JP6649393B2 - Ｖｅｇｆおよびｐｄｇｆのリガンド結合ドメインを含む融合タンパク質 - Google Patents

Description

本発明は、ＰＤＧＦ結合部分、ＶＥＧＦ結合部分およびＦｃ抗体領域、融合タンパク質をコードする核酸および発現ベクター、その組換え細胞、ならびに融合タンパク質を含む組成物に関する。ＰＤＧＦおよびＶＥＧＦの機能を阻害するために融合タンパク質を使用する方法もまた提供される。

血管新生は、既存の血管からの新しい血管の形成であり、胎児の発達および組織の修復に関与する正常かつ必須のプロセスである。血管新生は、血管新生因子および抗血管新生因子の両方によって高度に調節され、内皮細胞の遊走および増殖、血管の成熟およびリモデリング、ならびに細胞外マトリックスの分解に関与する。それは正常な成長および発達において重要なプロセスであるが、血管新生はまた、腫瘍増殖、虚血および炎症において重要な役割を果たす。

急速な制御されない眼の血管新生の間、血管透過性が増加し、出血ならびに体液およびタンパク質滲出物の蓄積を引き起こす血管脆弱性および漏出性がもたらされ、最終的に血管不全または血管過形成のいずれかが生じる。眼の血管新生は、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、増殖性糖尿病性ニューロパチー（ＰＤＲ）および新生血管形成といった一連の角膜疾患を引き起こし得る。ＡＭＤおよびＰＤＲの両方は、網膜ニューロンの構造および機能の障害をもたらし、最終的に失明を引き起こす可能性がある。放置すると、異常な血管が線維性瘢痕になり、網膜機能に不可逆的な損傷をもたらし、最終的には失明を引き起こす可能性がある（非特許文献１）。角膜血管新生は、同様に、角膜の透明性の減少および視力喪失につながる可能性がある。

血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、血管新生において重要な役割を果たす。ヒトＶＥＧＦファミリーは、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦ−Ｅおよび胎盤成長因子（ＰＩＧＦ）の６種を含む。さらに、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−ＢおよびＰＩＧＦの複数のアイソフォームが、選択的ＲＮＡスプライシングによって生成される（非特許文献２）。ＶＥＧＦ−Ａは、該ファミリーの原型のメンバーであり、最も特徴付けられている。ＶＥＧＦ−Ａは、内皮細胞への分裂促進因子として働き、内皮細胞の生存および増殖を促進し、細胞移動を誘導し、微小血管透過性を増加させることが示されている。ＶＥＧＦファミリーのタンパク質は、細胞表面ＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ）の細胞外領域に結合して、ＶＥＧＦシグナル伝達経路を活性化する。

ＶＥＧＦＲタンパク質には、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２およびＶＥＧＦＲ３の３種類があり、それぞれ７つの免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメインを含む細胞外領域を含む。ＶＥＧＦＲの細胞外領域は、異なるＶＥＧＦタンパク質に結合する。例えば、ＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）は、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−ＢおよびＰＩＧＦに結合し、ＶＥＧＦのデコイ受容体として、またはＶＥＧＦＲ−２の調節因子として機能することができる。ＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）は、すべてのＶＥＧＦアイソフォームに結合し、ＶＥＧＦ誘導血管新生シグナル伝達の主要メディエーターである。ＶＥＧＦＲ−３（Ｆｌｔ−４）は、ＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦ−Ｄに結合するが、ＶＥＧＦ−Ａには結合せず、リンパ管形成のメディエーターとして機能する。

高分子量の変異体であるＶＥＧＦ_２０６およびＶＥＧＦ_１８９Ｋは、細胞外膜に強く結合し、ＶＥＧＦ受容体と相互作用しない。ＶＥＧＦ_１６５が主な可溶性変異体である一方で、ＶＥＧＦ_１２１およびＶＥＧＦ_１４５はまた、分解生成物ＶＥＧＦ_１１０と同様に、ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２受容体に結合する可溶性の変異体である（非特許文献３）。

抗体、可溶性ＶＥＧＦ受容体またはＶＥＧＦチロシンキナーゼ活性阻害剤によるＶＥＧＦ活性の遮断は、ＡＭＤなどの血管新生型疾患を治療するために使用されてきた戦略である。抗ＶＥＧＦ療法は一般に、視覚機能を安定化または改善するが、網膜下の瘢痕または線維化が、抗ＶＥＧＦ治療の２年以内に全ての治療された眼の約半分に発生することが報告されている（非特許文献４）。さらに、ＶＥＧＦのみを標的とすることは、新しい血液の形成を妨げるが、新しく確立された血管には影響を及ぼさない。

最近のデータは、周皮細胞が抗ＶＥＧＦ耐性、新血管の安定化および瘢痕化において役割を果たし得ることを示唆している。周皮細胞は、内皮細胞と相互作用し、血液網膜障壁の確立に寄与する。重要なことに、周皮細胞は、血管新生内皮細胞に生存シグナルを提供し、ＶＥＧＦ枯渇治療に耐性を示す（非特許文献５）。血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）は、周皮細胞を制御し、それらの動員、増殖および生存を促進し、新血管の成熟を調節する。

ヒトＰＤＧＦファミリーは、ＰＤＧＦ−Ａ、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＰＤＧＦ−ＣおよびＰＤＧＦ−Ｄの４種類を含む。４つのＰＤＧＦタンパク質は、ホモ二量体またはヘテロ二量体（例えば、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＣＣおよびＰＤＧＦ−ＤＤ）を形成し、それらは単量体形態において不活性である。二量体タンパク質は、細胞表面ＰＤＧＦ受容体（ＰＤＧＦＲ）の細胞外領域に結合して、ＰＤＧＦシグナル伝達経路を活性化する。

ＰＤＧＦ受容体には、ＰＤＧＦＲ−αおよびＰＤＧＦＲ−βの２種類があり、それらは、ホモ二量体またはヘテロ二量体（例えば、ＰＤＧＦＲ−αα、ＰＤＧＦＲ−ββおよびＰＤＧＦＲ−αβ）を形成し、５つのＩｇ様ドメインを含む細胞外領域を含む。受容体のリガンド結合部位は、最初の３つのＩｇ様ドメイン（Ｄ１〜Ｄ３）に位置する。

ＰＤＧＦＲ二量体の細胞外領域は、異なるＰＤＧＦタンパク質に結合する。例えば、ＰＤＧＦＲ−ααは、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢおよびＰＤＧＦ−ＣＣと特異的に相互作用する。ＰＤＧＦＲ−αβは、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＣＣおよびＰＤＧＦ−ＤＤと特異的に相互作用する。ＰＤＧＦＲ−ββは、ＰＤＧＦ−ＢＢおよびＰＤＧＦ−ＤＤと特異的に相互作用する。高親和性で３つの受容体二量体のすべてに結合することができる唯一のＰＤＧＦであるＰＤＧＦ−ＢＢは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方で周皮細胞の増殖および移動を誘導することができることが示されている。ＰＤＧＦＲ−βの５つ全てのＩｇ様ドメイン（Ｄ１〜Ｄ５）からなる細胞外領域は、ＰＤＧＦ−Ｂによって刺激された応答に拮抗することが以前に示されている（非特許文献６、７）。ＰＤＧＦＲβ−Ｆｃキメラタンパク質を用いた研究は、ヒトＰＤＧＦＲ−βのＤ１〜Ｄ３が高親和性ＰＤＧＦ−Ｂリガンド結合に十分であることを示した（非特許文献８、９）。さらに、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）と融合したＰＤＧＦＲ−βのＤ１〜Ｄ３の前二量体化は、組換えＰＤＧＦＲ−βのＤ１〜Ｄ３タンパク質と比較してＰＤＧＦ−ＢＢリガンドへの結合親和性を改善させた（非特許文献１０）。

現在の抗ＶＥＧＦ療法は非常に有効であるが、最適な結果を達成するためには、集中的な患者モニタリングおよび頻繁な治療が必要である。さらに、これらの薬剤は根本的な原因ではなく疾患の症状を標的とするため、治療は無期限に続けられる必要がある。最適ではない治療では、既存の脈絡膜血管新生病変（ＣＮＶ）は成長し続け、最終的には線維性瘢痕に成熟し、不可逆的な失明をもたらす（非特許文献１１−１３）。血管新生をブロックし、血管新生脈絡膜病変内の未成熟血管系の退縮を引き起こすことができる薬剤は、血管漏出および線維化の原因を排除し、集中的な患者モニタリングおよび連続治療の必要性を低減または排除する可能性を有する。

近年、Ｎ末端からＣ末端まで、ＰＤＧＦ受容体の細胞外部分、ＶＥＧＦ受容体の細胞外部分および多量体化ドメインを含む融合タンパク質が開示されている（特許文献１）。融合タンパク質は、ＰＤＧＦおよびＶＥＧＦの両方に結合し、それらの活性を阻害する。

米国特許出願公開第２０１４／０３１５８０４号明細書

Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｍａ，Ｐｒｏｇ Ｒｅｔｉｎ Ｅｙｅ Ｒｅｓ．２００７ Ｊａｎ；２６（ｌ）：ｌ−３７ Ｓｕｌｌｉｖａｎ ａｎｄ Ｂｒｅｋｋｅｎ，ＭＡｂｓ．２０１０ Ｍａｒ−Ａｐｒ；２（２）：１６５−７５ Ｂｈｉｓｉｔｋｕｋ，Ｂｒ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．２００６ Ｄｅｃ；９０（１２）：１５４２−７ Ｄａｎｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ．２０１４ Ｍａｒ；１２１（３）：６５６−６６ Ｂｅｎｊａｍｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．１９９８ Ｍａｙ；１２５（９）：１５９１−８；Ｐａｔｅｌ，Ｒｅｔｉｎａ．２００９ Ｊｕｎ；２９（６ Ｓｕｐｐｌ）：Ｓ４５−８ Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９１ Ｊａｎ ５；２６６（ｌ）：４１３−８ Ｕｅｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９１ Ｍａｙ １０；２５２（５００７）：８４４−８ Ｈｅｉｄａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ．１９９５ Ｊａｎ；９（ｌ）：１４０−５ Ｌｏｋｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９７ Ｄｅｃ ２６；２７２（５２）：３３０３７−４４ Ｌｅｐｐａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２０００ Ｍａｒ ７；３９（９）：２３７０−５ Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ ２０１２；１１９：１３８８−１３９８ Ｂｌｏｃｈ ｅｔ ａｌ，Ａｍ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．２０１３ Ｊｕｌ；１５６（ｌ）：ｌ １６−１２４； Ｄａｎｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ．２０１４ Ｍａｒ；１２１（３）：６５６−６６

ＰＤＧＦおよびＶＥＧＦの両方の阻害剤の技術に記載された進歩にもかかわらず、血管新生型障害の改善された製剤および治療のための当該技術分野における必要性が存在する。

本発明は、ＶＥＧＦおよびＰＤＧＦの両方に同時に結合して、両方のシグナル伝達経路を同時に標的とする、新規な融合タンパク質を提供することによってこの必要性を満たす。融合タンパク質は、ＶＥＧＦおよびＰＤＧＦ受容体に由来する細胞外リガンド結合ドメインを、ＩｇＧ１からの半減期延長Ｆｃドメインに融合することによって生成される。本発明の特定の実施形態では、融合タンパク質の成分の全てがヒト起源であり、従ってヒトにおいて非免疫原性治療剤として有用であると期待される。融合タンパク質は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＶＥＧＦおよびＰＤＧＦ依存性細胞増殖を阻害することができ、動物モデルにおけるＶＥＧＦ誘導網膜漏出を減少させることができる。

血管新生がＶＥＧＦシグナル伝達の非存在下で起こりうること、および周皮細胞がＶＥＧＦおよび他の細胞の生存因子を増殖している内皮細胞に供給し、抗ＶＥＧＦ耐性を付与するという証拠が増えている（Ｒｅｉｎｍｕｔｈ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ．２００１ Ｍａｙ；１５（７）：１２３９−４１）。周皮細胞の起源はまた、瘢痕組織および腫瘍における筋線維芽細胞に対して示唆されている。ＰＤＧＦシグナル伝達経路は、周皮細胞の動員、生存および成熟に関与する（Ａｎｄｒａｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２００８ Ｍａｙ １５；２２（１０）：１２７６−３１２）。抗体によるＰＤＧＦ受容体シグナル伝達の阻害は、眼の血管新生の複数のマウスモデルにおいて抗ＶＥＧＦ治療の治療効果を増強することが示された（Ｊｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．２００６ Ｊｕｎ；１６８（６）：２０３６−５３）。抗ＶＥＧＦ剤と組み合わせた抗ＰＤＧＦ剤 Ｅ１００３０の大きな第２相臨床試験は、抗ＶＥＧＦ単独療法よりも優れた結果を示した（Ｄｕｇｅｌ，Ｒｅｔｉｎａ Ｔｏｄａｙ，Ｍａｒｃｈ ２０１３，６５−７１）。したがって、本発明の融合タンパク質は、ＡＭＤおよび癌などの血管新生型障害の治療に有効である。融合タンパク質のさらなる利点は、２つの別々の組成物、すなわち抗ＰＤＧＦ剤および抗ＶＥＧＦ剤を注射する必要がないことである。代わりに、両方の薬剤の融合タンパク質を含む単一の組成物は、単回注射を可能にし、それにより、感染および注射外傷の患者へのリスクを減少させる。

１つの一般的な態様において、本発明は、（ａ）ＶＥＧＦ受容体の細胞外リガンド結合ドメインを含む第１のペプチド、（ｂ）抗体のＦｃ領域、および（ｃ）ＰＤＧＦ受容体の細胞外リガンド結合ドメインを含む第２のペプチドを含む融合タンパク質に関し、融合タンパク質は、（ａ）−（ｂ）−（ｃ）および（ｃ）−（ｂ）−（ａ）からなる群から選択される順序でＮ末端からＣ末端に配置され、融合タンパク質は、ＶＥＧＦ−Ａ分子およびＰＤＧＦ−ＢＢ分子に結合し、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２の活性およびＰＤＧＦＲの活性を阻害することができる。

本発明の一実施形態では、ＶＥＧＦ受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、ＶＥＧＦリガンドに結合することができ、１又は複数のＶＥＧＦ受容体の１又は複数のＩｇ様ドメインＤ１〜Ｄ７を含む。好ましくは、ＶＥＧＦ受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、第１のＶＥＧＦ受容体のＩｇ様ドメインＤ２および第２のＶＥＧＦ受容体のＩｇ様ドメインＤ３を含み、第１および第２のＶＥＧＦ受容体は同一または異なるＶＥＧＦ受容体である。一実施形態では、ＶＥＧＦ受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、ＶＥＧＦＲ１のＩｇ様ドメインＤ２およびＶＥＧＦＲ２のＩｇ様ドメインＤ３を含む。別の実施形態では、ＶＥＧＦ受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、配列番号７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましくは、ＶＥＧＦ受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、配列番号７および１０からなる群より選択されたアミノ酸配列を含む。

本発明の一実施形態では、ＰＤＧＦ受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、ＰＤＧＦリガンドに結合することができ、１又は複数のＰＤＧＦレセプターの１又は複数のＩｇ様ドメインＤ１〜Ｄ５を含む。好ましくは、ＰＤＧＦ受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、１または複数のＰＤＧＦ受容体のＩｇ様ドメインＤ１〜Ｄ３を含む。一実施形態では、ＰＤＧＦ受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましくは、存在するＰＤＧＦ受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、配列番号２および５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。

本発明の一実施形態では、抗体のＦｃ領域は、ＩｇＧ１のＣＨ２およびＣＨ３領域を含む。好ましくは、抗体のＦｃ領域は、配列番号１２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましくは、抗体のＦｃ領域は、配列番号１２および１５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。

本発明の好ましい実施形態では、融合タンパク質は、（ａ）ＶＥＧＦＲ１のＩｇ様ドメインＤ２およびＶＥＧＦＲ２のＩｇ様ドメインＤ３、（ｂ）ＩｇＧ１のＣＨ２およびＣＨ３領域を含む抗体のＦｃ領域、（ｃ）ＰＤＧＦＲβのＩｇ様ドメインＤ１〜Ｄ３を含み、（ａ）−（ｂ）−（ｃ）および（ｃ）−（ｂ）−（ａ）からなる群から選択される順序でＮ末端からＣ末端に配置され、より好ましくは、（ｃ）−（ｂ）−（ａ）の順序で配置される。

本発明の一実施形態では、融合タンパク質は、Ｆｃ領域と融合タンパク質のＣ末端の第１または第２のペプチドとの間にリンカーペプチドを含み、任意に、融合タンパク質のＮ末端の第１または第２のペプチドとＦｃ領域との間に第２のリンカーペプチドを含む。

本発明の一実施形態では、融合タンパク質はさらに、融合タンパク質のＮ末端に作動可能に結合されたシグナルペプチドを含む。

別の一般的な態様において、本発明は、本発明の融合タンパク質をコードする単離された核酸分子に関する。

別の一般的な態様において、本発明は、本発明の融合タンパク質をコードする核酸分子を含む発現ベクターに関する。

別の一般的な態様において、本発明は、本発明の融合タンパク質をコードする核酸分子を含む組換え宿主細胞に関する。

別の一般的な態様において、本発明は、本発明の融合タンパク質を得る方法に関する。該方法は、（１）融合タンパク質を産生する条件下で、該融合タンパク質をコードする核酸分子を含む宿主細胞を培養する工程；（２）宿主細胞によって産生された融合タンパク質を回収する工程を含む。

別の一般的な態様において、本発明は、本発明の融合タンパク質および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。

別の一般的な態様において、本発明は、本発明の融合タンパク質をコードする核酸分子と薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。

別の一般的な態様において、本発明は、ＶＥＧＦＲの活性およびＰＤＧＦＲの活性を低下させる方法に関し、この方法は、それを必要とする対象に有効量の本発明の融合タンパク質を投与することを含む。

別の一般的な態様において、本発明は、組織血管新生、血管透過性、浮腫および炎症からなる群より選択される臨床状態を治療または予防する方法に関し、該方法は、それを必要とする対象に有効量の本発明の一実施形態による融合タンパク質を投与することを含む。

別の一般的な態様において、本発明は、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、湿潤加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）および地図状萎縮からなる群から選択される臨床状態を治療または予防する方法に関し、該方法は、それを必要とする対象に有効量の本発明の一実施形態による融合タンパク質を投与することを含む。

本発明の一実施形態では、融合タンパク質は、単離されたタンパク質として、または発現ベクターとして投与される。

本発明の一実施形態において、臨床状態は、脳浮腫、脳卒中、癌、乾癬、関節炎、喘息、火傷に関連する全身浮腫、腫瘍に関連する腹水および胸水、炎症または外傷、慢性気道炎症、全身性毛細血管漏出症候群、敗血症、タンパク質の増加する漏出に関連する腎疾患、関節リウマチ、炎症性関節炎、変形性関節症、アテローム性動脈硬化症、乾癬、眼の炎症および／または眼の血管新生からなる群より選択され、加齢性黄斑変性症、増殖性及び非増殖性糖尿病性網膜症、角膜新生血管形成、虹彩血管新生および新血管性緑内障を含む。

別の一般的な態様において、本発明は、本発明の融合タンパク質を含むＰＤＧＦおよびＶＥＧＦの二量体アンタゴニストに関する。

別の一般的な態様において、本発明は、ＰＤＧＦ−ＢＢおよびＶＥＧＦ−Ａからなる群より選択される少なくとも１つのリガンドに結合した本発明の融合タンパク質を含むタンパク質コンジュゲートに関する。

本発明の他の態様、特徴および利点は、本発明の詳細な説明およびその好ましい実施形態ならびに添付の特許請求の範囲を含む以下の開示から明らかになるであろう。

前述の概要および本発明の以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むことで、よりよく理解されるであろう。本発明は、図面に示された厳密な実施形態に限定されないことを理解されたい。

ＰＤＧＦおよびＶＥＧＦ経路の両方を同時に阻害するように設計された、本発明の実施形態による例示的な二機能性融合タンパク質、融合タンパク質２（上）および融合タンパク質１（下）の構造上のデザインを示す図である。ＰＤＧＦＲ細胞外Ｉｇ様ドメイン（ＰＩＤ）は、ＰＤＧＦＲβの細胞外Ｉｇ様ドメインＤ１〜Ｄ３を表し、Ｆｃは、ＩｇＧ１のＣＨ２およびＣＨ３ドメインを表し、ＶＥＧＦＲ細胞外Ｉｇ様ドメイン（ＶＩＤ）は、ＶＥＧＦＲ１の細胞外Ｉｇ様ドメインＤ２およびＶＥＧＦＲ２の細胞外Ｉｇ様ドメインＤ３を表す。 （ａ）は、精製された二機能性Ｆｃ融合タンパク質１のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析を表す図であり、（ｂ）は、精製された二機能性Ｆｃ融合タンパク質１のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析を表す図であり、（ｃ）は、それぞれ非還元および還元精製二機能性Ｆｃ融合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析を表す図である。レーンＭ＝マーカー、レーン１（非還元）および２（還元）＝ポジティブコントロール２、レーン３（非還元）および４（還元）＝融合タンパク質５、レーン５（非還元）および６（還元）＝融合タンパク質３である。 ＶＥＧＦ_１６５に対する精製ポジティブコントロール１（黒色丸）、融合タンパク質３（黒色三角）、および融合タンパク質５（黒色四角）の３つの試験サンプルの直接リガンド結合アッセイの結果を示す図である。ウェルをＶＥＧＦ_１６５でプレコートし、試験サンプルの様々な濃度でインキュベートし、ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ特異的抗体を用いて結合した試験サンプルの量を検出し、ＯＤ_４５０の値を試験サンプル濃度に対してプロットした。 ＰＤＧＦ−ＢＢに対する精製ポジティブコントロール２（黒色丸）、融合タンパク質３（黒色三角）、および融合タンパク質５（黒色四角）の３つの試験サンプルの直接リガンド結合アッセイの結果を示す図である。ウェルをＰＤＧＦ−ＢＢでプレコートし、試験サンプルの様々な濃度でインキュベートし、ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ特異的抗体を用いて試験サンプルの量を検出し、ＯＤ_４５０の値を試験サンプル濃度に対してプロットした。 （ａ）は、競合的結合アッセイにおける溶液中のＶＥＧＦ_１６５に対する融合タンパク質１の親和性評価を示す図であり、（ｂ）は、競合的結合アッセイにおける溶液中のＰＤＧＦ−ＢＢに対する融合タンパク質１の親和性評価を示す図である。様々な濃度の融合タンパク質１を、ＶＥＧＦ_１６５またはＰＤＧＦ−ＢＢのいずれかの固定された濃度の溶液中でインキュベートし、遊離ＶＥＧＦ_１６５またはＰＤＧＦ−ＢＢの濃度を、定量的サンドイッチ酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）アッセイを用いて決定し、融合タンパク質１の濃度に対してプロットした。 （ａ）は、競合的結合アッセイにおける溶液中のＶＥＧＦ_１６５に対する融合タンパク質２の親和性評価を示す図であり、（ｂ）は、競合的結合アッセイにおける溶液中のＰＤＧＦ−ＢＢに対する融合タンパク質２の親和性評価を示す図である。様々な濃度の融合タンパク質１を、ＶＥＧＦ_１６５またはＰＤＧＦ−ＢＢのいずれかの固定された濃度の溶液中で一晩インキュベートし、遊離ＶＥＧＦ_１６５またはＰＤＧＦ−ＢＢの濃度を、定量的サンドイッチ酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）アッセイを用いて決定し、融合タンパク質２の濃度に対してプロットした。 ＨＵＶＥＣ細胞のＶＥＧＦ依存性増殖に対するポジティブコントロール１（黒色丸）、融合タンパク質３（黒色三角）、および融合タンパク質５（黒色四角）の抑制効果を示す図である。ＯＤ_４９０の値を試験サンプル濃度に対してプロットした。 ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞のＰＤＧＦ依存性増殖に対するポジティブコントロール１（黒色丸）、融合タンパク質３（黒色三角）、および融合タンパク質５（黒色四角）の抑制効果を示す図である。ＯＤ_４９０の値を試験サンプル濃度に対してプロットした。

様々な刊行物、記事および特許は、背景および明細書全体にわたって引用または記載されている。これらの参考文献のそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書に含まれる文書、行為、材料、装置、物品等の議論は、本発明の文脈を提供することを目的とするものである。そのような議論は、これらの事項のいずれかまたはすべてが、開示または請求された発明に関する先行技術の一部を形成することを認めるものではない。

他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。そうでなければ、本明細書で使用される特定の用語は、本明細書で定義された意味を有する。本明細書で引用した全ての特許、公開特許出願および刊行物は、本明細書に完全に記載されているかのように参照により組み込まれる。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用する単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上他に明白に指示しない限り、複数形を含むことに留意されたい。

本発明は、（ａ）ＶＥＧＦ受容体の細胞外リガンド結合ドメインを含む第１のペプチド、（ｂ）抗体のＦｃ領域、および（ｃ）ＰＤＧＦ受容体の細胞外リガンド結合ドメインを含む第２のペプチドを含む融合タンパク質に関し、融合タンパク質は、（ａ）−（ｂ）−（ｃ）および（ｃ）−（ｂ）−（ａ）からなる群から選択される順序でＮ末端からＣ末端に配置され、融合タンパク質は、ＶＥＧＦ−ＡおよびＰＤＧＦ−ＢＢに結合し、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２の活性およびＰＤＧＦＲの活性を阻害することができる。

驚くべきことに、本発明の間に、抗体Ｆｃ領域のような融合タンパク質における他の成分に関連するＶＥＧＦおよびＰＤＧＦ受容体の細胞外リガンド結合ドメインの配向が、ＶＥＧＦおよびＰＤＧＦリガンドに対する融合タンパク質の結合親和性に影響を与えることが発見された。本発明の一実施形態による融合タンパク質は、両方のリガンドに対する融合タンパク質の親和性を最適化し、融合タンパク質の効果を増加させ得る。

本明細書中で使用される場合、語句「融合タンパク質」は、共に共有結合した２つ以上の部分を有するタンパク質を指し、各部分は異なるタンパク質に由来する。

本明細書中で使用される場合、用語「ＶＥＧＦ」は、ＶＥＧＦシグナル伝達経路を調節する任意の血管内皮増殖因子タンパク質を指す。したがって、用語ＶＥＧＦは、ＶＥＧＦ−Ａ ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦ−Ｅ、Ｐ１ＧＦまたはそれらのアイソフォームを意味し得る。

本明細書中で使用される場合、用語「ＶＥＧＦ受容体」および「ＶＥＧＦＲ」は、ＶＥＧＦリガンドに結合する任意の受容体を指す。したがって、用語ＶＥＧＦ受容体は、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２またはＶＥＧＦＲ３を指し得る。

本明細書で使用される場合、語句「細胞外リガンド結合ドメイン」は、細胞の外側に位置し、そのリガンドに結合することができる受容体タンパク質の任意の領域を指す。

従って、本発明の融合タンパク質中に存在するＶＥＧＦ受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、任意のＶＥＧＦＲに由来し得、これらに限定されないがＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２およびＶＥＧＦＲ３を含む。ＶＥＧＦＲタンパク質の７つの細胞外ＩｇＧ様ドメインは、細胞外領域のＮ末端からＣ末端へ、１，２，３，４，５，６および７と番号が付けられ、各々、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５、Ｄ６およびＤ７と称される。本発明の融合タンパク質中に存在するＶＥＧＦＲの細胞外リガンド結合ドメインは、１または複数の任意のＶＥＧＦＲタンパク質の細胞外領域由来の７つのＩｇＧ様ドメインのいずれか１つ以上を含み得る。例えば、本発明の融合タンパク質中に存在するＶＥＧＦ受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、１または複数のＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２またはＶＥＧＦＲ３由来の１または複数のＤ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５、Ｄ６またはＤ７であり得る。

好ましい実施形態では、融合タンパク質中に存在するＶＥＧＦ受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、ＶＥＧＦＲ１のＩｇ様ドメインＤ２およびＶＥＧＦＲ２のＩｇ様ドメインＤ３を含む。好ましくは、ＶＥＧＦＲの細胞外リガンド結合ドメインは、ＶＥＧＦへのその結合を増加させる１または複数の突然変異を含む。より好ましい実施形態では、融合タンパク質中に存在するＶＥＧＦ受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、配列番号７と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。さらにより好ましい実施形態では、融合タンパク質中に存在するＶＥＧＦ受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、配列番号７および１０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。

本発明の融合タンパク質中に存在するＶＥＧＦ受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、ヒトまたは他の適切な哺乳動物、例えばマウス、ウサギ、ラット、ブタ、イヌ、または霊長類といったいかなる動物由来のものでもよい。好ましい実施形態では、ＶＥＧＦＲはヒト由来である。

本明細書で使用する「ＰＤＧＦ」という用語は、ＰＤＧＦシグナル伝達経路を調節する任意の血漿由来成長因子タンパク質を指す。したがって、ＰＤＧＦという用語は、ＰＤＧＦ−Ａ、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＰＤＧＦ−ＣまたはＰＤＧＦ−Ｄを指し得る。

本明細書で使用される場合、用語「ＰＤＧＦ受容体」および「ＰＤＧＦＲ」は、ＰＤＧＦリガンドに結合する任意の受容体をいう。

本発明の融合タンパク質中に存在するＰＤＧＦ受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、ＰＤＧＦＲ−αおよびＰＤＧＦＲ−βを含むがこれに限定されない任意のＰＤＧＦＲに由来し得る。ＰＤＧＦＲタンパク質の５つの細胞外ＩｇＧ様ドメインは、細胞外領域のＮ末端からＣ末端に１，２，３，４および５と番号が付けられ、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４およびＤ５とも呼ばれる。本発明の融合タンパク質中に存在するＰＤＧＦＲの細胞外リガンド結合ドメインは、任意のＰＤＧＦＲタンパク質の１つ以上の細胞外領域に由来する５つのＩｇＧ様ドメインのいずれか１つ以上であり得る。例えば、本発明の融合タンパク質中に存在するＰＤＧＦ受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、ＰＤＧＦＲ−αまたはＰＤＧＦＲ−βの１つ以上由来のＤ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４またはＤ５の１つ以上であり得る。

好ましい実施形態では、融合タンパク質中に存在するＰＤＧＦ受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、ＰＤＧＦＲβのＩｇ様ドメインＤ１〜Ｄ３を含む。好ましくは、ＰＤＧＦＲの細胞外リガンド結合ドメインは、ＰＤＧＦへのその結合を増加させる１つ以上の突然変異を含む。より好ましい実施形態では、融合タンパク質中に存在するＰＤＧＦ受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。さらにより好ましい実施形態では、融合タンパク質中に存在するＰＤＧＦ受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、配列番号２および５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。

本発明の融合タンパク質中に存在するＰＤＧＦ受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、ヒトまたは他の適切な哺乳動物、例えばマウス、ウサギ、ラット、ブタ、イヌ、または霊長類といったいかなる動物由来のものでもよい。好ましい実施形態では、ＰＤＧＦ受容体はヒト由来である。

本明細書で使用される場合、抗体の「Ｆｃ領域」という用語は、抗体のクラスに応じて、２つまたは３つの定常ドメインを含む２つの重鎖からなる抗体の「フラグメント、結晶化可能な」領域を指す。この用語は、定常領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を規定するために使用される。この用語は、天然および変異Ｆｃ領域の両方を含む。抗体のＦｃ領域は、二量体、三量体、四量体などの多量体へのサブユニットの会合を促進するドメインである、多量体化ドメインとして機能することができる。好ましくは、Ｆｃ領域は、多量体へのサブユニットの会合を促進する１つ以上の突然変異を含む。

本発明の融合タンパク質中に存在する抗体のＦｃ領域は、任意のアイソタイプ（例えばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥ）、任意のサブクラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２など）、任意のアロタイプ、またはノブおよびホールＦｃフラグメントなどの任意の操作された突然変異体であり得る。好ましい実施形態では、本発明の融合タンパク質中に存在する抗体のＦｃ領域は、ＩｇＧ１のＣＨ２およびＣＨ３領域を含む。より好ましい実施形態では、本発明の融合タンパク質中に存在する抗体のＦｃ領域は、配列番号１２に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。さらにより好ましい実施形態では、本発明の融合タンパク質中に存在する抗体のＦｃ領域は、配列番号１２および１５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。

本発明の融合タンパク質中に存在する抗体のＦｃ領域は、ヒトまたは他の適切な哺乳動物、例えばマウス、ウサギ、ラット、ブタ、イヌ、または霊長類といったいかなる動物由来のものでもよい。好ましい実施形態では、Ｆｃ領域はヒト由来である。

本発明の実施形態によれば、融合タンパク質の成分は、ペプチドリンカーなどの連結部分によって連結され得る。好ましくは、リンカーは、融合タンパク質成分の柔軟性を高め、正確な折りたたみを確実にし、立体障害を最小限にし、融合タンパク質内の各機能成分の構造を著しく妨害しない。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、２〜２０個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９、または２０個のアミノ酸を含む。好ましくは、融合タンパク質は、Ｆｃ領域と融合タンパク質のＣ末端の第１または第２ペプチドとの間の第１のリンカーペプチドおよび任意に融合タンパク質のＮ末端の第２または第１ペプチドとＦｃ領域との間の第２のリンカーペプチドを含む。本発明の好ましい実施形態では、第１のリンカーペプチドは、配列番号２０，２２，２４，２６，２８，３０および３２からなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸配列を含み、第２のリンカーペプチドは、配列番号１８のアミノ酸配列を含む。

本発明の実施形態によれば、融合タンパク質は、細胞からの融合タンパク質の分泌を確実にするために、融合タンパク質のＮ末端に結合されたシグナルペプチドをさらに含む。宿主細胞によって認識され処理される任意のシグナルペプチドを使用することができる。好ましい実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号３４または３６のアミノ酸配列を含むが、これに限定されない。

好ましい実施形態では、本発明の融合タンパク質は、配列番号３８と少なくとも９０％の同一性、または配列番号４０と少なくとも９０％の同一性、好ましくは配列番号４２のアミノ酸番号２０〜７６６、配列番号４４のアミノ酸番号２１〜７６９または配列番号５０のアミノ酸番号２０〜７６８と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。融合タンパク質は、ＶＥＧＦ受容体ドメインおよび／またはＰＤＧＦ受容体ドメインにおける１つ以上の突然変異または１つのヌクレオチドの多型（ＳＮＰ）を含み得る。本発明の実施形態に従って、抗体のＦｃ領域で生じる１つ以上の突然変異またはＳＮＰを含むこともできる。

より好ましい実施形態において、本発明の融合タンパク質は、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２のアミノ酸２０〜７６６、配列番号４４の２１〜７６９および配列番号５０のアミノ酸２０〜７６８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

一般的な観点において、本発明の融合タンパク質は、ＶＥＧＦおよびＰＤＧＦに結合し、ＶＥＧＦおよびＰＤＧＦ受容体の活性を阻害する。本明細書中で使用される場合、用語「に結合する」とは、リガンドの活性を阻害、遮断、中和、還元、阻止または妨害することの１つ以上をもたらすリガンドへの受容体タンパク質の細胞外ドメインの結合をいう。特定の実施形態では、ＶＥＧＦまたはＰＤＧＦ受容体タンパク質の細胞外ドメインは、リガンド、すなわちＶＥＧＦまたはＰＤＧＦにそれぞれ結合し、他のＶＥＧＦ受容体およびＰＤＧＦ受容体などの他の分子への結合からリガンドを隔離することによってリガンド活性を阻害する。特定の他の実施形態では、ＶＥＧＦまたはＰＤＧＦ受容体タンパク質の細胞外ドメインは、リガンド、すなわちＶＥＧＦまたはＰＤＧＦにそれぞれ結合し、リガンドが細胞内の下流シグナル伝達の現象を引き起こさないようにすることによって、リガンド活性を阻害する。

本明細書中で使用される場合、本明細書中で使用されるリガンド活性の文脈における「阻害」または「阻害する」という用語は、結合アッセイ、細胞増殖アッセイ、競合的結合アッセイ、およびｉｎ ｖｉｖｏアッセイを含むが、これらに限定されない種々の機能的アッセイによって分析されるリガンドの活性を低下させる受容体タンパク質の細胞外ドメインの特性を指す。

本明細書中に開示される融合タンパク質または融合タンパク質の成分は、標的結合パートナー（例えば、ＰＤＧＦおよび／またはＶＥＧＦファミリータンパク質）に対する親和性、競合的結合（例えば、ＰＤＧＦＲまたはＶＥＧＦＲへのＰＤＧＦまたはＶＥＧＦの結合をブロックする）、阻害活性（例えば、ＰＤＧＦまたはＶＥＧＦシグナル伝達経路の活性化を阻害する）、細胞増殖の阻害、腫瘍増殖の阻害および血管新生の阻害（例えば、脈絡膜新生血管形成の阻害）を含むが、これらに限定されない生物学的活性に対して特徴付けられまたは評価され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される融合タンパク質または融合タンパク質の成分は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏでの生物学的活性に対して評価され得る。

本発明はまた、（ａ）ＶＥＧＦ受容体の細胞外リガンド結合ドメインを含む第１のペプチド、（ｂ）抗体のＦｃ領域、および（ｃ）ＰＤＧＦ受容体の細胞外リガンド結合ドメインを含む第２のペプチドを含む融合タンパク質をコードする単離された核酸を提供し、融合タンパク質は、（ａ）−（ｂ）−（ｃ）および（ｃ）−（ｂ）−（ａ）からなる群から選択される順序でＮ末端からＣ末端に配置される。本発明の実施形態によれば、融合タンパク質をコードする核酸分子は、チャイニーズハムスター卵巣細胞などの特定のタイプの宿主細胞での発現に対してコドン最適化され得る。本発明の好ましい実施形態によれば、融合タンパク質をコードする核酸分子は、配列番号３７，３９，４１，４３および４９からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む。

本発明の他の実施形態によれば、融合タンパク質をコードする核酸分子は、発現ベクター中に存在し得る。発現ベクターには、組換えタンパク質発現のためのベクターおよびウイルスベクターのような対象の組織における発現のために核酸を対象に送達するためのベクターが含まれるが、これに限定されない。本発明での使用に適したウイルスベクターの例としては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどが挙げられるが、これらに限定されない。ベクターはまた、非ウイルスベクターであってもよい。非ウイルスベクターの例としては、プラスミド、細菌人工染色体、酵母人工染色体、バクテリオファージなどが挙げられるが、これらに限定されない。ベクターは、発現ベクターの従来の機能を確立するための任意のエレメント、例えばプロモーター、リボソーム結合エレメント、ターミネーター、エンハンサー、選択マーカー、または複製起点を含み得る。

本発明の他の実施形態によれば、融合タンパク質をコードする核酸分子は、本開示の観点から当技術分野で公知の方法を用いて所望の宿主細胞からの組換え発現を改善するためにコドン最適化され得る。

本発明はまた、（ａ）ＶＥＧＦ受容体の細胞外リガンド結合ドメインを含む第１のペプチド、（ｂ）抗体のＦｃ領域、および（ｃ）ＰＤＧＦ受容体の細胞外リガンド結合ドメインを含む第２のペプチドを含む融合タンパク質をコードする核酸分子を含む宿主細胞を提供し、融合タンパク質は、（ａ）−（ｂ）−（ｃ）および（ｃ）−（ｂ）−（ａ）からなる群から選択される順序でＮ末端からＣ末端に配置される。宿主細胞には、組換えタンパク質発現のための宿主細胞、および対象の組織における発現のために核酸を対象に送達するための宿主細胞が含まれるが、これに限定されない。本発明での使用に適した宿主細胞の例としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎臓２９３（ＨＥＫ−２９３）などが挙げられるが、これらに限定されない。

本発明はまた、（ａ）ＶＥＧＦ受容体の細胞外リガンド結合ドメインを含む第１のペプチド、（ｂ）抗体のＦｃ領域、および（ｃ）ＰＤＧＦ受容体の細胞外リガンド結合ドメインを含む第２のペプチドを含む融合タンパク質の製造方法を提供し、融合タンパク質は、（ａ）−（ｂ）−（ｃ）および（ｃ）−（ｂ）−（ａ）からなる群から選択される順序でＮ末端からＣ末端に配置される。一般的な観点において、本方法は、（１）融合タンパク質を産生する条件下で、融合タンパク質をコードする核酸分子を含む宿主細胞を培養する工程、および（２）宿主細胞によって産生された融合タンパク質を回収する工程を含む。融合タンパク質は、当該分野で公知の方法を用いてさらに精製され得る。

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は宿主細胞中で発現され、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー、プロテインＧアフィニティークロマトグラフィー、緩衝液交換、サイズ排除クロマトグラフィー、限外ろ過、および透析が含まれるがこれらに限定されない１つ以上の標準的な精製技術の組み合わせを用いて精製される。

本発明はまた、（ａ）ＶＥＧＦ受容体の細胞外リガンド結合ドメインを含む第１のペプチド、（ｂ）抗体のＦｃ領域、および（ｃ）細胞外リガンドを含む第２のペプチドを含む融合タンパク質を含む医薬組成物を提供し、融合タンパク質は、（ａ）−（ｂ）−（ｃ）および（ｃ）−（ｂ）−（ａ）からなる群から選択される順序でＮ末端からＣ末端に配置される。本発明の組成物は、治療上有効量の融合タンパク質を含む。

用語「治療上有効量」は、所望の生物学的効果または臨床効果を引き出すために必要な治療的に活性な化合物の量を意味する。本発明の実施形態によれば、「治療上有効量」は、臨床結果を含む有益なまたは所望の結果をもたらすのに十分な量である。治療有効量は１回以上の投与で投与され得る。疾患状態に関して、有効量は、疾患の改善、安定化、または発達の遅延をもたらすのに十分な量である。本発明の特定の実施形態によれば、治療有効量は、血管透過性、浮腫、炎症、網膜症、線維症または癌を特徴とする疾患といった異常な血管新生を特徴とする疾患を治療または予防するために必要な融合タンパク質の量である。

いくつかの実施形態では、融合タンパク質を含む医薬組成物は、４０、５０、６０、７０または８０ｍｇ／ｍＬ、最も好ましくは約４０±約５ｍｇ／ｍＬといった、約０．５〜約１００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約４０〜約８０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度で処方された融合タンパク質を含む。他の好ましい実施形態では、融合タンパク質は、約４０ｍｇ／ｍＬを超える、好ましくは約８０±約１０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度で緩衝液中に処方される。

特定の実施形態において、緩衝液は、約６．５〜８、より好ましくは約７〜７．５、さらにより好ましくは約７．２のｐＨを有するリン酸緩衝液である。リン酸緩衝液は、５、１０、１５または２０ｍＭのリン酸ナトリウム、より好ましくは約１０ｍＭのリン酸ナトリウムといった約５〜２０ｍＭのリン酸ナトリウム；約２０〜６０ｍＭの塩化ナトリウム、より好ましくは約４０ｍＭの塩化ナトリウム；約１〜１０重量／体積％（ｗ／ｖ）のスクロース、より好ましくは約５％ｗ／ｖのスクロース；約０．０１〜０．０５％ｗ／ｖの界面活性剤、より好ましくは約０．０３％ｗ／ｖのポリソルベート２０を含む。

他の特定の実施形態では、緩衝液は、約５〜８、より好ましくは約６〜７、最も好ましくは約６．８のｐＨを有するヒスチジン緩衝液である。ヒスチジン緩衝液は、例えば１０、２０、３０、４０または５０ｍＭのヒスチジン、より好ましくは約２５ｍＭのヒスチジンといった約１０〜５０ｍＭのヒスチジン；１０、２０または３０ｍＭの塩化ナトリウム、より好ましくは約２０ｍＭの塩化ナトリウムといった約１０〜３０ｍＭの塩化ナトリウム；１、２、４、６、８または１０％ｗ／ｖのスクロース、より好ましくは約６％ｗ／ｖのスクロースといった約１〜１０％ｗ／ｖのスクロース；約０．０１〜０．０５％ｗ／ｖの界面活性剤、より好ましくは約０．０３％ｗ／ｖポリソルベート２０を含む。

本発明はまた、（ａ）ＶＥＧＦ受容体の細胞外リガンド結合ドメインを含む第１のペプチド、（ｂ）抗体のＦｃ領域、および（ｃ）ＰＤＧＦ受容体の細胞外リガンドを含む第２のペプチドを含む融合タンパク質をコードする核酸を含む組成物を提供し、融合タンパク質は、（ａ）−（ｂ）−（ｃ）および（ｃ）−（ｂ）−（ａ）からなる群から選択される順序で、好ましくは（ｃ）−（ｂ）−（ａ）の順番でＮ末端からＣ末端に配置される。

本発明の融合タンパク質をコードする核酸分子を含む組成物は、融合タンパク質の発現のために核酸分子を細胞に導入するための送達媒体を含むことができる。核酸送達媒体の例には、リポソーム、天然ポリマーおよび合成ポリマーを含む生体適合性ポリマー、リポタンパク質、ポリペプチド、多糖類、リポ多糖類、人工ウイルスエンベロープ、金属粒子およびバクテリア、バキュロウイルス、アデノウイルスおよびレトロウイルスなどのウイルス、バクテリオファージ、コスミド、プラスミド、真菌ベクターならびに種々の真核生物宿主での発現のために開示されている当該分野で典型的に使用される他の組換え媒体が含まれる。

本発明はまた、新血管新生、血管透過性、浮腫、または炎症、網膜症、線維症または癌を特徴とする疾患といった異常な血管新生を特徴とする状態、疾患または障害を治療または予防するための本明細書に記載の医薬組成物の使用に関する。本発明の実施形態によれば、対象における異常な血管新生を特徴とする状態、疾患または障害を治療する方法は、本発明の医薬組成物の治療が必要な対象に投与することを含む。本明細書に記載の医薬組成物のいずれも、本発明の方法において使用され得、それには、融合タンパク質を含む医薬組成物または融合タンパク質をコードする核酸を含む医薬組成物が含まれる。好ましくは、本発明の医薬組成物は、眼科関連疾患のために硝子体、結膜、テノン、後眼球、または強膜を介して、全身疾患に対する血液または組織に投与される。

本明細書中で使用される場合、「対象」は、本発明の実施形態による方法によって治療されるかまたは治療される任意の動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトを意味する。本明細書中で使用される場合、「哺乳動物」は、いかなる哺乳動物をも包含する。哺乳類の例としては、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、サルまたは類人猿といった非ヒト霊長類（ＮＨＰ）ヒトなど、より好ましくはヒトが挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書中で使用される「異常な血管新生を特徴とする状態、疾患または障害」または「血管新生型障害」は、同じ意味を有するものとし、過度の、不十分な、または異常な血管新生を含む、異常な血管生成に関連する任意の障害をいう。本発明の方法に従って治療され得る血管新生型障害の例としては、限定されるものではないが、血管新生、血管透過性、浮腫、または炎症を含む。これらには、限定されるものではないが、加齢性黄斑変性症（滲出性ＡＭＤ、乾性ＡＭＤまたは地図状萎縮症など）を含む加齢黄斑変性、増殖性及び非増殖性糖尿病性網膜症、血管新生（角膜血管新生または脈絡膜血管新生など）により特徴付けられる眼の疾患、ブドウ膜炎（前部ブドウ膜炎または後部ブドウ膜炎など）、色素性網膜炎、糖尿病性網膜症、虹彩血管新生、血管新生性緑内障、炎症性疾患、慢性関節リウマチ、炎症性関節炎、変形性関節症、自己免疫疾患および癌が含まれる。本発明の好ましい実施形態では、治療される血管新生型疾患は、網膜症、線維症または癌である。

他の実施形態では、本発明の方法に従って治療され得る血管新生型疾患には、脳浮腫、脳卒中、乾癬、喘息、火傷に関連する全身浮腫、腫瘍に関連する腹水および胸水、炎症または外傷、慢性気道炎症、全身性毛細血管漏出症候群、敗血症、タンパク質漏出の増加に関連する腎臓疾患を含むが、これらに限定されない。

本明細書で使用する「治療する」、「治療すること」および「治療」という用語は、対象における所望の治療または臨床的転帰を達成するために対象に組成物を投与することをいう。一実施形態では、「治療する」、「治療すること」および「治療」という用語は、血管透過性、浮腫または炎症などの血管新生型疾患の進行または発達を軽減、緩和または緩徐化するために本発明の医薬組成物を投与することをいう。さらに別の実施形態では、「治療する」、「治療すること」および「治療」という用語は、眼の角膜血管新生および／または漏出性脈管構造を阻害または減少させるために本発明の医薬組成物を投与することをいう。さらに別の実施形態では、「治療する」、「治療すること」および「治療」という用語は、本発明の医薬組成物を投与して、角膜における新血管（すなわち、角膜新生血管形成）または影響部位の進行または発達を遅らせることをいう。本発明の特定の実施形態では、ＡＭＤに関連して使用する場合、「治療する」、「治療すること」および「治療」という用語は、ＶＥＧＦ誘導性網膜漏出を予防または低減すること、また、血管新生に関連する眼の瘢痕および線維症を予防または低減することをいう。本発明の特定の実施形態において、癌に関連して使用される場合、「治療する」、「治療すること」および「治療」という用語は、癌性細胞の増殖、脱分化または拡散の低減をいう。本発明による腫瘍の治療には、腫瘍サイズの縮小、腫瘍増殖の減少、および腫瘍転移の減少が含まれる。本明細書で使用する「腫瘍」という用語は、異常な組織塊を指し、良性および悪性塊の両方を含む。

本発明の実施形態によれば、医薬組成物は、局所投与、硝子体内注射、脈絡膜上または結膜下注射などの、本開示の観点から当業者に公知の任意の方法によって投与され得る。好ましい実施形態では、眼用製剤は硝子体内投与される。医薬組成物は、眼の任意の部分に投与され得、好ましくは血管新生型疾患の治療のために眼の硝子体に投与される。医薬組成物は、身体の任意の部分に投与され得、好ましくは血管新生型障害の治療のために血液または組織／器官に投与される。

本発明の実施形態による、対象への医薬組成物の投与量、投与頻度、および投与期間などのパラメータは、特定の方法で限定されない。そのようなパラメータの最適値は、治療される対象、治療される特定の血管新生型疾患、疾患の重症度などの様々な要因に依存し得、当業者は、所望の治療または臨床的転帰を達成するために、そのようなパラメータの最適値を決定することができる。例えば、医薬組成物は１日１回、または例えば２回、３回、４回などのように１日に複数回投与され得る。典型的かつ非限定的な投与レジメンは、医薬組成物を硝子体内に１ヵ月の期間に１回投与することを含む。

他の実施形態では、本発明の医薬組成物は、抗肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、抗ＨＧＦ受容体（ＨＧＦＲ）、抗線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、抗ＦＧＦ受容体（ＦＧＦＲ）、抗炎症剤（コルチコステロイド、非ステロイド性抗炎症薬）、免疫調節剤、抗生剤、および抗癌剤といった他の抗血管新生剤ともに投与され得る。

一般的な態様において、本発明は、本発明の融合タンパク質を含むＰＤＧＦおよびＶＥＧＦに対する二量体アンタゴニストを提供する。二量体中の各融合タンパク質は、本明細書に開示される任意の融合タンパク質を含む。一実施形態では、二量体融合タンパク質は、本発明の２つの同一の融合タンパク質を含む。別の実施形態では、二量体融合タンパク質は、本発明の２つの異なる融合タンパク質を含む。別の実施形態では、二量体融合タンパク質は、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２のアミノ酸２０〜７６６、配列番号４４のアミノ酸２１〜７６９および配列番号５０のアミノ酸２０〜７６８からなる群より選択されるアミノ酸配列、または配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２のアミノ酸２０〜７６６、配列番号４４のアミノ酸２１〜７６９ならびに配列番号５０のアミノ酸２０〜７６８からなる群より選択されるアミノ酸に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む少なくとも１つの融合タンパク質を含む。

別の一般的な態様において、本発明は、ＰＤＧＦおよびＶＥＧＦからなる群から選択される少なくとも１つのリガンドに結合した本発明の融合タンパク質を含むタンパク質コンジュゲートを提供する。

（実施形態）
実施形態１は、（ａ）ＶＥＧＦ受容体の細胞外リガンド結合ドメインを含む第１のペプチド、（ｂ）抗体のＦｃ領域、および（ｃ）ＰＤＧＦ受容体の細胞外リガンドを含む第２のペプチドを含む融合タンパク質であり、融合タンパク質は、（ａ）−（ｂ）−（ｃ）および（ｃ）−（ｂ）−（ａ）からなる群から選択される順序でＮ末端からＣ末端に配置され、融合タンパク質は、ＶＥＧＦおよびＰＤＧＦに結合し、ＶＥＧＦの活性およびＰＤＧＦの活性を阻害することができる。

実施形態２は、実施形態１による融合タンパク質であり、ＶＥＧＦ受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、ＶＥＧＦリガンドに結合することができ、ＶＥＧＦ受容体のＩｇ様ドメインＤ１〜Ｄ７からなる群より選択される１つ以上を含む。

実施形態３は、実施形態１による融合タンパク質であり、ＰＤＧＦ受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、ＰＤＧＦリガンドに結合することができ、ＰＤＧＦ受容体のＩｇ様ドメインＤ１〜Ｄ５からなる群より選択される１つ以上を含む。

実施形態４は、実施形態１による融合タンパク質であり、（ａ）ＶＥＧＦ受容体の細胞外リガンド結合ドメインが、第１のＶＥＧＦＲ、好ましくはＶＥＧＦＲ１のＩｇ様ドメインＤ２及び第２のＶＥＧＦＲ、好ましくはＶＥＧＦＲ２のＩｇ様ドメインＤ３を含み、（ｂ）抗体のＦｃ領域は、ＩｇＧ１のＣＨ２およびＣＨ３領域を含み、（ｃ）ＰＤＧＦ受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、ＰＤＧＦＲ、好ましくはＰＤＧＦＲβのＩｇ様ドメインＤ１〜Ｄ３を含む。

実施形態５は、実施形態４による融合タンパク質であり、（ａ）ＶＥＧＦ受容体の細胞外リガンド結合ドメインが、配列番号７と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、（ｂ）抗体のＦｃ領域は、配列番号１２に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、（ｃ）ＰＤＧＦ受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

実施形態６は、実施形態５による融合タンパク質であり、（ａ）ＶＥＧＦ受容体の細胞外リガンド結合ドメインが、配列番号７および１０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、（ｂ）抗体のＦｃ領域は、配列番号１２および１５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、（ｃ）ＰＤＧＦ受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、配列番号２および５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。

実施形態７は、実施形態１〜６のいずれかによる融合タンパク質であり、Ｆｃ領域と融合タンパク質のＣ末端の第１または第２ペプチドとの間に第１のリンカーペプチドをさらに含み、場合により、融合タンパク質のＮ末端の第２または第１のペプチドとＦｃ領域との間に第２のリンカーペプチドを含む。

実施形態８は、実施形態７による融合タンパク質であり、第１のリンカーペプチドが、配列番号２０，２２，２４，２６，２８，３０および３２からなる群より選択される１つまたは複数のアミノ酸配列を含み、第２のリンカーペプチドが、配列番号１８のアミノ酸配列を含む。

実施形態９は、実施形態１〜８のいずれかによる融合タンパク質であり、融合タンパク質は、融合タンパク質のＮ末端に結合されたシグナルペプチドをさらに含む。

実施形態１０は、実施形態９による融合タンパク質であり、シグナルペプチドが、配列番号３４および３６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。

実施態様１１は、実施態様１〜１０のいずれかに記載の融合タンパク質であり、融合タンパク質が、（ｃ）−（ｂ）−（ａ）の順序でＮ末端からＣ末端に配置される。

実施形態１２は、配列番号３８または４０と少なくとも９０％の同一性を有するか、または配列番号４２のアミノ酸２０〜７６６、配列番号４４のアミノ酸２１〜７６９もしくは配列番号５０のアミノ酸２０〜７６８と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む融合タンパク質である。

実施態様１３は、実施形態１２による融合タンパク質であり、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２のアミノ酸２０〜７６６、配列番号４４のアミノ酸２１〜７６９および配列番号５０のアミノ酸２０〜７６８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。

実施形態１４は、実施形態１〜１３のいずれか１つの融合タンパク質をコードする単離された核酸分子である。

実施態様１５は、実施形態１４による単離された核酸分子であり、融合タンパク質が、融合タンパク質のＮ末端に結合されたシグナルペプチドをさらに含む。

実施形態１６は、実施形態１５による単離された核酸分子であり、シグナルペプチドが、配列番号３４および３６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。

実施形態１７は、実施形態１４〜１６のいずれかに記載の単離された核酸分子であり、核酸分子が、配列番号３７，３９，４１，４３および４９からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む。

実施形態１８は、実施形態１〜１３のいずれか１つの融合タンパク質をコードする核酸分子を含む発現ベクターである。

実施形態１９は、実施形態１８による発現ベクターであり、核酸分子が配列番号３７，３９，４１，４３および４９からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む。

実施形態２０は、実施形態１〜１３のいずれか１つの融合タンパク質をコードする核酸分子を含む宿主細胞である。

実施形態２１は、実施形態１〜１３のいずれか１つの融合タンパク質を産生する方法であって、（１）融合タンパク質が産生される条件下で、実施形態１〜１３のいずれか１つの融合タンパク質をコードする核酸分子を含む宿主細胞を培養する工程と、（２）宿主細胞によって産生された融合タンパク質を回収する工程と、を含む。

実施形態２２は、実施形態１〜１３のいずれか１つの融合タンパク質と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物である。

実施態様２３は、実施形態２２による医薬組成物であり、組成物が、ｐＨ約６．３〜７．３で、約５〜１００ｍＭのヒスチジン、約１〜１０％ｗ／ｖのスクロース、および約０．００５〜０．１％ｗ／ｖのポリソルベート２０を含む緩衝液中に処方された４０〜８０ｍｇ／ｍＬの融合タンパク質を含む。

実施形態２４は、実施形態１〜１３のいずれか１つの融合タンパク質をコードする核酸分子と、脂質担体（例えば、リポフェクタミン）、化学物質（例えば、ポリエチレンイミン）またはエレクトロポレーション緩衝液といった薬学的に許容される担体と、を含む医薬組成物である。

実施態様２５は、実施形態２４による医薬組成物であり、組成物は、発現カセットを有するプラスミドと、脂質担体（例えば、リポフェクタミン）、化学物質（例えば、ポリエチレンイミン）またはエレクトロポレーション緩衝液といった薬学的に許容される担体と、を含む。

実施形態２６は、新血管新生、血管透過性、浮腫および炎症からなる群より選択される臨床状態を治療または予防する方法であって、該方法は、それを必要とする対象に有効量の実施形態１〜１３のいずれの融合タンパク質または実施形態２２〜２５のいずれかの医薬組成物を投与することを含む。

実施形態２７は、実施形態２６の方法であり、融合タンパク質は、実施形態２２〜２３のいずれかの医薬組成物において、単離されたタンパク質として投与される。

実施形態２８は、実施形態２６の方法であり、融合タンパク質は、実施形態２４および２５のいずれかの医薬組成物において投与される。

実施形態２９は、実施形態２６〜２８のいずれか１つの方法であり、臨床状態は、脳浮腫、脳卒中、癌、乾癬、関節炎、喘息、火傷に関連する全身浮腫、腫瘍に関連する腹水および胸水、炎症または外傷、慢性気道炎症、全身性毛細血管漏出症候群、敗血症、タンパク質の増加する漏出に関連する腎疾患、眼の炎症および／または眼の血管新生からなる群より選択され、加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症、虹彩血管新生および新血管性緑内障を含む。

実施形態３０は、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、湿潤加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）および地図状萎縮からなる群から選択される臨床状態を治療または予防する方法であって、該方法は、それを必要とする対象に有効量の実施形態１〜１３のいずれか１つの融合タンパク質、または実施形態２２〜２５のいずれかの医薬組成物を投与することを含む。

実施形態３１は、実施形態３０の方法であり、融合タンパク質は、実施形態２２〜２３のいずれかの医薬組成物において、単離されたタンパク質として投与される。

実施形態３２は、実施形態３０の方法であり、融合タンパク質は、実施形態２４および２５のいずれかの医薬組成物において投与される。

実施形態３３は、実施形態１〜１３のいずれか１つの融合タンパク質を含むＰＤＧＦおよびＶＥＧＦの二量体アンタゴニストである。

実施形態３４は、ＰＤＧＦおよびＶＥＧＦからなる群より選択される少なくとも１つのリガンドに結合された、実施形態１〜１３のいずれか１つの融合タンパク質を含むタンパク質コンジュゲートである。

以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

（実施例１）
融合タンパク質の生成、発現および精製および分析

ＰＤＧＦＲβのＩｇ様ドメインＤ１〜Ｄ３を有するＰＤＧＦＲ細胞外Ｉｇ様ドメイン（ＰＩＤ）（配列番号２）（Ｈｅｉｄａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ．１９９５ Ｊａｎ；９（ｌ）：１４０−５；Ｌｏｋｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９７ Ｄｅｃ ２６；２７２（５２）：３３０３７−４４）およびＶＥＧＦＲ−１のＩｇ様ドメインＤ２（ＶＥＧＦＲ−１＿Ｄ２）ならびにＶＥＧＦＲ−２のＩｇ様ドメインＤ３（ＶＥＧＦＲ−２＿Ｄ３）を有するＶＥＧＦＲ細胞外Ｉｇ様ドメイン（ＶＩＤ）（配列番号７）（Ｈｏｌａｓｈ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ，ＰＮＡＳ，２００２，９９（１７）：１１３９３−９８）を融合タンパク質に組み込んだ。正しい折り畳みを確実にし、立体障害を最小限にするために、短い柔軟なペプチドリンカー、ＧＧＧＧＧＳ（配列番号２０）を、Ｆｃ領域のＣ末端（配列番号１２）とＮ末端モジュール（ＰＩＤまたはＶＩＤのいずれか）との間に配置した。産生された融合タンパク質２または融合タンパク質１が確実に分泌されるように、シグナルペプチド（例えば、配列番号３４または配列番号３６）を含めた。ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域を組み込んで、ｉｎ ｖｉｖｏ受容体二量体化を模倣して融合タンパク質の二量化を引き起こし、発現された融合タンパク質の容易な精製を可能にした。

配列番号３８および４０のアミノ酸配列を有する融合タンパク質１および２のコード配列を各々、ヒト胎児腎臓細胞株（ＨＥＫ２９３Ｆ）にトランスフェクトし、発現させた。分泌された融合タンパク質を、ワンステッププロテインＧクロマトグラフィーを用いて細胞培養上清から精製した。タンパク質を、プロテインＧアフィニティーカラム（サーモフィッシャーサイエンティフィック）で捕捉し、低ｐＨ（３．５）緩衝液で溶出し、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌで中和した。図２（ａ）〜２（ｃ）に示すように、９０％を超える純度が、一段階精製法を用いて達成された。図２（ａ）〜２（ｃ）はまた、精製された融合タンパク質１，２，３および５が予測される重量（ＭＷ〜１８０ｋＤａ）を有し、哺乳動物細胞で発現される場合に適切に二量体化されることを示す。

試験中、融合タンパク質１のコード配列、配列番号３７を発現ベクターに組み込んだ。ＰＤＧＦに対する精製融合タンパク質１の競合結合アッセイおよび融合タンパク質１のＰＤＧＦ依存性ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞増殖阻害アッセイの結果は、融合タンパク質１の結合能に位置的な効果があることを示しており、例えば、それははるかに低い親和性でＰＤＧＦ−ＢＢに結合する（例えば、表４および６参照）。

したがって、融合タンパク質２は、ＶＩＤおよびＰＩＤの配向を再配列することによって構築された。融合タンパク質２のコード配列、配列番号３９を発現ベクターに組み込んだ。適切な量の発現ベクターＤＮＡを用いて、ＨＥＫ２９３Ｆ宿主細胞を発現ベクターでトランスフェクトした。安定したクローンを、抗Ｆｃ ＥＬＩＳＡによって評価されたタンパク質発現レベルに基づいて選択し、融合タンパク質発現の最適レベルによってクローンから研究細胞バンク（ＲＣＢ）を作製した。融合タンパク質２ ＲＣＢを振とうフラスコタンパク質生産に用い、タンパク質を、プロテインＡアフィニティ樹脂を用いて培養上清から精製した。タンパク質を、賦形剤を含むリン酸緩衝液に緩衝液交換した。精製された融合タンパク質２の最終濃度は、約２０ｍｇ／ｍＬであった。

融合タンパク質２の変異を実施し、融合タンパク質２の変異体、すなわち融合タンパク質３を産生した。これは、ＩｇＧ１ ＦｃのＣ末端に欠失リジン残基（Ｋ５２８）および融合タンパク質２のＰＩＤにフェニルアラニンからセリン（Ｆ１５０Ｓ）への変異を含む。２段階ＰＣＲ突然変異誘導法を用いて、最初にリジンを欠失させ、次にフェニルアラニンをセリンに変化させた。最終構築物は、配列番号４３のコード配列を含む。ＣＨＯ−Ｓ宿主細胞を、適切な量の発現ベクターＤＮＡを用いて発現ベクターでトランスフェクトした。第１の安定なクローンを、抗Ｆｃ ＥＬＩＳＡによって評価したタンパク質発現レベルに基づいて選択した。これを用いて、配列番号４４のアミノ酸２１〜７６９のアミノ酸配列（配列番号４４のアミノ酸１〜２０は、タンパク質合成中に切断されたシグナルペプチド配列である）を有する融合タンパク質３を産生した。モノクローナル性の問題がＦＡＣＳによって検出されたので、１回の再クローニングが行われた。発現レベルに基づいて第２の安定なクローンを選択し、クローンを用いて融合タンパク質４ ＲＣＢを生成した。融合タンパク質４ ＲＣＢは、振とうフラスコ試験およびバイオリアクター製造の両方に対して使用された。融合タンパク質４ ＲＣＢのバイアルを解凍し、１Ｌ振とうフラスコ中で増殖させ、融合タンパク質３と同じアミノ酸配列を有する融合タンパク質４を生成した。プロテインＡアフィニティー樹脂を用いて、６バッチの精製タンパク質を調製した（１段階精製）。タンパク質を、賦形剤を含むヒスチジン緩衝液に緩衝液交換した。融合タンパク質４の最終濃度は、約２０ｍｇ／ｍＬであった。

十分な量の融合タンパク質４を得るために、約５Ｌの最終容積で、７Ｌのバイオリアクター（ＢＲ）を作動させた。プラットフォーム操作手順、パラメータ設定および制御ストラテジーを使用し、培地の種類および供給スケジュールに従った。最終生成物力価は、０．２１ｇ／Ｌであった。

精製された融合タンパク質サンプルを、清澄化、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー、第１の限外濾過工程、サイズ排除クロマトグラフィー、第２の限外ろ過工程、透析、および第３の限外ろ過工程によってさらに処理して、最終生成物を得た。

配列番号５０のアミノ酸２０〜７６８のアミノ酸配列（配列番号５０のアミノ酸１〜１９は、タンパク質合成の間に切断されたシグナルペプチド配列である）を有する融合タンパク質５を作製するために、融合タンパク質５をコードするＤＮＡ配列を、ＣＨＯ細胞に対してコドン最適化した。配列番号４９の核酸配列を有する合成コドン最適化ＤＮＡを、発現ベクターにクローニングした。ＣＨＯ Ｋ１宿主細胞を、トランスフェクションの７２時間前に、４ｍＭグルタミン（Ｊ．Ｔ Ｂａｋｅｒ ２０７８−０６）および１％ＨＴ補充物（Ｇｉｂｃｏ １１０６７−０３０）を含むＣＤ ＣＨＯ（Ｇｉｂｃｏ １２４９０−００３）中に２×１０^５細胞／ｍＬで播種した。宿主細胞を、インフォアシェーカー（３６．５℃、７５％湿度、６％ＣＯ_２、１１０ＲＰＭ）中でインキュベートし、使用前に細胞密度を数えた。適切な量の発現プラスミドＤＮＡを宿主細胞（１Ｌまたは５Ｌ容積）に添加し、ポリマーベースのトランスフェクション試薬を添加した。トランスフェクトされた培養物をインフォアシェーカー（３６．５℃、７５％湿度、６％ＣＯ_２、１１０ＲＰＭ）中で４時間インキュベートし、独自の供給溶液を加えた。次いで、トランスフェクトされた培養物をインフォアシェーカー（３２℃、７５％湿度、６％ＣＯ_２、１１０ＲＰＭ）中でインキュベートした。トランスフェクトされた培養物を、トランスフェクション後１０日目に回収した。上清を研究材料の生成のために精製した。精製プロセスには、清澄化、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａｃｅｌによる濃縮、サイズ排除クロマトグラフィー、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒによる透析、および製剤緩衝液中のＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａｃｅｌによる最終濃縮が含まれた。

配列番号４２のアミノ酸２０〜７６６を有する融合タンパク質６は、融合タンパク質５の最初の２つのアミノ酸（ＱＧ）を欠失させることで融合タンパク質５に由来し、配列番号４２のアミノ酸１−１９は、タンパク質合成中に切断されたシグナルペプチド配列である。ＤＮＡインサートを、融合タンパク質５発現ベクターを鋳型として用いてＰＣＲにより作製し、配列番号４１の核酸配列を有する融合タンパク質６をコードするＤＮＡ配列を発現ベクターにクローニングした。培養および精製手順は、融合タンパク質５と同じであった。融合タンパク質６の最終濃度は、指定の製剤緩衝液中で約８０ｍｇ／ｍＬであった（２８０ｎｍでの吸収に基づく）。

合計として、これらのデータは、同時の抗ＶＥＧＦおよび抗ＰＤＧＦ活性を有する融合タンパク質が構築され、発現され、精製され、特徴付けされたことを示す。

（実施例２）
融合タンパク質のＶＥＧＦ_１６５への結合親和性

直接結合酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬ１ＳＡ）を用いて、ＶＥＧＦ−Ａのスプライス変異体であるＶＥＧＦ_１６５に対する本発明の融合タンパク質の結合親和性を測定した。合成したＶＥＧＦトラップを、ポジティブコントロール１として使用した。

ＶＥＧＦトラップは、治療的使用のために設計された可溶性ＶＥＧＦ受容体であり、現在ＡＭＤを治療するためにＦＤＡによって承認されている。ＶＥＧＦトラップは、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合したＶＥＧＦＲ２の第３のＩｇ様ドメイン（Ｄ３）に融合したＶＥＧＦＲ１の第２のＩｇ様ドメイン（Ｄ２）を含む（Ｈｏｌａｓｈ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２００２ Ａｕｇ ２０；９９（１７）：１１３９３−８）。ＶＥＧＦトラップは、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、およびＰ１ＧＦを標的とする。

９６ウェルＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに１００μＬのコーティング溶液（１×リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．２中の１μｇ／ｍＬ ＶＥＧＦ_１６５）を添加し、プレートを４℃で一晩インキュベートした。ウェルを４００μＬの１×ＰＢＳ緩衝液で２回洗浄し、過剰の液体をペーパータオルで注意深く除去した。

４００μＬのブロッキング溶液（１００ｍＬの１×ＰＢＳ中の５ｇスキムミルク）を各ウェルに添加し、プレートを室温で１時間インキュベートした。ウェルを１×ＰＢＳ緩衝液で２回洗浄した。

融合タンパク質およびコントロールサンプルをブロッキング溶液中で連続的に３倍に希釈し、最も高いタンパク質濃度は１０ｍＭであった。連続希釈したサンプル１００μＬを各ウェルに添加した。プレートを覆い、プレートシェーカー（〜１００ｒｐｍ）上で室温で１時間インキュベートした。ウェルを洗浄緩衝液（１×ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄した。

ブロッキング溶液中の１００μＬの１：２５００希釈西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ特異的抗体を各ウェルに添加した。プレートを密封し、プレートシェーカー上で、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄した。

１００μＬの３，５，３’，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を各ウェルに加え、プレートを３〜５分間インキュベートして反応を起こさせた。反応を停止させるために、１００μＬの停止溶液（１Ｎ ＨＣｌ）を各ウェルに添加した。

各ウェルの光学密度（ＯＤ）を、４５０ｎｍの吸光度波長で、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用して決定した。吸光度を融合タンパク質またはコントロールのタンパク質濃度に対してプロットし、シグナルが最大有効濃度（ＥＣ_５０）の半分である濃度を決定した。

試験された本発明の融合タンパク質について、ＥＣ_５０値として表される結合親和性は、０．２２と０．９３ｎＭとの間であった。ＥＬ１ＳＡの結果を表１に示す。

この実施例からの結果は、本発明の実施形態による融合タンパク質、例えば融合タンパク質１〜５が、ＶＥＧＦ_１６５に高親和性で結合することを示した。図３も参照のこと。

（実施例３）
融合タンパク質のＰＤＧＦへの結合親和性

直接結合ＥＬＩＳＡを用いて、本発明の融合タンパク質のＰＤＧＦへの結合親和性を測定した。合成ＰＤＧＦトラップをポジティブコントロール２として使用した。

ＰＤＧＦトラップは、ポジティブコントロールとしての使用のために操作された可溶性ＰＤＧＦ受容体である。ＰＤＧＦトラップは、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合されたＰＤＧＦＲβの第２のＩｇ様ドメイン（Ｄ１〜Ｄ３）を含む（Ｌｕ ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ．，２００８，１９８（４）：４７７．ｅｌ−ｅｌ０）。ＰＤＧＦトラップは、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＤＤ、およびＰＤＧＦ−ＡＢを標的とする。

１００μＬのコーティング溶液（１×リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．２中の１μｇ／ｍＬのＰＤＧＦ−ＢＢ）を９６ウェルＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに添加し、プレートを４℃で一晩インキュベートした。ウェルを４００μＬの１×ＰＢＳ緩衝液で２回洗浄し、余分な液体をペーパータオルで注意深く除去した。

４００μＬのブロッキング溶液（１００ｍＬの１×ＰＢＳ中の１ｇのウシ血清アルブミン）を各ウェルに添加し、プレートを室温で１時間インキュベートした。ウェルを１×ＰＢＳ緩衝液で２回洗浄した。

融合タンパク質およびコントロールサンプルをブロッキング溶液中で連続的に３倍に希釈し、最も高いタンパク質濃度は１０ｍＭであった。連続希釈したサンプル１００μＬを各ウェルに添加した。プレートを覆い、プレートシェーカー（〜１００ｒｐｍ）上で室温で１時間インキュベートした。ウェルを洗浄緩衝液（１×ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄した。

ブロッキング溶液中の１００μＬの１：２５００希釈西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ特異的抗体を、各ウェルに添加した。プレートを密封し、プレートシェーカー上で、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄した。

１００μＬの３，５，３’，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を各ウェルに加え、プレートを３〜５分間インキュベートして反応を起こさせた。反応を停止させるために、１００μＬの停止溶液（１Ｎ ＨＣｌ）を各ウェルに添加した。

各ウェルの光学密度（ＯＤ）を、４５０ｎｍの吸光度波長で、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用して決定した。吸光度を融合タンパク質またはコントロールのタンパク質濃度に対してプロットし、シグナルが最大有効濃度（ＥＣ_５０）の半分である濃度を決定した。

試験された本発明の融合タンパク質について、ＥＣ_５０値として表される結合親和性は、０．１６〜２．５ｎＭであった。ＥＬ１ＳＡの結果を表２に示す。

この実施例からの結果は、本発明の実施形態による融合タンパク質、例えば融合タンパク質１〜５が、ＰＤＧＦに高親和性で結合することを示した。図４も参照のこと。

（実施例４）
融合タンパク質のＶＥＧＦＫ_１６５への競合的結合

競合的結合アッセイを用いて、本発明の融合タンパク質のＶＥＧＦ_１６５に対する結合親和性を評価した。合成したＶＥＧＦトラップをポジティブコントロール１として使用した。

融合タンパク質およびコントロールサンプルをブロッキング溶液中で連続的に３倍に希釈し、最も高いタンパク質濃度は１０ｍＭであった。等量の希釈サンプルを室温で一晩５ｐＭ ＶＥＧＦ−Ａ（Ｒ＆Ｄシステム）の最終濃度に対して１０ｐＭのＶＥＧＦ_１６５と共にインキュベートした。

Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡヒトＶＥＧＦキット（Ｒ＆Ｄシステム社）からのアッセイ希釈液５０μＬを９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。２００μＬの標準、コントロール、または融合タンパク質を、適切なウェルに二重に添加した。プレートを密封し、室温で２時間インキュベートし、次いで洗浄緩衝液で３回洗浄した。

キット中に提供されたＶＥＧＦ_１６５コンジュゲート２００μＬを各ウェルに加え、プレートを密封し、室温で２時間インキュベートした。プレートを３回洗浄した。

キット中に提供された基質溶液２００μＬを各ウェルに加え、プレートを密封し、室温で２０分間インキュベートした。反応を停止させるために、キット中に提供された停止溶液５０μＬを各ウェルに添加した。

各ウェルのＯＤは、４５０ｎｍおよび５４０ｎｍ（または５７０ｎｍ）の吸光度波長でＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用して決定した。結合していないＶＥＧＦ_１６５（遊離ＶＥＧＦ_１６５）の濃度を、融合タンパク質またはコントロールのタンパク質濃度に対してプロットし、遊離ＶＥＧＦ_１６５からのシグナルが５０％減少した融合タンパク質の濃度（ＩＣ_５０）を決定した。

本発明の融合タンパク質のＩＣ_５０値は、約３．７８〜４．６７ｐＭであると決定された。競合結合アッセイの結果を表３に示す。

この実施例からの結果は、本発明の融合タンパク質、例えば融合タンパク質１、２および３が高親和性でＶＥＧＦ_１６５に結合することを確認した。図５（ａ）および図６（ａ）も参照のこと。

（実施例５）
ＰＤＧＦ−ＢＢへの融合タンパク質の競合的結合

競合的結合アッセイを用いて、ＰＤＧＦ−ＢＢに対する本発明の融合タンパク質の結合親和性を評価した。合成ＰＤＧＦトラップをポジティブコントロール２として使用した。

融合タンパク質およびコントロールサンプルをブロッキング溶液中で連続的に３倍に希釈し、最も高いタンパク質濃度は１０ｍＭであった。等量の希釈サンプルを２０ｐＭのＰＤＧＦ−ＢＢと一緒に最終濃度１０ｐＭで、室温で一晩インキュベートした。

１００μＬのＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡヒトＰＤＧＦ−ＢＢキット由来のアッセイ希釈液１００μＬを、９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。１００μＬの標準、コントロール、または融合タンパク質を、適切なウェルに二重に添加した。プレートを密封し、室温で２時間インキュベートし、次いで洗浄緩衝液で４回洗浄した。

キット中に提供されたＰＤＧＦ−ＢＢコンジュゲート２００μＬを各ウェルに加え、プレートを密封し、室温で１．５時間インキュベートした。プレートを４回洗浄した。

キット中に提供された基質溶液２００μＬを各ウェルに添加し、プレートを密封し、室温で２０分間インキュベートした。反応を停止するために、キット中に提供された５０μＬの停止溶液を各ウェルに添加した。

各ウェルのＯＤを、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて、４５０ｎｍおよび５４０ｎｍ（又は５７０ｎｍ）の吸光度波長で決定した。遊離ＰＤＧＦ−ＢＢを融合タンパク質またはコントロールのタンパク質濃度に対してプロットし、遊離ＰＤＧＦ−ＢＢからのシグナルが５０％減少した融合タンパク質の濃度（ＩＣ_５０）を決定した。

本発明の融合タンパク質のＩＣ_５０値は、約０．１２５〜２００ｎＭであると決定された。競合的結合アッセイの結果を表４に示す。

この実施例の結果から、本発明の融合タンパク質、例えば、融合タンパク質２および３が、高親和性でＰＤＧＦに結合することが確認された。図５（ｂ）および６（ｂ）も参照のこと。

（実施例６）
融合タンパク質によるＨＵＶＥＣ増殖の阻害

ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）増殖アッセイを実施して、本発明の融合タンパク質の機能性を試験した。合成したＶＥＧＦトラップをポジティブコントロール１として使用した。

９６ウェルＥＬＩＳＡプレートの各ウェルにコーティング溶液（再蒸留水中の１％ゼラチン）１００μＬを添加し、３７℃で２時間または一晩インキュベートした。ウェルを１×ＰＢＳ緩衝液で２回洗浄した。

内皮細胞増殖培地中の３５００カウントのヒト臍帯静脈内皮細胞を各ウェルに添加し、プレートを３７℃で一晩インキュベートした。

融合タンパク質のサンプルをアッセイ緩衝液（Ｍｅｄｉｕｍ−１９９ ｌ×Ｅａｒｌｅ’ｓ Ｓａｌｔｓ、１０％ウシ胎仔血清、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１×抗生物質／抗真菌薬）で希釈し、最も高いタンパク質濃度は３００ｎＭであった。融合タンパク質のサンプルをＶＥＧＦ_１６５（８ｎｇ／ｍＬ）と混合し、混合物を室温で一晩インキュベートした。次いで、ウェルを２００μＬの１×ＰＢＳで洗浄した。

１００μＬのＶＥＧＦ_１６５／サンプル混合物を各ウェルに加え、プレートを５％ＣＯ_２と共に３７℃で７２時間インキュベートした。インキュベート後、１０μＬのＭＴＳ検出試薬（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム）＋メソ硫酸フェナジンを蒸留ＰＢＳに溶解したもの）を各ウェルに加え、プレートを３７℃で２．５時間インキュベートした。

各ウェルのＯＤを、４９０ｎｍの吸光度波長でＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用して決定した。融合タンパク質またはコントロールのタンパク質濃度に対して吸光度をプロットし、細胞増殖が５０％阻害される濃度（ＩＣ_５０）を決定した。

細胞増殖の阻害（ＩＣ_５０）は、試験した本発明の融合タンパク質については０．０５８と０．２８５ｎＭとの間と決定された。増殖アッセイの結果を表５に示す。

この実施例からの結果は、本発明の融合タンパク質、例えば、融合タンパク質１〜５は、ＨＵＶＥＣ細胞のＶＥＧＦ依存性増殖を阻害したことを示した。図７も参照のこと。

（実施例７）
融合タンパク質によるＢＡＬＢ／３Ｔ３増殖の阻害

本発明の融合タンパク質の機能性を試験するために、ＢＡＬＢマウス由来の３Ｔ３線維芽細胞を用いた細胞増殖アッセイを行った。合成したＰＤＧＦトラップをポジティブコントロール２として使用した。

ＤＭＥＭ（１ｍＭピルビン酸ナトリウム、４ｍＭ Ｌ−グルタミン、１０％ウシ血清アルブミン、１×抗生物質／抗真菌剤）中の４０００カウントのマウス３Ｔ３線維芽細胞を各ウェルに添加し、プレートを３７℃で一晩インキュベートした。

融合タンパク質のサンプルをアッセイ緩衝液（１ｍＭピルビン酸ナトリウム、４ｍＭ Ｌ−グルタミン、０．５％ウシ血清アルブミン、１×抗生物質／抗真菌薬）で希釈し、最も高いタンパク質濃度は３００ｎＭであった。融合タンパク質のサンプルをＰＤＧＦ（８ｎｇ／ｍＬ）と混合し、混合物を室温で一晩インキュベートした。次いで、ウェルを２００μＬの１×ＰＢＳで洗浄した。

細胞をアッセイ緩衝液で３７℃、５％ＣＯ_２で４時間飢餓状態にした。１００μＬのＰＤＧＦ／サンプル混合物を各ウェルに添加し、プレートを３７℃、５％ＣＯ_２で７２時間インキュベートした。インキュベーション後、１０μＬのＭＴＳ検出試薬を各ウェルに加え、プレートを３７℃で２．５時間インキュベートした。

各ウェルのＯＤを、４９０ｎｍの吸光度波長でＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用して決定した。融合タンパク質またはコントロールのタンパク質濃度に対して吸光度をプロットし、細胞増殖が５０％阻害される濃度（ＩＣ_５０）を決定した。

試験した本発明の融合タンパク質のＩＣ_５０値は、０．４５と１０００ｎＭとの間であると計算された。増殖アッセイの結果を表６に示す。

この実施例の結果は、本発明の融合体、例えば融合タンパク質１〜５は、ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞のＰＤＧＦ依存性増殖を阻害したことを示した。図８も参照のこと。

（実施例８）
融合タンパク質によるダッチベルテッドウサギ（Ｄｕｔｃｈ Ｂｅｌｔｅｄ Ｒａｂｂｉｔ）におけるＶＥＧＦ誘導漏出の阻害

本発明の融合タンパク質を網膜血管新生のｉｎ ｖｉｖｏモデルで試験して、血管漏出の予防における有効性を決定した。このモデルでは、ＶＥＧＦをウサギの眼の硝子体に硝子体内注射して、網膜の制御されない血管新生およびそれに続く漏出を引き起こす。ＶＥＧＦ−Ａを阻害することにより血管新生をブロックする組換えヒト化モノクローナル抗体Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）およびヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に融合されたヒトＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２の部分からなる組換え融合タンパク質Ｅｙｌｅａを、ポジティブコントロール３および４として使用した。

ダッチベルテッドウサギをイソフルラン（３−５％）を用いて麻酔し、その眼を眼用ベタジン溶液で処置した。次いで、ウサギの眼を滅菌生理食塩水で洗浄し、塩酸リドカイン（２％注射剤）またはプロパラカイン（０．５％）を眼球表面に適用した。

１日目に、ダッチベルテッドウサギに、ＢＤ３００μＬインスリン注射器（３１ｇａ×５／１６インチ）を使用して、所定の用量で、本発明の融合タンパク質、媒材（ネガティブ）コントロール、または参照（ポジティブ）コントロールを硝子体内に注射した。針は眼の背側四分円、肢に対して約３〜４ｍｍ、背側直筋に対して３〜４ｍｍの側方に挿入され、５０μＬの溶液が送達された。３日目に、ＶＥＧＦ_１６５を同じ眼に注射した。

フルオレセイン血管造影（ＦＡ）をＶＥＧＦ誘導（６日目）の３日後のすべての投与群で実施し、０（正常）〜４（重度）のスケールを用いて漏出性および蛇行性を評価した。

眼の刺激のサインは、融合タンパク質投与の前、ＶＥＧＦ誘導前、およびＦＡ評価の前に、Ｄｒａｉｚｅスコアリングシステムを用いてスコア化した。Ｄｒａｉｚｅ分析によれば、ウサギの眼の全ては投薬開始前に正常であり、試験中に薬物関連の所見は見られなかった。Ｄｒａｉｚｅシステムを用いて得られた知見は、すべての投与群で一過性であり、観察され、したがって、硝子体内投与に関連する手順の可能性が高い。

媒材コントロール群に関連するＦＡは、網膜血管系の漏出および蛇行に関連する最も高い平均スコア（２．５８）を有していた。２つの参照ポジティブコントロール群は平均スコア０．２５および０を有し、網膜血管系の漏出および蛇行の有意な減少を示した。本発明の試験した融合タンパク質は、平均スコア０．１６７を有し、ポジティブコントロールに匹敵してＶＥＧＦ誘導性網膜漏出および蛇行を低減させることにおける有効性を示した。ｉｎ ｖｉｖｏアッセイの結果を表７に示す。

（実施例９）
融合タンパク質によるダッチベルテッドウサギにおけるＶＥＧＦ誘導漏出の用量応答阻害

本発明の融合タンパク質を、網膜血管新生のｉｎ ｖｉｖｏモデルにおいて種々の用量で試験して、血管漏出を予防する際の用量応答効果を決定した。このモデルでは、ＶＥＧＦ_１６５をウサギの眼の硝子体に硝子体内注射して、網膜の制御されない血管新生およびその後の漏出を誘導した。

１日目に、ダッチベルテッドウサギに、様々な用量、媒材（ネガティブ）コントロール、または参照（ポジティブ）コントロールで、本発明の実施形態による融合タンパク質５を硝子体内注射した。３日目にＶＥＧＦ誘導を行った。

０（正常）〜４（重症）のスケールを用いて、漏出および蛇行を評価するために、ＶＥＧＦ誘導（６日目）の３日後のすべての用量群についてＦＡを行った。

眼の刺激のサインは、融合タンパク質投与の前、ＶＥＧＦ誘導の前、およびＦＡ評価の前に、Ｄｒａｉｚｅスコアリングシステムを用いて示された。Ｄｒａｉｚｅ分析によれば、ウサギの眼の全ては投薬開始前に正常であり、試験中に薬物関連の所見は見られなかった。Ｄｒａｉｚｅシステムを用いて得られた知見は、すべての投与群で一過性であり、観察され、したがって、硝子体内投与に関連する手順の可能性が高い。

最初のＶＥＧＦ誘導に関して、媒材コントロール群に関連するＦＡは、網膜血管系漏出および蛇行に関連する最も高い平均スコア（３．４）を有していた。２つの参照ポジティブコントロール群は、０の平均スコアを有し、網膜血管系の漏出および蛇行の有意な減少を示した。本発明の試験した融合タンパク質（融合タンパク質５）は、それぞれ１００，５００および１０００μｇの用量で０．０８，０．４２および０．１７のスコアを有し、ポジティブコントロールに匹敵するＶＥＧＦ誘導性網膜漏出および蛇行を低減することにおける有効性を示した。

用量応答ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの結果を表８に示す。

（実施例１０）
融合タンパク質によるラットのレーザー誘導脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）における病変サイズの縮小

ブラウン・ノルウェーの目を１％シクロクロニル溶液で拡張し、光から保護した。拡張後、ラットをケタミンおよびキシラジン混合物を用いて麻酔する。１日目に５３２ｎｍのレーザーを用いて、３つの病変熱傷を各眼の網膜に導入する。

３日目に、動物をケタミンおよびキシラジン混合物で麻酔し、それらの目を拡張させ、所定の用量で、本発明の実施形態による５μＬの融合タンパク質、媒材（ネガティブ）コントロール、または参照（ポジティブ）コントロールを、３３ゲージの針を備えたハミルトンシリンジを用いて動物の両眼に硝子体内注射する。

２２日目に、動物は、体重当たり１μＬ／ｇの１０％フルオレセインナトリウムのＩＰ注射を受ける。眼底画像を、にＭｉｃｒｏｎ ＩＩＩ小動物ファンドスコープ（フェニックスリサーチ）を用いて、病変の導入前、病変を確認するために病変の焼き付け後、および２２日目に撮影する。病変の大きさを決定し、投与量グループ間で比較する。

（実施例１１）
融合タンパク質によるサルのレーザー誘導ＣＮＶにおける病変サイズの減少

レーザーで誘導されたＣＮＶモデルがサルで確立される。５３２ｎｍダイオードレーザー光凝固を使用して各眼の黄斑周囲に６〜９回の熱傷を導入し、本発明の０．５ｍｇの融合タンパク質を同日に硝子体内に注射する。

動物は、２０日後に静脈内２．５％可溶性ペントバルビタール（１ｍＬ／ｋｇ）で鎮静化される。眼瞼を固定して眼を開いたままにして、カラー写真を眼底カメラで撮影する。

その後、フルオレセイン色素（２０％フルオレセインナトリウム；０．０５ｍＬ／ｋｇ）を下肢の静脈に注射する。ＣＮＶ病変に関連するフルオレセインの漏出をモニタリングするために、動脈相、早期動静脈相、およびいくつかの後期動静脈相を含む、色素の注入後のいくつかの時点で写真を撮る。

（実施例１２）
融合タンパク質による異種移植マウスにおけるヒト腫瘍増殖の阻害

ヒト肝細胞癌Ｈｅｐ３Ｂ細胞（ＡＴＣＣ＃ＨＢ−８０６４）およびヒト結腸直腸癌ＬｏＶｏ細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−２２９）などの様々なヒト癌細胞を用いて、ヌードマウスに異種移植モデルを確立することができる。

腫瘍増殖に対する本発明の融合タンパク質の阻害効果を評価するために、腫瘍細胞をヌードマウスに移植し、０．１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲の本発明の実施形態による様々な濃度の融合タンパク質を、週に２回静脈内投与する。腫瘍の増殖は７週間まで測定される。

（実施例１３）
ラットおよびサルにおける融合タンパク質の薬物動態学的評価

本発明の融合タンパク質の薬物動態は動物において評価される。本発明の実施形態による１０〜３００ｍｇ／ｋｇの範囲の融合タンパク質が、皮下注射または静脈内注射によってラットまたはサルに投与される。血液サンプルは、注射後１５日まで異なる時点で得られる。血液サンプル中の融合タンパク質の濃度は、ＥＬＩＳＡ法を用いて決定され、薬物動態パラメータが計算される。

（実施例１４）
ウサギとサルにおける融合タンパク質の眼の薬物動態学的評価

本発明の融合タンパク質の薬物動態は動物において評価される。片眼あたり０．１〜４ｍｇの範囲の本発明の実施形態による融合タンパク質が、硝子体内注射によってウサギまたはサルに投与される。眼組織および血液サンプルは、注射後２８日まで異なる時点で得られる。眼組織および血液サンプル中の融合タンパク質の濃度は、ＥＬＩＳＡ法を用いて決定され、薬物動態パラメータが計算される。

本発明を詳細に説明し、特定の実施形態を参照して、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、様々な変更および修正を行うことができることが当業者には明らかであろう。

本出願は、２０１５年３月１１日に出願された米国仮出願６２／１３１，２６１号に基づくものであり、その明細書、特許請求の範囲、図面および要約書を含むものである。上記日本国特許出願における開示は、その全体が本明細書中に参照として含まれる。

この出願には、配列表が含まれており、それは、ファイル名が「６８８９４７−３ＷＯ＿ＳＴ２５」、作成日が２０１６年３月３日、約８８．９ｋバイトのサイズを有するＡＳＣＩＩ形式の配列表としてＥＦＳ−Ｗｅｂを介して提出される。ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して提出された配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

（付記項）
（付記１）
（ａ）ＶＥＧＦ受容体の細胞外リガンド結合ドメインを含む第１のペプチドと、
（ｂ）抗体のＦｃ領域と、
（ｃ）ＰＤＧＦ受容体の細胞外リガンド結合ドメインを含む第２のペプチドと、
を含み、
（ａ）−（ｂ）−（ｃ）および（ｃ）−（ｂ）−（ａ）からなる群から選択される順序でＮ末端からＣ末端に配置され、
ＶＥＧＦおよびＰＤＧＦに結合し、ＶＥＧＦの活性およびＰＤＧＦの活性を阻害することができる、
ことを特徴とする融合タンパク質。

（付記２）
（ａ）前記ＶＥＧＦ受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、ＶＥＧＦＲ１のＩｇ様ドメインＤ２およびＶＥＧＦＲ２のＩｇ様ドメインＤ３を含み、
（ｂ）前記抗体のＦｃ領域は、ＩｇＧ１のＣＨ２およびＣＨ３領域を含み、
（ｃ）前記ＰＤＧＦ受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、ＰＤＧＦＲβのＩｇ様ドメインＤ１〜Ｄ３を含む、
ことを特徴とする付記１に記載の融合タンパク質。

（付記３）
（ａ）前記ＶＥＧＦ受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、配列番号７に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
（ｂ）前記抗体のＦｃ領域は、配列番号１２に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
（ｃ）前記ＰＤＧＦ受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
ことを特徴とする付記２に記載の融合タンパク質。

（付記４）
（ａ）前記ＶＥＧＦ受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、配列番号７および１０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、
（ｂ）前記抗体のＦｃ領域は、配列番号１２および１５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、
（ｃ）前記ＰＤＧＦ受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、配列番号２および５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、
ことを特徴とする付記３に記載の融合タンパク質。

（付記５）
Ｆｃ領域と前記融合タンパク質のＣ末端の第１または第２のペプチドとの間の第１リンカーペプチドをさらに含み、
前記融合タンパク質のＮ末端の第１または第２のペプチドとＦｃ領域との間の第２リンカーペプチドを任意に含む、
ことを特徴とする付記１乃至４のいずれか１項に記載の融合タンパク質。

（付記６）
前記第１リンカーペプチドは、配列番号２０，２２，２４，２６，２８，３０および３２からなる群より選択される１つまたは複数のアミノ酸配列を含み、前記第２リンカーペプチドは、配列番号１８のアミノ酸配列を含む、
ことを特徴とする付記５に記載の融合タンパク質。

（付記７）
前記融合タンパク質のＮ末端に連結されたシグナルペプチドをさらに含む、
ことを特徴とする付記１乃至６のいずれか１項に記載の融合タンパク質。

（付記８）
配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２のアミノ酸２０〜７６６、配列番号４４のアミノ酸２１〜７６９または配列番号５０のアミノ酸２０〜７６８に対して少なくとも９０％の同一配列を有するアミノ酸配列を含む、
ことを特徴とする融合タンパク質。

（付記９）
配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２のアミノ酸２０〜７６６、配列番号４４のアミノ酸２１〜７６９および配列番号５０のアミノ酸２０〜７６８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、
ことを特徴とする付記８に記載の融合タンパク質。

（付記１０）
付記１乃至９のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする単離された核酸分子。

（付記１１）
付記１乃至９のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする核酸分子を含む宿主細胞。

（付記１２）
（１）融合タンパク質が産生される条件下で、付記１乃至９のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする核酸分子を含む宿主細胞を培養する工程と、
（２）前記宿主細胞によって産生された融合タンパク質を回収する工程と、
を含む付記１乃至９のいずれか１項に記載の融合タンパク質の製造方法。

（付記１３）
付記１乃至９のいずれか１項に記載の融合タンパク質および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。

（付記１４）
付記１乃至９のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする核酸分子および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。

（付記１５）
有効量の付記１乃至９のいずれか１項に記載の融合タンパク質を必要な対象に投与することを含む、血管新生、血管透過性、浮腫および炎症からなる群より選択される臨床状態を治療または予防する方法。

（付記１６）
有効量の付記１乃至９のいずれか１項に記載の融合タンパク質を必要な対象に投与することを含む、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、湿潤加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）および地図状萎縮からなる群から選択される臨床状態を治療または予防する方法。

Claims (15)

1. （ａ）ＶＥＧＦ受容体の細胞外リガンド結合ドメインを含む第１のペプチドと、
   （ｂ）抗体のＦｃ領域と、
   （ｃ）ＰＤＧＦ受容体の細胞外リガンド結合ドメインを含む第２のペプチドと、
   を含み、
   （ａ）−（ｂ）−（ｃ）および（ｃ）−（ｂ）−（ａ）からなる群から選択される順序でＮ末端からＣ末端に配置され、
   ＶＥＧＦおよびＰＤＧＦに結合し、ＶＥＧＦの活性およびＰＤＧＦの活性を阻害することができ、
   前記ＶＥＧＦ受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、ＶＥＧＦＲ１のＩｇ様ドメインＤ２およびＶＥＧＦＲ２のＩｇ様ドメインＤ３を含み、
   前記抗体のＦｃ領域は、ＩｇＧ１のＣＨ２およびＣＨ３領域を含み、
   前記ＰＤＧＦ受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、ＰＤＧＦＲβのＩｇ様ドメインＤ１〜Ｄ３を含む、
   ことを特徴とする融合タンパク質。
2. （ａ）前記ＶＥＧＦ受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、配列番号７に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
   （ｂ）前記抗体のＦｃ領域は、配列番号１２に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
   （ｃ）前記ＰＤＧＦ受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
   ことを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。
3. （ａ）前記ＶＥＧＦ受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、配列番号７および１０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、
   （ｂ）前記抗体のＦｃ領域は、配列番号１２および１５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、
   （ｃ）前記ＰＤＧＦ受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、配列番号２および５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、
   ことを特徴とする請求項２に記載の融合タンパク質。
4. Ｆｃ領域と前記融合タンパク質のＣ末端の第１または第２のペプチドとの間の第１リンカーペプチドをさらに含み、
   前記融合タンパク質のＮ末端の第１または第２のペプチドとＦｃ領域との間の第２リンカーペプチドを任意に含む、
   ことを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
5. 前記第１リンカーペプチドは、配列番号２０，２２，２４，２６，２８，３０および３２からなる群より選択される１つまたは複数のアミノ酸配列を含み、前記第２リンカーペプチドは、配列番号１８のアミノ酸配列を含む、
   ことを特徴とする請求項４に記載の融合タンパク質。
6. 前記融合タンパク質のＮ末端に連結されたシグナルペプチドをさらに含む、
   ことを特徴とする請求項１乃至５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
7. 配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２のアミノ酸２０〜７６６、配列番号４４のアミノ酸２１〜７６９または配列番号５０のアミノ酸２０〜７６８に対して少なくとも９０％の同一配列を有するアミノ酸配列を含む、
   ことを特徴とする融合タンパク質。
8. 配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２のアミノ酸２０〜７６６、配列番号４４のアミノ酸２１〜７６９および配列番号５０のアミノ酸２０〜７６８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、
   ことを特徴とする請求項７に記載の融合タンパク質。
9. 請求項１乃至８のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする単離された核酸分子。
10. 請求項１乃至８のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする核酸分子を含む宿主細胞。
11. （１）融合タンパク質が産生される条件下で、請求項１乃至８のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする核酸分子を含む宿主細胞を培養する工程と、
    （２）前記宿主細胞によって産生された融合タンパク質を回収する工程と、
    を含む請求項１乃至８のいずれか１項に記載の融合タンパク質の製造方法。
12. 請求項１乃至８のいずれか１項に記載の融合タンパク質および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
13. 請求項１乃至８のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする核酸分子および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
14. 血管新生、血管透過性、浮腫および炎症からなる群より選択される臨床状態を治療または予防するために用いられる、
    ことを特徴とする薬剤の製造における請求項１乃至８のいずれか１項に記載の融合タンパク質の使用。
15. 脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、湿潤加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）および地図状萎縮からなる群から選択される臨床状態を治療または予防するために用いられる、
    ことを特徴とする薬剤の製造における請求項１乃至８のいずれか１項に記載の融合タンパク質の使用。