CN104204811A - 胰腺β-细胞紊乱中的可溶性MANF - Google Patents

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Abstract

本发明部分地提供用于诊断胰腺β-细胞紊乱、预测受试者发展胰腺β-细胞紊乱的风险、监测处于发展胰腺β-细胞紊乱风险的受试者的胰腺β-细胞功能或胰腺β-细胞团、监测受试者中胰腺β-细胞紊乱的治疗效力、鉴别发展胰腺β-细胞紊乱的风险增加的受试者、选择治疗胰腺β-细胞紊乱的受试者、选择参加临床研究的受试者和检测胰腺β-细胞中的内质网应激的方法。这些方法包括确定可溶性中脑星形胶质细胞来源的神经营养因子(MANF)在来自受试者的生物样品中的至少一个水平。还提供包含可溶性MANF蛋白的药物组合物和包含特异性结合可溶性MANF的抗体或抗原结合性抗体片段的试剂盒。

Description

胰腺β-细胞紊乱中的可溶性MANF
优先权申明
本申请要求2012年1月24日提交的美国专利申请序列号61/590,021的优先权。在此将美国专利申请序列号61/590,021的整体引入以作参考。
背景技术
受试者的胰腺β-细胞的功能或数量的缺失促成包括1型糖尿病(糖尿病(diabetes mellitus))、2型糖尿病和Wolfram综合征等的多种疾病的发病(pathogenesis)。在1型糖尿病中，患者由于胰岛素缺乏而具有高血糖水平。一般来说，胰岛素的绝对缺乏发生在患有1型糖尿病的患者中，而胰岛素的相对缺乏发生在患有2型糖尿病的患者中。越来越多的证据表明功能性胰腺β-细胞团(β-cell mass)减少是1型和2型糖尿病二者，以及糖尿病如Wolfram综合征的遗传形式的共同特征(Pipeleers等人，Novartis Found Symp.292:19-24,2008)。在1型或2型糖尿病的进展期间，胰腺β-细胞功能和团(mass)逐渐下降，最终导致胰岛素缺乏和高血糖症。最新研究成果表明“应激的”胰腺β-细胞对功能紊乱和死亡敏感(Oslowski等人，Curr.Opin.Endocrinol.Diabetes Obes.17:107-112,2010；Oslowski等人，Curr.Opin.Cell Biol.23:207-215,2011；Fonseca等人，Trends Endocrinol.Metab.22:266-274,2011)。辅助预测受试者对发展胰腺β-细胞功能紊乱和死亡的易感性的诊断标记物将有助于治疗或延缓受试者中胰腺β-细胞紊乱(例如，1型或2型糖尿病)的进展。
发明内容
本发明部分地基于如下发现：应激的胰腺β-细胞产生并分泌可溶性中脑星形胶质细胞来源的神经营养因子(MANF)，可溶性MANF保护胰腺β-细胞免于内质网应激-诱导的凋亡，且可溶性MANF保持胰腺β-细胞中的内质网氧化还原体内平衡。
鉴于这些发现，本文提供诊断受试者中胰腺β-细胞紊乱、预测受试者发展胰腺β-细胞紊乱的风险、监测受试者(例如，处于发展胰腺β-细胞紊乱风险的受试者)中胰腺β-细胞功能或胰腺β-细胞团、鉴别发展胰腺β-细胞紊乱的风险增加的受试者、选择治疗胰腺β-细胞紊乱的受试者、选择参加临床研究的受试者和检测胰腺β-细胞中的内质网应激的方法(例如体外方法)。这些方法包括确定可溶性MANF的至少一个水平(例如，可溶性MANF在来自受试者的生物样品中或培养基中的内源水平)。
本文还提供诊断受试者的胰腺β-细胞紊乱的方法(例如，体外方法)，所述方法包括确定可溶性中脑星形胶质细胞来源的神经营养因子(MANF)在来自受试者的生物样品中的水平；将可溶性MANF在生物样品中的水平与可溶性MANF的参考水平相比较；和将与参考水平相比可溶性MANF在生物样品中的水平升高的受试者鉴定为患有胰腺β-细胞紊乱。
本文还提供预测受试者发展胰腺β-细胞紊乱的风险的方法(例如，体外方法)，所述方法包括：确定可溶性中脑星形胶质细胞来源的神经营养因子(mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor，MANF)在来自受试者的生物样品中的水平；将可溶性MANF在生物样品中的水平与可溶性MANF的参考水平相比较；和将与参考水平相比可溶性MANF在生物样品中的水平升高的受试者鉴定为发展胰腺β-细胞紊乱的风险增加，或者将与参考水平相比可溶性MANF在生物样品中的水平降低或没有显著差异的受试者鉴定为发展胰腺β-细胞紊乱的风险正常或降低。
本文还提供监测受试者中胰腺β-细胞功能或胰腺β-细胞团的方法(例如，体外方法)，所述方法包括：确定在第一时间点时可溶性中脑星形胶质细胞来源的神经营养因子(MANF)在来自受试者的生物样品中的水平；确定在第二时间点时可溶性MANF在来自受试者的生物样品中的水平；将第二时间点时可溶性MANF在生物样品中的水平与第一时间点时可溶性MANF在生物样品中的水平相比较；和将与第一时间点时可溶性MANF在生物样品中的水平相比第二时间点时可溶性MANF在生物样品中的水平升高的受试者鉴定为胰腺β-细胞功能下降或胰腺β-细胞减少，或者与第一时间点时可溶性MANF在生物样品中的水平相比第二时间点时可溶性MANF在生物样品中的水平降低或无显著变化的受试者鉴定为受试者中胰腺β-细胞功能没有变化或提高，或胰腺β-细胞团没有变化或增加。
本文还提供监测受试者中胰腺β-细胞紊乱的治疗效力的方法(例如，体外方法)。这些方法包括确定在第一时间点时可溶性中脑星形胶质细胞来源的神经营养因子(MANF)在来自受试者的生物样品中的水平，确定在第二时间点时可溶性MANF在来自受试者的生物样品中的水平，和将第二时间点时可溶性MANF在生物样品中的水平与第一时间点时可溶性MANF在生物样品中的水平相比较，其中(i)第一时间点为在治疗之前，和第二时间点为在治疗起始后的任意时间点，或(ii)第一时间点在治疗起始之后(following the initiationof treatment)，和第二时间点为晚于治疗期间或之后的时间点；和与第一时间点时可溶性MANF在生物样品中的水平相比第二时间点时可溶性MANF在生物样品中的水平降低表明该治疗在受试者中是有效的。
本文还提供治疗或延缓受试者中胰腺β-细胞紊乱发病(onset)的方法、减少胰腺β-细胞中的内质网应激的方法(例如，体外方法)、或减少或延缓在两个以上的胰腺β-细胞群体中内质网应激-诱导的凋亡性细胞死亡的方法(例如，体外方法)。这些方法包括向受试者施用有效量的可溶性MANF或阿朴吗啡(apomorpine)，或者使胰腺β-细胞或胰腺β-细胞群体与可溶性MANF或阿朴吗啡接触。在某些实施方案中，可溶性MANF包含与哺乳动物可溶性MANF蛋白序列(例如，SEQ ID NOS:2和4-7任何之一)至少80％(例如，85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一的序列。在某些实施方案中，例如其中所述方法包括施用阿朴吗啡，受试者不患有勃起功能障碍或帕金森氏病。
本文还提供在制造用于治疗或延缓受试者中胰腺β-细胞紊乱发病的医药品时使用本文记载的可溶性MANF(例如，包括与SEQ ID NO:2至少80％同一的序列的可溶性MANF)或阿朴吗啡的任一种的方法。本文还提供在治疗或延缓受试者中胰腺β-细胞紊乱发病中使用的分离的可溶性MANF(例如，包括含与SEQ ID NO:2至少80％同一的序列的分离的可溶性MANF)或阿朴吗啡。
本文还提供筛选用于治疗或延缓受试者中胰腺β-细胞紊乱发病的候选化合物的方法(例如，体外方法)、减少胰腺β-细胞中的内质网应激的方法(例如，体外方法)、和减少或延缓胰腺β-细胞中内质网应激-诱导的凋亡性细胞死亡(apoptotic cell death)的方法(例如，体外方法)。这些方法包括提供胰腺β-细胞，使胰腺β-细胞与候选化合物接触，确定在候选化合物的存在下由胰腺β-细胞产生的可溶性MANF的水平，将由胰腺β-细胞产生的可溶性MANF的水平与可溶性MANF的参考水平相比较，和选择与参考水平相比由胰腺β-细胞产生的可溶性MANF的水平升高相关的化合物作为用于治疗或延缓受试者中胰腺β-细胞紊乱发病的候选化合物。在这些方法中，与参考水平相比由胰腺β-细胞产生的可溶性MANF的水平升高表明该候选化合物可对治疗或延缓受试者中胰腺β-细胞紊乱发病、减少胰腺β-细胞中的内质网应激、或者减少或延缓在胰腺β-细胞中内质网应激-诱导的凋亡性细胞死亡有用。
本文还提供筛选用于治疗或延缓受试者中胰腺β-细胞紊乱发病的候选化合物的方法(例如，体外方法)、减少胰腺β-细胞中内质网应激的方法、或减少或延缓胰腺β-细胞中内质网应激-诱导的凋亡性细胞死亡的方法。这些方法包括提供表达含有BiP信号序列、氧化还原敏感性荧光蛋白(例如氧化还原敏感性绿色荧光蛋白)和氨基酸序列KDEL的报告蛋白的哺乳动物细胞；使该细胞与试验化合物接触；确定细胞中氧化的报告蛋白的存在量；和将细胞中氧化的报告蛋白的存在量与参考水平相比较；其中与参考水平相比细胞中氧化的报告蛋白的水平升高表明候选化合物可对治疗或延缓受试者的胰腺β-细胞紊乱发病有用。在某些实施方案中，参考水平为在不存在候选剂(candidate agent)下哺乳动物细胞中氧化的报告蛋白的存在量。在某些实施方案中，参考水平为氧化的报告蛋白的阈值水平。
本文还提供筛选用于治疗或延缓受试者中胰腺β-细胞紊乱发病的候选化合物的方法(例如，体外方法)、减少胰腺β-细胞中内质网应激的方法、或减少或延缓胰腺β-细胞中内质网应激-诱导的凋亡性细胞死亡的方法。这些方法包括提供表达含有BiP信号序列、氧化还原敏感性荧光蛋白(例如氧化还原敏感性绿色荧光蛋白)和氨基酸序列KDEL的报告蛋白的哺乳动物细胞；使该细胞与试验化合物接触；确定细胞中还原的报告蛋白的存在量；和将细胞中还原的报告蛋白的存在量与参考水平相比较；其中与参考水平相比细胞中还原的报告蛋白的水平降低表明候选化合物可对治疗或延缓受试者的胰腺β-细胞紊乱发病有用。在某些实施方案中，参考水平为在不存在候选剂(candidate agent)下哺乳动物细胞中还原的报告蛋白的存在量。在某些实施方案中，参考水平为还原的报告蛋白的阈值水平。
还提供试剂盒，其包括特异性结合可溶性MANF(例如，人可溶性MANF)的抗体或抗原结合性抗体(antigen-binding antibody)片段，和结合至选自由胰岛素、C-蛋白和胰岛淀粉样多肽(IAPP)组成的组的蛋白质的至少一种抗体或抗原结合性抗体片段。还提供药物组合物，其包含可溶性MANF蛋白(例如，包含与SEQ ID NO:2至少80％同一的序列的可溶性MANF蛋白)和/或阿朴吗啡，和用于治疗胰腺β-细胞紊乱的至少一种附加剂(additional agent)(例如，吡格列酮(pioglitazone)、TUDCA、GLP-1或DPP-4抑制剂(例如，西他列汀(sitagliptin)、维达列汀(vildagliptin)、沙格列汀(saxagliptin)、利拉列汀(linagliptin)、度格列汀(dutogliptin),、吉格列汀(gemigliptin)和阿格列汀(alogliptin)))。
术语“胰腺β-细胞紊乱”意指包括胰腺β-细胞功能(例如胰岛素分泌)下降或存在于受试者中的活的分泌胰岛素的胰腺β-细胞数(胰腺β-细胞团)减少作为其发病机理的一部分的疾病。在某些实施方案中，胰腺β-细胞紊乱的进一步特征在于受试者的胰腺β-细胞群体(例如两个以上的胰腺β-细胞)中内质网应激的增加。如本文所述，胰腺β-细胞功能的下降、活的胰腺β-细胞数(胰腺β-细胞团)的下降、或存在于受试者的胰腺β-细胞中的内质网应激的增加可使用本文所述方法或本领域已知的其它方法间接检测。胰腺β-细胞紊乱的非限制性实例包括1型糖尿病(糖尿病)、2型糖尿病和Wolfram综合征。
术语“胰腺β-细胞功能”意指用于描述哺乳动物(例如，人)的胰腺β-细胞的生物活性(例如，胰腺β-细胞特别独特的活性)。胰腺β-细胞功能的非限制性实例包括胰岛素的合成和分泌、胰岛淀粉样多肽(IAPP)的合成和分泌以及C-肽的合成和分泌。检测胰岛素、IAPP和C-肽的合成和分泌是本领域已知的。胰腺β-细胞功能还可使用本文所述方法以及本领域已知方法(例如，确定血糖水平和确定糖化血红蛋白A1C水平)间接检测。
术语“胰腺β-细胞团”意指哺乳动物(例如，人)中活的分泌胰岛素的胰腺β-细胞的总数。本文记载了用于间接确定受试者的胰腺β-细胞团的方法。用于间接确定受试者中胰腺β-细胞团的其它方法是本领域已知的(例如，确定血糖水平和确定糖化血红蛋白A1C水平)。
胰腺β-细胞团可表示受试者的内源活的胰腺β-细胞的总数或可表示受试者的内源活的胰腺β-细胞的数量加上移植入受试者中的活的胰腺β-细胞(例如，自体移植、同种移植或异种移植的活的胰腺β-细胞)的数量的总和。
术语“可溶性MANF”意指包含与中脑星形胶质细胞来源的神经营养因子(MANF)的可溶性哺乳动物形式至少80％同一的序列的蛋白质。例如，可溶性MANF可为包含与SEQ ID NOS:2和4-7任一种，即与SEQ ID NOS:2和4-7的全长至少80％同一(例如，至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一)的序列的蛋白质。在某些实施方案中，可溶性MANF可为野生型哺乳动物可溶性MANF(例如，SEQ ID NO:2和4-7)。
可溶性MANF蛋白可作为治疗处理(例如，作为使用本文所述任一种方法的重组体或纯化的内源性蛋白)施用。纯化的可溶性MANF蛋白可为例如干重纯度至少80％(例如，至少85％、90％、95％或99％)。本文记载了可溶性MANF的其它修饰形式。
术语“增加”或“升高”意指与参考水平或同一受试者(例如，在来自同一受试者的生物样品)在较早或较后的时间点时测量的水平相比，可观察、可检测或显著的水平增加。
术语“减少(下降)”意指与参考水平或同一受试者(例如，在来自同一受试者的生物样品)在较早或较后的时间点时测量的水平相比，可观察、可检测或显著的水平减少(下降)。
术语“与可溶性MANF水平升高相关的化合物”意指诱导或导致与该化合物接触的哺乳动物细胞存在、产生或分泌的可溶性MANF(例如蛋白质或mRNA)的水平与在不存在该化合物下对照哺乳动物细胞(例如，同一或相同类型的哺乳动物细胞)存在、产生或分泌的可溶性MANF(例如蛋白质或mRNA)的水平相比升高的化合物。
短语“发展疾病的风险”意指与对照受试者或群体(例如，健康受试者或群体、或没有胰腺β-细胞紊乱家族史的受试者或群体)相比受试者在未来将发展胰腺β-细胞紊乱的相对可能性。本文提供确定受试者发展胰腺β-细胞紊乱的风险(在未来)的方法，所述方法包括确定可溶性MANF的水平。
术语“治疗”包括减少受试者的疾病(例如，胰腺β-细胞紊乱)的症状的数量、或者减少受试者的疾病(例如，胰腺β-细胞紊乱)的一种或多种症状的严重性、持续时间或频率。术语治疗还可包括减少受试者发展胰腺β-细胞紊乱的风险(在未来)或延缓受试者胰腺β-细胞紊乱的一种或多种症状的发生。
短语“延缓胰腺β-细胞紊乱发病”意指在受试者中观察到胰腺β-细胞紊乱的一种或多种症状之前的时间长度增加。在某些实施方案中，受试者可预先鉴定为发展胰腺β-细胞紊乱的风险增加。如本文所述，受试者可使用本文所述方法或通过观察胰腺β-细胞紊乱(例如，2型糖尿病)的家族史鉴定为发展胰腺β-细胞紊乱的风险增加。
术语“生物样品”包括从受试者采集的包括生物流体(biological fluid)的任何样品。在非限制性样品中，生物样品可包括血液、血清、血浆、尿、脑脊液、唾液、胆汁、胃液或母乳。
短语“内质网应激”意指反应性氧类(助氧化剂类(pro-oxidant species))的产生、与细胞的或细胞器对反应性氧类(或它们的中间体)的解毒(除去)的能力之间的内质网失衡，该反应性氧类导致内质网腔内氧化还原电位的移动和/或内质网腔内错误折叠或未折叠蛋白的积累。内质网应激触发独特的应激通路，称为未折叠蛋白应答(UPR)(在本文中另外描述)。
胰腺β-细胞中的内质网应激可由许多分子事件(例如，内质网中脂肪酸的水平增加、血胰岛素增多(hyperinsulemia)、VEGF的过量产生、低氧、葡萄糖剥夺(glucose deprivation)、胰岛淀粉样多肽突变体、胰岛素突变体、IL-1的水平增加、IFN-γ的水平增加或病毒感染)引起。各种不同化学试剂也可用于诱导内质网应激(例如，毒胡萝卜素或衣霉素)。内质网应激已显示将内质网从氧化环境向更加还原的环境移动。在某些实施方案中，具有将内质网在ER应激条件下从还原向氧化环境移动的能力的试剂将帮助减少ER应激和/或可减少或防止ER应激-诱导的凋亡性细胞死亡。
内质网应激可使用本领域已知的各种不同方法检测。本文记载了用于检测、减少或延缓胰腺β-细胞中的内质网应激发生的示例性方法。
短语“胰腺β-细胞群体”意指两种以上的胰腺β-细胞。在某些实施方案中，胰腺β-细胞群体可存在于哺乳动物(例如，人)受试者(例如，受试者的内源胰腺β-细胞，胰腺β-细胞的自体移植物、同种移植物或异种移植物)。在某些实施方案中，胰腺β-细胞群体可在体外培养(组织培养)。在某些实施方案中，胰腺β-细胞群体为胰腺β-细胞系(例如，本文记载的那些胰腺β-细胞系)。在某些实施方案中，胰腺β-细胞可源自任何哺乳动物物种(例如，人、猴(例如黑猩猩)、小鼠、猪、大鼠或猿)。在某些实施方案中，胰腺β-细胞群体可为原代细胞系或无限增殖化细胞系。
术语“胰腺β-细胞”意指通常存在于哺乳动物胰腺中的胰岛中的胰岛素-产生细胞。如本文所使用的，术语胰腺β-细胞包括存在于哺乳动物体内的胰腺β-细胞(例如，内源胰腺β-细胞，或胰腺β-细胞的自体移植物、同种移植物或异种移植物)或体外培养的胰腺β-细胞(例如，来自本文所记载的任意哺乳动物物种的胰腺β-细胞的先体外后体内(ex vivo)(例如，原代)培养物或胰腺β-细胞系(例如，原代或无限增殖化细胞系)。在某些实施方案中，存在于哺乳动物中的胰腺β-细胞在胰腺中存在。在某些实施方案中，存在于哺乳动物中的胰腺β-细胞位于除胰腺以外的组织中(例如，在肝脏组织中)。在其它实施方案中，胰腺β-细胞包封在植入受试者中的装置(例如，生物相容性聚合物)中。术语胰腺β-细胞还包括哺乳动物(例如，人、猪、大鼠和小鼠)细胞系或原代哺乳动物(例如，人、猪、大鼠和小鼠)细胞培养物中的胰腺β-细胞。在某些实施方案中，胰腺β-细胞可使用分子生物技术来遗传操作以表达一种或多种重组蛋白(例如，胰岛素)和/或减少一种或多种内源蛋白的表达。
术语“内质网-诱导的凋亡性细胞死亡”意指由细胞(例如，胰腺β-细胞)内质网中的应激触发的程序性细胞死亡。在某些实施方案中，诱导凋亡性细胞死亡的内质网应激诱导细胞(例如，胰腺β-细胞)中的未折叠蛋白应答(UPR)通路。本文记载了UPR通路的典型成分。如本文所记载的，内质网应激可由多种试剂(例如，生物和化学试剂)引发。本文记载了用于检测、测量、降低和延缓胰腺β-细胞中的内质网-诱导的凋亡性细胞死亡发生的方法。用于检测和测量内质网-诱导的凋亡性细胞死亡的另外的方法是本领域已知的。
术语“确定水平”意指使用一种或多种科学技术(例如，分子生物学、分子遗传学、免疫学和生物化学方法或试验)来评价特定分子的水平(例如，在生物样品或细胞培养基中)。短语确定水平包括与特定分子(例如，抗体或抗体的抗原结合性片段)特异性结合的一种或多种试剂与样品(例如，生物样品或细胞培养基)的物理接触。
术语“第二时间点”一般意指在第一时间点(例如，入院时间(time ofadmission))之后发生的任何时间点。第二时间点可发生在第一时间点后的例如至少6小时、12小时、24小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、4周、6周、2个月、6个月、1年或2年发生。在某些实施方案中，受试者可在第一时间点和第二时间点之间实施治疗。
术语“氧化还原敏感的荧光蛋白”为改变其荧光性质(例如，在其氧化还原环境改变(例如，内质网的氧化还原环境的改变)时激发和/或发射光谱(例如，峰激发或发射波长)改变)的蛋白质。在某些实施方案中，该蛋白质荧光性质的改变可例如由于一个以上的二硫键的形成和/或断裂而发生。氧化还原敏感的荧光蛋白非限制性实例包括氧化还原氧化敏感型绿色荧光蛋白(roGFP)和氧化还原敏感的黄色荧光蛋白(rxYFP)。另外的氧化还原敏感的荧光蛋白是本领域已知的。
其它定义贯穿本公开出现在上下文中。除非另有限定，否则本文所使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。本文记载了方法和材料用于在本发明中使用；还可使用本领域已知的其它适合的方法和材料。材料、方法和实例仅为说明性而不意欲限制。本文提及的所有公报、专利申请、专利、序列、数据库条目(database entries)和其它文献以其整体引入以作参考。在冲突的情况下，本说明书，包括定义在内，将会调控。
本发明的其它特征和优势从下列详细描述和图示中，以及从权利要求中将会是显而易见的。
附图说明
图1为示出在不用或用毒胡萝卜素(50nM)或衣霉素(0.5μg/mL)处理24小时后MANF蛋白在来自大鼠胰腺β-细胞系(INS-1 832/13)培养物的浓缩培养基中或在来自大鼠胰腺β-细胞系(INS-1 832/13)溶解产物中的水平的免疫印迹。
图2为示出MANF mRNA在下述条件下培养的大鼠胰腺β-细胞系(INS-1832/13)中的相对表达的图：11mM葡萄糖(24小时)；25mM葡萄糖(24小时)；25mM葡萄糖(48小时)；25mM葡萄糖(72小时)；11mM葡萄糖和5μM衣霉素(TM)(24小时)；或11mM葡萄糖和20nM毒胡萝卜素(Tg)(24小时)。示出的数据使用定量实时PCR产生(n＝3,S.D.)。
图3为示出MANF、WFS1、TXNIP和CHOP mRNA在用5mM葡萄糖(LG)、11mM葡萄糖(MG)或25mM葡萄糖(HG)培养五天的，或用5mM葡萄糖(LG)培养五天和用0.5μM毒胡萝卜素(TG)培养6小时的小鼠初级胰岛(primary islets)中的相对表达的图。示出的数据使用定量实时PCR产生(n＝3,S.D.)。
图4为示出MANF mRNA在用5.5mM葡萄糖(UT)、25mM葡萄糖(HG)、0.25μM毒胡萝卜素(TG)、10μM胰岛淀粉样多肽(IAPP)或500μM含牛血清白蛋白的棕榈酸盐(酯)(Palmitate)24小时处理后在来自两个人类供体(HP11139-01和HI 11-20)的人初级胰岛(human primary islet)中的相对表达的图。示出的数据使用定量实时PCR产生(n＝3,S.D.)。
图5为示出可溶性MANF在人初级胰岛的培养基中无另外的处理或用25mM葡萄糖(24小时)、0.25μM毒胡萝卜素(24小时)或0.5mM棕榈酸盐(酯)(24小时)处理后的水平的免疫印迹。
图6为示出从人初级胰岛的培养基中无另外的处理或用25mM葡萄糖(24小时)、0.25μM毒胡萝卜素(24小时)或0.5mM棕榈酸盐(酯)(24小时)处理后的免疫沉淀的可溶性MANF的水平的免疫印迹。在该实验中，人MANF使用兔抗人MANF抗体(Proteintech)免疫沉淀，和将相同的抗体用于进行免疫印迹。
图7为示出BiP mRNA在转染有阴性对照siRNA(NC)或靶向MANFmRNA的三种不同siRNA分子(siMANF#1、siMANF#2或siMANF#3)之一的鼠科胰腺β-细胞系(MIN6)中在无另外的处理或用2μM衣霉素处理24小时后的相对表达的图。这些数据用定量实时PCR产生(n＝3,S.D.)。
图8为示出裂解的胱天蛋白酶(caspase)-3在未处理的或用1μM衣霉素或100nM毒胡萝卜素处理24小时并进一步用0、40或200nM可溶性MANF处理的鼠科胰腺β-细胞系(MIN6)中的水平的免疫印迹。
图9A为哺乳动物内质网-定位的氧化还原敏感的GFP(MEROS-GFP)的图。
图9B为COS7细胞的两个共焦图像。左图示出MEROS-GFP的荧光，右图中示出DsRed-ER示踪剂(tracker)的荧光。
图10A为一组MEROS-GFP在无处理或用不同浓度的DTT处理后的激发光谱(发射波长为510nM)。
图10B为氧化的MEROS-GFP在未处理NSC34细胞中的发射光谱(激发波长为394nM)。
图10C为还原的MEROS-GFP在用2mM DTT处理的NSC34细胞中发射光谱(激发波长为473nM)。
图11为一组四个使用476-nm激发波长(下面两幅图)或405-nm激发波长(上面两幅图)在用(右侧两幅图)或没用(左侧两幅图)2mM DTT处理的INS-1832/13细胞中聚集的MEROS-GFP的共焦显微图像。
图12为未加处理(无标记)的或用H2O2(1或0.1mM H2O2)或DTT(0.1、0.2、0.5、1、2、5或10mM DTT)处理的INS-1 832/13细胞中的MEROS-GFP比的图。MEROS-GFP比使用酶标仪(plate reader)确定。示出的数据为平均值±S.D.(n＝3)。
图13为未加处理的(左图)或用2mM DTT处理的(右图)的细胞的溶解产物中的4-乙酰氨基-4’-二苯乙烯马来酰亚胺(maleimidylstilbene)-2,2’-二磺酸(AMS)-改性的MEROS-GFP的非还原性(non-reducing)聚丙烯酰胺凝胶电泳照片。溶解产物为在电泳前未加处理的(-βME)(上方)或用β-巯基乙醇(+βME)处理的(下方)。
图14为示出用1mM DTT处理10分钟然后洗涤的NSC34细胞中MEROS-GFP比的时程(time course)的图。MEROS-GFP比在处理前一分钟至洗涤后四分钟之间的各分钟间隔下计算。下方的线表示473nM的激发下观察的荧光，黑色线表示MEROS-GFP比，浅灰色线表示394nM激发下的荧光(n＝3；S.D.)。
图15为稳定转染有MEROS-GFP的在无处理或用DTT(0.2、0.5或10mMDTT)处理后的INS-1 832/13细胞的荧光辅助细胞分选(FACS)数据。数据使用488nM和405nM的激发波长和510nM的发射光谱收集。从下方到上方来看，不同的数据集是未处理的、0.2mM DTT、0.5mM DTT和10mM DTT(表明在用增加浓度的DTT处理后向更加还原的状态移动)。
图16为稳定转染有MEROS-GFP的在无处理或用DTT(0.2mM、0.5mM或10mM DTT)处理后的INS-1 832/13细胞的FACS数据的直方图。横轴表示MEROS-GFP比，纵轴表示细胞数。从左至右的峰表示未处理的、0.2mM DTT-处理的、0.5mM DTT-处理的和10mM DTT处理的细胞。
图17为稳定转染有MEROS-GFP的在无处理或用DTT(0.2,0.5,or 10mMDTT)处理后的INS-1 832/13细胞中的中值MEROS-GFP比的图。示出的MEROS-GFP值标准化为未处理的值。
图18为示出稳定转染有MEROS-GFP的在无处理或用1mM H2O2处理30分钟后的INS-1 832/13细胞的FACS分析的数据的两幅图。右图为未处理或用1mM H2O2处理的INS-1 832/13细胞中MEROS-GFP比的柱状图。左图示出未处理(左)或用1mM H2O2处理30分钟的INS-1 832/13细胞中的中值MEROS-GFP比。
图19为使用FACS分析的在无处理或用衣霉素(TM)(5μM；24小时)、毒胡萝卜素(TG)(10nM；24小时)、TG(1μM；4小时)、布雷菲德菌素A(BreA)(100ng/mL；24小时)或MG132(100nM；24小时)处理后的INS-1 832/13细胞中计算的中值MEROS-GFP比的图。误差线(error bars)表示±S.D.(*p<0.01)。数据标准化为计算的未处理细胞的中值MEROS-GFP比。
图20为示出未加处理的或用1μM毒胡萝卜素(TG)处理4小时的INS-1832/13细胞中的MEROS-GFP比的直方图。
图21为使用FACS分析的在用11mM葡萄糖(24小时)处理或25mM葡萄糖处理24、48或72小时后的INS-1 832/13细胞中计算的中值MEROS-GFP比的图。误差线表示±S.D。数据标准化为计算的用11mM葡萄糖处理24小时的细胞的中值MEROS-GFP比。
图22为使用FACS分析的在无处理的、血清消耗或葡萄糖消耗后的INS-1832/13细胞中计算的中值MEROS-GFP比的图。误差线表示±S.D.(*p<0.01)。数据标准化为计算的未处理细胞的中值MEROS-GFP比。
图23为未加处理的或用棕榈酸(0.2mM；24小时)、棕榈酸(0.2mM)和高葡萄糖(25mM)(24小时)、棕榈酸(0.5mM；24小时)、油酸(0.5mM；24小时)或亚油酸(0.5mM；24小时)处理的INS-1 832/13细胞中的中值MEROS-GFP比的图。误差线表示±S.D.数据标准化为计算的未处理细胞的中值MEROS-GFP比。
图24为未加处理的或用人胰岛淀粉样多肽(IAPP)(10μM；24小时)、小鼠IAPP(10μM；24小时)或细胞因子(白细胞介素-1β(5ng/mL)、IFNγ(100ng/mL)和TNFα(25ng/mL)；24小时)处理的INS-1 832/13细胞中的中值MEROS-GFP比的图。误差线表示±S.D.数据标准化为计算的未处理细胞的中值MEROS-GFP比。
图25为来自未加处理的(左)或用0.5mM棕榈酸盐(酯)(PA)处理24小时的INS-1 832/13细胞的FACS数据的两幅图。y轴表示使用488nM激发后的荧光，x轴表示使用405nM激发后的荧光。
图26为示出使用FACS分析在无处理或用0.5mM棕榈酸盐(酯)(PA)或0.5mM油酸(OA)处理24小时后的INS-1 832/13细胞中计算的MEROS-GFP比的图。用棕榈酸盐(酯)处理的细胞的数据向右移动。
图27为示出还原的细胞在用11mM葡萄糖处理24小时或用25mM葡萄糖处理24、48或72小时后的INS-1 832/13细胞群体中的百分比的图。误差线表示±标准差(**p<0.01)。
图28为示出还原的细胞在无处理、血清消耗24小时或葡萄糖消耗24小时后的INS-1 832/13细胞群体中的百分比的图。误差线表示±标准差(**p<0.01)。
图29为示出还原的细胞在无处理，或用10μM人IAPP，10μM小鼠IAPP，或白细胞介素-1β(5ng/mL)、IFNγ(100ng/mL)和TNFα(25ng/mL)的组合处理24小时后的INS-1 832/13细胞群体中的百分比的图。误差线表示±标准差(**p<0.01)。
图30为示出还原的细胞在无处理，用0.2mM棕榈酸盐(酯)、0.2mM棕榈酸盐(酯)和25mM葡萄糖、0.5mM棕榈酸盐(酯)、0.5mM油酸、0.5mM亚油酸、牛血清白蛋白和0.5mM棕榈酸盐(酯)、0.5mM棕榈酸盐(酯)和0.5mM油酸、以及0.5mM棕榈酸盐(酯)和0.5mM亚油酸处理24小时后的INS-1 832/13细胞群体中的百分比的图。误差线表示±标准差(**p<0.01)。
图31为转染有BiP-P-mCherry的细胞的图和示出流式细胞仪激光线和滤波器的构造的图。
图32为氧化或还原的INS-1 832/13细胞中的中值BiP-P-mCherry表达的图。细胞为未加处理的或为用10nM毒胡萝卜素，5μM衣霉素，25mM葡萄糖，血清剥夺(serum deprivation)，葡萄糖剥夺(glucose deprivation)，0.5mM棕榈酸盐(酯)，10μM人IAP，或白细胞介素-1β(5ng/mL)、IFNγ(100ng/mL)和TNFα(25ng/mL)的组合处理24小时。BiP-P-mCherry表达使用FACS分析确定。误差线表示±标准差。
图33为示出用5μM衣霉素(TM,上方直方图)或葡萄糖剥夺(下方直方图)处理24小时的氧化和还原的INS-1 832/13细胞的两幅直方图。x轴表示表达由人BiP启动子驱动的mCherry的水平。
图34为来自用0.5mM棕榈酸盐(酯)处理24小时的INS-1 832/13细胞的FACS数据的直方图。
图35为示出FACS-分离的氧化和还原的INS-1 832/13细胞的纯度的直方图。
图36为示出BiP(左图)和剪接的XBP1(sXBP)(右图)在用0.5mM棕榈酸盐(酯)处理24小时的INS-1 832/13细胞中的表达水平的两幅图。BiP和sXBP的表达水平使用实时PCR测量。误差线表示±标准差。
图37为示出Derlin3、BiP、Herp和PDla5在从氧化的或还原的INS-1 832/13细胞中纯化的内质网中的表达水平的表格。表达数据使用DNA微阵列分析收集。
图38为示出用单独DMSO、10nM毒胡萝卜素(Tg)、10nM Tg和10μM吡格列酮、或者10nM Tg和500μg/mL牛黄熊脱氧胆酸(tauroursodeoxycholic acid，TUDCA)处理的INS-1 832/13细胞的死亡细胞的百分比(左图)或中值MEROS-GFP比(右图)的两幅图。
图39为示出使用MEROS-GFP体系的筛选体系的图。
图40为示出从在不存在(左上图)或存在(右上图)10μM阿朴吗啡(Apo)下用0.5mM棕榈酸盐(酯)处理后的INS-1 832/13-MEROS-GFP细胞收集的FACS数据的两幅直方图，和示出在无处理，或在存在或不存在10μM阿朴吗啡下用0.5mM棕榈酸盐(酯)处理后的INS-1 832/13 MEROS-GFP细胞中还原的细胞的百分比的图。误差线表示±标准差。
图41为从用0.5mM棕榈酸盐(酯)(PA)与10nM或50nM阿朴吗啡(Apo)、或不与10nM或50nM阿朴吗啡(Apo)处理后的用Mitoprobe染料染色的INS-1832/13-MEROS-GFP细胞收集的FACS数据的直方图。
图42为示出在不处理、或用单独0.5mM棕榈酸盐(酯)、或0.5mM棕榈酸盐(酯)和10nM阿朴吗啡处理后的通过FACS分析分级的低Δψ细胞的百分比(左图)和死亡细胞的百分比的两幅图。
图43为在不处理、或用10nM毒胡萝卜素(Tg)处理、或用10nM Tg和10nM阿朴吗啡处理后的死亡细胞的百分比的图。
图44为示出存在于10nM毒胡萝卜素-处理的初级人胰岛(右侧免疫印迹)、和用10nM阿朴吗啡或10μM吡格列酮处理的2μM多西环素(doxycycline)-处理的WFS1敲除的INS-1 832/13细胞(shWFS1)(左侧免疫印迹)中的裂解的胱天蛋白酶3(c-胱天蛋白酶3)和裂解的PARP(c-PARP)的量的两个免疫印迹。
图45为示出在11mM葡萄糖或25mM葡萄糖中培养后(24小时)(分别为上图和下图)，以及用0或0.5μg/mL可溶性MANF处理48小时(分别为左图和右图)后的内质网中含有还原形式EroGFP的INS1 832/13细胞(胰腺β细胞系)的百分比的荧光辅助细胞分选数据的图。细胞使用473nM的波长和510nM的发射光谱激发。
具体实施方式
本发明基于，至少部分地基于如下发现，可溶性MANF由应激的胰腺β-细胞分泌，并且可溶性MANF延缓内质网应激-诱导的胰腺β-细胞凋亡性细胞死亡并减少暴露于诱导内质网应激的试剂或条件的胰腺β-细胞中内质网的氧化还原状态的波动。鉴于这些发现，提供用于诊断胰腺β-细胞紊乱、预测受试者发展胰腺β-细胞紊乱的风险、监测受试者(例如，处于发展胰腺β-细胞紊乱的风险的受试者)中胰腺β-细胞功能和胰腺β-细胞团、监控受试者中胰腺β-细胞紊乱的治疗效力、鉴别发展胰腺β-细胞紊乱的风险增加的受试者、选择治疗胰腺β-细胞紊乱的受试者、选择参加临床研究的受试者和检测胰腺β-细胞中的内质网应激的方法。这些方法包括确定可溶性MANF的至少一个水平(例如，在来自受试者的生物样品中或在培养基中)。
还提供治疗或延缓受试者的胰腺β-细胞紊乱发病、减少胰腺β-细胞中的内质网应激、或者减少或延缓在两个以上的胰腺β-细胞群体中内质网应激-诱导的凋亡性细胞死亡的方法。这些方法包括向受试者施用有效量的可溶性MANF或阿朴吗啡，或者使胰腺β-细胞或胰腺β-细胞群体与可溶性MANF接触。在某些实施方案中，例如其中所述方法包括施用阿朴吗啡，受试者不患有勃起功能障碍或帕金森氏病。
还提供筛选用于治疗或延缓受试者的胰腺β-细胞紊乱发病的候选化合物、减少胰腺β-细胞中的内质网应激、或者减少或延缓胰腺β-细胞中内质网应激-诱导的凋亡性细胞死亡的方法。在某些实施方案中，这些方法包括提供胰腺β-细胞，使胰腺β-细胞与候选化合物接触，确定在候选化合物的存在下由胰腺β-细胞产生的可溶性MANF的水平，将由胰腺β-细胞产生的可溶性MANF的水平与可溶性MANF的参考水平相比较。在某些实施方案中，这些方法包括提供表达含有BiP信号序列、氧化还原敏感的荧光蛋白(例如，氧化还原敏感的绿色荧光蛋白或氧化还原敏感的黄色荧光蛋白)和氨基酸序列KDEL的报告蛋白的哺乳动物细胞(例如，胰腺β-细胞)；使该细胞与试验化合物接触；确定细胞中氧化的报告蛋白的存在量；和将细胞中氧化的报告蛋白的存在量与参考水平相比较；其中与参考水平相比细胞中氧化的报告蛋白的水平升高表明候选化合物可对治疗或延缓受试者的胰腺β-细胞紊乱发病、减少胰腺β-细胞中的内质网应激和/或减少或延缓在胰腺β-细胞中内质网应激-诱导的凋亡性细胞死亡有用。在某些实施方案中，这些方法包括提供表达含有BiP信号序列、氧化还原敏感的荧光蛋白(例如，氧化还原敏感的绿色荧光蛋白或氧化还原敏感的黄色荧光蛋白)和氨基酸序列KDEL的报告蛋白的哺乳动物细胞(例如，胰腺β-细胞)；使该细胞与试验化合物接触；确定细胞中还原的报告蛋白的存在量；和将细胞中还原的报告蛋白的存在量与参考水平相比较；其中与参考水平相比细胞中还原的报告蛋白的水平降低表明候选化合物可对治疗或延缓受试者的胰腺β-细胞紊乱发病、减少胰腺β-细胞中的内质网应激和/或减少或延缓在胰腺β-细胞中内质网应激-诱导的凋亡性细胞死亡有用。
胰腺β-细胞紊乱
胰腺β-细胞紊乱为特征在于受试者的胰腺β-细胞功能紊乱或胰腺β-细胞团递减的一类疾病。可在患有胰腺β-细胞紊乱的受试者中下降的胰腺β-细胞功能包括，但不限于，胰岛素产生和分泌、C-肽产生和分泌、和胰岛淀粉样多肽(IAPP)产生和分泌。胰腺β-细胞紊乱的非限制性实例包括1型糖尿病(糖尿病)、2型糖尿病和Wolfram综合征。胰腺β-细胞紊乱可发生在任何年龄的人类中，例如，在婴幼儿、儿童、成年和老年受试者中。例如，胰腺β-细胞紊乱可发生在年龄大于35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85或90的受试者中。
医疗保健专业人员(例如，医师、护士、医师助手或化验员(laboratorytechnician))可通过评定受试者的胰腺β-细胞紊乱的一种或多种(例如，两种、三种、四种或五种)症状来诊断受试者为患有胰腺β-细胞紊乱。受试者的胰腺β-细胞紊乱的非限制性症状包括与健康个体或群体(例如，空腹血糖水平大于100mg/dL或大于120mg/dL)相比血糖水平(例如，空腹血糖水平)显著增加，与健康个体或群体(例如，血红蛋白A1C水平大于6.5％，大于7.0％，或大于8.0％)相比糖化血红蛋白水平(血红蛋白A1C水平)显著增加，口渴增加，尿频，极度饥饿，无法解释的体重减轻，存在尿酮，疲劳，视力模糊，疮愈合缓慢，轻度高血压，和频繁感染。医疗保健专业人员还可在某种程度上基于受试者的胰腺β-细胞紊乱家族史来诊断。医疗保健专业人员可在将受试者送往医疗机构(例如，诊所或医院)时诊断患有胰腺β-细胞紊乱的受试者。在某些情况下，医疗保健专业人员可在将受试者收入辅助医疗机构的同时诊断受试者为患有胰腺β-细胞紊乱。典型地，医师在观察或检测受试者的一种或多种症状后诊断受试者的胰腺β-细胞紊乱。
医疗保健专业人员还可基于以下因素中的一种或多种来鉴别受试者为发展胰腺β-细胞紊乱的风险增加：体重增加(例如，体质指数(body massindex)>25或>30)，迟钝，胰腺β-细胞紊乱的家族史，种族，年龄，诊断患有多囊卵巢综合征，高血压，高密度脂蛋白水平下降(例如，低于35mg/dL)，和高水平甘油三酯(例如，超过250mg/dL)。
本文提供有用于诊断胰腺β-细胞紊乱的受试者(例如，表现胰腺β-细胞紊乱的一种或多种症状的受试者或不表现胰腺β-细胞紊乱症状的受试者(例如，未确诊和/或无症状受试者)的其它方法。还提供鉴别发展胰腺β-细胞紊乱的风险增加的受试者的其它方法。本文还提供治疗受试者的胰腺β-细胞紊乱的方法。
中脑星形胶质细胞来源的神经营养因子(MANF)
可溶性MANF蛋白的内源水平，如本文所述，可在本文记载的任一种方法中检测，例如作为诊断胰腺β-细胞紊乱、预测受试者发展胰腺β-细胞紊乱的风险、监测受试者(例如，处于发展胰腺β-细胞紊乱的风险的受试者)中胰腺β-细胞功能和胰腺β-细胞团，鉴别发展胰腺β-细胞紊乱的风险增加的受试者，选择治疗胰腺β-细胞紊乱的受试者，选择参加临床研究的受试者，和检测胰腺β-细胞中的内质网应激的标记物。纯化的、分离的和/或重组的可溶性MANF蛋白也可用于治疗或延缓受试者的胰腺β-细胞紊乱的发病、减少胰腺β-细胞中的内质网应激，和减少或延缓两个以上的胰腺β-细胞群体中内质网应激-诱导的凋亡性细胞死亡的方法。
MANF蛋白翻译为前体蛋白，前体蛋白随后从细胞(例如，胰腺β-细胞)裂解并释放为可溶性蛋白。下面示出全长(前体)人MANF蛋白和人可溶性MANF蛋白。下面加下划线的为前体人MANF蛋白中的25个氨基酸信号序列。下面还示出编码人前体MANF蛋白的mRNA。
人前体MANF蛋白(SEQ ID NO:1)
MRRMWATQGLAVALALSVLPGSRALRPGDCEVCISYLGRFYQDLKDRDVTFSPATIENELIKFCREARGKENRLCYYIGATDDAATKIINEVSKPLAHHIPVEKICEKLKKKDSQICELKYDKQIDLSTVDLKKLRVKELKKILDDWGETCKGCAEKSDYIRKINELMPKYAPKAASARTDL
人可溶性MANF蛋白(SEQ ID NO:2)
LRPGDCEVCISYLGRFYQDLKDRDVTFSPATIENELIKFCREARGKENRLCYYIGATDDAATKIINEVSKPLAHHIPVEKICEKLKKKDSQICELKYDKQIDLSTVDLKKLRVKELKKILDDWGETCKGCAEKSDYIRKINELMPKYAPKAASARTDL
人MANF mRNA(SEQ ID NO:3)
ggaggcggtg cggcgcggcg ggtgcggttc agtcggtcgg cggcggcagc ggaggaggag gaggaggaggaggaggagga ggatgaggag gatgtgggcc acgcaggggc tggcggtggc gctggctctg agcgtgctgc cgggcagccgggcgctgcgg ccgggcgact gcgaagtttg tatttcttat ctgggaagat tttaccagga cctcaaagac agagatgtcacattctcacc agccactatt gaaaacgaac ttataaagtt ctgccgggaa gcaagaggca aagagaatcg gttgtgctactatatcgggg ccacagatga tgcagccacc aaaatcatca atgaggtatc aaagcctctg gcccaccaca tccctgtggagaagatctgt gagaagctta agaagaagga cagccagata tgtgagctta agtatgacaa gcagatcgac ctgagcacagtggacctgaa gaagctccga gttaaagagc tgaagaagat tctggatgac tggggggaga catgcaaagg ctgtgcagaaaagtctgact acatccggaa gataaatgaa ctgatgccta aatatgcccc caaggcagcc agtgcacgga ccgatttgtagtctgctcaa tctctgttgc acctgagggg gaaaaaacag ttcaactgct tactcccaaa acagcctttt tgtaatttat tttttaagtgggctcctgac aatactgtat cagatgtgaa gcctggagct ttcctgatga tgctggccct acagtacccc catgaggggattcccttcct tctgttgctg gtgtactcta ggacttcaaa gtgtgtctgg gattttttta ttaaagaaaa aaaatttcta gctgtccttgcagaattata gtgaatacca aaatggggtt ttgccccagg aggctcctaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa
还记载了牛、大鼠、小鼠、猪、苍蝇和斑马鱼可溶性MANF蛋白序列，并在下面示出。
牛可溶性MANF(SEQ ID NO:4)
LRQGDCEVCISYLGRFYQDLKDRDVTFSPASIEKELIKFCREARGKENRLCYYIGATEDAATKIINEVSKPLSHHIPVEKICEKLKKKDSQICELKYDKQIDLSTVDLKKLRVKELKKILDDWGETCKGCAEKSDYIRKINELMPKYAPKAASSRTDL
大鼠可溶性MANF(SEQ ID NO:5)
LRPGDCEVCISYLGRFYQDLKDRDVTFSPATIEEELIKFCREARGKENRLCYYIGATDDAATKIINEVSKPLAHHIPVE KICEKLKKKDSQICELKYGECD
小鼠可溶性MANF(SEQ ID NO:6)
LRPGDCEVCISYLGRFYQDLKDRDVTFSPATIEEELIKFCREARGKENRLCYYIGATDDAATKIINEVSKPLAHHIPVEKICEKLKKKDSQICELKYDKQIDLSTVDLKKLRVKELKKILDDWGEMCKGCAEKSDYIRKINELMPKYAPKAASARTDL
猪可溶性MANF(SEQ ID NO:7)
LRPGDCEVCISYLGRFYQDLKDRDVTFSPASIEKELTKFCREARGKENRLCYYIGATDDAATKIINEVSKPLAHHIPVEKICEKLKKKDSQICELKYDKQIDLSTVDLKKLRVKELKKILDDWGETCKGCAEKSDYIRKINELMPKYAPKAASSRTD
黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)可溶性MANF(SEQ ID NO:8)
LKEEDCEVCVKTVRRFADSLDDSTKKDYKQIETAFKKFCKAQKNKEHRFCYYLGGLEESATGILNELSKPLSWSMPAEKICEKLKKKDAQICDLRYEKQIDLNSVDLKKLKVRDLKKILNDWDESCDGCLEKGDFIKRIEELKPKYSR SEL
斑马鱼可溶性MANF(SEQ ID NO:9)
LKDGECEVCVGFLQRLYQTIQENNVKFDSDSIEKALLKSCKDAKGKENRFCYYIGATSDAATKITNEVSKPMSYHVPVEKICEKLKKKDSQICELKYDKQVDLSSVDLKKLKVKDLKKILEEWGESCKGCVEKSDFIRKINELMPKYAPSAAKARTDL
哺乳动物可溶性MANF蛋白高度保守，其中人和牛可溶性MANF蛋白具有96％的同一性，人和小鼠可溶性MANF蛋白具有99％的同一性，人和猪可溶性MANF蛋白具有97％的同一性。人可溶性MANF蛋白液与斑马鱼可溶性MANF蛋白共享72％的同一性和88％的相似性。
诊断方法
本文提供诊断受试者的胰腺β-细胞紊乱的方法。这些方法包括确定(分析)可溶性MANF在来自受试者的生物样品中的水平，并将可溶性MANF在生物样品中的水平与可溶性MANF的参考水平相比较。在这些方法中，与可溶性MANF的参考水平相比可溶性MANF在生物样品中的水平升高表明受试者患有胰腺β-细胞紊乱，与可溶性MANF的参考水平相比可溶性MANF在生物样品中的水平降低或无显著变化表明受试者不患有胰腺β-细胞紊乱。
如本文任一处所提到的，“可溶性MANF的参考水平”可为可溶性MANF的阈值水平，可溶性MANF存在于对照受试者或群体(例如，未诊断为患有疾病的受试者或群体(健康受试者或群体)，不具有胰腺β-细胞紊乱的一种或多种症状，和/或不具有胰腺β-细胞紊乱的家族史)中的水平，或可溶性MANF在同一受试者的较早时间点时的水平。
可溶性MANF的水平可使用本领域已知的方法确定。例如，可溶性MANF的水平可使用利用与可溶性MANF特异性结合的抗体的本领域已知的多种技术(例如，酶联免疫吸附试验)检测。与人可溶性MANF特异性结合的多种抗体是商购可得的(例如，兔抗人可溶性MANF抗体，可购自Sigma-Aldrich和Proteintech)。
本文记载的任一种方法可进一步包括从受试者获得或收集样品(例如，包含生物流体例如尿、血液、血浆、血清或脑脊液的生物样品)。在本文记载的任一种方法中，生物样品可在确定可溶性MANF的水平之前保存一段时间(例如，至少1小时或至少24小时)(例如，在10℃或低于10℃下保存)。
本文记载的任一种方法可对送往医疗机构(例如，医院、诊所或辅助医疗机构)的患者进行。受试者可表现出胰腺β-细胞紊乱的一种或多种症状(例如，本文记载的胰腺β-细胞紊乱的任一种症状)。受试者可被怀疑患有胰腺β-细胞紊乱。受试者还可表现出无胰腺β-细胞紊乱症状(无症状受试者)或只有一种胰腺β-细胞紊乱症状。受试者可具有胰腺β-细胞紊乱(例如，2型糖尿病)的家族史。受试者还可具有发展胰腺β-细胞紊乱的风险增加。受试者可为婴幼儿、儿童、青少年、成年人或老年人。
在某些实施方案中，所述方法对具有可检测或可观察的胰腺β-细胞团和/或具有可检测或可观察量的胰腺β-细胞功能的受试者(例如，不具有完全丧失的胰腺β-细胞团或胰腺β-细胞功能的受试者)进行。本文记载了检测胰腺β-细胞功能的方法。胰腺β-细胞团可通过观察受试者的胰腺β-细胞功能或使用本领域已知的方法(例如，美国专利申请20110123443号公报中记载的方法)直接检测。
本文记载的诊断方法可由任何医疗保健专业人员(例如，医师、化验员、护士、医师助理和护士助理)进行。本文记载的诊断方法可与一种或多种本领域已知的或本文记载的其它诊断试验方法组合使用(例如，观察或评定受试者的胰腺β-细胞紊乱的一种或多种症状，例如，血糖监测、糖化血红蛋白分析、胰岛素水平、IAPP水平、C-肽水平或尿中酮类的水平)。本文记载的诊断方法可对鉴别为发展胰腺β-细胞紊乱的风险增加的受试者(例如，使用本文记载的任一种方法鉴别为发展胰腺β-细胞紊乱的风险增加的受试者)进行。在某些实施方案中，本文记载的诊断方法可对已鉴别为发展胰腺β-细胞紊乱的风险增加的受试者定期进行(例如，至少每月、每两个月、每六个月或每年一次)。某些实施方案进一步包括从受试者收集生物样品。
某些实施方案另外包括向鉴别为患有胰腺β-细胞紊乱或处于发展胰腺β-细胞紊乱的风险的受试者施以针对胰腺β-细胞紊乱的治疗(例如，分离、纯化或重组的可溶性MANF蛋白、吡格列酮、GLP-1或DPP-4抑制剂(例如，西他列汀、维达列汀、沙格列汀、利拉列汀、度格列汀、吉格列汀和阿格列汀)，或者本文记载的任意组合物，例如治疗有效剂量的含有与SEQ ID NO:2至少90％同一的序列的可溶性MANF蛋白和/或阿朴吗啡)。某些实施方案另外包括进行附加试验来证实胰腺β-细胞紊乱在受试者中的诊断。某些实施方案包括选择受试者用于周期性葡萄糖监测(例如，使用血糖仪的周期性自体葡萄糖(self-glucose)监测)或本文记载的任一种监测方法。某些实施方案另外包括选择受试者用于由医师或医疗保健专业人员进行的周期性医学评定(例如，至少每年一次、至少每六个月一次、至少每三个月一次、至少每两个月一次或至少每个月一次的周期性探访)。某些实施方案包括记录受试者医疗记录中诊断试验的结果，或者使用本文所述方法对诊断为患有胰腺β-细胞紊乱的受试者的一名以上的直系家庭(lineal family)成员进行胰腺β-细胞紊乱的诊断试验。
预测发展胰腺β-细胞紊乱的风险的方法
还提供预测受试者发展胰腺β-细胞紊乱的风险的方法。这些方法包括确定(试验)可溶性MANF在来自受试者的生物样品中的水平并将可溶性MANF在生物样品中的水平与可溶性MANF的参考水平相比较。与可溶性MANF的参考水平相比可溶性MANF在生物样品中的水平升高表明受试者发展胰腺β-细胞紊乱的风险增加，和与参考水平相比可溶性MANF在生物样品中的水平降低或没有显著差异表明受试者发展胰腺β-细胞紊乱的风险降低或不显著。本文记载的可溶性MANF的任何参考水平可用于这些方法中。某些实施方案另外包括从受试者获得生物样品。
可溶性MANF的水平可使用本领域已知的方法确定。例如，可溶性MANF的水平可使用利用与可溶性MANF特异性结合的抗体的本领域已知的多种技术(例如，酶联免疫吸附试验)检测。在某些实施方案中，所述方法另外包括从受试者获得或收集样品(例如，包含生物流体例如尿、血液、血浆、血清或脑脊液的生物样品)。
本文记载的任一种方法可对送往医疗机构(例如，医院、诊所或辅助医疗机构)的患者进行。在某些实施方案中，所述方法作为由医疗保健专业人员进行的周期性物理检查的一部分对受试者进行。受试者可表现出胰腺β-细胞紊乱的一种或多种症状(例如，本文记载的胰腺β-细胞紊乱的任一种症状)。受试者可被怀疑患有胰腺β-细胞紊乱。受试者还可表现出无胰腺β-细胞紊乱症状(无症状受试者)或只有一种胰腺β-细胞紊乱症状。受试者可具有胰腺β-细胞紊乱(例如，2型糖尿病)的家族史。受试者可为婴幼儿、儿童、青少年、成年人或老年人。
本文记载的这些诊断方法可由任何医疗保健专业人员(例如，医师、化验员、护士、医师助理和护士助理)进行。这些方法可与用于鉴别处于发展胰腺β-细胞紊乱的风险的受试者的本领域已知的任何其它方法(例如，评定下列一个或多个因素：体重增加、迟钝、胰腺β-细胞紊乱的家族史、种族、年龄、诊断患有多囊卵巢综合征、高血压、高密度脂蛋白水平下降(例如，低于35mg/dL)和高水平的三酸甘油酯(例如，高于250mg/dL))组合使用。鉴别为发展胰腺β-细胞紊乱的风险增加的受试者可使用本文记载的任何方法监测(参见，例如下一部分)。
某些实施方案另外包括向鉴别为发展胰腺β-细胞紊乱的风险增加的受试者施以针对胰腺β-细胞紊乱的治疗(例如，分离、纯化或重组的可溶性MANF蛋白、吡格列酮、GLP-1或DPP-4抑制剂(例如，西他列汀、维达列汀、沙格列汀、利拉列汀、度格列汀、吉格列汀和阿格列汀)，或者本文记载的任意组合物，例如治疗有效剂量的含有与SEQ ID NO:2至少90％同一的序列的可溶性MANF蛋白和/或阿朴吗啡)。某些实施方案包括选择鉴别为发展胰腺β-细胞紊乱的风险增加的受试者用于周期性葡萄糖监测(例如，使用血糖仪的周期性自体葡萄糖监测)。某些实施方案另外包括选择鉴别为具有发展胰腺β-细胞紊乱的风险增加的受试者用于由医师或医疗保健专业人员进行的周期性医学评定(例如，至少每年一次、至少每六个月一次、至少每三个月一次、至少每两个月一次或至少每个月一次的周期性探访)。某些实施方案另外包括记录受试者医疗记录中的试验结果，或者使用本文记载的方法对鉴别为发展胰腺β-细胞紊乱的风险增加的受试者的一名以上的直系家庭成员进行类似的试验或任何本领域已知的试验来确定发展胰腺β-细胞紊乱的风险。
监测胰腺β-细胞功能紊乱和胰腺β-细胞团的方法
还提供监测受试者(例如，处于发展胰腺β-细胞紊乱的风险的受试者，患有胰腺β-细胞紊乱的受试者或具有接收的胰腺β-细胞移植物的受试者)的胰腺β-细胞功能紊乱的方法。这些方法包括确定(试验)在第一时间点时可溶性MANF在来自受试者的生物样品中的水平，确定(试验)在第二时间点时可溶性MANF在来自受试者的生物样品中的水平，和将第二时间点时可溶性MANF在生物样品中的水平与第一时间点时可溶性MANF在生物样品中的水平相比较。与第一时间点时可溶性MANF的水平相比第二时间点时可溶性MANF在生物样品中的水平升高表明受试者的胰腺β-细胞功能下降(例如，显著的、可观察的或可检测的下降)或胰腺β-细胞团减少。与第一时间点时可溶性MANF在生物样品中的水平相比第二时间点时可溶性MANF在生物样品中的水平降低或无显著变化表明受试者胰腺β-细胞功能或胰腺β-细胞团没有变化或增加。
在某些实施方案中，所述方法对在第一时间点和第二时间点具有可检测的或可观察的胰腺β-细胞团和/或具有可检测的或可观察的量的胰腺β-细胞功能的受试者(例如，在第一和第二时间点不具有完全丧失的胰腺β-细胞团或胰腺β-细胞功能的受试者)进行。
在某些实施方案中，第二时间点可为第一时间点之后的至少6小时(例如，至少12小时、18小时、24小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、6个月、1年、2年、3年、4年或5年)。在某些实施方案中，第一时间点可为进入医疗机构的入院时间或首次出现胰腺β-细胞紊乱的至少一种症状的1周内。
在某些实施方案中，所述方法可另外包括确定(试验)在一个以上的其它的稍迟时间点时可溶性MANF在来自受试者的生物样品中的水平。在这些方法中，与可溶性MANF在稍早(例如，在之前的即刻)样品(按时间顺序(chronological time)稍早收集的)中的水平相比，可溶性MANF在稍迟样品(按时间顺序稍后收集的)中的水平升高表明受试者的胰腺β-细胞功能下降(例如，显著的、可观察的、或可检测的下降)或胰腺β-细胞团减少。同样地，与可溶性MANF在稍早(例如，在之前的即刻)样品(按时间顺序稍早收集的)中的水平相比，可溶性MANF在稍迟样品(按时间顺序稍后收集的)中的水平的下降或无显著变化表明受试者的胰腺β-细胞功能或胰腺β-细胞团没有变化或增加。在某些实施方案中，这些方法对在第一、第二和一个以上的其它时间点时具有可检测的或可观察的胰腺β-细胞团和/或具有可检测的或可观察的量的胰腺β-细胞功能的受试者(例如，在第一、第二和一个以上的其它时间点时不具有完全丧失的胰腺β-细胞团或胰腺β-细胞功能的受试者)进行。
在某些实施方案中，受试者可预先接受了胰腺β-细胞移植物，以便这些方法在某种程度上监测移植入受试者中的胰腺β-细胞的胰腺β-细胞功能和胰腺β-细胞团。在某些实施方案中，移植的胰腺β-细胞是自体移植、同种移植或异种移植的胰腺β-细胞。在某些实施方案中，移植的胰腺β-细胞存在于装置中，或被生物相容性聚合物包围或置于生物相容性聚合物中。在某些实施方案中，移植的胰腺β-细胞存在于除胰腺以外的组织(例如，肝组织)中。在某些实施方案中，这些方法在胰腺β-细胞移植1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月或1年内的受试者中进行。在某些实施方案中，第一时间点在移植操作后不久(例如，在1周或2周内)。
可溶性MANF的水平可使用本领域已知的方法确定。例如，可溶性MANF的水平可使用利用与可溶性MANF特异性结合的抗体的本领域已知的多种技术(例如，酶联免疫吸附试验)检测。在某些实施方案中，所述方法另外包括从受试者获得或收集样品或至少两个样品(例如，包含生物流体例如尿、血液、血浆、血清或脑脊液的生物样品)。
本文记载的任一种方法可对送往医疗机构(例如，医院、诊所或辅助医疗机构)的患者进行。在某些实施方案中，所述方法对受试者进行作为由医疗保健专业人员进行的周期性检查的一部分。受试者可表现出胰腺β-细胞紊乱的一种或多种症状(例如，本文记载的胰腺β-细胞紊乱的任一种症状)。受试者还可表现出无胰腺β-细胞紊乱症状(无症状受试者)或只有一种胰腺β-细胞紊乱症状。受试者可具有胰腺β-细胞紊乱(例如，2型糖尿病)的家族史。受试者可为婴幼儿、儿童、青少年、成年人或老年人。
本文记载的这些方法可由任何医疗保健专业人员(例如，医师、化验员、护士、医师助理和护士助理)进行。鉴别为具有胰腺β-细胞功能下降(例如，显著的、可观察的或可检测的下降)或胰腺β-细胞团减少的受试者可施以针对胰腺β-细胞紊乱的治疗(例如，分离、纯化或重组的可溶性MANF蛋白、吡格列酮、GLP-1或DPP-4抑制剂(例如，西他列汀、维达列汀、沙格列汀、利拉列汀、度格列汀、吉格列汀和阿格列汀)，或者本文记载的任意组合物，例如治疗有效剂量的含有与SEQ ID NO:2至少90％同一的序列的可溶性MANF蛋白和/或阿朴吗啡)。在某些实施方案中，例如，其中所述方法包括施用阿朴吗啡，受试者不具有勃起功能障碍或帕金森氏病。
某些实施方案另外包括受试者的一种或多种(例如两种、三种或四种)胰腺β-细胞功能障碍的其它标记物的附加检测或评定(例如，降低的C-肽产生和分泌、降低的胰岛素产生和分泌、降低的IAPP产生和分泌、增加的血糖水平、增加的糖化血红蛋白水平和受试者生物流体中(例如，在尿中)酮类的存在)。用于检测胰腺β-细胞的一种或多种其它标记物的方法是本领域已知的。
某些实施方案另外包括向鉴别为具有胰腺β-细胞功能下降或胰腺β-细胞团减少的受试者施以针对胰腺β-细胞紊乱的治疗(例如，分离、纯化或重组的可溶性MANF蛋白、吡格列酮、GLP-1或DPP-4抑制剂(例如，西他列汀、维达列汀、沙格列汀、利拉列汀、度格列汀、吉格列汀和阿格列汀)，或者本文记载的任意组合物，例如治疗有效剂量的含有与SEQ ID NO:2至少90％同一的序列的可溶性MANF蛋白和/或阿朴吗啡)。某些实施方案包括选择鉴别为具有胰腺β-细胞功能下降或胰腺β-细胞团减少的受试者用于周期性葡萄糖监测(例如，使用血糖仪的周期性自体葡萄糖监测)。某些实施方案另外包括选择鉴别为具有胰腺β-细胞功能下降或胰腺β-细胞团减少的受试者用于由医师或保健专业人员的周期性医学评定(例如，至少每年一次、至少每六个月一次、至少每三个月一次、至少每两个月一次、至少每个月一次或至少每周一次的周期性探访)。某些实施方案另外包括记录受试者医疗记录中的试验结果，或者对鉴别为具有胰腺β-细胞功能下降或胰腺β-细胞团减少的受试者的一名以上的直系家庭成员进行类似的试验或任何本领域已知的试验来监测胰腺β-细胞功能或胰腺β-细胞团。某些实施方案另外包括选择具有胰腺β-细胞功能下降或胰腺β-细胞团减少的受试者用于胰腺β-细胞移植。
监测胰腺β-细胞紊乱的治疗效力的方法
还提供监测受试者(例如，诊断为患有胰腺β-细胞紊乱的受试者)胰腺β-细胞功能紊乱的治疗效力的方法。这些方法包括确定(试验)在第一时间点时可溶性MANF在来自受试者的生物样品中的水平，确定(试验)在第二时间点时可溶性MANF在来自受试者的生物样品中的水平，和将第二时间点时可溶性MANF在生物样品中的水平与第一时间点时可溶性MANF在生物样品中的水平相比较，其中(i)第一时间点为在治疗之前，和第二时间点为在治疗起始后的任意时间点，或(ii)第一时间点在治疗起始之后，和第二时间点为晚于治疗期间或之后的时间点；和与第一时间点时可溶性MANF在生物样品中的水平相比第二时间点时可溶性MANF在生物样品中的水平降低表明该治疗在受试者中是有效的。在某些实施方案中，胰腺β-细胞紊乱的治疗是施用胰岛素(例如，本文记载的任意形式的胰岛素)、吡格列酮和TUDCA中的一种或多种。在某些实施方案中，治疗为将胰腺β-细胞移植入受试者(例如，如本文记载的)。
与第一时间点时可溶性MANF的水平相比第二时间点时可溶性MANF在生物样品中的水平降低表明在受试者中治疗有效。与第一时间点时可溶性MANF的水平相比第二时间点时可溶性MANF在生物样品中的水平增加或无显著变化表明治疗无效和/或本治疗应终止和/或应向受试者施用替代疗法。在某些实施方案中，与第一时间点时可溶性MANF的水平相比第二时间点时可溶性MANF在生物样品中的水平增加或无显著变化表明应向受试者施用增加治疗剂量或应以提高的频率和/或持续时间施用治疗。
在某些实施方案中，所述方法对在第一和第二时间点时具有可检测的或可观察的胰腺β-细胞团和/或具有可检测的或可观察的量的胰腺β-细胞功能的受试者(例如，在第一和第二时间点不具有完全丧失的胰腺β-细胞团或胰腺β-细胞功能的受试者)进行。在某些实施方案中，所述方法对预先已鉴别或诊断为患有胰腺β-细胞紊乱的受试者进行。某些实施方案另外包括选择患有胰腺β-细胞紊乱的受试者。某些实施方案另外包括从受试者获得样品。某些实施方案另外包括向受试者施用一种或多种剂量的治疗。
在某些实施方案中，第二时间点可为第一时间点之后的至少6小时(例如，至少12小时、18小时、24小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、6个月、1年、2年、3年、4年或5年)。在某些实施方案中，第一时间点可为进入医疗机构的入院时间或首次出现胰腺β-细胞紊乱的至少一种症状的1周内。
在某些实施方案中，所述方法可进一步包括确定(试验)在一个以上的另外的稍迟时间点时可溶性MANF在来自受试者的生物样品中的水平。在这些方法中，与可溶性MANF在稍早(例如，在之前的即刻)样品(按时间顺序稍早收集的)中的水平相比，可溶性MANF在稍迟样品(按时间顺序稍后收集的)中的水平降低表明受试者中的治疗效力。同样地，与可溶性MANF在稍早(例如，在之前的即刻)样品(按时间顺序稍早收集的)中的水平相比，可溶性MANF在稍迟样品(按时间顺序稍后收集的)中的水平的升高或无显著变化表明治疗在受试者中无效。在某些实施方案中，这些方法对在第一、第二和一个以上的其它时间点时具有可检测的或可观察的胰腺β-细胞团和/或具有可检测的或可观察的量的胰腺β-细胞功能的受试者(例如，在第一、第二和一个以上的其它时间点时不具有完全丧失的胰腺β-细胞团或胰腺β-细胞功能的受试者)进行。
在某些实施方案中，受试者可预先接受了胰腺β-细胞移植物，以便这些方法在某种程度上监测胰腺β-细胞移植在受试者中的效力。在某些实施方案中，移植的胰腺β-细胞是自体移植、同种移植或异种移植的胰腺β-细胞。在某些实施方案中，移植的胰腺β-细胞存在于装置中，或被生物相容性聚合物包围或置于生物相容性聚合物中。在某些实施方案中，移植的胰腺β-细胞存在于除胰腺以外的组织(例如，肝组织)中。在某些实施方案中，这些方法在胰腺β-细胞移植1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月或1年内的受试者中进行。在某些实施方案中，第一时间点在移植操作后不久(例如，在1周或2周内)。
可溶性MANF的水平可使用本领域已知的方法确定。例如，可溶性MANF的水平可使用利用与可溶性MANF特异性结合的抗体的本领域已知的多种技术(例如，酶联免疫吸附试验)检测。在某些实施方案中，所述方法另外包括从受试者获得或收集样品或至少两个样品(例如，包含生物流体例如尿、血液、血浆、血清或脑脊液的生物样品)。
本文记载的任一种方法可对送往医疗机构(例如，医院、诊所或辅助医疗机构)的患者进行。在某些实施方案中，所述方法作为由医疗保健专业人员进行的周期性物理检查的一部分对受试者进行。受试者可预先诊断有胰腺β-细胞紊乱和/或可表现出胰腺β-细胞紊乱的一种或多种症状(例如，本文记载的胰腺β-细胞紊乱的任一种症状)。受试者可为婴幼儿、儿童、青少年、成年人或老年人。
这些方法可由任何医疗保健专业人员(例如，医师、化验员、护士、医师助理和护士助理)进行。某些实施方案另外包括受试者的一种或多种(例如两种、三种或四种)胰腺β-细胞紊乱的其它标记物的附加检测或评定(例如，增加的C-肽产生和分泌、增加的胰岛素产生和分泌、增加的IAPP产生和分泌、降低的血糖水平、降低的糖化血红蛋白水平、和受试者生物流体中(例如，在尿中)在第二时间点的缺乏或无显著水平的酮类(相对于第一时间点时的相应水平)另外表明治疗是有效的)。用于检测胰腺β-细胞的一种或多种其它标记物的方法是本领域已知的。
选择用于治疗的受试者的方法
还提供选择治疗胰腺β-细胞紊乱的受试者的方法。这些方法包括确定(试验)可溶性MANF在来自受试者的生物样品中的水平；将可溶性MANF在生物样品中的水平与可溶性MANF的参考水平相比较；选择具有与参考水平相比可溶性MANF在生物样品中的水平升高的受试者用于治疗胰腺β-细胞紊乱。在这些方法中，不选择具有与参考水平相比可溶性MANF在生物样品中的水平降低或无显著变化的受试者用于胰腺β-细胞紊乱的治疗。
某些实施方案可另外包括试验或确定胰腺β-细胞紊乱的一种或多种其它标记物的水平，其中胰腺β-细胞紊乱的一种或多种其它标记物的检测另外表明应选择受试者用于治疗胰腺β-细胞紊乱。这些胰腺β-细胞紊乱的一种或多种其它标记物包括C肽在来自受试者的生物样品中的水平降低、IAPP在来自受试者的生物样品中的水平降低、胰岛素在来自受试者的生物样品中的水平降低、受试者的一种或多种血糖水平增加、受试者的糖化血红蛋白水平增加或在来自受试者的生物样品中(例如，在尿中)检测到酮类。用于检测C-肽、IAPP、胰岛素、血糖、糖化血红蛋白和酮类在来自受试者的生物样品中的水平的方法是本领域已知的。
可溶性MANF的水平可使用本领域已知的方法确定。例如，可溶性MANF的水平可使用利用与可溶性MANF特异性结合的抗体的本领域已知的多种技术(例如，酶联免疫吸附试验)检测。在某些实施方案中，所述方法另外包括从受试者获得或收集样品(例如，包含生物流体例如尿、血液、血浆、血清或脑脊液的生物样品)。所述方法可由任何医疗保健专业人员(例如，医师、护士、医师助理、化验员、或护士助理)进行。
受试者可表现出胰腺β-细胞紊乱的一种或多种症状(例如，本文记载的胰腺β-细胞紊乱的任一种症状)。受试者还可表现出无胰腺β-细胞紊乱症状或只有一种胰腺β-细胞紊乱症状。受试者可被怀疑患有胰腺β-细胞紊乱或受试者可具有发展胰腺β-细胞紊乱的风险增加。受试者可具有胰腺β-细胞紊乱(例如，2型糖尿病)的家族史。受试者可预先诊断为患有胰腺β-细胞紊乱。
在某些实施方案中，所述方法对具有可检测的或可观察的胰腺β-细胞团和/或具有可检测的或可观察的量的胰腺β-细胞功能的受试者(例如，不具有完全丧失的胰腺β-细胞团或胰腺β-细胞功能的受试者)进行。
可向受试者施用的胰腺β-细胞紊乱的治疗包括，但不限于：可溶性MANF(例如，含有与SEQ ID NO:2(即与SEQ ID NO:2全长)至少80％同一的序列的可溶性MANF蛋白)、阿朴吗啡、速效胰岛素(例如，天冬(aspart)或赖脯(lispro)胰岛素)、短效(例如，常规胰岛素)、中效胰岛素(例如，中效低精蛋白锌胰岛素(neutral protamine Hagedorn)或NPH胰岛素)、长效胰岛素(例如，超慢(ultralente)胰岛素)、甘精胰岛素(insulin glargine)、地特胰岛素(insulindetemir)、普兰林肽(pramlintide)、肠降糖素模拟物(incretin mimetics)(例如，艾塞那肽(exenatide))、磺酰脲类(例如，氯磺丙脲(chorpropamide)、格列吡嗪(glipizide)、格列本脲(glyburide)和格列美脲(glimepiride))、氯茴苯酸类(meglitinides)(例如，瑞格列奈(repaglinide)和那格列奈(nateglinide))、双胍类(例如，二甲双胍)、噻唑烷二酮类(例如，罗格列酮(rosiglitazone)和吡格列酮)、α-葡萄糖苷酶抑制剂(例如，阿卡波糖(acarbose)和米格列醇(meglitol))和DPP-4抑制剂(例如，西他列汀和沙格列汀)。胰腺β-细胞紊乱的治疗可包括以任意组合使用的一种或多种(例如，两种、三种或四种)上述试剂。在某些实施方案中，例如，其中所述方法包括施用阿朴吗啡，受试者不患有勃起功能障碍或帕金森氏病。
这些方法中的某些实施方案另外包括向受试者施用至少一种(例如，两种、三种或四种)胰腺β-细胞紊乱用的治疗(例如，本文记载的或本领域已知的胰腺β-细胞紊乱的一种或多种治疗)。例如这些方法中的某些实施方案另外包括施用本文记载的任意药物组合物的至少一剂(例如，至少两剂、四剂、六剂、八剂或十剂)。胰腺β-细胞紊乱的治疗可持续一段时间，至少1周、1个月、6个月、1年、2年、3年、4年、5年或10年。治疗可周期性施用至受试者(例如，每天一次、每天两次、每天三次、每天四次、每周一次、每周两次、每周三次、每周四次、每个月一次、每个月两次、每个月三次或每个月四次)。
在某些实施方案中，选择具有与参考水平相比可溶性MANF的水平升高的受试者用于由医师或保健专业人员进行的周期性医学评定(例如，至少每年一次、至少每六个月一次、至少每三个月一次、至少每两个月一次、至少每个月一次或至少一周一次的周期性探访)。某些实施方案另外包括记录受试者的医疗记录，受试者应施用或开处方(prescribed)的胰腺β-细胞紊乱的一种或多种治疗(例如，本文记载的任一种示例性治疗)。在某些实施方案中，选择具有与参考水平相比可溶性MANF水平升高的受试者用于胰腺β-细胞移植。
鉴别受试者处于发展胰腺β-细胞紊乱的风险的方法
还提供鉴别受试者处于发展胰腺β-细胞紊乱的风险的方法。这些方法包括确定可溶性MANF在来自受试者的生物样品中的水平；将可溶性MANF在来自受试者的生物样品中的水平与可溶性MANF的参考水平相比较。如果与参考水平相比可溶性MANF在来自受试者的生物样品中的水平升高，则受试者鉴别为发展胰腺β-细胞紊乱的风险增加。如果与参考水平相比可溶性MANF在来自受试者的生物样品中的水平降低或无显著变化，则受试者鉴别为发展胰腺β-细胞紊乱的风险降低。
在本文记载的任一种方法中，增加的风险是相对于不具有可溶性MANF水平的显著的或可观察的升高的受试者(例如，使用本文记载的任一种方法未诊断为患有胰腺β-细胞紊乱的受试者，未诊断为患有疾病的健康受试者，或不具有胰腺β-细胞紊乱的症状或胰腺β-细胞紊乱的家族史的受试者)的。
可溶性MANF的水平可使用标准方法(例如，本领域已知的任一种基于抗体的方法)确定。所述方法可由任何医疗保健专业人员(例如，医师、护士、医师助理、化验员、或护士助理)进行。
受试者可表现出胰腺β-细胞紊乱的一种或多种症状(例如，本文记载的胰腺β-细胞紊乱的任一种症状)。受试者还可被怀疑患有胰腺β-细胞紊乱。受试者还可表现出无胰腺β-细胞紊乱症状或只有一种胰腺β-细胞紊乱症状。受试者可具有胰腺β-细胞紊乱(例如，2型糖尿病)的家族史。
在某些实施方案中，所述方法对具有可检测的或可观察的胰腺β-细胞团和/或可检测的或可观察的量的胰腺β-细胞功能的受试者(例如，不具有完全丧失的胰腺β-细胞团或胰腺β-细胞功能的受试者)进行。
鉴别为发展胰腺β-细胞紊乱的风险增加的受试者可施以胰腺β-细胞紊乱的治疗(例如，本文记载的任一种治疗)或可施以新的或替代的胰腺β-细胞紊乱治疗。鉴别为发展胰腺β-细胞紊乱的风险增加的受试者还可进行更加积极的治疗处理(例如，增加的探访诊所或医院的周期)。
某些实施方案另外包括向鉴别为发展胰腺β-细胞紊乱的风险增加的受试者施以针对胰腺β-细胞紊乱的治疗(例如，分离、纯化或重组的可溶性MANF蛋白、吡格列酮、GLP-1或DPP-4抑制剂(例如，西他列汀、维达列汀、沙格列汀、利拉列汀、度格列汀、吉格列汀和阿格列汀)，或者本文记载的任意组合物，例如治疗有效剂量的含有与SEQ ID NO:2至少90％同一的序列的可溶性MANF蛋白和/或阿朴吗啡)。某些实施方案包括选择鉴别为发展胰腺β-细胞紊乱的风险增加的受试者用于葡萄糖监测(例如，使用血糖仪的自体葡萄糖监测)。某些实施方案另外包括选择受试者用于由医师或医疗保健专业人员进行的周期性医学评定(例如，至少每年一次、至少每六个月一次、至少每三个月一次、至少每两个月一次或至少每个月一次的周期性探访)。某些实施方案另外包括记录受试者医疗记录中的试验结果，或者使用本文记载的方法对鉴别为发展胰腺β-细胞紊乱的风险增加的受试者的一名以上的直系家庭成员进行类似的试验或任何本领域已知的试验来确定发展胰腺β-细胞紊乱的风险。
选择参与临床研究的受试者的方法
还提供选择参与临床研究的受试者的方法。这些方法包括确定可溶性MANF在来自受试者的生物样品中的水平；将可溶性MANF在来自受试者的生物样品中的水平与可溶性MANF的参考水平相比较，和选择具有与参考水平(例如，本文记载的可溶性MANF的任意参考水平)相比可溶性MANF在生物样品中的水平升高、或者降低或无显著变化的受试者用于参与临床研究。
可溶性MANF的水平可使用标准分子生物学方法确定(例如，本文记载的任一种基于抗体的方法)。所述方法可由任何医疗保健专业人员(例如，医师、护士、医师助理、化验员、或护士助理)进行。
在某些实施方案中，受试者可表现出胰腺β-细胞紊乱的一种或多种症状(例如，本文记载的胰腺β-细胞紊乱的任一种症状)。在某些实施方案中，受试者还可表现出无胰腺β-细胞紊乱症状或只有一种胰腺β-细胞紊乱症状。在某些实施方案中，受试者可具有胰腺β-细胞紊乱(例如，2型糖尿病)的家族史。在某些实施方案中，受试者可已经诊断为患有胰腺β-细胞紊乱。在某些实施方案中，受试者正采取胰腺β-细胞紊乱的治疗。在某些实施方案中，受试者在临床研究期间施以新的或替代的胰腺β-细胞紊乱治疗。
检测胰腺β-细胞中的内质网应激的方法
还提供检测胰腺β-细胞中的内质网应激的方法，所述方法包括确定由胰腺β-细胞产生的可溶性MANF的水平，并将产生的可溶性MANF的水平与可溶性MANF的参考水平(例如，本文记载的任意参考水平)相比较。与可溶性MANF的参考水平相比由胰腺β-细胞产生的可溶性MANF的水平升高表明胰腺β-细胞中的内质网应激增加。与可溶性MANF的参考水平相比由胰腺β-细胞产生的可溶性MANF的水平降低或无显著变化表明胰腺β-细胞未经历可检测水平的内质网应激。
可溶性MANF的水平可使用标准分子生物学方法确定(例如，本文记载的任一种基于抗体的方法)。所述方法可由任何医疗保健专业人员(例如，医师、护士、医师助理、化验员、或护士助理)或科学家进行。
在某些实施方案中，胰腺β-细胞在哺乳动物(例如，人)中，并且由胰腺β-细胞产生的可溶性MANF的水平可从来自哺乳动物的生物样品(例如，包含血液、血清或血浆的样品)中确定。在某些实施方案中，胰腺β-细胞可为内源胰腺β-细胞或移植的胰腺β-细胞(例如，自体移植、同种移植或异种移植的胰腺β-细胞)。在某些实施方案中，胰腺β-细胞为已遗传修饰的自体移植的胰腺β-细。在某些实施方案中，胰腺β-细胞可存在于哺乳动物胰腺内或可存在于除胰腺以外的组织中(例如，肝)。在某些实施方案中，胰腺β-细胞可存在于装置、生物相容性材料或聚合物中。
在某些实施方案中，胰腺β-细胞存在于体外(例如，组织培养物中)。例如，从哺乳动物采集的初级胰腺β-细胞可先体外再体内培养。在某些实施方案中，培养的胰腺β-细胞为初级哺乳动物(例如，人、大鼠、猴、牛或猪)胰腺β-细胞系。在某些实施方案中，培养的哺乳动物胰腺β-细胞可遗传操作(例如，遗传修饰为表达一种或多种蛋白质、或遗传修饰为减少一种或多种蛋白质的表达)或化学处理(例如，利用一种或多种生长因子)。在某些实施方案中，胰腺β-细胞可在一种或多种生物相容性聚合物或生物合成材料(例如，辅助胰腺β-细胞移植入哺乳动物(例如，人)中的聚合物或材料)的存在下培养。各种生物相容性聚合物和生物合成材料是本领域已知的。
在某些实施方案中，受试者体内的胰腺β-细胞中内质网应激的检测接着一个或多个以下过程：鉴别在他或她的胰腺β-细胞中内质网应激的水平增加的受试者，施用治疗剂(例如，将降低胰腺β-细胞中的内质网应激的试剂，例如，本文记载的任一种可溶性MANF蛋白和/或阿朴吗啡)；监测受试者的胰腺β-细胞功能(例如，本文记载的监测胰腺β-细胞功能的任一种方法)；和增加受试者的临床探访的频率或健康水平的监测(例如，增加血糖试验的频率)。在某些实施方案中，例如，其中所述方法包括施用阿朴吗啡，受试者不患有勃起功能障碍或帕金森氏病。
在某些实施方案中，体外检测胰腺β-细胞中内质网应激的增加接着使胰腺β-细胞与治疗剂(例如，将减少胰腺β-细胞中的内质网应激的试剂，例如，本文记载的任一种可溶性MANF蛋白或阿朴吗啡)相接触和/或监测胰腺β-细胞功能(例如，本文记载的任一种监测胰腺β-细胞功能的方法)。在本文记载的任一种方法中，胰腺β-细胞可利用至少一种其它细胞类型或至少一种其它细胞系体外培养(例如，共培养或饲喂培养(feeder culture))。
治疗方法
还提供治疗或延缓受试者的胰腺β-细胞紊乱发病的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的可溶性MANF(例如，纯化、分离或重组的可溶性MANF蛋白(例如，本文记载的任一种可溶性MANF蛋白))和/或阿朴吗啡。在某些实施方案中，治疗可导致受试者中胰腺β-细胞紊乱的症状(例如，本文记载的症状中的任一种)的数量降低，或胰腺β-细胞紊乱的一种或多种症状(例如，本文记载的症状中的任一种)的严重程度、强度或频率降低。在某些实施方案中，治疗可导致发病或者一种或多种症状的延缓(与接受治疗的受试者相比，未接受治疗的受试者中一种或多种症状的实际发生的时间增加)。例如，治疗可导致一种或多种下列结果：受试者的血糖水平降低、受试者的糖化血红蛋白水平降低、受试者的胰岛素生产的损失比例降低、受试者的胰腺β-细胞功能丧失的比例降低和受试者的胰腺β-细胞团的损失比例降低。在某些实施方案中，例如，其中所述方法包括施用阿朴吗啡，受试者不患有勃起功能障碍或帕金森氏病。
可溶性MANF
例如，在某些实施方案中，向受试者施用的可溶性MANF包含与SEQ IDNOS:2和4-7任一种，即与SEQ ID NOS:2和4-7的全长至少80％同一(例如，至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一)的序列，并任选地具有可溶性MANF蛋白的生物活性(本文记载)。在某些实施方案中，向受试者施用的可溶性MANF包含与SEQ ID NO:2(人可溶性MANF)，即与SEQ ID NO:2的全长至少95％同一(例如，至少96％、97％、98％、99％或100％同一)的序列，并任选地具有可溶性MANF的生物活性(本文记载)。在某些实施方案中，向受试者施用的可溶性MANF为SEQ ID NO:2或内源(野生型)形式的可溶性MANF。在这些实施方案的任一个中，可溶性MANF可被纯化或分离。在这些实施方案的任一个中，可溶性MANF可为重组蛋白。
序列的比较和两个序列之间的同一性百分比的确定使用数学算法完成。两个氨基酸序列之间的同一性百分比使用Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.,48:444-453,1970)算法确定，其已并入GCG软件包中的GAP程序(可在互联网gcg.com上获得)，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，空位权重(gap weight)为16，长度权重为1。两个核苷酸序列之间的同一性百分比使用GCG软件包中的GAP程序(也可在互联网gcg.com上获得)确定，使用NWSgapdna.CMP矩阵，空位权重为40，长度权重为1。
一般而言，本文所指的氨基酸序列之间的同一性百分比使用BLAST 2.0程序确定，该程序可在对国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information，NCBI)网站向公众开放。序列比较使用无空位的比对并使用缺省参数(Blossum 62矩阵、空位存在罚分(gap existence cost)为11、每个残基的空位罚分为1，λ比率为0.85)进行。用于BLAST程序的数学算法记载于Altschul等人，Nucleic Acids Research 25:3389-3402,1997中。
如本文所决定的，可溶性MANF的哺乳动物形式具有高度的序列同一性。本领域技术人员将会认识到，一般而言，为了获得具有生物学活性(例如，治疗或延缓受试者的胰腺β-细胞紊乱发病、减少胰腺β-细胞中的内质网应激、或者减少或延缓两种以上的胰腺β-细胞群体中内质网应激-诱导的凋亡性细胞死亡的能力)的可溶性MANF变体，在各种哺乳动物物种的可溶性MANF之间不保守的残基可改变或除去，同时那些高度保守的残基不应改变或除去。如本领域已知的，本领域技术人员可比对本文提供的哺乳动物可溶性MANF蛋白的各种序列，从而鉴别那些高度保守的残基和那些不保守的残基。
各种形式的可溶性MANF的生物学活性可通过进行本文记载的各种生物活性试验或本领域已知的那些来测试。例如，可溶性MANF蛋白(例如，本文记载的任一种可溶性MANF蛋白)的生物活性可通过处理在可溶性MANF存在或缺乏下培养的胰腺β-细胞来测试、并用诱导胰腺β-细胞中的内质网应激的试剂刺激胰腺β-细胞。相对于不与可溶性MANF接触和用试剂处理的细胞，具有生物活性的可溶性MANF将减少与可溶性MANF和试剂相接触的细胞中观察到的内质网应激或内质网应激-诱导的凋亡的量。例如，相对于不用可溶性MANF处理和用试剂处理的细胞，具有生物活性的可溶性MANF可减少用诱导内质网应激的试剂处理的细胞中内质网应激的一种或多种标记物(例如，减少葡萄糖调控蛋白-78(也称作grp78或BiP)或bcl-2-相关的抗死亡基因(athanogene)-1(bag-1)表达的诱导；减少激活，高尔基体转位(Golgitranslocation)，蛋白酶裂解或转录激活因子6(ATF6)的核转位；减少蛋白激酶RNA样内质网激酶(PERK)激活、低聚或自体磷酸化；减少IRE1的激活；减少eIF2α的磷酸化；减少XBP1 mRNA的内含子加工；减少JNK信号转导通路的激活；防止胱天蛋白酶原(procaspase)4的激活和裂解；和防止或减少内质网氧化还原环境的变化(例如，实施例中记载的使用氧化还原敏感型eroGFP蛋白测量))。
向受试者施用的可溶性MANF还可包含一种或多种(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15)插入、增加、删除或修饰。例如，可溶性MANF可共价结合至化学部分(例如，蛋白质(例如，白蛋白)、糖(例如，N-连接的聚糖或O-连接的聚糖，例如甘露糖)(参见，例如Sola等人，J.Pharm.Sci.98:1123-1245,2009)、或显著增加可溶性MANF在受试者中的半衰期或增加可溶性MANF(例如，在贮藏期间)的热稳定性的聚合物(例如，聚乙二醇))。用于这些方法的可溶性MANF蛋白还可包括HIV tat蛋白或增加可溶性MANF蛋白的细胞渗透性的任何其它部分。
使用分子生物学和细胞培养技术生产重组蛋白(例如，重组可溶性MANF)的几种方法是本领域已知的。例如，由mRNA序列(例如，含有与SEQ ID NO:3至少80％同一(例如，至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的序列的mRNA)编码的可溶性MANF可转染至允许可溶性MANF被转染细胞表达的细菌、酵母或哺乳动物细胞(使用蛋白表达质粒或病毒载体)中。可使用本领域已知的方法来收集转染细胞或培养基、并将重组可溶性MANF蛋白纯化。多种编码其它哺乳动物可溶性MANF蛋白的其它核酸(mRNA)是本领域已知的。
在某些实施方案中，首先使用本文记载的任一种诊断方法、或者本文记载的或本领域已知的预测受试者处于发展胰腺β-细胞紊乱的风险的任一种方法来鉴别或选择受试者用于治疗。
受试者可施用至少一剂(例如，至少2、3、4或5剂)的可溶性MANF(例如，本文记载的任一种可溶性MANF蛋白)和/或阿朴吗啡。可溶性MANF和/或阿朴吗啡可至少每天一次(例如，每天两次、每天三次和每天四次)、至少每周一次(例如，每周两次、每周三次、每周四次)和/或至少每个月一次施用至受试者。受试者可被长时间(例如，至少一个月、两个月、六个月、一年、两年、三年、四年或五年)治疗(例如，周期性施用可溶性MANF)。如本文详细记载的，施用至受试者的可溶性MANF和/或阿朴吗啡的剂量可由医师通过考虑多种生理因素，包括但不限于，受试者的性别、受试者的体重、受试者的年龄和其它医疗状况的存在来确定。可溶性MANF和/或阿朴吗啡可口服、静脉内注射、动脉内注射、皮下注射、肌内注射、颅内注射或经注射入脑脊液而施用至受试者。同样地，试剂可制成固体(例如，用于口服)或生理上可接受的液体载体(例如，盐水)(例如，用于静脉内、动脉内、皮下、肌肉或脑脊给药)。
在某些实施方案中，受试者另外施用至少一种(例如，两种、三种、四种或五种)其它胰腺β-细胞紊乱治疗(例如，本文记载的胰腺β-细胞紊乱的任一种治疗，如本文记载的任一种胰岛素)。在某些实施方案中，可溶性MANF和/或阿朴吗啡与至少一种(例如，两种、三种或四种)其它胰腺β-细胞紊乱治疗一起配制(例如，在全身给药用生理上可接受的缓冲液或培养基中配制)(如，本文记载的任一种药物组合物)。
减少胰腺β-细胞中的内质网应激的方法
还提供减少胰腺β-细胞中的内质网应激的方法。这些方法包括使胰腺β-细胞与有效量的一种或多种(例如，两种或三种)可溶性MANF(例如，本文记载的任一种可溶性MANF蛋白，如包含与SEQ ID NO:2至少80％同一的序列的重组、纯化或分离的可溶性MANF蛋白)、阿朴吗啡和吡格列酮。在某些实施方案中，胰腺β-细胞在体外(组织培养)。在某些实施方案中，胰腺β-细胞可在受试者中。用于这些实验的胰腺β-细胞可为本文记载的任一种胰腺β-细胞。
在某些实施方案中，胰腺β-细胞可与可溶性MANF、阿朴吗啡和吡格列酮的一种或多种(例如，两种或三种)接触较长的一段时间(例如，至少15分钟、30分钟、1小时、2小时、6小时、8小时、10小时、12小时或24小时)。在某些实施方案中，胰腺β-细胞与几剂(例如，至少两剂、三剂、四剂或五剂)的可溶性MANF、阿朴吗啡和吡格列酮的一种或多种(例如，两种或三种)以例如有规律的时间间隔(约每天一次、每周一次或每个月一次)相接触。
内质网应激的减少可使用本领域已知的任意方法用于检测细胞中的内质网应激来确定(例如，检测或分析本文记载的内质网应激的任一种标记物)。例如，内质网应激的减少可通过细胞中内质网应激的一种或多种标记物的减少来检测。在某些实施方案中，内质网应激的减少可通过一个或多个下列事件观察：grp78(BiP)的诱导或bag-1表达的减少；激活、高尔基体转位、蛋白酶裂解或ATF6核转位的减少；PERK激活、寡聚或自体磷酸化的减少；IRE1的激活的减少；eIF2α磷酸化的减少；XBP1 mRNA的内含子加工的减少；JNK信号转导通路的激活的减少；胱天蛋白酶原4的激活和裂解的减少；以及通过暴露至ER-应激诱导剂而诱导的内质网的氧化还原环境移动的减少(例如，与暴露于ER-应激诱导剂但不用可溶性MANF、阿朴吗啡和吡格列酮的一种或多种(例如，两种或三种)处理的对照胰腺β-细胞相比)。内质网的氧化还原环境移动的减少可使用氧化还原敏感型染料或蛋白质，例如实施例中记载的报告蛋白来测量。在某些实施方案中，胰腺β-细胞中内质网应激的减少可相对于不与可溶性MANF、阿朴吗啡和吡格列酮的一种或多种相接触的胰腺β-细胞中观察或检测的内质网应激的量分别相比较(例如，在体外或在受试者中)。在某些实施方案中，胰腺β-细胞中内质网应激的减少，是相对于不与可溶性MANF蛋白、阿朴吗啡或吡格列酮相接触但与诱导内质网应激的试剂(如毒胡萝卜素)相接触的对照胰腺β-细胞的。
这些方法可由医疗保健专业人员(例如，本文记载的任一类医疗保健专业人员)或科学家进行。
减少或延缓内质网应激-诱导的凋亡的方法
具有内质网应激的胰腺β-细胞可激活细胞内的凋亡通路。本文还提供减少或延缓两个或多个胰腺β-细胞群体中内质网应激-诱导的凋亡的方法，所述方法包括使胰腺β-细胞的群体与有效量的可溶性MANF(例如，本文记载的任一种可溶性MANF蛋白)、阿朴吗啡和吡格列酮的一种或多种(例如，两种或三种)相接触。
在某些实施方案中，胰腺β-细胞是在体外的(组织培养)。在某些实施方案中，胰腺β-细胞可在受试者中(例如，在移植的生物相容性材料或聚合物中)。用于这些方法的胰腺β-细胞可为本文记载的任意胰腺β-细胞。在某些实施方案中，胰腺β-细胞可与可溶性MANF、阿朴吗啡和吡格列酮的一种或多种(例如，两种或三种)接触较长的一段时间(例如，至少15分钟、30分钟、1小时、2小时、6小时、8小时、10小时、12小时或24小时)。在某些实施方案中，胰腺β-细胞与几剂(例如，至少两剂、三剂、四剂或五剂)可溶性MANF、吡格列酮和阿朴吗啡例的一种或多种(例如，两种或三种)例如以有规律的时间间隔相接触。
胰腺β-细胞群体中凋亡的发生和时机可使用本文记载的任一种方法或本领域已知的那些方法确定。使胰腺β-细胞群体与可溶性MANF、阿朴吗啡和吡格列酮的一种或多种(例如，两种或三种)相接触可调节胰腺β-细胞在经受凋亡(例如，内质网应激-诱导的凋亡)的群体中的百分比下降或延缓在胰腺β-细胞群体内凋亡的发生。在某些实施方案中，用可溶性MANF、阿朴吗啡和吡格列酮的一种或多种(例如，两种或三种)处理的细胞中内质网应激-诱导的凋亡的降低或延缓可与不用可溶性MANF、阿朴吗啡和吡格列酮的一种或多种(例如，两种或三种)处理的胰腺β-细胞群体相比较。在某些实施方案中，在用可溶性MANF、阿朴吗啡和吡格列酮的一种或多种(例如，两种或三种)处理的细胞中内质网应激-诱导的凋亡的降低或延缓可与不用可溶性MANF、阿朴吗啡和吡格列酮的一种或多种(例如，两种或三种)处理但与诱导内质网应激的试剂(例如毒胡萝卜素)接触的对照胰腺β-细胞群体相比较。
检测凋亡性细胞死亡的方法是本领域公知的，包括但不限于，细胞胱天蛋白酶(例如，胱天蛋白酶原-3和胱天蛋白酶原-4)的裂解，Hoescht和7-氨基-放线菌素摄取，TdT-介导的dUTP缺口末端标记试验(dUTP nick end labelingassay)，和膜联蛋白膜染色。各种用于检测凋亡性细胞死亡的试剂盒是商购可得的。
药物组合物
本文还提供包含至少一种可溶性MANF(例如，本文记载的任一种可溶性MANF蛋白，如，纯化、分离或重组的可溶性MANF)和/或阿朴吗啡，以及至少一种针对胰腺β-细胞紊乱的其它处理(例如，一种或多种本文记载的胰腺β-细胞紊乱的任意处理，例如，吡格列酮、TUDCA和本文记载的任一种胰岛素)的药物组合物。
在某些实施方案中，组合物配制有药学可接受载体。药物组合物和制剂可肠胃外、口服或例如通过气溶胶或透皮等的通过局部给药来施用。药物组合物可以任何方式配制并可以各种单位剂型施用，依赖于病况或疾病以及患病程度、各患者的总体医疗状况和所得优选使用方法等。药物配制和施用的技术细节在科学文献和专利文献中很好地记载，参见例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第21版,2005。
本文提供的药物组合物可以任何用于人类医学或兽医学的常规方式为施用而配制。湿润剂、乳化剂和润滑剂，例如十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂，释放剂(release agents)，涂布剂，甜味、风味和芳香剂，防腐剂和抗氧化剂也可存在于组合物中。
本发明的组合物的制剂包括那些适用于皮内给药、吸入给药、口服/鼻腔给药、局部给药和/或肠胃外给药。制剂可以单位剂型方便地呈递并可通过药物领域公知的任何方法制备。可与载体材料结合产生单一剂型的活性成分(例如，可溶性MANF和/或阿朴吗啡，以及胰腺β-细胞紊乱的一种或多种附加治疗剂)的量将根据待治疗的宿主、特定的施用模式如皮内或吸入而变化。可与载体材料结合产生单一剂型的活性成分的量一般将是产生治疗效果(例如，本文记载的一种或多种任意的治疗效果)的化合物的量。
本发明的药物制剂可根据药物制造领域已知的任何方法来制备。此类药物可包含甜味剂、风味剂、着色剂和防腐剂。制剂可与适用于制造的无毒药学可接受赋形剂混合。制剂可包括一种或多种稀释剂、乳化剂、防腐剂、缓冲剂、赋形剂等，并可以诸如液剂、粉剂、乳液、冻干粉、喷雾剂、霜剂、洗剂(lotions)、控释制剂、片剂、丸剂、凝胶、在贴剂上、在移植物中等的形式提供。
口服用药物制剂可使用本领域公知的药学可接受载体以适当且适合的剂量配制。此类载体使得药物能够以单位剂型配制为适用于被患者摄取的片剂、丸剂、粉剂、糖衣剂(dragees)、胶囊、液剂、锭剂(lozenges)、凝胶、糖浆剂、浆液、混悬剂等。口服用药物制剂可配制为固体赋形剂，任选地研磨所得混合物，并根据需要在添加适当的附加化合物后加工颗粒的混合物，从而获得片剂或糖衣剂核(dragee cores)。适合的固体赋形剂为碳水化合物(carbohydrate)或蛋白质填料，包括，例如包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇等的糖类；来自玉米、小麦、水稻、马铃薯或其它植物的淀粉；纤维素如甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素或羧甲基纤维素钠；和包括阿拉伯树胶和西黄耆胶等的胶类；以及例如明胶和胶原等的蛋白质。可添加崩解剂或增溶剂(solubilizing agents)如交联聚乙烯吡咯烷酮，琼脂，海藻酸、或其盐如海藻酸钠。推入配合胶囊(Push-fit capsules)可包含与填料或粘结剂混合的活性剂如乳糖或淀粉，润滑剂如滑石或硬脂酸镁，以及任选地稳定剂。在软胶囊中，活性剂可在有或没有稳定剂的情况下溶解或悬浮在适合的液体如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇中。
水性悬浮液可在与适用于制造水性悬浮液的例如适用于水性皮内注射的赋形剂的混合物中包含活性剂(例如，可溶性MANF和/或阿朴吗啡，以及胰腺β-细胞紊乱的一种或多种附加处理)。此类赋形剂包括悬浮剂如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、西黄耆胶和阿拉伯树胶，以及分散剂或湿润剂如天然存在的磷脂(例如，卵磷脂)、环氧烷(alkylene oxide)与脂肪酸的缩合产物(例如，聚氧乙烯硬脂酸酯)、环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物(例如，十七碳亚乙基氧基鲸蜡醇(heptadecaethylene oxycetanol))、环氧乙烷与源自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物(例如，聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯)、或环氧乙烷与源自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物(例如，聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯)。水性悬浮液还可包含一种或多种防腐剂如乙基或正丙基对羟基苯甲酸酯，一种或多种着色剂，一种或多种风味剂，和一种或多种甜味剂如蔗糖、阿斯巴甜或糖精。可按重量克分子渗透浓度(osmolarity)调节制剂。
在某些实施方案中，油基药物(oil-based pharmaceutical)用于施用。油基悬浮液可通过在植物油如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油中，或在矿物油如液体石蜡中；或这些的混合物中悬浮活性剂来配制。参见，例如美国专利5,716,928号，其记载了使用精油或精油组分用于增加生物利用度并减少口服疏水性药物化合物的个体间和个体内的变异性(还参见美国专利5,858,401号)。油性悬浮液可包含增稠剂如蜂蜡、固体石蜡(hard paraffin)或鲸蜡醇。可添加甜味剂以提供可口的口服制剂，例如甘油、山梨糖醇或蔗糖。这些制剂可通过添加抗氧化剂如抗环血酸来保藏。作为可注射的油性载体的实例，参见Minto,J.Pharmacol.Exp.Ther.281:93-102,1997。
药物制剂还可为水包油型乳液的形式。油相可为上述植物油或矿物油，或者这些的混合物。适合的乳化剂包括天然存在的胶类如阿拉伯树胶和西黄耆胶、天然存在的磷脂如大豆卵磷脂、源自脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯如山梨糖醇酐单油酸酯、和这些偏酯与环氧乙烷的缩合产物如聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯。乳液还可如糖浆剂和酏剂(elixirs)的制剂包含甜味剂和风味剂。此类制剂还可包含缓和剂(demulcent)、防腐剂或着色剂。在替代的实施方案中，本发明的这些可注射的水包油型乳液包括石蜡油、山梨糖醇酐单硬脂酸酯、乙氧基化山梨糖醇酐单油酸酯和/或乙氧基化山梨糖醇酐三油酸酯。
药物化合物还可通过鼻内或眼内途径施用，包括吹入剂(insufflation)、粉剂和气溶胶制剂(对于甾类吸入剂(inhalant)的实例，参见例如Rohatagi,J.Clin.Pharmacol.35:1187-1193,1995；Tjwa,Ann.Allergy Asthma Immunol.75:107-111,1995)。
在某些实施方案中，药物化合物可通过局部途径透皮给药，制成敷药棒、溶液、悬浮液、乳液、凝胶、霜剂、膏剂、糊剂、凝胶剂、涂料、粉剂和气溶胶。
在某些实施方案中，药物化合物还可作为微球给药用于体内缓释。例如，微球可经透皮注射皮下缓释的药物来施用；参见Rao,J.Biomater Sci.Polym.Ed.7:623-645,1995；作为生物可降解和可注射的凝胶制剂，参见例如Gao,Pharm.Res.12:857-863,1995；或者作为口服用微球，参见，例如Eyles,J.Pharm.Pharmacol.49:669-674,1997。
在某些实施方案中，药物化合物可肠胃外施用，例如通过静脉内(IV)、肌肉内、腹膜内或皮下施用，或施用于受试者的体腔、器官内腔内，或施用于受试者的脑脊液内。这些制剂可包括溶解在药学可接受载体中的活性剂的溶液。可采用的可接受载体和溶剂为水和林格氏溶液(Ringer’s solution)，或者等渗氯化钠。另外，无菌固定油可用作溶剂或悬浮介质。出于该目的，可使用包括合成单-或双甘油酯等的任何温和(bland)的固定油(fixed oil)。另外，脂肪酸如油酸可类似地用于可注射制剂中。这些溶液为无菌的，且通常不含不期望的物质。这些制剂可通过常规公知的灭菌技术灭菌。制剂可根据为接近生理条件的需要包含药学可接受佐剂物质，例如pH调节和缓冲剂、毒性调节剂，如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、和乳酸钠等。这些制剂中的活性剂的浓度可广泛变化，并将主要基于流体体积、粘度和体重等，按照所选择的或患者需要的特定施用模式来选择。对于IV施用，制剂可为无菌可注射制剂，如无菌可注射水性或油质悬浮液。该悬浮液可使用那些适合的分散或湿润剂和悬浮剂来配制。无菌可注射制剂还可为非毒性肠胃外可接受的稀释剂或溶剂的悬浮液如1,3-丁二醇的溶液中。施用可为快速浓注的(by bolus)或连续的(例如，基本上不间断地导入血管中特定的一段时间)。
在某些实施方案中，药物化合物和制剂可冻干。包括可溶性MANF和/或阿朴吗啡以及胰腺β-细胞紊乱的一种或多种附加处理的稳定的冻干制剂可通过将包括可溶性MANF和/或阿朴吗啡以及一种或多种附加处理和填充剂(bulking agent)例如甘露醇、海藻糖、棉籽糖和蔗糖，或其混合物的溶液冻干来制备。制备稳定的冻干制剂的过程可包括冻干约2.5mg/mL蛋白质、约15mg/mL蔗糖、约19mg/mL NaCl和pH大于5.5且小于6.5的柠檬酸钠缓冲液的溶液。参见例如US2004/0028670。
组合物和制剂可通过使用脂质体来给药。通过使用脂质体，特别是对靶细胞特异的、或者是另外优选针对特定器官的脂质体表面载体配体，技术人员可聚焦于在体内活性剂向靶细胞内的递送。参见例如，美国专利6,063,400和6,007,839号；Al-Muhammed,J.Microencapsul.13:293-306,1996；Chonn,Curr.Opin.Biotechnol.6:698-708,1995；和Ostro,Am.J.Hosp.Pharm.46:1576-1587,1989。
本发明的制剂可用于预防性和/或治疗性处理而施用。在某些实施方案中，对于治疗性应用，组合物以足以治愈、减轻或部分阻止紊乱或其并发症的临床表现的量施用至处于本文记载的紊乱的风险或患有本文记载的紊乱的受试者；这可称为治疗有效量。例如，在某些实施方案中，本发明的药物组合物以足以减少症状数量或减少受试者的胰腺β-细胞紊乱的一个或多个症状的严重程度、持续时间或频率的量施用。
适合于完成该处理的药物组合物的量为治疗有效剂量。剂量方案(dosageschedule)和对该用途有效的量，即给药方案(dosing regimen)将依赖于各种因素，包括疾病或病况的阶段、疾病或病况的严重程度、患者健康的总体状况和患者的身体状况、和年龄等。在计算患者的给药方案时，施用模式也考虑在内。
给药方案还考虑本领域公知的药代动力学参数，即，活性剂的吸收率、生物可利用率、新陈代谢和清除率(clearance)等(参见，例如Hidalgo-Aragones,J.Steroid Biochem.Mol.Biol.58:611-617,1996；Groning,Pharmazie51:337-341,1996；Fotherby,Contraception 54:59-69,1996；Johnson,J.Pharm.Sci.84:1144-1146,1995；Rohatagi,Pharmazie 50:610-613,1995；Brophy,Eur.J.Clin.Pharmacol.24:103-108,1983；Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第21版,2005)。目前技术水平允许临床医生确定各单独患者的给药方案、活性剂、和治疗的疾病或病况。为用作药物的类似的组合物提供的指南可用作确定给药方案即剂量方案和剂量水平、施用的实施本发明的方法是正确且合适的指南。
可根据下列给出制剂的单一或多个施用，例如：根据需要的剂量和频率，和患者的耐受等。制剂应为了有效治疗，防止或改善病况、疾病或症状而提供足够量的活性剂。
在替代的实施方案中，口服用药物制剂日用量在每天每千克体重约1至100或更多mg之间。与口服相反，施用至血流中、至体腔中或至器官内腔中可使用较低的剂量。基本上较高的剂量可用于局部或口服施用或通过粉剂、喷雾剂或吸入剂施用。实际用于制备肠胃外或非肠胃外可施用制剂的方法对于本领域技术人员将是已知或显而易见的，并且更详细地记载于诸如下述的出版物等中，Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第21版,2005。
试剂盒
还提供包含特异性结合至可溶性MANF蛋白(如本文记载的任一种可溶性MANF蛋白)的至少一种抗体或抗原结合性的抗体片段(例如，Fab、F(ab')2、Fab'、scFv、di-scFv或sdAb)和特异性结合至的胰腺β-细胞紊乱的另一标记物(例如，胰岛素、C-蛋白和IAPP)的至少一种(例如，两种、三种或四种)抗体或抗原结合性抗体片段的试剂盒。在某些实施方案中，包括在试剂盒中的抗体或抗原结合性抗体片段位于底物上(例如，酶联免疫吸附试验)。在某些实施方案中，试剂盒可进一步包括分离、纯化或重组的可溶性MANF蛋白(例如，本文记载的任一种可溶性MANF)。在某些实施方案中，一种或多种抗体或抗原结合性抗体片段被标记(例如，放射性同位素、荧光团或结合蛋白(如抗生物素蛋白(avidin))。这些试剂盒可用于，例如用于诊断胰腺β-细胞紊乱，鉴别受试者处于发展胰腺β-细胞紊乱的风险，或监测受试者的胰腺β-细胞功能或胰腺β-细胞团。在某些实施方案中，试剂盒可另外包含进行本文记载的任一种方法的说明。
报告蛋白
本文提供的方法使用报告蛋白，所述报告蛋白包含结合蛋白(BiP)信号序列(例如，小鼠或人BiP信号序列)、氧化还原敏感的荧光蛋白(例如，氧化还原敏感的绿色荧光蛋白和氧化还原敏感的黄色荧光蛋白)和氨基酸序列KDEL(Lys-Asp-Glu-Leu)。在某些实施方案中，BiP信号序列位于N-末端，氧化还原敏感的荧光蛋白位于BiP信号序列的C-末端，氨基酸序列KDEL位于氧化还原敏感的荧光蛋白的C末端。在某些实施方案中，在存在于报告蛋白中的两个或多个独立的蛋白质元件(protein elements)(例如，BiP信号序列、氧化还原敏感的荧光蛋白和KDEL序列)之间存在1至100个氨基酸(例如，1至50、1至40、1至30、1至25、1至20、1至15和1至10个氨基酸)。氧化还原敏感的绿色荧光蛋白的氨基酸序列在下面列出。
氧化还原敏感的绿色荧光蛋白(SEQ ID NO:10)
MSKGEELFTG VVPILVELDG DVNGHKFSVS GEGEGDATYG KLTLKFIVTTGKLPVPWPTL VTTFXLQCFA RYPDHMKRHD FFKSAMPEGY VQERTIFFKDDGNYKTRAEV KFEGDTLVNR IELKGIDFKE DGNILGHKLE YNYNSHCVYIVADKQKNGIK VNFKIRHNIE DGSVQLADHY QQNTPIGDGP VLLPDNHYLCYQSALSKDPN EKRDHMVLLE FVTAAGITHG MDELYK
本文记载的报告蛋白可包含与SEQ ID NO:10至少80％(例如，至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)同一的序列(只要所得蛋白质保持其氧化还原敏感的荧光特性即可)。例如，引入至氧化还原敏感的绿色荧光蛋白或氧化还原敏感的黄色荧光蛋白的突变不应包括半胱氨酸中的突变。在某些实施方案中，氧化还原敏感的荧光蛋白为氧化还原敏感的黄色荧光蛋白(例如，rxYFP；记载于Ostergaard等人，EMBO J.20:5853-5862,2001)。氧化还原敏感的荧光蛋白的其它实例记载于Merksamer等人(Cell 135:933-947,2008)和Dooley等人(J.Biol.Chem.279:22284-22293,2004)。
可存在于报告蛋白的示例性人和小鼠BiP信号序列在下面示出。用于本文记载的方法的报告蛋白可包含任意哺乳动物BiP信号序列(例如，人或小鼠BiP信号序列)。
在某些实施方案中，报告蛋白和编码这些报告蛋白的核酸提供灵敏的(例如，显著改善的)检测完整(intact)胰腺β-细胞内的氧化还原环境中的微小波动的手段。
人BiP信号序列(SEQ ID NO:12)
MKLSLVAAMLLLLSAARA
小鼠BiP信号序列(SEQ ID NO:13)
MMKFTVAAALLLLGAVRA
在某些实施方案中，报告蛋白含有如下序列，该序列与含有SEQ ID NO:14的序列(在下面示出)的报告蛋白至少80％同一(例如，至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一)。在某些实施方案中，报告蛋白由含有与SEQ ID NO:15至少80％同一(例如，至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一)的序列的核酸编码。例如，SEQ ID NO:14的报告蛋白中的突变不应包括半胱氨酸中的突变。SEQ ID NO:14的不同突变可使用本文记载的任一种方法测试来确定突变体是否保持它们的氧化还原依赖的荧光特性。包含与SEQ IDNO:14(MEROS-GFP)至少80％同一的序列的蛋白质的特定的氧化还原依赖的荧光特性在实施例中详细记载。
MEROS-GFP蛋白(SEQ ID NO:14)
MMKFTVVAAALLLLGAVRAEEEDPPVATMSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFISTTGKLPVPWPTLVTTFSYGVQCFSRYPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNCHKVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLKTCSALSKDPNEKRDHMVLLERVTAAGITHGMDELYKTSGGPPPTGEEDTSEKDEL
MEROS-GFP mRNA(SEQ ID NO:15)
atgatgaagttcactgtggtggcggcggcgttgctgctgctgggcgcggtgcgggccgaggaggaggatccaccggtcgccaccatgagtaaaggagaagaacttttcactggagttgtcccaattcttgttgaattagatggtgatgttaatgggcacaaattttctgtcagtggagagggtgaaggtgatgcaacatacggaaaacttacccttaaatttatttccactactggaaaactacctgttccatggccaacacttgtcactactttcagttatggtgttcaatgcttttcaagatacccagatcatatgaaacggcatgactttttcaagagtgccatgcccgaaggttatgtacaggaaagaactatatttttcaaagatgacgggaactacaagacacgtgctgaagtcaagtttgaaggtgatacccttgttaatagaatcgagttaaaaggtattgattttaaagaagatggaaacattcttggacacaaattggaatacaactataactgccacaaggtatacatcatggcagacaaacaaaagaatggaatcaaagttaacttcaaaattagacacaacattgaagatggaagcgttcaactagcagaccattatcaacaaaatactccaattggcgatggccctgtccttttaccagacaaccattacctgaagacatgctctgccctttcgaaagatcccaacgaaaagagagaccacatggtccttcttgagcgcgtaacagctgctgggattacacatggcatggatgaactatacaaaactagtggaggccctcccccaactggtgaagaggatacatcagaaaaagatgagttgtag
候选试剂的筛选方法
还提供用于下列一个或多个方面的候选化合物的筛选方法：治疗或延缓受试者的胰腺β-细胞紊乱的发病，降低胰腺β-细胞中的内质网应激，和减少或延缓胰腺β-细胞中的内质网应激-诱导的凋亡性细胞死亡。这些方法包括提供胰腺β-细胞，使胰腺β-细胞与候选化合物接触，并确定在候选化合物存在下由胰腺β-细胞产生的可溶性MANF的水平，并将由胰腺β-细胞产生的可溶性MANF的水平与可溶性MANF的参考水平相比较。在这些方法中，与参考水平相比由胰腺β-细胞产生的可溶性MANF的水平升高表明试验化合物可用于下列一个或多个方面：治疗或延缓受试者的胰腺β-细胞紊乱的发病，降低胰腺β-细胞中的内质网应激，和减少或延缓胰腺β-细胞中内质网应激-诱导的凋亡性细胞死亡。
用于这些方法的胰腺β-细胞可为本文记载的任一种胰腺β-细胞(例如，胰腺β-细胞系(例如，本文记载的任一种胰腺β-细胞系)或初级胰腺β-细胞)。
可溶性MANF的水平可使用标准分子生物学方法(例如，本文记载的任何以抗体为基础的方法)确定。该方法可由任何医疗保健专业人员(例如，医师、护士、医师助理、化验员、或护士助理)或科学家来进行。
在某些实施方案中，参考水平为在不存在候选化合物的情况下由胰腺β-细胞产生的可溶性MANF的水平。在某些实施方案中，参考水平为存在于不患有胰腺β-细胞紊乱、不具有胰腺β-细胞紊乱的症状或胰腺β-细胞紊乱家族史的受试者中的可溶性MANF的水平。在某些实施方案中，参考水平为在来自哺乳动物的初级胰腺β-细胞或哺乳动物胰腺β-细胞系中产生的可溶性MANF的水平。在某些实施方案中，参考水平为可溶性MANF的阈值水平。
还提供筛选用于治疗或延缓受试者的胰腺β-细胞紊乱的发病，降低胰腺β-细胞中的内质网应激，和/或减少或延缓胰腺β-细胞中内质网应激-诱导的凋亡性细胞死亡的候选化合物的方法。这些方法包括提供表达含有BiP信号序列、氧化还原敏感的荧光蛋白和氨基酸序列KDEL的报告蛋白的哺乳动物细胞(例如，哺乳动物细胞胰腺β-细胞或胰腺β-细胞系)；使细胞与试验化合物接触；确定细胞中氧化的报告蛋白的存在量；和将细胞中氧化的报告蛋白的存在量与参考水平相比较；与参考水平相比细胞中氧化的报告蛋白的水平升高表明候选化合物可用于治疗或延缓受试者的胰腺β-细胞紊乱发病，降低胰腺β-细胞中的内质网应激，和/或减少或延缓胰腺β-细胞中内质网应激-诱导的凋亡性细胞死亡。在某些实施方案中，参考水平为在不存在候选试剂的情况下哺乳动物细胞中的氧化的报告蛋白的存在量。在某些实施方案中，细胞与候选试剂和诱导ER应激的试剂二者相接触，并且参考水平为存在于单独用诱导ER应激的试剂处理的细胞中的氧化的报告蛋白的水平。诱导ER应激的试剂的非限制性实例记载于本文中。诱导ER应激的其它实例是本领域已知的。在某些实施方案中，参考水平为氧化的报告蛋白的阈值水平。所用细胞可为人、小鼠、大鼠、猪、猴或牛细胞。细胞可为本文记载的或本领域已知的任何胰腺β-细胞系。在某些实施方案中，报告蛋白为SEQ ID NO:14，或含有与SEQ ID NO:14至少80％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)同一的序列的蛋白质。
还提供筛选用于治疗或延缓受试者的胰腺β-细胞紊乱的发病，降低胰腺β-细胞中的内质网应激，和/或减少或延缓胰腺β-细胞中内质网应激-诱导的凋亡性细胞死亡的候选化合物的方法。该方法包括提供表达含有BiP信号序列、氧化还原敏感的荧光蛋白和氨基酸序列KDEL的报告蛋白的哺乳动物细胞(例如，哺乳动物细胞胰腺β-细胞)；使细胞与试验化合物接触；确定细胞中还原的报告蛋白的存在量；和将细胞中还原的报告蛋白的存在量与参考水平相比较；与参考水平相比细胞中还原的报告蛋白的水平升高表明候选化合物可用于治疗或延缓受试者的胰腺β-细胞紊乱发病，降低胰腺β-细胞中的内质网应激，和/或减少或延缓胰腺β-细胞中内质网应激-诱导的凋亡性细胞死亡。在某些实施方案中，参考水平为在不存在候选试剂的情况下哺乳动物细胞中的还原的报告蛋白的存在量。在某些实施方案中，细胞与候选试剂和诱导ER应激的试剂二者相接触，并且参考水平为存在于单独用诱导ER应激的试剂处理的细胞中的还原的报告蛋白的水平。诱导ER应激的试剂的非限制性实例记载于本文中。诱导ER应激的其它实例是本领域已知的。在某些实施方案中，参考水平为还原的报告蛋白的阈值水平。所用细胞可为人、小鼠、大鼠、猪、猴或牛细胞。细胞可为本文记载的或本领域已知的任何胰腺β-细胞系。在某些实施方案中，报告蛋白为SEQ ID NO:14，或含有与SEQ ID NO:14至少80％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)同一的序列的蛋白质。
在某些实施方案中，通过检测细胞中报告蛋白的一个或多个荧光性质(例如，检测还原或氧化形式的报告蛋白所特有的光谱特征)来进行确定。在某些实施方案中，还原或氧化形式的报告蛋白的水平使用荧光平板读数器或使用荧光辅助细胞分选术(FACS)确定。
例如，表达报告蛋白的胰腺β-细胞(例如，INS-1 832/13)可接种(plated)至6-孔板中，与候选化合物接触，然后通过胰蛋白酶消化来收集。用磷酸盐缓冲盐水洗涤后，细胞可悬浮在适合的介质(例如，11mM葡萄糖-汉克斯缓冲盐溶液)中，用LSRII(BD)进行FACS，从而确定存在于细胞中的还原或氧化形式的报告蛋白的水平。
在某些实施方案中，荧光平板读数器可用于确定存在于细胞中的还原或氧化形式的报告蛋白的水平。例如，胰腺β-细胞系(如INS-1 832/13细胞)可接种至96-孔板中并用候选试剂处理。还原或氧化形式的报告蛋白的水平可使用荧光平板读数器检测。在该实施方案中，背景信号的减去应在确定还原或氧化形式的报告蛋白的水平之前进行。
在某些实施方案中，报告蛋白包含SEQ ID NO:14或含有与SEQ ID NO:14至少80％同一的序列的蛋白质。在这些实施方案中，还原形式的报告蛋白具有473nM的激发波长和510nM的发射波长，氧化形式的报告蛋白具有394nM的激发波长和510nM的发射波长。
在这些方法的某些实施方案中，可确定细胞中还原形式的报告蛋白的水平与氧化形式的报告蛋白的水平之比。在这些方法中，计算的比可与参考比相比较。参考比可为来自未用候选试剂处理的细胞的比。参考比还可为阈值比。在某些实施方案中，细胞与候选试剂和诱导ER应激的试剂相接触，确定细胞中还原形式的报告蛋白的水平与氧化形式的报告蛋白的水平之比，并将细胞中的比与来自单独用诱导ER应激的试剂处理的细胞的参考比相比较。在这些方法中，使得与参考比相比细胞中的比下降的候选试剂定义为用于治疗受试者的胰腺β-细胞紊乱的候选试剂。
上述方法的某些实施方案进一步包括在胰腺β-细胞紊乱的动物模型中试验候选化合物(例如，确定候选化合物的施用是否会治疗动物模型中胰腺β-细胞紊乱的一个或多个症状(例如，减少严重程度、频率或持续时间)或延缓动物模型中胰腺β-细胞紊乱的一个或多个症状的发生)。2型糖尿病的非限制性动物模型包括朱克肥胖大鼠(Zucker fatty rats,ZFR)、ob/ob(肥胖(obese))小鼠、cp(肥胖(corpulent))大鼠、朱克糖尿病肥胖型(ZDF)大鼠、沙鼠(肥沙鼠(Psammomys obesus))、为恒河猴(obsess rhesus monkeys)、KK小鼠和KK-Ay小鼠(记载于Srinivasan等人，Indian J.Med.Res.125:451-472,2007)。1型糖尿病的非限制性动物模型包括非肥胖的糖尿病型(NOD)小鼠和生物育种(BB)大鼠(记载于Rees等人，Diabetic Med.22:359-370,2005)。胰腺β-细胞紊乱的一个或多个症状的严重程度或发生可在这些动物中使用本文记载的方法或本领域已知的方法确定或观察。
上述方法的某些实施方案进一步包括试验候选化合物是否会降低或延缓胰腺β-细胞群体中的内质网应激-诱导的凋亡性细胞死亡(例如，与在不存在候选试剂的情况下的用诱导内质网应激的试剂处理的胰腺β-细胞群体相比，减少或延缓用候选试剂和诱导内质网应激的试剂处理的胰腺β-细胞群体中的内质网应激-诱导的凋亡性细胞死亡)。用于检测凋亡性细胞死亡的方法是本领域已知的并包括，但不限于，细胞胱天蛋白酶(cellular caspases)(例如，胱天蛋白酶原-3和胱天蛋白酶原-4)的裂解、Hoescht和7-氨基-放线菌素摄取，TdT-介导的dUTP缺口末端标记试验，和膜联蛋白膜染色。各种用于检测凋亡性细胞死亡的试剂盒是商购可得的。
上述方法的某些实施方案包括试验候选化合物是否防止或延缓胰腺β-细胞中内质网应激其它标记物的诱导(例如，候选化合物是否减少grp78(BiP)或bag-1表达的诱导；减少激活，高尔基体转位，蛋白酶裂解或ATF6的核转位；减少PERK激活、低聚或自体磷酸化；减少IRE1的激活；减少eIF2α的磷酸化；减少XBP1 mRNA的内含子加工；减少JNK信号转导通路的激活；防止胱天蛋白酶原(procaspase)4的激活和裂解；和/或防止或减少内质网氧化还原环境的变化(例如，使用本文记载的任一种报告蛋白测量))。BiP和Bag-1的表达水平可使用定量实时PCR利用设计为与BiP或Bag-1的部分杂交的几组引物确定。BiP、Bag-1、PERK、IRE1、eIF2α、XBP1和ATF6的表达水平或加工、激活、磷酸化或细胞定位还可使用与一个BiP、Bag-1、PERK、IRE1、eIF2α、XBP1或ATF6特异性结合的抗体利用本领域已知的方法确定。在某些实施方案中，内质网应激的一个或多个标记物的防止或延缓是将用候选试剂和诱导内质网应激的试剂处理的细胞与在不存在候选试剂的情况下用诱导内质网应激的试剂处理的一种或多种胰腺β-细胞相比较。
任一种类型的候选化合物可用于上述方法。候选化合物，例如可为蛋白质、肽、核酸(如RNA或DNA)、无机化合物、脂质、寡糖、或其任意组合。可用于上述方法的候选化合物的文库是商购可得的。
要筛选的候选化合物可使用本领域已知的组合文库方法中多种手段中的任一种获得，包括：生物文库；空间寻址平行固相或溶液相文库；需要反褶积(deconvolution)的合成文库法；“一珠一化合物(one-bead one-compound)”文库法；和使用亲和层析选择的合成文库法。生物文库手段仅限于肽文库，而其它四种手段适用于肽、非肽低聚物或小分子化合物文库(Lam,AnticancerDrug Des.,12:145,1997)。
用于合成分子文库的方法的实例可见于文献，例如：DeWitt等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,90:6909,1993；Erb等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,91:11422,1994；Zuckermann等人，J.Med.Chem.,37:2678,1994；Cho等人，Science 261:1303,1993；Carrell等人，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.,33:2059,1994；Carell等人，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.,33:2061,1994；和Gallop等人，J.Med.Chem.,37:1233,1994。
化合物的文库可存在于溶液中(例如，Houghten,Bio/Techniques,13:412-421,1992)，或在珠上(Lam,Nature,354:82-84,1991)，芯片上(Fodor,Nature 364:555-556,1993)，细菌上(美国专利5,223,409)，孢子上(美国专利5,571,698；5,403,484；和5,223,409)，质粒上(Cull等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,89:1865-1869,1992)或噬菌体上(Scott和Smith,Science,249:386-390,1990；Devlin,Science,249:404-406,1990；Cwirla等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,87:6378-6382,1990；和Felici,J.Mol.Biol.,222:301-310,1991)。
实施例
实施例1.胰腺β-细胞中可溶性MANF表达在ER应激期间增加
进行实验来确定是否可溶性MANF的表达在应答内质网应激的胰腺β-细胞中被诱导。这些实验使用啮齿类胰腺β-细胞系(INS-1 832/13 and MIN6)、初级小鼠和人胰岛、和诱导内质网应激的两种不同的化学试剂(毒胡萝卜素和衣霉素)进行。INS-1 832/13细胞在包含10％胎牛血清、青霉素、链霉素、丙酮酸钠和0.1％β-巯基乙醇的RPMI-1640中培养。初级胰岛从Prodo获得，并接种于预涂有804G细胞产生的层粘连蛋白V的6-孔板中，并在增补有胎牛血清、非必需氨基酸、丙酮酸钠和抗生素的CMRL培养基中培养。
在用毒胡萝卜素(50nM)处理后的培养的大鼠胰腺β-细胞系(INS-1 832/13)的培养基中检测可溶性MANF蛋白(图1)。在用5μM衣霉素或20nM毒胡萝卜素处理24小时后的相同细胞系中检测MANF mRNA的升高水平(图2)。
来自使用小鼠初级胰岛进行的实验的数据进一步显示，用0.5μM毒胡萝卜素处理小鼠胰岛6小时导致MANF mRNA表达的显著增加(图3)。第二组实验使用来自两个人类供体的人初级胰岛进行。这些数据还显示用毒胡萝卜素(0.25μM)处理人胰岛导致MANF mRNA表达的显著增加(图4)，并且可溶性MANF蛋白的产生和释放至细胞外基质(图5和6)。
进行实验以确定是否可溶性MANF保护胰腺β-细胞免受内质网应激。在第一组实验中，MANF表达使用靶向MANF mRNA的三种不同siRNA构建体之一敲除。根据制造商的使用手册使用Lipofectamine 2000(脂质体转染试剂)进行转染。来自这些实验的数据显示，当细胞用衣霉素(2μM)处理24小时时，与用对照siRNA转染并用相同水平的衣霉素处理的对照细胞相比，MANF表达的敲除导致内质网应激增加(如BiP mRNA水平增加所示)(图7)。这些数据表明，可溶性MANF起到防止或降低胰腺β-细胞中的内质网应激的作用。
进行另外的实验以确定是否可溶性MANF会降低或延缓用内质网应激-诱导的化学试剂处理的胰腺β-细胞中的内质网应激-诱导的凋亡。来自这些实验的数据显示，小鼠胰腺β-细胞系(MIN6)用可溶性MANF的处理显著地减少了在用衣霉素(1μM,24小时)处理后的细胞中观察到的胱天蛋白酶-3裂解量(图8)。这些数据表明，可溶性MANF可防止或延缓胰腺β-细胞中的内质网应激-诱导的凋亡性细胞死亡。
实施例2.用于监测ER中氧化还原状态的体系
开发了检测细胞中ER的氧化还原状态的新体系。在该体系中，小鼠BiP和哺乳动物ER滞留信号(retrieval signal)的信号序列(KDEL)分别附加至氧化还原敏感的绿色荧光蛋白(GFP)的N-和C-末端(图9A)。重组蛋白称为MEROS-GFP(哺乳动物内质网-定位的氧化还原-敏感的GFP(MammalianEndoplasmic Reticulum-Localized RedOx-Sensitive GFP))。荧光显微镜用于证实MEROS-GFP定位于ER(图9B)。MEROS-GFP在NSC34细胞中的完全氧化和还原的物质(species)中显示了不同的激发光谱，在394nM和473nM处存在极大值(图10A)。NSC 34细胞培养在含有10％胎牛血清、青霉素和链霉素的DMEM中。
来自两个不同的激发波长508nM和510nM的激发光谱是可比较的(图10B和10C)。共焦显微镜分析证实，在用强还原剂二硫苏糖醇(DTT)处理的细胞中，来自476nM的荧光激发显著增加，而405nM处的荧光稍微降低(图11)。
标准化为野生型未处理细胞的来自激发473nM对394nM的荧光之比称为MEROS-GFP比。MEROS-GFP比使用荧光平板读数器确定。在这些实验中，INS-1 832/13细胞以50,000个细胞/孔接种至96-孔板上，细胞在各浓度下用H2O2或DTT处理30分钟，测量激发波长473nM和发射波长510nM(针对还原的MEROS-GFP)处的、或激发波长394nM和发射波长510nM(针对氧化的MEROS-GFP)处的荧光。MEROS-GFP比在减去背景信号后确定。数据显示，氧化剂H2O2不改变MEROS-GFP比-表明MEROS-GFP在体内几乎100％被氧化(图12)。相反，DTT处理以剂量-依赖方式增加了MEROS-GFP比(图12)。
进行了另外的实验以证实MEROS-GFP比反应了其在体内氧化还原状态的改变。在这些实验中，MEROS-GFP的氧化还原状态使用非还原性SDS-PAGE与硫醇-烷基化试剂、4-乙酰氨基-4’-二苯乙烯马来酰亚胺-2,2’-二磺酸(AMS)组合来监测。在这些实验中，不处理的或用2mM DTT处理的INS-1832/13细胞用含有25mM AMS的带有或不带有2-β-巯基乙醇的1×SDS-PAGE样品缓冲液溶解，在95℃下煮沸10分钟，使用SDS-PAGE电泳，并使用抗-GFP抗体免疫印迹。正如所预期的，来自DTT-处理的细胞的溶解产物的非还原性SDS-PAGE显示仅一条MEROS-GFP的较缓慢的迁移带(migrating form)，表明DTT处理完全还原了体内的MEROS-GFP(图13)。
MEROS-GFP比还在不同时间点在DTT-处理的细胞中监控。图14显示ER可在DTT处理的几分钟内还原，并且在DTT洗脱(washout)一分钟内恢复至氧化环境。这些结果表明，MEROS-GFP可用于实时、活体监测哺乳动物细胞的ER内的氧化还原状态。
流式细胞术用于精确监测体内的MEROS-GFP。这些数据显示，胰腺β-细胞系INS-1 832/13用DTT处理导致来自488nM对405nM处激发的荧光比剂量依赖性增加(图15和16)。为了进一步分析该观测数据，在DTT-处理的细胞中检测中值MEROS-GFP比。数据显示DTT处理以剂量-依赖方式增加了中值MEROS-GFP比(图17)。然而，H2O2处理不改变MEROS-GFP比(图18)，表明MEROS-GFP在ER中在基础水平(basal level)上几乎完全氧化。中值MEROS-GFP比还由ER应激的实验和生理诱导剂，包括衣霉素、毒胡萝卜素、布雷菲德菌素A、MG 132(图19和20)，慢性高葡萄糖(chronic high glucose)(图21)，血清消耗、葡萄糖剥夺(图22)，棕榈酸盐(酯)、人胰岛淀粉样多肽(hIAPP)和炎性因子(图23和24)来增加。
实施例3.ER应激细胞中ER氧化还原状态的异质性
两种不同的细胞群体通过流式细胞仪在用棕榈酸盐(酯)(胰腺β细胞的强ER诱导剂)处理INS-1 832/13细胞后观察：一种可保持氧化的ER状态，另一种具有高度还原的ER(图25和26)。为了进一步研究这些异质细胞群体，将MEROS-GFP比大于2的细胞归类为“还原的细胞”。这些两种不同的细胞群体还观察下列利用其它已知的胰腺β-细胞的ER应激诱导剂的处理，包括慢性高葡萄糖(图27)、血清消耗、葡萄糖剥夺(图28)和人IAPP(图29)。在应激诱导剂中，棕榈酸盐(酯)处理导致具有高度还原的ER的细胞群体中最大的增加。有趣的是，已预先显示对棕榈酸盐(酯)-诱导的细胞功能障碍的保护的不饱和脂肪酸、油酸和亚油酸，显著地抑制了棕榈酸盐(酯)建立还原ER的能力(图30)。这些数据表明ER应激的细胞在其氧化还原状态中是异质的。
实施例4.具有诱导的ER的细胞中未折叠蛋白应答(UPR)的激活
进行实验以研究UPR和氧化还原状态的异质性之间的关系。在这些实验中，氧化还原状态与UPR活化水平均在相同细胞中监测。为了达到该目标，构建了由人BiP启动子驱动的编码红色荧光蛋白的UPR报告基因mCherry。BiP启动子包含三个未折叠蛋白应答元件(UPRE)并已显示有效反映UPR的活化水平。该BiP-mCherry报告质粒转染至表达MEROS-GFP的INS-1 832/13细胞中，并且将FACS分析用于监测在相同细胞中的MEROS-GFP比和经BiP-mCherry的UPR活化水平(图31)。BiP-mCherry的活化水平和MEROS-GFP比在诱导ER应激后监测。在这些实验中，表达MEROS-GFP的INS-1 832/13细胞接种至6-孔板中，用各化合物处理规定的时间，然后通过胰蛋白酶消化收集。在用磷酸盐缓冲盐水洗涤后，将细胞重悬在11mM葡萄糖-汉克斯缓冲盐溶液中。流式细胞仪分析利用LSRII(BD)进行。
数据显示具有还原ER的细胞群体(MEROS-GFP比>2.0)与可保持氧化ER的细胞相比具有较高的BiP-mCherry活化水平，预示了UPR在高度还原的ER细胞群体中的活化(图32和33)。
进行另外的实验以证实这些数据。在这些实验中，具有氧化ER和高度还原ER的细胞在用棕榈酸盐(酯)处理后通过FACS分选(图34和35)，并使用实时PCR测定UPR标记物BiP和剪接的XBP-1的表达。在这些实验中，还原和氧化的细胞通过FACS分选，总RNA通过RNeasy试剂盒(Qiagen)提取。反转录酶和定量PCR使用BioRad iQ5使用SYBR绿色染料进行。
数据显示BiP和剪接的XBP-1的表达水平与具有氧化的ER的细胞中的水平相比在具有高度还原的ER的细胞中增加(图36)。这些数据进一步通过具有还原的ER和氧化的ER的细胞中的表达谱证实(图37)。这些实验使用利用0.5mM棕榈酸盐(酯)处理24小时的FACS-分选的INS-1 832/13细胞进行。总RNA使用RNAeasy试剂盒(Qiagen)提取。接着将纯化的RNA根据制造商的使用手册用于GeneChip Rat Gene 1.0 ST Array(Affymetrix)。这些数据表明怀有高度还原的ER的细胞还具有高度活化的UPR，可能作为一种调节机制。
实施例5.将ER从还原环境向氧化环境转移的化合物的小分子筛选
上述数据表明，将ER向氧化环境转移的化合物和生物制剂可能对于治疗ER应激和ER功能紊乱相关的疾病有效。为了调查这种可能性，两种FDA-批准的药物，吡格列酮(Actos)和牛黄熊脱氧胆酸(TUDCA)，可影响ER氧化还原状态并改善ER疾病细胞模型中的细胞死亡。吡格列酮批准用于治疗患有2型糖尿病的患者并已在Wolfram综合征的小鼠模型中显示保护胰腺β-细胞功能。吡格列酮显示在用毒胡萝卜素处理的胰腺β-细胞中将ER朝氧化环境转移(图38，右图)并保护这些细胞免受细胞死亡(图38，左图)。另一种小分子，TUDCA，已用于治疗胆结石和胆汁性肝硬化，并显示减轻糖尿病小鼠模型中的ER应激。TUDCA显示还将ER朝氧化环境转移(图38，右图)并保护细胞在ER应激条件下免受死亡(图38，左图)。
将ER朝氧化环境转移的试剂可给予对抗ER应激的保护的这一发现，允许开发新的筛选试验来使用高通量手段鉴别新的还原ER的小分子抑制剂。进行1280-化合物文库(MicroSource)的试验性筛选(pilot screen)，1,040美国药物和240国际药物的收集(图39)。在该实验中，稳定表达MEROS-GFP的INS-1832/13细胞接种(20,000个细胞/孔)在黑光(black optical)96-孔板中。24小时后，使用TeMo液体处理机器人添加2μL各化合物。另外24小时后，细胞用0.2mMDTT强还原剂刺激2小时，然后计算MEROS-GFP比。未处理细胞的平均比为0.037(S.D.＝0.003)，且DTT-处理的细胞为0.069(S.D.＝0.006)。阳性化合物为可保持MEROS-GFP比低于0.05的那些。使用该标准，在筛选中鉴别出20种阳性化合物。
使用0.4mM棕榈酸盐(酯)与20mM葡萄糖的组合进行第二个筛选以诱导ER应激。在两次筛选中，鉴别出9种常见的阳性化合物，其中5种由于自体荧光而除去。为了进一步消除假阳性，稳定表达MEROS-GFP的INS-1 832/13细胞用剩余的4种常见化合物预处理，用0.5mM棕榈酸盐(酯)刺激24小时，并使用FACS测定MEROS-GFP比。该另外的步骤除去作为假阳性的两种化合物。剩余的两种化合物为临床使用的试剂阿朴吗啡和灰黄霉素。尽管在筛选试验中鉴别为阳性，但灰黄霉素对INS-1 832/13细胞具有强毒性作用。
实施例6.阿朴吗啡将ER朝氧化环境转移并给与对ER应激的保护
进行另外的实验以证实阿朴吗啡可将ER从还原环境向氧化环境转移。在这些实验中，表达MEROS-GFP的INS-1 832/13细胞用阿朴吗啡处理24小时，接着用棕榈酸盐(酯)刺激24小时。数据显示阿朴吗啡处理使具有还原ER的细胞群体减少(图40)。用棕榈酸盐(酯)处理的INS-1 832/13细胞中的细胞活力和线粒体膜电位分别使用碘化丙啶(PI)和MitoProbe(Invitrogen)染色测定。阿朴吗啡使具有较低线粒体膜电位的群体减少(图41)并抑制ER应激-诱导的细胞死亡(图42)。阿朴吗啡还保护INS-1 832/13细胞免受由强ER应激诱导剂毒胡萝卜素诱导的ER应激-介导的细胞死亡(图43)。共同地，这些数据显示阿朴吗啡将ER朝氧化环境转移并给与对抗ER应激的保护。
实施例7.将ER朝氧化环境转移的小分子可减轻ER应激细胞模型的病理
上述数据显示阿朴吗啡和吡格列酮具有将ER朝氧化环境转移的并给予对抗ER应激的保护的能力。进行另外的实验以确定是否阿朴吗啡和吡格列酮可保护人胰岛免受ER应激-介导的细胞死亡。数据表明阿朴吗啡和吡格列酮均可保护人胰岛免受毒胡萝卜素-介导的细胞死亡(图44，左图)。
使用INS-1 832/13-来源的多西环素-可诱导的WFS1敲除细胞，Wolfram综合征的细胞模型，进行另外的实验。该模型用于试验是否阿朴吗啡和吡格列酮可防止细胞死亡。如前所报道的，shRNA-介导的WFS1敲除导致细胞死亡，其由胱天蛋白酶-3的裂解完成(Riggs等人，Diabetologia 48:2313-2321,2005)。在该模型中，阿朴吗啡和吡格列酮均抑制了胱天蛋白酶-3的裂解以及胱天蛋白酶-3底物聚(ADP)-核糖基化酶(ribosylating enzyme)(PARP)的裂解，并能够保护WFS1-敲除的β-细胞免受细胞死亡(图44，右图)。合起来考虑，这些数据显示将ER朝氧化环境转移的小分子可减轻ER疾病的细胞模型的病理。
实施例8.可溶性MANF保护胰腺β-细胞免受ER应激和ER应激-诱导的凋亡性细胞死亡
进行另外的实验以确定是否可溶性MANF可在暴露于诱导内质网应激的试剂时防止胰腺β-细胞的内质网中氧化还原环境中的波动。使用表达MEROS-GFP的转染有慢病毒载体(lentivirus vector)的INS-1 832/13细胞(胰腺β-细胞系)进行实验。细胞在11mM或25mM葡萄糖中培养，并未处理或用0.5μg/mL可溶性MANF处理。细胞接着使用FACS分析使用460-495nM之间的激发光谱和520-570nM之间的发射光谱(FITC-A滤光器)来分析，其中允许来自转染细胞中的还原的EroGFP的荧光发射的特定检测。数据示出用可溶性MANF的处理导致含有可检测水平的还原MEROS-GFP的细胞数量减少(图45；右下图vs.左下图)。与上述数据一致，这些数据显示胰腺β-细胞利用可溶性MANF的处理可将ER朝氧化环境转移，并可用于治疗或防止受试者的胰腺β细胞功能紊乱。
其它实施方案
应理解的是，在本发明连同其详细描述一起记载的同时，前述描述意欲说明但不限定本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求限定。其它方面、优势和修改在下列权利要求的范围内。

Claims (26)

1.一种诊断受试者的胰腺β-细胞紊乱的方法，所述方法包括：
确定可溶性中脑星形胶质细胞来源的神经营养因子(MANF)在来自所述受试者的生物样品中的水平；和
将可溶性MANF在所述生物样品中的水平与可溶性MANF的参考水平相比较，
其中与所述参考水平相比可溶性MANF在所述生物样品中的水平升高表明所述受试者患有胰腺β-细胞紊乱。
2.一种预测受试者发展胰腺β-细胞紊乱的风险的方法，所述方法包括：
确定可溶性中脑星形胶质细胞来源的神经营养因子(MANF)在来自所述受试者的生物样品中的水平；和
将可溶性MANF在所述生物样品中的水平与可溶性MANF的参考水平相比较，
其中与所述参考水平相比可溶性MANF在所述生物样品中的水平升高表明所述受试者发展胰腺β-细胞紊乱的风险增加，和与所述参考水平相比可溶性MANF在所述生物样品中的水平降低或没有显著差异表明所述受试者具有发展胰腺β-细胞紊乱的风险正常或降低。
3.一种监测受试者的胰腺β-细胞功能或胰腺β-细胞团的方法，所述方法包括：
确定在第一时间点时可溶性中脑星形胶质细胞来源的神经营养因子(MANF)在来自所述受试者的生物样品中的水平；
确定在第二时间点时可溶性MANF在来自所述受试者的生物样品中的水平；和
将第二时间点时可溶性MANF在所述生物样品中的水平与第一时间点时可溶性MANF在所述生物样品中的水平相比较，
其中与第一时间点时可溶性MANF在所述生物样品中的水平相比第二时间点时可溶性MANF在所述生物样品中的水平升高表明所述受试者的胰腺β-细胞功能下降或胰腺β-细胞团减少，和与第一时间点时可溶性MANF在所述生物样品中的水平相比第二时间点时可溶性MANF在所述生物样品中的水平降低或无显著变化表明所述受试者胰腺β-细胞功能没有变化或提高，或胰腺β-细胞团没有变化或增加。
4.一种选择治疗胰腺β-细胞紊乱的受试者的方法，所述方法包括：
确定可溶性中脑星形胶质细胞来源的神经营养因子(MANF)在来自所述受试者的生物样品中的水平；和
将可溶性MANF在所述生物样品中的水平与可溶性MANF的参考水平相比较，
选择具有与所述参考水平相比可溶性MANF在所述生物样品中的水平升高的受试者用于治疗胰腺β-细胞紊乱。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其中所述胰腺β-细胞紊乱选自由1型糖尿病、2型糖尿病和Wolfram综合征组成的组。
6.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其中所述参考水平为可溶性MANF的阈值水平。
7.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其中所述参考水平为可溶性MANF在健康受试者中的水平。
8.一种治疗或延缓受试者的胰腺β-细胞紊乱发病的方法，其包括向所述受试者施用有效量的包括与SEQ ID NO:2至少80％同一的序列的可溶性中脑星形胶质细胞来源的神经营养因子(MANF)或阿朴吗啡。
9.一种减少胰腺B-细胞中内质网应激的方法，所述方法包括使所述胰腺β-细胞与有效量的包括与SEQ ID NO:2至少80％同一的序列的可溶性中脑星形胶质细胞来源的神经营养因子(MANF)或阿朴吗啡接触。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述胰腺β-细胞在所述受试者中。
11.一种减少或延缓两个以上的胰腺β-细胞群体中内质网应激-诱导的凋亡性细胞死亡的方法，所述方法包括使所述胰腺β-细胞群体与有效量的包括与SEQ ID NO:2至少80％同一的序列的可溶性中脑星形胶质细胞来源的神经营养因子(MANF)或阿朴吗啡接触。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述胰腺β-细胞群体在所述受试者中。
13.根据权利要求1-4、8、10和12任一项所述的方法，其中所述受试者为人类。
14.一种监测受试者中胰腺β-细胞紊乱的治疗效力的方法，所述方法包括：
确定在第一时间点时可溶性中脑星形胶质细胞来源的神经营养因子(MANF)在来自所述受试者的生物样品中的水平；
确定在第二时间点时可溶性MANF在来自所述受试者的生物样品中的水平；和
将第二时间点时可溶性MANF在所述生物样品中的水平与第一时间点时可溶性MANF在所述生物样品中的水平相比较，
其中(i)所述第一时间点为在治疗之前，和所述第二时间点为在治疗起始后的任意时间点，或(ii)所述第一时间点在治疗起始之后，和所述第二时间点为晚于治疗期间或之后的时间点；和
与第一时间点时可溶性MANF在所述生物样品中的水平相比第二时间点时可溶性MANF在所述生物样品中的水平降低表明所述治疗在所述受试者中是有效的。
15.一种筛选用于治疗或延缓受试者的胰腺β-细胞紊乱发病的候选化合物的方法，所述方法包括：
提供胰腺β-细胞；
使所述胰腺β-细胞与试验化合物接触；
确定在所述试验化合物的存在下由所述胰腺β-细胞产生的可溶性中脑星形胶质细胞来源的神经营养因子(MANF)的水平；和
将在所述试验化合物的存在下由所述胰腺β-细胞产生的可溶性(MANF)的水平与可溶性MANF的参考水平相比较，
选择与所述参考水平相比由所述胰腺β-细胞产生的可溶性MANF的水平升高相关的化合物作为用于治疗或延缓所述受试者的胰腺β-细胞紊乱发病的候选化合物。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述参考水平为在不存在候选剂下由胰腺β-细胞产生的可溶性MANF的水平。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述参考水平为可溶性MANF的阈值水平。
18.一种筛选用于治疗或延缓受试者的胰腺β-细胞紊乱发病的候选化合物的方法，所述方法包括：
提供表达含有BiP信号序列、氧化还原敏感的荧光蛋白和氨基酸序列KDEL的报告蛋白的哺乳动物细胞；
使所述细胞与试验化合物接触；
确定所述细胞中氧化的报告蛋白的存在量；和
将所述细胞中氧化的报告蛋白的存在量与参考水平相比较；
选择与所述参考水平相比细胞中氧化的报告蛋白的水平升高相关的试验化合物作为用于治疗或延缓所述受试者的胰腺β-细胞紊乱发病的候选化合物。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述参考水平为在不存在候选剂下哺乳动物细胞中氧化的报告蛋白的存在量。
20.根据权利要求18所述的方法，其中所述参考水平为氧化的报告蛋白的阈值水平。
21.一种筛选用于治疗或延缓受试者的胰腺β-细胞紊乱发病的候选化合物的方法，所述方法包括：
提供表达含有BiP信号序列、氧化还原敏感的荧光蛋白和氨基酸序列KDEL的报告蛋白的哺乳动物细胞；
使所述细胞与试验化合物接触；
确定所述细胞中还原的报告蛋白的存在量；和
将所述细胞中还原的报告蛋白的存在量与参考水平相比较；
选择与所述参考水平相比细胞中还原的报告蛋白的水平降低相关的试验化合物作为用于治疗或延缓受试者的胰腺β-细胞紊乱发病的候选化合物。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述参考水平为在不存在候选剂下哺乳动物细胞中还原的报告蛋白的存在量。
23.根据权利要求21所述的方法，其中所述参考水平为氧化的报告蛋白的阈值水平。
24.一种试剂盒，其包括：
特异性结合可溶性MANF的抗体或抗原结合性抗体片段；和
结合至选自由胰岛素、C-蛋白和胰岛淀粉样多肽组成的组的蛋白质的至少一种抗体或抗原结合性抗体片段。
25.一种药物组合物，其包括：
包括与SEQ ID NO:2至少80％同一的序列的可溶性MANF蛋白，或阿朴吗啡；和
至少一种用于治疗胰腺β-细胞紊乱的附加剂。
26.根据权利要求25所述的组合物，其中所述至少一种附加剂为胰岛素。
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