicio de la dosificación, y no se observaron descubrimientos relacionados con el fármaco durante el transcurso del estudio. Los descubrimientos que se puntuaron usando el sistema Draize fueron transitorios y se observaron en todos los grupos de dosis, por lo que probablemente se debieron al procedimiento asociado con la administración de la dosis intravítrea.
Los FA asociados con el grupo de control del vehículo tuvieron la puntuación media más alta (2,58) asociada con la filtración y la tortuosidad de la vasculatura retiniana. Los dos grupos de control positivo de referencia tuvieron puntuaciones medias de 0,25 y 0, lo que indica una reducción significativa en la filtración y tortuosidad de la vasculatura retiniana. Las proteínas de fusión probadas de la invención tenían una puntuación media de 0,167, mostrando una eficacia en la reducción de la filtración y tortuosidad retiniana inducida por VEGF comparable a los controles positivos. Los resultados del ensayo in vivo se muestran en la Tabla 7.
Tabla 7
Ejemplo 9 - Inhibición de respuesta a la dosis de fugas inducidas por VEGF en conejos Dutch Belted por las proteínas de fusión
Las proteínas de fusión de la invención se probaron en un modelo in vivo de neovascularización retiniana a dosis variables para determinar su eficacia de respuesta a la dosis en la prevención de fugas vasculares. En este modelo, el VEGF165 se inyecta por vía intravítrea en el vítreo de los ojos del conejo para inducir una neovascularización incontrolada de la retina y la fuga posterior.
El día 1, se inyectó intravítreamente a conejos Dutch Belted Proteína de fusión 5 de acuerdo con una realización de la invención a varias dosis, control de vehículo (negativo) o controles de referencia (positivos). La inducción de VEGF se llevó a cabo el día 3.
Los FA se realizaron en todos los grupos de dosificación 3 días después de la inducción de VEGF (día 6) para evaluar la filtración y la tortuosidad usando una escala de 0 (normal) a 4 (grave).
Los signos de irritación ocular se anotaron usando el sistema de puntuación Draize antes de la dosificación de la proteína de fusión, antes de la inducción de VEGF y antes de las evaluaciones de FA. De acuerdo con el análisis de Draize, todos los ojos de los conejos eran normales antes del inicio de la dosificación y no se observaron descubrimientos relacionados con el fármaco durante el transcurso del estudio. Los descubrimientos que se puntuaron usando el sistema Draize fueron transitorios y se observaron en todos los grupos de dosis, por lo que probablemente se debieron al procedimiento asociado con la administración de la dosis intravítrea.
Para la primera inducción de VEGF, los FA asociados con el grupo de control del vehículo tuvieron la puntuación media más alta (3,4) asociada con la filtración y la tortuosidad de la vasculatura retiniana. Los dos grupos de control positivo de referencia tuvieron puntuaciones medias de 0, lo que indica una reducción significativa en la filtración y la tortuosidad de la vasculatura retiniana. La proteína de fusión probada de la invención (Proteína de fusión 5) tenía puntuaciones de 0,08, 0,42 y 0,17 a dosis de 100, 500 y 1000 pg, respectivamente, mostrando una eficacia para reducir la filtración y tortuosidad retiniana inducida por VEGF comparable con los controles positivos.
Los resultados del ensayo in vitro de respuesta a la dosis se muestran en la Tabla 8.
Tabla 8
Ejemplo 10 - Reducción del tamaño de la lesión en la neovascularización coroidea (CNV) inducida por láser en ratas por las proteínas de fusión
Los ojos de Brown Norway se dilatarán con una solución de Ciclogyl al 1% y se protegerán de la luz. Después de la dilatación, las ratas serán anestesiadas usando una mezcla de ketamina y xilacina. Se introducirán tres quemaduras por lesiones en la retina de cada ojo usando un láser a 532 nm el día 1.
El día 3, los animales serán anestesiados con una mezcla de ketamina y xilazina, sus ojos se dilatarán y se inyectarán por vía intravítrea 5 pl de proteínas de fusión de acuerdo con realizaciones de la invención, control de vehículo (negativo) o controles de referencia (positivos) a dosis predeterminadas en ambos ojos de un animal usando una jeringuilla Hamilton con aguja de calibre 33.
El día 22, los animales recibirán una inyección IP de fluoresceína sódica al 10% a 1 pl/g de peso corporal. Las imágenes del fondo de ojo se tomarán antes de la introducción de la lesión, después de las quemaduras por lesiones para confirmar las lesiones con éxito, y el día 22 usando un fondo de ojo de animales pequeños Micron III (Phoenix Research). El tamaño de la lesión se determinará y comparará entre los grupos de dosis.
Ejemplo 11 - Reducción del tamaño de la lesión en CNV inducida por láser en monos por las proteínas de fusión
Se establecerá un modelo de CNV inducida por láser en monos. Se introducirán de seis a nueve quemaduras alrededor de la mácula de cada ojo usando fotocoagulación con láser de diodo de 532 nm, y se inyectarán por vía intravítrea 0,5 mg de proteínas de fusión de la invención el mismo día.
Los animales se sedarán con pentobarbitona soluble al 2,5% intravenosa (1 ml/kg) 20 días después. Se fijarán los párpados para mantener los ojos abiertos y se tomarán fotografías en color con una cámara de fondo de ojo.
Luego, se inyectará colorante de fluoresceína (20% de fluoresceína sódica; 0,05 ml/kg) en una vena de una extremidad inferior. Se tomarán fotografías en varios puntos temporales después de la inyección del colorante, incluyendo la fase arterial, la fase arteriovenosa temprana y varias fases arteriovenosas tardías, para monitorizar la fuga de fluoresceína asociada con las lesiones de CNV.
Ejemplo 12 - Inhibición del crecimiento tumoral humano en ratones con xenoinjertos por las proteínas de fusión
Pueden usarse varias células cancerosas humanas, como células Hep3B de carcinoma hepatocelular humano (ATCC# HB-8064) y células LoVo de cáncer colorrectal humano (ATCC# CCL-229), para establecer modelos de xenoinjerto en ratones desnudos.
Para evaluar los efectos inhibidores de las proteínas de fusión de la invención sobre el crecimiento tumoral, se implantarán células tumorales en ratones desnudos, y se administrarán varias concentraciones de proteínas de fusión de acuerdo con realizaciones de la invención, que varían de 0,1 a 10 mg/kg á a los ratones por vía intravenosa dos veces a la semana. El crecimiento del tumor se medirá semanalmente durante un máximo de 7 semanas.
Ejemplo 13 - Evaluación farmacocinética de las proteínas de fusión en ratas y monos
Se evaluará la farmacocinética de las proteínas de fusión de la invención en animales. Se administrará un intervalo de 10 a 300 mg/kg de proteínas de fusión de acuerdo con las realizaciones de la invención a ratas o monos mediante inyección subcutánea o inyección intravenosa. Se obtendrán muestras de sangre en diferentes puntos
Claims (13)
1. Una proteína de fusión que comprende:
a. un primer péptido que comprende un dominio de unión al ligando extracelular de un receptor de VEGF, en donde el dominio de unión al ligando extracelular del receptor de VEGF consiste de un dominio similar a Ig D2 de un VEGFR1 y un dominio similar a IG D3 de un VEGFR2,
b. una región Fc de un anticuerpo, en donde la región Fc del anticuerpo consiste de una región CH2 y una CH3 de IgG1, y
c. un segundo péptido que comprende un dominio de unión al ligando extracelular de un receptor de PDGF, en donde el dominio de unión al ligando extracelular del receptor de PDGF consiste de dominios similares a Ig D1 a D3 de un PDGFRp;
en donde la proteína de fusión está dispuesta desde el extremo N-terminal al extremo C-terminal en el orden de (c)-(b)-(a);
en donde la proteína de fusión comprende además un primer péptido conector entre la región Fc y el primer o segundo péptido en el extremo C-terminal de la proteína de fusión, en donde el primer péptido conector comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 20 o 24; y
en donde la proteína de fusión es capaz de unirse a un VEGF y un PDGF e inhibir la actividad del VEGF y la actividad del PDGF.
2. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en donde:
a. el dominio de unión al ligando extracelular del receptor de VEGF comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 90% de identidad con la SEQ ID NO: 7;
b. la región Fc del anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 90% de identidad con la SEQ ID NO: 12; y
c. el dominio de unión al ligando extracelular del receptor de PDGF comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 90% de identidad con la SEQ ID NO: 2.
3. La proteína de fusión de la reivindicación 2, en donde:
a. el dominio de unión al ligando extracelular del receptor de VEGF comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 7 y 10;
b. la región Fc del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 12 y 15; y
c. el dominio de unión al ligando extracelular del receptor de PDGF comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 2 y 5.
4. La proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que comprende además un segundo péptido conector entre el segundo o el primer péptido en el extremo N-terminal de la proteína de fusión y la región Fc.
5. La proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde la proteína de fusión comprende además un péptido señal enlazado al extremo N-terminal de la proteína de fusión.
6. Una proteína de fusión que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 40, los aminoácidos 20-766 de la SEQ ID nO: 42, los aminoácidos 21 769 de la SEQ ID NO: 44 o los aminoácidos 20-768 de la SEQ ID NO: 50.
7. Una proteína de fusión, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NO: 40, los aminoácidos 20-766 de la SEQ ID NO: 42, los aminoácidos 21-769 de la SeQ ID NO: 44 y los aminoácidos 20-768 de la SEQ ID NO: 50.
8. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica la proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
9. Una célula huésped que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
10. Un método para producir la proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende: (1) cultivar una célula huésped que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, con la condición de que se produzca la proteína de fusión; y (2) recuperar la proteína de fusión producida por la célula huésped.
11. Una composición farmacéutica que comprende la proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y
un portador farmacéuticamente aceptable.
12. Una composición farmacéutica que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y un portador farmacéuticamente aceptable.
13. Una proteína de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7 o una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 11 o 12 para su uso en un método de tratamiento o prevención de una condición clínica seleccionada del grupo que consiste de trastornos caracterizados por neovascularización o permeabilidad vascular, edema, inflamación, neovascularización coroidea (CNV), degeneración macular húmeda relacionada con la edad (AMD) y atrofia geográfica.
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