ES2245833T3 - Antagonistas del factor de crecimiento endotelial y sus utilizaciones. - Google Patents
Antagonistas del factor de crecimiento endotelial y sus utilizaciones.Info
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Abstract
Uso de un antagonista de hVEGF en la fabricación de un medicamento para tratar a un mamífero que tiene edema asociado a una enfermedad o afección no neoplásica, o para prevenir el edema en un mamífero donde el edema está asociado a una enfermedad o afección no neoplásica.
Description
Antagonistas del factor de crecimiento celular
del endotelio vascular y usos de los mismos.
La presente invención se refiere al uso de
antagonistas del factor de crecimiento celular del endotelio
vascular (VEGF) en la fabricación de un medicamento para propósitos
terapéuticos. En particular, la presente invención se refiere a la
fabricación de un medicamento para el tratamiento de edema asociado
con una enfermedad o afección no neoplásica.
Los dos componentes celulares principales de la
vasculatura son las células endoteliales y las células del músculo
liso. Las células endoteliales forman el revestimiento de la
superficie interna de todos los vasos sanguíneos, y constituyen una
superficie de contacto no trombogénica entre la sangre y el tejido.
Además, las células endoteliales son un componente importante para
el desarrollo de nuevos capilares y vasos sanguíneos. Por tanto, las
células endoteliales proliferan durante la angiogénesis, o
neovascularización, asociada con crecimiento tumoral y metástasis,
así como una diversidad de enfermedades o trastornos no
neoplásicos.
Según se dice, diversos polipéptidos de origen
natural inducen la proliferación de células endoteliales. Entre esos
polipéptidos están los factores de crecimiento de fibroblastos (FGF)
básicos o ácidos, Burgess and Maciag, Annual Rev. Biochem.,
58:575 (1989), factor de crecimiento de células endoteliales
derivado de plaquetas (PD-ECGF), Ishikawa, et
al., Nature, 338:557 (1989), y factor de crecimiento del
endotelio vascular (VEGF), Leung, et al., Science
246:1306 (1989); Ferrara & Henzel, Biochem. Biophys. Res.
Commun. 161:851 (1989); Tischer, et al., Biochem.
Biophys. Res. Commun. 165:1198 (1989); Ferrara, et
al., Publicación de Patente PCT Nº WO 90/13649 (publicada el 15
de noviembre de 1990).
VEGF se identificó por primera vez en medios
condicionados por células foliculares y foliculoestrelladas de
pituitaria bovina. Los análisis bioquímicos indican que VEGF bovino
es una proteína dimérica con una masa molecular aparente de
aproximadamente 45.000 Dalton, y con una especificidad mitogénica
aparente para células del endotelio vascular. El ADN que codifica
VEGF bovino se aisló explorando una biblioteca de ADNc preparada a
partir de dichas células, usando oligonucleótidos basados en la
secuencia de aminoácidos amino-terminal de la
proteína como sondas de hibridación.
El VEGF humano se obtuvo explorando primero una
biblioteca de ADNc preparada a partir de células humanas, usando el
ADNc de VEGF bovino como sonda de hibridación. Un ADNc identificado
de este modo codifica una proteína de 165 aminoácidos que tiene más
del 95% de homología con VEGF bovino, mencionándose dicha proteína
como VEGF humano (hVEGF). La actividad mitogénica de VEGF humano se
confirmó expresando el ADNc de VEGF humano en células hospedadoras
de mamífero. Los medios condicionados por células transfectadas con
el ADNc de VEGF humano promovieron la proliferación de células del
endotelio capilar, mientras que las células de control no. Véase,
Leung, et al., Science 246:1306 (1989).
Se identificaron varios ADNc adicionales en
bibliotecas de ADNc humano que codifican isoformas de 121, 189, y
206 aminoácidos de hVEGF (también mencionadas colectivamente como
proteínas relacionadas con hVEGF). La proteína de 121 aminoácidos
difiere de hVEGF debido a la deleción de los 44 aminoácidos entre
los restos 116 y 159 en hVEGF. La proteína de 189 aminoácidos
difiere de hVEGF debido a la inserción de 24 aminoácidos en el resto
116 en hVEGF, y aparentemente es idéntica al factor de permeabilidad
vascular humano (hVPF). La proteína de 206 aminoácidos difiere de
hVEGF debido a una inserción de 41 aminoácidos en el resto 116 en
hVEGF. Houck, et al., Mol. Endocrin. 5:1806 (1991);
Ferrara, et al., J. Cell. Biochem. 47:211 (1991);
Ferrara, et al., Endocrine Reviews 13:18 (1992); Keck,
et al., Science 246:1309 (1989); Connolly, et
al., J. Biol. Chem. 246:20017 (1989); Keck, et
al., Publicación de Patente EPO Nº 0 370 989 (publicada el 30 de
mayo de 1990).
Los receptores para VEGF se han descrito en la
bibliografía. Se ha descubierto que dos de dichos receptores,
flt-1 y flk-1, median
los efectos de VEGF [DeVries et al., Science 255:989
(1992); Shibuya et al., Oncogene 5:519 (1990);
Matthews et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 88:9026
(1991); Terman et al., Oncogene 6:1677 (1991); Terman
et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 187:1579 (1992);
Neufeld et al., Prog, Growth Factor Res.
5:89-97 (1994); Waltenberger et al.,
J. Biol. Chem. 269:26988 (1994); Quinn et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. 90:7533 (1991)], pero su regulación y
mecanismos aún no se entienden completamente. Lennmyr et al.,
J. Neuropathology and Exp. Neurology
57:874-882 (1998). Ambos receptores
flt-1 y flk-1 son
receptores de membrana y pertenecen a la familia del receptor
tirosina quinasa clase III. Barleon et al., J. Cell Biochem.
54:56 (1994); Neufeld et al., supra.
VEGF no sólo estimula la proliferación de células
del endotelio vascular, sino que también induce la angiogénesis. La
angiogénesis, que implica la formación de nuevos vasos sanguíneos a
partir del endotelio preexistente, es un componente importante de
una diversidad de enfermedades y trastornos incluyendo crecimiento
tumoral y metástasis, artritis reumatoide, psoriasis,
aterosclerosis, retinopatía diabética, fibroplasia retrolental,
glaucoma neovascular, degeneración macular relacionada con la edad,
hemangiomas, rechazo inmune de tejido corneal transplantado y otros
tejidos, e inflamación crónica.
En el caso de crecimiento tumoral, la
angiogénesis parece ser crucial para la transición de hiperplasia a
neoplasia, y para proporcionar alimento al crecimiento del tumor
sólido. Folkman, et al., Nature 339:58 (1989). La
angiogénesis también permite a los tumores que estén en contacto con
el lecho vascular del hospedador que puede proporcionar una vía para
la metástasis de las células tumorales. Se proporciona una evidencia
del papel de la angiogénesis en la metástasis tumoral, por ejemplo,
por estudios que muestran la correlación entre la cantidad y
densidad de microvasos en secciones histológicas de carcinoma de
mama humano invasivo y la presencia real de metástasis distante.
Weidner, et al., New Engl. J. Med. 324:1 (1991).
También se ha informado de que VEGF está
implicado en la permeabilidad endotelial y vascular. Véase, Ferrara
et al., Endocrine Reviews 18:4-25
(1997); Dobrogowska et al., J. Neurocytology 27:163
(1998). Aunque no se entiende completamente, se cree que VEGF
aumenta la filtración de las células endoteliales en la piel,
retina, y tejidos tumorales. Collins et al., Brit. J.
Pharmacology 109:195 (1993); Connolly et al., J. Clin.
Invest. 84:1470 (1989); Sheweiki et al., Nature
359:843 (1992); Monacci et al., Am. J. Physiol.
246:C995 (1993); Stone et al., J. Neurosci.
15:4738 (1995); Detmar et al., J. Invest. Dermatol.
108:263 (1997); Weindel et al., Neurosurgery
35:437 (1994). También se han examinado los efectos
potenciales y el papel de VEGF (y sus receptores, particularmente,
el receptor flt-1), sobre las células
endoteliales y la permeabilidad de la barrera
sangre-cerebro. Véase, por ejemplo, Rosenstein et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. 95:7086 (1998); Dobrogowska,
supra; Kovacs et al., Stroke 27:1865 (1996). Se
ha observado expresión de ARNm de VEGF relativamente difusa en
cerebro de rata adulta pero a abundancia algo baja. Monacci et
al., Am. J. Physiol. 146:368-378 (1993).
Sin embargo, se ha demostrado que la tensión de oxígeno reducida
desencadena la expresión de VEGF [Dor and Keshet, Trends in
Cardiovascular Med., 7:289-294 (1998)] y se
ha demostrado que se encuentran niveles potenciados de VEGF,
flt-1, y flk-1 en
cerebro de rata después de la inducción de isquemia cerebral focal.
Hayashi et al., Stroke 28:2039 (1997); Kovacs et
al., supra; Lennmyr et al., J. Neuropathology and
Experimental Neurology, 57:874 (1998). El papel de VEGF en la
patogénesis de apoplejía y fallo BBB ha sido poco claro con
observaciones experimentales contradictorias mencionadas en la
bibliografía. Por ejemplo, Nag et al., J. Neuropathology and
Experimental Neurology 56:912 (1997), en su modelo de lesión
cortical por frío, demostraron la presencia de VEGF murino en los
vasos piales permeables y arteriolas en el tejido dañado y, a partir
de esta observación, se dedujo que VEGF es uno de varios factores
que puede mediar el fallo BBB y la formación de edema. Por otra
parte, en Hayashi et al., J. Cerebral Blood Flow and
Metabolism, 18:887 (1998), se informa de que VEGF en sí
mismo, cuando se aplicó por vía tópica a la superficie de un cerebro
de rata con reperfusión después de oclusión transitoria de la
arteria cerebral, redujo el daño cerebral isquémico, volumen de
infarto y formación de edema.
El documento WO 94/10202 (D1) describe
antagonistas de VEGF y expone que los antagonistas son útiles para
el tratamiento de enfermedades o trastornos caracterizados por
proliferación de células endoteliales o neovascularización no
deseable o excesiva.
El documento WO 98/16551 (D2) describe
antagonistas de VEGF y expone que los antagonistas son útiles para
el tratamiento de indicaciones donde se desea la modulación del
crecimiento de células endoteliales y angiogénesis.
El documento WO 00/29584 (D6), que coincide en
los términos del Artículo 54(3) EPC, describe antagonistas de
VEGF y expone que los antagonistas son útiles para el tratamiento de
afecciones neoplásicas y no neoplásicas.
La presente invención proporciona el uso de un
antagonista de hVEGF en la fabricación de un medicamento para tratar
o prevenir edema asociado con una enfermedad o afección no
neoplásica en un mamífero.
Las realizaciones adicionales de la invención son
como se describe en las reivindicaciones 2-20.
La presente solicitud también describe
antagonistas de VEGF, incluyendo (a) anticuerpos y variantes de los
mismos que son capaces de unirse específicamente a hVEGF, el
receptor de hVEGF, o un complejo que comprende hVEGF junto con el
receptor de hVEGF, (b) el receptor de hVEGF y variantes del mismo, y
(c) variantes de hVEGF. Los antagonistas inhiben, secuestran o
neutralizan la actividad mitogénica, angiogénica, de permeabilidad
vascular y otras actividades biológicas de hVEGF, y por tanto son
útiles para el tratamiento de enfermedades o afecciones
caracterizadas por neovascularización excesiva no deseable,
incluyendo, a modo de ejemplo, artritis reumatoide, psoriasis,
aterosclerosis, retinopatía diabética y otras retinopatías,
fibroplasia retrolental, degeneración macular relacionada con la
edad, glaucoma neovascular, hemangiomas, hiperplasias de tiroides
(incluyendo enfermedad de Grave), transplante de córnea y otros
tejidos, e inflamación crónica. Los antagonistas también son útiles
para el tratamiento de enfermedades o afecciones tales como edema
que pueden estar asociadas a, por ejemplo, apoplejía, traumatismo
craneal, ascitis asociado con malignidades, enfermedad de Meig,
inflamación pulmonar, síndrome nefrótico, efusión pericárdica (tal
como la asociada con pericarditis), y efusión pleural.
En otros aspectos, los antagonistas de VEGF son
anticuerpos monoclonales poliespecíficos que son capaces de unirse a
(a) un epítopo no hVEGF, por ejemplo, un epítopo de una proteína
implicada en trombogénesis o trombólisis, o un antígeno de
superficie de célula tumoral, o a (b) hVEGF, el receptor de hVEGF, o
un complejo que comprende hVEGF junto con el receptor de hVEGF.
En otros aspectos más, los antagonistas de VEGF
se conjugan con un resto citotóxico.
En otro aspecto, la invención concierne a ácidos
nucleicos aislados que codifican los anticuerpos monoclonales como
se ha descrito anteriormente, y líneas celulares de hibridoma que
producen dichos anticuerpos monoclonales.
En otro aspecto, la invención concierne a
composiciones, tales como composiciones farmacéuticas, que
comprenden un antagonista de VEGF en una cantidad eficaz para
reducir o eliminar la actividad mitogénica, angiogénica u otra
actividad biológica mediada por hVEGF en un mamífero.
En un aspecto diferente, la invención concierne a
la fabricación de un medicamento que comprende una cantidad eficaz
de un antagonista de VEGF para la administración a un mamífero,
preferiblemente un paciente humano en necesidad del mismo. Si se
desea, el antagonista de VEGF se co-administra, de
manera simultánea o secuencial, con uno o más antagonistas de VEGF
diferentes, sustancias antitumorales o
anti-angiogénicas, o terapias apropiadas para la
enfermedad o afección que se está tratando.
En otro aspecto, la invención concierne a un
método para detectar hVEGF en una muestra de ensayo haciendo
contactar la muestra de ensayo con un anticuerpo capaz de unirse
específicamente a hVEGF y determinando el grado de dicha unión.
La Figura 1 muestra el efecto de anticuerpos
monoclonales anti-hVEGF (A4.6.1 o B2.6.2) o un
anticuerpo anti-factor de crecimiento de hepatocitos
irrelevante (anti-HGF) en la unión de los
anticuerpos monoclonales anti-hVEGF a hVEGF.
La Figura 2 muestra el efecto de los anticuerpos
monoclonales anti-hVEGF (A4.6.1 o B2.6.2) o un
anticuerpo anti-HGF irrelevante en la actividad
biológica de hVEGF en cultivos de células del endotelio capilar de
la corteza suprarrenal (ACE) bovinas.
La Figura 3 muestra el efecto de los anticuerpos
monoclonales anti-hVEGF (A4.6.1, B2.6.2, o A2.6.1)
en la unión de hVEGF a células ACE bovinas.
La Figura 4 muestra el efecto del tratamiento con
anticuerpo monoclonal anti-hVEGF A4.6.1 sobre la
velocidad de crecimiento de tumores NEG55 en ratones.
La Figura 5 muestra el efecto del tratamiento con
anticuerpo monoclonal anti-hVEGF A4.6.1 sobre el
tamaño de tumores NEG55 en ratones después de cinco semanas de
tratamiento.
La Figura 6 muestra el efecto del tratamiento con
anticuerpo monoclonal anti-hVEGF A4.6.1 (Ab VEGF)
sobre el crecimiento de tumores
SK-LMS-1 en ratones.
La Figura 7 muestra el efecto de dosis variadas
de tratamiento con anticuerpo monoclonal anti-hVEGF
A4.6.1 (Ab VEGF) sobre el crecimiento de tumores A673 en
ratones.
La Figura 8 muestra el efecto del anticuerpo
monoclonal anti-hVEGF A4.6.1 sobre el crecimiento y
supervivencia de células de glioblastoma NEG55 (G55) en cultivo.
La Figura 9 muestra el efecto del anticuerpo
monoclonal anti-hVEGF A4.6.1 sobre el crecimiento y
supervivencia de células de rabdomiosarcoma A673 en cultivo.
La Figura 10 muestra el efecto del anticuerpo
monoclonal anti-hVEGF A4.6.1 sobre la quimiotaxis de
células endoteliales humanas inducida por fluido sinovial
humano.
La Figura 11 muestra el efecto del tratamiento
con flt-IgG sobre el alcance del tejido edematoso
representado por una intensidad de señal elevada en la imagen de MR
ponderada-T2.
La Figura 12 muestra imágenes de MR
ponderadas-T2 representativas registradas 24 horas
después de la aparición de isquemia para el grupo tanto de control
(panel superior) como de tratamiento (panel inferior), mostrando
reducción del tejido edematoso en el grupo de tratamiento.
La Figura 13 muestra el efecto del tratamiento
con flt-IgG sobre el tamaño de infarto determinado usando MRI
anatómica de alta resolución 8-12 semanas después de
la aparición de isquemia.
Las Figuras 14A-B muestran un
alineamiento de las secuencias de aminoácidos para los dominios
variables de la cadena ligera y pesada respectivamente de
anticuerpos anti-VEGF de afinidad madurada en
comparación con el anticuerpo F(ab)-12
(SEC.ID.Nº 1 mostrada en la Figura 14A; SEC.ID.Nº 9 mostrada en la
Figura 14B). Los CDR están subrayados y denominados por L, cadena
ligera, o H, pesada, y los números 1-3. Las
secuencias de afinidad madurada se denominan Y0243-1
(SEC.ID.Nº 2 mostrada en la Figura 14A; SEC.ID.Nº 10 mostrada en la
Figura 14B); Y0238-3 (SEC.ID.Nº 3 mostrada en la
Figura 14A; SEC.ID.Nº 11 mostrada en la Figura 14B);
Y0313-1 (SEC.ID.Nº 4 mostrada en la Figura 14A;
SEC.ID.Nº 12 mostrada en la Figura 14B); e Y0317 (SEC.ID.Nº 5
mostrada en la Figura 14A; SEC.ID.Nº 13 mostrada en la Figura 14B).
Las diferencias a partir F(ab)-12 se muestran
en recuadros sombreados.
Las Figuras 15A-B muestran un
alineamiento de las secuencias de aminoácidos para los dominios
variables de la cadena ligera y pesada respectivamente de
anticuerpos anti-VEGF de afinidad madurada en
comparación con el anticuerpo F(ab)-12
(SEC.ID.Nº 1 mostrada en las Figuras 14A y 15A; SEC.ID.Nº 9 mostrada
en las Figuras 14B y 15B). Los CDR están subrayados y denominados
por L, cadena ligera, o H, pesada, y los números
1-3. Las secuencias de afinidad madurada se
denominan Y0192 (SEC.ID.Nº 6 mostrada en la Figura 15A; SEC.ID.Nº 14
mostrada en la Figura 15B); Y0238-3 (SEC.ID.Nº 3
mostrada en las Figuras 14A y 14B; SEC.ID.Nº 11 mostrada en las
Figuras 14B y 15B); Y0239-19 (SEC.ID.Nº 7 mostrada
en la Figura 15A; SEC.ID.Nº 15 mostrada en la Figura 15B); e
Y0313-2 (SEC.ID.Nº 8 mostrada en la Figura 15A;
SEC.ID.Nº 16 mostrada en la Figura 15B). Las diferencias de
F(ab)-12 se muestran en recuadros
sombreados.
La presente invención proporciona la fabricación
de medicamentos que contienen antagonistas de hVEGF que son capaces
de inhibir, secuestrar, o neutralizar una o más de las actividades
biológicas de hVEGF. Los antagonistas de hVEGF funcionan impidiendo
la unión de hVEGF a un receptor celular, incapacitando o eliminando
las células que se han activado por hVEGF, o impidiendo la
activación de las células del endotelio vascular después de la unión
de hVEGF a un receptor celular. Todos estos puntos de intervención
por un antagonista de hVEGF se considerarán equivalentes para los
propósitos de esta invención. Por tanto, se incluyen en el alcance
de la invención anticuerpos, anticuerpos monoclonales y anticuerpos
humanizados, o fragmentos de los mismos, que se unen a hVEGF, el
receptor de hVEGF, o un complejo que comprende hVEGF junto con el
receptor de hVEGF. También se incluyen en el alcance de la invención
fragmentos y variantes de la secuencia de aminoácidos de hVEGF que
se unen al receptor de hVEGF pero que no muestran una actividad
biológica de hVEGF nativo. También se incluyen en el alcance de la
invención el receptor de hVEGF y fragmentos y variantes de la
secuencia de aminoácidos del mismo que son capaces de unirse a
hVEGF.
El término "hVEGF" como se usa en este
documento se refiere al factor de crecimiento celular del endotelio
vascular humano de 165 aminoácidos, y los factores de crecimiento
celular del endotelio vascular relacionados de 121, 189, y 206
aminoácidos, como se describe por Leung, et al., Science
246:1306 (1989), y Houck, et al., Mol. Endocrin.
5:1806 (1991), junto con las formas alélicas y procesadas de
origen natural de esos factores de crecimiento.
El término "receptor de hVEGF" o
"hVEGFr" como se usa en este documento se refiere a un receptor
celular para hVEGF, generalmente un receptor de superficie celular
que se encuentra en las células del endotelio vascular, así como
fragmentos y variantes del mismo que mantienen la capacidad de
unirse a hVEGF. Típicamente, los receptores de hVEGF y fragmentos y
variantes de los mismos que son antagonistas de hVEGF estarán en
forma aislada, en lugar estar integrados en una membrana celular o
fijados a una superficie celular como puede ser el caso en la
naturaleza. Un ejemplo de un receptor de hVEGF es el fms-tipo
tirosina quinasa (flt o flt-1), un
receptor transmembrana de la familia tirosina quinasa. DeVries,
et al., Science 255:989 (1992); Shibuya, et
al., Oncogene 5:519 (1990). El receptor flt de
longitud completa comprende un dominio extracelular, un dominio
transmembrana, y un dominio intracelular con actividad tirosina
quinasa. El dominio extracelular está implicado en la unión a hVEGF,
mientras que el dominio intracelular está implicado en la
transducción de señal.
Otro ejemplo de un receptor de hVEGF es el
receptor flk-1 (también mencionado como KDR).
Matthews, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 88:9026
(1991); Terman, et al., Oncogene 6:1677 (1991);
Terman, et al., Biochem. Biphys. Res. Commun. 187:1579
(1992).
La unión de hVEGF al receptor flt da como
resultado la formación de al menos dos complejos de alto peso
molecular, que tienen un peso molecular aparente de 205.000 y
300.000 Dalton. Se cree que el complejo de 300.000 Dalton es un
dímero que comprende dos moléculas de receptor unidas a una única
molécula de hVEGF.
Las variantes de hVEGFr también se incluyen en el
alcance del mismo. Los ejemplos representativos incluyen formas
truncadas de un receptor en el que al menos los dominios
transmembrana y citoplásmico están delecionados de la molécula de
receptor de longitud completa, y proteínas de fusión en las que se
conjugan polímeros o polipéptidos no hVEGFr con hVEGFr o,
preferiblemente, formas truncadas del mismo. Un ejemplo de dicho
polipéptido no hVEGF es una inmunoglobulina. En ese caso, por
ejemplo, se sustituye una secuencia del dominio extracelular del
hVEGFr por el domino Fv de la cadena ligera o (preferiblemente)
pesada de una inmunoglobulina, con el extremo
C-terminal del dominio extracelular del receptor
unido covalentemente al extremo amino terminal del CH1, bisagra, CH2
u otro fragmento de la cadena pesada. Dichas variantes se hacen del
mismo modo que las inmunoadhesinas conocidas. Véase por
ejemplo, Gascoigne, et al., Proc. Nat. Acad. Sci.
84:2936 (1987); Capon, et al., Nature 337:525
(1989); Aruffo, et al., Cell 61:1303 (1990);
Ashkenazi, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 88:10535
(1991); Bennett, et al., J. Biol. Chem. 266:23060
(1991). Los ejemplos de diversas proteínas de fusión flt-IgG
se describen en el Ejemplo 3 a continuación. Las formas truncadas
del dominio extracelular del receptor de hVEGF contempladas para su
uso en la invención incluyen fragmentos ECD (por ejemplo, que tienen
uno o más aminoácidos en la secuencia ECD delecionados) y formas ECD
que tienen uno o más dominios tipo inmunoglobulina en el ECD
delecionados. El ejemplo 3B describe, por ejemplo, una forma ECC
truncada que incluye sólo los primeros tres dominios tipo
inmunoglobulina de flt fusionados a un
Fc-IgG. Preferiblemente, una forma truncada del ECD
usada para hacer una molécula antagonista incluirá suficientes
dominios tipo inmunoglobulina para asegurar una unión deseada
a
hVEGF.
hVEGF.
En otras realizaciones, el hVEGFr o fragmentos o
variantes del mismo se conjugan con un polímero no proteico tal como
polietilenglicol (PEG) (véase, por ejemplo, Davis, et
al., Patente de Estados Unidos Nº 4.179.337; Goodson, et
al., BioTechnology 8:343-346 (1990);
Abuchowski, et al., J. Biol. Chem. 252:3578 (1977);
Abuchowski, et al., J. Biol. Chem. 252:3582 (1977)) o
carbohidratos (véase, por ejemplo, Marshall, et al.,
Arch. Biochem. Biophys., 167:77 (1975)). Esto pude servir
para prolongar la vida media biológica del hVEGFr y reducir la
posibilidad de que el receptor sea inmunogénico en el mamífero al
que se administra.
El hVEGFr se usa sustancialmente de la misma
manera que los anticuerpos frente a hVEGF, teniendo en cuenta la
afinidad del antagonista y su valencia para hVEGF. Es especialmente
útil una secuencia del dominio extracelular del receptor de hVEGF,
por sí mismo o fusionado a un polipéptido de inmunoglobulina u otro
polipéptido de vehículo, como antagonista de hVEGF, debido a su
capacidad para secuestrar hVEGF que está presente en un hospedador
pero que no se une a hVEGF en una superficie celular.
hVEGFr y fragmentos y variantes del mismo también
son útiles en ensayos de exploración para identificar agonistas y
antagonistas de hVEGF. Por ejemplo, la células hospedadoras
transfectadas con ADN que codifica hVEGFr (por ejemplo, flt o
flk-1) sobre-expresan el
polipéptido receptor en la superficie celular, haciendo a dichas
células hospedadoras recombinantes apropiadas de manera ideal para
analizar la capacidad de un compuesto de ensayo (por ejemplo, una
molécula pequeña, péptido lineal o cíclico, o polipéptido) de unirse
a hVEGFr. Las proteínas hVEGFr y hVEGFr de fusión, tales como una
proteína de fusión hVEGFr-IgG, pueden usarse de un
modo similar. Por ejemplo, la proteína de fusión se une a un soporte
inmovilizado y se determina la capacidad de un compuesto de ensayo
de desplazar hVEGF radiomarcado del dominio hVEGFr de la proteína de
fusión.
El término "recombinante" usado con
referencia a hVEGF, receptor de hVEGF, anticuerpos, u otras
proteínas, se refiere a proteínas que se producen por expresión de
ADN recombinante en una célula hospedadora. La célula hospedadora
puede ser procariota (por ejemplo, una célula bacteriana tal como
E. coli) o eucariota (por ejemplo, una célula de levadura o
de mamífero).
El término "anticuerpo monoclonal" como se
usa en este documento se refiere a un anticuerpo obtenido de una
población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los
anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos
en especificidad y afinidad excepto para posibles mutaciones de
origen natural que pueden estar presentes en cantidades
minoritarias. Debe apreciarse que como resultado de dichas
mutaciones de origen natural y similares, una composición de
anticuerpos monoclonales de la invención, que contendrá
predominantemente anticuerpos capaces de unirse específicamente a
hVEGF, hVEGFr, o un complejo que comprende hVEGF junto con hVEGFr
("complejo hVEGF-hVEGFr"), también puede
contener cantidades minoritarias de otros anticuerpos.
Por tanto, el modificador "monoclonal"
indica el carácter del anticuerpo como obtenido de dicha población
sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no se entiende como que
requiere la producción del anticuerpo por ningún método particular.
Por ejemplo, pueden fabricarse anticuerpos monoclonales de la
presente invención usando el método de hibridoma descrito por
primera vez por Kohler & Milstein, Nature 256:495 (1975),
o pueden fabricarse por métodos de ADN recombinante. Véase, por
ejemplo, Cabilly, et al., Patente de Estados Unidos Nº
4.816.597.
En el método de hibridoma, un ratón u otro animal
hospedador apropiado se inmuniza con antígeno por vía subcutánea,
intraperitoneal, o intramuscular para provocar linfocitos que
produzcan o sean capaces de producir anticuerpos que se unirán
específicamente a la proteína o proteínas usadas para inmunización.
Como alternativa, pueden inmunizarse linfocitos in vitro.
Después los linfocitos se fusionan con células de mieloma usando un
agente de fusión apropiado, tal como polietilenglicol, para formar
una célula de hibridoma. Goding, Monoclonal Antibodies:
Principles and Practice, páginas 59-103
(Academic Press, 1986).
El antígeno puede ser hVEGF, hVEGFr, o complejo
hVEGF-hVEGFr. El antígeno opcionalmente es un
fragmento o porción o variante de uno cualquiera de hVEGF o hVEGFr
que tiene uno o más restos de aminoácidos que participan en la unión
de hVEGF a uno de sus receptores. Por ejemplo, la inmunización con
una secuencia de dominio extracelular de un hVEGFr (tal como, un
polipéptido hVEGFr truncado que carece de al menos los dominios
transmembrana e intracelular) será especialmente útil para producir
anticuerpos que son antagonistas de hVEGF, ya que la región o
regiones del dominio extracelular son las que están implicadas en la
unión de hVEGF.
Los anticuerpos monoclonales capaces de unirse al
complejo hVEGF-hVEGFr son útiles, particularmente si
no se unen también a hVEGF y hVEGFr no asociados (no complejados).
Dichos anticuerpos, por tanto, sólo se unen a células que
experimentan activación intermedia por hVEGF y por consiguiente con
están secuestradas por hVEGF o hVEGFr libres como se encuentran
habitualmente en un mamífero. Dichos anticuerpos típicamente unen un
epítopo que abarca uno o más puntos de contacto entre el receptor y
hVEGF. Dichos anticuerpos se han producido para otros complejos
ligando-receptor y pueden producirse aquí del mismo
modo. Estos anticuerpos no necesitan, o pueden no necesitar,
neutralizar o inhibir una actividad biológica de hVEGF o hVEGFr no
asociados, sean o no capaces los anticuerpos de unirse a hVEGF o
hVEGFr no asociados.
Las células de hibridoma preparadas de este modo
se siembran y se hacen crecer en un medio de cultivo apropiado que
contiene preferiblemente una o más sustancias que inhiben el
crecimiento o supervivencia de las células de mieloma no fusionadas
parentales. Por ejemplo, si las células de mieloma parentales
carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforribosil transferasa
(HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas típicamente
incluirá hipoxantina, aminopterina, y timidina (medio HAT), que
evitan, dichas sustancias, el crecimiento de células deficientes en
HGPRT.
Las células de mieloma preferidas son aquéllas
que se fusionan de manera eficaz, mantienen un alto nivel de
expresión estable del anticuerpo por las células que producen
anticuerpo seleccionadas, y son sensibles a un medio tal como medio
HAT. Entre otras, las líneas de células de mieloma preferidas son
líneas de mieloma murinas, tales como las obtenidas de tumores de
ratón MOPC-21 y MPC-11 disponibles
del Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California
USA, células SP-2 disponibles de la American Type
Culture Collection, Manassas, Virginia USA, y células P3X63Ag8U.1
descritas por Yelton, et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol.
81:1 (1978). También se han descrito líneas celulares de
mieloma humano y heteromieloma de ratón-humano para
la producción de anticuerpos monoclonales humanos. Kozbor, J.
Immunol. 133:3001 (1984); Brodeur, et al.,
Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,
páginas 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York,
1987).
El medio de cultivo en el que se hacen crecer las
células de hibridoma se ensaya para la producción de anticuerpos
monoclonales dirigidos frente al antígeno. Preferiblemente, la
especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos
por células de hibridoma se determina por inmunoprecipitación o por
un ensayo de unión in vitro, tal como radioinmunoensayo (RIA)
o ensayo inmunoabsorbente de enzimas unidas (ELISA). Los anticuerpos
monoclonales de la invención son aquéllos que inmunoprecipitan de
manera preferente hVEGF, hVEGFr, o complejo
hVEGF-hVEGFr, o que unen de manera preferente al
menos uno de esos antígenos en un ensayo de unión, y que son capaces
de inhibir una actividad biológica de hVEGF.
Después de identificar las células de hibridoma
que producen anticuerpos antagonistas de la especificidad, afinidad,
y actividad deseadas, los clones pueden subclonarse por
procedimientos de dilución limitante y hacerse crecer por métodos
convencionales. Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and
Practice, páginas 59-104 (Academic Press, 1986).
Los medios de cultivo apropiados para este propósito incluyen, por
ejemplo, Medio de Eagle Modificado por Dulbecco o medio
RPMI-1640. Además, las células de hibridoma pueden
hacerse crecer in vivo como tumores ascíticos en un
animal.
Los anticuerpos monoclonales secretados por los
subclones se separan apropiadamente del medio de cultivo, fluido
ascítico, o suero por procedimientos de purificación de
inmunoglobulinas convencionales tales como, por ejemplo, proteína
A-Sepharose, cromatografía con hidroxilapatita,
electroforesis en gel, diálisis, o cromatografía de afini-
dad.
dad.
El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales
de la invención se aísla fácilmente y se secuencia usando
procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas
oligonucleotídicas que son capaces de unirse específicamente a genes
que codifican las cadenas pesada y ligera de anticuerpos murinos).
Las células de hibridoma de la invención sirven como fuente
preferida de dicho ADN. Una vez aislado, el ADN se coloca en
vectores de expresión, que después se transfectan en células
hospedadoras tales como células COS de simio, células de ovario de
Hámster Chino (CHO), o células de mieloma que no producen de otro
modo proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de
anticuerpos monoclonales en las células hospedadoras
recombinantes.
El ADN opcionalmente puede modificarse para
cambiar el carácter de la inmunoglobulina producida por su
expresión. Por ejemplo, las formas humanizadas de anticuerpos
murinos se producen sustituyendo una región determinante de
complementariedad (CDR) del dominio variable del anticuerpo murino
por la región correspondiente de un anticuerpo humano. En algunas
realizaciones, los restos de aminoácidos de la región flanqueante
(FR) seleccionados del anticuerpo murino también se sustituyen por
los restos de aminoácidos correspondientes en el anticuerpo humano.
Carter, et al., Proc. Nat. Sci. 89:4285 (1992);
Carter, et al., BioTechnology 10:163 (1992). Las
formas quiméricas de anticuerpos murinos también se producen
sustituyendo la secuencia codificante para los dominios constantes
de cadena pesada y ligera humanos seleccionados en lugar de las
secuencias murinas homólogas. Cabilly, et al., Patente de
Estados Unidos Nº 4.816.567; Morrison, et al., Proc. Nat.
Acad. Sci. 81:6851 (1984).
Los anticuerpos humanizados particulares
contemplados para su uso en la presente invención incluyen los
anticuerpos anti-hVEGF humanizados y de afinidad
madurada descritos en las solicitudes PCT publicadas WO 98/45331
(publicada el 15 de octubre de 1998) y WO 98/45332 (publicada el 15
de octubre de 1998). Dichos anticuerpos anti-VEGF
humanizados o de afinidad madurada pueden prepararse o fabricarse
usando métodos y técnicas descritos en el documento WO 98/45331 y el
documento WO 98/45332. Preferiblemente, el anticuerpo
anti-hVEGF comprende el F(ab) humanizado,
denominado como F(ab)-12, o el anticuerpo de
afinidad madurada, denominado como Y0317, en las solicitudes PCT
mencionadas anteriormente. Las figuras 14A-B y
15A-B ilustran las secuencias de aminoácidos
(cadenas ligera y pesada) para estos anticuerpos
anti-VEGF, junto con otros anticuerpos
anti-VEGF de afinidad madurada, denominados como
Y0192; Y0238-3; Y0239-19;
Y0313-2; Y0243-1; e
Y0313-1. Todos estos anticuerpos
anti-VEGF se contemplan para su uso en los métodos
descritos en este documento. Como se describe en estas solicitudes
PCT publicadas, se demostró que varios de los anticuerpos
humanizados y de afinidad madurada reducían o inhibían la actividad
VEGF en diferentes tipos de ensayos in vitro, y por tanto
funcionan como antagonistas de VEGF.
Los anticuerpos incluidos en el alcance de la
invención incluyen, por tanto, anticuerpos variantes, tales como
anticuerpos quiméricos (incluyendo "humanizados") y anticuerpos
híbridos que comprenden cadenas de inmunoglobulina capaces de unir
hVEGF, hVEGFr, o complejo hVEGF-hVEGFr, y un epítopo
no hVEGF.
Los anticuerpos de este documento incluyen todas
las especies de origen, y clases (por ejemplo, IgA, IgD, IgE, IgG, e
IgM) y subclases de inmunoglobulina, así como fragmentos de
anticuerpo (por ejemplo, Fab, F(ab')_{2}, y Fv), mientras
que sean capaces de unir hVEGF, hVEGFr, o complejo
hVEGF-hVEGFr, y sean capaces de antagonizar una
actividad biológica de hVEGF.
En una realización preferida de la invención, el
anticuerpo tendrá una afinidad por el antígeno inmunizante de al
menos aproximadamente 10^{9} litros/mol, como se determina, por
ejemplo, por el análisis de Scatchard de Munson & Pollard, Anal.
Biochem. 107:220 (1980). Además, el anticuerpo monoclonal
típicamente inhibirá la actividad mitogénica o angiogénica de hVEGF
al menos al 50%, preferiblemente más del 80%, y más preferiblemente
más del 90%, como se determina, por ejemplo, por un ensayo de
supervivencia o proliferación celular in vitro, tal como se
describe en el Ejemplo 2 o como se describe en el documento WO
98/45331 y el documento WO 98/45332.
Para algunas aplicaciones terapéuticas y de
diagnóstico, es deseable que el anticuerpo monoclonal sea reactivo
con no todas las diferentes formas moleculares de hVEGF. Por
ejemplo, puede ser deseable tener un anticuerpo monoclonal que sea
capaz de unirse específicamente a hVEGF de 165 aminoácidos de
secuencia pero no a los polipéptidos hVEGF de 121 o 189 aminoácidos
de secuencia. Dichos anticuerpos se identifican fácilmente por
ensayos ELISA comparativos o inmunoprecipitación comparativa de los
diferentes polipéptidos hVEGF.
En algunas realizaciones es deseable proporcionar
un resto citotóxico conjugado con un anticuerpo monoclonal
específico de hVEGF o con hVEGFr. En estas realizaciones la
citotoxina sirve para incapacitar o eliminar células que están
expresando o uniendo hVEGF o su receptor. El conjugado se dirige a
la célula por el dominio que es capaz de unirse a hVEGF, hVEGFr, o
complejo hVEGF-hVEGFr. Por tanto, los anticuerpos
monoclonales que son capaces de unir hVEGF, hVEGFr, o complejo
hVEGF-hVEGFr se conjugan con citotoxinas. De manera
similar, hVEGFr se conjuga con una citotoxina. Aunque los
anticuerpos monoclonales son capaces de neutralizar de manera óptima
la actividad de hVEGF solos (sin la citotoxina), no es necesario en
esta realización que el anticuerpo monoclonal o receptor sea capaz
de algo más que unirse a hVEGF, hVEGFr, o complejo
hVEGF-hVEGFr.
Típicamente, la citotoxina es una citotoxina
proteica, por ejemplo, la toxina de la difteria, ricino o de
Pseudomonas, aunque en el caso de ciertas clases de inmunoglobulinas
el dominio Fc del anticuerpo monoclonal en sí mismo puede servir
para proporcionar la citotoxina (por ejemplo, en el caso de
anticuerpos IgG2, que son capaces de fijar el complemento y
participar en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo
(ADCC)). Sin embargo, la citotoxina no necesita ser proteica y puede
incluir agentes quimioterapéuticos empleados hasta ahora, por
ejemplo, para el tratamiento de tumores.
La citotoxina típicamente se une a un anticuerpo
monoclonal o fragmento del mismo mediante un enlace amida central en
(o en lugar de parte o todo) el dominio Fc del anticuerpo. Cuando se
proporciona la función diana por hVEGFr, el resto citotóxico se
sustituye en cualquier dominio del receptor que no participe en la
unión de hVEGF; preferiblemente, el resto se sustituye en lugar de o
sobre los dominios transmembrana y/o citoplásmico del receptor. El
sitio óptimo de sustitución se determinará por experimentación de
rutina y pertenece a la especialidad de la técnica.
Los conjugados que son fusiones proteicas se
fabrican fácilmente en cultivo de células recombinantes expresando
un gen que codifica el conjugado. Como alternativa, los conjugados
se fabrican entrecruzando de manera covalente el resto citotóxico
con la cadena lateral de un resto de aminoácido o el carboxilo
C-terminal del anticuerpo o el receptor, usando
métodos conocidos per se tales como intercambio de disulfuro
o unión a través de un enlace tioéster usando, por ejemplo,
iminotiolato y
metil-4-mercaptobutirimadato.
Los anticuerpos monoclonales y hVEGFr que son
antagonistas de hVEGF también se pueden conjugar con sustancias que
no se pueden clasificar fácilmente como citotoxinas en su propio
sentido, pero que aumentan la actividad de las composiciones de este
documento. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales o hVEGFr
capaces de unirse a hVEGF, hVEGFr, o complejo
hVEGF-hVEGFr se fusionan con polipéptidos
heterólogos, tales como secuencias virales, con receptores
celulares, con citoquinas tales como TNF, interferones, o
interleuquinas, con polipéptidos que tienen actividad procoagulante,
y con otros polipéptidos biológica o inmunológicamente activos.
Dichas fusiones se hacen fácilmente por métodos recombinantes.
Típicamente, el dominio o dominios constantes de un anticuerpo
anti-hVEGF o complejo
anti-hVEGF-hVEGFr, o el dominio
transmembrana y/o intracelular de un hVEGFr se sustituyen por dichos
polipéptidos de no inmunoglobulina. Como alternativa, se sustituye
un dominio variable de un sitio de unión a antígeno de un anticuerpo
anti-hVEGF descrito en este documento.
En realizaciones preferidas, dichos polipéptidos
de no inmunoglobulina se unen a o se sustituyen en los dominios
constantes de un anticuerpo descrito en este documento. Bennett,
et al., J. Biol. Chem. 266:23060-23067
(1991). Como alternativa, se sustituye el Fv de un anticuerpo de
este documento para crear un anticuerpo polivalente quimérico que
comprende al menos un sitio de unión a antígeno restante que tiene
especificidad por hVEGF, hVEGFr, o un complejo
hVEGF-hVEGFr, y un sitio de unión a antígeno
sustituto que tiene una función o especificidad distinta de la del
anticuerpo de partida.
Los anticuerpos monoclonales capaces de unirse a
hVEGF, hVEGFr, o complejo hVEGF-hVEGFr sólo
necesitan contener un único sitio de unión para los epítopos
enumerados, típicamente un único complejo de cadena
pesada-ligera o fragmento del mismo. Sin embargo,
dichos anticuerpos opcionalmente también albergan dominios de unión
a antígeno que son capaces de unir un epítopo no encontrado en
ninguno cualquiera de hVEGF, hVEGFr, o complejo
hVEGF-hVEGFr. Por ejemplo, sustituyendo la secuencia
de aminoácidos o los restos de aminoácidos correspondientes de un
anticuerpo anti-hVEGF, anti-hVEGFr,
o anti-complejo hVEGF-hVEGFr nativo
con los restos determinantes de complementariedad y, si es
necesario, los flanqueantes, de un anticuerpo que tiene
especificidad por un antígeno distinto de hVEGF, hVEGFr, o complejo
hVEGF-hVEGFr se creará un anticuerpo poliespecífico
que comprende un sitio de unión a antígeno que tiene especificidad
por hVEGF, hVEGFr, o complejo hVEGF-hVEGFr, y otro
sitio de unión a antígeno que tiene especificidad por el antígeno no
hVEGF, hVEGFr, o complejo hVEGF-hVEGFr. Estos
anticuerpos son al menos bivalentes, pero pueden ser polivalentes,
dependiendo de la cantidad de sitios de unión a antígeno que tenga
la clase de anticuerpo elegida. Por ejemplo, los anticuerpos de la
clase IgM serán polivalentes.
En realizaciones preferidas de la invención
dichos anticuerpos son capaces de unir un epítopo hVEGF o hVEGFr y
(a) un polipéptido activo en la coagulación sanguínea, tal como
proteína C o factor tisular, (b) una proteína citotóxica tal como
factor de necrosis tumoral (TNF), o (c) un receptor de superficie
celular no hVEGFr, tal como CD4, o receptor HER-2
(Maddon, et al., Cell 42:93 (1985); Coussens, et
al., Science 230:1137 (1985)). Los anticuerpos
heteroespecíficos multivalentes se fabrican adecuadamente
cotransformando una célula hospedadora con ADN que codifica las
cadenas pesada y ligera de ambos anticuerpos y recuperando después,
por cromatografía de inmunoafinidad o similares, la proporción de
anticuerpos expresados que tiene las propiedades de unión a antígeno
deseadas. Como alternativa, dichos anticuerpos se fabrican por
recombinación in vitro de anticuerpos monoespecíficos.
Los anticuerpos monovalentes capaces de unirse a
hVEGFr o complejo hVEGF-hVEGFr son especialmente
útiles como antagonistas de hVEGF. Sin limitar la invención a ningún
mecanismo particular de actividad biológica, se cree que la
activación de receptores de hVEGF celulares procede por un mecanismo
donde la unión de hVEGF a receptores de hVEGF celulares induce la
agregación de los receptores, y a su vez activa la actividad quinasa
intracelular del receptor. Como los anticuerpos
anti-receptor de hVEGF monovalentes no pueden
inducir dicha agregación, y por lo tanto no pueden activar el
receptor de hVEGF por ese mecanismo, son antagonistas ideales de
hVEGF.
Debe apreciarse, sin embargo, que estos
anticuerpos deben estar dirigidos frente al sitio de unión a hVEGF
del receptor o deben ser capaces de impedir de otro modo la unión de
hVEGF al receptor de hVEGF, tal como impidiendo estéricamente el
acceso de hVEGF al receptor. Como se describe en otra parte en este
documento, sin embargo, los anticuerpos anti-hVEGFr
que no son capaces de impedir la unión de hVEGF son útiles cuando se
conjugan con restos de no inmunoglobulina, por ejemplo,
citotoxinas.
Los métodos para preparar anticuerpos
monovalentes son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, un
método implica la expresión recombinante de la cadena ligera y la
cadena pesada modificada de inmunoglobulina. La cadena pesada
generalmente está truncada en cualquier punto de la región Fc para
evitar el entrecruzamiento de la cadena pesada. Como alternativa,
los restos de cisteína relevantes se sustituyen con otro resto de
aminoácido o se delecionan para evitar el entrecruzamiento. También
son apropiados métodos in vitro para preparar anticuerpos
monovalentes. Por ejemplo, se preparan fragmentos Fab por escisión
enzimática de anticuerpo intacto.
Para aplicaciones de diagnóstico, los anticuerpos
o hVEGFr de la invención se marcarán típicamente con un resto
detectable. El resto detectable puede ser uno cualquiera que sea
capaz de producir, directa o indirectamente, una señal detectable.
Por ejemplo, el resto detectable puede ser un radioisótopo, tal como
^{3}H, ^{14}C, ^{32}P, ^{35}S, o ^{125}I, un compuesto
fluorescente o quimioluminiscente, tal como isotiocianato de
fluoresceína, rodamina, o luciferina; marcadores isotópicos
radiactivos, tales como, por ejemplo, ^{125}I, ^{32}P, ^{14}C,
o ^{3}H, o una enzima, tal como fosfatasa alcalina,
beta-galactosidasa o peroxidasa de rábano
rusticano.
Puede emplearse cualquier método conocido en la
técnica para conjugar por separado el anticuerpo o hVEGFr al resto
detectable, incluyendo los métodos descritos por Hunter, et
al., Nature 144:945 (1962); David, et al.,
Biochemistry 13:1014 (1974); Pain, et al., J. Immunol.
Meth. 40:219 (1981); y Nygren, J. Histochem. and Cytochem.
30:407 (1982). Los anticuerpos y receptores de la presente
invención pueden emplearse en cualquier método de ensayo conocido,
tal como ensayos de unión competitiva, ensayos tipo sándwich
directos o indirectos, y ensayos de inmunoprecipitación. Zola,
Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, páginas
147-158 (CRC Press, Inc., 1987).
Los ensayos de unión competitiva dependen de la
capacidad del patrón marcado (que puede ser hVEGF o una porción
inmunológicamente reactiva del mismo) de competir con el analito de
muestra de ensayo (hVEGF) para la unión con una cantidad limitada de
anticuerpo. La cantidad de hVEGF en la muestra de ensayo es
inversamente proporcional a la cantidad de patrón que llega a unirse
a los anticuerpos o receptores. Para facilitar la determinación de
la cantidad de patrón que llega a unirse, los anticuerpos o
receptores generalmente se insolubilizan antes o después de la
competición, de modo que el patrón y el analito que se unen a los
anticuerpos o receptores pueden separarse adecuadamente del patrón y
el analito que permanecen sin unir.
Los ensayos tipo sándwich implican el uso de dos
anticuerpos o receptores, cada uno capaz de unirse a una porción
inmunogénica diferente, o epítopo, de la proteína a detectar. En un
ensayo tipo sándwich, el analito de muestra de ensayo se une por un
primer anticuerpo o receptor que está inmovilizado en un soporte
sólido, y después un segundo anticuerpo se une al analito, formando
de este modo un complejo tripartito insoluble. David & Greene,
Patente de Estados Unidos Nº 4.376.110. El segundo anticuerpo o
receptor puede, por sí mismo, estar marcado con un resto detectable
(ensayos tipo sándwich directos) o pueden medirse usando un
anticuerpo anti-inmunoglobulina que está marcado con
un resto detectable (ensayo tipo sándwich indirecto). Por ejemplo,
un tipo de ensayo tipo sándwich en un ensayo ELISA, en cuyo caso el
resto detectable es una enzima.
Los anticuerpos o receptor de este documento
también son útiles para formación de imágenes in vivo, donde
un anticuerpo o hVEGFr marcado con un resto detectable se administra
a un paciente, preferiblemente en el torrente sanguíneo, y se ensaya
la presencia y localización del anticuerpo o receptor marcado en el
paciente. Esta técnica de formación de imágenes es útil, por
ejemplo, en la determinación de la fase o tratamiento de neoplasmas.
El anticuerpo o hVEGFr se marca con cualquier resto que sea
detectable en un mamífero, sea por resonancia magnética nuclear,
radiología, u otro medio de detección conocido en la técnica.
Además de los anticuerpos descritos en este
documento, otros antagonistas útiles de hVEGF incluyen fragmentos y
variantes de la secuencia de aminoácidos de hVEGF nativo que se unen
al receptor de hVEGF pero que no muestran la actividad biológica de
hVEGF nativo. Por ejemplo, dichos antagonistas incluyen fragmentos y
variantes de la secuencia de aminoácidos que comprenden un dominio
de unión al receptor de hVEGF, pero que carecen de un dominio que
confiere actividad biológica, o que son deficientes de otro modo en
la activación de los receptores de hVEGF celulares, tal como en el
caso de un fragmento o una variante de la secuencia de aminoácidos
que es deficiente en su capacidad para inducir la agregación o
activación de receptores de hVEGF celulares. El término "dominio
de unión al receptor" se refiere a las secuencias de aminoácidos
en hVEGF que están implicadas en la unión al receptor de hVEGF. El
término "dominio de actividad biológica" o "dominio que
confiere actividad biológica" se refiere a una secuencia de
aminoácidos en hVEGF que confiere actividad biológica particular del
factor, tal como actividad mitogénica, angiogénica, o de
permeabilidad vascular.
La observación de que hVEGF parece ser capaz de
formar un complejo con dos o más moléculas hVEGFr en la superficie
de un célula sugiere que hVEGF tiene al menos dos sitios discretos
para la unión a hVEGFr y que se une a dichos receptores celulares de
un modo secuencial, primero a un sitio y después al otro antes de
que suceda la activación, del modo de la hormona de crecimiento,
prolactina y similares (véase, por ejemplo, Cunningham, et
al., Science 254:821 (1991); deVos, et al.,
Science 255:306 (1992); Fuh, et al., Science
256:1677 (1992)). Por consiguiente, se seleccionan variantes
antagonistas de hVEGF en las que un sitio de unión al receptor de
hVEGF (típicamente el sitio implicado en la unión inicial de hVEGF a
hVEGFr) permanece sin modificar (o si se modifica se varía para
potenciar la unión), mientras que típicamente se modifica un segundo
sitio de unión al receptor de hVEGF por sustitución o sustituciones
o deleción o deleciones de restos de aminoácidos conservativas para
volver a ese sitio de unión inoperante.
Los dominios de unión al receptor en hVEGF y los
dominios de unión a hVEGF en hVEGFr se determinan por métodos bien
conocidos en la técnica, incluyendo estudios de rayos X, análisis
mutacionales, y estudios de unión a anticuerpo. Los enfoques
mutacionales incluyen las técnicas de mutagénesis por saturación
aleatoria acopladas a selección de mutantes de escape, y mutagénesis
por inserción. Otra estrategia apropiada para identificar los
dominios de unión al receptor en ligandos es conocida como
mutagénesis por exploración de alanina (Ala). Cunningham, et
al., Science 244, 1081-1985 (1989). Este
método implica la identificación de regiones que contienen cadenas
laterales de aminoácidos cargados. Los restos cargados en cada
región identificados (es decir, Arg, Asp, His, Lys, y Glu) se
remplazan (una región por molécula mutante) con Ala y se ensaya la
unión al receptor de los ligandos obtenidos, para evaluar la
importancia de la región particular en la unión al receptor. Un
método poderoso adicional para la localización de los dominios de
unión al receptor es a través del uso de anticuerpos
anti-hVEGF neutralizantes. Kim, et al.,
Growth Factors 7:53 (1992). Habitualmente se usa una
combinación de estos y métodos similares para la localización de los
dominios implicados en la unión al receptor.
El término "variante de secuencia de
aminoácidos" usado con referencia a hVEGF se refiere a
polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos que difieren hasta
cierto punto de las secuencias de aminoácidos de las formas nativas
de hVEGF. Habitualmente, las variantes de la secuencia de
aminoácidos antagonistas tendrán al menos aproximadamente un 70% de
homología con al menos un dominio de unión al receptor de un hVEGF
nativo, y preferiblemente, serán al menos aproximadamente un 80%,
más preferiblemente al menos aproximadamente un 90% homólogos con el
dominio de unión al receptor de un hVEGF nativo. Las variantes de la
secuencia de aminoácidos tienen sustituciones, deleciones, y/o
inserciones en ciertas posiciones en la secuencia de aminoácidos de
hVEGF nativo, de modo que las variantes mantengan la capacidad de
unirse al receptor de hVEGF (y por tanto compiten con hVEGF nativo
por la unión al receptor de hVEGF) pero no logran indicar uno o más
de los efectos biológicos de hVEGF, tal como proliferación celular
del endotelio, angiogénesis, o permeabilidad vascular.
"Homología" se define como el porcentaje de
restos en la variante de la secuencia de aminoácidos que son
idénticos a los restos en la secuencia de aminoácidos de un dominio
de unión al receptor de un hVEGF nativo después de alinear las
secuencias e introducir huecos, si es necesario, para conseguir el
máximo porcentaje de homología y sin considerar ninguna sustitución
conservativa como parte del porcentaje de homología de aminoácidos.
Los métodos y programas informáticos para el alineamiento son bien
conocidos en la técnica. Uno de dichos programas informáticos es
"Align 2", creado por Genentech, Inc., que se presentó con la
documentación del usuario en la United States Copyright Office,
Washington, DC 20559, el 10 de diciembre de 1991. Los especialistas
en la técnica pueden determinar, usando técnicas de rutina,
parámetros apropiados para medir el alineamiento, incluyendo
cualquier algoritmo necesario para conseguir el máximo alineamiento
sobre la longitud de las secuencias que se están comparando.
Las variantes de sustitución son aquéllas que
tienen al menos un resto de aminoácido en una secuencia nativa
retirado y un aminoácido diferente insertado en su lugar en la misma
posición. Las sustituciones pueden ser únicas, donde sólo un
aminoácido en la molécula se ha sustituido, o pueden ser múltiples,
donde dos o más aminoácidos se han sustituido en la misma
molécula.
Las variantes de inserción son aquéllas con uno o
más aminoácidos insertados inmediatamente adyacentes a un aminoácido
en una posición particular en la secuencia nativa. Inmediatamente
adyacente a un aminoácido significa que está conectado al grupo
funcional \alpha-carboxi o
\alpha-amino del aminoácido.
Las variantes de deleción son aquéllas con uno o
más restos de aminoácido retirados en una secuencia nativa.
Habitualmente, las variantes de deleción tendrán uno o dos restos de
aminoácido delecionados en una región particular de la molécula.
Los fragmentos y variantes de la secuencia de
aminoácidos de hVEGF se preparan fácilmente por métodos conocidos en
la técnica, tal como por mutagénesis dirigida de sitio del ADN que
codifica el factor nativo. El ADN mutado se inserta en un vector de
expresión apropiado, y después se transfectan las células
hospedadoras con el vector recombinante. Las células hospedadoras
recombinantes se hacen crecer en un medio de cultivo apropiado, y el
fragmento deseado o variante de la secuencia de aminoácidos
expresado en las células hospedadoras se recupera después del
cultivo celular recombinante por métodos cromatográficos u otros
métodos de purificación.
Como alternativa, los fragmentos y variantes de
aminoácidos de hVEGF se preparan in vitro, por ejemplo, por
proteolisis de hVEGF nativo, o por síntesis usando procedimientos de
síntesis peptídica en fase sólida convencional como se describe por
Merrifield (J. Am. Chem. Soc. 85:2149 (1963)), aunque pueden
usarse otras síntesis químicas equivalentes conocidas en la técnica.
La síntesis en fase sólida se inicia a partir del extremo
C-terminal del péptido acoplando un
\alpha-aminoácido protegido a una resina
apropiada. Los aminoácidos se acoplan a la cadena peptídica usando
técnicas bien conocidas en la técnica para la formación de enlaces
peptídicos.
Los términos "tratar", "tratamiento",
"terapia" y "terapéutico" como se usan en este documento
se refieren a terapia curativa, terapia profiláctica y terapia
preventiva.
Para aplicaciones terapéuticas, los antagonistas
de la invención se administran a un mamífero, preferiblemente un ser
humano, en una forma de dosificación aceptable, incluyendo las que
pueden administrarse a un ser humano por vía intravenosa en forma de
bolo o por infusión continua durante un periodo de tiempo, por vías
intramuscular, intraperitoneal,
intra-cerebroespinal, subcutánea,
intra-articular, intrasinovial, intradural,
intratecal, oral, tópica, o por inhalación. Los antagonistas también
se administran apropiadamente por vías intratumoral, peritumoral,
intralesional, o perilesional, para ejercer efectos terapéuticos
locales así como sistémicos. Se espera que la vía intraperitoneal
sea particularmente útil, por ejemplo, en el tratamiento de tumores
de ovario. Se espera que la infusión intravenosa sea particularmente
útil por ejemplo, en el tratamiento de edema cerebral.
Dichas formas de dosificación abarcan vehículos
que son no tóxicos y no terapéuticos de manera inherente. Los
ejemplos de dichos vehículos incluyen intercambiadores de iones,
alúmina, estearato de aluminio, lecitina, proteínas séricas, tales
como albúmina de suero humano, sustancias tamponantes tales como
fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato potásico, mezclas de
glicéridos parciales de ácidos grasos vegetales saturados, agua,
sales, o electrolitos tales como sulfato de protamina,
hidrogenofosfato disódico, hidrogenofosfato potásico, cloruro
sódico, sales de cinc, sílice coloidal, trisilicato de magnesio,
polivinilpirrolidona, sustancias basadas en celulosa, y
polietilenglicol. Los vehículos para formas tópicas o basadas en gel
de antagonistas incluyen polisacáridos tales como
carboximetilcelulosa sódica o metilcelulosa, polivinilpirrolidona,
poliacrilatos, polímeros de bloque de
polioxietileno-polioxipropileno, polietilenglicol, y
ceras de alcohol de madera. Pueden usarse formas de almacenamiento
convencionales. Dichas formas incluyen, por ejemplo, microcápsulas,
nano-cápsulas, liposomas, parches, formas de
inhalación, pulverizadores nasales, comprimidos sublinguales, y
preparaciones de liberación sostenida. El antagonista típicamente se
formulará en dichos vehículos a una concentración de aproximadamente
0,1 mg/ml a 100 mg/ml.
Los ejemplos apropiados de preparaciones de
liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros
hidrófobos sólidos que contienen el antagonista, estando dichas
matrices en forma de artículos con forma, por ejemplo, películas, o
microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación sostenida
incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo,
poli(2-hidroexietil-metacrilato)
como se describe por Langer et al., J. Biomed. Mater. Res.
15:167 (1981) y Langer, Chem. Tech.,
12:98-105 (1982), o
poli(vinilalcohol), polilactidas (Patente de Estados Unidos
Nº 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y
gamma etil-L-glutamato (Sidman et
al., Biopolymers, 22:547 (1983), copolímeros de
etileno-acetato de vinilo no degradables (Langer
et al., supra), de ácido láctico-ácido glicólico
degradables tales como Lupron Depot^{TM} (microesferas inyectables
compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato
de leuprolida), y ácido
poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.
Aunque los polímeros tales como etileno-acetato de
vinilo y ácido láctico-ácido glicólico posibilitan la liberación de
moléculas durante más de 100 días, ciertos hidrogeles liberan
proteínas durante periodos de tiempo más cortos. Cuando los
antagonistas polipeptídicos encapsulados permanecen en el cuerpo
durante un largo periodo de tiempo, pueden desnaturalizarse o
agregarse como resultado de la exposición a humedad a 37ºC, dando
como resultado una pérdida de actividad biológica y posibles cambios
en la inmunogenicidad. Pueden idearse estrategias racionales para la
estabilización dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si
se descubre que el mecanismo de agregación es la formación de
enlaces S-S intermoleculares a través de intercambio
tio-disulfuro, la estabilización puede conseguirse
modificando los restos sulfhidrilo, liofilizando en soluciones
ácidas, controlando el contenido de humedad, usando aditivos, y
desarrollando composiciones de matriz polimérica específicas.
Las composiciones de antagonista de hVEGF de
liberación sostenida también incluyen anticuerpos antagonistas o
hVEGFr atrapados en forma de liposomas. Los liposomas que contienen
los antagonistas se preparan por métodos conocidos en la técnica,
tales como los descritos en Epstein, et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985); Hwang, et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 77:4030 (1980); Patente de Estados
Unidos Nº 4.485.045; Patente de Estados Unidos Nº 4.544.545.
Habitualmente, los liposomas son pequeños (aproximadamente
200-800 Angstroms) de tipo unilamelar en los que el
contenido en lípidos es mayor del 30% en moles de colesterol,
estando ajustada la proporción seleccionada para la terapia HRG
óptima. Los liposomas con tiempo de circulación potenciado se
describen en la Patente de Estados Unidos Nº 5.013.556.
Otro uso de la presente invención comprende
incorporar un antagonista de hVEGF en artículos con forma. Dichos
artículos pueden usarse, por ejemplo, en la modulación del
crecimiento celular endotelial y angiogénesis. Además, la invasión
tumoral y metástasis puede modularse con estos artículos.
Una dosificación apropiada y eficaz de
antagonista dependerá del tipo de enfermedad o afección a tratar,
como se define en este documento, la gravedad y curso de la
enfermedad o afección, si los antagonistas se administran para
propósitos preventivos o terapéuticos, terapia previa, la historia
clínica del paciente y respuesta al antagonista, y la discreción del
médico que está atendiendo. Una dosificación eficaz de antagonista
será típicamente la cantidad de antagonista administrada para
conseguir el máximo de cantidad deseada de inhibición de actividad
biológica de VEGF. El antagonista se administra apropiadamente al
paciente en una vez o durante una serie de tratamientos.
Los antagonistas de hVEGF son útiles en el
tratamiento de edema asociado a diversas enfermedades y afecciones
no neoplásicas.
Las afecciones no neoplásicas que con
susceptibles de tratamiento incluyen artritis reumatoide, psoriasis,
aterosclerosis, retinopatía diabética y otras retinopatías,
fibroplasia retrolental, glaucoma neovascular, degeneración macular
relacionada con la edad, hiperplasias de tiroides (incluyendo
enfermedad de Grave), transplante de tejido corneal y transplantes
de otros tejidos, inflamación crónica, inflamación pulmonar,
síndrome nefrótico, preeclampsia, ascitis, efusión pericárdica (tal
como la asociada con pericarditis), y efusión pleural.
La degeneración macular relacionada con la edad
(AMD) es una causa principal de pérdida visual grave en la población
anciana. La forma exudativa de AMD está caracterizada por
neovascularización coroidal y desprendimiento de las células
epiteliales del pigmento retinal. Como la neovascularización
coroidal está asociada con un empeoramiento drástico en la
prognosis, se espera que los antagonistas de VEGF de la presente
invención sean especialmente útiles en la reducción de la gravedad
de AMD.
En este documento, el término "edema" se usa
en un sentido general e incluye afecciones en el cuerpo o que
acompañan a apoplejía o lesión craneal caracterizadas por un aumento
en el contenido acuoso tisular extravascular, debido sólo a niveles
de agua extracelular aumentados, o en combinación con niveles de
agua intracelular aumentados. El edema puede estar presente en
diversos tejidos en el cuerpo. En particular, se contempla que los
antagonistas de hVEGF pueden emplearse para tratar edema del sistema
nervioso central (SNC), incluyendo edema cerebral, típicamente
caracterizado por un aumento del volumen cerebral, así como edema de
médula espinal o canal medular u otras afecciones que conducen a
presión intracraneal aumentada (tal como lesión local de la médula
espinal). Un aumento en el volumen cerebral puede ser, por ejemplo,
el resultado de volumen de sangre cerebral aumentado y/o contenido
en agua tisular aumentado. El término "edema" usado en este
documento incluye las afecciones patológicas mencionadas en la
técnica como edema vasogénico y edema citotóxico. Típicamente, la
afección mencionada como edema vasogénico se ha caracterizado como
asociada a la alteración de la barrera
sangre-cerebro (BBB) mientras que el edema
citotóxico se ha caracterizado como asociado a BBB intacta. El edema
cerebral se describe en líneas generales en el artículo de revisión,
Hariri, Neurosurgical Intensive Care 5:687 (1994).
El edema en un mamífero puede ser el resultado de
o acompañar a una diversidad de afecciones patológicas o estímulos,
incluyendo aunque sin limitación, hipertensión aguda, meningitis,
encefalitis, abscesos, traumatismo (tal como lesión craneal),
hemorragia, infección viral, malaria cerebral, apoplejía, radiación,
esclerosis múltiple, post detención cardiaca, asfixia al nacer,
toxicidad por glutamato, encefalopatía, hipoxia, isquemia y diálisis
renal.
En particular, la invención contempla terapia que
usa los antagonistas de hVEGF para tratar edema cerebral, incluyendo
edema cerebral que acompaña a apoplejía. Se contempla que los
antagonistas de hVEGF de la presente invención pueden administrarse
solos o en combinación con otras terapias, para reducir o inhibir
dicho edema en el cerebro.
También es habitual para los mamíferos que tienen
o están experimentando apoplejía, desarrollar o sufrir edema
cerebral. El término apoplejía en la presente solicitud se usa en un
sentido general e incluye las afecciones clínicas conocidas por el
especialista en la técnica como apoplejía isquémica y apoplejía
hemorrágica. Se reconoce en la técnica que la apoplejía en un
paciente puede caracterizarse o clasificarse como diversos tipos
particulares de apoplejía, dependiendo por ejemplo, de la etiología
o patología de la interrupción de flujo sanguíneo, los tipos de
células o tejidos afectados, y la presencia de extravasación
sanguínea en el tejido (tal como tejido cerebral). Los diferentes
tipos de apoplejía que se han caracterizado clínicamente incluyen
aunque sin limitación, apoplejía trombótica, apoplejía embólica,
apoplejía hemodinámica, apoplejía lacunar, y apoplejías hemorrágicas
derivadas o como resultado de hemorragia intracerebral,
subaracnoidea, intraventricular, o subdural. El médico especialista
apreciará fácilmente y entenderá la naturaleza de dichas afecciones
de apoplejía, y será capaz de detectar y diagnosticar la presencia o
síntomas de dichas afecciones en pacientes. Los métodos de la
presente invención contemplan que las moléculas antagonistas de
hVEGF pueden usarse en el tratamiento de todas dichas afecciones de
apoplejía, particularmente para reducir o inhibir el edema y
proteger frente al daño celular y tisular. Los antagonistas de hVEGF
pueden administrarse en forma de un tratamiento agudo después de la
aparición de apoplejía para reducir o inhibir por ejemplo, edema
cerebral, potenciando de este modo la recuperación del mamífero de
la apoplejía. El uso de los antagonistas de hVEGF es beneficioso en
que el tratamiento puede prevenir o evitar tener que realizar
cirugía (como una craneotomía) en el mamífero para reducir o aliviar
la presión intracraneal debido al exceso de acumulación de agua en
tejidos cerebrales. También se contempla que después de la reducción
o prevención de dicho edema por los antagonistas de hVEGF, habrá una
reducción (es decir, efecto protector) en la cantidad de cerebro y
tejido neuronal que puede está típicamente dañado por la presión
intracraneal o edema.
Dependiendo del tipo y gravedad de la enfermedad
o afección que se está tratando, aproximadamente 1 \mug/kg a 15
mg/kg de antagonista es una dosificación candidata inicial para la
administración al paciente, sea, por ejemplo, por una o más
administraciones por separado, o por infusión continua. Una
dosificación diaria típica podría variar de aproximadamente 1
\mug/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados
anteriormente. Para administraciones repetidas durante varios días o
más, dependiendo de la afección, el tratamiento se repite hasta que
suceda una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Sin
embargo, pueden ser útiles otros regímenes de dosificación. Por
ejemplo, en los métodos de tratamiento de edema cerebral y
apoplejía, puede ser deseable administrar el antagonista o
antagonistas de hVEGF inmediatamente después de la detección o
diagnóstico en el paciente, en varias horas de lesión o aparición de
apoplejía, o en 1 a 4 días después de ello. El protocolo de
administración deseado será típicamente de la discreción del médico.
El progreso de la terapia con antagonista de hVEGF se controla
fácilmente por técnicas y ensayos convencionales, incluyendo, por
ejemplo, técnicas radiográficas (en particular, formación de
imágenes por resonancia magnética, MRI) para afecciones neoplásicas
y formación de edema asociada a traumatismo o apoplejía, o
controlando la presión intracraneal para el edema cerebral.
De acuerdo con otra realización de la invención,
la eficacia del antagonista en la prevención o tratamiento de un
afección o enfermedad puede mejorarse administrando el antagonista
de manera seriada o en combinación con otro agente que es eficaz
para esos propósitos, tal como factor de necrosis tumoral (TNF), un
anticuerpo capaz de inhibir o neutralizar la actividad angiogénica
de factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) ácido o básico o
factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), un anticuerpo capaz de
inhibir o neutralizar las actividades anticoagulantes del factor
tisular, proteína C, o proteína S (véase Esmon, et
al., Publicación de Patente PCT Nº WO 91/01753, publicada el 21
de febrero de 1991), un anticuerpo capaz de unirse al receptor HER2
(véase Hudziak, et al., Publicación de Patente PCT Nº
WO 89/06692, publicada el 27 de julio de 1989), o uno o más agentes
terapéuticos convencionales tales como, por ejemplo, agentes de
alquilación, antagonistas de ácido fólico, antimetabolitos del
metabolismo de ácidos nucleicos, antibióticos, análogos de
pirimidina, 5-fluorouracilo, cisplatino, nucleósidos
de purina, aminas, aminoácidos, nucleósidos de triazol, o
corticosteroides. Dichos agentes distintos pueden estar presentes en
la composición que se está administrando o pueden administrarse por
separado. Particularmente en el tratamiento de edema y apoplejía, el
antagonista puede administrarse de manera seriada o en combinación
con agentes tales como agentes antivirales, antifúngicos o
antiparasitarios, antibióticos, agentes trombolíticos (tales como
t-PA), agentes de terapia osmótica (por ejemplo,
manitol), o esteroides (como Decadron o prednisona). El uso de
dichos agentes en combinación con el antagonista está dentro de la
experiencia habitual del médico, y por supuesto, la selección de
dichos agentes dependería, por ejemplo, de la enfermedad o afección
que se está tratando.
También se contempla que el antagonista de hVEGF
puede administrarse de manera seriada con hVEGF, particularmente en
el tratamiento de apoplejía. Después del diagnóstico o detección de
apoplejía, el antagonista de hVEGF puede administrarse
inmediatamente o en aproximadamente 1 a 4 días después de la
aparición de apoplejía. Se cree que después de completar la
administración del antagonista para reducir o inhibir la formación
de edema, pude ser beneficioso administrar al paciente una cantidad
de hVEGF suficiente para estimular o promover la
re-vascularización. Preferiblemente, el hVEGF sería
una forma recombinante de hVEGF y se administraría en un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
Los anticuerpos anti-hVEGF de la
invención también son útiles como agentes de purificación por
afinidad. En este proceso, los anticuerpos frente a hVEGF se
inmovilizan en un soporte apropiado, tal como una resina de Sephadex
o papel de filtro, usando métodos bien conocidos en la técnica. El
anticuerpo inmovilizado después se pone en contacto con una muestra
que contiene el hVEGF a purificar, y después el soporte se lava con
un disolvente apropiado que retirará sustancialmente todo el
material en la muestra excepto el hVEGF, que está unido al
anticuerpo inmovilizado. Finalmente, el soporte se lava con otro
disolvente apropiado, tal como tampón glicina, pH 5,0, que liberará
el hVEGF del anticuerpo.
Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de
ilustración sólo y no pretenden limitar la invención de ningún
modo.
Se usaron los reactivos disponibles en el mercado
a los que se hace referencia en los ejemplos de acuerdo con las
instrucciones del fabricante salvo que se indique otra cosa. La
fuente de las células identificadas en los siguientes ejemplos, y
durante toda la memoria descriptiva, por los números de acceso ATCC
es la American Type Culture Collection, Manassas, Virginia.
Para obtener hVEGF conjugado a hemocianina de
lapa californiana (KLH) para inmunización, se mezcló hVEGF
recombinante (165 aminoácidos), Leung, et al., Science
246:1306 (1989), con KLH a una proporción 4:1 en presencia de
glutaraldehído al 0,05% y la mezcla se incubó a temperatura ambiente
durante 3 horas con agitación suave. La mezcla después se dializó
frente a solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 4ºC durante
una noche.
Se inmunizaron ratones balb/c cuatro veces cada
dos semanas por inyecciones intraperitoneales con 5 \mug de hVEGF
conjugado con 20 \mug de KLH, y se estimularon con la misma dosis
de hVEGF conjugado con KLH cuatro días antes de la fusión
celular.
Se fusionaron células de bazo de los ratones
inmunizados con células de mieloma P3X63Ag8U.1, Yelton, et
al., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 81:1 (1978), usando
polietilenglicol (PEG) al 35% como se describe. Yarmush, et
al., Proc. Nat. Acad. Sci. 77:2899 (1980). Los hibridomas
se seleccionaron en medio HAT.
Los sobrenadantes de los cultivos de células de
hibridoma se exploraron para la producción de anticuerpo
anti-hVEGF por un ensayo ELISA usando placas de
microtitulación recubiertas con hVEGF. Se determinó el anticuerpo
que se unió a hVEGF en cada uno de los pocillos usando
inmunoglobulina de cabra anti-IgG de ratón conjugada
con fosfatasa alcalina y el sustrato cromogénico fosfato de
p-nitrofenilo. Harlow & Lane, Antibodies: A
Laboratory Manual, página 597 (Cold Spring Harbor Laboratory,
1988). Las células de hibridoma determinadas de este modo para
producir anticuerpos anti-hVEGF se subclonaron por
dilución limitante, y dos de esos clones, denominados A4.6.1 y
B2.6.2, se eligieron para estudios adicionales.
Las especificidades de unión de los anticuerpos
monoclonales anti-hVEGF producidos por los
hibridomas A4.6.1 y B2.6.2 se determinaron por ELISA. Los
anticuerpos monoclonales se añadieron a los pocillos de placas de
microtitulación que se habían recubierto previamente con hVEGF, FGF,
HGF, o factor de crecimiento epidérmico (EGF). El anticuerpo unido
se detectó con inmunoglobulinas de cabra anti-IgG de
ratón conjugadas con peroxidasa. Los resultados de esos ensayos
confirmaron que los anticuerpos monoclonales producidos por los
hibridomas A4.6.1 y B2.6.2 se unen a hVEGF, pero de manera no
detectable a los otros factores de crecimiento proteicos.
Se uso un ELISA de unión competitiva para
determinar si los anticuerpos monoclonales producidos por los
hibridomas A4.6.1 y B2.6.2 se unen al mismo o a diferentes epítopos
(sitios) en hVEGF. Kim, et al., Infect. Immun. 57:944
(1989). Los anticuerpos monoclonales anti-hVEGF no
marcados individuales (A4.6.1 y B2.6.2) o anticuerpo
anti-HGF irrelevante (isotipo IgG1) se añadieron a
los pocillos de placas de microtitulación que se habían recubierto
previamente con hVEGF. Después se añadieron anticuerpos monoclonales
anti-hVEGF biotinilados (BIO-A4.6.1
o BIO-B2.6.2). La proporción de anticuerpo
biotinilado a anticuerpo no marcado fue 1:1000. La unión de los
anticuerpos biotinilados se visualizó por la adición de peroxidasa
conjugada con avidina, seguida de diclorhidrato de
o-fenilendiamina y peróxido de hidrógeno. La
reacción de color, que indica la cantidad de anticuerpo biotinilado
unido, se determinó midiendo la densidad óptica (O.D) a longitud de
onda de 495 nm.
Como se muestra en la Figura 1, en cada caso, la
unión del anticuerpo anti-hVEGF biotinilado se
inhibió por el correspondiente anticuerpo no marcado, pero no por el
otro anticuerpo anti-hVEGF no marcado o el
anticuerpo anti-HGF. Estos resultados indican que
los anticuerpos monoclonales producidos por los hibridomas A4.6.1 y
B2.6.2 se unen a diferentes epítopos en hVEGF.
Los isotipos de los anticuerpos monoclonales
anti-hVEGF producidos por los hibridomas A4.6.1 y
B2.6.2 se determinaron por ELISA. Las muestras de medio de cultivo
(sobrenadante) en el que se hicieron crecer los hibridomas se
añadieron a los pocillos de placas de microtitulación que se habían
recubierto previamente con hVEGF. Los anticuerpos monoclonales
anti-hVEGF capturados se incubaron con diferentes
anti-inmunoglobulinas de ratón, de cabra, conjugadas
con fosfatasa alcalina específicas de isotipo, y se determinó la
unión de los anticuerpos conjugados a los anticuerpos monoclonales
anti-hVEGF por la adición de fosfato de
p-nitrofenilo. La reacción de color se midió al 405
nm con un lector de placa ELISA.
Por ese método, se determinó que el isotipo de
los anticuerpos monoclonales producidos por ambos hibridomas A4.6.1
y B2.6.2 es IgG1.
Las afinidades de los anticuerpos monoclonales
anti-hVEGF producidos por los hibridomas A4.6.1 y
B2.6.2 por hVEGF se determinaron por ensayos de unión competitiva.
Se añadió una concentración por debajo de la óptima predeterminada
de anticuerpo monoclonal a las muestras que contenían
20.000-40.000 cpm de ^{125}I-hVEGF
(1-2 ng) y diversas cantidades conocidas de hVEGF no
marcado (1-1000 ng). Después de 1 hora a temperatura
ambiente, se añadieron 100 \mul de antisuero de cabra
anti-Ig de ratón (Pel-Freez, Rogers,
Ar USA), y se incubaron las mezclas otra hora a temperatura
ambiente. Los complejos de anticuerpo y proteína unida (complejos
inmunes) se hicieron precipitar por la adición de 500 \mul
polietilenglicol al 6% (PEG, peso en moles 8000) a 4ºC, seguido por
centrifugación a 2000 x G durante 20 min a 4ºC. La cantidad de
^{125}I-hVEGF unido al anticuerpo monoclonal
anti-hVEGF en cada muestra se determinó contando el
material sedimentado en un contador gamma.
Se calcularon las constantes de afinidad a partir
de los datos por análisis de Scatchard. Se calculó que la afinidad
del anticuerpo monoclonal anti-hVEGF producido por
el hibridoma A4.6.1 es 1,2 x 10^{9} litros/mol. Se calculó que la
afinidad del anticuerpo monoclonal anti-hVEGF
producido por el hibridoma B2.6.2 es 2,5 x 10^{9} litros/
mol.
mol.
Se sembraron células del endotelio capilar de la
corteza suprarrenal (ACE) bovinas, Ferrara, et al., Proc.
Nat. Acad. Sci. 84:5773 (1987), a una densidad de 10^{4}
células/ml en placas multipocillo de 12 pocillos, y se añadieron
2,5 ng/ml de hVEGF a cada pocillo en presencia o ausencia de
diversas concentraciones de los anticuerpos monoclonales
anti-hVEGF producidos por los hibridomas A4.6.1 o
B2.6.2, o un anticuerpo monoclonal anti-HGF
irrelevante. Después de cultivar 5 días, las células en cada pocillo
se contaron en un contador Coulter. Como control, se cultivaron
células ACE en ausencia de hVEGF añadido.
Como se muestra en la Figura 2, ambos anticuerpos
monoclonales anti-hVEGF inhibieron la capacidad del
hVEGF añadido de mantener el crecimiento o supervivencia de las
células ACE bovinas. El anticuerpo monoclonal producido por el
hibridoma A4.6.1 inhibió completamente la actividad mitogénica de
hVEGF (más de aproximadamente el 90% de inhibición), mientras que el
anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma B2.6.2 inhibió sólo
parcialmente la actividad mitogénica de hVEGF.
Se sembraron células ACE bovinas a una densidad
de 2,5 x 10^{4} células/0,5 ml/pocillo en placas de
microtitulación de 24 pocillos en Medio de Eagle Modificado por
Dulbecco (DMEM) que contenía suero de ternera al 10%, glutamina 2
mM, y 1 ng/ml de factor de crecimiento de fibroblastos básico.
Después de cultivar durante una noche, las células se lavaron una
vez en tampón de unión (volúmenes iguales de DMEM y medio F12 más
HEPES 25 mM y albúmina de suero bovino al 1%) a 4ºC.
Se preincubaron 12.000 cpm de
^{125}I-hVEGF (aproximadamente 5 x 10^{4}
cpm/ng/ml) durante 30 minutos con 5 \mug del anticuerpo monoclonal
anti-hVEGF producido por el hibridoma A4.6.1,
B2.6.2, o A2.6.1 (250 \mul de volumen total), y después las
mezclas se añadieron a las células ACE bovinas en las placas de
microtitulación. Después de incubar las células durante 3 horas a
4ºC, las células se lavaron 3 veces con tampón de unión a 4ºC, se
solubilizaron por la adición de 0,5 ml de NaOH 0,2 N, y se contaron
en un contador gamma.
Como se muestra en la Figura 3 (superior), los
anticuerpos monoclonales anti-hVEGF producidos por
los hibridomas A4.6.1 y B2.6.2 inhibieron la unión de hVEGF a las
células ACE bovinas. En contraste, el anticuerpo monoclonal
anti-hVEGF producido por el hibridoma A2.6.1 no tuvo
efecto aparente sobre la unión de hVEGF a las células ACE bovinas.
Consecuente con los resultados obtenidos en el ensayo de
proliferación celular descrito anteriormente, el anticuerpo
monoclonal producido por el hibridoma A4.6.1 inhibió la unión de
hVEGF a un mayor grado que el anticuerpo monoclonal producido por el
hibridoma B2.6.2.
Como se muestra en la Figura 3 (inferior), el
anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma A4.6.1 inhibió
completamente la unión de hVEGF a las células ACE bovinas a una
proporción molar 1:250 de hVEGF a anticuerpo.
Para determinar si el anticuerpo monoclonal
anti-hVEGF producido por el hibridoma A4.6.1 es
reactivo con las formas de 121 y 189 aminoácidos de hVEGF, se ensayó
el anticuerpo para su capacidad de inmunoprecipitar esos
polipéptidos.
Se transfectaron células 293 humanas con vectores
que comprenden la secuencia codificante de nucleótidos de los
polipéptidos hVEGF de 121 y 189 aminoácidos, como se describe.
Leung, et al., Science 246:1306 (1989). Dos días
después de la transfección, se transfirieron las células a medio que
carecía de cisteína y metionina. Las células se incubaron 30 minutos
en ese medio, después se añadieron 100 \muCi/ml de cada
^{35}S-metionina y
^{35}-S-cisteína al medio, y las
células se incubaron otras dos horas. El marcaje se fijó
transfiriendo las células a medio libre de suero e incubando tres
horas. Se recogieron los medios de cultivo celular, y se lisaron las
células incubando durante 30 minutos en tampón de lisis (NaCl 150
mM, NP40 al 1%, desoxicolato al 0,5%, dodecilsulfato sódico al 0,1%
(SDS), Tris 50 mM, pH 8,0). Los restos celulares se retiraron de los
lisados por centrifugación a 200 x G durante 30 minutos.
Se incubaron muestras de 500 \mul de medios de
cultivo celular y lisados celulares con 2 \mul de anticuerpo de
hibridoma A4.6.1 (2,4 mg/ml) durante 1 hora a 4ºC, y después se
incubaron con 5 \mul de inmunoglobulina de conejo
anti-IgG de ratón durante 1 hora a 4ºC. Los
complejos inmunes de hVEGF marcado con ^{35}S y anticuerpo
monoclonal anti-hVEGF se hicieron precipitar con
proteína A Sepharose (Pharmacia), después se sometieron a
electroforesis en gel de poliacrilamida al 12%-SDS en condiciones
reductoras. El gel se expuso a una película de rayos x para el
análisis de las proteínas radiomarcadas inmunoprecipitadas por
autorradiografía.
Los resultados de ese análisis indicaron que el
anticuerpo monoclonal anti-hVEGF producido por el
hibridoma A4.6.1 tenía reacción cruzada con ambas formas de 121 y
189 aminoácidos de hVEGF.
A.
Las secuencias de nucleótidos y codificantes de
aminoácidos del receptor de hVEGF flt se describen en
Shibuya, et al., Oncogene 5:519-524
(1990). La secuencia codificante del dominio extracelular completo
del receptor de hVEGF flt se fusionó a la secuencia
codificante de la cadena pesada de IgG1 humana en un proceso de dos
etapas.
Se usó mutagénesis dirigida de sitio para
introducir un sitio de restricción BstBI en el ADN que codifica
flt en un sitio 5' del codón para el aminoácido 759 de
flt, y para convertir el único sitio de restricción BstEII en
el plásmido pBSSK^{-} FC, Bennett, et al., J. Biol. Chem.
266:23060-23067 (1991), a un sitio BstBI. El
plásmido modificado se digirió con EcoRI y BstBI y el fragmento
grande resultante del ADN plasmídico se ligó junto con un fragmento
EcoRI-BstBI del ADN de flt que codifica el
dominio extracelular (aminoácidos 1-758) del
receptor de hVEGF flt.
La construcción resultante se digirió con ClaI y
NotI para generar un fragmento de aproximadamente 3,3 kb, que
después se inserta en el sitio de clonación múltiple del vector de
expresión de mamífero pHEBO2 (Leung, et al., Neuron
8:1045 (1992)) por ligamiento. Se modifican los extremos del
fragmento de 3,3 kb, por ejemplo, por la adición de enlazadores,
para obtener la inserción del fragmento en el vector en la
orientación correcta para la expresión.
Se transfectan células hospedadoras de mamífero
(por ejemplo, células CEN4 (Leung, et al. supra)) con
el plásmido pHEBO2 que contienen el inserto de flt por
electroporación. Las células transfectadas se cultivan en medio que
contiene suero bovino fetal aproximadamente al 10%, glutamina 2 mM,
y antibióticos, y se transfieren a una confluencia de
aproximadamente el 75% a medio libre de suero. El medio se
condiciona durante 3-4 días antes de la recogida, y
la proteína de fusión flt-IgG se purifica del medio
condicionado por cromatografía en una matriz de afinidad de proteína
A esencialmente como se describe en Bennett, et al., J. Biol.
Chem. 266:23060-23067 (1991).
B.
Se construyó un ADNc de flt-IgG humano
(mencionado como
hflt(1-3)-IgG) como se
describe en Davis-Smyth et al., EMBO J.
15:4919-4927 (1996). Esta forma de receptor truncado
incluía solo los primeros tres dominios tipo inmunoglobulina de
flt humano fusionado a un Fc-IgG. Véase
Ferrara et al., Nature Medicine 4:336 (1998).
Se construyó un flt-IgG murino (mencionado
como mflt(1-3)-IgG) por
amplificación por PCR del ADNc de embrión de 17 días de ratón
(Clontech, Palo Alto, CA) usando cebadores descritos en Ferrara
et al., supra. El diseño del cebador de PCR 3' aseguró
que la expresión del
mflt-1(1-3) estuviera en fase
con un clon de Fc de IgG2b murino. El fragmento de 1 kb resultante
primero se clonó en un vector de clonación TA (Invitrogen, San
Diego, CA) como un fragmento ClaI-BstEII. Este
fragmento se ligó al extremo 5' de Fc de IgG2b murino en un vector
pRK. Este plásmido posibilitó la expresión de la proteína de fusión
mflt(1-3)-IgG cuando se
transfirió a células de mamífero.
Para la expresión en células CHO, los ADNc se
subclonaron en un vector dicistrónico que une la expresión del
marcador dihidrofolato reductasa a la expresión de la proteína de
fusión obtenida de flt. Véase, Lucas et al., Nucleic
Acid Res. 24:1774-1779 (1996). Los plásmidos
se introdujeron en células DP12, un derivado de la línea celular
CHO-K1DUXB11 desarrollada por L. Chasin (Columbia
University, Nueva York) mediante lipofección y se seleccionaron para
el crecimiento en medio libre de
glicina-hipoxantina-timidina
(G-H-T). Chisholm et al., DAN
Cloning 4: A Practical Approach, Mammalian Systems (eds. Glover
& Hames) páginas 1-39 (Oxford Press, 1995). Los
clones de la primera ronda de selección se sembraron posteriormente
en placas a concentraciones en aumento de metotrexato. Después los
clones se exploraron para la producción por ELISA para el Fc humano
y murino. Los clones que presentaron la producción más alta se
adaptaron a cultivo en suspensión, y se recogieron los cultivos
libres de suero y se purificaron por proteína
A-Sepharose. Se determinaron las concentraciones de
proteína por análisis de aminoácidos. El contenido de endotoxina del
material purificado final no excedió de 0,5 eu/mg.
Como se describe en Ferrara et al.,
supra, tanto la proteína de fusión
flt(1-3)-IgG murina como al
proteína de fusión
flt(1-3)-IgG humana fueron
activas en la inhibición de la bioactividad de VEGF en el modelo de
roedor ensaya-
do.
do.
Se ensayaron diversas líneas de células tumorales
que crecían en cultivo para la producción de hVEGF por ELISA. Se
descubrió que las líneas de células tumorales de ovario, pulmón,
colon, gástricas, de mama, y de cerebro producían hVEGF. Tres líneas
celulares que producían hVEGF, NEG 55 (también mencionada como G55)
(línea de células de glioma humano obtenida de Dr. M. Westphal,
Department of Neurosurgery, University Hospital Eppendor, Hamburg,
Alemania, también mencionada como G55), A-673 (línea
de células de rabdomiosarcoma humano obtenida de la American Type
Culture Collection (ATCC), como línea celular número CRL 1598), y
SK-LMS-1 (línea celular de
leiomiosarcoma obtenida de la ATCC como línea celular número HTB
88), se usaron para estudios adiciona-
les.
les.
Se inyectaron por vía subcutánea ratones
Beige/nude hembras de seis a diez semanas de edad (Charles River
Laboratory, Wilmington, Massachussets USA) con 1-5 x
10^{6} células tumorales en 100-200 \mul de PBS.
En diversos momentos después de que se estableciera el crecimiento
tumoral, los ratones se inyectaron por vía intraperitoneal una o dos
veces por semana con diversas dosis de anticuerpo monoclonal
anti-hVEGF A4.6.1, un anticuerpo monoclonal
anti-gp120 irrelevante (5B6), o PBS. El tamaño
tumoral se midió cada semana, y al final del estudio, los tumores se
extirparon y se pesaron.
Se muestra el efecto de diversas cantidades de
anticuerpo monoclonal anti-hVEGF A4.6.1 sobre el
crecimiento de tumores NEG 55 en ratones en las Figuras 4 y 5. La
Figura 4 muestra que los ratones tratados con 25 \mug o 100 \mug
de anticuerpo monoclonal anti-hVEGF A4.6.1
comenzando una semana después de la inoculación de células NEG 55
tuvieron una velocidad sustancialmente reducida de crecimiento
tumoral en comparación con los ratones tratados con anticuerpo
irrelevante o PBS. La Figura 5 muestra que cinco semanas después de
la inoculación de las células NEG 55, el tamaño de los tumores en
ratones tratados con anticuerpo anti-hVEGF A4.6.1
fue aproximadamente del 50% (en el caso de ratones tratados con
dosificaciones de 25 \mug del anticuerpo) al 85% (en el caso de
ratones tratados con dosificaciones de 100 \mug del anticuerpo)
menor que el tamaño de los tumores en ratones tratados con
anticuerpo irrelevante o PBS.
El efecto del tratamiento con anticuerpo
monoclonal anti-hVEGF A4.6.1 sobre el crecimiento de
tumores SK-LMS-1 en ratones se
muestra en la Figura 6. Cinco semanas después de la inoculación de
las células SK-LMS-1, el tamaño
medio de los tumores en ratones tratados con el anticuerpo
anti-hVEGF A4.6.1 fue aproximadamente un 75% menor
que el tamaño de tumores en ratones tratados con anticuerpo
irrelevante o PBS.
El efecto del tratamiento con anticuerpo
monoclonal anti-hVEGF A4.6.1 sobre el crecimiento de
tumores A673 en ratones se muestra en la Figura 7. Cuatro semanas
después de la inoculación de las células A673, el tamaño medio de
los tumores en ratones tratados con anticuerpo
anti-hVEGF A4.6.1 fue aproximadamente del 60% (en el
cado de ratones tratados con dosificaciones de 10 \mug del
anticuerpo) a más del 90% (en el caso de ratones tratados con
dosificaciones de 50-400 \mug del anticuerpo)
menor que el tamaño de los tumores en ratones tratados con
anticuerpo irrelevante o PBS.
Se sembraron células de glioblastoma humano NEG55
o células de rabdomiosarcoma A673 a una densidad de 7 x 10^{3}
células/pocillo en placas multipocillo (12 pocillos/placa) en medio
F12/DMEM que contenía suero de ternera fetal al 10%, glutamina 2 mM,
y antibióticos. Después se añadió anticuerpo
anti-hVEGF A4.6.1 a los cultivos celulares a una
concentración final de 0-20,0 \mug anticuerpo/ml.
Después de cinco días, las células que crecían en los pocillos se
disociaron por exposición a tripsina y se contaron en un contador
Coulter.
Las Figuras 8 y 9 muestran los resultados de esos
estudios. Como es evidente, el anticuerpo anti-hVEGF
A4.6.1 no tuvo ningún efecto significativo sobre el crecimiento de
las células NEG55 o A673 en cultivo. Estos resultados indican que el
anticuerpo anti-hVEGF A4.6.1 es no citotóxico, y
sugiere fuertemente que los efectos antitumorales observados del
anticuerpo se deben a su inhibición de neovascularización mediada
por VEGF.
La quimiotaxis de células endoteliales y otras
células, incluyendo monocitos y linfocitos, juega un papel
importante en la patogénesis de artritis reumatoide. La migración de
células endoteliales y la proliferación acompañan a la angiogénesis
que sucede en el sinovio reumatoide. El tejido vascularizado
(pannus) invade y destruye el cartílago articular.
Para determinar si los antagonistas de hVEGF
impiden este proceso, se ensayó el efecto del anticuerpo
anti-hVEGF A4.6.1 en la quimiotaxis de células
endoteliales estimulada por el fluido sinovial de pacientes que
tienen artritis reumatoide. Como control, también se ensayó el
efecto del anticuerpo anti-hVEGF A4.6.1 en la
quimiotaxis de células endoteliales estimulada por fluido sinovial
de pacientes que tienen osteoartritis (la angiogénesis que sucede en
artritis reumatoide no sucede en osteoartritis).
Se ensayó la quimiotaxis de células endoteliales
usando cámaras de Boyden modificadas de acuerdo con procedimientos
establecidos. Thompson, et al., Cancer Res. 51:2670
(1991); Phillips, et al., Proc. Exp. Biol. Med.
197:458 (1991). Se dejó que aproximadamente 10^{4} células
endoteliales de la vena umbilical humana se adhirieran a filtros
recubiertos con gelatina (tamaño de poro de 0,8 micrómetros) en
microcámaras multipocillo de 48 pocillos en medio de cultivo que
contenía suero bovino fetal al 0,1%. Después de aproximadamente dos
horas, las cámaras se invirtieron y se añadieron las muestras de
ensayo (fluido sinovial de artritis reumatoide, fluido sinovial de
osteoartritis, FGF básico (bFGF) (a una concentración final de 1
\mug/ml), o PBS) y anticuerpo anti-hVEGF A4.6.1 (a
una concentración final de 10 \mug/ml) a los pocillos. Después de
dos a cuatro horas, las células que habían migrado se tiñeron y
contaron.
La Figura 10 muestra resultados promedio de esos
estudios. Los valores mostrados en la columna marcada "Fluido
Sin." y mostrados en la parte inferior de la página para los
controles son la cantidad media de células endoteliales que migraron
en presencia de fluido sinovial, bFGF, o PBS solo. Los valores en la
columna marcada "Fluido Sin. + mAB VEGF" son la cantidad media
de células endoteliales que migraron en presencia de fluido sinovial
más anticuerpo anti-hVEGF A4.6.1 añadido. Los
valores en la columna marcada "% de Supresión" indican el
porcentaje de reducción en la migración de células endoteliales
inducida por fluido sinovial como resultado de la adición de
anticuerpo anti-hVEGF. Como se ha indicado, en
anticuerpo anti-hVEGF inhibió significativamente la
capacidad del fluido sinovial de artritis reumatoide (porcentaje
medio de inhibición del 53,40), pero no del fluido sinovial de
osteoartritis (porcentaje medio de inhibición del 13,64), de inducir
la migración de células endoteliales.
Se realizó un ensayo in vivo para
determinar los efectos de un antagonista flt-IgG en edema
cerebral. La pérdida de integridad de BBB y la formación de edema
cerebral a menudo sucede en la patogénesis de infarto cerebral. Se
cree que el fallo de la BBB en apoplejía isquémica sucede
predominantemente después de las primeras 24 horas de la aparición
de apoplejía. Además, se cree que los efectos beneficiosos de una
rápida y adecuada restauración del flujo sanguíneo después de un
suceso de isquemia agudo pueden minarse por lesión por reperfusión
de la microvasculatura cerebral que comprende la BBB, contribuyendo
a la formación de edema cerebral. Klatzo et al. Eds., Brain
Edema, Tokio, Springer (1984), páginas 1-5. El
ensayo in vivo descrito a continuación se diseñó para
reflejar estos aspectos de la afección clínica.
Se indujo isquemia cortical focal en cerebro de
ratón por la oclusión de la arteria cerebral media (MCA) usando
técnicas descritas previamente por Chen et al., Stroke
17:738-743 (1986). Se anestesiaron los
ratones (C57BL-6J; 18-25 gramos) con
isofluorano al 1,5% en oxígeno. Se expuso la MCA derecha mediante
craneotomía y se ligó con una sutura 11-0. La
arteria carótida común ipsilateral también se ocluyó durante el
periodo isquémico. Los vasos permanecieron ocluidos durante 45
minutos. Antes de la cirugía, los animales se dividieron
aleatoriamente en dos grupos y se administró por vía intraperitoneal
flt-IgG murino (como se describe en el Ejemplo 3B anterior;
también descrito en Ferrara et al., Nature Medicine
4:336 (1998)) o un anticuerpo anti-GP120
murino de control irrelevante que pertenece al mismo isotipo que el
Fc en flt-IgG [Ferrara et al., supra] a una
dosis de 10 mg/kg a 12 horas antes de la cirugía, en el momento de
la reperfusión y otra vez a 1 ó 2 días después de la cirugía. El
grado de formación de edema se evaluó por formación de imágenes de
MR ponderadas T2 24 horas después de la aparición de isquemia. El
tamaño final del infarto se evaluó 8-12 semanas
después usando MRI anatómica de alta resolución. Se tomó un
subconjunto de animales (n=12) para la verificación del tamaño del
infarto usando técnicas de histología convencionales.
Como se muestra en la Fig. 11, la administración
de flt-Ig provocó una reducción significativa en el volumen
del edema cerebral como se define por la región de hiperintensidad
en la exploración de MRI ponderada T2 conseguida 1 día después de la
aparición de isquemia (reducción del 27%, ensayo t de Student
p=0,01, n=15 y 16 en los grupos de control y tratamiento,
respectivamente). Las imágenes de MR ponderadas T2 representativas
que muestran la aparición de edema cortical como una región de alta
señal de intensidad en comparación con el lado contralateral se
muestran en la Fig. 12. En este modelo, la progresión del daño
isquémico conduce a la pérdida de tejido cortical y cavitación. El
volumen del infarto final puede, por lo tanto, estimarse a partir de
las imágenes anatómicas de alta resolución definiendo la cantidad de
corteza no afectada y comparándola con el hemisferio contralateral.
Como se muestra en la Fig. 13, el tamaño del infarto cortical se
reduce significativamente por la administración de flt-IgG
medido 8-12 semanas después (reducción del 26% en el
tamaño del infarto, ensayo t de Student p=0,009, n=11 y 14 en los
grupos de control y tratamiento, respectivamente). Hubo una buena
correlación entre el volumen del infarto medido por MRI y el
determinado usando histología convencional (R^{2}=0,633). Por
consiguiente, los animales tratados mostraron una reducción en el
desarrollo de edema cerebral, que puede proporcionar adicionalmente
neuroprotección potenciada. Estos resultados indican que la
inhibición de la actividad biológica de VEGF puede reducir la
reperfusión isquémica relacionada con edema y lesión cerebral.
<110> Genentech, Inc.
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Crecimiento Celular del Endotelio Vascular y usos de los mismos
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<210> 1
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<211> 110
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 1
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<400> 16
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Claims (20)
1. Uso de un antagonista de hVEGF en la
fabricación de un medicamento para tratar a un mamífero que tiene
edema asociado a una enfermedad o afección no neoplásica, o para
prevenir el edema en un mamífero donde el edema está asociado a una
enfermedad o afección no neoplásica.
2. Uso de acuerdo con reivindicación 1, donde el
medicamento reduce o inhibe el edema.
3. Uso de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2,
donde el edema comprende edema del sistema nervioso central.
4. Uso de acuerdo con la reivindicación 3, donde
el edema del sistema nervioso central comprende edema cerebral.
5. Uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1-4, donde la enfermedad o afección
no neoplásica comprende lesión craneal, lesión de la médula espinal,
hipertensión aguda, meningitis, encefalitis, abscesos, hemorragia,
infección viral, malaria cerebral, radiación, esclerosis múltiple,
detención cardiaca, asfixia al nacer, toxicidad por glutamato,
encefalopatía, hipoxia, isquemia, o diálisis renal.
6. Uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, donde la enfermedad o afección no neoplásica
comprende apoplejía.
7. Uso de acuerdo con la reivindicación 6, donde
la apoplejía es apoplejía isquémica.
8. Uso de acuerdo con la reivindicación 7, donde
la apoplejía isquémica es apoplejía trombótica, apoplejía embólica,
apoplejía hemodinámica, o apoplejía lacunar.
9. Uso de acuerdo con la reivindicación 6, donde
la apoplejía es apoplejía hemorrágica.
10. Uso de acuerdo con la reivindicación 9, donde
la apoplejía hemorrágica está asociada a hemorragia intracerebral,
subaracnoidea, intraventricular, o subdural.
11. Uso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 6-10, donde el medicamento es para
tratar al mamífero inmediatamente después de la detección o
diagnóstico de la apoplejía.
12. Uso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 6-10, donde el medicamento es para
tratar al mamífero en 1 a 4 días de la aparición de la
apoplejía.
13. Uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12, donde el mamífero es un ser humano.
14. Uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 13, donde el antagonista de hVEGF comprende un
anticuerpo anti-hVEGF.
15. Uso de acuerdo con la reivindicación 14,
donde el anticuerpo anti-hVEGF comprende un
anticuerpo quimérico.
16. Uso de acuerdo con la reivindicación 14 ó 15,
donde el anticuerpo anti-hVEGF comprende un
anticuerpo humanizado.
17. Uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 14 a 16, donde dicho anticuerpo comprende un
anticuerpo monoclonal.
18. Uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 13, donde el antagonista de hVEGF comprende una
proteína de fusión del receptor de hVEGF.
19. Uso de acuerdo con la reivindicación 18,
donde la proteína de fusión del receptor de hVEGF comprende una
secuencia del dominio extracelular de un receptor de hVEGF fusionada
a una inmunoglobulina.
20. Uso de acuerdo con la reivindicación 18 ó 19,
donde la proteína de fusión del receptor de hVEGF comprende una
proteína de fusión flt-IgG.
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