JP2003125789A - 組み換え型骨形態形成蛋白 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、骨欠損の治療、骨損傷の治療およ
び一般的な傷の治療の分野に有用な組み換え型ホモダイ
マーＢＭＰ蛋白の製法、組み換え型ホモダイマーおよび
それらを含有する組成物を提供することを目的とする。 【解決手段】 イー・コリにおいて生成される骨刺激活
性を有する組み換え型ＢＭＰ−２ホモダイマー、および
イー・コリ宿主細胞を培養し、得られた培養基からホモ
ダイマーＢＭＰ−２を単離、精製することからなる、骨
刺激活性を有するホモダイマーＢＭＰ−２蛋白の製法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、骨欠損の治療、骨
損傷の治療および一般的な傷の治療に有用な一連の新規
組み換え型ヘテロダイマー蛋白に関する。また本発明
は、これらのヘテロダイマーを得る方法、それらを遺伝
子組み換え法により製造する方法、およびそれらを含有
する組成物に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、骨または軟骨成長誘導特性により
特徴づけられる蛋白性因子が単離、同定された。例え
ば、米国特許第５,０１３,６４９号、ＰＣＴ出願公開Ｗ
Ｏ９０／１１３６６号、ＰＣＴ出願公開ＷＯ９１／０５
８０２号およびそれらに引用された種々の文献参照。実
質的にヒト・ＢＭＰ−７と同じであり、骨形成活性を有
すると報告されているＯＰ−１と命名された蛋白配列を
開示しているＰＣＴ／ＵＳ９０／０５９０３号も参照。
ＢＭＰ−２ないしＢＭＰ−９と命名された個々の骨形成
蛋白（ＢＭＰ）の族が単離、同定されている。これらの
蛋白およびその製法を開示するために、共同出願で同時
係属の米国特許出願第７２１,８４７号およびその前文
に引用された関連出願を、出典明示により本明細書の一
部とする。上記出願に示されたＢＭＰ−２およびＢＭＰ
−４と命名された蛋白、米国特許出願第４３８,９１９
号に開示されたＢＭＰ−７、第３７０,５４７号および
第３５６,０３３号に開示されたＢＭＰ−５、および第
３７０,５４４号および第３４７,５５９号に開示された
ＢＭＰ−６、ならびに第５２５,３５７号に開示された
ＢＭＰ−８は、特に興味深い。さらに、米国特許出願第
６５５,５７８号に開示されたＢＭＰ−１、第７２０,５
９０号に開示されたＢＭＰ−９,第１７９,１９７号およ
びＰＣＴ公開８９／０１４６４号に開示されたＢＭＰ−
３も興味深い。これらの出願を出典明示により本明細書
の一部とする。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】当該分野においては、
骨および傷の治療の分野で有用な他の蛋白および組成物
が必要とされている。

【０００４】

【課題を解決するための手段】１の態様において本発明
は、１つ目に選択したＢＭＰまたはそのフラグメントお
よび２つ目に選択したＢＭＰまたはそのフラグメントを
コードしているポリクレオチド配列を含む選択宿主細胞
を培養することからなる、組み換え型ヘテロダイマー蛋
白の製法を提供する。得られた同時発現した生物学的に
活性のあるヘテロダイマーを培養基から単離する。本発
明の１の具体例によれば、宿主細胞を、１種またはそれ
以上のＢＭＰのコード配列を有する１種またはそれ以上
のベクターで同時形質転換してもよい。個々のＢＭＰポ
リヌクレオチド配列が、細胞中に導入される同一のベク
ターまたは別々のベクター上に存在していてもよい。別
法として、ＢＭＰまたはそのフラグメントを宿主細胞染
色体中に取り込ませてもよい。さらに、単一の転写単位
が、異なるＢＭＰをコードしている２つの遺伝子の単一
コピーをコードしていてもよい。

【０００５】本発明のもう１つの具体例によれば、２つ
のポリペプチドのコード配列を含む選択宿主細胞は、１
つ目または２つ目のＢＭＰあるいはそれらのフラグメン
トをコードしているポリヌクッレオチド配列で形質転換
され、これを安定に発現できる２種の安定な選択宿主細
胞を融合させることにより得られるハイブリッド細胞系
である。

【０００６】それゆえ、本発明のもう１つの態様におい
て、２つ目のＢＭＰ蛋白またはそのフラグメントと会合
した１つ目のＢＭＰ蛋白またはそのフラグメントからな
る組み換え型ヘテロダイマー蛋白が提供される。ヘテロ
ダイマーを、骨刺激活性により特徴づけてもよい。ヘテ
ロダイマーが、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７ま
たはＢＭＰ−８いずれかの蛋白またはそのフラグメント
と会合したＢＭＰ−２蛋白またはそのフラグメント、あ
るいはＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７またはＢＭ
Ｐ−８いずれかの蛋白またはそのフラグメントと会合し
たＢＭＰ−４蛋白またはそのフラグメントからなってい
てもよい。さらなる具体例において、ヘテロダイマーが
ＢＭＰ−１、ＢＭＰ−３、またはＢＭＰ−４いずれかの
蛋白またはそのフラグメントと会合したＢＭＰ−２蛋白
またはそのフラグメントからなっていてもよい。ＢＭＰ
−４が、ＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２またはそのフラグメン
トと会合したヘテロダイマーの形態であってもよい。さ
らなる具体例が、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７
およびＢＭＰ−８の組み合わせからなるヘテロダイマー
からなっていてもよい。例えば、へテロダイマーが、Ｂ
ＭＰ−６、ＢＭＰ−７またはＢＭＰ−８に会合したＢＭ
Ｐ−５からなっていてもよく、あるいはＢＭＰ−７、ま
たはＢＭＰ−８に会合したＢＭＰ−６からなっていても
よく、もしくはＢＭＰ−８に会合したＢＭＰ−７からな
っていてもよい。これらのへテロダイマーを、選択宿主
細胞で個々の蛋白を同時発現させることにより得て、該
へテロダイマーを培養基から単離してもよい。

【０００７】本発明のさらなる態様として、１つ目のＢ
ＭＰまたはそのフラグメントをコードしている１つ目の
ポリヌクレオチド配列および２つ目のＢＭＰまたはその
フラグメントをコードしている２つ目のポリヌクレオチ
ド配列（これらの配列は、ＢＭＰをへテロダイマーとし
て同時発現されることのできる１つまたはそれ以上の発
現制御系のコントロール下にある）を含む細胞系が提供
される。細胞系を１種またはそれ以上のポリヌクレオチ
ド分子で形質転換してもよい。別法として、細胞系が、
上記細胞融合により作られたハイブリッド細胞系であっ
てもよい。

【０００８】本発明の別の態様は、１つ目の選択ＢＭＰ
またはそのフラグメントをコードしているポリヌクレオ
チド配列および２つ目の選択ＢＭＰまたはそのフラグメ
ントをコードしているポリヌクレオチド配列からなるポ
リヌクレオチド分子またはプラスミドベクターである。
該配列は、個々の蛋白またはフラグメントを同時発現さ
せることのできる少なくとも１つの適当な調節配列の制
御下にある。該分子が、両方の遺伝子のコピーを含む単
一の転写単位または単一遺伝子のコピーをそれぞれに含
む１個以上の転写単位を有していてもよい。

【０００９】本発明のさらに別の態様として、１つ目の
選択ＢＭＰまたはそのフラグメントをコードしているポ
リヌクレオチド配列を有する選択宿主細胞を培養し、２
つ目の選択ＢＭＰまたはそのフラグメントをコードして
いるポリヌクレオチド配列を有する選択宿主細胞を培養
し、個々のモノマー形態のＢＭＰ蛋白を培養基から単離
してモノマー形態の１番目の蛋白とモノマー形態の２番
目の蛋白とを会合させることからなる、骨刺激活性のあ
る組み換え型ダイマーあるいはへテロダイマー蛋白を真
核細胞中で製造する方法が提供される。１つ目の蛋白お
よび２つ目の蛋白は、同じＢＭＰであっても異なるＢＭ
Ｐであってもよい。そして、得られた生物学的に活性の
あるダイマーまたはへテロダイマーを混合物から単離す
る。好ましい細胞はイー・コリ（E.coli）である。

【００１０】したがって、本発明のさらなる態様は、適
当なベクターまたはプラスミド、およびかかる製法にお
いて有用な選択形質転換細胞のみならず、真核細胞中で
生産された組み換え型ＢＭＰダイマーまたはへテロダイ
マーである。さらに本発明の他の態様および利点を、以
下の本発明具体例の詳細な説明に記載する。

【００１１】

【発明の実施の形態】本発明は、組み換え型へテロダイ
マー自体のみならず骨刺激活性を有する組み換え型へテ
ロダイマー蛋白の製法、およびそれらを含有する骨刺激
用または骨治療用組成物を提供する。本明細書全体を通
して、「へテロダイマー」を、少なくとも１個の共有結
合またはジスルフィド結合により会合した２種の異なる
ＢＭＰ蛋白モノマーまたはそれらの活性フラグメントか
らなる生物学的に活性のある蛋白構築物と定義する。２
種のＢＭＰ構成成分間の１〜７個のジスルフィド結合の
存在により本発明へテロダイマーを特徴づけてもよい。

【００１２】それゆえ本発明によれば、本発明の組み換
え型ＢＭＰへテロダイマーの製法は、１つ目の選択ＢＭ
Ｐまたはその生物学的に活性のあるフラグメントをコー
ドしているポリヌクレオチド配列および２つ目の選択Ｂ
ＭＰまたはその生物学的に活性のあるフラグメントをコ
ードしているポリヌクレオチド配列を有する選択宿主細
胞を培養することからなる。同時発現した生物学的に活
性のあるへテロダイマーは、宿主細胞中に生産され、そ
れより分泌され、培養基から単離される。本発明へテロ
ダイマー蛋白の製法の好ましい具体例を、以下に、そし
て後記実施例に詳細に記載する。本発明の好ましい方法
は、既知の遺伝子組換法を包含する（例えば、サムブル
ック（Sambrook）ら,「モレキュラー・クローニング．
ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecular Cloning.A
Laboratory Manual）」第２版,ニューヨークのコールド
・スプリング・ハーバー（Cold Spring Harbor）のコー
ルド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spr
ing Harbor Laboratory）（１９８９年）参照）。しか
しながら、慣用的な化学合成のごとき他の方法も、本発
明へテロダイマーの調製に有用である。

【００１３】本発明方法により得られたＢＭＰへテロダ
イマーは、ホモダイマーとヘテロダイマーの混合物中に
生成される。古典的な蛋白生化学的方法またはへテロダ
イマーを形成するＢＭＰの１つに特異的なアフィニティ
ーカラムのごとき本質的に慣用的な方法により、このホ
モダイマーとヘテロダイマーの混合物を、培養基中の汚
染物質から分離してもよい。さらに、所望ならば、ヘテ
ロダイマーを、混合物中のホモダイマーから分離しても
よい。かかる分離方法により、へテロダイマー種の活性
の明確な測定が可能になる。実施例４は、この目的のた
めに現に用いられる１つの精製方法を示す。好ましく
は、これらの方法により生産される本発明の組み換え型
へテロダイマーが、ヒト・ＢＭＰ−２、ヒト・ＢＭＰ−
４、ヒト・ＢＭＰ−５、ヒト・ＢＭＰ−６、ヒト・ＢＭ
Ｐ−７およびＢＭＰ−８と命名されたＢＭＰを包含する
ものとする。しかしながら、ＢＭＰ−３もまたＢＭＰ−
２と一緒になって活性へテロダイマーを形成することが
わかっている。上で特に示したＢＭＰのみならずこれら
のＢＭＰの他の種も、獣医学、診断または研究用に用い
ることができる。しかしながら、以下に特に示すヒト・
蛋白が、ヒトの医薬用に好ましい。

【００１４】ヒト・ＢＭＰ−２を、Figure１に開示する
アミノ酸配列およびＤＮＡ配列の全配列またはフラグメ
ントを実質的に含んでいることにより特徴づける。さら
にヒト・ＢＭＰ−２を、成熟ＢＭＰ−２サブユニットの
ジスルフィド結合したダイマーまたはホモダイマーとし
て特徴づける。遺伝子組換えにより発現したＢＭＰ−２
サブユニットは、異種のアミノ末端を有する蛋白種を含
んでいる。あるＢＭＰ−２サブユニットを、Figure１
（配列番号：１および２）のアミノ酸＃２４９（Ｓｅ
ｒ）〜＃３９６（Ａｒｇ）からなることによって特徴づ
ける。別のＢＭＰ−２サブユニットを、Figure１のアミ
ノ酸＃２６６（Ｔｈｒ）〜＃３９６（Ａｒｇ）からなる
ことによって特徴づける。さらに別のＢＭＰ−２サブユ
ニットを、Figure１のアミノ酸＃２９６（Ｃｙｓ）〜＃
３９６（Ａｒｇ）からなることによって特徴づける。成
熟ＢＭＰ−２を、Figure１のアミノ酸＃２８３（Ｇｌ
ｎ）〜＃３９６（Ａｒｇ）からなることによって特徴づ
ける。この後者のサブユニットが、実際には、組換法に
よる発現で得られるＢＭＰ−２の最も多い蛋白種である
（Figure１）。しかしながら、得られるある種のＢＭＰ
−２の特性を、培養条件を操作することにより変化させ
てもよい。ＢＭＰ−２が、Figure１の配列において、例
えば＃２４１〜２８０のアミノ酸の欠失および＃２４５
ＡｒｇのＩｌｅへの変化、または他の変化のごとき修飾
を有していてもよい。

【００１５】米国特許第７２１,８４７号（出典明示に
より本明細書の一部とする）に詳細に記載されているよ
うに、Figure１の＃３５６ないし＃１５４３のヌクレオ
チドコード配列からなるＤＮＡ配列で形質転換された細
胞を培養し、一緒に生産される他の蛋白性物質を実質的
に含まない１種またはそれ以上の上記蛋白種を培養基か
ら回収し、精製することにより、ヒト・ＢＭＰ−２を製
造してもよい。ヒト・ＢＭＰ−２蛋白を骨形成誘導能力
により特徴づけてもよい。また、ヒト・ＢＭＰ−２は、
Ｗ２０アッセイにおいてインビトロ活性を有している。
さらにヒト・ＢＭＰ−２を軟骨形成誘導能力により特徴
づけてもよい。さらにヒト・ＢＭＰ−２を上で参照した
出願に記載されたラット・骨形成アッセイにおいて軟骨
および／または骨形成活性を示す能力により特徴づけて
もよい。

【００１６】ヒト・ＢＭＰ−４を、Figure２（配列番
号：３および４）に開示したアミノ酸配列およびＤＮＡ
配列の全配列またはフラグメントを実質的に有すること
により特徴づける。さらにヒト・ＢＭＰ−４を、成熟Ｂ
ＭＰ−４サブユニットのジスルフィド結合したダイマー
およびホモダイマーとして特徴づける。遺伝子組み換え
により発現したＢＭＰ−４サブユニットが、異種のアミ
ノ末端を有する蛋白種を含んでいてもよい。ヒト・ＢＭ
Ｐ−４の成熟サブユニットを、Figure２のアミノ酸＃２
９３（Ｓｅｒ）〜＃４０８（Ｓｅｒ）からなることによ
り特徴づける。ＢＭＰ−４の他のアミノ末端を、Figure
２の配列から選択してもよい。また、さらにアミノまた
はカルボキシ末端で切形された蛋白をはじめとするＢＭ
Ｐ−４の修飾バージョンを、慣用的な変異法により構築
してもよい。

【００１７】上で本明細書の一部とした米国特許出願第
７２１,８４７号に開示されているように、Figure２の
＃４０３から＃１６２６のヌクレオチドコード配列から
なるＤＮＡ配列で形質転換した細胞を培養し、一緒に生
産される他の蛋白性物質を実質的に含まない、Figure２
の＃２９３から＃４０８のアミノ酸配列からなる蛋白を
培養基から回収し、精製することにより、ＢＭＰ−４を
生産してもよい。ＢＭＰ−４蛋白は、骨形成を誘導する
能力がある。ＢＭＰ−４蛋白は、軟骨形成誘導能力があ
る。さらにＢＭＰ−４蛋白を、ラット・骨形成アッセイ
において軟骨および／または骨形成活性を示す能力によ
り特徴づけてもよい。

【００１８】ヒト・ＢＭＰ−７を、Figure３に開示した
アミノ酸配列およびＤＮＡ配列の全配列またはフラグメ
ントを実質的に含むことにより特徴づける。さらにヒト
・ＢＭＰ−７蛋白を、成熟ＢＭＰ−７サブユニットのジ
スルフィド結合したダイマーおよびホモダイマーとして
特徴づける。遺伝子組み換えで発現したＢＭＰ−７サブ
ユニットは、異種のアミノ末端を有する蛋白種を含んで
いる。ヒト・ＢＭＰ−７のある成熟サブユニットを、Fi
gure３（配列番号：５および６）のアミノ酸＃２９３
（Ｓｅｒ）〜＃４３１（Ｈｉｓ）からなることにより特
徴づける。このサブユニットが、ＢＭＰ−７の組換え発
現により最も多く生産される蛋白である。別のＢＭＰ−
７サブユニットを、Figure３のアミノ酸＃３００（Ｓｅ
ｒ）〜＃４３１（Ｈｉｓ）からなることにより特徴づけ
る。さらに別のＢＭＰ−７サブユニットを、Figure３の
アミノ酸＃３１６（Ａｌａ）〜＃４３１（Ｈｉｓ）から
なることにより特徴づける。ＢＭＰ−７の他のアミノ末
端を、Figure３の配列から選択してもよい。同様に、さ
らにＢＭＰ−７のアミノまたはカルボキシ末端を切形し
た蛋白をはじめとする修飾バージョンを、慣用的な変異
法により構築してもよい。

【００１９】上で本明細書の一部とした米国特許出願第
４３８,９１９号に開示されているように、Figure３の
ヌクレオチド＃９７からヌクレオチド＃１３８９のヌク
レオチドコード配列からなるＤＮＡ配列で形質転換した
細胞を培養し、一緒に生産される他の蛋白性物質を実質
的に含まない、Figure３の＃２９３から＃４３１のアミ
ノ酸配列からなる蛋白を培養基から回収し、精製するこ
とにより、ＢＭＰ−７を生産してもよい。これらの蛋白
は、軟骨および／または骨の形成を刺激、促進、あるい
は誘導する能力を有する。

【００２０】ヒト・ＢＭＰ−６を、Figure４のアミノ酸
配列およびＤＮＡ配列の全配列またはフラグメントを含
むことによって特徴づける。さらにヒト・ＢＭＰ−６蛋
白を、成熟ＢＭＰ−６サブユニットのジスルフィド結合
したダイマーとして特徴づける。組換えにより発現した
ＢＭＰ−６サブユニットが、異種のアミノ末端を有する
蛋白種を含んでいてもよい。あるＢＭＰ−６サブユニッ
トを、Figure４（配列番号：７および８）のアミノ酸＃
３７５（Ｓｅｒ）〜＃５１３（Ｈｉｓ）からなることに
より特徴づける。ＢＭＰ−６の他のアミノ末端を、Figu
re４の配列から選択してもよい。さらにアミノまたはカ
ルボキシ末端を切形したＢＭＰ−６の修飾バージョン
を、慣用的変異法により構築してもよい。

【００２１】米国特許出願第４９０,０３３号（出典明
示により本明細書の一部とする）に詳細に記載されてい
るように、Figure４のヌクレオチド＃１６０から＃１６
９８のヌクレオチドコード配列からなるＤＮＡ配列で形
質転換した細胞を培養し、一緒に生産される他の蛋白性
物質を実質的に含まない、Figure４の＃３７５から＃５
１３のアミノ酸配列からなる蛋白を培養基から回収し、
精製することにより、ヒト・ＢＭＰ−６を生産してもよ
い。さらにヒト・ＢＭＰ−６を、ラット・骨形成アッセ
イにおいて軟骨および／または骨形成活性を示す能力に
より特徴づけてもよい。ヒト・ＢＭＰ−５を、Figure５
（配列番号：９および１０）に開示したアミノ酸配列お
よびＤＮＡ配列の全配列またはフラグメントを含むこと
により特徴づける。さらにヒト・ＢＭＰ−５蛋白を、成
熟ＢＭＰ−５サブユニットのジスルフィド結合したダイ
マーとして特徴づける。組換発現したＢＭＰ−５サブユ
ニットが、異種のアミノ末端を有する蛋白種を含んでい
てもよい。あるＢＭＰ−５サブユニットを、Figure５の
アミノ酸＃３２９（Ｓｅｒ）〜＃４５４（Ｈｉｓ）から
なることにより特徴づけてもよい。アミノまたはカルボ
キシ末端を切形したＢＭＰ−５の修飾バージョンを、慣
用的変異法により構築してもよい。

【００２２】米国特許出願第５８８,２２７号（出典明
示により本明細の一部とする）に詳細に記載されている
ように、Figure５のヌクレオチド＃７０１から＃２０６
０のヌクレオチドコード配列からなるＤＮＡ配列で形質
転換した細胞を培養し、一緒に生産される他の蛋白性物
質を実質的に含まない、Figure５の＃３２９から＃４５
４のアミノ酸配列からなる蛋白を培養基から回収し、精
製することにより、ヒト・ＢＭＰ−５を生産してもよ
い。さらにヒト・ＢＭＰ−５を、上で参照した出願に記
載されているラット・骨形成アッセイにおいて軟骨およ
び／または骨形成活性を示す能力により特徴づけてもよ
い。

【００２３】ヒト・ＢＭＰ−８を、Figure６に開示した
アミノ酸配列およびＤＮＡ配列の全配列またはフラグメ
ントを含むことにより特徴づける。さらにヒト・ＢＭＰ
−８蛋白を、成熟ＢＭＰ−８サブユニットのジスルフィ
ド結合したダイマーとして特徴づけてもよい。組換え発
現したＢＭＰ−８サブユニットが、異種のアミノ末端を
有する蛋白種を含んでいてもよい。あるＢＭＰ−配列ま
たはサブユニット配列は、Figure６（配列番号：１１お
よび１２）のアミノ酸＃１４３（Ａｌａ）〜＃２８１
（Ｈｉｓ）からなる。ＢＭＰ−８の他のアミノ末端を、
Figure６の配列から選択してもよい。アミノまたはカル
ボキシ末端を切形したＢＭＰ−８の修飾バージョンを、
慣用的変異法により構築してもよい。

【００２４】米国特許出願第５２５,３５７号（出典明
示により本明細の一部とする）に詳細に記載されている
ように、Figure６のヌクレオチド＃１から＃８５０のヌ
クレオチドコード配列からなるＤＮＡ配列で形質転換し
た細胞を培養し、一緒に生産される他の蛋白性物質を実
質的に含まない、Figure６の＃１４３から＃２８１のア
ミノ酸配列、あるいは異種のＮ−末端を有する同様のア
ミノ酸配列からなる蛋白を培養基から回収し、精製する
ことにより、ヒト・ＢＭＰ−８を生産してもよい。ま
た、アミノ酸＃１４３の前にＭｅｔを挿入した＃１４３
から＃２８１のアミノ酸（Figure６）をコードしている
配列をベクター中に挿入することにより、イー・コリ中
で、このＢＭＰ−８を生産させてもよい。さらにヒト・
ＢＭＰ−８を、ラット・骨形成アッセイにおいて軟骨お
よび／または骨形成活性を示す能力により特徴づけても
よい。

【００２５】未修飾で非還元型の上記それぞれのＢＭＰ
蛋白を、１２％レムリ（Laemmli）ゲル上の約２８ｋＤ
ないし約４０ｋＤの間の範囲の見掛けの分子量により特
徴づけてもよい。後記実施例９記載のラット・骨形成ア
ッセイにおいて骨の刺激または修復活性を示す蛋白ある
いは活性フラグメントを提供する本明細書記載のＤＮＡ
およびアミノ酸配列の類似または修飾バージョンも、本
発明で使用するの適当なＢＭＰに分類される。ただしジ
スルフィド結合に関与する１個またはそれ以上のＣｙｓ
を有する蛋白またはフラグメントを有することが条件で
ある。これらの配列の有用な修飾を、当業者に知られた
遺伝子組換え法により行ってもよい。これらのＢＭＰ配
列は、哺乳動物における生産の際、ホモダイマー（普通
は、異種のＮ末端を有するホモダイマー混合物）として
生産される。イー・コリ中のこれらのＢＭＰ配列から
は、モノマー蛋白種が生産される。

【００２６】したがって、本発明によれば、本発明の１
の組み替え型ヘテロダイマーは、例えば上記成熟ＢＭＰ
−５サブユニットのモノマー部分またはその活性フラグ
メントを含めたヒト・ＢＭＰ−５に１ないし７個までの
共有ジスルフィド結合により結合した、例えば上記成熟
ＢＭＰ−２サブユニットのモノマー部分またはその活性
フラグメントを含めたヒト・ＢＭＰ−２の会合物からな
る。本発明のもう１つの組み換え型ヘテロダイマーは、
例えば上記成熟ＢＭＰ−６サブユニットのモノマー部分
またはその活性フラグメントを含めたヒト・ＢＭＰ−６
に１ないし７個までの共有ジスルフィド結合により結合
した、上記ヒト・ＢＭＰ−２の会合物からなる。本発明
の別の組み換え型ヘテロダイマーは、例えば上記成熟Ｂ
ＭＰ−７サブユニットのモノマー部分またはその活性フ
ラグメントを含めたヒト・ＢＭＰ−７に１ないし７個ま
での共有ジスルフィド結合により結合した、上記ヒト・
ＢＭＰ−２の会合物からなる。本発明のまた別の組み換
え型ヘテロダイマーは、例えば上記成熟ＢＭＰ−８サブ
ユニットのモノマー部分またはその活性フラグメントを
含めたヒト・ＢＭＰ−８に１ないし７個までの共有ジス
ルフィド結合により結合した、上記ヒト・ＢＭＰ−２の
会合物からなる。

【００２７】本発明のさらに別の組み換え型ヘテロダイ
マーは、例えば上記成熟ＢＭＰ−５サブユニットのモノ
マー部分またはその活性フラグメントを含めたヒト・Ｂ
ＭＰ−５に１ないし７個までの共有ジスルフィド結合に
より結合した、例えば上記成熟ＢＭＰ−４サブユニット
のモノマー部分またはその活性フラグメントを含めたヒ
ト・ＢＭＰ−４の会合物からなる。本発明のもう１つの
組み換え型ヘテロダイマーは、１ないし７個までの共有
ジスルフィド結合により、上記ヒト・ＢＭＰ−６に結合
した、上記ヒト・ＢＭＰ−４の会合物からなる。本発明
の別の組み換え型ヘテロダイマーは、１個またはそれ以
上の共有ジスルフィド結合により、上記ヒト・ＢＭＰ−
６に結合した、上記ヒト・ＢＭＰ−４の会合物からな
る。さらにもう１つの本発明の組み換え型ヘテロダイマ
ーは、１個またはそれ以上の共有ジスルフィド結合によ
り、上記ヒト・ＢＭＰ−７に結合した、上記ヒト・ＢＭ
Ｐ−４の会合物からなる。さらに別の本発明組み換え型
ヘテロダイマーは、１個またはそれ以上の共有ジスルフ
ィド結合により、上記ヒト・ＢＭＰ−８に結合した、上
記ヒト・ＢＭＰ−４の会合物からなる。本発明のさらな
る組み換え型ヘテロダイマーは、例えば上記成熟ＢＭＰ
−３サブユニットのモノマー部分またはその活性フラグ
メントを含めたヒト・ＢＭＰ−３に少なくとも１個のジ
スルフィド結合により結合した、例えば上記成熟ＢＭＰ
−２サブユニットのモノマー部分またはその活性フラグ
メントを含めたヒト・ＢＭＰ−２の会合物からなる。本
発明の別の組み換え型へテロダイマーは例えば上記成熟
ＢＭＰ−４サブユニットのモノマー部分またはその活性
フラグメントを含めたヒト・ＢＭＰ−４に少なくとも１
個のジスルフィド結合により結合した、上記ヒト・ＢＭ
Ｐ−２の会合物からなる。本発明もう１つの組み換え型
へテロダイマーは、例えば上記成熟ＢＭＰ−６サブユニ
ットのモノマー部分またはその活性フラグメントを含め
たヒト・ＢＭＰ−６に少なくとも１個のジスルフィド結
合により結合した、上記ヒト・ＢＭＰ−５の会合物から
なる。本発明の別の組み換え型へテロダイマーは、例え
ば上記成熟ＢＭＰ−７サブユニットのモノマー部分また
はその活性フラグメントを含めたヒト・ＢＭＰ−７に少
なくとも１個のジスルフィド結合により結合した、上記
ヒト・ＢＭＰ−５の会合物からなる。さらに、少なくと
も１個のジスルフィド結合により、ヒト・ＢＭＰ−５
が、ヒト・ＢＭＰ−８サブユニットまたはその活性フラ
グメントに結合していてもよい。

【００２８】本発明のさらにもう１つの組み換え型へテ
ロダイマーは、少なくとも１個のジスルフィド結合によ
り、上記ヒト・ＢＭＰ−７に結合した、例えば上記成熟
ＢＭＰ−６サブユニットのモノマー部分またはその活性
フラグメントを含めたヒト・ＢＭＰ−６の会合物からな
る。本発明の別の組み換え型へテロダイマーは、１個ま
たはそれ以上の共有またはジスルフィド結合により、上
記ヒト・ＢＭＰ−８に結合した上記ヒト・ＢＭＰ−６の
会合物からなる。本発明のもう１つの組み換え型へテロ
ダイマーは、１個またはそれ以上の共有またはジスルフ
ィド結合により、上記ヒト・ＢＭＰ−８に結合した上記
ヒト・ＢＭＰ−７の会合物からなる。

【００２９】ＢＭＰのモノマー構成成分間に形成された
ジスルフィド結合が、各モノマー構成成分上の１個のＣ
ｙｓ間で形成されてもよい。ジスルフィド結合が、各Ｂ
ＭＰ上の２個のＣｙｓ間で形成されてもよい。ジスルフ
ィド結合が、各ＢＭＰ上の３個のＣｙｓ間で形成されて
もよい。ジスルフィド結合が、各ＢＭＰ上の４個のＣｙ
ｓ間で形成されてもよい。ジスルフィド結合が、各ＢＭ
Ｐ上の５個のＣｙｓ間で形成されてもよい。ジスルフィ
ド結合が、各ＢＭＰ上の６個のＣｙｓ間で形成されても
よい。ジスルフィド結合が、各ＢＭＰ上の７個のＣｙｓ
間で形成されてもよい。これらのジスルフィド結合が、
各ＢＭＰ上の隣接したＣｙｓ間または個々の蛋白配列中
に散在する選択されたＣｙｓのみの間で形成されてもよ
い。同じＢＭＰ構成成分を有する種々のへテロダイマー
が、異なる数のジスルフィド結合で形成されてもよい。
同じＢＭＰ成分を有する種々のへテロダイマーが、異な
るＣｙｓの位置におけるジスルフィド結合で形成されて
もよい。本発明に包含される同じＢＭＰ成分を有する異
なるへテロダイマーが、哺乳動物細胞、細菌細胞、昆虫
細胞または酵母細胞における組換え生産に起因して異な
っていてもよい。

【００３０】これらの組み換え型へテロダイマーを、個
々のＢＭＰホモダイマー（その構成成分の１つがそれぞ
れのへテロダイマーを形成する）と比較するＷ２０マウ
ス・基質細胞系アッセイ（実施例８）におけるアルカリ
ホスファターゼの上昇により特徴づけてもよい。さら
に、これらのへテロダイマーを、Ｗ２０バイオアッセイ
における、個々のＢＭＰダイマーの単なる混合物よりも
高い活性により特徴づけてもよい。Ｗ２０バイオアッセ
イで調べられるへテロダイマーの予備的特徴により、Ｂ
ＭＰ−５、ＢＭＰ−６またはＢＭＰ−７とＢＭＰ−２と
のへテロダイマーは非常に活性が高いことが示された。
同様に、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６またはＢＭＰ−７とＢ
ＭＰ−４とのへテロダイマーもＷ２０バイオアッセイに
おいて活性が高い。

【００３１】本発明へテロダイマーを、骨成長および刺
激アッセイにおける活性により特徴づけてもよい。例え
ば、本発明へテロダイマーは、実施例９記載のラット・
骨形成アッセイにおいても活性がある。本発明へテロダ
イマーは、実施例８記載のオステオカルシンのバイオア
ッセイにおいても活性がある。本発明へテロダイマーの
他の特徴は、ウェスタンブロット、高速液体クロマトグ
ラフィー（ＨＰＬＣ）および２次元ゲル（還元条件下お
よび非還元条件下）のみならず、２種の異なる構成成分
ＢＭＰに対する抗ＢＭＰ抗体との共沈も包含される。

【００３２】ＢＭＰへテロダイマーを製造する本発明方
法の１の具体例は、適当な細胞系を培養し、既知調節配
列の調節下で、１つ目のＢＭＰまたはそのフラグメント
をコードしているＤＮＡ配列と２つ目のＢＭＰまたはそ
のフラグメントをコードしているＤＮＡ配列とで同時形
質転換させることを包含する。該形質転換した宿主細胞
を培養し、へテロダイマー蛋白を回収し、ついで培養基
から精製する。現在のところ本発明へテロダイマーの好
ましい発現法であるこの方法のもう１つの具体例におい
て、例えばＣＨＯ ＤＵＫＸ細胞のごとき単一宿主細胞
を、１のＢＭＰをコードしているＤＮＡ配列を含むＤＮ
Ａ分子と、次に選択されたＢＭＰをコードしているＤＮ
Ａ配列を含むＤＮＡ分子とで同時トランスフェクション
する。一方または両方のプラスミドは、ＢＭＰを発現す
る適当な細胞系を確立するのに用いることができる選択
マーカーを有している。別々のＢＭＰ遺伝子を別々の転
写単位上に含むこれらの別々のプラスミドを混合し、慣
用的プロトコールを用いてＣＨＯ細胞にトランスフェク
ションさせる。Ｗ２０アッセイにおいて活性を最大に発
現させるプラスミドの割合（通常１：１）を調べる。

【００３３】例えば、実施例３に詳述するように、リン
酸カルシウム共沈およびトランスフェクション、エレク
トロポーレーション、マイクロインジェクション、プロ
トプラスト融合またはリポフェクションによって、等し
い割合の、１つ目のＢＭＰおよびジヒドロ葉酸レダクタ
ーゼ（ＤＨＦＲ）マーカー遺伝子を含むプラスミドと、
２つ目のＢＭＰおよびＤＨＦＲマーカーを含むプラスミ
ドとを、ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞であるＤＵＫＸ−ＢＩ
Ｉに同時導入できる。それぞれのＤＨＦＲ発現形質転換
体を、慣用的手段により透析した子ウシ・胎児血清を含
むアルファ培地での増殖に関して選択する。遺伝子コピ
ーの増加したＤＨＦＲ^＋細胞を、メトトレキセート（Ｍ
ＸＴ）濃度を増加させていった場合（例えば段階的に
０.０２、０.１、０.５および２.０μＭ ＭＸＴ）の増
殖に関して選択できる（カウフマン（Kaufman）および
シャープ（Sharp）,ジャーナル・オブ・モレキュラー・
バイオロジー（J.Mol.Biol.）第１５９巻：６０１〜６
２９頁（１９８２年）；およびカウフマンら,モレキュ
ラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Mol.Cell.Bio
l.）第５巻：１７５０頁（１９８３年）の方法によ
る）。ＤＨＦＲに結合したへテロダイマーまたは少なく
とも１種のＢＭＰの発現は、ＭＴＸ耐性レベルの上昇に
伴い増加するはずである。ＢＭＰ／ＤＨＦＲ遺伝子のい
ずれかまたは両方を安定に発現する細胞が生き残るであ
ろう。いかに高頻度であっても、細胞系は、両方のプラ
スミド（最初のトランスフェクションの間存在してい
た）を安定に取り込み、発現する。その後、調整培地か
ら収穫を行い、へテロダイマーを慣用的方法により単離
し、活性測定する。このアプローチ法を、ＤＨＦＲ欠損
細胞に用いることができる。

【００３４】本法の別の具体例としては、１の選択ＢＭ
Ｐ遺伝子を含んでいるＤＮＡ分子を、すでに別の選択さ
れたＢＭＰ遺伝子を発現するようになっている細胞系に
トランスフェクションさせてもよい。例えば後記実施例
３に詳述するように、ＢＭＰ−７を発現する安定なＣＨ
Ｏ細胞系（ＤＨＦＲマーカーを有する）［ジェネティク
ス・インスティチュート,インク（Genetics Institute,
Inc）］を、ＢＭＰ−２および２番目の選択マーカー遺
伝子（例えばネオマイシン耐性（Ｎｅｏ））を含むプラ
スミドでトランスフェクションしてもよい。トランスフ
ェクション後、細胞を培養し、ＭＴＸおよび抗生物質Ｇ
−４１８で処理することにより適当な細胞を選択する。
ついで、生き残った細胞を、へテロダイマーの発現に関
してスクリーニングる。この発現系は、単一ステップで
の選択ができるという利点を有している。

【００３５】異なる細胞系または異なるマーカーを用い
る別の２段階選択法も使用できる。例えば、アデノシン
デアミナーゼ（ＡＤＡ）マーカーを用いて、ＤＨＦＲマ
ーカーと一緒に異なるＢＭＰを発現する安定なＣＨＯ細
胞系における２つ目のＢＭＰ遺伝子を増幅することは好
ましいといえる。なぜならば、デオキシコホルマイシン
（ＤＣＦ）による遺伝子増幅を用いて発現レベルを増加
させることができるからである（実施例１記載のＡＤＡ
を含むプラスミド参照）。別法として、最初にこのマー
カーを用いて細胞系を作り、ついで、異なるマーカーを
含むベクターに対してレシピエントな状態にし、２重の
耐性およびＢＭＰ同時発現に関して選択することができ
る。

【００３６】本発明のへテロダイマーを発現させる方法
のさらに別の具体例は、単一の転写単位上または別々の
転写単位上いずれかの上にある発現に関する複数の遺伝
子をコードしている単一のＤＮＡ分子で宿主細胞をトレ
ンスフェクションすることを包含する。多シストロン発
現は、例えばＥＭＣウィルス、ポリオウィルスまたは他
の慣用的なリーダー配列の源に由来するリーダー配列の
ごときリーダー配列を用いてベクターから有効に翻訳さ
れうる単一の転写単位中にコードされている複数のポリ
ペプチドを含む。２個のＢＭＰ遺伝子および選択マーカ
ーは、単一の転写単位中で発現されうる。例えば、ＢＭ
Ｐｘ−ＥＭＣ−ＢＭＰｙ−ＤＨＦＲまたはＢＭＰｘ−Ｅ
ＭＣ−ＢＭＰｙ−ＥＭＣ−ＤＨＦＲの配置を含むベクタ
ーをＣＨＯ細胞中へトランスフェクションさせ、ＤＨＦ
Ｒマーカーを用いて選択し、増幅する。２種の異なるＢ
ＭＰ、１種またはそれ以上のマーカー遺伝子および適当
なリーダーあるいは調節配列を単一転写単位上に有する
プラスミドを構築してもよい。

【００３７】同様に、各ＢＭＰに関する別々の転写単位
を含む単一のプラスミドで宿主細胞をトランスフェクシ
ョンしてもよい。例えば、ＤＨＦＲのごとき選択マーカ
ーが、別の転写単位上に含まれていてもよく、あるいは
ＢＭＰ遺伝子の一方または両方の上の２番目のシストロ
ンとして含まれていてもよい。へテロダイマーを発現さ
せるために、これらのプラスミドを、選択宿主細胞中に
トランスフェクションさせ、へテロダイマーを該細胞ま
たは培養基から上記のごとく単離してもよい。

【００３８】この発現法の別の具体例は細胞融合を包含
する。実施例１および本明細書の一部とした前記米国出
願に記載されているように、ＤＨＦＲ／ＭＸＴ遺伝子増
幅システムおよび高レベルのＢＭＰ発現系を用いて開発
された、選択ＢＭＰを発現する２種の安定な細胞系（例
えばＢＭＰ−２を発現する細胞系（例２ＥＧ５）および
ＢＭＰ−７を発現する細胞系（例７ＭＢ９））を、数個
の優勢なマーカー遺伝子のうちの１つ（例えばｎｅ
ｏ^ｒ、ヒグロマイシン^ｒ、ＧＰＴ）でトランスフェクシ
ョンすることができる。同時培養において十分な時間
（約１日）経過後、得られた１種のＢＭＰおよび１つの
優勢なマーカーを発現する細胞系を、ポリエチレングリ
コール、センダイウィルスあるいは他の知られた試薬の
ごとき融合剤を用いて別のＢＭＰおよび好ましくは別の
マーカーを発現する細胞系と融合させることができる。

【００３９】得られた優勢マーカーおよびＤＨＦＲを発
現する細胞ハイブリッドを、適当な培養条件を用いて選
択し、ＢＭＰまたはそれらのフラグメントの同時発現に
関してスクリーニングする。選択されたハイブリッド細
胞は、両方の選択ＢＭＰをコードしている配列を含んで
おり、細胞中にへテロダイマーが生成され、ついで分泌
される。へテロダイマーを調整培地から得、慣用的方法
（実施例４参照）により、そこから単離、精製する。得
られたへテロダイマーを本明細書記載の方法により特徴
づけてもよい。

【００４０】上記アプローチにより得られた細胞系を用
いて、同時発現されるへテロダイマーＢＭＰポリペプチ
ドを生産することができる。慣用的精製法により、宿主
細胞中に存在する他の夾雑物質のみならず同時生産され
る他の蛋白が実質的にない該へテロダイマー蛋白を細胞
培養物から単離する。実際上好ましい生産方法は、ＣＨ
Ｏ細胞中への異なるベクターの同時トランスフェクショ
ンおよびメトトレキセートによる遺伝子増幅である。安
定な細胞系を用いて組み換え型ＢＭＰを含有する調整培
地を得、該組み換え型ＢＭＰを精製し、インビトロおよ
びインビボ活性を測定する。例えば、本明細書記載のい
ずれかの方法により得られたへテロダイマー生産細胞
を、実施例８および９記載の分析による活性、ＲＮＡ発
現、およびドデシル硫酸ナトリウムゲル電気泳動（ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ）による蛋白発現に関してスクリーニング
する。

【００４１】本発明のへテロダイマーを同時発現させる
上記方法は、宿主細胞または細胞系を用いる。適当な細
胞は、好ましくは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨ
Ｏ）細胞のごとき哺乳動物細胞を含む。適当な宿主細胞
の選択および形質転換、培養、増幅、スクリーニングな
らびに生成物の生産と精製に関する方法は、当該分野に
おいて公知である。例えば、ゲシング（Gething）およ
びサムブルック（Sambrook）,ネイチャー（Nature）第
２９３巻：６２０〜６２５頁（１９８１年）、あるいは
カウフマンら,モレキュラー・アンド・セルラー・バイ
オロジー,第５巻第７号：１７５０〜１７５９頁（１９
８５年）、またはハウリー（Howley）らの米国特許第
４,４１９,４４６号参照。他の適当な哺乳動物細胞系
は、ＣＶ−１細胞系、ＢＨＫ細胞系および２９３細胞系
である。サル・ＣＯＳ−１細胞系は、現在のところＢＭ
Ｐへテロダイマー生産には不適と考えられている。

【００４２】当業者に知られた多くの酵母細胞も、本発
明ポリペプチド発現宿主細胞として利用できる(例え
ば、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerev
isiae))。さらに、所望ならば、昆虫細胞を、本発明方
法に用いることができる。例えば、ミラー（Miller）
ら,ジェネティック・エンジニアリング（Genetic Engin
eering）第８巻：２７７〜２９８頁（プレナム・プレス
（Plenum Press）１９８６年）およびそこに引用されて
いる文献参照。本発明の生物学的に活性のあるへテロダ
イマー蛋白を生産する別の方法を、宿主細胞が微生物細
胞、好ましくは、細菌細胞、詳細にはイー・コリである
場合に用いてもよい。例えば、種々のイー・コリ株（例
えばＨＢ１０１、ＭＣ１０６１）が、バイオテクノロジ
ーの分野では宿主細胞としてよく知られている。ビー・
ズブチリス（B.subtilis）、シュードモナス（Pseudomo
nas）、他のバチルス等の種々の株も本発明に使用でき
る。

【００４３】モノマーおよびダイマー（ホモダイマーお
よびへテロダイマーの両方）を生産するために用いられ
てもよいこの方法は、欧州特許出願第４３３,２２５号
（出典明示により本明細書の一部とする）に記載されて
いる。簡単に説明すると、この方法は、蛋白発現を可能
にする発現調節配列に対する正当なリーディングフレー
ムに連結された所望のＢＭＰ蛋白をコードしているヌク
レオチド配列を有する微生物宿主を培養し、モノマー型
の可溶性蛋白を回収することを包含する。宿主細胞中で
蛋白が不溶性である場合、該水不溶性蛋白画分を宿主細
胞から単離し、ついで蛋白を可溶化させる。クロマトグ
ラフィー精製の後、可溶化した蛋白を選択された条件に
付して生物学的に活性のある該蛋白のダイマー配置を得
る。本発明のへテロダイマーを生産するのに用いられて
もよいこの方法を、ＢＭＰ−２ホモダイマーの生産に関
して、特に実施例７に記載してある。

【００４４】本発明のもう１つの態様は、これらの組み
換え型へテロダイマーの発現に用いるＤＮＡ分子または
プラスミドベクターを提供する。これらのプラスミドベ
クターを、当業者に知られた方法および利用可能なエレ
メントを用いて構築してもよい。一般的には、本発明方
法に有用なベクターを得るためには、所望のＢＭＰをコ
ードしているＤＮＡを、選択した宿主細胞に適する１個
またはそれ以上の適当な発現ベクター中に導入する。哺
乳動物細胞において有効ないかなる発現ベクターを用い
ても、哺乳動物細胞中で本発明組み換え型へテロダイマ
ーを生産させることができると現在考えられている。好
ましくは、ベクターが、上記し、図示した選択ＢＭＰの
ＤＮＡ配列を含んでおり、選択されたへテロダイマーの
構成成分をコードしているものとする。別法として、上
で参照した特許出願記載の、修飾配列を取り込んだベク
ターもまた本発明の具体例であり、ベクターの構築に有
用である。

【００４５】実施例１記載の特定のベクター以外に、当
業者は、Figure１〜６の配列またはFigure１〜６のコー
ド配列（配列番号：１、３、５、７、９および１１）を
含む他のＤＮＡ配列、あるいは他の修飾配列およびｐＣ
Ｄ［オカヤマ（Okayama）ら,モレキュラー・アンド・セ
ルラー・バイオロジー第２巻：１６１〜１７０頁(１９
８２年)］ならびにｐＪＬ３、ｐＪＬ４[ゴフ（Gough）
ら,エムボー・ジャーナル（EMBO J.）第４巻：６４５〜
６５３頁(１９８５年)］のごとき既知ベクターを用いる
ことにより、哺乳動物発現ベクターを構築できる。コー
ド領域の５'および３'末端の非コードヌクレオチドを除
去することにより、ＢＭＰのＤＮＡ配列を修飾できる。
なくなった非コード領域を、発現に有益であることが知
られている他の配列で置き換えても、置き換えなくても
よい。上記の適当な宿主細胞中へのこれらのベクターの
形質転換により、所望のへテロダイマーを得ることがで
きる。

【００４６】当業者ならば、コード配列の横にある哺乳
動物の調節配列を除去、あるいは例えば酵母または昆虫
の調節配列と置換することにより、Figure１〜６の配列
を処理して酵母または昆虫細胞による細胞内もしくは細
胞外発現用ベクターを作ることができよう［昆虫細胞に
おける発現については、例えば欧州特許出願第１５５,
４７６号記載の方法を、酵母細胞における発現について
はＰＣＴ出願公開ＷＯ８６／００６３９号および欧州特
許出願ＥＰＡ１２３,２８９号記載の方法を参照］。同
様に、細菌の配列および好ましいコドンを、記載、例示
した哺乳動物ベクターの代わりに用いて上記方法のＢＭ
Ｐモノマーの生産に用いる適当な発現系を構築してもよ
い。例えば、コード配列をさらに処理することができる
（例えば、他の既知リンカーに連結、あるいはそこから
非コード領域を除去、またはその中のヌクレオチドを他
の既知方法により変更）。ついで、ティー・タニグチ
（T.Taniguchi）ら,プロシーディングス・オブ・ナショ
ナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ
（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）第７７巻：５２３０〜５２
３３頁（１９８０年）記載のごとき方法を用いて、修飾
されたＢＭＰコード配列を既知ベクター中に挿入でき
る。ついで、典型的な細菌ベクターで細菌宿主細胞を形
質転換させ、そのことによりＢＭＰへテロダイマーを発
現させる。典型的な微生物用（例えば細菌用）発現ベク
ターを後記実施例７に記載する。

【００４７】本発明方法に有用な他のベクターが、単一
の転写単位中に複数の遺伝子を含んでいてもよい。例え
ば、提案されたプラスミドｐ７Ｅ２Ｄが、ＢＭＰ−７遺
伝子、そのうしろにＥＭＣリーダー配列、そのうしろに
ＢＭＰ−２遺伝子、そのうしろにＤＨＦＲマーカー遺伝
子を含んでいてもよい。別の例はプラスミドｐ７Ｅ２Ｅ
Ｄであり、これはＢＭＰ−７遺伝子、ＥＭＣリーダー、
ＢＭＰ−２遺伝子、もう１つのＥＭＣリーダー配列およ
びＤＨＦＲマーカー遺伝子を含んでいる。別法として、
ベクターが、１個以上の転写単位を含んでいてもよい。
一例として、プラスミドｐ２ＥＤ７ＥＤは、ＢＭＰ−２
に関する転写単位およびＢＭＰ−７に関する別の転写単
位、すなわちＢＭＰ−２−ＥＭＣ−ＤＨＦＲおよびＢＭ
Ｐ−７−ＥＭＣ−ＤＨＦＲを含んでいる。別法として、
プラスミド上の個々の転写単位が異なるマーカー遺伝子
を含んでいてもよい。例えば、プラスミドｐ２ＥＮ７Ｅ
Ｄは、ＢＭＰ−２−ＥＭＣ−ＮｅｏおよびＢＭＰ−７−
ＥＭＣ−ＤＨＦＲを含んでいる。 さらにまた、ベクタ
ーが、選択宿主細胞における複製およびＢＭＰ発現を支
配できる適当な発現調節配列を含んでいる。かかるベク
ターにとり有用な調節配列は当業者に知られており、選
択宿主細胞に応じて選択できる。かかる選択はよく行わ
れることであって、本発明の一部ではない。同様に、ベ
クターが、１種またはそれ以上の選択マーカー（例えば
抗生物質耐性遺伝子、ＮｅｏまたはＤＨＦＲおよびＡＤ
Ａのような選択可能なマーカーのごときもの）を含んで
いてもよい。目下好ましいマーカーはＤＨＦＲである。
これらの遺伝子は当業者により選択されうる。

【００４８】上記方法のうちの１つによりベクターが発
現した場合、本発明へテロダイマーを、種々のアッセイ
および方法により同定し、特徴づけることができる。へ
テロダイマーを形成している個々のＢＭＰに対する抗体
による共沈（免疫沈降）アッセイを行ってもよい。一般
的には、例えば、選択ＢＭＰ、そのフラグメントまたは
合成ＢＭＰペプチドを抗原として、慣用的手段により、
この用途の抗体を得る。一般的に、アッセイに使用する
抗体は、古典的方法によりウサギに注射された個々のＢ
ＭＰペプチドまたは蛋白から作られる。このアッセイを
慣用的に行い、へテロダイマーの両方のＢＭＰ構成成分
に対する抗体により沈澱するへテロダイマーの同定を行
う。対照的に、当該へテロダイマー生産法において得ら
れるすべてのホモダイマーに対しては、２種の抗体のう
ちの１種のみが沈澱を生じる。

【００４９】特徴づけのためのもう１つのアッセイは、
沈澱を生じる抗体、プローブとなる抗体および検出用抗
体を用いるウエスタンアッセイである。ダイマーを沈澱
させるＢＭＰのうちの１つに対する抗体を用い、ウエス
タン分析用の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でこのアッセイを
慣用的に行ってもよい。２つ目のＢＭＰに対する抗体を
用いてウエスタンゲル上のヘテロダイマーに関する沈澱
を捜し当てる。ついで、セイヨウワサビ・ペルオキシダ
ーゼ（ＨＲＰ）で標識したヤギ・抗ウサギ抗体のごとき
検出用抗体を適用し、へテロダイマーの構成成分のサブ
ユニットの１つの存在を明らかにする。

【００５０】最終的には、へテロダイマーの比活性を、
実施例６記載のごとく定量してもよい。簡単に説明する
と、個々のＢＭＰホモダイマーおよびへテロダイマーの
試料中の個々のＢＭＰ量を、ウエスタンブロット分析ま
たはパルスラベリングおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によ
り定量する。詳細には実施例８記載のごとく、Ｗ２０活
性も測定する。相対的な比活性を次式により計算しても
よい：Ｗ２０アルカリホスファターゼ活性／ウエスタン
ブロットまたはフルオログラフィーによるＢＭＰ量。一
例として、この式をＢＭＰ−２／７へテロダイマーに用
い、該へテロダイマーが、見掛け上ＢＭＰ−２ホモダイ
マーよりも５ないし５０倍高い比活性を有することが示
された。

【００５１】本発明へテロダイマーが、種々の治療上お
よび医薬上の用途（例えば、傷の治療用、組織の修復用
の組成物中に用いられ、また個々のＢＭＰの用途につい
て指示された同様の組成物中に用いられる）を有してい
てもよい。個々のＢＭＰに優るへテロダイマーの増大し
た能力により、単一のＢＭＰのみを含有する組成物の用
量と比較すると、へテロダイマー含有組成物の患者に投
与すべき用量は少量でよい。本発明のへテロダイマー蛋
白は、骨が正常に成長しない環境下における軟骨および
／または骨の成長を誘導し、ヒトや他の動物の骨折およ
び軟骨欠損の治療に適用できる。本発明へテロダイマー
蛋白を用いるかかる調製物には、解放骨折のみならず閉
鎖骨折の減少おける、また人工関節の良い状態での固定
における用途がある。骨形成剤により誘導される骨のデ
ノボ合成は、先天性の、または外傷による、あるいは腫
瘍切除による頭蓋と顔の欠損の修復に貢献し、また美容
整形術にも有用である。

【００５２】本発明のへテロダイマー蛋白を、歯周病お
よびその他の歯の修復法に用いてもよい。かかる薬剤
は、骨形成細胞を引き寄せ、骨形成細胞の成長を刺激
し、あるいは骨形成細胞の前駆細胞の分化を誘導する。
また本発明のへテロダイマーポキペプチドは、骨粗鬆症
の治療にも有用である。種々の骨形成性、軟骨誘導性、
および骨誘導性因子が記載されている。それらを議論す
るには、例えば、欧州特許出願第１４８,１５５号およ
び第１６９,０１６号参照。本発明蛋白を、傷の治療お
よび関連組織の修復に用いてもよい。傷のタイプは、熱
傷、切り傷および潰瘍を含むが、これらに限定しない
（ＰＣＴ公開ＷＯ８４／０１１０６号参照、傷の治療お
よび関連組織の修復について議論するために、出典明示
により本明細書の一部とする）。

【００５３】さらに、本発明蛋白は、神経の生存率を増
加させることができるので、移植および神経の生存率の
低下を示す症状の治療に有用である。それゆえ本発明へ
テロダイマーの有用性の見地からすると、本発明のさら
なる態様は、骨折および軟骨および／または骨の欠損あ
るいは歯周病に関連した他の症状の治療法および治療組
成物である。さらに、本発明は、傷の治療および組織修
復のための治療法ならびに組成物からなる。かかる組成
物は、医薬上許容される賦形剤、担体またはマトリック
スとの混合物となっている治療上有効量の本発明へテロ
ダイマー蛋白からなる。ｐＨ、等張性、安定性等につい
ての正当性を有するかかる生理学上許容される蛋白組成
物は、当該分野の技術的範囲内に属する。

【００５４】本発明の蛋白が、他の関連蛋白および成長
因子と共同して作用することが予想される。それゆえ、
本発明治療法および組成物は、治療に用いる量の少なく
とも１種の他のＢＭＰ蛋白（共有かつ同時出願の前記米
国特許出願に開示）と一緒に治療に用いる量のへテロダ
イマー蛋白からなる。かかる混合物は、個々のＢＭＰ蛋
白分子または本発明の他のへテロ分子からなっていても
よい。

【００５５】さらなる組成物において、本発明へテロダ
イマー蛋白が、骨および／または軟骨欠損、傷または問
題となる組織の治療に有益な他の薬剤と混合されていて
もよい。これらの薬剤には、上皮成長因子（ＥＧＦ）、
血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、腫瘍成長因子（ＴＧ
Ｆ−αおよびＴＧＦ−β）およびインスリン様成長因子
（ＩＧＦ）のごとき種々の成長因子が包含される。ＢＭ
Ｐ蛋白は種特異性を欠くので、該治療組成物は、目下、
獣医用にも価値がある。詳細には、ヒトの他に家畜およ
びサラブレッド馬が、本発明へテロダイマー蛋白でかか
る治療をする対象として望ましい。

【００５６】該治療方法は、移植片または器具による該
組成物の局所的、全身的あるいは局部的投与を包含す
る。投与の際には、本発明で使用する該治療用組成物
は、勿論、発熱原がなく生理学的に許容される形態であ
る。さらに、該組成物を、望ましくは、カプセルに入れ
るか、または粘性のある形態として注入して骨、軟骨あ
るいは組織損傷部位に到達させる。局所的投与は傷の治
療および組織修復に適するであろう。本発明へテロダイ
マー蛋白以外の治療上有用な薬剤を、所望により上記組
成物に含有させてもよく、本発明方法において、別法と
してあるいは付加的に該ＢＭＰ組成物とともに同時また
は連続的に投与してもよい。好ましくは、骨および／ま
たは軟骨形成のためには、該組成物が、骨および／また
は軟骨損傷部位にへテロダイマー蛋白含有組成物を送達
し、骨および軟骨の成長に適した構造を提供し、最適に
体内に再吸収されるマトリックスを含有するものとす
る。かかるマトリックスを、他の体内移植用外用薬に直
ちに使用できる材料形態としてもよい。

【００５７】マトリックス材料の選択を、生体適合性、
生分解性、機械的特性、美容的外観および界面特性に基
づいて行う。へテロダイマーＢＭＰ組成物の特殊な応用
は,適当な処方を決定するであろう。当該組成物に都合
のよいマトリックスは、生分解性であり化学的に性質の
分かっている硫酸カルシウム、りん酸三カルシウム、ヒ
ドロキシアパタイト、ポリ乳酸およびポリ無水物であ
る。他の都合のよい材料は、骨または皮膚コラーゲンの
ごとき生分解性であり生物学的に性質のよく分かってい
るものである。さらに、マトリックスは純粋な蛋白また
は細胞外マトリックス成分からなる。他の都合のよいマ
トリックスは、焼結ヒドロキシアパタイト、バイオグラ
ス、アルミン酸塩あるいは他のセラミックスのごとき非
生分解性であり化学的に性質の分かっているものであ
る。マトリックスが、ポリ乳酸およびヒドロキシアパタ
イト、またはコラーゲンおよびりん酸三カルシウムのご
とき上述したいずれかの形態の材料の混合物からなって
いてもよい。カルシウム−アルミン酸塩−りん酸中のご
とき組成物中においてバイオセラミックスを変更し、孔
のサイズ、粒子のサイズ、粒子の形態および生分解性を
変化させてもよい。

【００５８】１５０ないし８００ミクロンの範囲の直径
の多孔性粒子に形態の乳酸およびグリコール酸の５０：
５０（重量モル）のコポリマーが、本発明に好ましい。
ある適用法においては、カルボキシメチルセルロースま
たは自己由来の血餅のごとき放散防止剤を用いてＢＭＰ
組成物がマトリックスから解離するのを防止するのが便
利である。担当医師は、へテロダイマー蛋白の作用を調
節する種々の因子、例えば、形成されることが望まれる
骨の重量、骨の損傷部位、損傷した骨の状態、傷の大き
さ、損傷組織の形態、患者の年令、性別、食事、何等か
の感染症の重篤性、投薬期間および他の医療上の因子を
考慮したうえで、へテロダイマー蛋白含有組成物の投薬
規則を決定する。再構成に使用するマトリックスの形態
およびへテロダイマー中のＢＭＰ蛋白、医薬組成物中の
何等かの付加的なＢＭＰまたは他の蛋白によっても薬用
量を変更しうる。例えばＩＧＦ−Ｉ（インシュリン様成
長因子Ｉ）のごとき他の知られた成長因子の最終組成物
への添加もまた、薬用量に影響しうる。骨の成長および
／または修復を、例えば、Ｘ線、組織形態的分析および
テトラサイクリン標識のごとき定期的な分析により、経
過をモニターする。以下の実施例は、本発明の説明であ
って、その範囲を限定するものではない。

【００５９】

【実施例】実施例１−ＢＭＰベクターの構築および細胞
系 Ａ. ＢＭＰ−２ベクター 哺乳動物の発現ベクターｐＭＴ２ ＣＸＭは、ｐ９１０
２３［ウォング（Wong）ら，サイエンス（Science）第
２２８巻：８１０〜８１５頁（１９８５年）］の誘導体
であるが、前者は、テトラサイクリン耐性遺伝子（Ｔｅ
ｔ）の代わりにアンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐ）を含
んでおり、さらにｃＤＮＡクローン挿入用にＸｈｏＩ部
位を有していることで後者と異なる。ｐＭＴ２ ＣＸＭ
の機能的エレメントが記載されており［アイール・ジェ
イ・カウフマン（R.J.Kaufman）,プロシーディングス・
オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・
ユーエスエイ（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）第８２巻：６
８９〜６９３頁（１９８５年）参照］、アデノウイルス
ＶＡ遺伝子、７２ｂｐのエンハンサーを含むＳＶ４０複
製開始点、５'スプライシング部位を有するアデノウイ
ルス大後期プロモーター、およびアデノウイルス後期ｍ
ＲＮＡ上に存在するアデノウイルス三分節リーダー配列
の大部分、３'スプライシング受容体部位、ＤＨＦＲ挿
入遺伝子、ＳＶ４０初期ポリアデニル化部位（ＳＶ４
０）、ならびにイー・コリ中で増殖するのに必要なｐＢ
Ｒ３２２配列を含んでいる。

【００６０】ｐＭＴ２−ＶＷＦ（米国メリーランド州ロ
ックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ
ョン（ＡＴＣＣ）に、受託番号ＡＴＣＣ６７１２２のも
と寄託された）を、ＥｃｏＲＩ消化により切形し、ｐＭ
Ｔ２−ＶＷＦ中に存在していたｃＤＮＡ挿入部位を切除
し、線形のｐＭＴ２を得る。プラスミドｐＭＴ２を連結
し、イー・コリＨＢ１０１またはＤＨ−５をアンピシリ
ン耐性に形質転換させるのに用いることができる。プラ
スミドｐＭＴ２ＤＮＡを慣用的方法で調製することがで
きる。ついで、プラスミドｐＭＴ２ ＣＸＭを、ループ
アウト／イン変異法［モリナガ（Morinaga）ら,バイオ
テクノロジー（Biotechnology）第８４巻：６３６頁
（１９８４年）］を用いて構築する。これにより、ＳＶ
４０複製開始点およびｐＭＴ２のエンハンサー配列の近
くのＨｉｎｄIII部位に対して１０７５ないし１１４５
番目の塩基を除去する。さらに、以下の配列： ５'ＰＯ_４−ＣＡＴＧＧＧＣＡＧＣＴＣＧＡＧ−３'
（配列番号：１５） を１１４５番目のヌクレオチド部位に挿入する。この配
列は、制限エンドヌクレアーゼＸｈｏＩ認識部位を含ん
でいる。ｐＭＴ２３と命名したｐＭＴ２誘導体は、制限
エンドヌクレアーゼＰｓｔＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩお
よびＸｈｏＩ認識部位を含んでいる。全長にわたるＢＭ
Ｐ−２ ｃＤＮＡ（Figure１）（配列番号：１）を、Ｅ
ｃｏＲＩ消化によりλＧＴ１０ベクターから切除し、こ
れをｐＳＰ６５［ウィスコンシン州マディソンのプロメ
ガ・バイオテク（Promega Biotech）社製］中に両方向
にサブクローン化し、ｐＢＭＰ−２＃３９−３またはｐ
ＢＭＰ−２＃３９−４を得る。

【００６１】ＢＭＰ−２ ｃＤＮＡの非翻訳領域の大部
分を以下の方法により除去する。ＢＭＰ−２ ｃＤＮＡ
を含むｐＳＰ６５プラスミドをＳａｌＩで消化し、再連
結することにより、アダプター中のＳａｌＩ部位（はじ
めのｃＤＮＡクローニングの時から存在）およびイニシ
エーターＡＴＧから７塩基対上流のＳａｌＩ部位との間
で、５'側の配列を除去する。３'側の非翻訳部位を、オ
リゴヌクレオチド： ＡＧＣＡＡＡＡＴＴ３' （配列番号：１６） を用いるヘテロ二重鎖変異法を用いて除去する。該配列
は、ＢＭＰ−２ ｃＤＮＡの末端３'コード領域とそれ
にすぐに続くＳａｌＩ認識部位を含む。該配列は、終止
（ＴＡＧ）コドンの次にＳａｌＩ部位を有する。

【００６２】このクローンのＳａｌＩフラグメントを、
発現ベクターｐＭＴ２３中にサブクローン化し、ｐＭＴ
２３−ＢＭＰ２ΔＵＴを得る。配列ＰｓｔＩ−ＥｃｏＲ
Ｉ−ＳａｌＩ−ＢＭＰ−２ ｃＤＮＡ−ＳａｌＩ−Ｅｃ
ｏＲＩ−ＸｈｏＩ中のＢＭＰ−２コード領域に制限酵素
切断部位が隣接している。発現プラスミドｐＥＤ４［カ
ウフマンら,ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucl.
Acids Res.）第１９巻：４４８５〜４４９０頁（１９９
１年）］を、ＥｃｏＲＩで消化し、子ウシ・腸ホスファ
ターゼで処理することにより線形にする。ＥｃｏＲＩで
消化することにより、ＢＭＰ−２ ｃＤＮＡ遺伝子をｐ
ＭＴ２３−ＢＭＰ２ΔＵＴから切除し、１.０％低融点
アガロースゲルによる電気泳動により１.２ｋｂのフラ
グメントを回収する。線形にたったｐＥＤ４ベクターと
ＥｃｏＲＩ ＢＭＰ−２フラグメントとを連結し、ＢＭ
Ｐ−２発現プラスミドｐＢＭＰ２Δ−ＥＭＣを得た。も
う１つのベクターｐＢＭＰ−２Δ−ＥＮは、慣用的方法
によりＤＨＦＲ遺伝子がＴｎ５トランスポゾン由来のネ
オマイシン耐性遺伝子で置き換えられていること以外
は、ベクターｐＢＭＰ２Δ−ＥＭＣに含まれるのと同じ
配列を含んでいる。

【００６３】Ｂ. ＢＭＰ４ベクター ３'非翻訳領域が除去されたＢＭＰ−４ ｃＤＮＡ（Fig
ure２（配列番号：３）に示す）を、変異原オリゴヌク
レオチド： ＧＡＡＴＴＣ３' （配列番号：１７） ＥｃｏＲＩを用いるヘテロ二重鎖変異法により調製す
る。これによりＢＭＰ−４ ｃＤＮＡの翻訳終結コドン
に対する３'側のすべての配列が除去され、この終結コ
ドンとベクターのポリリンカー配列が並ぶ。このステッ
プをＳＰ６５ベクター［プロメガ・バイオテク社製］に
おいて行うが、前記ＢＭＰ２ベクターと同様にＢＭＰ−
４ ｃＤＮＡを含んでいるｐＭＴ２誘導体において行っ
てもよい。制限エンドヌクレアーゼＢｓｍＩ（ＢＭＰ−
４ ｃＤＮＡの８番目のコドンを開裂する）を用いて
５'非翻訳領域を切除する。

【００６４】はじめの８つのコドンの再構築を、以下の
オリゴヌクレオチド： ＥｃｏＲＩ イニシエーター
ＢｓｍＩ ５'ＡＡＴＴＣＡＣＣＡＴＧＡＴＴＣＣＴＧＧＴＡＡＣ
ＣＧＡＡＴＧＣＴ３'（配列番号：１８） および ３'ＧＴＧＧＴＡＣＴＡＡＧＧＡＣＣＡＴＴＧＧＣＴＴ
ＡＣ５'（配列番号：１９） を連結することによって行う。これらのオリゴヌクレオ
チドは、ＢｓｍＩで切断されたＢＭＰ−４ ｃＤＮＡに
連結可能なＢｓｍＩ相補的粘着末端を有する二重鎖を形
成する。また該二重鎖は、ＥｃｏＲＩで切断されたベク
ターｐＭＴ２に連結可能なＥｃｏＲＩ相補的粘着末端を
有している。よって、５'および３'非翻訳領域が除去さ
れているが全コード配列を保持しているＢＭＰ−４に対
するｃＤＮＡが、約１.２ｋｂのＥｃｏＲＩ制限フラグ
メント中に含まれる。このＢＭＰ−４配列を含むｐＭＴ
２ ＣＸＭプラスミドをｐＸＭＢＭＰ−４ΔＵＴと命名
する。これをＥｃｏＲＩで消化して該ベクター由来の挿
入フラグメントを含むＢＭＰ−４ ｃＤＮＡを遊離させ
る。この挿入フラグメントを、哺乳動物の発現ベクター
ｐＥＤ４のＥｃｏＲＩ部位中にサブクローン化する。

【００６５】Ｃ. ＢＭＰ−５ベクター Figure５（配列番号：９）の＃６９９ないし＃２０７０
のヌクレオチド由来の配列を含むＢＭＰ−５ ｃＤＮＡ
配列を、以下のごとく特異的に増幅する。オリゴヌクレ
オチドＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣＡＴＣ
ＴＧＡＣＴＧＴＡ（配列番号：２０）およびＴＧＣＣＴ
ＧＣＡＧＴＴＴＡＡＴＡＴＴＡＧＴＧＧＣＡＧＣ（配列
番号：２１）をプライマーとして用いてλ−ＺＡＰクロ
ーンＵ２−１６［ＡＴＣＣ ＃６８１０９］のＢＭＰ−
５挿入フラグメント由来の＃６９９ないし＃２０７０の
ヌクレオチド配列（Figure５）を増幅する。この方法に
より、ヌクレオチド＃６９９のすぐ前にヌクレオチド配
列ＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＣＣＡＣＣ（配列番号：２２）
が、そしてヌクレオチド＃２０７０のすぐ後にヌクレオ
チド配列ＣＴＧＣＡＧＧＣＡが導入される。これらの配
列の付加により、増幅されたＤＮＡフラグメントの両方
の末端にＰｓｔＩ制限エンドヌクレアーゼ部位かでき
る。この方法で得られた増幅ＤＮＡ産物を、制限エンド
ヌクレアーゼＰｓｔＩで消化し、ｐＭＴ２の誘導体であ
るｐＭＴ２１［カウフマン,ヌクレイック・アシッズ・
リサーチ第１９巻：４４８５〜４４９０頁（１９９１
年）］のＰｓｔＩ部位中にサブクローン化する。得られ
たクローンをＨ５／５／ｐＭＴと命名する。

【００６６】Ｈ５／５／ｐＭＴの挿入フラグメントをＰ
ｓｔＩ消化で切除し、プラスミドベクターｐＳＰ６５
（プロメガ・バイオテク社製）のＰｓｔＩ部位中にサブ
クローン化し、プラスミドＢＭＰ５／ＳＰ６を得る。Ｂ
ＭＰ５／ｓｐ６およびＵ２−１６を制限エンドヌクレア
ーゼＮｓｉＩおよびＮｄｅＩで消化してそれらの挿入フ
ラグメントの一部（Figure５の＃７０４から＃１８７６
のヌクレオチドに対応）を切除する。得られた１１７３
個のヌクレオチドからなるクローンＵ１２−１６のＮｓ
ｉＩ−ＮｄｅＩフラグメントを、ＢＭＰ５／ＳＰ６のＮ
ｓｉＩ−ＮｄｅＩ部位（ここから対応する１１７３個の
ヌクレオチドからなるＮｓｉＩ−ＮｄｅＩフラグメント
が除去された）中に連結する。得られたクローンをＢＭ
Ｐ５ｍｉｘ／ＳＰ６５と命名する。ＢＭＰ５ｍｉｘ／Ｓ
Ｐ６５の直接ＤＮＡ配列分析を行って、増幅により得ら
れたヌクレオチド配列のFigure５に示す配列に対する同
一性を確認する。クローンＢＭＰ５ｍｉｘ／ＳＰ６５を
制限エンドヌクレアーゼＰｓｔＩで消化し、Figure５の
ヌクレオチド＃６９９から＃２０７０および上記Ｐｓｔ
Ｉ認識部位を含むさらなる配列からなる挿入フラグメン
トを切除する。得られた１３８２個のヌクレオチドから
なるＰｓｔＩフラグメントを、ｐＭＴ２誘導体であるｐ
ＭＴ２１のＰｓｔＩ部位中にサブクローン化する。この
クローンをＢＭＰ５ｍｉｘ／ｐＭＴ２１＃２と命名す
る。また、同じフラグメントをｐＥＤ４のＰｓｔＩ部位
中にサブクローン化してＢＭＰ５ｍｉｘ−ＥＭＣ−１１
と命名されるベクターを得る。

【００６７】Ｄ. ＢＭＰ−６ベクター Figure４（配列番号：７）のヌクレオチド＃１６０から
＃１７０６のヌクレオチド配列からなるＢＭＰ−６ ｃ
ＤＮＡ配列を、当業者に知られた一連の方法により得
る。クローンＢＭＰ６Ｃ３５[ＡＴＣＣ ６８２４５]を
制限エンドヌクレアーゼＡｐａＩおよびＴａｑＩで消化
し、１４７６個のヌクレオチドからなる挿入フラグメン
トの一部(Figure４のヌクレオチド＃２３１から＃１７
０３からなる)を切除する。１４７６個のヌクレオチド
からなるＢＭＰ−６ ｃＤＮＡ配列のＡｐａＩ−Ｔａｑ
Ｉフラグメントには含まれていない＃１６０から＃２３
０および＃１７０４から＃１７０６に対応するヌクレオ
チドに置き換わるようにＳａｌＩ制限エンドヌクレアー
ゼ部位コンバーターを伴う合成ヌクレオチを設計する。
なくたった配列

【化１】 に置き換わると考えられるオリゴヌクレオチド／Ｓａｌ
Ｉコンバーターを互いにアニーリングする。ついでアニ
リングした５'および３'コンバーターを、上記１４７６
個のヌクレオチドからなるＡｐａＩ−ＴａｑＩに連結
し、Figure４の＃１６０から＃１７０６のヌクレオチド
配列および両方の末端にＳａｌＩ制限エンドヌクレアー
ゼ部位を生じるように工夫された付加的な配列からなる
１５６３個のヌクレオチドからなるフラグメントを得
る。得られた１５６３個のヌクレオチドからなるフラグ
メントを、ｐＳＰ６４［ウィスコンシン州マディソンの
プロメガ・バイオテク社製］のＳａｌＩ部位中にサブク
ローン化する。このクローンをＢＭＰ６／ＳＰ６４＃１
５と命名する。

【００６８】ＢＭＰ６／ＳＰ６４＃１５のＤＮＡ分析を
行い、コンバーターにより置き換わったFigure４に示す
配列に対する５'および３'配列の同一性を確認する。Ｂ
ＭＰ６／ＳＰ６４＃１５の挿入フラグメントを制限エン
ドヌクレアーゼＳａｌＩで消化することにより切除す
る。得られた１５６３個のヌクレオチドからなるＳａｌ
Ｉフラグメントを、ｐＭＴ２１のＸｈｏＩ制限エンドヌ
クレアーゼ部位中にサブクローン化し、ＢＭＰ６／ｐＭ
Ｔ２１と命名する。該プラスミドをＰｓｔＩで消化し、
ｐＥＤ４のＰｓｔＩ部位を以下のコンバーターヌクレオ
チド：５'−ＴＣＧＡＣＡＧＧＣＴＣＧＣＣＴＧＣＡ−
３' （配列番号：２７）および３'−ＧＴＣＣＧＡＧＣ
ＧＧ−５' （配列番号：２８）に連結することによ
り、ＳａｌＩ部位に変換する。上記１５６３個のヌクレ
オチドからなるＳａｌＩフラグメントもｐＥＤ４ベクタ
ーのＳａｌＩ部位中にサブクローン化し、発現ベクター
ＢＭＰ６／ＥＭＣを得る。

【００６９】Ｅ. ＢＭＰ−７ベクター Figure３（配列番号：５）のヌクレオチド＃９７から＃
１４０２のヌクレオチド配列配列からなるＢＭＰ−７配
列を以下のようにして特異的に増幅する。オリゴヌクレ
オチドＣＡＧＧＴＣＧＡＣＣＣＡＣＣＡＴＧＣＡＣＧＴ
ＧＣＧＣＴＣＡ（配列番号：２９）およびＴＣＴＧＴＣ
ＧＡＣＣＴＣＧＧＡＧＧＡＧＣＴＡＧＴＧＧＣ（配列番
号：３０）をプライマーとして用いてクローンＰＥＨ７
−９［ＡＴＣＣ ＃６８１８２］の挿入フラグメント由
来のFigure３の＃９７から＃１４０２のヌクレオチド配
列を増幅する。この方法により、ヌクレオチド＃９７の
すぐ前に配列ＣＡＧＧＴＣＧＡＣＣＣＡＣＣ、そしてヌ
クレオチド＃１４０２のすぐ後にヌクレオチド配列ＧＴ
ＣＧＡＣＡＧＡの挿入フラグメントを生じる。これらの
配列の付加により、増幅されたＤＮＡフラグメントの各
末端にＳａｌＩ制限エンドヌクレアーゼ認識部位を生じ
る。この方法で得られた増幅ＤＮＡ産物を制限エンドヌ
クレアーゼＳａｌＩで消化し、プラスミドベクターｐＳ
Ｐ６４［ウィスコンシン州マディソンのプロメガ・バイ
オテク社製］のＳａｌＩ部位にサブクローン化し、ＢＭ
Ｐ７／ＳＰ６＃２を得る。

【００７０】クローンＢＭＰ７／ＳＰ６＃２およびＰＥ
Ｈ７−９を制限エンドヌクレアーゼＮｃｏＩおよびＳｔ
ｕＩで消化して、Figure３のヌクレオチド＃３６３から
＃１０８１に対応する挿入フラグメント部分を切除す
る。得られた７１９ヌクレオチドからなるＰＥＨ７−９
のＮｃｏＩ−ＳｔｕＩフラグメントを、ＢＭＰ７／ＳＰ
６＃２（これより７１９ヌクレオチドからなるヌクレオ
チドフラグメントが除去されている）のＮｃｏＩ−Ｓｔ
ｕＩ部位中に連結する。得られたクローンをＢＭＰ７ｍ
ｉｘ／ＳＰ６と命名する。ＢＭＰ７ｍｉｘ／ＳＰ６の直
接ＤＮＡ配列決定により、その３'領域の、Figure３の
＃１０８２から＃１４０２のヌクレオチド配列に対する
同一性が確認されるが、５'領域には１個の異なるヌク
レオチドが含まれている。ＰＥＨ７−９を鋳型として用
いるヌクレオチド配列（Figure３の＃９７から＃１４０
２）の増幅を上記のごとく繰り返す。この方法で得られ
た増幅ＤＮＡ産物を制限エンドヌクレアーゼＳａｌＩお
よびＰｓｔＩで消化する。この消化により、Figure３の
ヌクレオチド＃９７から＃８３３および前記ＳａｌＩ制
限エンドヌクレアーゼ認識部位を作るのに用いた５'側
のプライマーオリゴヌクレオチドの付加的配列からなる
７４７個のヌクレオチドからなるフラグメントが切形さ
れる。この７４７個のヌクレオチドからなるＳａｌＩ−
ＰｓｔＩフラグメントを、ＳａｌＩ−ＰｓｔＩ消化した
ｐＳＰ６５［ウィスコンシン州マディソンのプロメガ・
バイオテク社製］ベクター中にサブクローン化し、５'
ＢＭＰ７／ＳＰ６５を得る。ＤＮＡ配列決定により、
５'ＢＭＰ７／ＳＰ６５＃１の挿入部位がFigure３のヌ
クレオチド＃９７から＃３６２と同じ配列からなること
が示される。

【００７１】クローンＢＭＰ７ｍｉｘ／ＳＰ６および
５'ＢＭＰ７／ＳＰ６５を制限エンドヌクレアーゼＳａ
ｌＩおよびＮｃｏＩで消化する。Figure３のヌクレオチ
ド＃３６３から＃１４０２のヌクレオチドからなる得ら
れたＢＭＰ７ｍｉｘ／ＳＰ６の３'ＮｃｏＩ−ＳａｌＩ
フラグメントと、Figure３のヌクレオチド＃９７から＃
３６２からなるＢＭＰ７／ＳＰ６５の５'ＳａｌＩ−Ｎ
ｃｏＩフラグメントとをＮｃｏＩ制限部位で連結して１
３１７個のヌクレオチドフラグメント（Figure３のヌク
レオチド＃９７から＃１４０２からなる１３１７個のヌ
クレオチドフラグメントおよびこのフラグメント（１３
１７個のヌクレオチドフラグメント）の両末端にＳａｌ
Ｉ制限エンドヌクレアーゼ部位を作るための５'および
３'オリゴヌクレオチドプライマー由来の付加的配列か
らなる）を得る。この１３１７個のヌクレオチドからな
るＳａｌＩフラグメントを、ｐＭＴ２由来のｐＭＴ２Ｃ
ｌａ−２のＳａｌＩ部位中に連結する。ｐＭＴ２１をＥ
ｃｏＲＶおよびＸｈｏＩで消化し、この消化したＤＮＡ
をＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメントで処理
し、ついでＣｌａＩリンカー（ネビオ・ラブズ（NEBio
Labs）社製,ＣＡＴＣＧＡＴＧ）を連結することによ
り、ｐＭＴ２Ｃｌａ−２を構築する。これにより、ＳＶ
４０複製開始点近傍のＨｉｎｄIII部位から始まる２１
７１から２４２０番目の塩基およびｐＭＴ２のエンハン
サー配列が除去され、唯一のＣｌａＩ部位が導入される
が、アデノウイルスのＶＡＩ遺伝子はそのまま残る。か
くしてｐＭＴ２Ｃｌａ−２が得られる。このクローンを
ＢＭＰ−７−ｐＭＴ２と命名する。ＢＭＰ−７−ｐＭＴ
２の挿入フラグメントを、制限エンドヌクレアーゼＳａ
ｌＩで消化することにより切除する。得られた１３１７
個のヌクレオチドからなるＳａｌＩフラグメントをｐＭ
Ｔ２１のＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼ部位中にサブ
クローン化してクローンＢＭＰ−７／ｐＭＴ２１を得
る。このＳａｌＩフラグメントもｐＥＤ４ベクター（上
記のごとくＰｓｔＩ部位をＳａｌＩ部位に変換してあ
る）のＳａｌＩ部位中にサブクローン化し、ｐＢＭＰ７
／ＥＭＣ＃４を得る。

【００７２】Ｆ. ＢＭＰ−８ベクター 現在のところ、哺乳動物のＢＭＰ−８ベクターは構築さ
れていない。しかしながら、Figure６（配列番号：１
１）の配列を用いれば、他のＢＭＰについて上記したも
のと同様なベクターを容易に構築できると考えられる。
実施例７に詳述したＢＭＰ−２ベクターと同様な細菌の
発現ベクターを、Figure６のアミノ酸＃２８４の前にＭ
ｅｔを導入することにより構築してもよい。このＢＭＰ
−８配列を、ＢＭＰ−２配列の代わりにベクターｐＡＬ
ＢＰ２−７８１中に挿入する。実施例７参照。

【００７３】Ｇ. アデノシンデアミナーゼ（Ａｄａ）マ
ーカーを有するＢＭＰベクター ＢＭＰ遺伝子をベクターｐＭＴ３ＳＶ２Ａｄａ［アール
・ジェイ・カウフマン,メソッズ・イン・エンザイモロ
ジー（Meth.Enz.）第１８５巻：５３７〜５６６頁（１
９９０年）］中に挿入して、ＢＭＰ ｃＤＮＡ遺伝子お
よび選択マーカー（Ａｄａ）それぞれの転写単位を含む
発現プラスミドを得る。ｐＭＴ３ＳＶ２Ａｄａは、哺乳
動物細胞における遺伝子（例えばＢＭＰ）の挿入および
発現に使用可能なＰｓｔＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩおよ
びＸｂａＩ認識部位を有するポリリンカーを含んでい
る。さらに、該ベクターは、哺乳動物細胞における主要
かつ増幅可能なマーカーとして役立つＡｄａをコードし
ている２番目の転写単位を有している。ＢＭＰ−５、Ｂ
ＭＰ−６、ＢＭＰ−７それぞれの発現ベクターを構築す
るために、同一の一般的方法を用いる。ＢＭＰ−５（Fi
gure５）、６（Figure４）または７（Figure３）に対す
る遺伝子を、ｐＥＤ４ベクターについて本質的に前記し
たポリリンカー中に挿入する。これらのベクターを、Ｃ
ＨＯ ＤＵＫＸ細胞中へのトランスフェクション、つい
で上記Ａｄａマーカーを用いた選択および増幅［カウフ
マンら,プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ（Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA）第８３巻：３１３６〜３１４０頁（１
９８６年）］に用いることができる。各ベクターはＤＨ
ＦＲ遺伝子を含んでおらず、得られる形質転換細胞はＤ
ＨＦＲ陰性のままであるので、ＤＨＦＲと連結された異
なるＢＭＰを含む２番目のベクターでトランスフェクシ
ョンし、メトトレキセートで増幅することができる。別
法として、ｐＭＴ３ＳＶ２Ａｄａ／ＢＭＰベクターを用
いて、安定なＣＨＯ細胞系（前もって異なるＢＭＰ遺伝
子でトランスフェクションしてある）をトランスフェク
ションし、ついでＤＨＦＲ／メトトレキセート系を用い
て増幅することができる。ついで、得られた形質転換体
をＡｄａ系を用いて増幅し、２種の異なるＢＭＰ遺伝子
を同時発現し、ＤＨＦＲおよびＡｄａマーカー双方を用
いて増幅される細胞系を得る。

【００７４】Ｈ. ＢＭＰ−発現哺乳動物細胞系 現在のところ、本発明の組み替え型ホモダイマーおよび
へテロダイマーの製造に用いる最も望ましい細胞系は以
下のものである。上記ベクターを用いる慣用的な形質転
換により、これらの細胞系を調製した。ＢＭＰ−２発現
細胞系２ＥＧ５は、ベクターｐＢＭＰ２ｄｅｌｔａ−Ｅ
ＭＣで安定に形質転換されたＣＨＯ細胞である。ＢＭＰ
−４発現細胞系４Ｅ９は、ベクターｐＢＭＰ４ｄｅｌｔ
ａ−ＥＭＣで安定に形質転換されたＣＨＯ細胞である。
ＢＭＰ−５発現細胞系５Ｅ１０は、ベクターＢＭＰ５ｍ
ｉｘ−ＥＭＣ−１１（増幅レベルは２マイクロモラーの
ＭＸＴ）で安定に形質転換されたＣＨＯ細胞である。Ｂ
ＭＰ−６発現細胞系６ＨＧ８は、ベクターＢＭＰ６／Ｅ
ＭＣで安定に形質転換されたＣＨＯ細胞である。ＢＭＰ
−７発現細胞系７ＭＢ９は、ベクターＢＭＰ７／ｐＭＴ
２１で安定に形質転換されたＣＨＯ細胞である。

【００７５】実施例２−ＢＭＰへテロダイマーの一時的
発現 以下の２つの異なる方法により、実施例８のアッセイの
スクリーニングのための一時的発現系における同時発現
によって本発明へテロダイマーを調製してもよい。１番
目の方法において、実施例１記載のｐＭＴ２由来および
ＥＭＣ由来の発現プラスミドならびに同様にして誘導さ
れたベクター（それぞれＢＭＰ−２からＢＭＰ−７およ
び腫瘍増殖因子（ＴＧＦβ１）をコードしている）を構
築した。すべてのプラスミド対の組み合わせを等しい割
合で混合し、ＤＥＡＥ−デキストラン法［ソムペイラク
（Sompayrac）およびダンナ（Danna）,プロシーディン
グス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエン
シズ・ユーエスエイ第７８巻：７５７５〜７５７８頁
（１９８１年）；ルスマン（Luthman）およびマグヌソ
ン（Magnusson）,ヌクレイック・アシッズ・リサーチ
（Nucl.Acids Res.）第１１巻：１２９５〜１３０８頁
（１９８３年）］を用いるＣＨＯ細胞の同時トランスフ
ェクションに用いた。１０％ウシ胎児血清、アデノシ
ン、デオキシアデノシン、チミジン（各１００μｇ／ｍ
ｌ）、ペニシリン／ストレプトマイシンおよびグルタミ
ン（１ｍＭ）を添加したアルファ最少必須培地（α−Ｍ
ＥＭ）で細胞を増殖させる。

【００７６】ヘパリン、スラミン、デキストラン硫酸の
ごとき化合物の増殖培地への添加は望ましく、ＣＨＯ細
胞調整培地中に存在するＢＭＰ−２の量を増加させる。
同様に、ＢＭＰ−５もかかる化合物に応答する。それゆ
え、これらのＢＭＰ構成成分を含むすべてのへテロダイ
マーのためにこれらの化合物を添加することが考えられ
る。他のＢＭＰも、これらの化合物の効果に応答するか
もしれず、その効果は、成熟ＢＭＰと細胞表面との相互
作用を抑制することであると考えられている。翌日、１
００μｇ／ｍｌヘパリン添加あるいは無添加新鮮培地を
添加した。２４時間後、培養物を収穫した。いくつかの
実験系において、トランスフェクション後２４〜４８時
間のヘパリン無添加培養物を集め、ついで同じプレート
を用いてトランスフェクション後４８〜７２時間のヘパ
リン存在下での培養物を得た。対照系は、ＢＭＰ配列を
欠く発現プラスミドを有する形質転換細胞、ただ１つの
ＢＭＰ配列を含むプラスミドを有する形質転換細胞、ま
たは単一ＢＭＰ形質転換細胞による培養物と異なるＢＭ
Ｐ形質転換細胞による培養物の混合物を含んでいる。

【００７７】粗調整培地中に同時発現された（あるいは
未精製の）へテロダイマーＢＭＰを特徴づけすることに
より、以下の結果を得た。一時的に同時発現したＢＭＰ
を、実施例８記載のＷ２０基質細胞に対するアルカリホ
スファターゼ活性に関してアッセイした。以下に示すよ
うに、ＢＭＰ−２とＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６およびＢＭ
Ｐ−７との同時発現、ＢＭＰ−４とＢＭＰ−５、ＢＭＰ
−６およびＢＭＰ−７との同時発現は、Ｗ２０アッセイ
において、個々のへテロダイマーのみあるいはホモダイ
マー混合物のいずれよりも強いアルカリホスファターゼ
誘導活性を示した。ＢＭＰ−２とＢＭＰ−７が同時発現
した場合に最大活性が得られた。へテロダイマーＢＭＰ
−２／５；ＢＭＰ−２／６；ＢＭＰ−４／５；ＢＭＰ−
４／６およびＢＭＰ−４／７も活性が高かった。

【００７８】

【表１】

【表２】 単位：活性１単位は、１ｎｇ／ｍｌのｒｈＢＭＰ−２に
相当する。 −：アッセイの検出限界以下の活性を示す。

【００７９】ついで、ＣＨＯ細胞の一時的トランスフェ
クションの間、種々の比率の発現プラスミド（９：１、
３：１、１：１、１：３、１：９）を用いてこれらのＢ
ＭＰの組み合わせを発現させた。９：１ないし１：９の
範囲のプラスミド数の比で、ＢＭＰ−２を含むプラスミ
ドとＢＭＰ−７を含むプラスミドとを用いてこの方法を
行い、個々のＢＭＰのプラスミドが大体同数の場合に、
Ｗ２０アッセイにおいて最大活性が得られた。単一のＢ
ＭＰを含むプラスミドでトランスフェクションした宿主
細胞と比較すると、ＢＭＰ−２のＢＭＰ−７に対する比
がそれぞれ３：１ないし１：３の場合にもＷ２０アッセ
イにおける活性が増大した。しかしながら、これら後者
の比較においては１：１の比よりも活性が低かった。Ｂ
ＭＰ−２およびＢＭＰ−７以外からなるへテロダイマー
に関する同様な比率が当業者により決定されうる。例え
ば、ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−６間で形成されるへテロ
ダイマーに関する予備実験により、同時トランスフェク
ションに好ましい比率は３：１であることが示されてい
る。この方法に関する好ましい比率の決定は、当該分野
の技術的範囲内である。同時発現したＢＭＰを一時的に
得るための別法として、それぞれＢＭＰ−２、ＢＭＰ−
４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６およびＢＭＰ−７を発現す
る実施例１で確認された安定なＣＨＯ細胞系を１日間同
時培養し、ついで４６.７％ポリエチレングリコール
（ＰＥＧ）で融合させる。融合１日後、新鮮培地を添加
し、２４時間後にＷ２０アッセイ（実施例８に記載）用
に収穫する。そのアッセイの結果は、実質的に上記結果
と同様であった。それゆえ、ＢＭＰ−５、６または７と
ともに同時発現したＢＭＰ−２または４との組み合わせ
のすべては、いかなる単独ＢＭＰホモダイマーよりも高
い活性を示した。個々のＢＭＰホモダイマーのみが発現
される対照実験および収穫後混合された調整培地におい
ては、活性は常に個々のＢＭＰの中間値であり、同時発
現されたへテロダイマーＢＭＰは、個々に発現されたＢ
ＭＰホモダイマーの組み合わせよりも高い活性を示すこ
とがわかった。

【００８０】実施例３−ＢＭＰへテロダイマーの安定な
発現 Ａ. ＢＭＰ−２／７ 実施例２の一時的な分析の結果に基づき、ＢＭＰ−２お
よびＢＭＰ−７を同時発現する安定な細胞系を作った。
好ましい安定な細胞系２Ｅ７Ｅ−１０を以下のようにし
て得た：プラスミドＤＮＡ（ｐＢＭＰ−７−ＥＭＣおよ
びｐＢＭＰ−２−ＥＭＣの１：１混合物,実施例１に記
載）を、エレクトロポーレーション［ノイマン（Neuma
n）ら,エムボー・ジャーナル第１巻：８４１〜８４５頁
（１９８２年）］によりＣＨＯ細胞中へトランスフェク
ションさせた。２日後、細胞を、１０％透析済みウシ胎
児血清を含み、ヌクレオシド不含選択培地に移した。１
０〜１４日後にＤＨＦＲを発現するコロニーを数えた。
各コロニーまたはコロニーのプールを培養し、標準的方
法を用いて、各へテロダイマーＢＭＰ構成成分のＲＮＡ
および蛋白の発現について分析し、ついでＭＴＸを増加
させた場合の増殖により、その増幅に関して選択を行っ
た。好ましいクローン（２Ｅ７Ｅと命名）の段階的選択
を、ＭＴＸ濃度０．５μＭまで行った。ついで得られた
細胞系を増殖させ、へテロダイマー２／７発現について
アッセイした。かかる分析法には、構成成分のＤＮＡの
存在を検出するウエスタンブロット分析、代謝的に標識
された蛋白の定量およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析、ならび
に部位の異なるラット・骨形成アッセイを用いた軟骨お
よび／または骨形成活性の分析（実施例９）が包含され
る。現在のところ、好ましいクローン的に誘導された細
胞系は２Ｅ７Ｅ−１０であると確認されている。この細
胞系は、０.５μＭ ＭＴＸ含有培地中にＢＭＰ−２／
７へテロダイマー蛋白を分泌する。

【００８１】ＣＨＯ細胞系２Ｅ７Ｅ−１０を、１０％ウ
シ胎児血清を含むダルベッコの改変イーグル培地（Dalb
ecco's modified Eagle's medium）（ＤＭＥＭ）／ハム
の（Ham's）栄養混合物Ｆ−１２の１：１（ｖ／ｖ）混
合培地中で増殖させる。細胞が８０ないし１００％集密
的になった場合、培地を無血清ＤＭＥＭ／Ｆ−１２に置
換する。４日にわたり２４時間おきに培養物を収穫す
る。蛋白生産および精製のために細胞を無血清下で培養
する。同時発現細胞系２Ｅ７Ｅ−１０が、最初は実施例
２記載のＢＭＰ−２発現細胞系２ＥＧ５よりも少量のＢ
ＭＰ蛋白を生産するように見えるが、推定へテロダイマ
ーの比活性が、少なくともＢＭＰ−ホモダイマーの５倍
であることがわかる（実施例６参照）。別のへテロダイ
マー生産細胞を構築するために、安定な細胞系７ＭＢ９
（前もってｐＢＭＰ−７−ｐＭＴ２でトランスフェクシ
ョンされ、ＢＭＰ−７を発現する）を用いる。７ＭＢ９
を増幅し、ＤＨＦＲ／ＭＴＸ系を用いて２μＭメトトレ
キセート耐性により選択する。安定な同時発現細胞系を
得るために、ＢＭＰ−２およびＴｎ５トランスポゾン由
来のネオマイシン耐性遺伝子を含む発現ベクターｐＢＭ
Ｐ−２Δ−ＥＮ（ＥＭＣ−Ｎｅｏ）で、細胞系７ＭＢ９
をトランスフェクションする。得られた形質転換された
安定細胞系を、Ｇ−４１８およびＭＴＸ耐性に関して選
択する。個々のクローンを拾い、前記したようにＢＭＰ
発現について分析する。一時的同時発現により上昇した
活性を示すＢＭＰの他の組み合わせを同時発現する安定
な細胞系は、安定な発現においても同様に高い活性を示
すことが予想される。

【００８２】Ｂ. ＢＭＰ−２／６ 実施例２の一時的アッセイの結果に基づいて、ＢＭＰ−
２およびＢＭＰ−６を同時発現する安定な細胞系を作っ
た。好ましい細胞系１２Ｃ０７を以下のようにして得
た：プラスミドＤＮＡ（ｐＢＭＰ−６−ＥＭＣおよびｐ
ＢＭＰ−２−ＥＭＣの１：３混合物）を、エレクトロポ
ーレーション［ノイマンら,エムボー・ジャーナル第１
巻：８４１〜８４５頁（１９８２年）］によりＣＨＯ細
胞中にトランスフェクションさせた。２日後、細胞を選
択培地（１０％透析済みウシ胎児血清含有、ヌクレオシ
ド不含）に移した。ＤＨＦＲを発現するコロニーを１０
〜１４日後に得た。個々のコロニーあるいはコロニーの
プールを広げ、標準的方法を用いて個々のへテロダイマ
ーＢＭＰ構成成分のＲＮＡおよび蛋白の発現を分析し、
ついでＭＴＸ濃度を増加させて増殖させることにより、
増幅に関して選択した。ＭＴＸ濃度２.０μＭに至るま
で、好ましいクローン（１２−Ｃと命名）の段階的選択
を行った。ついで細胞系を増殖させ、へテロダイマー２
／６発現についてアッセイした。かかるアッセイ方法に
は、構成成分のＤＮＡの存在を検出するウエスタンブロ
ット分析、代謝的に標識された蛋白の定量およびＳＤＳ
−ＰＡＧＥ分析、ならびに部位の異なるラット・骨形成
アッセイを用いた軟骨および／または骨形成活性の分析
（実施例９）が包含される。現在のところ、好ましいク
ローン的に誘導された細胞系は１２Ｃ０７であると確認
されている。この細胞系は、２.０μＭＭＴＸ含有培地
中にＢＭＰ−２／６へテロダイマー蛋白を分泌する。Ｃ
ＨＯ細胞系１２Ｃ０７を、１０％ウシ胎児血清を含むダ
ルベッコの改変イーグル培地（Dalbecco's modified Ea
gle's medium）（ＤＭＥＭ）／ハムの（Ham's）栄養混
合物Ｆ−１２の１：１（ｖ／ｖ）混合培地中で増殖させ
る。細胞が８０ないし１００％集密的になった場合、培
地を無血清ＤＭＥＭ／Ｆ−１２に置換する。４日にわた
り２４時間おきに培養物を収穫する。蛋白生産および精
製のために細胞を無血清下で培養する。同時発現細胞系
１２Ｃ０７が、最初は実施例２記載のＢＭＰ−２発現細
胞系２ＥＧ５よりも少量のＢＭＰ蛋白を生産するように
見えるが、推定へテロダイマーの比活性が、少なくとも
ＢＭＰ−ホモダイマーの３〜５倍であることがわかる
（実施例６参照）。別のへテロダイマー生産細胞を構築
するために、安定な細胞系２ＥＧ５（前もってｐＢＭＰ
−２−ＥＭＣでトランスフェクションされ、ＢＭＰ−２
を発現する）を用いる。２ＥＧ５を増幅し、ＤＨＦＲ／
ＭＴＸ系を用いて２μＭＴＸメトトレキセート耐性によ
り選択する。安定な同時発現細胞系を得るために、ＢＭ
Ｐ−６およびＡＤＡ耐性遺伝子を含む発現ベクターｐＢ
ＭＰ−６−ａｄａ（ａｄａデアミナーゼ）で、細胞系２
ＥＧ５をトランスフェクションする。得られた形質転換
された安定細胞系を、ＤＣＦおよびＭＴＸ耐性に関して
選択する。個々のクローンを拾い、前記したようにＢＭ
Ｐ発現について分析する。一時的同時発現により上昇し
た活性を示すＢＭＰの他の組み合わせを同時発現する安
定な細胞系は、安定な発現においても同様に高い活性を
示すことが予想される。

【００８３】実施例４−ＢＭＰ２／７およびＢＭＰ２／
６へテロダイマーの精製 ＢＭＰ−２／６へテロダイマーおよびＢＭＰ−２／７へ
テロダイマーに関するのと同じ精製法を用いた。組換え
によりＢＭＰへテロダイマー２／７または２／６を生産
するようになった細胞系２Ｅ７Ｅ−１０または１２Ｃ０
７を含む培養物を、付着または懸濁いずれかの培養によ
り得た。同時発現したＢＭＰを小スケールの培養で得る
たまに、付着培養物をローラーボトル中に接種し、１０
％透析済み熱失活ウシ胎児血清［ペンシルバニア州デン
バーのハズレトン（Hazleton）社製］含有アルファ最少
イーグル培地［α−ＭＥＭ,ニューヨークのグランドア
イランド（Grand Island）のギブコ（Gibco）社製］中
で集密的になるまで培養した。ついで培地を無血清、無
アルブミン、低蛋白培地（ダルベッコの改変イーグル培
地およびハムのＦ−１２培地の５０：５０混合物を基礎
とし、所望により１００マイクログラム／ｍｌのデキス
トラン硫酸を補足）に切り替えた。４〜５日間毎日収穫
してプールしておき、組み換え型蛋白の精製に用いた。
上記のごとくローラーボトル培養で得られた培養物を室
温でゆっくりと融解し、プールした。プールした培養物
のｐＨを、１Ｍ Ｔｒｉｓ,ｐＨ８.０を用いて８.０に
合わせた。カラムにマトレックス・セルファイン・サル
フェート(MatrexCellfine Sulfate）［アミコン社製］
を入れ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ,ｐＨ８.０で平衡化した。
培養物の負荷が完了した後、カラムを５０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ、０.４Ｍ ＮａＣｌを含む緩衝液（ｐＨ８.０）で、
２８０ｎｍのベースラインが安定化するまで洗浄した。
ついでカラムを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ,ｐＨ８.０で洗浄し
て緩衝液からＮａＣｌを除去した。ついで樹脂を、５０
ｍＭ Ｔｒｉｓ、０.２Ｍ ＮａＣｌ、４Ｍ尿素（ｐＨ
８.０）で、ピークが溶出するまで洗浄した。ついでカ
ラムを、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ,ｐＨ８.０で洗浄して尿素
を除去した。ついで、結合したＢＭＰ−２/７またはＢ
ＭＰ−２/６を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０.５Ｍ ＮａＣ
ｌ、０.５Ｍアルギニン（ｐＨ８.０）を用いて溶出し
た。溶出液を１つに集め、所望ならばさらなる精製まで
凍結してもよい。このセルファイン・サルフェート溶出
物を、１４倍体積の６Ｍ尿素で希釈し、ついで試料のｐ
Ｈを６.０にした。ヒドロキシアパタイト−ウルトロゲ
ル（Hydroxyapatite-Ultrogel）［アイビーエフ（IBF）
社製］をカラムに注入し、８０ｍＭリン酸カリウム、６
Ｍ尿素（ｐＨ６.０）で平衡化した。

【００８４】試料負荷完了後、べッド体積の１０倍の平
衡化緩衝液で洗浄した。結合しているＢＭＰ−２／７あ
るいはＢＭＰ−２／６へテロダイマーは、ベッド体積の
５倍の１００ｍＭリン酸カリウム、６Ｍ尿素（ｐＨ７.
４）で溶出された。この溶出物を、ビダック（Vydac）
Ｃ_４逆相ＨＰＬＣカラム（水−０.１％ＴＦＡで平衡
化）に直接負荷した。ＢＭＰ−２／７あるいはＢＭＰ−
２／６へテロダイマーを、水−０.１％トリフルオロ酢
酸中３０〜５０％アセトニトリルのグラジエントで溶出
した。ＢＭＰ−含有フラクションを、還元剤の存在また
は不存在下のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した。ホモダ
イマー対へテロダイマーに関するＢＭＰ−の同定を２次
元ＰＡＧＥ（還元剤の存在または不存在下）により行っ
た。へテロダイマー含有フラクションのバンドは２個の
スポットに減少し、ホモダイマーのバンドは各ＢＭＰ種
の１個のスポットに減少した。ＢＭＰ−２／６へテロダ
イマーサブユニットを蛋白シーケネーターで分析した。
以下の種のＢＭＰ−２／６へテロダイマーが存在する：
アミノ酸＃２８３ Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｌｙｓまたは＃２
４９ Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓから始まるＢＭＰ−２サ
ブユニットに結合した、アミノ酸＃３７５ Ｓｅｒ−Ａ
ｌａ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒから始まるＢＭＰ−６サブユニッ
ト。しかしより少量の他の種も存在しうる。本発明のい
かなる組み替え型ＢＭＰについても同一または実質的に
同様な精製法を用いることができると考えられる。本発
明のＢＭＰ−２／７あるいはＢＭＰ−２／６もしくは他
のへテロダイマーに関しては、ハイドロキシアパタイト
−ウルトロゲルカラムが不要であるかもしれず、その場
合、セルファイン・サルフェート溶出物を直接Ｃ_４逆相
ＨＰＬＣカラムに負荷することにより精製スキームを変
更してもよい（ハイドロキシアパタイト−ウルトロゲル
カラムを用いず）。

【００８５】実施例５−蛋白の特徴づけ^３５ Ｓメチオニン標識後、同時発現細胞系から分泌され
る全蛋白をウエスタンブロット分析（例えばＢＭＰ−２
およびＢＭＰ−７のへテロダイマーの両方のＢＭＰに対
する抗体を用いる）により分析する。アルカリホスファ
ターゼのアッセイも一緒に行い、データによりへテロダ
イマーの存在およびその比活性が示される。以下の詳細
な説明は、ＢＭＰ−２／７およびＢＭＰ−２／６へテロ
ダイマーについて集めたデーターに対するものである。
しかしながら、同様の方法を本明細書記載の他のへテロ
ダイマーに適用することにより、同様の結果が得られ
る。

【００８６】Ａ. ^３５Ｓ−Ｍｅｔ標識 ＢＭＰ２Δ−ＥＭＣおよびＢＭＰ７Δ−ＥＭＣ発現ベク
ターの同時トランスフェクションにより誘導された細胞
系に^３５Ｓ−メチオニンを１５分間パルスし、無血清培
地（ヘパリン存在または不存在）で６時間チェイスし
た。ＰＡＧＥおよびフルオログラフィーにより、還元条
件下で全分泌蛋白を分析した。その結果により、いくつ
かの細胞系がＢＭＰ−２およびＢＭＰ−７蛋白を分泌す
ることが示された。アルカリホスファターゼ活性と同時
発現した蛋白量との間には良い相関関係がある。いくつ
かの細胞系は、ＢＭＰ−２のみを分泌する細胞系２ＥＧ
５（１０μｇ／ｍｌのＢＭＰ−２を生産）よりも少量の
ＢＭＰ−２および７を分泌する。細胞系２Ｅ７Ｅ−１０
（０.５ｍＭ ＭＴＸのレベルで増幅）は、細胞系２Ｅ
Ｇ５と同じレベルでＢＭＰ−２およびＢＭＰ−７を等し
い割合で分泌する。細胞系２Ｅ７Ｅ−１０は、ある分析
において６００マイクログラム／ｍｌのＢＭＰ−２ホモ
ダイマー活性に相当する量を生産する。全標識蛋白を２
次元非還元／還元ゲル系で分析してへテロダイマーが生
成しているかどうかを確認した。予備実験結果により、
ＢＭＰ−２のみまたはＢＭＰ−７のみを発現するいずれ
かの細胞系においては見られない独自のスポットがこの
ゲル中に存在することが示され、２／７へテロダイマー
の存在が示唆された。精製物質を用いた同じゲルは、２
／７へテロダイマーの存在を示す同じ結果（ゲル上の２
つの特有のスポット）を示した。組み換え型ＢＭＰ−２
／７の精製とは対照的に、ＢＭＰ−２ホモダイマーはＢ
ＭＰ−２／６調製物中には検出されなかった。しかしな
がら、有意な量のＢＭＰ−６ホモダイマーが見られた。
さらに、有意な量のＮ−末端アミノ酸が２０個切除され
ているＢＭＰ−６が見られた。細胞培養中、プロテアー
ゼインヒビターを添加することにより、この種を除去で
きた。ＢＭＰ−２／６は、Ｃ_４逆相ＨＰＬＣにおいて、
ＢＭＰ−２／７よりも２ないし３フラクション遅れて溶
出することがわかった。主要なＢＭＰ−２／７へテロダ
イマー種が、成熟ＢＭＰ−２サブユニット［アミノ酸＃
２８３（Ｇｌｎ）〜＃３９６（Ａｒｇ）］およびＢＭＰ
−７成熟サブユニット［＃２９３（Ｓｅｒ）〜＃４３１
（Ｈｉｓ）］からなることがアミノ酸配列決定により示
される。ＢＭＰ−２／６へテロダイマーは、成熟ＢＭＰ
−２サブユニット（＃２８３〜３９６）および成熟ＢＭ
Ｐ−６サブユニット［＃３７５（Ｓｅｒ）〜＃５１３
（Ｈｉｓ）］からなっている。

【００８７】Ｂ. ウエスタンブロット分析と組み合わせ
た免疫沈降 ＢＭＰ−２のみ（２ＥＧ５）、ＢＭＰ−７のみ（７ＭＢ
９）または２Ｅ７Ｅ−１０同時発現細胞系による調整培
地を、ＢＭＰ−２またはＢＭＰ−７抗体（いずれもウサ
ギで得た慣用的なポリクローナル抗体）いずれかととも
に免疫沈降反応に付し、ついで抗ＢＭＰ−２または抗Ｂ
ＭＰ−７抗体いずれかをプローブとするウエスタンブロ
ットで分析した。２／７へテロダイマーは沈澱し、ウエ
スタンブロットにおいてＢＭＰ−２およびＢＭＰ−７両
抗体と反応した。一方、いずれのＢＭＰもそれ自身はそ
の特異的抗体と反応するが、相対する抗体とは反応しな
い。 抗ＢＭＰ−７抗体Ｗ３３［マサチューセッツ州ケ
ンブリッジのジェネティクス・インスティチュート,イ
ンク社製］により沈澱し、ウエスタンブロット上で抗Ｂ
ＭＰ−２抗体Ｗ１２またはＷ１０［ジェネティクス・イ
ンスティチュート,インク社製］と反応する、同時発現
細胞系中の蛋白は、ＢＭＰ−２またはＢＭＰ−７のみを
発現する細胞系には存在しないことがこの方法を用いて
示された。この実験により、この蛋白種がへテロダイマ
ー蛋白であることが示される。逆に、Ｗ１２との沈澱お
よびＷ３３でのプローブにおいては同じ結果が得られ
た。

【００８８】実施例６−へテロダイマーの比活性 Ａ. インビトロでのアッセイ 安定な細胞系２Ｅ７Ｅ−１０と２ＥＧ５との、および１
２Ｃ０７と２ＥＧ５との増殖培地中に分泌されるＢＭＰ
−２／７またはＢＭＰ−２／６へテロダイマー、および
ＢＭＰ−２ホモダイマーそれぞれの比活性を以下のごと
く測定した。ウエスタンブロット分析またはＰＡＧＥお
よびフルオロメトリーによる^３５Ｓメチオニン標識細胞
から分泌される蛋白を分析することにより、調整培地中
のＢＭＰ蛋白量を測定した。ついで、同じ細胞系により
Ｗ２０細胞に対して生産されるアルカリホスファターゼ
または骨カルシウム沈着誘導の活性を測定した。増殖培
地中に分泌された蛋白に対する活性の比からＢＭＰ比活
性を計算した。ある実験において、ＰＡＧＥおよびフル
オロメトリーによれば、２Ｅ７Ｅ−１０および２ＥＧ５
は同程度の量の全ＢＭＰ蛋白を分泌した。２Ｅ７Ｅ−１
０は２ＥＧ５の約５０倍のアルカリホスファターゼ誘導
活性を示し、該へテロダイマーの比活性がそのホモダイ
マーの約５０倍であることが示された。別の実験におい
て、２ＥＧ５により分泌されたＢＭＰ−２蛋白量は、２
Ｅ７Ｅ−１０により分泌されたＢＭＰ−２／７よりも約
５０％多かった。しかしながら、２Ｅ７Ｅー１０は、２
ＥＧ５の約１０倍の骨カルシウム沈着誘導活性を示し
た。このタイプのいくつかの異なる実験から、ＢＭＰ−
２／７へテロダイマーの比活性は、ＢＭＰ−２ホモダイ
マーの５ないし５０倍であると評価された。

【００８９】Figure８およびFigure９は、Ｗ２０アルカ
リホスファターゼおよびＢＧＰ（骨Ｇｌａ蛋白,オステ
オカルシン）アッセイにおけるＢＭＰ−２およびＢＭＰ
−２／７の活性の比較である。ＢＭＰ−２／７は比活性
がＢＭＰ−２よりもずっと高い(Figure８)。Figure８か
らわかるように、Ｗ−２０細胞において最大ホスファタ
ーゼ応答の５０％を誘導するには約１.３ｎｇ／ｍｌの
ＢＭＰ−２／７で十分であった。アルカリホスファター
ゼ応答が極大化しないため、ＢＭＰ−２の対応する値は
計算が困難である。しかし最大の半分の応答には３０ｎ
ｇ／ｍｌ以上が必要である。よって、ＢＭＰ−２／７
は、Ｗ−２０アッセイにおいて、ＢＭＰ−２の２０ない
し３０倍の比活性を有する。Figure９からわかるよう
に、この実験においてＢＭＰ−２／７は、ＢＧＰ（骨Ｇ
ｌａ蛋白,骨カルシウム沈着）生成において、ＢＭＰ−
２よりも効果的な刺激剤であった。ＢＭＰ−２／７でＷ
−２０−１７細胞を４日間処理すると６２ｎｇ／ｍｌで
最大ＢＧＰ応答が得られ、１１ｎｇ／ｍｌで最大ＢＧＰ
の５０％が誘発される。対照的に、４６８ｎｇ／ｍｌの
蛋白を与えるまではＢＭＰ−２によるＢＧＰ合成に対す
る最大刺激が見られなかった。Ｗ−２０−１７細胞によ
るＢＧＰ応答を誘発するのに必要なＢＭＰ−２／７の最
少量は３.９ｎｇ／ｍｌであり、ＢＭＰ−２所要量２９
ｎｇ／ｍｌの約７分の１であった。これらの結果は、Ｂ
ＭＰ−２およびＢＭＰ−２／７について得られたＷ−２
０−１７アルカリホスファターゼアッセイにおいて得ら
れたデータと矛盾しなかった。予備分析により、ＢＭＰ
−２／６がインビトロにおいてＢＭＰ−２／７と同等の
比活性を有することが示される。Ｗ−２０におけるＢＭ
Ｐ−２およびＢＭＰ−２／６のアルカリホスファターゼ
誘導能力を比較すると、Figure１２に示すように、この
アッセイ系においては、ＢＭＰ−２／６はＢＭＰ−２よ
りも高い比活性を有している。このデータは、ＢＭＰ−
２およびＢＭＰ−２／６のインビボでのアッセイにより
得られた値とよく一致している。

【００９０】Ｂ. インビボでのアッセイ （ｉ）ＢＭＰ−２／７ 精製ＢＭＰ−２／７およびＢＭＰ−２／７を、ラットの
異なる部位における骨形成アッセイにおいて試験した。
一連の異なる量のＢＭＰ−２／７またはＢＭＰ−２を、
３系並列してラットに移植した。５および１０日後、移
植物を取り出し、骨または軟骨の存在について組織学的
に試験した。新たに形成された軟骨および骨の量につい
ての組織学的スコアを表Ａにまとめてある。

【００９１】

【表３】

【００９２】ラットの異なる部位における軟骨および骨
誘導アッセイに要したＢＭＰ−２／７の量はＢＭＰ−２
よりも少量である。組織学的には、ＢＭＰ−２／７およ
びＢＭＰ−２により誘導された軟骨または骨の外観は同
じである。

【００９３】（ii）ＢＭＰ−２／６ 種々の量のそれぞれのＢＭＰをラットの異なる部位に１
０日間移植することにより、ＢＭＰ−２／６のインビボ
活性をＢＭＰ−２のそれと比較した。この実験結果（表
Ｂ,Figure１３）により、ＢＭＰ−２／７同様ＢＭＰ−
２／６もＢＭＰ−２にと比べてインビボ活性が上昇した
ことが示される。ＢＭＰ−２／７、ＢＭＰ−６およびＢ
ＭＰ−２／６の比活性を、蛋白をラットの異なる部位に
１０日間移植した後比較する。これらの実験結果を表Ｃ
およびFigure１４に示す。ＢＭＰ−２／６は、ＢＭＰ−
２／６またはＢＭＰ−６よりも、強力な骨形成誘導剤で
ある。ＢＭＰ−２／６で観察された骨形成は、等量のＢ
ＭＰ−２／７で観察された結果と比肩しうる。ＢＭＰ−
２／６移植物の外観は、ＢＭＰ−２またはＢＭＰ−２／
７含有移植物の外観と全く同じである。

【００９４】

【表４】

【００９５】

【表５】

【００９６】実施例７−イー・コリにおけるＢＭＰダイ
マーの発現 欧州特許出願第４３３,２５５号の記載をわずかに改変
した方法により、生物学的に活性のあるホモダイマー形
態のＢＭＰ−２をイー・コリ中で発現させた。上記欧州
特許出願中に開示されている他の方法を用いて本発明へ
テロダイマーをイー・コリから生産させてもよい。本発
明へテロダイマーにこれらの方法を適用することは、イ
ー・コリから活性ＢＭＰへテロダイマー蛋白を生産させ
ることを予想させる。

【００９７】Ａ. ＢＭＰ−２発現ベクター ＢＭＰ−遺伝子の成熟部分（配列番号：１４）および以
下に詳述する他の配列を含んでいる発現プラスミドｐＡ
ＬＢＰ−７８１（Figure７）（配列番号：１３）を構築
した。下記のごとく、このプラスミドにより、イー・コ
リ宿主株ＧＩ７２４においてＢＭＰ−２が全蛋白の５〜
１０にまで蓄積した。プラスミドｐＡＬＢＰ−７８１は
以下の基本的特徴を有する。ヌクレオチド１〜２０６０
は、宿主イー・コリにおいて抗生物質アンピシリン耐性
を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子を含むｐＵＣ−１８
由来の配列、およびｃｏｌＥ１由来の複製開始点を含ん
でいる。ヌクレオチド２０６１〜２２２１は、３つのオ
ペレーター配列Ｏ_Ｌ１、Ｏ_Ｌ２およびＯ_Ｌ３を有するバ
クテリオファージλの主要なレフトワードプロモーター
（leftward promotor）（ｐＬ）のＤＮＡ配列［サンガ
ー（Sanger）ら,ジャーナル・オブ・モレキュラー・バ
イオロジー（J.Mol.Biol.）第１６２巻：７２９〜７７
３頁（１９８２年）］を含んでいる。オペレーターはλ
ｃＩリプレッサー蛋白の結合部位であり、その細胞内レ
ベルはｐＬによる転写開始量を制御している。ヌクレオ
チド２２２２〜２７２３は、サンガーら,ジャーナル・
オブ・モレキュラー・バイオロジー第１６２巻：７２９
〜７７３頁（１９８２年）記載のバクテリオファージλ
由来のヌクレオチド３５５６６ないし３５４７２および
３８１３７ないし３８３６１に由来する配列上に含まれ
る強力なリボゾーム結合配列を含んでいる。ヌクレオチ
ド２７２４〜３１３３は、さらに６２ヌクレオチドから
なる３'−非翻訳配列を伴った成熟ＢＭＰ−２をコード
しているＤＮＡ配列を含んでいる。

【００９８】ヌクレオチド３１３４〜３１４９は、制限
エンドヌクレアーゼ部位を有する「リンカー」ＤＮＡを
提供する。ヌクレオチド３１５０〜３２１８は、イー・
コリａｓｐＡ遺伝子の転写終結配列［タカギ（Takagi）
ら,ヌクレイック・アシッズ・リサーチ第１３巻：２０
６３〜２０７４頁（１９８５年）］に基づく転写終結配
列を提供する。ヌクレオチド３２１９〜３６２３はｐＵ
Ｃ−１８由来のＤＮＡ配列である。後記するように、イ
ー・コリ宿主株を適当な条件下で培養した場合、ｐＡＬ
ＢＰ２−７８１により高レベル（全細胞蛋白の約１０
％）のＢＭＰ−２蛋白が生産されうる。ダゲルト（Dage
rt）およびエールリッヒ（Ehrlich）,ジーン（Gene）第
６巻２３頁（１９７９年）の方法により、ｐＡＬＢＰ２
−７８１をイー・コリ宿主株ＧＩ７２４（F,lacI^ｑ,lac
P^Ｌ８,ampC::λcI^＋）中に形質転換した。［形質転換さ
れない宿主株イー・コリＧＩ７２４を、適用可能な法律
および規則に従い、特許目的のために受託番号ＡＴＣＣ
５５１５１の下、１９９１年１月３１日に、メリーラ
ンド州ロックビルのパークローンドライブ１２３０１の
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託
した］形質転換株を、０.５％（ｗ／ｖ）グルコース、
０.２％（ｗ／ｖ）カザミノ酸および１００μｇ／ｍｌ
アンピシリンを補足したＭ９培地［ミラー（Miller）,
「エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティ
クス（Experiments in Molecular Genetics）」,ニュー
ヨークのコールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリ
ー（１９７２年）］からなる１.５％（ｗ／ｖ）寒天プ
レート上で選択した。ＧＩ７２４は、ａｍｐＣの位置の
染色体中に安定に組み込まれた野生型λｃＩリプレッサ
ー遺伝子のコピーを含んでいる。この位置で該遺伝子は
サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonalla typhimuri
um）のｔｒｐプロモータ／オペレーター配列の支配を受
ける。ＧＩ７２４において、λｃＩ蛋白は、トリプトフ
ァン不含培地中（最少培地または上記ＩＭＣのごときカ
ザミノ酸を補足した最少培地）で増殖している間のみ生
産される。ＧＩ７２４の培地へのトリプトファン添加に
よりｔｒｐプロモーターを抑制し、λｃＩ合成のスイッ
チを切り、徐々にｐＬプロモーター（細胞中に存在する
ならば）からの転写誘導を引き起こす。

【００９９】ｐＡＬＢＰ２−７８１で形質転換されたＧ
Ｉ７２４を、Ａ_５５０（５５０ｎｍにおける吸光度）が
０.５になるまでＩＭＣ培地中で３７℃で増殖させる。
トリプトファンを最終濃度１００μｇ／ｍｌになるよう
添加し、さらに４時間培養した。この期間中、ＢＭＰ−
２蛋白が、細胞の全蛋白の約１０％になるまで蓄積し、
すべて「封入体」画分となる。ＢＭＰ−を以下のごとく
不溶性モノマー形態として回収する。細胞破壊および回
収を４℃で行う。約９ｇの培養済み湿イー・コリＧＩ７
２４／ｐＡＬＢＰ２−７８１細胞を３０ｍｌの０.１Ｍ
Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭフェ
ニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）,ｐＨ
８.３（破壊用緩衝液）に懸濁する。細胞を、細胞破壊
器に４回通し、破壊用緩衝液で体積を１００ｍｌにす
る。懸濁物を２０分遠心分離（１５０００ｘ ｇ）す
る。得られたペレットを、１Ｍ ＮａＣｌ含有破壊用緩
衝液（５０ｍｌ）に懸濁し、上記のごとく１０分間遠心
分離する。ペレットを、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１０
０（ピアース（Pierce）社製）含有破壊用緩衝液（５０
ｍｌ）に懸濁し、再度上記のごとく遠心分離する。つい
で洗浄したペレットを、２５ｍｌの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１％
ＤＴＴ,ｐＨ８.３に懸濁し、ガラス製ホモジナイザー
でホモジナイズする。得られた懸濁液に、不溶型の粗モ
ノマーＢＭＰ−２が含まれている。

【０１００】上記のごとく得た１０ｍｌの該ＢＭＰ−２
懸濁液を、１０％酢酸で酸性にしてｐＨ２.５とし、エ
ッペンドルフ遠心管に入れ室温で１０分間遠心分離す
る。上清をクロマトグラフィーに付した。１％酢酸中セ
ファクリルＳ−１００ＨＲカラム（ファルマシア（Phar
macia）社製）クロマトグラフィーを行った（流速１.４
ｍｌ／分）。モノマーＢＭＰ−２含有フラクションをプ
ールする。これを用いて生物学的活性のあるホモダイマ
ーＢＭＰ−２を得る。上記可溶化および精製により得ら
れたモノマーＢＭＰ−２から、生物学的活性のあるホモ
ダイマーＢＭＰ−２を下記のようにして得ることができ
る。０.１、０.５または２.５ｍｇのＢＭＰ−２をそれ
ぞれ２０、１００または５００μｇ／ｍｌとなるよう、
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ,ｐＨ８.０、１Ｍ ＮａＣ
ｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ還元型グルタチオン、１
ｍＭ酸化型グルタチオンおよび３３ｍＭ ＣＨＡＰＳ
［カルビオケム（Calbiochem）社製］に溶解する。４℃
または２３℃で４日おいた後、該混合物を０.１％ＴＦ
Ａで５〜１０倍に希釈する。透析した該混合物をビダッ
クＣ４ ２１４ＴＰ５４カラム（２５ｘ０.４６ｃｍ）
［米国のザ・ネスト・グループ（The Nest Group）社
製］上の逆相ＨＰＬＣ（流速１ｍｌ／分）に付すことに
より、生物学的に活性のあるＢＭＰ−２の精製を行う。
緩衝液Ａは０.１％ＴＦＡである。緩衝液Ｂは９０％ア
セトニトリルおよび０.１％ＴＦＡである。直線的グラ
ジエントは、０から５分で緩衝液Ｂ２０％；５から１０
で緩衝液Ｂ２０から３０％；１０から４０分で緩衝液Ｂ
３０から６０％；４０から５０分で緩衝液Ｂ６０から１
００％とした。ホモダイマーＢＭＰ−２をＨＰＬＣカラ
ムから溶出し、集める。

【０１０１】ＨＰＬＣフラクションを凍結乾燥し、試料
用緩衝液（１.５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ,ｐＨ８.４５、
１２％グリセロール、４％ ＳＤＳ、０.００７５％Ｓ
ｅｒｖａ Ｂｌｕｅ Ｇ、０.００２５％フェノールレ
ッド、１００ｍＭジチオスレイトール添加または無添
加）に再溶解し、９５℃で５分間加熱する。泳動用緩衝
液は、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、１００ｍＭトリシン（１
６％トリシンゲル）［ノベックス（Novex）社製］、０.
１％ ＳＤＳ（ｐＨ８.３）である。該ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅゲルを、１２５ボルトで２.５時間通電する。ゲル
を、２００ｍｌの０.５％クーマシーブリリアントブル
ーＲ−２５０、２５％イソプロパノール、１０％酢酸
中、６０℃に加熱して１時間染色する。ついで、ゲル
を、１０％酢酸、１０％イソプロパノールでバックグラ
ウンドが透明になるまで脱色する。還元型物質は約１３
ｋＤのところまで泳動した。非還元型物質は約３０ｋＤ
まで泳動した。このことはＢＭＰ−２ダイマーであるこ
とを示す。この物質は、後のＷ２０アッセイ（実施例
６）において活性を示した。

【０１０２】Ｂ. ＢＭＰ−７発現ベクター ＢＭＰ−７を高レベル発現させるためにプラスミドｐＡ
ＬＢＰ７−９８１を構築した。ｐＡＬＢＭＰ７−９８１
は、２つの例外を除いてはｐＡＬＢＭＰ２−７８１と同
じである。ＢＭＰ−２遺伝子（ｐＡＬＢＰ２−７８１の
２７２４〜３１３３番目の残基）がＢＭＰ−７成熟蛋白
の遺伝子で置き換えられており、成熟ＢＭＰ−７蛋白配
列：

【化２】 の初めの７個の残基をコードしている配列が除去されて
おり、ｐＡＬＢＰ２−７８１の２７０７および２７２３
番目の残基間に見られるリボゾーム結合部位が別のリボ
ゾーム結合部位（Ｔ７ファージの遺伝子１０に先行する
配列５'−ＣＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴ−３'
に基づく）に置き換えられている。ＢＭＰ−７生産に用
いた宿主株および増殖条件はＢＭＰ−２に関して記載し
たものと同じであった。

【０１０３】Ｃ. ＢＭＰ−３発現ベクター ＢＭＰ−３を高レベル発現させるためにプラスミドｐＡ
ＬＢ７−７８２を構築した。このプラスミドは、ＢＭＰ
−２遺伝子（ｐＡＬＢＰ２−７８１の２７２４〜３１３
３番目の残基）が成熟ＢＭＰ−３の形態をコードしてい
る遺伝子に置き換えられていること以外は、プラスミド
ｐＡＬＢＰ２−７８１と同じである。このＢＭＰ−３遺
伝子の配列は：

【化３】 である。ＢＭＰ−３の生産に用いた宿主株および増殖条
件は、ＢＭＰ−２に関して記載したものと同じであっ
た。

【０１０４】Ｄ. イー・コリにおけるＢＭＰ−２／７へ
テロダイマーの発現 前記のごとく、酸性化およびゲル濾過により、精製した
変性ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−７モノマーをイー・コリ
封入体ペレットから単離した。１２５μｇの各ＢＭＰ
（１％酢酸中）を混合し、急速真空乾燥した。得られた
物質を、２.５ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１.０Ｍ Ｎ
ａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、３３ｍＭＣＨＡＰＳ、２ｍ
Ｍグルタチオン（還元型）、１ｍＭグルタチオン（酸化
型）,ｐＨ８.０に再懸濁した。この試料を２３℃で１週
間インキュベーションした。ＢＭＰ−２／７へテロダイ
マーを、ビダックＣ４カラム（２５ｘ０.４６ｃｍ）上
のＨＰＬＣにより単離した。該試料を微量遠心機で５分
間遠心分離し、上清を２２.５ｍｌの０.１％ＴＦＡで希
釈した。 Ａ緩衝液：０.１％ＴＦＡ Ｂ緩衝液：０.１％ＴＦＡ、９５％アセトニトリル １.０ｍｌ／分 ０〜５分 ２０％Ｂ ５〜１０分 ２０〜３０％Ｂ １０〜９０分 ３０〜５０％Ｂ ９０〜１００分 ５０〜１００％Ｂ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によると、ＢＭＰ−２／７へテロ
ダイマーは約２３分で溶出した。Figure１０は、イー・
コリＢＭＰ−２およびＢＭＰ−２／７へテロダイマーの
Ｗ２０活性を比較したもので、へテロダイマーのほうが
活性が高いことを示す。

【０１０５】Ｆ.イー・コリにおけるＢＭＰ−２／３へ
テロダイマーの発現 ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−３モノマーを以下のようしし
て得た：１.０ｇの凍結した収穫細胞（ＢＭＰ−２また
はＢＭＰ−３を発現する）に、３.３ｍｌの１００ｍＭ
Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ,ｐＨ８.３を添加し
た。細胞を激しくボルテックスすることにより再懸濁し
た。３３μｌのイソプロパノール中１００ｍＭ ＰＭＳ
Ｆを添加し、細胞を、フレンチプレスに１回かけること
により溶解させた。溶解物を微量遠心機にて４℃で２０
分遠心分離した。上清を捨てた。封入体ペレットを８.
０Ｍグアニジン塩酸塩、０.２５Ｍ ＤＴＴ、０.５Ｍ
Ｔｒｉｓ、５ｍＭ ＥＤＴＡ,ｐＨ８.５中に取り、３７
℃で１時間暖めた。還元され変性したＢＭＰモノマー
を、以下のようにしてスペルコ（Supelco）Ｃ４ガード
カラム上のＨＰＬＣにより単離した。 Ａ緩衝液：０.１％ＴＦＡ Ｂ緩衝液：０.１％ＴＦＡ、９５％アセトニトリル １.０ｍｌ／分 ０〜５分 １％Ｂ ５〜４０分 １〜７０％Ｂ ４０〜４５分 ７０〜１００％Ｂ モノマーＢＭＰは２８〜３０分で溶出した。Ａ２８０お
よび適当な吸光係数により蛋白濃度を測定した。１０μ
ｇのＢＭＰ−２およびＢＭＰ−３を合一し、急速真空乾
燥した。これに５０μｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１.０
Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、３３ｍＭ ＣＨＡＰ
Ｓ、２ｍＭ還元型グルタチオン、１ｍＭ酸化型グルタチ
オン,ｐＨ８.５を添加した。得られた試料を２３℃で３
日間インキュベーションした。該試料を、１６％トリシ
ンゲル上のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元または非還元条件
下）により分析した。ＢＭＰ−２／３へテロダイマーは
非還元条件下で約３５ｋＤの位置まで移動し、還元条件
下では、ＢＭＰ−２モノマーは１３ｋＤまで、ＢＭＰ−
３は２１ｋＤまで移動した。イー・コリにおいて生産さ
れたＢＭＰ−２／３へテロダイマーを、インビボ活性に
ついて試験する。１０日間にわたり、２０μｇを用いて
ＢＭＰ−２／３とＢＭＰ−２のインビボ活性を比較す
る。ＢＭＰ−２／３移植物は軟骨または骨形成活性を示
さなかったが、対象のＢＭＰ−２移植物は、予想どおり
の量の骨および軟骨形成を示した。ＢＭＰ−２／３に関
して得られたインビボでのデーターは、Ｗ−２０アッセ
イにより得られたインビトロでのデータと矛盾しない。

【０１０６】実施例８−Ｗ−２０バイオアッセイ Ａ. Ｗ−２０細胞の説明 指示細胞系としてのＷ−２０骨髄基質細胞の使用は、Ｂ
ＭＰ−２で処理した後、これらの細胞が骨芽細胞様細胞
へ転換することに基づく［アール・エス・シース（R.S.
Thies）ら,「ボーン・モルホジェネティック・プロテイ
ン・オルターズ・Ｗ−２０・ストロマル・セル・ディフ
ァレンシエーション・イン・ビトロ（BoneMorphogeneti
c Protein alters W-20 stromal cell differentiation
in vitro）」,ジャーナル・オブ・ボーン・アンド・ミ
ネラル・リサーチ（Journal of Bone and Mineral Rese
arch）第５巻（２）：３０５頁（１９９０年）；および
アール・エス・シースら,「リコンビナント・ヒューマ
ン・ボーン・モルホジェニック・プロテイン ２ イン
デューシズ・オステオブラスティック・ディファレンシ
エーション・イン・Ｗ−２０−１７・ストローマル・セ
ルズ（RecombinantHuman Bone Morphogenetic Protein
2 Induces Osteoblastic Differentiationin W-20-17 S
tromal Cells）」,エンドクリノロジー（Endocrinolog
y）印刷中（１９９２年）］。詳細には、Ｗ−２０細胞
は、ディー・ナタン（D.Nathan）博士（マサチューセッ
ツ州ボストンのチルドレンズ・ホスピタル（Children's
Hospital））の研究室の研究者により成長したマウス
から誘導された骨髄基質細胞系クローンである。Ｗ−２
０細胞のＢＭＰ−２処理により、（１）アルカリホスフ
ァターゼ生産が増大する、（２）ＰＴＨ刺激によるｃＡ
ＭＰの誘導、および（３）該細胞によるオステオカルシ
ン合成の誘導が起こる。（１）および（２）は骨芽細胞
の表現形に関連するが、オステオカルシン合成能は、成
熟骨芽細胞によってのみ示される表現形の特徴である。
さらに、現在に至るまで、ＢＭＰでの処理によってのみ
Ｗ−２０基質細胞の骨芽細胞様細胞への転換が観察され
た。この方法において、ＢＭＰ−処理されたＷ−２０細
胞によるインビトロ活性は、ＢＭＰ−について知られて
いるインビボ骨形成活性と相関を有している。新規骨誘
導性分子のＢＭＰ活性の比較に有用な２種のインビトロ
でのアッセイを以下に記載する。

【０１０７】Ｂ．Ｗ−２０アルカリホスファターゼのア
ッセイプロトコール Ｗ−２０細胞を、ウェルあたり１００００個（培地２０
０μｌ）の密度で９６ウェル組織培養用プレートに撒
く。培地は１０％熱失活ウシ胎児血清,２ｍＭグルタミ
ンおよび１００Ｕ／ｍｌ＋１００μｇ／ｍｌストレプト
マイシン含有ＤＭＥである。９５％空気、５％ＣＯ
_２中、３７℃のインキュベーター中に細胞を一晩置いて
付着させる。各ウェルから２００μｌの培地をマルチチ
ャンネルピペッターで除去し、１０％熱失活ウシ胎児血
清、２ｍＭグルタミンおよび１％ペニシリン−ストレプ
トマイシンを含有する同体積のＤＭＥ中の試験試料で置
換する。試験物質を３系で分析する。試験試料および標
準物質を、Ｗ−２０指示細胞とともに２４時間インキュ
ベーションする。２４時間後、プレーを３７℃のインキ
ュベーターから出し、細胞から試験培地を除去する。Ｗ
−２０細胞層を、ウェル当たり２００μｌのカルシウム
／マグネシウム不含リン酸緩衝化生理食塩水で３回洗浄
し、これらの洗液を捨てる。ガラス容器で蒸留した５０
μｌの水を各ウェルに添加し、ついで該アッセイプレー
トをドライアイス／エタノール浴で急速冷凍する。冷凍
したらすぐにアッセイプレートをドライアイス／エタノ
ール浴から除去し、３７℃で融解する。このステップを
２回以上繰り返し、合計３回の凍結−融解工程を行う。
この工程が終了したならば、膜結合アルカリホスファタ
ーゼを測定に用いる。５０μｌのアッセイ混合物（５０
ｍＭグリシン、０.０５％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、
４ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５ｍＭ ｐ−ニトロフェノールホ
スフェート,ｐＨ＝１０.３）を各アッセイウェルに添加
し、ついで該アッセイプレートを、１分間に６０回振盪
する水浴中、３７℃で３０分インキュベーションする。
３０分間のインキュベーションが終了したとき、１００
μｌの０.２Ｎ ＮａＯＨを各ウェルに添加して反応停
止し、該アッセイプレートを氷上に置く。各ウェルの分
光学的吸光度を４０５ナノメーターにおいて読む。つい
で、これらの値を既知標準と比較して各試料のアルカリ
ホスファターゼ活性を評価する。例えば、既知量のｐ−
ニトロフェノールホスフェートを用いて吸光度値を得
る。これを表Ｉに示す。

【０１０８】

【表６】

【０１０９】既知量のＢＭＰ−２についての吸光度値を
決定し、表IIに示すように、単位時間当たり開裂された
ｐＨ−ニトロフェノールホスフェートのμモル数に換算
できる。

【表７】 ついで、これらの値を用いて、既知量のＢＭＰ−へテロ
ダイマーとＢＭＰ−２ホモダイマーの活性を比較する。

【０１１０】Ｃ. オステオカルシンＲＩＡプロトコール Ｗ−２０細胞を、２４ウェル組織培養ディッシュにウェ
ルあたり１０^６個撒く（ウェルあたり１０％熱失活ウシ
胎児血清、２ｍＭグルタミンを含有する２ｍｌのＤＭＥ
中）。９５％空気、５％ＣＯ_２の下、３７℃で一晩細胞
を付着させる。翌日、培地を１０％ウシ胎児血清、２ｍ
Ｍグルタミンおよび試験物質を含有するＤＭＥ（総体積
２ｍｌ）に交換する。試験物質をそれぞれ３系のウェル
に入れる。試験物質をＷ−２０細胞とともに合計９６時
間培養する（４８時間で同じ培地と交換）。９６時間
後、５０μｌの試験培地を各ウェルから除去し、マウス
・オステオカルシンに関するラジオイムノアッセイを用
いてオステオカルシン生成をアッセイする。アッセイの
詳細は、マサチューセッツ州０２０７２スタウトンのペ
イジストリート３７８（378 Page Street,Stoughton,MA
02072）のバイオメディカル・テクノロジーズ・インク
（Biomedical Technologies Inc.）により製造されてい
るキットにおいて述べられている。アッセイ用試薬は、
製品番号ＢＴ−４３１（マウス・オステオカルシン標準
物質）、ＢＴ−４３２（ヤギ・抗マウス・オステオカル
シン）、ＢＴ−４３２Ｒ（ヨウ素化マウス・オステオカ
ルシン）、ＢＴ−４１５（正常ヤギ・血清）およびＢＴ
−４１４（ロバ・抗ヤギ・ＩｇＧ）である。ＢＭＰ処理
に応答してＷ−２０細胞により合成されたオステオカル
シンについてのＲＩＡを、製造者により示されたプロト
コール中に記載のごとく行う。試験化合物について得ら
れた値を、マウス・オステオカルシンの既知標準につい
ての値、およびＢＭＰ−２の既知量に応答してＷ−２０
細胞により生成されたオステオカルシン量と比較する。
ＢＭＰ−２により誘導されたＷ−２０細胞によるオステ
オカルシン合成に関する値を表IIIに示す。

【０１１１】

【表８】

【０１１２】実施例９−ローゼン改変サムパス−レディ
アッセイ（Rosen-modified Sampath-Reddi assey）サン
パスおよびレディ,プロシーディングス・オブ・ナショ
ナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエ
イ,第８０巻：６９５１〜６５９５頁（１９８３年）記
載のラット・骨形成アッセイを用いて、ＢＭＰ蛋白の骨
および／または軟骨活性を評価する。この改変法を本明
細書ではローゼン改変サムパス−レディアッセイと呼
ぶ。サムパス−レディ法のエタノール沈澱ステップを、
分析すべきフラクションを水に対して透析（組成物が溶
液の場合）または限外濾過（組成物が懸濁液の場合）す
ることに置き換える。ついで溶液または懸濁液を０.１
％ＴＦＡに溶解し、得られた溶液を２０ｍｇのラット・
マトリックスに添加する。蛋白処理しない模擬ラット・
マトリックスは対照として役立つ。この物質を凍結し、
凍結乾燥し、得られた粉末を＃５ゼラチンカプセル中に
封入する。カプセルを２１〜４９日齢のオスのロング・
エバンズ（Long Evans）・ラットの腹胸部に移植する。
７〜１４日後に移植物を取り出す。各移植物の半分をア
ルカリホスファターゼ分析［エイ・エイチ・レディ（A.
H.Reddi）ら,プロシーディングス・オブ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ第６９
巻：１０６１頁（１９７２年）］に用いる。移植物のも
う半分を固定し、組織学的分析用に処理する。１μｍｇ
のグリコールメタクリレート切片をフォン・コッサ（Vo
n・Kossa）および酸フクシン染色して、各移植物に存在
する誘導された骨および軟骨形成量を評価する。＋１か
ら＋５は、新たな骨および／または軟骨細胞およびマト
リックスにより占められた移植物の各組織学的切片の面
積を表す。＋５のスコアは、移植物の５０％以上が、移
植物中の蛋白の直接的な結果として生成した新たな骨お
よび／または軟骨であることを示す。＋４、＋３、＋２
および＋１のスコアは、それぞれ移植物の４０％、３０
％、２０％および１０％以上が新たな軟骨および／また
は骨を含んでいることを示す。本発明のへテロダイマー
ＢＭＰ蛋白をこのアッセイに関して評価してもよい。本
発明の実施に際しての多くの改変および変法が当業者に
より行われるであろう。かかる改変および変法は以下の
請求の範囲の包含される。

【０１１３】

【配列表】 （１）一般的情報： （ｉ）出願人：イスラエル，デイビッド（Israel,David） ウォルフマン，ニール・エム（Wolfman,Niel M.） （ｉｉ）発明の名称：組み換え型骨形態形成蛋白へテロダイマー、組成物および 使用法 （ｉｉｉ）配列の数：３０ （ｉｖ）連絡先： （Ａ）名称：ジェネティクス・インスティチュート，インク(Genetics Instit ute,Inc) （Ｂ）通り名：リーガル・アフェアーズ(Legal Affairs)−ケンブリッジパー ク・ドライブ(CambridgePark Drive)８７番地 （Ｃ）都市名：ケンブリッジ(Cambridge) （Ｄ）州名：マサチューセッツ州 （Ｅ）国名：アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号：０２１４０−２３８７ （ｖ）コンピューター・リーダブル・フォーム(Computer Readable Form)： （Ａ）媒体形態：フロッピー（登録商標）ディスク （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ ＰＣ コンパチブル （Ｃ）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウェア：パテントイン・リリース(PatentIn Release)＃１.０， バージョン＃１.２５ （ｖｉ）現在の出願データ： （Ａ）出願番号：ＵＳ （Ｂ）受理日： （Ｃ）分類： （ｖｉｉｉ）代理人等の情報： （Ａ）氏名：カピノス，エレン・ジェイ(Capinos,Ellen J.) （Ｂ）登録番号：３２,２４５ （Ｃ）代理人等における処理番号：ＧＩ ５１９２Ｂ （ｉｘ）テレコミュニケーションの情報： （Ａ）電話番号：（６１７）８７６−１１７０ （Ｂ）ファックス番号：（６１７）８７６−５８５１ （２）配列番号：１に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１６０７塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：不明 （ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：ＣＤＳ （Ｂ）存在位置：３５６．．１５４３ （ｘｉ）配列の記載：配列番号：１：

【化４】 （２）配列番号：２に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：３９６アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：蛋白 （ｘｉ）配列の記載：配列番号：２：

【化５】 （２）配列番号：３に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１９５４塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：不明 （ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：ＣＤＳ （Ｂ）存在位置：４０３．．１６２６ （ｘｉ）配列の記載：配列番号：３：

【化６】 （２）配列番号：４に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：４０８アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：蛋白 （ｘｉ）配列の記載：配列番号：４：

【化７】 （２）配列番号：５に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１４４８塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：不明 （ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：ＣＤＳ （Ｂ）存在位置：９７．．１３８９ （ｘｉ）配列の記載：配列番号：５：

【化８】 （２）配列番号：６に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：４３１アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：蛋白 （ｘｉ）配列の記載：配列番号：６：

【化９】 （２）配列番号：７に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２９２３塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：環状 （ｉｉ）配列の種類：ｍＲＮＡに対するｃＤＮＡ （ｉｉｉ）ハイポセティカル配列：なし （ｖｉ）起源： （Ａ）生物名：ヒト （Ｆ）組織の種類：ヒト・胎盤 （ｖｉｉ）直接の起源： （Ａ）ライブラリー：ストラタジーン・カタログ＃９３６２０３ヒト・胎盤 ｃＤＮＡライブラリー （Ｂ）クローン：ＢＭＰ６Ｃ３５ （ｖｉｉｉ）ゲノム内での位置： （Ｃ）単位：ｂｐ （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：ＣＤＳ （Ｂ）存在位置：１６０．．１７０１ （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：ｍａｔ ｐｅｐｔｉｄｅ （Ｂ）存在位置：１２８２．．１６９８ （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：ｍＲＮＡ （Ｂ）存在位置：１．．２９２３ （ｘｉ）配列の記載：配列番号：７：

【化１０】 （２）配列番号：８に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：５１３アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：蛋白 （ｘｉ）配列の記載：配列番号：８：

【化１１】 （２）配列番号：９に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２１５３塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉｉ）ハイポセティカル配列：なし （ｖｉ）起源： （Ａ）生物名：ヒト （Ｈ）細胞系：Ｕ２−ＯＳ骨肉腫 （ｖｉｉ）直接の起源： （Ａ）ライブラリー：Ｕ２−ＯＳヒト・骨肉腫ｃＤＮＡライブラリー （Ｂ）クローン：Ｕ２−１６ （ｖｉｉｉ）ゲノム内での位置： （Ｃ）単位：ｂｐ （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：ＣＤＳ （Ｂ）存在位置：６９９．．２０６３ （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：ｍａｔ ｐｅｐｔｉｄｅ （Ｂ）存在位置：１６４７．．２０６０ （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：ｍＲＮＡ （Ｂ）存在位置：１．．２１５３ （ｘｉ）配列の記載：配列番号：９：

【化１２】 （２）配列番号：１０に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：４５４アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：蛋白 （ｘｉ）配列の記載：配列番号：１０：

【化１３】 （２）配列番号：１１に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１００３塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：環状 （ｉｉ）配列の種類：ｍＲＮＡに対するｃＤＮＡ （ｉｉｉ）ハイポセティカル配列：なし （ｖｉ）起源： （Ａ）生物名：ヒト （Ｈ）組織の種類：ヒト・心臓 （ｖｉｉ）直接の起源： （Ａ）ライブラリー：ヒト・心臓ｃＤＮＡライブラリー・ストラタジーン・ カタログ＃９３６２０８ （Ｂ）クローン：ｈＨ３８ （ｖｉｉｉ）ゲノム内での位置： （Ｃ）単位：ｂｐ （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：ＣＤＳ （Ｂ）存在位置：８．．８５０ （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：ｍａｔ ｐｅｐｔｉｄｅ （Ｂ）存在位置：４２７．．８４３ （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：ｍＲＮＡ （Ｂ）存在位置：１．．９９７ （ｘｉ）配列の記載：配列番号：１１：

【化１４】 （２）配列番号：１２に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２８１アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：蛋白 （ｘｉ）配列の記載：配列番号：１２：

【化１５】 （２）配列番号：１３に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：３６２３塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （ｖｉｉ）直接の起源： （Ｂ）クローン：ｐＡＬＢＰ２−７８１ （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：ＣＤＳ （Ｂ）存在位置：２７２４．．３０７１ （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：ｍａｔ ｐｅｐｔｉｄｅ （Ｂ）存在位置：３１５０．．３２１８ （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：ＲＢＳ （Ｂ）存在位置：２２２２．．２７２３ （ｘｉ）配列の記載：配列番号：１３：

【化１６】 （２）配列番号：１４に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１１５アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：蛋白 （ｘｉ）配列の記載：配列番号：１４：

【化１７】 （２）配列番号：１５に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１４塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （ｘｉ）配列の記載：配列番号：１５： ＣＡＴＧＧＧＣＡＧＣ ＴＧＡＧ １４ （２）配列番号：１６に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：４１塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （ｘｉ）配列の記載：配列番号：１６： ＧＡＧＧＧＴＴＧＴＧ ＧＧＴＧＴＣＧＣＴＡ ＧＴＧＡＧＴＣＧＡＣ ＴＡＣ ＡＧＣＡＡＡＴ Ｔ ４１ （２）配列番号：１７に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：３８塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （ｘｉ）配列の記載：配列番号：１７： ＧＧＡＴＧＴＧＧＧＴ ＧＣＣＧＣＴＧＡＣＴ ＣＴＡＧＡＧＴＣＧＡ ＣＧＧ ＡＡＴＴＣ ３８ （２）配列番号：１８に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：３１塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （ｘｉ）配列の記載：配列番号：１８： ＡＡＴＴＣＡＣＣＡＴ ＧＡＴＴＣＣＴＧＧＴ ＡＡＣＣＧＡＡＴＧＣ Ｔ ３１ （２）配列番号：１９に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２５塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （ｘｉ）配列の記載：配列番号：１９： ＧＴＧＧＴＡＣＴＡＡ ＧＧＡＣＣＡＴＴＧＧ ＣＴＴＡＣ ２５ （２）配列番号：２０に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２７塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （ｘｉ）配列の記載：配列番号：２０： ＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧ ＣＣＡＴＧＣＡＴＣＴ ＧＡＣＴＧＴＡ ２７ （２）配列番号：２１に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２７塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （ｘｉ）配列の記載：配列番号：２１： ＴＧＣＣＴＧＣＡＧＴ ＴＴＡＡＴＡＴＴＡＧ ＴＧＧＣＡＧＣ ２７ （２）配列番号：２２に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１５塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （ｘｉ）配列の記載：配列番号：２２： ＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧ ＣＣＡＣＣ １５ （２）配列番号：２３に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：８１塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （ｘｉ）配列の記載：配列番号：２３： ＴＣＧＡＣＣＣＡＣＣ ＡＴＧＣＣＧＧＧＧＣ ＴＧＧＧＧＣＧＧＡＧ ＧＧＣ ＧＣＡＧＴＧＧ ＣＴＧＴＧＣＴＧＧＴ ＧＧＴＧＧＧＧＧＣＴ ６０ ＧＴＧＣＴＧＣＡＧＣ ＴＧＣＴＧＣＧＧＧＣ Ｃ ８１ （２）配列番号：２４に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：７３塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （ｘｉ）配列の記載：配列番号：２４： ＣＧＣＡＧＣＡＧＣＴ ＧＣＡＣＡＧＣＡＧＣ ＣＣＣＣＡＣＣＡＣＣ ＡＧＣ ＡＣＡＧＣＣＡ ＣＴＧＣＧＣＣＣＴＣ ＣＧＣＣＣＣＡＧＣＣ ６０ ＣＣＧＧＣＡＴＧＧＴ ＧＧＧ ７３ （２）配列番号：２５に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１１塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （ｘｉ）配列の記載：配列番号：２５： ＴＣＧＡＣＴＧＧＴ Ｔ １１ （２）配列番号：２６に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：９塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （ｘｉ）配列の記載：配列番号：２６： ＣＧＡＡＡＣＣＡＧ ９ （２）配列番号：２７に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１８塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （ｘｉ）配列の記載：配列番号：２７： ＴＣＧＡＣＡＧＧＣＴ ＣＧＣＣＴＧＣＡ １８ （２）配列番号：２８に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１０塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （ｘｉ）配列の記載：配列番号：２８： ＧＴＣＣＧＡＧＣＧＧ １０ （２）配列番号：２９に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２９塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （ｘｉ）配列の記載：配列番号：２９： ＣＡＧＧＴＣＧＡＣＣ ＣＡＣＣＡＴＧＣＡＣ ＧＴＧＣＧＣＴＣＡ １９ （２）配列番号：３０に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２７塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （ｘｉ）配列の記載：配列番号：３０： ＴＣＴＧＴＣＧＡＣＣ ＴＣＧＧＡＧＧＡＧＣ ＴＡＧＴＧＧＣ ２７

【図面の簡単な説明】

【図１】 ヒト・ＢＭＰ−２（配列番号：１および２）
のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す（Figure1A)。

【図２】 ヒト・ＢＭＰ−２（配列番号：１および２）
のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す（Figure1B)。

【図３】 ヒト・ＢＭＰ−２（配列番号：１および２）
のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す（Figure1C)。

【図４】 ヒト・ＢＭＰ−４（配列番号：３および４）
のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す（Figure2A)。

【図５】 ヒト・ＢＭＰ−４（配列番号：３および４）
のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す（Figure2B)。

【図６】 ヒト・ＢＭＰ−４（配列番号：３および４）
のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す（Figure2C)。

【図７】 ヒト・ＢＭＰ−７（配列番号：５および６）
のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す（Figure3A)。

【図８】 ヒト・ＢＭＰ−７（配列番号：５および６）
のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す（Figure3B)。

【図９】 ヒト・ＢＭＰ−７（配列番号：５および６）
のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す（Figure3C)。

【図１０】 ヒト・ＢＭＰ−６（配列番号：７および
８）のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す（Figure4A)。

【図１１】 ヒト・ＢＭＰ−６（配列番号：７および
８）のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す（Figure4B)。

【図１２】 ヒト・ＢＭＰ−６（配列番号：７および
８）のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す（Figure4C)。

【図１３】 ヒト・ＢＭＰ−６（配列番号：７および
８）のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す（Figure4D)。

【図１４】 ヒト・ＢＭＰ−６（配列番号：７および
８）のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す（Figure4E)。

【図１５】 ヒト・ＢＭＰ−５（配列番号：９および１
０）のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す（Figure5A)。

【図１６】 ヒト・ＢＭＰ−５（配列番号：９および１
０）のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す（Figure5B)。

【図１７】 ヒト・ＢＭＰ−５（配列番号：９および１
０）のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す（Figure5C)。

【図１８】 ヒト・ＢＭＰ−５（配列番号：９および１
０）のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す（Figure5D)。

【図１９】 ヒト・ＢＭＰ−８（配列番号：１１および
１２）のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す（Figure6)。

【図２０】 ヒト・ＢＭＰ−８（配列番号：１１および
１２）のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す（Figure6の
つづき)。

【図２１】 ＢＭＰ−２成熟蛋白遺伝子（配列番号：１
３および１４）を含むベクターｐＡＬＢ２−７８１のＤ
ＮＡ配列を示す（Figure7)。

【図２２】 ＢＭＰ−２成熟蛋白遺伝子（配列番号：１
３および１４）を含むベクターｐＡＬＢ２−７８１のＤ
ＮＡ配列を示す（Figure7のつづき)。

【図２３】 Ｗ２０アルカリホスファターゼのアッセイ
におけるＣＨＯ ＢＭＰ−２とＣＨＯ ＢＭＰ−２／７
の活性の比較である（Figure8)。

【図２４】 ＢＧＰ（オステオカルシン（osteocalci
n））のアッセイにおけるＣＨＯ ＢＭＰ−２とＣＨＯ
ＢＭＰ−２／７の活性の比較である（Figure9)。

【図２５】 イー・コリにより生産されたＢＭＰ−２と
ＢＭＰ−２／７へテロダイマーのＷ−２０活性の比較で
ある（Figure10)。

【図２６】 ＢＭＰ−３のＤＮＡおよびアミノ酸配列を
示す（Figure11A)。

【図２７】 ＢＭＰ−３のＤＮＡおよびアミノ酸配列を
示す（Figure11B)。

【図２８】 ＢＭＰ−３のＤＮＡおよびアミノ酸配列を
示す（Figure11C)。

【図２９】 Ｗ−２０アッセイにおけるＢＭＰ−２とＢ
ＭＰ−２／６の比較を示す（Figure12)。

【図３０】 ＢＭＰ−２／６とＢＭＰ−２のインビボ活
性の比較を示す（Figure13A)。

【図３１】 ＢＭＰ−２／６とＢＭＰ−２のインビボ活
性の比較を示す（Figure13B)。

【図３２】 インビボ活性におけるＢＭＰ−２、ＢＭＰ
−６およびＢＭＰ−２／６比較を示す（Figure14A)。

【図３３】 インビボ活性におけるＢＭＰ−２、ＢＭＰ
−６およびＢＭＰ−２／６比較を示す（Figure14B)。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 19/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 デイビッド・イスラエル アメリカ合衆国マサチューセッツ州01742、 コンコルド、アンソン・ロード117番 (72)発明者 ニール・エム・ウォルフマン アメリカ合衆国マサチューセッツ州02030、 ドーヴァー、ローリング・レイン30番 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA04 DA02 DA06 EA04 GA11 HA01 4B064 AG13 CA02 CA19 CC24 CE10 DA01 4C084 AA02 AA06 AA07 BA01 BA08 BA22 BA23 CA53 DC50 NA14 ZA891 ZA892 ZA961 ZA962 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 BA17 BA18 CA40 EA20 FA74 GA25

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 イー・コリにおいて生成される骨刺激活
   性を有する組み換え型ＢＭＰ−２ホモダイマー。
2. 【請求項２】 イー・コリ宿主細胞を培養し、得られた
   培養基からホモダイマーＢＭＰ−２を単離、精製するこ
   とからなる、骨刺激活性を有するホモダイマーＢＭＰ−
   ２蛋白の製法。
3. 【請求項３】 ＢＭＰ−２である２つ目の蛋白またはそ
   のフラグメントに会合したＢＭＰ−２である１つ目の蛋
   白またはそのフラグメントからなる、骨刺激活性を有す
   る組み換え型へテロダイマー蛋白。