KR20170117107A - Vegf 및 pdgf의 리간드 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질 - Google Patents

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올제네시스 바이오테라퓨틱스 아이엔씨.
에이피 바이오사이언시스, 아이엔씨.
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Abstract

PDGF 결합 부위, VEGF 결합 부위 및 Fc 항체 영역을 포함하는 융합 단백질이 기재되어 있다. 또한, 융합 단백질을 코딩하는 핵산, 융합 단백질을 포함하는 조성물, 및 혈관 투과성, 부종 또는 염증과 같은 비정상적인 혈관 신생을 특징으로 하는 임상 증상을 치료 또는 예방하기 위한 융합 단백질의 사용 방법이 기재되어 있다.

Description

VEGF 및 PDGF의 리간드 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질
본 출원은 2015년 3월 11일 출원된 미국 특허출원 제 62/131,261호에 대하여 35 U.S.C. §119(e)의 우선권의 이익을 주장하며, 그 기재는 본원에 참조로서 삽입된다.
본 출원은 EFS-Web을 통해 전자 제출된 2016년 3월 3일 제조되고, 약 88.9 킬로바이트 용량의 파일 제목 "688947-3WO_ST25"을 갖는 ASCII 포맷의 서열 목록을 포함한다. 서열 목록은 명세서의 일부로서 EFS-web을 통해 제출된 것이고, 이는 본 출원에 전체로서 참조로 삽입된다.
본 발명은 PDGF 결합 부분(binding portion), VEGF 결합 부분, 및 Fc 항체 영역, 융합 단백질을 코딩하는 핵산 및 발현 벡터, 이의 재조합 세포를 포함하는 융합 단백질, 및 융합 단백질을 포함하는 조성물에 관한 것이다. PDGF 및 VEGF 기능을 억제하기 위한 융합 단백질의 사용 방법도 제공된다.
혈관 신생(Angiogenesis)은 기존 혈관으로부터 새로운 혈관을 형성하는 것으로, 태아 발달 및 조직 수리와 관련된 정상적이고 중요한 과정이다. 혈관 신생은 혈관 신생 인자 및 항 혈관 신생 인자 모두에 의해 고도로 조절되며, 내피 세포 이동 및 증식, 혈관 성숙 및 재형성, 및 세포외기질의 분해를 포함한다. 혈관 신생은 정상적인 성장 및 발달에 중요한 과정임에 불구하고, 또한 종양 성장, 허혈 및 염증에서 핵심적인 역할을 한다.
급성 조절되지 않는 안구 혈관 신생 과정 동안에, 혈관 투과성이 증가되어, 혈관의 취약성과 누출로 이어져 출혈과 체액 및 단백질 삼출물이 축적되고, 궁극적으로 혈관 기능 부전이나 혈관 과증식을 유발한다. 안구 혈관 신생은 노인성 황반 변성(AMD), 당뇨병성 신경병증(PDR), 및 각막 신생 혈관증과 같은 시각 장애의 스펙트럼에서 발생할 수 있다. AMD와 PDR 모두 망막 신경 세포의 구조와 기능을 손상시켜 궁극적으로 시각 상실을 일으킬 수 있다. 치료를 받지 않으면 비정상적인 혈관이 섬유성 흉터를 유발하여 망막 기능에 돌이킬 수 없는 손상을 일으켜 결국 실명을 초래할 수 있다(Zhang and Ma, Prog Retin Eye Res 2007 Jan; 26 (l): 1-37). 각막 혈관 신생은 유사하게 각막의 투명성을 감소시키고 시력 손실을 야기한다.
혈관 내피 성장 인자(VEGF)는 혈관 신생에 중요한 역할을 한다. 인간 VEGF 패밀리는 VEGF-A VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E 및 태반 성장 인자(PIGF)를 포함한다. 또한 VEGFA, VEGF-B 및 PIGF의 여러 가지 동형 단백질(isoform)이 선택적 RNA 이어맞추기(alternative RNA splicing)를 통해 생성된다(Sullivan and Brekken, MAbs. 2010 Mar-Apr, 2 (2): 165-75). VEGF-A는 패밀리의 프로토타입 멤버(prototypic memver)이며, 가장 잘 특성화되어 있다. VEGF-A는 내피 세포에 분열 형성 인자(mitogenic factor)로서 작용하고, 내피 세포 생존 및 증식을 촉진하고, 세포 이동을 유도하고, 미세 혈관 투과성을 증가시키는 것으로 나타났다. VEGF 패밀리의 단백질은 세포 표면 VEGF 수용체(VEGFRs)의 세포 외 영역에 결합하여 VEGF 신호 전달 경로를 활성화시켜 VEGF 신호 전달 경로를 활성화시킨다.
VEGFR 단백질은 3 가지 유형이 있고: VEGFR1, VEGFR2 및 VEGFR3, 이들은 각각 7 개의 면역 글로불린(Ig)-유사 도메인을 포함하는 세포 외 영역을 함유한다. VEGFRs의 세포 외 영역은 상이한 VEGF 단백질에 결합한다. 예를 들어, VEGFR-1(Flt-1)은 VEGF-A, VEGF-B 및 PIGF에 결합하고, VEGFs의 유인 수용체(decoy receptor) 또는 VEGFR-2의 조절자(regulator)로서 기능 할 수 있다. VEGFR-2(KDR/Flk-1)는 모든 VEGF 동형 단백질(isoform)에 결합하고, VEGF-유도성 혈관 신생 신호 전달의 주요 매개체이다. VEGFR-3(Flt-4)는 VEGF-C 및 VEGF-D에는 결합하지만 VEGF-A에는 결합하지 않고, 림프관 형성의 매개체로서 기능한다.
고분자량 변이체 VEGF206 및 VEGF189K는 세포외막에 단단히 결합되어 있으며, VEGF 수용체와 상호 작용하지 않는다. VEGF165가 우세한(predominant) 가용성 변이체인 반면, VEGF121 및 VEGF145 또한 분해 생성물 VEGF110와 마찬가지로 VEGFR1 및 VEGFR2 수용체에 결합하는 가용성 변이체이다(Bhisitkuk, Br J Ophthalmol. 2006 Dec; 90 (12): 1542-7).
항체, 가용성 VEGF 수용체 또는 VEGF 티로신 키나아제 활성의 억제제로 VEGF 활성을 차단하는 것은 AMD와 같은 혈관 신생형 장애를 치료하는데 사용된 전략이다. 항VEGF 치료법은 일반적으로 시각 기능을 안정화시키거나 향상시킴에도 불구하고, 모든 치료된 눈의 약 절반에서 치료 2 년 이내에 망막하 흉터 또는 섬유증이 발생하는 것으로 보고되었다(Daniel 등, Ophthalmology. 2014 Mar; 121 (3) : 656-66). 또한, VEGF만을 표적으로 하는 것은 새로운 혈액 소포(blood vesicles)의 형성을 방지하지만, 새로 형성된 혈관에는 영향을 주지 않는다.
최근 데이터는, 혈관 주위 세포(pericyte)가 항VEGF 내성, 새로운 혈관의 안정화 및 흉터에 역할을 할 수 있다고 제시한다. 혈관 주위 세포는 내피 세포와 상호 작용하여 혈액-망막 장벽의 형성에 기여한다. 특히, 혈관 주위 세포는 혈관 내피 세포에 생존 신호를 제공하여, 그들을 VEGF 감소 치료에 대해 내성을 갖도록 한다(Benjamin et al, Development. 1998 May; 125 (9): 1591-8, Patel, Retina, 2009 Jun, 29(6 Suppl) S45-8). 혈소판 유래 성장 인자(PDGF)는 혈관 주위 세포를 조절하여 이들의 모집, 증식 및 생존을 유도하고 새로운 혈관의 성숙을 조절한다.
인간 PDGF 패밀리는 PDGF-A, PDGF-B, PDGF-C 및 PDGF-D를 포함한다. 4 개의 PDGF 단백질은 동종 또는 이종 이량체(예: PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PDGF-CC 및 PDGF-DD)를 형성하며, 이들은 단량체 형태로는 불활성이다. 이량체 단백질은 세포 표면 PDGF 수용체(PDGFR)의 세포 외 영역에 결합하여 PDGF 신호 전달 경로를 활성화시킨다.
PDGF 수용체는 PDGFR-α 및 PDGFR-β의 두 종류가 있으며, 이들은 동종 또는 이종 이량체(예: PDGFR-αα, PDGFR-ββ 및 PDGFR-αβ)를 형성하고, 5 개의 Ig-유사 도메인을 포함하는 세포 외 영역을 포함한다. 수용체의 리간드-결합 부위는 처음 3 개의 Ig-유사 도메인(D1 내지 D3)에 위치한다.
PDGFR 이량체의 세포 외 영역은 다른 PDGF 단백질에 결합한다. 예를 들어, PDGFR-αα는 PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB 및 PDGF-CC와 특이적으로 상호 작용한다. PDGFR-αβ는 PDGF-AB, PDGF-BB, PDGF-CC 및 PDGF-DD와 특이적으로 상호 작용한다. PDGFR-ββ는 PDGF-BB 및 PDGF-DD와 특이적으로 상호 작용한다. PDGF-BB는 3 가지 수용체 이량체 형태 모두에 높은 친화성으로 결합할 수 있는 유일한 PDGF로서, 생체 내외(in vitro 및 in vivo)에서 주위 세포(pericyte)의 증식과 이동을 유도할 수 있는 것으로 나타났다. PDGFR-β(D1 내지 D5)의 5 개의 Ig-유사 도메인으로 구성된 세포 외 영역은 이전에 PDGF-B에 의해 자극된 반응을 길항하는 것으로 나타났다(Duan 등, J Biol Chem. 1991 Jan 5; 266 (l) : 413-8; Ueno et al., Science. 1991 May 10, 252 (5007) : 844-8] 참조). PDGFRJ3-Fc 키메라 단백질을 사용하는 연구는 인간 PDGFR-β의 D1 내지 D3가 고친화성 PDGF-B 리간드 결합에 충분함을 입증하였다(Heidaran et al., FASEB J.1991; 9 (1) : 140-5, Lokker et al., J Biol Chem. 1997 Dec 26; 272 (52) : 33037-44] 참조). 또한, 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST)에 융합된 PDGFR-β의 D1 내지 D3의 예비 이량체화는 재조합 PDGFR-β D1-D3 단백질과 비교하여 PDGF-BB 리간드에 대한 결합 친화도를 개선시켰다(Leppanen et al., Biochemistry, 2000 Mar 7, 39 (9) : 2370-5] 참조).
현재의 항VEGF 치료법은 매우 효과적이지만, 최적의 결과를 얻기 위하여 집중적인 환자 모니터링과 빈번한 치료가 필요하다. 또한 이 약제는 근본 원인이 아닌 질병의 증상을 표적으로 하기 때문에 치료를 무기한 지속해야 한다. 부적절한 치료로 기존 맥락막 혈관 신생(CNVs)은 계속 성장하여 결국 섬유성 흉터로 성숙해 비가역적 시력 손실로 이어진다(Martin et al., Ophthalmology 2012; 119 : 1388-1398; Bloch et al, Am J Ophthalmol. Jul; 156 (l): l 16-124; Daniel et al., Ophthalmology, 2014 Mar; 121 (3): 656-66). 신생 혈관 형성을 막을 수 있고, 신생 혈관 맥락 병변 내 미숙 혈관 형성을 유발할 수 있는 약제는 혈관 누출 및 섬유화의 원인을 제거하여 집중적인 환자 모니터링 및 지속적인 치료의 필요성을 줄이거나 없앨 수 있다.
최근, N-말단부터 C-말단까지 PDGF 수용체의 세포 외 부분, VEGF 수용체의 세포 외 부분 및 다량화(multimerization) 도메인을 포함하는 융합 단백질이 공개되었다(미국공개공보 제2014/0315804호). 상기 융합 단백질은 PDGF와 VEGF를 모두 결합시키고 이들의 활성을 억제한다.
PDGF 및 VEGF의 이중 억제제 분야에 기술된 진보에도 불구하고, 당업계에는 혈관 형성형 장애의 개선된 제제 및 치료법이 필요하다.
미국공개공보 제2014/0315804호
Zhang and Ma, Prog Retin Eye Res 2007 Jan; 26 (l): 1-37 Sullivan and Brekken, MAbs. 2010 Mar-Apr, 2 (2): 165-75 Bhisitkuk, Br J Ophthalmol. 2006 Dec; 90 (12): 1542-7 Daniel et al, Ophthalmology. 2014 Mar; 121 (3) : 656-66 Benjamin et al, Development. 1998 May; 125 (9): 1591-8, Patel, Retina, 2009 Jun, 29(6 Suppl) S45-8 Duan et al, J Biol Chem. 1991 Jan 5; 266 (l) : 413-8; Ueno et al., Science. 1991 May 10, 252 (5007) : 844-8 Heidaran et al., FASEB J.1991; 9 (1) : 140-5 Lokker et al., J Biol Chem. 1997 Dec 26; 272 (52) : 33037-44 Leppanen et al., Biochemistry, 2000 Mar 7, 39 (9) : 2370-5 Martin et al., Ophthalmology 2012; 119 : 1388-1398 Bloch et al, Am J Ophthalmol. Jul; 156 (l): l 16-124 Daniel et al., Ophthalmology, 2014 Mar; 121 (3): 656-66
본 발명은 VEGF 및 PDGF 모두에 동시에 결합하여 동시에 두 신호 경로 모두를 표적으로 하는 신규한 융합 단백질을 제공함으로써 이러한 요구를 만족시킨다. 융합 단백질은 VEGF 및 PDGF 수용체로부터 유도된 세포 외 리간드 결합 도메인을 IgG1의 반감기 연장 Fc 도메인에 융합시킴으로써 생성되었다.
하나의 일반적인 양태에서, 본 발명은 (a) VEGF 수용체의 세포 외 리간드 결합 도메인을 포함하는 제 1 펩타이드, (b) 항체의 Fc 영역, 및 (c) PDGF 수용체의 세포 외 리간드 결합 도메인을 포함하는 제 2 펩타이드를 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다; 상기 융합 단백질은 (a)-(b)-(c) 및 (c)-(b)-(a)로 이루어진 군으로부터 선택된 순서로 N-말단에서 C-말단으로 배열되고; 융합 단백질은 VEGF 및 PDGF에 결합할 수 있고 VEGF의 활성 및 PDGF의 활성을 억제 할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, VEGF 수용체의 세포 외 리간드 결합 도메인은 VEGF 리간드에 결합할 수 있고, 하나 이상의 VEGF 수용체의 Ig-유사 도메인 D1-D7을 포함한다. 바람직하게는, VEGF 수용체의 세포 외 리간드 결합 도메인은 제 1 VEGF 수용체의 Ig-유사 도메인 D2 및 제 2 VEGF 수용체의 Ig-유사 도메인 D3를 포함하며, 제 1 및 제 2 VEGF 수용체는 동일하거나 상이한 VEGF 수용체이다. 일 실시예에서, VEGF 수용체의 세포 외 리간드 결합 도메인은 VEGFR1의 Ig-유사 도메인 D2 및 VEGFR2의 Ig-유사 도메인 D3를 포함한다. 다른 실시예에서, VEGF 수용체의 세포 외 리간드 결합 도메인은 서열번호 7과 90 % 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 보다 바람직하게는, VEGF 수용체의 세포 외 리간드 결합 도메인은 서열번호 7 및 10으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일 실시예에서, PDGF 수용체의 세포 외 리간드 결합 도메인은 PDGF 리간드에 결합할 수 있고, 하나 이상의 PDGF 수용체의 하나 이상의 Ig-유사 도메인 D1-D5를 포함한다. 바람직하게는, PDGF 수용체의 세포 외 리간드 결합 도메인은 하나 이상의 PDGF 수용체의 Ig-유사 도메인 D1-D3을 포함한다. 일 실시예에서, PDGF 수용체의 세포 외 리간드 결합 도메인은 서열번호 2와 90 % 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 보다 바람직하게는, PDGF 수용체의 세포 외 리간드 결합 도메인은 서열번호 2 및 5로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일 실시예에서, 항체의 Fc 영역은 IgG1의 CH2 및 CH3 영역을 포함한다. 바람직하게는, 항체의 Fc 영역은 서열번호 12와 90 % 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 보다 바람직하게는, 항체의 Fc 영역은 서열번호 12 및 15로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 융합 단백질은 (a) VEGFR1의 Ig-유사 도메인 D2 및 VEGFR2의 Ig-유사 도메인 D3, (b) IgG1의 CH2 및 CH3를 포함하는 항체의 Fc 영역, 및 (c) PDGFR의 Ig-유사 도메인 D1 내지 D3을 포함한다; 상기 융합 단백질은 (a)-(b)-(c) 및 (c)-(b)-(a)로 이루어진 군으로부터 선택된 순서로 N-말단에서 C-말단으로 배열되며, 보다 바람직하게는 (c)-(b)-(a)의 순서로 배열된다.
본 발명의 일 실시예에서, 융합 단백질은 Fc 영역과 융합 단백질의 C-말단의 제 1 또는 제 2 펩타이드 사이의 링커 펩타이드를 더 포함하고, 선택적으로 융합 단백질의 N-말단의 제 2 또는 제 1 펩타이드와 Fc 영역 사이의 제2 링커 펩타이드를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에서, 융합 단백질은 융합 단백질의 N-말단에 작동가능하게 연결된 신호 펩타이드를 더 포함한다.
또 다른 일반적인 양태에서, 본 발명은 본 발명의 융합 단백질을 코딩하는 분리된 핵산 분자에 관한 것이다.
또 다른 일반적인 양태에서, 본 발명은 본 발명의 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.
또 다른 일반적인 양태에서, 본 발명은 본 발명의 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 숙주 세포에 관한 것이다.
또 다른 일반적인 양태에서, 본 발명은 본 발명의 융합 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 (1) 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포를 융합 단백질이 제조되는 조건하에 배양하는 단계; 및 (2) 숙주 세포에 의해 제조된 융합 단백질을 회수하는 단계를 포함한다.
또 다른 일반적인 양태에서, 본 발명은 본 발명의 융합 단백질 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
또 다른 일반적인 양태에서, 본 발명은 본 발명의 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
또 다른 일반적인 양태에서, 본 발명은 VEGFR의 활성 및 PDGFR의 활성을 감소시키는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 본 발명의 융합 단백질의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 일반적인 양태에서, 본 발명은 조직 신생 혈관 형성(neovascularization), 혈관 투과성(vascular permeability), 부종(edema) 및 염증(inflammation)으로 이루어진 군으로부터 선택된 임상 증상(clinical condition)을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 본 발명의 일 실시예에 따른 융합 단백질의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 일반적인 양태에서, 본 발명은 맥락막 혈관 신생(choroidal neovascularization), 습성 노인성 황반변성(wet age-related macular degeneration) 및 지도형 위축(geographic atrophy)으로 이루어진 군으로부터 선택된 임상 증상(clinical condition)을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 본 발명의 일 실시예에 따른 융합 단백질의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 일 실시예에서, 융합 단백질은 분리된 단백질 또는 발현 벡터로서 투여된다.
본 발명의 일 실시예에서, 임상 증상은 뇌부종(brain edema), 뇌졸중(stroke), 암(cancer), 건선(psoriasis), 관절염(arthritis), 천식(asthma), 화상과 관련된 일반 부종(generalized edema associated with burns), 종양과 관련된 복수 및 흉막 삼출액(ascites and pleural effusion associated with tumors), 염증 또는 외상(inflammation or trauma), 만성 기도 염증(chronic airway inflammation), 모세혈관 누출 증후군(capillary leak syndrome), 패혈증(sepsis), 단백질 누출 증가와 관련된 신장 질환(kidney disease associated with increased leakage of protein), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 염증성 관절염(inflammatory arthritis), 골관절염(osteoarthritis), 죽상 동맥 경화증(atherosclerosis psoriasis), 및 노인성 황반변성(aged-related macular degeneration), 증식성 또는 비증식성 당뇨병성 망막증(proliferative and nonproliferative diabetic retinopathy), 각막 혈관 신생(corneal neovascularization), 홍채 혈증(rubeosis iridis) 및 신생 혈관 녹내장(neovascular glaucoma)을 포함하는 안구 염증 및/또는 안구 혈관 신생(ocular inflammation and/or ocular angiogenesis)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 일반적인 양태에서, 본 발명은 본 발명의 융합 단백질을 포함하는 PDGF 및 VEGF에 대한 이량체 길항제에 관한 것이다.
또 다른 일반적인 양태에서, 본 발명은 PDGF-BB 및 VEGF-A로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 리간드에 결합된 본 발명의 융합 단백질을 포함하는 단백질 접합체에 관한 것이다.
본 발명의 다른 태양, 특징 및 이점은 본 발명의 상세한 설명 및 그 바람직한 실시예 및 첨부된 청구 범위를 포함하는 다음의 설명으로부터 명백해질 것이다.
본 발명의 특정 실시 양태에서, 융합 단백질의 모든 성분은 인간 기원의 것이며 따라서 인간에서 비-면역원성 치료제로서 유용할 것으로 기대된다. 융합 단백질은 생체 외에서 VEGF 및 PDGF 의존성 세포 성장을 억제할 수 있으며, 동물 모델에서 VEGF에 의한 망막 유출을 감소시킬 수 있다.
혈관 신생이 VEGF 신호의 부재하에 발생할 수 있고, 혈관 주위 세포가 VEGF 및 다른 세포 생존 인자를 증식하는 내피 세포에 공급하여 항-VEGF 내성을 부여한다는 증거가 증가하고 있다(Reinmuth et al., FASEB J. 2001 May; 15(7): 123 9-41). 주위 세포(pericyte) 기원은 또한 조직 및 종양에 상처를 입히는 근섬유아세포에 대해 제안되어 왔다. PDGF 신호 전달 경로는 주위 세포 모집, 생존 및 성숙을 담당한다(Andrae et al., Genes Dev. 2008 May 15; 22 (10): 1276-3 12). 항체에 의한 PDGF 수용체 신호의 억제는 안구 신생 혈관 형성의 다중 마우스 모델에서 항-VEGF 치료의 효과를 향상시키는 것으로 나타났다(Jo et al., Am J Pathol. 2006 Jun;168(6):2036-53). 항-VEGF 제제 및 항-PDGF 제제인 E10030의 대규모 2 단계 임상 실험은 항-VEGF 단독 요법보다 우수한 결과를 보였다(Dugel, Retina Today, March 2013, 65-71). 따라서, 본 발명의 융합 단백질은 AMD 및 암과 같은 혈관 신생형 장애의 치료에 효과적이다. 융합 단백질의 추가적인 이점은 두 개의 분리된 조성물, 즉 항-PDGF 제제 및 항-VEGF 제제를 주사할 필요가 없다는 것이다. 대신에, 두 약제의 융합 단백질을 포함하는 단일 조성물은 단일 주사를 허용하여 감염 및 주사 외상에 대한 환자의 위험을 감소시킨다.
본 발명의 다음의 상세한 설명뿐만 아니라 전술한 요약은 첨부된 도면과 함께 읽으면 더 잘 이해 될 것이다. 본 발명은 도면에 도시된 정확한 실시예에 한정되지 않는다는 것을 이해해야 한다.
도면에서:
도 1은 본 발명의 실시예들에 따라 PDGF 및 VEGF 경로 모두를 동시에 억제하도록 설계된 이-기능성(bi-functional) 융합 단백질을 나타내는 것으로, 융합 단백질 2(상부) 및 융합 단백질 1(하부)을 나타낸다: PDGFR 세포 외 Ig-유사 도메인(PID)은 PDGFRP의 세포 외 Ig-유사 도메인 D1 내지 D3를 나타내고; Fc는 IgG1 CH2 및 CH3 도메인을 나타내고; VEGFR 세포 외 Ig-유사 도메인(VID)은 VEGFR1의 세포 외 Ig-유사 도메인 D2 및 VEGFR2의 세포 외 Ig-유사 도메인 D3을 나타낸다.
도 2a 및 도 2b는 각각 정제된 이-기능성 Fc 융합 단백질 1 및 2의 SDS-PAGE 겔 분석을 도시한다. 도 2c는 환원 또는 비환원되고 정제된 이-기능성 Fc 융합 단백질의 SDS-PAGE 겔 분석을 각각 나타낸다: 레인 M = 표지(marker); 레인 1(비환원) 및 2(환원) = 양성 대조군 2; 레인 3(비환원) 및 4(환원) = 융합 단백질 5; 레인 5(비환원) 및 6(환원) = 융합 단백질 3;
도 3은 3 가지 시험 샘플의 직접 리간드 결합 분석의 결과를 나타낸다: VEGF165에 대한 정제된 양성 대조군 1(·), 융합 단백질 3(A) 및 융합 단백질 5(■). 웰을 VEGF165로 미리 코팅하고 다양한 농도의 시험 샘플과 함께 인큐베이션하고; 결합된 시험 샘플의 양을 FIRP-접합 염소 항-인간 IgG1 Fc 특이적 항체를 사용하여 검출하였고, OD450 판독 값을 시험 샘플 농도에 대해 플롯팅 하였다;
도 4는 3 가지 시험 샘플의 직접 리간드 결합 분석의 결과를 나타낸다: PDGF-BB에 대한 정제된 양성 대조군 2(·), 융합 단백질 3(A) 및 융합 단백질 5(■). 웰을 PDGF-BB로 미리 코팅하고 다양한 농도의 시험 샘플과 함께 인큐베이션하고; 결합된 시험 샘플의 양을 FIRP-접합 염소 항-인간 IgG1 Fc 특이적 항체를 사용하여 검출하였고, OD450 판독 값을 시험 샘플 농도에 대해 플롯팅 하였다;
도 5a 및 5b는 각각 경쟁 결합 분석에서 용액 중의 VEGF165 및 PDGF-BB에 대한 융합 단백질 1의 친화력 평가를 나타낸다. 다양한 농도의 융합 단백질 1을 고정 농도의 VEGF165 또는 PDGF-BB와 함께 용액 중에서 하룻밤 배양하고, 유리 VEGF165 또는 PDGF-BB의 농도를 정량적 샌드위치 ELISA 검정법을 사용하여 측정하고 융합 단백질 1 농도에 대해 플롯팅 하였다;
도 6a 및 6b는 각각 경쟁 결합 분석에서 용액 중의 VEGF165 및 PDGF-BB에 대한 융합 단백질 2의 친화력 평가를 나타낸다. 다양한 농도의 융합 단백질 2를 고정 농도의 VEGF165 또는 PDGF-BB와 함께 용액 중에서 하룻밤 배양하고, 유리 VEGF165 또는 PDGF-BB의 농도를 정량적 샌드위치 ELISA 검정법을 사용하여 측정하고 융합 단백질 2 농도에 대해 플롯팅 하였다;
도 7은 HUVEC 세포의 VEGF-의존성 성장에 대한 양성 대조군 1 (·), 융합 단백질 3(A) 및 융합 단백질 5(■)의 억제 효과를 나타낸다. OD490 판독 값을 시험 샘플 농도에 대해 플롯팅 하였다;
도 8은 BALB/3T3 세포의 PDGF-의존성 성장에 대한 양성 대조군 2 (·), 융합 단백질 3(A) 및 융합 단백질 5(■)의 억제 효과를 나타낸다. OD490 판독 값을 시험 샘플 농도에 대해 플롯팅 하였다;
다양한 출판물, 논문 및 특허는 배경 및 명세서 전반에 걸쳐 인용되거나 설명된다. 이들 참조 문헌 각각은 그 전체가 참고 문헌으로 여기에 포함된다. 본 명세서에 포함된 문서, 행위, 재료, 장치, 물품 등의 논의는 본 발명의 배경을 제공하기 위한 것이다. 그러한 논의는 이러한 사안 중 일부 또는 전부가 공개되거나 청구된 발명과 관련하여 선행 기술의 일부를 구성한다는 것을 인정하는 것이 아니다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 그렇지 않은 경우, 본 명세서에서 사용된 특정 용어는 명세서에서 설정된 의미를 갖는다. 여기에 인용된 모든 특허, 공개된 특허 출원 및 출판물은 본원에 완전히 기재된 것처럼 참고 문헌으로 포함된다. 본 명세서 및 첨부 된 청구의 범위에서 사용 된 단수 형태는 문맥 상 명확하게 다르게 지시하지 않는 한 복수 참조를 포함한다는 것을 유의해야 한다.
본 발명은 (a) VEGF 수용체의 세포 외 리간드 결합 도메인을 포함하는 제 1 펩타이드, (b) 항체의 Fc 영역, 및 (c) PDGF 수용체의 세포 외 리간드 결합 도메인을 포함하는 제 2 펩타이드를 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다; 상기 융합 단백질은 (a)-(b)-(c) 및 (c)-(b)-(a)로 이루어진 군으로부터 선택된 순서로 N-말단에서 C-말단으로 배열되고; 융합 단백질은 VEGF-A 및 PDGF-BB에 결합할 수 있고 VEGFR1, VEFGFR2의 활성 및 PDGFR의 활성을 억제 할 수 있다.
놀랍게도 본 발명 중에는, 항체 Fc 영역과 같은 융합 단백질 내의 다른 성분에 대한 VEGF 및 PDGF 수용체의 세포 외 리간드 결합 도메인의 배향이 VEGF 및 PDGF 리간드에 대한 융합 단백질의 결합 친화도에 영향을 미친다는 것이 발견되었다. 본 발명의 일 실시예에 따른 융합 단백질은 두 리간드 모두에 대해 최적화된 친화성을 가지고, 증가된 효능을 가질 수 있다.
본 명세서에서 사용된, 문구 "융합 단백질"은 공유 결합된 2 개 이상의 부분을 가지며, 각각의 부분(portion)은 상이한 단백질로부터 유래된 단백질을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "VEGF" 는 VEGF 신호 전달 경로를 조절하는 임의의 혈관 내피 성장 인자 단백질을 지칭한다. 따라서, 용어 VEGF는 VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, P1GF 또는 이들의 동형 단백질(isoforms)을 지칭할 수 있다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "VEGF 수용체" 및 "VEGFR"dms VEGF 리간드에 결합하는 임의의 수용체를 지칭한다. 따라서, 용어 VEGF 수용체는 VEGFR1, VEGFR2 또는 VEGFR3을 지칭할 수 있다.
본 명세서에서 사용된, 문구 "세포 외 리간드 결합 도메인"은 세포 외부에 위치하여 그의 리간드에 결합할 수 있는 수용체 단백질의 임의의 영역을 말한다.
따라서, 본 발명의 융합 단백질에 존재하는 VEGF 수용체의 세포 외 리간드 결합 도메인은 VEGFR1, VEGFR2 및 VEGFR3을 포함하나, 이에 한정되지 않는 임의의 VEGFR로부터 유래될 수 있다. VEGFR 단백질의 7 개의 세포 외 IgG-유사 도메인은 세포 외 영역의 N-말단으로부터 C-말단까지 1, 2, 3, 4, 5, 6 및 7로 번호가 매겨지며, D1, D2, D3, D4, D5, D6 및 D7로도 불린다. 본 발명의 융합 단백질에 존재하는 VEGFR의 세포 외 리간드 결합 도메인은 하나 이상의 임의의 VEGFR 단백질의 세포 외 영역으로부터의 7 개의 IgG-유사 도메인 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 융합 단백질에 존재하는 VEGF 수용체의 세포 외 리간드 결합 도메인은 VEGFR1, VEGFR2, 또는 VEGFR3 중 하나 이상으로부터의 D1, D2, D3, D4, D5, D6 또는 D7 중 하나 이상일 수 있다.
바람직한 실시예에서, 융합 단백질에 존재하는 VEGF 수용체의 세포 외 리간드 결합 도메인은 VEGFR1의 Ig-유사 도메인 D2 및 VEGFR2의 Ig-유사 도메인 D3을 포함한다. 바람직하게는, VEGFR의 세포 외 리간드 결합 도메인은 VEGF에 대한 그의 결합을 증가시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 보다 바람직한 실시예에서, 융합 단백질에 존재하는 VEGF 수용체의 세포 외 리간드 결합 도메인은 서열번호 7과 90 % 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 보다 더 바람직한 실시예에서, 융합 단백질에 존재하는 VEGF 수용체의 세포 외 리간드 결합 도메인은 서열번호 7 및 10으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 융합 단백질에 존재하는 VEGF 수용체의 세포 외 리간드 결합 도메인은 인간 또는 마우스, 토끼, 쥐, 돼지, 개 또는 영장류와 같은 다른 적합한 포유동물과 같은 임의의 동물로부터 유래될 수 있다. 바람직한 실시예에서, VEGFR은 인간으로부터 유래된다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "PDGF"는 PDGF 신호 전달 경로를 조절하는 임의의 혈장-유래 성장 인자 단백질을 지칭한다. 따라서 용어 PDGF는 PDGF-A, PDGF-B, PDGF-C 또는 PDGF-D를 지칭할 수 있다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "PDGF 수용체" 및 "PDGFR"은 PDGF 리간드에 결합하는 임의의 수용체를 지칭한다.
본 발명의 융합 단백질에 존재하는 PDGF 수용체의 세포 외 리간드 결합 도메인은 PDGFR-α 및 PDGFR-β를 포함하나, 이에 한정되지 않는 임의의 PDGFR로부터 유래될 수 있다. PDGFR 단백질의 5 개의 세포 외 IgG-유사 도메인은 세포 외 영역의 N-말단으로부터 C-말단까지 1,2,3,4 및 5로 번호가 매겨지며, D1, D2, D3, D4 및 D5로도 불린다. 본 발명의 융합 단백질에 존재하는 PDGFR의 세포 외 리간드 결합 도메인은 하나 이상의 임의의 PDGFR 단백질의 세포 외 영역으로부터의 5 개의 IgG-유사 도메인 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 융합 단백질에 존재하는 PDGF 수용체의 세포 외 리간드 결합 도메인은 PDGFR-α 또는 PDGFR-β 중 하나 이상으로부터의 D1, D2, D3, D4 또는 D5 중 하나 이상일 수 있다.
바람직한 실시예에서, 융합 단백질에 존재하는 PDGF 수용체의 세포 외 리간드 결합 도메인은 PDGFRp의 Ig-유사 도메인 D1 내지 D3을 포함한다. 바람직하게는, PDGFR의 세포 외 리간드 결합 도메인은 PDGF에 대한 그의 결합을 증가시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 보다 바람직한 실시예에서, 융합 단백질에 존재하는 PDGF 수용체의 세포 외 리간드 결합 도메인은 서열번호 2와 90 % 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 보다 더 바람직한 실시예에서, 융합 단백질에 존재하는 VEGF 수용체의 세포 외 리간드 결합 도메인은 서열번호 2 및 5로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 융합 단백질에 존재하는 PDGF 수용체의 세포 외 리간드 결합 도메인은 인간 또는 마우스, 토끼, 쥐, 돼지, 개 또는 영장류와 같은 다른 적합한 포유동물와 같은 임의의 동물로부터 유래될 수 있다. 바람직한 실시예에서, PDGFR은 인간으로부터 유래된다.
본 명세서에서 사용된, 용어 항체의 "Fc 영역"이란 항체의 종류에 따라 2 개 또는 3 개의 불변 도메인을 포함하는 2 개의 중쇄(heavy chains)로 구성된 항체의 "단편, 결정화 가능(fragment, crystallizable" 영역을 지칭한다. 이 용어는 불변 영역의 적어도 일부를 포함하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는데 사용된다. 이 용어는 천연 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역 모두를 포함한다. 항체의 Fc 영역은 서브 유닛의 이량체(dimers), 삼량체(trimers), 사량체(tetramers) 등과 같은 다량체(multimers)로의 결합을 촉진하는 도메인인 다량화 도메인(multimerization domain)으로서 작용할 수 있다. 바람직하게는, Fc 영역은 서브 유닛의 다량체로의 결합을 촉진시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
본 발명의 융합 단백질에 존재하는 항체의 Fc 부위는 임의의 동형 단백질(예를 들어, IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE), 임의의 서브클래스(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2 등), 임의의 알로타입(allotype), 또는 손잡이 및 구멍(knob and hole) Fc 단편과 같은 조작된 돌연변이체를 포함할 수 있다. 바람직한 실시예에서, 본 발명의 융합 단백질에 존재하는 항체의 Fc 영역은 IgG1의 CH2 및 CH3 영역을 포함한다. 보다 바람직한 실시예에서, 본 발명의 융합 단백질에 존재하는 항체의 Fc 영역은 서열번호 12와 90 % 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 보다 더 바람직한 실시예에서, 본 발명의 융합 단백질에 존재하는 항체의 Fc 영역은 서열번호 12 및 15로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 융합 단백질에 존재하는 항체의 Fc 영역은 인간 또는 마우스, 토끼, 쥐, 돼지, 개 또는 영장류와 같은 다른 적합한 포유동물과 같은 임의의 동물로부터 유래될 수 있다. 바람직한 실시예에서, Fc 영역은 인간 항체로부터 유래된다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 융합 단백질의 성분은 펩타이드 링커와 같은 연결 부분에 의해 결합 될 수 있다. 바람직하게는, 링커는 융합 단백질 성분의 유연성을 증가시키고, 정확한 폴딩을 보장을 돕고, 입체 장애를 최소화하며, 융합 단백질 내의 각각의 기능성 성분의 구조를 크게 간섭하지 않는다. 일부 실시예에서, 펩타이드 링커는 2 내지 20 개의 아미노산을 포함한다. 일부 실시예에서, 펩타이드 링커는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 개의 아미노산을 포함한다. 바람직하게는, 융합 단백질은 Fc 영역과 융합 단백질의 C-말단의 제 1 또는 제 2 펩타이드 사이의 제 1 링커 펩타이드를 포함하고, 선택적으로 융합 단백질의 N-말단의 제 2 또는 제 1 펩타이드와 Fc 영역 사이의 제 2 링커 펩타이드를 포함한다. 본 발명의 바람직한 실시예에서, 제 1 링커 펩타이드는 서열번호 20, 22, 24, 26, 28, 30 및 32로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하고, 제 2 링커 펩타이드는 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 실시예에 따르면, 융합 단백질은 세포로부터 융합 단백질의 분비를 보장하기 위하여 융합 단백질의 N-말단에 연결된 신호 펩타이드를 추가로 포함한다. 숙주 세포에 의해 인식되고 처리되는 모든 신호 펩타이드를 사용할 수 있다. 바람직한 실시예에서, 신호 펩타이드는 서열번호 34 또는 36의 아미노산 서열을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
바람직한 실시예에서, 본 발명의 융합 단백질은 서열번호 38과 90 % 이상의 상동성, 또는 서열번호 40과 90 % 이상의 상동성, 바람직하게는 서열번호 42의 20-766 아미노산, 서열번호 44의 21-769 아미노산 또는 서열번호 50의 20-768 아미노산 서열과 90 % 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 융합 단백질은 VEGF 수용체 도메인 및/또는 PDGF 수용체 도메인의 하나 이상의 돌연변이 또는 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNPs)을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 실시예에 따라 항체의 Fc 영역에서 발생하는 하나 이상의 돌연변이 또는 SNPs를 포함할 수 있다.
보다 바람직한 실시예에서, 본 발명의 융합 단백질은 서열번호 38, 서열번호 40, 서열번호 42의 20-766 아미노산, 서열번호 44의 21-769 아미노산 및 서열번호 50의 20-768 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
일반적인 측면에서, 본 발명의 융합 단백질은 VEGF 및 PDGF에 결합하고 VEGF 및 PDGF 수용체의 활성을 억제한다. 본 명세서에서 사용된, 용어 "~에 결합하다"는 리간드의 활성의 억제(inhibiting), 차단(blocking), 중화(neutralizing), 감소(reducing), 폐기(abrogating) 또는 간섭(interfering) 중 하나 이상에 이르는, 리간드에 대한 수용체 단백질의 세포 외 도메인의 결합을 의미한다. 특정 실시예에서, VEGF 또는 PDGF 수용체 단백질의 세포 외 도메인은 리간드, 즉, VEGF 또는 PDGF에 각각 결합하고, 리간드가 다른 VEGF 수용체 및 PDGF 수용체와 같은 다른 분자에 결합되는 것을 차단함으로써 리간드 활성을 억제한다. 특정 다른 실시예에서, VEGF 또는 PDGF 수용체 단백질의 세포 외 도메인은 리간드, 즉 VEGF 또는 PDGF에 각각 결합하여 리간드 활성을 억제하고, 리간드가 세포에서의 다운스트림(downstream) 신호 사건을 유발하는 것을 방지한다.
본 명세서에서 사용된, 리간드 활성의 배경 내의 용어 "억제" 또는 "억제하다"는 결합 분석(binding assays), 세포 성장 분석(cell growth assays), 경쟁적 결합 분석(competitive binding assays) 및 생체 내 분석(in vivo assays)을 포함하나, 이에 한정되지는 않는 다양한 기능 분석에 의해 분석되는 리간드의 활성을 감소시키는 수용체 단백질의 세포 외 도메인의 특성을 지칭한다.
본 명세서에서 개시된 융합 단백질 또는 융합 단백질의 구성 요소는 표적 결합 파트너(예를 들어, PDGF 및/또는 VEGF 패밀리 단백질)에 대한 친화성, 경쟁적 결합(예를 들어, PDGF 또는 VEGF가 PDGFR 또는 VEGFR에 결합하는 것을 차단하는 것), 억제 활성(예를 들어, PDGF 또는 VEGF 신호 전달 경로의 활성화 억제), 세포 증식 억제, 종양 성장 억제 및 혈관 신생 억제(예를 들어, 맥락막의 억제 신생 혈관 형성)를 포함하나, 이에 한정되지 않는 생물학적 활성을 특징으로 하거나 평가될 수 있다. 일부 실시예에서, 본 발명에 개시된 융합 단백질 또는 융합 단백질의 구성 요소는 생체 내(in vivo) 또는 시험 관내(in vitro)에서 생물학적 활성이 평가될 수 있다.
본 발명은 또한 (a) VEGF 수용체의 세포 외 리간드 결합 도메인을 포함하는 제 1 펩타이드, (b) 항체의 Fc 영역, 및 (c) PDGF 수용체의 세포 외 리간드 결합 도메인을 포함하는 제 2 펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 분리된 핵산 분자를 제공한다; 상기 융합 단백질은 (a)-(b)-(c) 및 (c)-(b)-(a)로 이루어진 군으로부터 선택된 순서로 N-말단에서 C-말단으로 배열된다. 본 발명의 실시예에 따르면, 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 차이니즈 햄스터 난소 세포(Chinese hamster ovary cell)와 같은 특정 유형의 숙주 세포에서의 발현을 위하여 코돈-최적화(codon-optimized)될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 서열번호 37, 39, 41, 43 및 49로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 발현 벡터 내에 존재할 수 있다. 발현 벡터는 재조합 단백질 발현용 벡터, 및 바이러스 벡터와 같이, 개체 조직에서의 발현을 위한 개체로의 핵산 전달용 벡터를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명과 함께 사용하기에 적합한 바이러스 벡터의 예는 아데노 바이러스 벡터(adenoviral vectors), 아데노-관련 바이러스 벡터(adeno-associated virus vectors), 렌티 바이러스 벡터(lentiviral vectors) 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 벡터는 비바이러스성 벡터일 수도 있다. 비바이러스성 벡터의 예는 플라스미드(plasmids), 박테리아 인공 염색체(bacterial artificial chromosomes), 효모 인공 염색체(yeast artificial chromosomes), 박테리오파지(bacteriophages) 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 벡터는 발현 벡터의 통상적인 기능, 예를 들어 프로모터(promoter), 리보좀 결합 요소(ribosome binding element), 터미네이터(terminator), 인핸서(enhancer), 선별 마커(selection marker) 또는 복제 기점(origin of replication)을 확립하기 위한 임의의 요소를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 본 발명에서 개시된 내용을 고려하여 당업계에 공지된 방법을 사용하여 원하는 숙주 세포로부터의 재조합 발현을 향상시키기 위하여 코돈-최적화될 수 있다.
본 발명은 또한 (a) VEGF 수용체의 세포 외 리간드 결합 도메인을 포함하는 제 1 펩타이드, (b) 항체의 Fc 영역, 및 (c) PDGF 수용체의 세포 외 리간드 결합 도메인을 포함하는 제 2 펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포를 제공한다; 상기 융합 단백질은 (a)-(b)-(c) 및 (c)-(b)-(a)로 이루어진 군으로부터 선택된 순서로 N-말단에서 C-말단으로 배열된다. 숙주 세포는 재조합 단백질 발현용 숙주 세포 및 개체 조직에서 발현을 위한 개체로의 핵산 전달용 숙주 세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명과 함께 사용하기에 적합한 숙주 세포의 예는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, 인간 배아 신장 293(HEK-293) 등이 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명은 또한 (a) VEGF 수용체의 세포 외 리간드 결합 도메인을 포함하는 제 1 펩타이드, (b) 항체의 Fc 영역, 및 (c) PDGF 수용체의 세포 외 리간드 결합 도메인을 포함하는 제 2 펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 제조하는 방법을 제공한다; 상기 융합 단백질은 (a)-(b)-(c) 및 (c)-(b)-(a)로 이루어진 군으로부터 선택된 순서로 N-말단에서 C-말단으로 배열된다. 일반적인 측면에서, 본 방법은 (1) 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포를 융합 단백질이 제조되는 조건하에 배양하는 단계; 및 (2) 숙주 세포에 의해 제조된 융합 단백질을 회수하는 단계를 포함한다. 융합 단백질은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 더 정제될 수 있다.
일부 실시예에서, 융합 단백질은 숙주 세포에서 발현되고, 단백질 A 친화성 크로마토그래피(Protein A affinity chromatography), 단백질 G 친화성 크로마토그래피(Protein G affinity chromatography), 완충액 교환(buffer exchange), 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography), 한외여과(ultrafiltration) 및 투석(dialysis)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 표준 정제 기술 중 하나 또는 그 이상의 조합을 사용하여 이로부터 정제된다.
본 발명은 또한 (a) VEGF 수용체의 세포 외 리간드 결합 도메인을 포함하는 제 1 펩타이드, (b) 항체의 Fc 영역, 및 (c) PDGF 수용체의 세포 외 리간드 결합 도메인을 포함하는 제 2 펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다; 상기 융합 단백질은 (a)-(b)-(c) 및 (c)-(b)-(a)로 이루어진 군으로부터 선택된 순서로 N-말단에서 C-말단으로 배열된다. 본 발명의 조성물은 치료학적 유효량의 융합 단백질을 포함한다.
용어 "치료학적 유효량"은 목적하는 생물학적 또는 임상적 효과를 유도하는데 필요한 치료학적 활성 화합물의 양을 의미한다. 본 발명의 실시예에 따르면, "치료학적 유효량"은 임상 결과를 비롯한 유익한 또는 바람직한 결과를 달성하기에 충분한 양이다. 치료학적 유효량은 1회 이상의 투여로 투여될 수 있다. 질병 상태(disease state)의 관점에서, 유효량은 질병의 개선, 안정화 또는 발달을 지연시키기에 충분한 양이다. 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 치료학적 유효량은 혈관 투과성, 부종, 염증, 망막병증, 섬유증 또는 암을 특징으로 하는 질환과 같은 비정상적인 혈관 신생을 특징으로 하는 장애를 치료 또는 예방하는데 필요한 융합 단백질의 양이다.
일부 실시예에서, 융합 단백질을 포함하는 약학적 조성물은 약 0.5 내지 약 100 mg/mL, 바람직하게는 약 40 내지 약 80 mg/mL, 예를 들어 약 40, 50, 60, 70 또는 80 mg/mL, 가장 바람직하게는 약 40±5 mg/mL의 단백질 농도로 완충액 중에 제형화된 융합 단백질을 포함한다. 다른 바람직한 실시예에서, 융합 단백질은 약 40 mg/mL 초과, 바람직하게는 약 80±10 mg/mL의 단백질 농도로 완충액 중에 제형화된다.
특정 실시예에서, 완충액은 pH가 약 6.5 내지 8, 보다 바람직하게는 약 7 내지 7.5, 보다 더 바람직하게는 약 7.2인 인산염 완충액이다. 인산염 완충액은 약 5 내지 20 mM 인산나트륨, 예컨대 5, 10, 15 또는 20 mM 인산나트륨, 보다 바람직하게는 약 10 mM 인산나트륨; 약 20 내지 60 mM의 염화나트륨, 보다 바람직하게는 약 40 mM의 염화나트륨; 약 1 내지 10 중량%(w/v) 수크로스, 보다 바람직하게는 약 5 %w/v 수크로스; 및 약 0.01 내지 0.05 %w/v의 계면 활성제, 보다 바람직하게는 약 0.03 %w/v 폴리소르베이트(polysorbate) 20을 포함한다.
본 발명의 다른 특정 실시예에서, 완충액은 pH가 약 5 내지 8, 보다 바람직하게는 약 6 내지 7, 보다 더 바람직하게는 약 6.8인 히스티딘 완충액이다. 히스티딘 완충액은 10, 20, 30, 40 또는 50 mM 히스티딘과 같은 약 10 내지 50 mM 히스티딘, 보다 바람직하게는 약 25 mM 히스티딘; 10, 20 또는 30 mM 염화나트륨과 같은 약 10 내지 30 mM 염화나트륨, 보다 바람직하게는 약 20 mM 염화나트륨; 1, 2, 4, 6, 8 또는 10 %w/v 수크로스와 같은 약 1 내지 10 %w/v 수크로스, 보다 바람직하게는 약 6 %w/v 수크로스; 및 약 0.01 내지 0.05 %w/v의 계면 활성제, 보다 바람직하게는 약 0.03 %w/v 폴리소르베이트(polysorbate) 20을 포함한다.
본 발명은 또한 (a) VEGF 수용체의 세포 외 리간드 결합 도메인을 포함하는 제 1 펩타이드, (b) 항체의 Fc 영역, 및 (c) PDGF 수용체의 세포 외 리간드 결합 도메인을 포함하는 제 2 펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 조성물을 제공한다; 상기 융합 단백질은 (a)-(b)-(c) 및 (c)-(b)-(a)로 이루어진 군으로부터 선택된 순서로 N-말단에서 C-말단으로 배열된다. 본 발명의 조성물은 치료학적 유효량의 융합 단백질을 포함한다.
본 발명의 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 조성물은 융합 단백질의 발현을 위하여 세포 내로 핵산 분자를 도입하기 위한 전달 비히클(vehicle)을 포함할 수 있다. 핵산 전달 비히클의 예는 리포좀(liposomes), 천연 중합체 및 합성 중합체를 포함하는 생체 적합성 중합체(biocompatible polymers), 지질단백질(lipoproteins), 폴리펩타이드(polypeptides), 폴리사카라이드(polysaccharides), 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharides), 인공 바이러스 엔벨로프(artificial viral envelopes), 금속 입자(metal particles), 및 박테리아(bacteria), 바큘로 바이러스(baculoviruses), 아데노 바이러스(adenoviruses) 및 레트로 바이러스(retroviruses)와 같은 바이러스(viruses), 박테리오파지(bacteriophages), 코스미드(cosmids), 플라스미드(plasmids), 곰팡이 벡터(fungal vectors) 및 다양한 진핵생물(eukaryotic) 숙주에서의 발현을 위해 기술된 당업계에서 전형적으로 사용되는 기타 재조합 비히클을 포함한다.
본 발명은 또한 혈관 신생, 혈관 침투성, 부종 또는 염증, 망막병증, 섬유증 또는 암을 특징으로 하는 질환과 같은 비정상적인 혈관 신생을 특징으로 하는 상태, 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하기 위한 본 발명의 약학적 조성물의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 개체에서 비정상적인 혈관 신생을 특징으로 하는 상태, 질환 또는 장애를 치료하는 방법은 본 발명의 약학적 조성물을 치료가 필요한 개체에 투여하는 것을 포함한다. 본 발명에 기재된 임의의 약학적 조성물은 융합 단백질을 포함하는 약학적 조성물 또는 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 약학적 조성물을 포함하는 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 약학적 조성물은 안과 관련 질환의 경우 유리체(vitreous), 결막(conjunctiva), 테논(tenon), 안구후부(retrobulbar) 또는 공막(sclera)을 통해, 전신성 질환의 경우 혈액 또는 조직을 통해 투여된다.
본 명세서에서 사용된, "개체"는 본 발명의 실시예에 따른 방법에 의해 치료되거나 치료될 임의의 동물, 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간을 의미한다. 본 발명에서 "포유동물"은 임의의 포유동물을 포함한다. 포유동물의 예로는 소, 말, 양, 돼지, 고양이, 개, 마우스, 래트, 토끼, 기니아 피그, 원숭이 또는 유인원과 같은 인간 이외의 영장류(NHPs), 인간 등이 포함되나, 보다 바람직하게는 인간이다.
본 명세서에서 사용된, "비정상적인 혈관 신생을 특징으로 하는 상태, 질환 또는 장애" 또는 "혈관 신생형 장애"는 동일한 의미를 가지며, 과도한, 불충분한 또는 비정상적인 혈관 신생을 포함하는 비정상적인 혈관 생성과 관련된 임의의 장애를 지칭한다. 본 발명의 방법에 따라 치료될 수 있는 혈관 신생형 장애의 예는 신생 혈관 형성(neovascularization), 혈관 투과성(vascular permeability), 부종(edema) 또는 염증(inflammation)을 특징으로 하는 질환을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 여기에는 노인성 황반변성(예를 들면, 습성 AMD, 건성 AMD 또는 지질 위축), 증식성 및 비증식성 당뇨병성 망막증, 신생 혈관 형성을 특징으로 하는 안과 질환(예를 들면, 각막 혈관 신생 또는 맥락막 혈관 신생), 포도막염(예를 들면, 전방 포도막염 또는 후천성 포도막염), 색소성 망막염, 당뇨병성 망막증, 홍채 혈증(rubeosis iridis) 및 신생 혈관 녹내장(neovascular glaucoma)를 포함하는 안과 염증 및/또는 안과 혈관형성, 염증성 질환, 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 염증성 관절염(inflammatory arthritis), 골관절염(osteoarthritis), 자가 면역 질환(autoimmune disease) 또는 암이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 바람직한 실시예에서, 치료될 수 있는 혈관 신생형 장애는 망막병증, 섬유증 또는 암이다.
다른 실시예에서, 본 발명의 방법에 따라 치료될 수 있는 혈관 신생형 장애에는 뇌부종(brain edema), 뇌졸중(stroke), 건선(psoriasis), 천식(asthma), 화상과 관련된 일반 부종(generalized edema associated with burns), 종양과 관련된 복수 및 흉막 삼출액(ascites and pleural effusion associated with tumors), 염증 또는 외상(inflammation or trauma), 만성 기도 염증(chronic airway inflammation), 모세혈관 누출 증후군(capillary leak syndrome), 패혈증(sepsis), 단백질 누출 증가와 관련된 신장 질환(kidney disease associated with increased leakage of protein)이 포함되나, 이에 제한되지 않는다
본 명세서에서 사용된, 용어 "치료하다", "치료하는" 및 "치료"는 조성물을 개체에 투여하여 개체에서 원하는 치료 또는 임상 결과를 달성하는 것을 의미한다. 일 실시예에서, 용어 "치료하다", "치료하는" 및 "치료"는 본 발명의 약학적 조성물을 투여하여 혈관 신생형 장애, 예컨대 혈관 투과성, 부종 또는 염증의 진행 또는 발달을 감소, 경감 또는 지연시키는 것을 지칭한다. 또 다른 실시예에서, 용어 "치료하다", "치료하는" 및 "치료"는 눈의 각막 혈관 신생 및/또는 새는 혈관 형성(leaky vasculature)을 억제 또는 감소시키기 위하여 본 발명의 약학적 조성물을 투여하는 것을 지칭한다. 또 다른 실시예에서, 용어 "치료하다", "치료하는" 및 "치료"는 본 발명의 약학적 조성물을 투여하여 각막 또는 관심 부위의 새로운 혈관(예를 들면, 각막 혈관 신생)의 진행 또는 발달을 늦추는 것을 지칭한다. 본 발명의 특정 실시예에서, AMD와 관련하여 사용될 때, 용어 "치료하다", "치료하는" 및 "치료"는 VEGF-유도 망막 유출을 예방 또는 감소시키는 것을 말하며, 혈관 신생과 관련된 안구 흉터 및 섬유증을 예방 또는 감소시키는 것을 지칭한다. 본 발명의 특정 실시예에서, 암과 관련하여 사용될 때, 용어 "치료하다", "치료하는" 및 "치료"는 암세포의 증식, 비분화 또는 전이를 감소시키는 것을 지칭한다. 본 발명에 따른 종양의 치료는 종양 크기의 감소, 종양 성장의 감소 및 종양 전이의 감소를 포함한다. 본 명세서에서, "종양"은 비정상적인 조직 덩어리 의미하며, 양성 종양 및 악성 종양을 모두 포함한다.
본 발명의 실시예에 따르면, 약학적 조성물은 국소 투여, 유리체 내 주사, 맥락막상 또는 결막하 주사와 같은 본 발명의 관점에서 당업자에게 공지된 임의의 방법으로 투여될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 안과 제형은 유리질로(intravitreally) 투여된다. 약학적 조성물은 눈의 어느 부분으로 투여될 수 있고, 바람직하게는 혈관 신생형 장애의 치료를 위하여 눈의 유리체(vitreous)에 투여된다. 약학적 조성물은 신체의 임의의 부분에 투여될 수 있고, 바람직하게는 혈관 신생형 장애의 치료를 위하여 혈액 또는 조직/기관에 투여된다.
본 발명의 일 실시예에 따른 약학적 조성물의 투여량, 투여 빈도 및 투여 기간과 같은 파라미터는 임의의 특정 방법으로 제한되지 않는다. 이러한 파라미터의 최적 값은 치료될 대상, 치료될 특정 혈관 신생형 질환, 질환의 중증도 등과 같은 다양한 인자에 의존적일 수 있으며, 당업자는 원하는 치료 또는 임상 결과를 달성하기 위하여 그러한 파라미터에 대한 최적 값을 결정할 수 있다. 예를 들어, 약학적 조성물은 1 일 1 회 또는 1 일 2 회, 3 회, 4 회 등으로 수회 투여 될 수 있다. 예시적이고 비제한적인 투약 요법은 약학적 조성물을 1 개월 동안 1 회 유리 체내에 투여하는 것을 포함한다.
다른 실시예에서, 본 발명은 항-간세포 성장 인자(IIGF), 항-HGF 수용체(HGFR), 항-섬유아세포 성장 인자(FGF), 항-FGF 수용체 (FGFR), 항염증제(코르티코스테로이드, 비스테로이드 항염증제), 면역 조절제, 항생제 및 항암제와 같은 다른 항-혈관 신생제와 함께 투여될 수 있다.
일반적인 측면에서, 본 발명은 본 발명의 융합 단백질을 포함하는 PDGF 및 VEGF에 대한 이량체 길항제를 제공한다. 이량체 내의 각각의 융합 단백질은 본 명세서에 개시된 임의의 융합 단백질을 포함한다. 일 실시예에서, 이량체 융합 단백질은 본 발명의 두 개의 동일한 융합 단백질을 포함한다. 다른 실시예에서, 이량체 융합 단백질은 본 발명의 두 개의 상이한 융합 단백질을 포함한다. 또 다른 실시예에서, 이량체 융합 단백질은 서열번호 38, 서열번호 40, 서열번호 42의 20-766 아미노산, 서열번호 44의 21-769 아미노산 및 서열번호 50의 20-768 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 38, 서열번호 40, 서열번호 42의 20-766 아미노산, 서열번호 44의 21-769 아미노산 및 서열번호 50의 20-768 아미노산에 대해 90 % 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질 중 적어도 하나를 포함한다.
다른 일반적 측면에서, 본 발명은 PDGF 및 VEGF로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 리간드에 결합된 본 발명의 융합 단백질을 포함하는 단백질 접합체를 제공한다.
실시예
실시예 1은 융합 단백질로서, (a) VEGF 수용체의 세포 외 리간드 결합 도메인을 포함하는 제 1 펩타이드, (b) 항체의 Fc 영역, 및 (c) PDGF 수용체의 세포 외 리간드 결합 도메인을 포함하는 제 2 펩타이드를 포함한다; 상기 융합 단백질은 (a)-(b)-(c) 및 (c)-(b)-(a)로 이루어진 군으로부터 선택된 순서로 N-말단에서 C-말단으로 배열되고; 상기 융합 단백질은 VEGF 및 PDGF에 결합할 수 있고, VEGF의 활성 및 PDGF의 활성을 억제 할 수 있다.
실시예 2는 실시예 1에 따른 융합 단백질로서, 상기 VEGF 수용체의 세포 외 리간드 결합 도메인은 VEGF 리간드에 결합할 수 있고, VEGF 수용체의 Ig-유사 도메인 D1 내지 D7로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.
실시예 3은 실시예 1에 따른 융합 단백질로서, 상기 PDGF 수용체의 세포 외 리간드 결합 도메인은 PDGF 리간드에 결합할 수 있고, PDGF 수용체의 Ig-유사 도메인 D1 내지 D5로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함한다.
실시예 4는 실시예 1에 따른 융합 단백질로서, 상기 (a) VEGF 수용체의 세포 외 리간드 결합 도메인은 제 1 VEGFR의 Ig-유사 도메인 D2, 바람직하게는 VEGFR1의 Ig-유사 도메인 D2, 제 2 VEGFR Ig-유사 도메인 D3, 바람직하게는 VEGFR2의 Ig-유사 도메인 D3을 포함하며, (b) 항체의 Fc 영역은 IgG1의 CH2 및 CH3 영역을 포함하고; (c) PDGF 수용체의 세포 외 리간드 결합 도메인은 PDGFR의 Ig-유사 도메인 D1 내지 D3, 바람직하게는 PDGFRβ의 Ig-유사 도메인 D1 내지 D3을 포함한다.
실시예 5는 실시예 4에 따른 융합 단백질로서, 상기 (a) VEGF 수용체의 세포 외 리간드 결합 도메인은 서열번호 7과 90 % 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; (b) 항체의 Fc 영역은 서열번호 12와 90 % 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; (c) PDGF 수용체의 세포 외 리간드 결합 도메인은 서열번호 2와 90 % 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
실시예 6은 실시예 5에 따른 융합 단백질로서, 상기 (a) VEGF 수용체의 세포 외 리간드 결합 도메인은 서열 번호 7 및 10으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고; (b) 항체의 Fc 영역은 서열 번호 12 및 15로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고; (c) PDGF 수용체의 세포 외 리간드 결합 도메인은 서열 번호 2 및 5로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
실시예 7은 실시예 1 내지 6 중 어느 하나에 따른 융합 단백질로서, Fc 영역과 융합 단백질의 C-말단의 제 1 또는 제 2 펩타이드 사이의 제 1 링커 펩티드를 더 포함하고, 선택적으로 융합 단백질의 N-말단의 제 2 또는 제 1 펩타이드와 Fc 영역 사이의 제 2 링커 펩타이드를 포함한다.
실시예 8은 실시예 7에 따른 융합 단백질로서, 상기 제 1 링커 펩타이드는 서열번호 20, 22, 24, 26, 28, 30 및 32로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제 2 링커 펩타이드는 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함한다.
실시예 9는 실시예 1 내지 8 중 어느 하나에 따른 융합 단백질로서, 상기 융합 단백질은 융합 단백질의 N-말단에 연결된 신호 펩타이드를 추가로 포함한다.
실시예 10은 실시예 9에 따른 융합 단백질로서, 상기 신호 펩타이드는 서열번호 34 및 36으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
실시예 11은 실시예 1 내지 10 중 어느 하나에 따른 융합 단백질로서, 상기 융합 단백질은 (c)-(b)-(a) 순서로 N-말단에서 C-말단으로 배열된다.
실시예 12는 융합 단백질로서, 서열번호 38 또는 40과 90 % 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열번호 42의 20-766 아미노산, 서열번호 44의 21-769 아미노산 또는 서열번호 50의 20-768 아미노산 서열과 90 % 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
실시예 13은 실시예 12에 따른 융합 단백질로서, 서열번호 38, 서열번호 40, 서열번호 42의 20-766 아미노산, 서열번호 44의 21-769 아미노산 및 서열번호 50의 20-768 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
실시예 14는 실시예 1 내지 13 중 어느 하나의 융합 단백질을 코딩하는 분리된 핵산 분자이다.
실시예 15는 실시예 14에 따른 분리된 핵산 분자로서, 상기 융합 단백질은 융합 단백질의 N-말단에 연결된 신호 펩타이드를 더 포함한다.
실시예 16은 실시예 15에 따른 분리된 핵산 분자로서, 상기 신호 펩타이드는 서열번호 34 및 36으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
실시예 17은 실시예 14 내지 16 중 어느 하나에 따른 분리된 핵산 분자로서, 상기 핵산 분자는 서열번호 37, 39, 41, 43 및 49로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
실시예 18은 실시예 1 내지 13 중 어느 하나의 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터이다.
실시예 19는 실시예 18에 따른 발현 벡터로서, 상기 핵산 분자는 서열 번호 37, 39, 41, 43 및 49로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
실시예 20은 실시예 1 내지 13 중 어느 하나의 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포이다.
실시예 21은 실시예 1 내지 13 중 어느 하나의 융합 단백질을 제조하는 방법으로서, (1) 실시예 1 내지 13 중 어느 하나의 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포를 융합 단백질이 제조되는 조건하에 배양하는 단계; 및 (2) 숙주 세포에 의해 제조된 융합 단백질을 회수하는 단계를 포함한다.
실시예 22는 실시예 1 내지 13 중 어느 하나의 융합 단백질 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물이다.
실시예 23은 실시예 22에 따른 약학적 조성물로서, 상기 조성물은 약 5-100 mM 히스티딘, 약 1-10 % w/v 수크로스, 및 약 0.005-0.1 % w/v 폴리소르베이트(polysorbate) 20을 포함하는 완충액 중에서 약 6.3 내지 7.3 pH로 제형화된 40 내지 80 mg/ml의 융합 단백질을 포함한다.
실시예 24는 실시예 1 내지 13 중 어느 하나의 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자, 및 지질 담체(예: 리포펙타민(Lipofectamine)), 화합물(예: 폴리에틸렌이민(polyethleneimine)) 또는 전기천공 완충액과 같은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물이다.
실시예 25는 실시예 24에 따른 약학적 조성물로서, 상기 조성물은 발현 카세트(expression cassette)를 갖는 플라스미드, 및 지질 담체(예: 리포펙타민(Lipofectamine)), 화합물(예: 폴리에틸렌이민(polyethleneimine)) 또는 전기천공 완충액과 같은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물이다.
실시예 26은 신생 혈관 형성(neovascularization), 혈관 투과성(vascular permeability), 부종(edema) 및 염증(inflammation)으로 이루어진 군으로부터 선택된 임상 증상(clinical condition)을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 상기 방법은 실시예 1 내지 13 중 어느 하나의 융합 단백질 또는 실시예 22 내지 25 중 어느 하나의 약학적 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함한다.
실시예 27은 실시예 26에 따른 방법으로서, 상기 융합 단백질은 실시예 22 및 23 중 어느 하나의 약학적 조성물 내의 분리된 단백질로서 투여되는 방법이다.
실시예 28은 실시예 26에 따른 방법으로서, 상기 융합 단백질은 실시예 24 및 25 중 어느 하나의 약학적 조성물로 투여되는 방법이다.
실시예 29는 실시예 26 내지 28 중 어느 하나의 방법으로서, 상기 임상 증상은 뇌부종(brain edema), 뇌졸중(stroke), 암(cancer), 건선(psoriasis), 관절염(arthritis), 천식(asthma), 화상과 관련된 일반 부종(generalized edema associated with burns), 종양과 관련된 복수 및 흉막 삼출액(ascites and pleural effusion associated with tumors), 염증 또는 외상(inflammation or trauma), 만성 기도 염증(chronic airway inflammation), 모세혈관 누출 증후군(capillary leak syndrome), 패혈증(sepsis), 단백질 누출 증가와 관련된 신장 질환(kidney disease associated with increased leakage of protein), 및 노인성 황반변성(aged-related macular degeneration), 당뇨병성 망막증(diabetic retinopathy), 포도막염(uveitis) 및 각막 혈관 신생(corneal neovascularization)을 포함하는 안구 염증 및/또는 안구 혈관 신생(ocular inflammation and/or ocular angiogenesis)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
실시예 30은 맥락막 혈관 신생(choroidal neovascularization), 습성 노인성 황반변성(wet age-related macular degeneration) 및 지도형 위축(geographic atrophy)으로 이루어진 군으로부터 선택된 임상 증상(clinical condition)을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 상기 방법은 실시예 1 내지 13 중 어느 하나의 융합 단백질 또는 실시예 22 내지 25 중 어느 하나의 약학적 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함한다.
실시예 31은 실시예 30에 따른 방법으로서, 상기 융합 단백질은 실시예 22 및 23 중 어느 하나의 약학적 조성물 내의 분리된 단백질로서 투여되는 방법이다.
실시예 32는 실시예 30에 따른 방법으로서, 상기 융합 단백질은 실시예 24 및 25 중 어느 하나의 약학적 조성물로 투여되는 방법이다.
실시예 33은 실시예 1 내지 13 중 어느 하나의 융합 단백질을 포함하는 PDGF 및 VEGF에 대한 이량체 길항제이다.
실시예 34는 PDGF 및 VEGF로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 리간드에 결합된 실시예 1 내지 13 중 어느 하나의 융합 단백질을 포함하는 단백질 접합체이다.
실험예
본 발명의 하기 실험예는 본 발명의 특성을 추가로 설명하기 위한 것이다. 하기 실험예는 본 발명을 제한하지 않으며 본 발명의 범위는 첨부된 청구범위에 의해 결정된다는 것을 이해해야 한다.
실험예 1. 융합 단백질의 생산, 발현, 정제 및 분석
PDGFRp의 Ig-유사 도메인 D1-D3를 갖는 PDGFR 세포 외 Ig-유사 도메인(PID)(서열번호 2)(Heidaran et al, FASEB J . 1995 Jan;9(l):140-5; Lokker et al, J Biol Chem. 1997 Dec 26;272(52):33037-44), 및 VEGFR-1의 Ig-유사 도메인 D2(VEGFR-1_D2)와 VEGFR-2의 Ig-유사 도메인 D3(VEGFR-2_D3)를 갖는 VEGFR 세포 외 Ig-유사 도메인(VID)(서열번호 7)(Holash, J., et al, PNAS, 2002, 99 (17): 1393-98)가 융합 단백질로 합쳐졌다. 정확한 폴딩(folding)을 보장하고 입체 장애를 최소화하기 위하여, 짧은 가변성 펩타이드 링커인 GGGGGS(서열번호 20)를 Fc 영역의 C-말단(서열번호 12)과 N-말단 모듈(PID 또는 VID) 사이에 위치시켰다. 제조된 융합 단백질 2 또는 융합 단백질 1의 분비를 보장하도록 신호 펩타이드(예: 서열번호 34 또는 서열번호 36)를 포함하였다. 인간 IgG1의 Fc 영역은 융합 단백질의 이량체화, 생체 내 수용체 이량체화를 모방하고, 발현된 융합 단백질의 용이한 정제를 가능하게 하기 위하여 합쳐졌다.
각각 서열번호 38 및 40의 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질 1 및 2의 코딩 서열을 인간 배아 신장 세포주(HEK293F)에 형질 감염시키고 발현시켰다. 분비된 융합 단백질은 one-step Protein G chromatography를 사용하여 세포 배양 상등액(supernatant)으로부터 정제하였다. 단백질을 Protein G affinity column(Thermo-Fisher Scientific)으로 포획하고, 낮은 pH(3.5) 완충액으로 용출시키고, Tris-HCl로 중화시켰다. 도 2A-2C에 도시된 바와 같이, 90 % 이상의 순도가 단일 단계 정제 방법을 사용하여 달성되었다. 도 2A-2C는 또한 정제된 융합 단백질 1, 2, 3 및 5가 포유동물 세포에서 발현될 때 예측된 중량(MW ~180kDa)을 가지며 적절하게 이량체화된 것을 보여준다.
발달(development) 중에, 융합 단백질 1의 코딩 서열, 즉 서열번호 37을 발현 벡터에 도입하였다. PDGF에 대한 정제된 융합 단백질 1의 경쟁적 결합 분석 결과 및 융합 단백질 1의 PDGF-의존성 BATB/3T3 세포 성장 억제 분석의 결과는, 융합 단백질 1의 결합 능력에 위치적인 효과가 있음을 나타내며, 예를 들면, 이는 PDGF-BB에 대하여 훨씬 낮은 친화도를 갖는다(표 4 및 표 6 참조).
따라서, 융합 단백질 2는 VID 및 PID의 방향을 재배열하여 구성하였다. 융합 단백질 2의 코딩 서열, 즉 서열번호 39를 발현 벡터에 도입하였다. HEK293F 숙주 세포를 적절한 양의 발현 벡터 DNA를 사용하여 발현 벡터로 형질 감염시켰다. 안정한 클론을 항-Fc ELISA에 의해 평가된 단백질 발현 수준에 기초하여 선택하였고, 최적 수준의 융합 단백질 발현을 갖는 클론으로부터 연구 세포 은행(RCB)을 제작하였다. 융합 단백질 2 RCB는 쉐이크 플라스크(shake flask) 단백질 생산에 사용되었으며, 단백질은 배양 상등액으로부터 Protein A 친화성 수지를 사용하여 정제되었다. 단백질을 부형제와 함께 인산 완충액으로 완충액 교환하였다. 정제된 융합 단백질 2의 최종 농도는 약 20 mg/mL이었다.
융합 단백질 2의 돌연변이유발(Mutagenesis)은 융합 단백질 2의 변이체, 예를 들면, IgG1 Fc의 C-말단에서 라이신 잔기(K528) 결실 및 융합 단백질 2의 PID에서 페닐알라닌이 세린으로 돌변변이 되는 것을 포함하는 융합 단백질 3을 생성하기 위해 얻어졌다. 2-단계 PCR 돌연변이유발 방법을 사용하여 먼저 라이신을 제거한 다음, 페닐알라닌을 세린으로 변경했다. 최종 구조물은 서열번호 43의 코딩 서열을 포함한다. 적절한 양의 발현 벡터 DNA를 사용하여 CHO-S 숙주 세포를 발현 벡터로 형질 감염시켰다. 항-Fc ELISA에 의해 평가된 단백질 발현 수준에 기초하여 최초의 안정한 클론을 선택하였다. 이것은 서열번호 44의 21-769 아미노산 서열(서열번호 44의 1 내지 20 아미노산은 단백질 합성 동안 절단된 신호 펩타이드 서열임)을 갖는 융합 단백질 3을 생산하는데 사용되었다. 단클론 항체 문제는 FACS에 의해 제거되었으므로, 1라운드의 재조합이 수행되었다. 발현 수준에 기초하여 두 번째 안정한 클론을 선택하고, 클론을 사용하여 융합 단백질 4 RCB를 제작하였다. 융합 단백질 4 RCB는 쉐이크 플라스크 연구 및 생물반응기(bioreactor) 생산에 사용되었다. 융합 단백질 4 RCB 바이알(vial)을 해동하고 1L 쉐이크 플라스크에서 팽창시켜 융합 단백질 3과 동일한 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질 4를 제조하였다. 정제된 단백질 6 집단(batches)은 단백질 A 친화성 수지(1 단계 정제)를 이용하여 준비되었다. 단백질을 부형제와 함께 히스티딘 완충액으로 완충액 교환하였다. 융합 단백질 4의 최종 농도는 약 20 mg/mL이었다.
충분한 양의 융합 단백질 4를 얻기 위하여, 7 L 생물반응기(BR)를 약 5 L의 최종 작업 부피로 작동시켰다. 플랫폼 조작 절차, 파라미터 설정, 및 제어 전략이 사용되었고, 배지 유형 및 공급 계획을 따랐다. 최종 생성물 최종 농도(titer)는 0.21 g/L이었다.
정제된 융합 단백질 샘플은 정화(clarification), 단백질 A 친화성 크로마토그래피, 제 1 한외여과 단계, 크기 배제 크로마토그래피, 제 2 한외여과 단계, 투석 및 제 3 한외여과 단계를 추가적으로 수행하여 최종 생성물을 수득하였다.
서열번호 50의 20-768 아미노산 서열(서열번호 50의 1 내지 19 아미노산은 단백질 합성 동안 절단된 신호 펩타이드 서열임)을 갖는 융합 단백질 5를 제작하기 위하여, 융합 단백질 5를 코딩하는 DNA 서열이 CHO 세포에서의 발현에 대해 코돈-최적화되었다. 서열번호 49의 핵산 서열을 갖는 합성된 코돈-최적화 DNA를 발현 벡터에 형질 전환하였다. 형질 전환하기 72 시간 전에, 4 mM 글루타민(J.T Baker 2078-06) 및 1 % HT 보충제(Gibco 11067-030)를 포함하는 CD CHO(Gibco 12490-003)에 CHO Kl 숙주 세포를 2x105 세포/mL로 접종하였다. 숙주 세포를 Infors 쉐이커 (36.5 ℃, 75 % 습도, 6 % CO2, 110 RPM)에서 배양하고 사용 전에 세포 밀도를 위하여 계수하였다. 적당량의 발현 플라스미드 DNA를 숙주 세포에 첨가하고(1 L 또는 5 L 작업 부피), 폴리머-기초 형질 전환 시약을 첨가하였다. 형질 전환된 배양물을 Infors 쉐이커(36.5 ℃, 75 % 습도, 6 % CO2, 110 RPM)에서 4 시간 동안 배양하고, proprietary feed 용액을 첨가하였다. 형질 감염된 배양물을 Infors 쉐이커(32 ℃, 75 % 습도, 6 % CO2, 110 RPM)에서 배양하였다. 형질 감염된 배양액을 형질 감염 후 10 일째에 수확하였다. 상등액은 연구 물질의 생산을 위해 정제되었다. 정제 과정은 정화, 단백질 A 친화성 크로마토그래피, Amicon Ultracel에 의한 농축, 크기 배제 크로마토그래피, Slide-A-Lyzer에 의한 투석 및 제형 완충액 중의 Amicon Ultracel에 의한 최종 농축을 포함한다.
서열번호 42의 20-766 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질 6은 융합 단백질 5의 처음 두 아미노산(QG)을 결실시킴으로써, 융합 단백질 5로부터 유래되었고, 상기 서열번호 42의 아미노산 1 내지 19 아미노산이 단백질 합성 동안 절단된 신호 펩타이드 서열이다. DNA 삽입물은 융합 단백질 5 발현 벡터를 주형으로 사용하여 PCR에 의해 생성되었고, 융합 단백질 6을 코딩하는 DNA 서열, 서열번호 41의 핵산 서열,은 발현 벡터 내로 클로닝되었다. 배양 및 정제 과정은 융합 단백질 5와 동일하였다. 융합 단백질 6의 최종 농도는 디자인된 제형 완충액(280 nm에서의 흡수에 기초)에서 약 80 mg/mL이었다.
종합적으로, 이들 데이터는 항-VEGF 및 항-PDGF에 활성을 갖는 융합 단백질이 생성, 발현, 정제 및 특성화되었음을 나타낸다.
실험예 2. 융합 단백질의 VEGF 165 에 대한 결합 친화도
본 발명의 융합 단백질의 VEGF-A의 이어맞춤 변이체(splice variant)인 VEGF165에 대한 결합 친화도를 시험하기 위하여, 직접 결합 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)를 실시하였다. 합성된 VEGF 트랩을 양성 대조군 1로 사용하였다.
VEGF 트랩은 치료용으로 설계된 수용성 VEGF 수용체이며, 현재 AMD 치료를 위해 FDA의 승인을 받았다. VEGF 트랩은 인간 IgG1의 Fc 영역에 융합된 VEGFR2의 제 3 Ig-유사 도메인(D3)에 융합된 VEGFR1의 제 2 Ig-유사 도메인(D2)을 함유한다(Holash, J., et al, Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 Aug 20;99(17):1 1393-8). VEGF 트랩은 VEGF-A, VEGF-B 및 P1GF를 표적으로 한다.
96-웰 ELISA 플레이트의 각 웰에 코팅 용액(lx 인산염 완충 용액 (PBS) 중의 1 μg/mL VEGF165, pH 7.2) 100 μL을 첨가하고, 플레이트를 4 에서 밤새 배양하였다. 웰을 1x PBS 완충액 400 μL로 2 회 세척하고, 과량의 액체(excess liquid)는 종이 타월로 조심스럽게 제거하였다.
블로킹 용액(100 mL 1x PBS 중의 5 g 탈지유) 400 μL를 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 실온에서 1 시간 동안 배양하였다. 웰을 1x PBS 완충액으로 2 회 세척하였다.
융합 단백질 및 대조군 샘플을 10 mM의 가장 높은 단백질 농도로 블로킹 용액에서 3 배 희석하였다. 연속 희석된 샘플 100 μL를 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 덮고, 실온에서 1 시간 동안 플레이트 진탕기(-100 rpm)에서 배양하였다. 웰을 세척 완충액(1x PBS, 0.05 % Tween-20)으로 3 회 세척하였다.
블로킹 용액 중의 1:2500 희석된 horseradish 퍼옥시다제-접합 염소 항-인간 IgG Fc 특이적 항체 100 μL를 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하고 실온에서 1 시간 동안 플레이트 진탕기에서 배양하였다. 플레이트를 세척 완충액으로 3 회 세척하였다.
3,5,3',5'-테트라메틸벤지딘(TMB) 100 μL를 각 웰에 첨가하고, 반응이 일어나도록 플레이트를 3 내지 5 분 동안 배양하였다. 반응을 멈추기 위해, 정지 용액(1N HCl) 100 μL를 각 웰에 첨가하였다.
각 웰의 광학 밀도(OD)는 450 nm의 흡수 파장에서 ELISA 플레이트 판독기를 사용하여 측정하였다. 융합 단백질 또는 대조군의 단백질 농도에 대해 흡광도를 플롯하고, 신호가 최대 유효 농도의 절반인 농도(EC50)를 측정하였다.
측정된 EC50 값으로 나타낸 결합 친화도는 본 발명의 융합 단백질에 대해 0.22 내지 0.93 nM 사이인 것으로 확인되었다. ELISA 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
실험 재료 EC50(nM)
양성 대조군 1 0.087
융합 단백질 1 (서열번호 38) 0.220
융합 단백질 2 (서열번호 40) 0.928
융합 단백질 3 (서열번호 44의 21-769 아미노산) 0.477
융합 단백질 4 (서열번호 44의 21-769 아미노산) 0.384
융합 단백질 5 (서열번호 50의 20-768 아미노산) 0.388
본 실험예의 결과는 본 발명의 융합 단백질, 예컨대 융합 단백질 1 내지 5가 VEGF165와 고친화적으로 결합함을 나타낸다. 도 3도 같다.
실험예 3. 융합 단백질의 PDGF에 대한 결합 친화도
본 발명의 융합 단백질의 PDGF에 대한 결합 친화도를 시험하기 위하여, 직접 결합 ELISA를 실시하였다. 합성된 PDGF 트랩을 양성 대조군 2로 사용하였다.
PDGF 트랩은 양성 대조군으로서 사용하기 위하여 설계된 가용성 PDGF 수용체이다. PDGF 트랩은 인간 IgG1의 Fc 영역에 융합된 PDGFRp의 제 2 Ig-유사 도메인(D1 내지 D3)을 포함한다(Lu et al. Am J Obstet Gynecol, 2008, 198(4): 477.el-el0). PDGF 트랩은 PDGF-BB, PDGF-DD 및 PDGF-AB를 표적으로 한다.
96-웰 ELISA 플레이트의 각 웰에 코팅 용액(lx 인산염 완충 용액 (PBS) 중의 1 μg/mL PDGF-BB, pH 7.2) 100 μL을 첨가하고, 플레이트를 4 에서 밤새 배양하였다. 웰을 1x PBS 완충액 400 μL로 2 회 세척하고, 과량의 액체는 종이 타월로 조심스럽게 제거하였다.
블로킹 용액(100 mL 1x PBS 중의 1 g 소혈청알부민) 400 μL를 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 실온에서 1 시간 동안 배양하였다. 웰을 1x PBS 완충액으로 2 회 세척하였다.
융합 단백질 및 대조군 샘플을 10 mM의 가장 높은 단백질 농도로 블로킹 용액에서 3 배 희석하였다. 연속 희석된 샘플 100 μL를 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 덮고, 실온에서 1 시간 동안 플레이트 진탕기(-100 rpm)에서 배양하였다. 웰을 세척 완충액(1x PBS, 0.05 % Tween-20)으로 3 회 세척하였다.
블로킹 용액 중의 1:2500 희석된 horseradish 퍼옥시다제-접합 염소 항-인간 IgG Fc 특이적 항체 100 μL를 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하고 실온에서 1 시간 동안 플레이트 진탕기에서 배양하였다. 플레이트를 세척 완충액으로 3 회 세척하였다.
3,5,3',5'-테트라메틸벤지딘(TMB) 100 μL를 각 웰에 첨가하고, 반응이 일어나도록 플레이트를 3 내지 5 분 동안 배양하였다. 반응을 멈추기 위해, 정지 용액(IN HC1) 100 μL를 각 웰에 첨가하였다.
각 웰의 광학 밀도(OD)는 450 nm의 흡수 파장에서 ELISA 플레이트 판독기를 사용하여 측정하였다. 융합 단백질 또는 대조군의 단백질 농도에 대해 흡광도를 플롯하고, 신호가 최대 유효 농도의 절반인 농도(EC50)를 측정하였다.
측정된 EC50 값으로 나타낸 결합 친화도는 본 발명의 융합 단백질에 대해 0.16 내지 2.5 nM 사이인 것으로 확인되었다. ELISA 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
실험 재료 EC50(nM)
양성 대조군 1 1.354
융합 단백질 1 0.160
융합 단백질 2 0.939
융합 단백질 3 2.285
융합 단백질 4 2.538
융합 단백질 5 2.286
본 실험예의 결과는 본 발명의 융합 단백질, 예컨대 융합 단백질 1 내지 5가 PDGF와 고친화적으로 결합함을 나타낸다. 도 4도 같다.
실험예 4. 융합 단백질의 PDGF -BB에 대한 경쟁적 결합
본 발명의 융합 단백질의 VEGF165에 대한 결합 친화력을 시험하기 위하여, 경쟁적 결합 분석을 실시하였다. 합성된 VEGF 트랩을 양성 대조군 1로 사용하였다.
융합 단백질 및 대조군 샘플을 10 mM의 가장 높은 단백질 농도를 갖는 블로킹 용액에서 3 배 희석하였다. 균등 부피로 희석된 샘플을 10 pM의 VEGF165와 함께 5 pM VEGF-A(R&D System)의 최종 농도로 실온에서 밤새 배양하였다.
Quantikine ELISA 인간 VEGF 키트(R & D Systems, Inc.)의 분석 희석액 50 μL를 96-웰 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 200 μL의 표준, 대조군 또는 융합 단백질을 적절한 웰에 이중으로(in duplicate) 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하고 실온에서 2 시간 동안 배양한 다음, 세척 완충액으로 3 회 세척하였다.
키트에서 제공된 VEGF165 접합체 200 μL를 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 밀봉하고 2 시간 동안 실온에서 배양하였다. 플레이트를 3 회 세척하였다.
키트에서 제공된 기질 용액 200 μL를 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 밀봉하고 실온에서 20 분 동안 배양하였다. 반응을 정지시키기 위해, 키트에서 제공된 정지 용액 50 μL를 각 웰에 첨가하였다.
각 웰의 OD는 450 nm 및 540 nm(또는 570 nm)의 흡수 파장에서 ELISA 플레이트 판독기를 사용하여 측정하였다. 결합되지 않은 VEGF165(유리 VEGF165)를 융합 단백질 또는 대조군의 단백질 농도에 대해 플롯하고, 유리 VEGF165로부터의 신호가 50 % 감소된 융합 단백질의 농도(IC50)를 측정하였다.
본 발명의 융합 단백질의 IC50 값은 약 3.78 내지 4.67 pM으로 측정되었다. 경쟁 결합 분석의 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
실험 재료 IC50(pM)
양성 대조군 1 5.173
융합 단백질 1 4.670
융합 단백질 2 3.780
융합 단백질 3 3.775
본 실험예의 결과는 본 발명의 융합 단백질, 예컨대 융합 단백질 1, 2 및 3이 VEGF와 고친화적으로 결합함을 나타낸다. 도 5A 및 6A도 같다.
실험예 5. 융합 단백질의 PDGF -BB에 대한 경쟁적 결합
본 발명의 융합 단백질의 PDGF-BB에 대한 결합 친화력을 시험하기 위하여, 경쟁적 결합 분석을 실시하였다. 합성된 PDGF 트랩을 양성 대조군 2로 사용하였다.
융합 단백질 및 대조군 샘플을 10 mM의 가장 높은 단백질 농도를 갖는 블로킹 용액에서 3 배 희석하였다. 균등 부피로 희석된 샘플을 20 pM의 PDGF-BB와 함께 10 pM의 최종 농도로 실온에서 밤새 배양하였다.
Quantikine ELISA 인간 PDGF-BB 키트의 분석 희석액 100 μL를 96-웰 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 100 μL의 표준, 대조군 또는 융합 단백질을 적절한 웰에 이중으로(in duplicate) 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하고 실온에서 2 시간 동안 배양한 다음, 세척 완충액으로 4 회 세척하였다.
키트에서 제공된 PDGF-BB 접합체 200 μL를 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 밀봉하고 1.5 시간 동안 실온에서 배양하였다. 플레이트를 4 회 세척하였다.
키트에서 제공된 기질 용액 200 μL를 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 밀봉하고 실온에서 20 분 동안 배양하였다. 반응을 정지시키기 위해, 키트에서 제공된 정지 용액 50 μL를 각 웰에 첨가하였다.
각 웰의 OD는 450 nm 및 540 nm(또는 570 nm)의 흡수 파장에서 ELISA 플레이트 판독기를 사용하여 측정하였다. 유리 PDGF-BB를 융합 단백질 또는 대조군의 단백질 농도에 대해 플롯하고, 유리 PDGF-BB로부터의 신호가 50 % 감소된 융합 단백질의 농도(IC50)를 측정하였다.
본 발명의 융합 단백질의 IC50 값은 약 0.125 내지 200 nM로 측정되었다. 경쟁 결합 분석의 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
실험 재료 IC50(pM)
양성 대조군 1 1.015
융합 단백질 1 200
융합 단백질 2 0.125
융합 단백질 3 1.371
본 실험예의 결과는 본 발명의 융합 단백질, 예컨대 융합 단백질 2 및 3이 PDGF와 고친화적으로 결합함을 나타낸다. 도 5B 및 6B도 같다.
실험예 6. 융합 단백질에 의한 HUVEC 증식 억제
본 발명의 융합 단백질의 기능을 시험하기 위하여, 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC) 증식 분석을 실시하였다. 합성된 VEGF 트랩을 양성 대조군 1로 사용하였다.
96-웰 ELISA 플레이트의 각 웰에 코팅용액 100 μL(이중 증류수 중 1 % 젤라틴)를 첨가하고, 37 ℃에서 2 시간 또는 밤새 배양하였다. 웰을 1x PBS 완충액으로 2 회 세척하였다.
내피 세포 성장 배지 내의 3500 카운트의 인간 제대 정맥 내피 세포를 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 37 ℃에서 밤새 배양하였다.
융합 단백질 샘플을 300 nM의 가장 높은 단백질 농도를 갖는 분석 완충액(Medium-199 lx Earle's Salts, 10 % 소혈청알부민, 10 mM HEPES, 1x 항생제/항균제)에 희석시켰다. 융합 단백질 샘플을 VEGF165(8 ng/mL)와 혼합하고, 혼합물을 실온에서 하룻밤 배양하였다. 이어서, 웰을 1x PBS 200 μL로 세척하였다.
100 μL의 VEGF165/샘플 혼합물을 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 72 시간 동안 37 ℃에서 5 % CO2로 배양하였다. 배양 후, 10 μL MTS 검출 시약((3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2Htetrazolium)+(증류된 PBS 중의 페나진 메소설파이드))을 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 2.5 시간 동안 37 ℃에서 배양하였다.
각 웰의 OD는 490 nm의 흡수 파장에서 ELISA 플레이트 판독기를 사용하여 측정하였다. 융합 단백질 또는 대조군의 단백질 농도에 대해 흡광도를 플롯하고, 세포 증식을 50 % 저해하는 농도(IC50)를 측정하였다.
측정된 IC50은 본 발명의 융합 단백질에 대해 0.058 내지 0.285 nM 사이인 것으로 확인되었다. 증식 분석의 결과를 하기 표 5에 나타내었다.
실험 재료 IC50(pM)
양성 대조군 1 0.068
융합 단백질 1 0.058
융합 단백질 2 0.202
융합 단백질 3 0.153
융합 단백질 4 0.285
융합 단백질 5 0.112
본 실험예의 결과는 본 발명의 융합체, 예컨대 융합 단백질 1 내지 5가 ITUVEC 세포의 VEGF-의존성 성장을 억제함을 나타낸다. 도 7도 같다.
실험예 7. 융합 단백질에 의한 BALB /3T3 증식 억제
본 발명의 융합 단백질의 기능을 시험하기 위하여, BALB 마우스로부터 유래된 3T3 섬유아세포를 이용한 세포 증식 분석을 실시하였다. 합성된 PDGF 트랩을 양성 대조군 2로 사용하였다.
DMEM(1 mM 소듐피루베이트, 4mM L-글루타민, 10 % 소혈청알부민, 1x 항생제/항균제) 내의 4000카운트의 마우스 3T3 섬유아세포를 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 37 ℃에서 밤새 배양하였다.
융합 단백질 샘플을 300 nM의 가장 높은 단백질 농도를 갖는 분석 완충액(1 mM 소듐피루베이트, 4 mM L-글루타민, 0.5 % 소혈청알부민, 1x 항생제/항균제)에 희석시켰다. 융합 단백질 샘플을 PDGF(8 ng/mL)와 혼합하고, 혼합물을 실온에서 하룻밤 배양하였다. 이어서, 웰을 1x PBS 200 μL로 세척하였다.
세포를 37 ℃, 5 % CO2에서 4 시간 동안 분석 완충액으로 결핍시켰다. 100 μL의 PDGF/샘플 혼합물을 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 72 시간 동안 37 ℃, 5 % CO2에서 배양하였다. 배양 후, 10 μL MTS 검출 시약을 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 2.5 시간 동안 37 ℃에서 배양하였다.
각 웰의 OD는 490 nm의 흡수 파장에서 ELISA 플레이트 판독기를 사용하여 측정하였다. 융합 단백질 또는 대조군의 단백질 농도에 대해 흡광도를 플롯하고, 세포 증식을 50 % 저해하는 농도(IC50)를 측정하였다.
측정된 IC50은 본 발명의 융합 단백질에 대해 0.45 내지 1000 nM 사이인 것으로 확인되었다. 증식 분석의 결과를 하기 표 6에 나타내었다.
실험 재료 IC50(pM)
양성 대조군 2 0.260
융합 단백질 1 1000
융합 단백질 2 0.669
융합 단백질 3 0.1992
융합 단백질 4 0.708
융합 단백질 5 0.275
본 실험예의 결과는 본 발명의 융합체, 예컨대 융합 단백질 1 내지 5가 BALB/3T3 세포의 PDGF-의존성 성장을 억제함을 나타낸다. 도 8도 같다.
실험예 8. 융합 단백질에 의한 네덜란드 벨티드 토끼 (Dutch Belted Rabbits)에서의 VEGF -유도 누출의 억제
망막 혈관 신생의 생체 내 모델에서 혈관 누출 예방에 있어 본 발명의 융합 단백질의 효과를 측정하였다. 이 모델에서, VEGF는 망막의 통제되지 않는 신생 혈관 형성 및 이후 누출을 유도하기 위하여 토끼 눈의 유리체 내 주사되었다. VEGF-A를 억제함으로써 혈관 신생을 차단하는 재조합 인간화 모노클로날 항체인 Avastin®, 및 인간 IgG1의 Fc 부분에 융합된 인간 VEGFR1 및 VEGFR2의 부분으로 구성된 재조합 융합 단백질인 Eylea를 양성 대조군 3 및 4로 사용하였다.
네덜란드 벨티드 토끼를 아이소플루레인(3-5 %)을 사용하여 마취시키고, 눈에 ophthalmic Betadine 용액을 처리하였다. 토끼의 눈을 멸균된 생리 식염수로 씻은 후 리도카인 하이드로클로라이드(2 % 주사제) 또는 프로파라카인(0.5 %)을 안구 표면에 가했다.
1 일째에, 네덜란드 벨티드 토끼에 BD 300 μL 인슐린 주사기(31 게이지 ? 5/16 인치)를 사용하여 본 발명의 실시예에 따른 융합 단백질, 비히클(음성) 대조군, 또는 참조(양성) 대조군을 기결정된 용량으로 유리체 내에 주사하였다. 바늘은 눈의 상측두엽을 통해 삽입되었고, 사지 후측에 약 3-4 mm 정도, 등쪽 직근에 약 3-4 mm 정도의 길이로 삽입되었으며, 용액 50 μL이 전달되었다. 3 일째에, VEGF165를 동일한 눈에 주사하였다.
누출 및 비틀림을 평가하기 위하여, 0(정상)에서 4(중증)까지의 눈금을 사용하여 VEGF-유도 3 일 후(6 일째), 모든 투여 그룹에서 Fluorescein angiograms(FAs)를 실시하였다.
눈 자극의 징후는 융합 단백질 투여 전, VEGF 유도 전 및 FA 평가 전에 Draize 스코어링 시스템을 사용하여 나타냈다. Draize 분석에 따르면, 모든 토끼의 눈은 투여 시작 전에 정상이었으며, 연구 과정에서 약물 관련 소견은 없었다. Draize 시스템을 사용하여 채점한 결과는 일시적이었고, 모든 투여군에서 관찰되었으므로 유리체 내 투여와 관련된 절차로 인한 것일 수 있다.
비히클 대조군과 관련된 FA는 망막 혈관계 누출 및 비틀림과 관련하여 가장 높은 평균 점수(2.58)를 나타냈다. 2 개의 참조 양성 대조군은 평균 점수가 0.25 및 0이었으며, 이는 망막 혈관계 누출 및 비틀림의 유의한 감소를 의미한다. 본 발명의 융합 단백질은 0.167의 평균 점수를 나타냈으며, 양성 대조군 대비 VEGF-유도 망막 유출 및 비틀림을 효과적으로 감소시키는 것으로 나타났다. 생체 내 분석의 결과를 하기 표 7에 나타내었다.
실험 재료 용량(㎍) 점수 6일째 평균 유출 점수
비히클 0 12 2.583
양성 대조군 3
(Avastin®)		 1250 12 0.250
양성 대조군 4
(Eylea®)		 625 12 0
융합 단백질 4 1000 12 0.167
융합 단백질 5 1000 12 0.167
실험예 9. 융합 단백질에 의한 네덜란드 벨티드 토끼에서의 VEGF -유도 누출의 용량-반응 억제
망막 혈관 신생의 생체 내 모델에서 다양한 용량으로 시험하여 혈관 누출 예방에 있어 본 발명의 융합 단백질의 용량-반응 효과를 측정하였다. 이 모델에서, VEGF165는 망막의 통제되지 않는 신생 혈관 형성 및 이후 누출을 유도하기 위하여 토끼 눈의 유리체 내 주사되었다.
1 일째에, 네덜란드 벨티드 토끼에 다양한 용량의 본 발명의 실시예에 따른 융합 단백질 5, 비히클(음성) 대조군, 또는 참조(양성) 대조군을 유리체 내 주사하였다. VEGF 유도는 3 일째에 수행하였다.
누출 및 비틀림을 평가하기 위하여, 0(정상)에서 4(중증)까지의 눈금을 사용하여 VEGF-유도 3 일 후(6 일째), 모든 투여 그룹에서 FA를 실시하였다.
눈 자극의 징후는 융합 단백질 투여 전, VEGF 유도 전 및 FA 평가 전에 Draize 스코어링 시스템을 사용하여 나타냈다. Draize 분석에 따르면, 모든 토끼의 눈은 투여 시작 전에 정상이었으며, 연구 과정에서 약물 관련 소견은 없었다. Draize 시스템을 사용하여 채점한 결과는 일시적이었고, 모든 투여군에서 관찰되었으므로 유리체 내 투여와 관련된 절차로 인한 것일 수 있다.
첫 번째 VEGF-유도에 있어서, 비히클 대조군과 관련된 FA는 망막 혈관계 누출 및 비틀림과 관련하여 가장 높은 평균 점수(3.4)를 나타냈다. 2 개의 참조 양성 대조군은 평균 점수가 0 이었으며, 망막 혈관계 누출 및 비틀림의 유의한 감소를 의미한다. 본 발명의 융합 단백질(융합 단백질 5)은 각각 100, 500 및 1000 μg의 용량에서 각각 0.08, 0.42 및 0.7의 점수를 나타내어, 양성 대조군 대비 VEGF-유도 망막 유출 및 비틀림을 효과적으로 감소시키는 것으로 나타났다.
용량-반응 시험 관내 분석의 결과를 하기 표 8에 나타내었다.
실험 재료 용량(㎍) 점수 6일째 평균 유출 점수
비히클 0 12 3.400
양성 대조군 3
(Avastin®)		 1250 10 0
양성 대조군 4
(Eylea®)		 625 12 0
융합 단백질 4 1000 12 0.167
융합 단백질 5 500 12 0.417
융합 단백질 5 100 12 0.083
실험예 10. 융합 단백질에 의한 래트에서의 레이저-유도 맥락막 혈관 신생(CNV) 병변 크기의 감소
래트(Brown Norway)의 눈은 1 % Cyclogyl 용액으로 확장되어 빛으로부터 보호될 것이다. 확장 후, 래트는 케타민 및 크실라진 혼합물을 사용하여 마취될 것이다. 세 병변 화상은 1 일째 532 nm의 레이저를 사용하여 각 눈의 망막에 도입될 것이다.
3 일째에, 동물을 케타민 및 크실라진 혼합물로 마취시키고, 이들의 눈을 팽창시키고, 본 발명의 실시예에 따른 융합 단백질 5 μL, 비히클(음성) 대조군, 또는 참조(양성) 대조군을 기결정된 용량으로 33 게이지 바늘이 달린 해밀턴 주사기를 사용하여 동물의 양쪽 눈에 주사할 것이다.
22 일째에, 동물은 체중 당 1 μL/g의 10 % 플루오레신 나트륨이 복강 내 주사될 것이다. 성공적으로 병변을 확인하기 위하여, Micron III 소형 동물성 안저 검사(Phoenix Research)를 사용하여 병변 화상을 입은 후 병변이 도입되기 전에, 그리고 22 일째에 안저 사진을 찍을 것이다. 병변 크기를 재고 투여량 그룹간에 비교될 것이다.
실험예 11. 융합 단백질에 의한 원숭이에서의 레이저-유도 CNV 병변 크기의 감소
원숭이에서 레이저-유도 CNV 모델이 확립될 것이다. 532 nm 다이오드 레이저 열응고법을 사용하여 각 눈의 황반 주변에 6~9 배의 화상을 유발할 것이며, 같은 날 본 발명의 융합 단백질 0.5 mg을 유리체 내로 주사할 것이다.
동물은 20 일 후, 2.5 % 가용성 펜토비톤 (1 mL/kg)을 정맥 내 주사하여 진정될 것이다. 눈꺼풀을 고정시켜 눈을 뜨고 안료 사진기를 사용하여 컬러 사진을 찍을 것이다.
플루오레신 염료 (20 % fluorescein sodium, 0.05 mL/kg)가 하지의 정맥에 주입될 것이다. CNV 병변과 관련된 플루오레신의 누출을 모니터링하기 위하여 염료 주입 후 동맥기, 초기 동정맥기 및 몇 가지 후기 동정맥기를 포함한 여러 시점에서 사진을 찍을 것이다.
실험예 12. 융합 단백질에 의한 이종 이식편 마우스에서의 인간 종양 성장의 억제
인간 간세포 암종 Hep3B 세포(ATCC# HB-8064) 및 인간 대장암 LoVo 세포(ATCC# CCL-229)와 같은 다양한 인간 암세포를 사용하여 누드 마우스에서 이종 이식 모델을 확립할 수 있다.
종양 성장에 대한 본 발명의 융합 단백질의 억제 효과를 평가하기 위하여, 종양 세포를 누드 마우스에 이식하고, 본 발명의 실시예에 따른 다양한 농도의 융합 단백질이 0.1 내지 10 mg/kg, 매주 2 회 정맥 내 투여될 것이다. 종양의 성장은 최대 7 주 동안 매주 측정될 것이다.
실험예 13. 래트 및 원숭이에서의 융합 단백질의 약동학(Ocular Pharmacokinetic) 평가
본 발명의 융합 단백질의 약동학은 동물에서 평가될 것이다. 본 발명의 실시예에 따라 10 내지 300 mg/kg 범위의 융합 단백질이 피하 주사 또는 정맥 내 주사를 통해 래트 또는 원숭이에게 투여될 것이다. 혈액 샘플은 주사 후 최대 15 일 동안 다른 시점에서 얻을 것이다. 혈액 샘플에서 융합 단백질의 농도는 ELISA 방법을 사용하여 결정될 것이며, 약동학 파라미터가 계산될 것이다.
실험예 14. 토끼 및 원숭이에서의 융합 단백질의 안(Ocular) 약동학 평가
본 발명의 융합 단백질의 약동학은 동물에서 평가될 것이다. 본 발명의 실시예에 따라 눈 당 0.1 내지 4 mg 범위의 융합 단백질이 유리체 내 주사를 통해 토끼 또는 원숭이에게 투여될 것이다. 안구 조직 및 혈액 샘플은 주사 후 최대 28 일 동안 다른 시점에서 얻을 것이다. 안구 조직 및 혈액 샘플에서의 융합 단백질의 농도는 ELISA 방법을 사용하여 결정될 것이며, 약동학 파라미터가 계산될 것이다.
본 발명은 본 발명의 특정 실시예를 참조하여 상세히 설명되었지만, 당업자에게는 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 다양한 변경 및 수정이 이루어질 수 있음이 명백할 것이다.
<110> Allgenesis Biotherapeutics Inc. 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ttctgagtcc gtctcatgga attgaactat ctgttggaga aaagcttgtc 360 ttaaattgta cagcaagaac tgaactaaat gtggggattg acttcaactg ggaataccct 420 tcttcgaagc atcagcataa gaaacttgta aaccgagacc taaaaaccca gtctgggagt 480 gagatgaaga aattcttgag caccctgact atagatggtg taacccggag tgaccaagga 540 ttgtacacct gtgcagcatc cagtgggctg atgaccaaga agaacagcac atttgtcagg 600 gtccatgaaa aa 612 <210> 7 <211> 204 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VID sequence <400> 7 Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile 1 5 10 15 Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr 20 25 30 Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu 35 40 45 Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile 50 55 60 Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala 65 70 75 80 Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln 85 90 95 Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu 100 105 110 Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu 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aagaagaaca gcacatttgt cagggtccat 600 gaaaaa 606 <210> 10 <211> 202 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified VID sequence <400> 10 Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His 1 5 10 15 Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro 20 25 30 Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro 35 40 45 Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser 50 55 60 Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val 65 70 75 80 Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn 85 90 95 Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser 100 105 110 Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn 115 120 125 Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His 130 135 140 Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met 145 150 155 160 Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp 165 170 175 Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys 180 185 190 Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys 195 200 <210> 11 <211> 681 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 gacaaaactc acacatgtcc accgtgtcca gcacctgaac tcctgggtgg accgtcagtc 60 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 120 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 180 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 240 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 300 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 360 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 420 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 480 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 540 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 600 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 660 ctctccctgt ctccgggtaa a 681 <210> 12 <211> 227 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205 His Glu Ala 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<210> 14 <211> 678 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding sequence for Fc sequence of Fusion Protein 4 <400> 14 gacaaaactc acacatgtcc accgtgtcca gcacctgaac tcctgggtgg accgtcagtc 60 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 120 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 180 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 240 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 300 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 360 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 420 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 480 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 540 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 600 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 660 ctctccctgt ctccgggt 678 <210> 15 <211> 226 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified Fc 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of a linker sequence <400> 23 ggcggcggcg gcagcggcgg aggcggatcc ggcggaggcg gctcc 45 <210> 24 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker sequence <400> 24 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 25 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding sequence of a linker sequence <400> 25 ggagacacc 9 <210> 26 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker sequence <400> 26 Gly Asp Thr 1 <210> 27 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding sequence of a linker sequence <400> 27 ggtgga 6 <210> 28 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker sequence <400> 28 Gly Gly 1 <210> 29 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding sequence of a linker sequence <400> 29 ggaggcggtg gatctggtgg cggtggaagc ggaggtggag gttcc 45 <210> 30 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker sequence <400> 30 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 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<210> 37 <211> 2217 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding sequence of Fusion Protein 1 sequence <400> 37 gacactggaa gaccttttgt tgaaatgtat tctgaaattc ctgaaattat tcatatgact 60 gaaggaagag aacttgttat tccttgtaga gttacttctc ctaatattac tgttactctt 120 aagaagtttc ctcttgatac tcttattcct gatggaaaga gaattatttg ggattctaga 180 aagggattta ttatttctaa tgctacttat aaggaaattg gacttcttac ttgtgaagct 240 actgttaatg gacatcttta taagactaat tatcttactc atagacaaac taataccatc 300 atcgacgtgg ttctgagtcc gtctcatgga attgaactat ctgttggaga aaagcttgtc 360 ttaaattgta cagcaagaac tgaactaaat gtggggattg acttcaactg ggaataccct 420 tcttcgaagc atcagcataa gaaacttgta aaccgagacc taaaaaccca gtctgggagt 480 gagatgaaga aattcttgag caccctgact atagatggtg taacccggag tgaccaagga 540 ttgtacacct gtgcagcatc cagtgggctg atgaccaaga agaacagcac atttgtcagg 600 gtccatgaaa aagacaaaac tcacacatgt ccaccgtgtc cagcacctga actcctgggt 660 ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 720 cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 780 tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 840 aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 900 aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 960 tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat 1020 gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1080 atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1140 gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1200 tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1260 acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaaggtggag gaggcggtgg atccggatct 1320 cagggcctgg tcgtcacacc cccggggcca gagcttgtcc tcaatgtctc cagcaccttc 1380 gttctgacct gctcgggttc agctccggtg gtgtgggaac ggatgtccca ggagccccca 1440 caggaaatgg ccaaggccca ggatggcacc ttctccagcg tgctcacact gaccaacctc 1500 actgggctag acacgggaga atacttttgc acccacaatg actcccgtgg actggagacc 1560 gatgagcgga aacggctcta catctttgtg ccagatccca ccgtgggctt cctccctaat 1620 gatgccgagg aactattcat ctttctcacg gaaataactg agatcaccat tccatgccga 1680 gtaacagacc cacagctggt ggtgacactg cacgagaaga aaggggacgt tgcactgcct 1740 gtcccctatg atcaccaacg tggctttttt ggtatctttg aggacagaag ctacatctgc 1800 aaaaccacca ttggggacag ggaggtggat tctgatgcct actatgtcta cagactccag 1860 gtgtcatcca tcaacgtctc tgtgaacgca gtgcagactg tggtccgcca gggtgagaac 1920 atcaccctca tgtgcattgt gatcgggaat gaggtggtca acttcgagtg gacatacccc 1980 cgcaaagaaa gtgggcggct ggtggagccg gtgactgact tcctcttgga tatgccttac 2040 cacatccgct ccatcctgca catccccagt gccgagttag aagactcggg gacctacacc 2100 tgcaatgtga cggagagtgt gaatgaccat caggatgaaa aggccatcaa catcaccgtg 2160 gttgagagcg gctacgtgcg gctcctggga gaggtgggca cactacaatt tgctgag 2217 <210> 38 <211> 739 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion Protein 1 sequence <400> 38 Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile 1 5 10 15 Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr 20 25 30 Ser Pro Asn Ile 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tggctttttt ggtatctttg aggacagaag ctacatctgc 480 aaaaccacca ttggggacag ggaggtggat tctgatgcct actatgtcta cagactccag 540 gtgtcatcca tcaacgtctc tgtgaacgca gtgcagactg tggtccgcca gggtgagaac 600 atcaccctca tgtgcattgt gatcgggaat gaggtggtca acttcgagtg gacatacccc 660 cgcaaagaaa gtgggcggct ggtggagccg gtgactgact tcctcttgga tatgccttac 720 cacatccgct ccatcctgca catccccagt gccgagttag aagactcggg gacctacacc 780 tgcaatgtga cggagagtgt gaatgaccat caggatgaaa aggccatcaa catcaccgtg 840 gttgagagcg gctacgtgcg gctcctggga gaggtgggca cactacaatt tgctgaggct 900 agcgacaaaa ctcacacatg tccaccgtgt ccagcacctg aactcctggg tggaccgtca 960 gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 1020 acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 1080 gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 1140 taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 1200 aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 1260 aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc 1320 aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 1380 gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1440 tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1500 gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1560 agcctctccc tgtctccggg taaaggtgga ggaggcggtg gatctggtgg cggtggaagc 1620 ggaggtggag gttccggaga cactggtaga ccttttgttg aaatgtattc tgaaattcct 1680 gaaattattc atatgactga aggaagagaa cttgttattc cttgtagagt tacttctcct 1740 aatattactg ttactcttaa gaagtttcct cttgatactc ttattcctga tggaaagaga 1800 attatttggg attctagaaa gggatttatt atttctaatg ctacttataa ggaaattgga 1860 cttcttactt gtgaagctac tgttaatgga catctttata agactaatta tcttactcat 1920 agacaaacta ataccatcat cgacgtggtt ctgagtccgt ctcatggaat tgaactatct 1980 gttggagaaa agcttgtctt aaattgtaca gcaagaactg aactaaatgt ggggattgac 2040 ttcaactggg aatacccttc ttcgaagcat cagcataaga aacttgtaaa ccgagaccta 2100 aaaacccagt ctgggagtga gatgaagaaa 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aagacaaaac tcacacatgt ccaccgtgtc cagcacctga actcctgggt 720 ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 780 cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 840 tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 900 aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960 aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1020 tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat 1080 gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1140 atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1200 gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1260 tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1320 acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaa 1353 <210> 46 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGF Trap sequence Plus a signal sequence <400> 46 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu 20 25 30 Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro 35 40 45 Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro 50 55 60 Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg 65 70 75 80 Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu 85 90 95 Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu 100 105 110 Thr His Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser 115 120 125 His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr 130 135 140 Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro 145 150 155 160 Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr 165 170 175 Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp 180 185 190 Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser 195 200 205 Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Pro Gly Lys 450 <210> 47 <211> 1644 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding sequence of PDGF Trap sequence <400> 47 atggagacag acacactcct gctatgggta ctgcttcttt gggttcccgg atccactggc 60 cagggcctgg tcgtcacacc cccggggcca gagcttgtcc tcaatgtctc cagcaccttc 120 gttctgacct gctcgggttc agctccggtg gtgtgggaac ggatgtccca ggagccccca 180 caggaaatgg ccaaggccca ggatggcacc ttctccagcg tgctcacact gaccaacctc 240 actgggctag acacgggaga atacttttgc acccacaatg actcccgtgg actggagacc 300 gatgagcgga aacggctcta catctttgtg ccagatccca ccgtgggctt cctccctaat 360 gatgccgagg aactattcat ctttctcacg gaaataactg agatcaccat tccatgccga 420 gtaacagacc cacagctggt ggtgacactg cacgagaaga aaggggacgt tgcactgcct 480 gtcccctatg atcaccaacg tggctttttt ggtatctttg aggacagaag ctacatctgc 540 aaaaccacca ttggggacag ggaggtggat tctgatgcct actatgtcta cagactccag 600 gtgtcatcca tcaacgtctc tgtgaacgca gtgcagactg tggtccgcca gggtgagaac 660 atcaccctca tgtgcattgt gatcgggaat gaggtggtca acttcgagtg gacatacccc 720 cgcaaagaaa gtgggcggct ggtggagccg gtgactgact tcctcttgga tatgccttac 780 cacatccgct ccatcctgca catccccagt gccgagttag aagactcggg gacctacacc 840 tgcaatgtga cggagagtgt gaatgaccat caggatgaaa aggccatcaa catcaccgtg 900 gttgagagcg gctacgtgcg gctcctggga gaggtgggca cactacaatt tgctgaggct 960 agcgacaaaa ctcacacatg tccaccgtgt ccagcacctg aactcctggg tggaccgtca 1020 gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 1080 acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 1140 gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 1200 taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 1260 aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 1320 aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc 1380 aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 1440 gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1500 tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1560 gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1620 agcctctccc tgtctccggg taaa 1644 <210> 48 <211> 548 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PDGF Trap sequence plus a signal sequence <400> 48 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Gln Gly Leu Val Val Thr Pro Pro Gly Pro Glu Leu 20 25 30 Val Leu Asn Val Ser Ser Thr Phe Val Leu Thr Cys Ser Gly Ser Ala 35 40 45 Pro Val Val Trp Glu Arg Met Ser Gln Glu Pro Pro Gln Glu Met Ala 50 55 60 Lys Ala Gln Asp Gly Thr Phe Ser Ser Val Leu Thr Leu Thr Asn Leu 65 70 75 80 Thr Gly Leu Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Thr His Asn Asp Ser Arg 85 90 95 Gly Leu Glu Thr Asp Glu Arg Lys Arg Leu Tyr Ile Phe Val Pro Asp 100 105 110 Pro Thr Val Gly Phe Leu Pro Asn Asp Ala Glu Glu Leu Phe Ile Phe 115 120 125 Leu Thr Glu Ile Thr Glu Ile Thr Ile Pro Cys Arg Val Thr Asp Pro 130 135 140 Gln Leu Val Val Thr Leu His Glu Lys Lys Gly Asp Val Ala Leu Pro 145 150 155 160 Val Pro Tyr Asp His Gln Arg Gly Phe Phe Gly Ile Phe Glu Asp Arg 165 170 175 Ser Tyr Ile Cys Lys Thr Thr Ile Gly Asp Arg Glu Val Asp Ser Asp 180 185 190 Ala Tyr Tyr Val Tyr Arg Leu Gln Val Ser Ser Ile Asn Val Ser Val 195 200 205 Asn Ala Val Gln Thr Val Val Arg Gln Gly Glu Asn Ile Thr Leu Met 210 215 220 Cys Ile Val Ile Gly Asn Glu Val Val Asn Phe Glu Trp Thr Tyr Pro 225 230 235 240 Arg Lys Glu Ser Gly Arg Leu Val Glu Pro Val Thr Asp Phe Leu Leu 245 250 255 Asp Met Pro Tyr His Ile Arg Ser Ile Leu His Ile Pro Ser Ala Glu 260 265 270 Leu Glu Asp Ser Gly Thr Tyr Thr Cys Asn Val Thr Glu Ser Val Asn 275 280 285 Asp His Gln Asp Glu Lys Ala Ile Asn Ile Thr Val Val Glu Ser Gly 290 295 300 Tyr Val Arg Leu Leu Gly Glu Val Gly Thr Leu Gln Phe Ala Glu Ala 305 310 315 320 Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 325 330 335 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 340 345 350 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 355 360 365 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 370 375 380 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 385 390 395 400 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 405 410 415 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 420 425 430 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 435 440 445 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val 450 455 460 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 465 470 475 480 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 485 490 495 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 500 505 510 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 515 520 525 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 530 535 540 Ser Pro Gly Lys 545 <210> 49 <211> 2250 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding sequence of Fusion Protein 5 sequence <400> 49 cagggcctgg tcgtgacacc tcccggaccc gagctggtgc tcaacgtctc ctccaccttt 60 gtgctgacat gcagcggcag cgctcctgtg gtctgggaac ggatgtccca ggagcctccc 120 caggaaatgg ccaaggccca ggacggcacc ttttccagcg tcctcacact caccaacctg 180 acaggcctgg acaccggcga gtacttttgc acccacaatg actccagggg actggaaacc 240 gatgagcgga agcggctcta cattttcgtc cccgacccca ccgtcggatt tctgcctaat 300 gacgctgaag agctgtttat cttcctgaca gagatcaccg aaatcaccat cccctgtcgg 360 gtcaccgatc cccagctggt ggtcacactg cacgagaaga agggagatgt cgccctgcct 420 gtgccttatg accatcagag gggcttttcc ggcattttcg aggacaggag ctacatctgc 480 aaaaccacca tcggagaccg ggaggtcgac agcgatgcct attacgtcta ccggctccag 540 gtctcctcca tcaatgtgag cgtgaatgct gtccagacag tggtccggca gggcgagaat 600 atcacactga tgtgcattgt cattggcaac gaggtggtca acttcgagtg gacctatcct 660 aggaaggaga gcggccggct cgtcgaacct gtgaccgact tcctcctgga catgccttac 720 cacattcggt ccatcctgca cattcctagc gccgagctgg aggacagcgg aacctacacc 780 tgcaacgtga ccgagtccgt gaatgaccac caggatgaga aggccatcaa catcacagtc 840 gtggagagcg gatacgtcag gctgctcgga gaagtcggca cactgcagtt cgccgaggcc 900 agcgataaga cccacacctg tcctccttgt cctgctcctg agctcctcgg cggacctagc 960 gtgttcctgt ttccccctaa gcctaaagac accctcatga tcagccggac ccccgaggtc 1020 acatgcgtgg tggtcgacgt ctcccatgag gatcccgagg tgaagttcaa ttggtacgtc 1080 gacggcgtcg aggtccacaa tgccaaaacc aaaccccggg aggagcagta caacagcacc 1140 tatagggtgg tcagcgtcct gaccgtgctg caccaagact ggctgaacgg caaggagtac 1200 aaatgcaaag tcagcaataa ggccctcccc gcccccattg agaagaccat ctccaaggct 1260 aagggccaac ctagggagcc ccaggtgtac accctgcctc ccagccggga tgagctgaca 1320 aagaaccagg tgagcctcac ctgtctggtg aagggctttt acccctccga tattgccgtg 1380 gagtgggaaa gcaacggaca gcctgagaac aactacaaga caaccccccc tgtcctggac 1440 agcgatggct ccttcttcct gtacagcaag ctgacagtgg ataagagccg gtggcagcag 1500 ggaaacgtct ttagctgcag cgtgatgcat gaggccctgc acaatcacta cacccagaag 1560 tccctgtccc tgagccctgg cggaggcggc ggcggcggca gcggcggagg cggatccggc 1620 ggaggcggct ccggagacac cggaaggccc ttcgtggaga tgtacagcga gattcctgag 1680 attatccaca tgaccgaggg acgggaactg gtgattccct gccgggtcac cagccccaac 1740 atcaccgtga ccctcaagaa gttccccctg gacaccctga tccctgacgg caaaaggatt 1800 atctgggaca gccggaaggg ctttatcatc agcaatgcca catacaagga gattggactc 1860 ctgacctgcg aggctacagt caacggacac ctgtacaaga ccaactacct gacccaccgg 1920 cagaccaata ccatcatcga cgtggtgctg agccccagcc acggaattga gctgagcgtg 1980 ggagaaaaac tcgtgctcaa ctgcacagcc cggaccgaac tcaatgtcgg aatcgacttc 2040 aactgggaat accccagctc caagcaccag cacaagaagc tggtcaaccg ggatctcaag 2100 acccagtccg gcagcgaaat gaagaagttc ctcagcaccc tgaccatcga tggcgtcaca 2160 aggagcgatc agggactcta cacctgcgcc gctagctccg gactcatgac caagaagaac 2220 tccacatttg tccgggtgca cgaaaagtga 2250 <210> 50 <211> 768 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion Protein 5 plus a signal peptide sequence <400> 50 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Gln Gly Leu Val Val Thr Pro Pro Gly Pro Glu Leu Val 20 25 30 Leu Asn Val Ser Ser Thr Phe Val Leu Thr Cys Ser Gly Ser Ala Pro 35 40 45 Val Val Trp Glu Arg Met Ser Gln Glu Pro Pro Gln Glu Met Ala Lys 50 55 60 Ala Gln Asp Gly Thr Phe Ser Ser Val Leu Thr Leu Thr Asn Leu Thr 65 70 75 80 Gly Leu Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Thr His Asn Asp Ser Arg Gly 85 90 95 Leu Glu Thr Asp Glu Arg Lys Arg Leu Tyr Ile Phe Val Pro Asp Pro 100 105 110 Thr Val Gly Phe Leu Pro Asn Asp Ala Glu Glu Leu Phe Ile Phe Leu 115 120 125 Thr Glu Ile Thr Glu Ile Thr Ile Pro Cys Arg Val Thr Asp Pro Gln 130 135 140 Leu Val Val Thr Leu His Glu Lys Lys Gly Asp Val Ala Leu Pro Val 145 150 155 160 Pro Tyr Asp His Gln Arg Gly Phe Ser Gly Ile Phe Glu Asp Arg Ser 165 170 175 Tyr Ile Cys Lys Thr Thr Ile Gly Asp Arg Glu Val Asp Ser Asp Ala 180 185 190 Tyr Tyr Val Tyr Arg Leu Gln Val Ser Ser Ile Asn Val Ser Val Asn 195 200 205 Ala Val Gln Thr Val Val Arg Gln Gly Glu Asn Ile Thr Leu Met Cys 210 215 220 Ile Val Ile Gly Asn Glu Val Val Asn Phe Glu Trp Thr Tyr Pro Arg 225 230 235 240 Lys Glu Ser Gly Arg Leu Val Glu Pro Val Thr Asp Phe Leu Leu Asp 245 250 255 Met Pro Tyr His Ile Arg Ser Ile Leu His Ile Pro Ser Ala Glu Leu 260 265 270 Glu Asp Ser Gly Thr Tyr Thr Cys Asn Val Thr Glu Ser Val Asn Asp 275 280 285 His Gln Asp Glu Lys Ala Ile Asn Ile Thr Val Val Glu Ser Gly Tyr 290 295 300 Val Arg Leu Leu Gly Glu Val Gly Thr Leu Gln Phe Ala Glu Ala Ser 305 310 315 320 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 325 330 335 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 340 345 350 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 355 360 365 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 370 375 380 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 385 390 395 400 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 405 410 415 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 420 425 430 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 435 440 445 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 450 455 460 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 465 470 475 480 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 485 490 495 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 500 505 510 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 515 520 525 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 530 535 540 Pro Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 545 550 555 560 Gly Gly Ser Gly Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu 565 570 575 Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro 580 585 590 Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro 595 600 605 Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg 610 615 620 Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu 625 630 635 640 Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu 645 650 655 Thr His Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser 660 665 670 His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr 675 680 685 Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro 690 695 700 Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr 705 710 715 720 Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp 725 730 735 Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser 740 745 750 Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys 755 760 765

Claims (16)

  1. a. VEGF 수용체의 세포 외 리간드 결합 도메인을 포함하는 제 1 펩타이드,
    b. 항체의 Fc 영역, 및
    c. PDGF 수용체의 세포 외 리간드 결합 도메인을 포함하는 제 2 펩타이드;를 포함하고,
    상기 융합 단백질은 (a)-(b)-(c) 및 (c)-(b)-(a)로 이루어진 군으로부터 선택된 순서로 N-말단에서 C-말단으로 배열되고;
    상기 융합 단백질은 VEGF 및 PDGF에 결합할 수 있고, VEGF의 활성 및 PDGF의 활성을 억제 할 수 있는 융합 단백질.
  2. 청구항 1에 있어서,
    a. VEGF 수용체의 세포 외 리간드 결합 도메인은 VEGFR1의 Ig-유사 도메인 D2 및 VEGFR2의 Ig-유사 도메인 D3를 포함하고;
    b. 항체의 Fc 영역은 IgG1의 CH2 및 CH3 영역을 포함하고;
    c. PDGF 수용체의 세포 외 리간드 결합 도메인은 PDGFRβ의 Ig-유사 도메인 D1 내지 D3을 포함하는, 융합 단백질.
  3. 청구항 2에 있어서,
    a. VEGF 수용체의 세포 외 리간드 결합 도메인은 서열번호 7과 90 % 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고;
    b. 항체의 Fc 영역은 서열번호 12와 90 % 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고;
    c. PDGF 수용체의 세포 외 리간드 결합 도메인은 서열번호 2와 90 % 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질.
  4. 청구항 3에 있어서,
    a. VEGF 수용체의 세포 외 리간드 결합 도메인은 서열번호 7 및 10으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고;
    b. 항체의 Fc 영역은 서열 번호 12 및 15로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고;
    c. PDGF 수용체의 세포 외 리간드 결합 도메인은 서열 번호 2 및 5로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질.
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 Fc 영역과 상기 융합 단백질의 C-말단의 상기 제 1 또는 상기 제 2 펩타이드 사이의 제 1 링커 펩타이드를 더 포함하고, 선택적으로 상기 융합 단백질의 N-말단의 상기 제 2 또는 상기 제 1 펩타이드와 Fc 영역 사이의 제 2 링커 펩타이드를 포함하는, 융합 단백질.
  6. 청구항 5에 있어서,
    상기 제 1 링커 펩타이드는 서열번호 20, 22, 24, 26, 28, 30 및 32로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제 2 링커 펩타이드는 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질.
  7. 청구항 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서,
    상기 융합 단백질은 상기 융합 단백질의 N-말단에 연결된 신호 펩타이드를 더 포함하는, 융합 단백질.
  8. 서열번호 38, 서열번호 40, 서열번호 42의 20-766 아미노산, 서열번호 44의 21-769 아미노산 또는 서열번호 50의 20-768 아미노산 서열과 90 % 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질.
  9. 청구항 8에 있어서,
    서열번호 38, 서열번호 40, 서열번호 42의 20-766 아미노산, 서열번호 44의 21-769 아미노산 및 서열번호 50의 20-768 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질.
  10. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항의 상기 융합 단백질을 코딩하는 분리된 핵산 분자.
  11. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항의 상기 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포.
  12. (1) 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항의 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포를 상기 융합 단백질이 제조되는 조건하에 배양하는 단계; 및
    (2) 숙주 세포에 의해 제조된 융합 단백질을 회수하는 단계;를 포함하는 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항의 융합 단백질의 제조 방법;
  13. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항의 융합 단백질 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물.
  14. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항의 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물.
  15. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항의 융합 단백질의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는, 신생 혈관 형성(neovascularization), 혈관 투과성(vascular permeability), 부종(edema) 및 염증(inflammation)으로 이루어진 군으로부터 선택된 임상 증상(clinical condition)을 치료 또는 예방하는 방법.
  16. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항의 융합 단백질의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는, 맥락막 혈관 신생(choroidal neovascularization), 습성 노인성 황반변성(wet age-related macular degeneration) 및 지도형 위축(geographic atrophy)으로 이루어진 군으로부터 선택된 임상 증상(clinical condition)을 치료 또는 예방하는 방법.
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