JP2017186342A - 膵臓β細胞障害における可溶性ＭＡＮＦ - Google Patents

膵臓β細胞障害における可溶性ＭＡＮＦ Download PDF

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Abstract

【課題】対象の膵臓β細胞障害を処置するかその発症を遅延させる方法の提供。【解決手段】対象の膵臓β細胞障害を治療するかその発症を遅延させるために用いられる組成物であって、特定のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である配列を含む、可溶性中脳星状細胞由来神経栄養因子（ＭＡＮＦ）の有効量を含むものである、前記組成物。また、生体試料中の可溶性中脳星状細胞由来神経栄養因子（ＭＡＮＦ）のレベルを分析し、生体試料中の可溶性ＭＡＮＦのレベルと可溶性ＭＡＮＦの基準レベルと比較することを含む、対象の膵臓β細胞障害を発症するリスクを決定する方法。【選択図】なし

Description

優先権の主張
本願は、２０１２年１月２４日に出願した米国特許出願第６１／５９０，０２１号への
優先権を主張するものである。米国特許出願第６１／５９０，０２１号は、その全体を参
照により本明細書に援用する。
対象の膵臓β細胞の機能または数の喪失は、１型糖尿病（真性糖尿病）、２型糖尿病お
よびウルフラム症候群をはじめとする、いくつかの疾患の病因の一因となっている。１型
糖尿病では、患者は、インスリン欠乏による高い血糖レベルを有する。一般的に言えば、
インスリンの絶対的欠乏は１型糖尿病患者に起こり、インスリンの相対的欠乏は２型糖尿
病患者に起こる。増加しつつある証拠によれば、機能性膵臓β細胞量の減少は、１型およ
び２型両方の糖尿病、ならびにウルフラム症候群などの糖尿病の遺伝型に共通する特徴で
あることを示唆している（Pipeleers et al., Novartis Found Symp. 292:19-24, 2008）
。１型または２型糖尿病の進行中に、膵臓β細胞の機能と量は徐々に減少し、インスリン
欠乏および高血糖症を最終的にもたらす。最新の知見によれば、「ストレスを受けた」膵
臓β細胞は機能不全および死滅を起こしやすいことが示唆されている（Oslowski et al.,
Curr. Opin. Endocrinol. Diabetes Obes. 17:107-112, 2010；Oslowski et al., Curr.
Opin. Cell Biol. 23:207-215, 2011；Fonseca et al., Trends Endocrinol. Metab. 22
:266-274, 2011）。対象の膵臓β細胞の機能不全および死滅を発症しやすさを予測するこ
とを支援する診断マーカーは、対象の膵臓β細胞障害（例えば、１型または２型糖尿病）
の処置または進行の遅延に有用である。
本発明は、一つには、ストレスを受けた膵臓β細胞は可溶性中脳星状細胞由来神経栄養
因子（ＭＡＮＦ）を産生および分泌し、可溶性ＭＡＮＦは小胞体ストレス由来アポトーシ
スから膵臓β細胞を保護し、かつ可溶性ＭＡＮＦは膵臓β細胞における小胞体酸化還元ホ
メオスタシスを維持するという発見に基づく。
これらの発見に鑑み、本願は、対象における膵臓β細胞障害を診断する方法（例えば、
インビトロにおける方法）、対象の膵臓β細胞障害を発症するリスクを予測する方法（例
えば、インビトロにおける方法）、対象（例えば、膵臓β細胞障害を発症するリスクのあ
る対象）における膵臓β細胞機能または膵臓β細胞量をモニターする方法（例えば、イン
ビトロにおける方法）、膵臓β細胞障害を発症するリスクが高い対象を同定する方法（例
えば、インビトロにおける方法）、膵臓β細胞障害を処置するための対象を選択する方法
（例えば、インビトロにおける方法）、臨床試験に参加する対象を選択する方法（例えば
、インビトロにおける方法）、および膵臓β細胞における小胞体ストレスを検出する方法
（例えば、インビトロにおける方法）を提供する。これらの方法は、可溶性ＭＡＮＦの少
なくとも１つのレベル（例えば、対象由来の生体試料中、または培地中の可溶性ＭＡＮＦ
の内因性レベル）を決定することを包含する。
また本願は、対象由来の生体試料中の可溶性中脳星状細胞由来神経栄養因子（ＭＡＮＦ
）のレベルを決定し；生体試料中の可溶性ＭＡＮＦのレベルを可溶性ＭＡＮＦの基準レベ
ルと比較し；基準レベルと比較して生体試料中の可溶性ＭＡＮＦのレベルが増加した対象
を膵臓β細胞障害に罹患していると同定することを含む、対象における膵臓β細胞障害を
診断する方法（例えば、インビトロにおける方法）を提供する。
さらに本願は、対象由来の生体試料中の可溶性中脳星状細胞由来神経栄養因子（ＭＡＮ
Ｆ）のレベルを決定し；生体試料中の可溶性ＭＡＮＦのレベルを可溶性ＭＡＮＦの基準レ
ベルと比較し；基準レベルと比較して生体試料中の可溶性ＭＡＮＦのレベルが増加した対
象を、膵臓β細胞障害を発症するリスクが高いと同定するか、または、基準レベルと比較
して生体試料中の可溶性ＭＡＮＦのレベルが減少したか有意な差がない対象を、膵臓β細
胞障害を発症するリスクが正常であるか低いと同定することを含む、対象の膵臓β細胞障
害を発症するリスクを予測する方法（例えば、インビトロにおける方法）を提供する。
さらに本願は、第１の時点での対象由来の生体試料中の可溶性中脳星状細胞由来神経栄
養因子（ＭＡＮＦ）のレベルを決定し；第２の時点での対象由来の生体試料中の可溶性Ｍ
ＡＮＦのレベルを決定し；第２の時点での生体試料中の可溶性ＭＡＮＦのレベルを第１の
時点での生体試料中の可溶性ＭＡＮＦのレベルと比較し；第１の時点での生体試料中の可
溶性ＭＡＮＦのレベルと比較して第２の時点での生体試料中の可溶性ＭＡＮＦのレベルが
増加した対象を、膵臓β細胞機能が減少している、または膵臓β細胞が減少していると同
定するか、あるいは、第１の時点での生体試料中の可溶性ＭＡＮＦのレベルと比較して第
２の時点での生体試料中の可溶性ＭＡＮＦのレベルが減少したか有意な変化がない対象を
、膵臓β細胞機能に変化がない、もしくは増加している、または、対象の膵臓β細胞量に
変化がない、もしくは増加していると同定することを含む、対象の膵臓β細胞機能または
膵臓β細胞量をモニターする方法（例えば、インビトロにおける方法）を提供する。
さらに、対象における膵臓β細胞障害の処置の有効性をモニターする方法（例えばイン
ビトロにおける方法）を提供する。これらの方法は、第１の時点での対象由来の生体試料
中の可溶性ＭＡＮＦのレベルを決定し、第２の時点での対象由来の生体試料中の可溶性Ｍ
ＡＮＦのレベルを決定し、第２の時点での生体試料中の可溶性ＭＡＮＦのレベルを第１の
時点での生体試料中の可溶性ＭＡＮＦのレベルと比較することを含むものであって、（ｉ
）第１の時点が処置前であり、第２の時点が処置開始後の任意の時点であるか、（ｉｉ）
第１の時点が処置開始後であり、第２の時点が処置中または処置後のより遅い時点であり
；第１の時点での生体試料中の可溶性ＭＡＮＦのレベルと比較した第２の時点での生体試
料中の可溶性ＭＡＮＦのレベルの減少が、対象での処置が有効であったことを示す方法。
さらに、対象の膵臓β細胞障害を処置するかその発症を遅延させる方法、膵臓β細胞に
おける小胞体ストレスを減少する方法（例えばインビトロにおける方法）、または２個以
上の膵臓β細胞の集団における小胞体ストレス由来アポトーシス細胞死を減少するか遅延
させる方法（例えばインビトロにおける方法）を提供する。これらの方法は、対象への有
効量の可溶性ＭＡＮＦもしくはアポモルヒネの投与、または膵臓β細胞もしくは膵臓β細
胞の集団を可溶性ＭＡＮＦもしくはアポモルヒネと接触させることを包含する。一部の実
施形態において、可溶性ＭＡＮＦは、哺乳動物の可溶性ＭＡＮＦタンパク質配列（例えば
、配列番号２および４〜７のいずれか１つの配列）に少なくとも８０％（例えば、８５％
、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％
または１００％）同一である配列を含有する。一部の実施形態において、例えば、本方法
がアポモルヒネ（apomorpine）を投与することを含むものである場合、対象は勃起不全ま
たはパーキンソン病に罹患していない。
さらに、本願は、対象の膵臓β細胞障害を処置するかその発症を遅延させる薬剤の製造
における、本願に記載のいずれかの可溶性ＭＡＮＦ（例えば、配列番号２に少なくとも８
０％同一である配列を含む可溶性ＭＡＮＦ）またはアポモルヒネを使用する方法の方法を
提供する。さらに、本願は、対象の膵臓β細胞障害の処置またはその発症の遅延で使用す
るための、単離された可溶性ＭＡＮＦ（例えば、配列番号２に少なくとも８０％同一であ
る配列を含む単離された可溶性ＭＡＮＦ）またはアポモルヒネを提供する。
さらに、本願は、対象の膵臓β細胞障害の処置またはその発症の遅延に有用な候補化合
物をスクリーニングする方法（例えばインビトロにおける方法）、膵臓β細胞における小
胞体ストレスを減少する方法（例えばインビトロにおける方法）、および膵臓β細胞にお
ける小胞体ストレス由来アポトーシス細胞死を減少するか遅延させる方法（例えばインビ
トロにおける方法）を提供する。これらの方法は、膵臓β細胞を提供し、膵臓β細胞を候
補化合物と接触させ、候補化合物の存在下で膵臓β細胞によって産生される可溶性ＭＡＮ
Ｆのレベルを決定し、膵臓β細胞によって産生される可溶性ＭＡＮＦのレベルを可溶性Ｍ
ＡＮＦの基準レベルと比較し、基準レベルと比較して膵臓β細胞によって産生される可溶
性ＭＡＮＦのレベルの増加に関連している化合物を、対象の膵臓β細胞障害を処置または
その発症を遅延させるための候補化合物として選択することを含む。これらの方法では、
基準レベルと比較して膵臓β細胞によって産生される可溶性ＭＡＮＦのレベルが増加した
ということは、候補化合物が対象の膵臓β細胞障害を処置するかその発症を遅延させ、膵
臓β細胞における小胞体ストレスを減少し、または膵臓β細胞における小胞体ストレス由
来アポトーシス細胞死を減少もしくは遅延させるのに有用であることを示す。
さらに、対象の膵臓β細胞障害を処置するかその発症を遅延させ、膵臓β細胞における
小胞体ストレスを減少し、または膵臓β細胞における小胞体ストレス由来アポトーシス細
胞死を減少するか遅延させるのに有用な候補化合物をスクリーニングする方法（例えばイ
ンビトロにおける方法）を提供する。これらの方法は、ＢｉＰシグナル配列、酸化還元感
受性蛍光タンパク質（例えば、酸化還元感受性緑色蛍光タンパク質）、およびＫＤＥＬの
アミノ酸配列を含有するレポータータンパク質を発現する哺乳動物細胞（例えば、膵臓β
細胞）を提供し；細胞を試験化合物と接触させ；細胞に存在する酸化型レポータータンパ
ク質の量の決定し；細胞に存在する酸化型レポータータンパク質の量を基準レベルと比較
することを含むものであって、基準レベルと比較して細胞中の酸化型レポータータンパク
質のレベルが増加したということは、候補化合物が対象の膵臓β細胞障害の処置またはそ
の発症の遅延に有用であり得ることを示す。一部の実施形態において、基準レベルは、候
補薬剤の非存在下における哺乳動物細胞に存在する酸化型レポータータンパク質の量であ
る。一部の実施形態において、基準レベルは、酸化型レポータータンパク質の閾値である
。
さらに、対象の膵臓β細胞障害を処置するかその発症を遅延させ、膵臓β細胞における
小胞体ストレスを減少し、または膵臓β細胞における小胞体ストレス由来アポトーシス細
胞死を減少するか遅延させるのに有用な候補化合物をスクリーニングする方法（例えばイ
ンビトロにおける方法）を提供する。これらの方法は、ＢｉＰシグナル配列、酸化還元感
受性蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質）、およびＫＤＥＬのアミノ酸配列を
含有するレポータータンパク質を発現する哺乳動物細胞（例えば、膵臓β細胞）を提供し
；細胞を試験化合物と接触させ；細胞に存在する還元型レポータータンパク質の量の決定
し；細胞に存在する還元型レポータータンパク質の量を基準レベルと比較することを含む
ものであって、基準レベルと比較して細胞中の還元型レポータータンパク質のレベルが減
少したということは、候補化合物が対象の膵臓β細胞障害の処置またはその発症の遅延に
有用であり得ることを示す。一部の実施形態において、基準レベルは、候補薬剤の非存在
下における哺乳動物細胞に存在する還元型レポータータンパク質の量である。一部の実施
形態において、基準レベルは、還元型レポータータンパク質の閾値である。
さらに、可溶性ＭＡＮＦ（例えば、ヒト可溶性ＭＡＮＦ）に特異的に結合する抗体また
は抗原結合性抗体フラグメントと、インスリン、Ｃタンパク質および膵島アミロイドポリ
ペプチド（ＩＡＰＰ）から選択されるタンパク質に特異的に結合する少なくとも１つの抗
体または抗原結合性抗体フラグメントとを含むキットを提供する。さらに、可溶性ＭＡＮ
Ｆタンパク質（例えば、配列番号２に少なくとも８０％同一である配列を含有する可溶性
ＭＡＮＦタンパク質）および／またはアポモルヒネと、膵臓β細胞障害を処置するための
少なくとも１つの追加薬剤（例えば、ピオグリタゾン、ＴＵＤＣＡ、ＧＬＰ−１、または
ＤＰＰ−４阻害剤（例えば、シタグリプチン、ビルダグリプチン、サクサグリプチン、リ
ナグリプチン、デュトグリプチン、ジェミグリプチン、およびアログリプチン））とを含
有する医薬組成物を提供する。
「膵臓β細胞障害」という用語は、一部のその病因として、膵臓β細胞機能（例えば、
インスリン分泌）の減少、または対象に存在する生存インスリン分泌性膵臓β細胞の数（
膵臓β細胞量）の減少を含む疾患を意味する。一部の実施形態において、膵臓β細胞障害
は、さらに、対象における膵臓β細胞の集団（例えば、２個以上の膵臓β細胞）における
小胞体ストレスの増加を特徴とすることができる。本願に記載のように、膵臓β細胞機能
の減少、生存膵臓β細胞数（膵臓β細胞量）の減少、または対象に存在する膵臓β細胞に
おける小胞体ストレスの増加は、本願に記載の方法または当技術分野で公知の他の方法を
用いて間接的に検出することができる。膵臓β細胞障害の非限定的な例としては、１型糖
尿病（真性糖尿病）、２型糖尿病、およびウルフラム症候群が挙げられる。
「膵臓β細胞機能」という用語は、哺乳動物（例えばヒト）の膵臓β細胞を説明するた
めに用いられる生物活性（例えば、膵臓β細胞に特に特有である活性）を意味する。膵臓
β細胞機能の非限定的な例としては、インスリンの合成および分泌、膵島アミロイドポリ
ペプチド（ＩＡＰＰ）の合成および分泌、ならびにＣペプチドの合成および分泌が挙げら
れる。インスリン、ＩＡＰＰおよびＣペプチドの合成および分泌を検出する方法は、当技
術分野で公知である。膵臓β細胞機能はまた、本願に記載の方法、ならびに当技術分野で
公知の方法（例えば、血糖レベルの決定および糖化ヘモグロビンＡ１Ｃレベルの決定）を
用いて、間接的に検出することができる。
「膵臓β細胞量」という用語は、哺乳動物（例えばヒト）における生存可能なインスリ
ン分泌性膵臓β細胞の総数を意味する。対象の膵臓β細胞量を間接的に決定する方法は、
本願に記載されている。対象の膵臓β細胞量を間接的に決定するさらなる方法は、当技術
分野で公知である（例えば、血糖レベルの決定および糖化ヘモグロビンＡ１Ｃレベルの決
定）。
膵臓β細胞量は、対象における内因性の生存膵臓β細胞の総数を表すか、対象における
内因性の生存膵臓β細胞の数と対象に移植された生存膵臓β細胞（例えば、自家移植、同
種移植または異種移植された生存膵臓β細胞）の数との合計を表し得る。
「可溶性ＭＡＮＦ」という用語は、中脳星状細胞由来神経栄養因子（ＭＡＮＦ）の可溶
性哺乳動物形態の配列に少なくとも８０％同一である配列を含有するタンパク質を意味す
る。例えば、可溶性ＭＡＮＦは、配列番号２および４〜７のいずれか１つに、すなわち、
配列番号２または４〜７の完全長に少なくとも８０％同一である（例えば、少なくとも８
１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９
１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００
％同一である）配列を含有するタンパク質であり得る。一部の実施形態において、可溶性
ＭＡＮＦは、野性型哺乳動物の可溶性ＭＡＮＦ（例えば、配列番号２および４〜７）であ
り得る。
可溶性ＭＡＮＦタンパク質は、治療的処置として（例えば、本願に記載されているいず
れかの方法を使用する組換え型または精製内因性タンパク質として）投与することができ
る。精製可溶性ＭＡＮＦタンパク質は、例えば、乾燥重量で少なくとも８０％（例えば、
少なくとも８５％、９０％、９５％または９９％）純粋であり得る。可溶性ＭＡＮＦのさ
らなる変更形態は、本願に記載されている。
「増加」または「増加した」という用語は、基準レベルまたは同一対象における（例え
ば、同一対象由来の生体試料における）より早い時点もしくはより遅い時点で測定された
レベルと比較した場合の観察可能な、検出可能な、または有意なレベルの増加を意味する
。
「減少」という用語は、基準レベルまたは同一対象における（例えば、同一対象由来の
生体試料における）より早い時点もしくはより遅い時点で測定されたレベルと比較した場
合の観察可能な、検出可能な、または有意なレベルの減少を意味する。
「可溶性ＭＡＮＦのレベルが増加したことに関連している化合物」という句は、化合物
の非存在下において対照の哺乳動物細胞（例えば、同一または同一タイプの哺乳動物細胞
）に存在するか、当該細胞よって産生または分泌される、可溶性ＭＡＮＦ（例えばタンパ
ク質またはｍＲＮＡ）のレベルと比較して、化合物と接触させた哺乳動物細胞に存在する
か、当該細胞よって産生または分泌される可溶性ＭＡＮＦ（例えばタンパク質またはｍＲ
ＮＡ）のレベルの増加を誘発またはもたらす化合物を意味する。
「疾患を発症するリスク」という句は、対照の対象または対象群（例えば、健康な対象
もしくは対象群、または膵臓β細胞障害の家族歴のない対象もしくは対象群）と比較して
、対象が将来、膵臓β細胞障害を発症する相対的可能性を意味する。本願は、可溶性ＭＡ
ＮＦのレベルを決定することを含む、対象の膵臓β細胞障害を（将来）発症するリスクを
決定する方法を提供する。
「処置する」という用語は、対象における疾患（例えば、膵臓β細胞障害）の症状の数
を減少すること、または疾患の１つもしくは複数の症状の重症度、持続期間もしくは頻度
を減少することを含む。また処置するという用語は、対象が（将来）膵臓β細胞障害を発
症するリスクを減少すること、または、対象の膵臓β細胞障害の１つもしくは複数の症状
の発症を遅延させることも含み得る。
「膵臓β細胞障害の発症を遅延させる」という句は、膵臓β細胞障害の１つまたは複数
の症状が対象において観察されるまでの期間を延ばすことを意味する。一部の実施形態に
おいて、対象は、膵臓β細胞障害を発症するリスクが高いと前もって同定され得る。本願
で記載されているように、対象は、本願に記載の方法を使用して、または膵臓β細胞障害
（例えば２型糖尿病）の家族歴の所見によって、膵臓β細胞障害を発症するリスクが高い
と同定され得る。
「生体試料」という用語は、体液を含む、対象から収集した任意の試料を包含する。非
限定的な例において、生体試料としては、血液、血清、血漿、尿、脳脊髄液、唾液、胆汁
、胃液または母乳を挙げることができる。
「小胞体ストレス」という句は、活性酸素種（プロオキシダント種）の産生と、活性酸
素種（またはそれらの中間体）を解毒する（除去する）細胞または細胞小器官の能力との
間の小胞体アンバランスであって、小胞体内腔の酸化還元電位のシフト、および／または
小胞体内腔内のミスフォールドもしくはアンフォールドタンパク質の蓄積が生じることを
意味する。小胞体ストレスは、小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）と呼ばれる固有のストレス
経路（本願にさらに記載されている）を誘発する。
膵臓β細胞における小胞体ストレスは、多数の分子事象（例えば、小胞体における遊離
脂肪酸レベルの増加、高インスリン血症、ＶＥＧＦの過剰産生、低酸素、グルコース除去
、変異型膵島アミロイドポリペプチド、変異型インスリン、ＩＬ−１レベルの増加、ＩＦ
Ｎ−γレベルの増加、またはウイルス感染）によって引き起こされ得る。様々な各種の化
学薬剤（例えば、タプシガルギンまたはツニカマイシン）も、小胞体ストレスの誘発に使
用することができる。小胞体ストレスは、酸化環境からより還元性の強い環境に向けて小
胞体をシフトすることが示されている。一部の実施形態において、ＥＲストレス条件下で
還元環境から酸化環境に向けて小胞体をシフトする能力を有する薬剤はＥＲストレスを減
少するのに有用であり、かつ／または、ＥＲストレス由来アポトーシス細胞死を減少もし
くは防止することができる。
小胞体ストレスは、当技術分野で公知の様々な異なる方法を使用して検出することがで
きる。膵臓β細胞における小胞体ストレスの発症を検出、減少、または遅延させる具体的
な方法は、本願に記載されている。
「膵臓β細胞の集団」という句は、２個以上の膵臓β細胞を意味する。一部の実施形態
において、膵臓β細胞の集団は、哺乳動物（例えばヒト）対象に存在し得る（例えば、対
象の内因性膵臓β細胞、膵臓β細胞の自家移植、同種移植または異種移植片）。一部の実
施形態において、膵臓β細胞の集団は、インビトロにおいて培養することができる（組織
培養）。一部の実施形態において、膵臓β細胞の集団は、膵臓β細胞株（例えば、本願に
記載の膵臓β細胞株）である。一部の実施形態において、膵臓β細胞は、任意の哺乳動物
種（例えば、ヒト、モンキー（例えばチンパンジー）、マウス、ブタ、ラットまたはサル
）由来であってもよい。一部の実施形態において、膵臓β細胞の集団は、初代細胞株また
は不死化細胞株であってもよい。
「膵臓β細胞」という用語は、ランゲルハンス島中の哺乳動物の膵臓に通常存在するイ
ンスリン産生細胞を意味する。本願で使用する場合、膵臓β細胞という用語は、哺乳動物
の体内に存在する膵臓β細胞（例えば、内因性膵臓β細胞、または膵臓β細胞の自家移植
、同種移植もしくは異種移植片）、またはインビトロで培養された膵臓β細胞（例えば、
本願に記載の任意の哺乳動物種由来の膵臓β細胞または膵臓β細胞株（例えば初代細胞株
または不死化細胞株）のエクスビボにおける（例えば初代）培養物）を包含する。一部の
実施形態において、哺乳動物に存在する膵臓β細胞は膵臓に存在する。一部の実施形態に
おいて、哺乳動物に存在する膵臓β細胞は膵臓以外の組織（例えば肝臓組織）に位置して
いる。別の実施形態において、膵臓β細胞は、対象に移植されているデバイス（例えば生
体適合性ポリマー）に封入されている。また膵臓β細胞という用語は、哺乳動物（例えば
、ヒト、ブタ、ラットおよびマウス）細胞株における膵臓β細胞、または初代哺乳動物（
例えば、ヒト、ブタ、ラットおよびマウス）細胞培養物を包含する。一部の実施形態にお
いて、膵臓β細胞は、１種もしくは複数の組換え型タンパク質（例えばインスリン）を発
現するように、かつ／または１種もしくは複数の内因性タンパク質の発現を減少するよう
に、分子生物学技術を使用して遺伝学的に操作され得る。
「小胞体由来アポトーシス細胞死」という用語は、細胞（例えば膵臓β細胞）の小胞体
におけるストレスが引き金となって起きるプログラム細胞死である。一部の実施形態にお
いて、アポトーシス細胞死を誘発する小胞体ストレスは、細胞（例えば膵臓β細胞）にお
ける小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）経路を誘発する。ＵＰＲ経路の例示的な成分は、本願
に記載されている。本願に記載されているように、小胞体ストレスは、多数の薬剤（例え
ば、生物薬剤および化学薬剤）によって引き起こされ得る。膵臓β細胞における小胞体由
来アポトーシス細胞死の発症を検出、測定、減少および遅延させる方法は、本願に記載さ
れている。小胞体由来アポトーシス細胞死を検出および測定するさらなる方法は、当技術
分野で公知である。
「レベルを決定する」という用語は、特定の分子（例えば、生体試料または細胞培養培
地中のもの）のレベルを測定する１つまたは複数の科学技術（例えば、分子生物学、分子
遺伝学、免疫学、および生化学上の方法またはアッセイ）を使用することを意味する。レ
ベルを決定するという句は、特定の分子（例えば抗体、または抗原結合性抗体フラグメン
ト）に特異的に結合する１種または複数の試薬を、試料（例えば生体試料または細胞培養
培地）に物理的に接触させることを包含する。
「第２の時点」という用語は、一般に、第１の時点（例えば入院の時点）の後に生じる
すべての時点を意味する。第２の時点は、例えば、第１の時点の少なくとも６時間、１２
時間、２４時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、２週間、３週間、４週
間、６週間、２か月、６か月、１年、または２年後に生じ得る。一部の実施形態において
、対象は、第１の時点と第２の時点の間に処置が施され得る。
「酸化還元感受性蛍光タンパク質」という用語は、その酸化還元環境の変化時に（例え
ば小胞体の酸化還元環境の変化時に）、その蛍光特性（例えば、励起および／または発光
スペクトル（例えばピーク励起または発光波長）が変化するタンパク質である。一部の実
施形態において、タンパク質の蛍光特性のこの変化は、例えば、１つまたは複数のジスル
フィド結合の形成および／または切断の結果として生じ得る。酸化還元感受性蛍光タンパ
ク質の非限定的な例としては、酸化還元−酸化感受性緑色蛍光タンパク質（ｒｏＧＦＰ）
および酸化還元感受性黄色蛍光タンパク質（ｒｘＹＦＰ）が挙げられる。さらなる酸化還
元感受性蛍光タンパク質は、当技術分野では公知である。
他の定義は、本開示の全体にわたる文脈において表示される。別段の定義がない限り、
本願で用いるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によ
って一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本発明における使用に関する方法およ
び材料は本願に記載されている。当技術分野で公知の好適な他の方法および材料を使用す
ることもできる。材料、方法および例は単なる例示にすぎず、限定することを意図するも
のではない。本願に記載されているすべての刊行物、特許出願、特許、配列、データベー
ス登録、および他の参考文献は、その全体を参照により援用するものとする。矛盾する場
合、定義を含む本明細書が規制する。
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および図面から、ならびに特許請求
の範囲から明白であろう。
２４時間のタプシガルギン（５０ｎＭ）またはツニカマイシン（０．５μｇ／ｍＬ）による処理後または未処理後に、ラット膵臓β細胞株（ＩＮＳ−１ ８３２／１３）の培養物から得た濃縮培地中、またはラット膵臓β細胞株（ＩＮＳ−１ ８３２／１３）から得た溶解物中のＭＡＮＦタンパク質のレベルを示すイムノブロットである。 下記の条件下で培養したラット膵臓β細胞株（ＩＮＳ−１ ８３２／１３）におけるＭＡＮＦ ｍＲＮＡの相対的発現を示すグラフである：１１ｍＭグルコース（２４時間）；２５ｍＭグルコース（２４時間）；２５ｍＭグルコース（４８時間）；２５ｍＭグルコース（７２時間）；１１ｍＭグルコースおよび５μＭツニカマイシン（ＴＭ）（２４時間）；または１１ｍＭグルコースおよび２０ｎＭタプシガルギン（Ｔｇ）（２４時間）。示したデータは、定量的リアルタイムＰＣＲを用いて作製した（ｎ＝３；Ｓ．Ｄ．）。 ５ｍＭグルコース（ＬＧ）、１１ｍＭグルコース（ＭＧ）、もしくは２５ｍＭグルコース（ＨＧ）と一緒に５日間培養したか、または５ｍＭグルコース（ＬＧ）と５日間および０．５μＭタプシガルギン（ＴＧ）と６時間培養した、マウス初代膵島におけるＭＡＮＦ、ＷＦＳ１、ＴＸＮＩＰおよびＣＨＯＰ ｍＲＮＡの相対的発現を示すグラフである。示したデータは、定量的リアルタイムＰＣＲを用いて作製した（ｎ＝３；Ｓ．Ｄ．）。 ５．５ｍＭグルコース（ＵＴ）、２５ｍＭグルコース（ＨＧ）、０．２５μＭタプシガルギン（ＴＧ）、１０μＭ膵島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰ）、またはウシ血清アルブミンを含む５００μＭパルミチン酸塩（パルミチン酸塩）で２４時間処理した後の二人のヒトのドナー（ＨＰ１１１３９−０１およびＨＩ１１−２０）由来のヒト初代膵島におけるＭＡＮＦ ｍＲＮＡの相対的発現を示すグラフである。示したデータは、定量的リアルタイムＰＣＲを用いて作製した（ｎ＝３；Ｓ．Ｄ．）。 ２５ｍＭグルコース（２４時間）、０．２５μＭタプシガルギン（２４時間）、または０．５ｍＭパルミチン酸塩（２４時間）による追加処理後または未処理後のヒト初代膵島培地中の可溶性ＭＡＮＦのレベルを示すイムノブロットである。 ２５ｍＭグルコース（２４時間）、０．２５μＭタプシガルギン（２４時間）、または０．５ｍＭパルミチン酸塩（２４時間）による追加処理後または未処理後のヒト初代膵島培地から免疫沈降させた可溶性ＭＡＮＦのレベルを示すイムノブロットである。この実験では、ヒトＭＡＮＦは、ウサギ抗ヒトＭＡＮＦ抗体（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ）を用いて免疫沈降し、同一抗体を用いてイムノブロットを展開した。 ２４時間２μＭツニカマイシンによる処理後または未処理後のネガティブコントロールのｓｉＲＮＡ（ＮＣ）または３つの異なるＭＡＮＦ ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡ分子（ｓｉＭＡＮＦ＃１、ｓｉＭＡＮＦ＃２、またはｓｉＭＡＮＦ＃３）のいずれかでトランスフェクトしたマウス膵臓β細胞株（ＭＩＮ６）におけるＢｉＰ ｍＲＮＡの相対的発現を示すグラフである。これらのデータは、定量的リアルタイムＰＣＲを用いて作製した（ｎ＝３；Ｓ．Ｄ．）。 １μＭツニカマイシンまたは１００ｎＭタプシガルギンによる２４時間処理または未処理後、さらに０、４０、または２００ｎＭの可溶性ＭＡＮＦで処理した、マウス膵臓β細胞株（ＭＩＮ６）における切断カスパーゼ−３のレベルを示すイムノブロットである。 図９Ａは、哺乳動物小胞体に局在するＲｅｄＯｘ感受性ＧＦＰ（ＭＥＲＯＳ−ＧＦＰ）の図である。 図９ＢはＣＯＳ７細胞の２つの共焦点画像である。ＭＥＲＯＳ−ＧＦＰの蛍光を左側の図に示し、ＤｓＲｅｄ−ＥＲトラッカーの蛍光を右側の図に示す。 図１０Ａは、異なる濃度のＤＴＴによる処理後または未処理後のＭＥＲＯＳ−ＧＦＰの一連の励起スペクトルである（５１０ｎｍの発光波長）。 図１０Ｂは、未処理ＮＳＣ３４細胞における酸化型ＭＥＲＯＳ−ＧＦＰの発光スペクトルである（３９４ｎｍの励起波長）。 図１０Ｃは、２ｍＭのＤＴＴで処理したＮＳＣ３４細胞における還元型ＭＥＲＯＳ−ＧＦＰの発光スペクトルである（４７３ｎｍの励起波長）。 ２ｍＭのＤＴＴで処理したＩＮＳ−１ ８３２／１３細胞（右の２つの図）またはＤＴＴによる処理なしのＩＮＳ−１ ８３２／１３細胞（左の２つの図）における、４７６ｎｍの励起波長（下の２つの図）または４０５ｎｍの励起波長（上の２つの図）を使用して収集された一連のＭＥＲＯＳ−ＧＦＰの４つの共焦点顕微鏡画像である。 未処理のままのＩＮＳ−１ ８３２／１３細胞（標識なし）またはＨ２Ｏ２（１ｍＭまたは０．１ｍＭのＨ２Ｏ２）もしくはＤＴＴ（０．１、０．２、０．５、１、２、５または１０ｍＭのＤＴＴ）で処理したＩＮＳ−１ ８３２／１３細胞におけるＭＥＲＯＳ−ＧＦＰ比のグラフである。ＭＥＲＯＳ−ＧＦＰ比はプレートリーダーを使用して決定した。示したデータは、平均±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）である。 未処理のままの細胞（左側レーン）または２ｍＭのＤＴＴで処理した細胞（右側レーン）由来の溶解物における、４−アセトアミド−４’−マレイミジルスチルベン−２，２’−ジスルホン酸（ＡＭＳ）で修飾したＭＥＲＯＳ−ＧＦＰの非還元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）の写真である。溶解物は、電気泳動前に未処理のままであったか（−βＭＥ）（上）、β−メルカプトエタノールで処理した（＋βＭＥ）（下）。 １０分間、１ｍＭのＤＴＴで処理し、次いで洗浄した、ＮＳＣ３４細胞におけるＭＥＲＯＳ−ＧＦＰ比の経時変化を示すグラフである。ＭＥＲＯＳ−ＧＦＰ比は、洗浄後、４分間処理する前に、それぞれ１分の間隔で計算した。一番下のラインは４７３ｎｍでの励起で観察された蛍光を表し、黒い線はＭＥＲＯＳ−ＧＦＰ比を表し、ライトグレーの線は、３９４ｎｍで励起した蛍光を表す（ｎ＝３；Ｓ．Ｄ．）。 ＤＴＴ（０．２、０．５、または１０ｍＭのＤＴＴ）による処理後または未処理後のＭＥＲＯＳ−ＧＦＰで安定的にトランスフェクトしたＩＮＳ−１ ８３２／１３細胞の蛍光標示式細胞分取（fluorescence-assisted cell sorting、ＦＡＣＳ）データである。データは、４８８および４０５ｎｍの励起波長、ならびに５１０ｎｍでの発光スペクトルを使用して収集した。下から上に、異なる一連のデータは、未処理、０．２ｍＭのＤＴＴ、０．５ｍＭのＤＴＴ、および１０ｍＭのＤＴＴである（濃度を上昇させたＤＴＴによる処理後、より一層還元状態へのシフトを示す）。 ＤＴＴ（０．２ｍＭ、０．５ｍＭ、または１０ｍＭのＤＴＴ）による処理後または未処理後にＭＥＲＯＳ−ＧＦＰで安定的にトランスフェクトしたＩＮＳ−１ ８３２／１３細胞のＦＡＣＳデータのヒストグラムである。水平軸はＭＥＲＯＳ−ＧＦＰ比を表し、垂直軸は細胞数を表す。左から右へのピークは、未処理のままの細胞、０．２ｍＭのＤＴＴ、０．５ｍＭのＤＴＴ、および１０ｍＭのＤＴＴで処理した細胞を表す。 ＤＴＴ（０．２、０．５、または１０ｍＭのＤＴＴ）による処理後または未処理後にＭＥＲＯＳ−ＧＦＰで安定的にトランスフェクトしたＩＮＳ−１ ８３２／１３細胞における平均ＭＥＲＯＳ−ＧＦＰ比のグラフである。示したＭＥＲＯＳ−ＧＦＰ値は、未処理の値に標準化される。 ３０分間１ｍＭのＨ２Ｏ２による処理後または未処理後に、ＭＥＲＯＳ−ＧＦＰで安定的にトランスフェクトしたＩＮＳ−１ ８３２／１３細胞のＦＡＣＳ分析から得たデータを示す２つのグラフである。右のグラフは、未処理であるか１ｍＭのＨ２Ｏ２で処理したＩＮＳ−１ ８３２／１３細胞のＭＥＲＯＳ−ＧＦＰ比のヒストグラムである。左のグラフは、未処理であるか（左）、１ｍＭのＨ２Ｏ２で３０分間処理したＩＮＳ−１ ８３２／１３細胞の平均ＭＥＲＯＳ−ＧＦＰ比を示す。 未処理後またはツニカマイシン（ＴＭ）（５μＭ；２４時間）、タプシガルギン（ＴＧ）（１０ｎＭ；２４時間）、ＴＧ（１μＭ；４時間）、ブレフェルジンＡ（ＢｒｅＡ）（１００ｎｇ／ｍＬ；２４時間）もしくはＭＧ１３２（１００ｎｍ；２４時間）で処理した後に、ＦＡＣＳ分析を使用して、ＩＮＳ−１ ８３２／１３細胞において計算した平均ＭＥＲＯＳ−ＧＦＰ比のグラフである。エラーバーは±Ｓ．Ｄ．を示す（＊ｐ＜０．０１）。データは、未処理の細胞について計算した平均ＭＥＲＯＳ−ＧＦＰ比に標準化される。 未処理のまま、または４時間１μＭのタプシガルギン（ＴＧ）で処理したＩＮＳ−１ ８３２／１３細胞におけるＭＥＲＯＳ−ＧＦＰ比を示すヒストグラムである。 １１ｍＭグルコース（２４時間）または２５ｍＭグルコースで２４、４８または７２時間処理した後、ＦＡＣＳ分析を用いてＩＮＳ−１ ８３２／１３細胞において計算した平均ＭＥＲＯＳ−ＧＦＰ比のグラフである。エラーバーは±Ｓ．Ｄ．を示す。データは、２４時間１１ｍＭグルコースで処理した細胞について計算した平均ＭＥＲＯＳ−ＧＦＰ比に標準化される。 未処理、血清枯渇、またはグルコース枯渇後に、ＦＡＣＳ分析を用いてＩＮＳ−１ ８３２／１３細胞において計算した平均ＭＥＲＯＳ−ＧＦＰ比のグラフである。エラーバーは±Ｓ．Ｄ．を示す（＊ｐ＜０．０１）。データは、未処理の細胞について計算した平均ＭＥＲＯＳ−ＧＦＰ比に標準化した。 未処理のままのＩＮＳ−１ ８３２／１３細胞、またはパルミチン酸（０．２ｍＭ；２４時間）、パルミチン酸（０．２ｍＭ）および高グルコース（２５ｍＭ）（２４時間）、パルミチン酸（０．５ｍＭ；２４時間）、オレイン酸（０．５ｍＭ；２４時間）もしくはリノール酸（０．５ｍＭ；２４時間）で処理したＩＮＳ−１ ８３２／１３細胞における平均ＭＥＲＯＳ−ＧＦＰ比のグラフである。エラーバーは±Ｓ．Ｄ．を示す。データは、未処理の細胞について計算した平均ＭＥＲＯＳ−ＧＦＰ比に標準化した。 未処理のままのＩＮＳ−１ ８３２／１３細胞、またはヒト膵島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰ）（１０μＭ；２４時間）、マウスＩＡＰＰ（１０μＭ；２４時間）、もしくはサイトカイン（インターロイキン−１β（５ｎｇ／ｍＬ）、ＩＦＮγ（１００ｎｇ／ｍＬ）、およびＴＮＦα（２５ｎｇ／ｍＬ）；２４時間））で処理したＩＮＳ−１ ８３２／１３細胞における平均ＭＥＲＯＳ−ＧＦＰ比のグラフである。エラーバーは±Ｓ．Ｄ．を示す。データは、未処理の細胞について計算した平均ＭＥＲＯＳ−ＧＦＰ比に標準化した。 未処理のままのＩＮＳ−１ ８３２／１３細胞、または２４時間０．５ｍＭパルミチン酸塩（ＰＡ）で処理したＩＮＳ−１ ８３２／１３細胞から得たＦＡＣＳデータの２つのグラフである。Ｙ軸は４８８ｎｍを使用して励起した後の蛍光を表し、Ｘ軸は４０５ｎｍを使用して励起した後の蛍光を表す。 未処理のＩＮＳ−１ ８３２／１３細胞、または２４時間０．５ｍＭパルミチン酸塩（ＰＡ）もしくは０．５ｍＭオレイン酸（ＯＡ）で処理したＩＮＳ−１ ８３２／１３細胞におけるＦＡＣＳ分析を使用して計算したＭＥＲＯＳ−ＧＦＰ比を示すグラフである。パルミチン酸塩で処理した細胞に関するデータは右へシフトされている。 ２４時間１１ｍＭグルコースによる処理または２４、４８もしくは７２時間２５ｍＭグルコースによる処理を行った後のＩＮＳ−１ ８３２／１３細胞の集団における還元型細胞のパーセンテージを示すグラフである。エラーバーは、±標準偏差を示す（＊＊ｐ＜０．０１）。 未処理、２４時間の血清枯渇、または２４時間のグルコース枯渇後のＩＮＳ−１ ８３２／１３細胞の集団における還元型細胞のパーセンテージを示すグラフである。エラーバーは、±標準偏差を示す（＊＊ｐ＜０．０１）。 未処理後、または２４時間１０μＭヒトＩＡＰＰ、１０μＭマウスＩＡＰＰ、もしくはインターロイキン−１β（５ｎｇ／ｍＬ）、ＩＦＮγ（１００ｎｇ／ｍＬ）およびＴＮＦα（２５ｎｇ／ｍＬ）の組合せによる処理後のＩＮＳ−１ ８３２／１３細胞の集団における還元型細胞のパーセンテージを示すグラフである。エラーバーは、±標準偏差を示す（＊＊ｐ＜０．０１）。 未処理後、または２４時間０．２ｍＭパルミチン酸塩、０．２ｍＭパルミチン酸塩および２５ｍＭグルコース、０．５ｍＭパルミチン酸塩、０．５のｍＭオレイン酸、０．５ｍＭリノール酸、ウシ血清アルブミンおよび０．５ｍＭパルミチン酸塩、０．５ｍＭパルミチン酸塩および０．５ｍＭオレイン酸、ならびに０．５ｍＭパルミチン酸塩および０．５ｍＭリノール酸で処理した後のＩＮＳ−１ ８３２／１３細胞の集団における還元型細胞のパーセンテージを示すグラフである。エラーバーは、±標準偏差を示す（＊＊ｐ＜０．０１）。 ＢｉＰ−Ｐ−ｍＣｈｅｒｒｙでトランスフェクトした細胞の図であり、図はフローサイトメーターレーザーラインおよびフィルターの構造を示す。 酸化型または還元型ＩＮＳ−１ ８３２／１３細胞における平均ＢｉＰ−Ｐ−ｍＣｈｅｒｒｙ発現のグラフである。これらの細胞は、未処理のままであるか、２４時間、１０ｎＭタプシガルギン、５μＭツニカマイシン、２５ｍＭグルコース、血清枯渇、グルコース枯渇、０．５ｍＭパルミチン酸塩、１０μＭヒトＩＡＰＰ、またはインターロイキン−１β（５ｎｇ／ｍＬ）、ＩＦＮγ（１００ｎｇ／ｍＬ）およびＴＮＦα（２５ｎｇ／ｍＬ）の組合せにより処理した。ＢｉＰ−Ｐ−ｍＣｈｅｒｒｙ発現は、ＦＡＣＳ分析を使用して決定した。エラーバーは±標準偏差を示す。 ２４時間、５μＭツニカマイシン（ＴＭ、上方のヒストグラム）またはグルコース枯渇（下方のヒストグラム）により処理した、酸化型または還元型ＩＮＳ−１ ８３２／１３細胞を示す２つのヒストグラムである。Ｘ軸は、ｍＣｈｅｒｒｙの発現レベルがヒトＢｉＰプロモーターによって作動されることを示す。 ２４時間、０．５ｍＭのパルミチン酸塩で処理したＩＮＳ−１ ８３２／１３細胞から得たＦＡＣＳデータのヒストグラムである。 ＦＡＣＳ分離した、酸化型または還元型ＩＮＳ−１ ８３２／１３細胞の純度を示すヒストグラムである。 ２４時間０．５ｍＭパルミチン酸塩で処理したＩＮＳ−１ ８３２／１３細胞におけるＢｉＰ（左のグラフ）およびスプライスＸＢＰ１（ｓＸＢＰ）（右のグラフ）の発現レベルを示す２つのグラフである。ＢｉＰおよびｓＸＢＰの発現レベルは、リアルタイムＰＣＲを使用して測定した。エラーバーは±標準偏差を示す。 酸化型または還元型ＩＮＳ−１ ８３２／１３細胞から精製された小胞体中のＤｅｒｌｉｎ３、ＢｉＰ、ＨｅｒｐおよびＰＤｌａ５の発現レベルを示す表である。発現データはＤＮＡマイクロアレイ分析を使用して収集した。 死滅細胞（左のグラフ）のパーセンテージ、またはＤＭＳＯ単独、１０ｎＭタプシガルギン（Ｔｇ）、１０ｎＭ Ｔｇおよび１０μＭピオグリタゾン、もしくは１０ｎＭ Ｔｇおよび５００μｇ／ｍＬのタウロウルソデオキシコール酸（ＴＵＤＣＡ）で処理したＩＮＳ−１ ８３２／１３細胞の平均ＭＥＲＯＳ−ＧＦＰ比（右のグラフ）を示す２つのグラフである。 ＭＥＲＯＳ−ＧＦＰ系を使用するスクリーニングシステムを示す図である。 １０μＭアポモルヒネ（Ａｐｏ）の非存在下（左上のグラフ）または存在下（右上のグラフ）で０．５ｍＭパルミチン酸塩により処理した後のＩＮＳ−１ ８３２／１３−ＭＥＲＯＳ−ＧＦＰ細胞から収集したＦＡＣＳデータを示す２つのヒストグラムおよび、未処理後、または１０μＭアポモルヒネの非存在下もしくは存在下で０．５ｍＭパルミチン酸塩により処理した後のＩＮＳ−１ ８３２／１３ ＭＥＲＯＳ−ＧＦＰ細胞における還元型細胞のパーセンテージを示すグラフである。エラーバーは±標準偏差を示す。 １０ｎＭまたは５０ｎＭのアポモルヒネ（Ａｐｏ）との組合せの有無における、０．５ｍＭパルミチン酸塩（ＰＡ）で処理した後のＭｉｔｏｐｒｏｂｅ色素で染色したＩＮＳ−１ ８３２／１３−ＭＥＲＯＳ−ＧＦＰ細胞から収集したＦＡＣＳデータのヒストグラムである。 未処理後、または０．５ｍＭパルミチン酸塩単独、もしくは０．５ｍＭパルミチン酸塩および１０ｎＭアポモルヒネで処理した後の、ＦＡＣＳ分析によって分画された低Δψｍ細胞（左のグラフ）のパーセンテージおよび死滅細胞（右のグラフ）のパーセンテージを示す２つのグラフである。 未処理後、または１０ｎＭタプシガルギン（Ｔｇ）で処理した後、もしくは１０ｎＭ Ｔｇと１０ｎＭアポモルヒネで処理した後の死滅細胞のパーセンテージのグラフである。 １０ｎＭアポモルヒネまたは１０μＭピオグリタゾンで処理した、１０ｎＭタプシガルギン処理初代ヒト膵島（右のイムノブロット）および２μＭドキシサイクリン処理ＷＦＳ１ノックダウンＩＮＳ−１ ８３２／１３細胞（ｓｈＷＦＳ１）（左のイムノブロット）に存在する切断カスパーゼ３（ｃ−ｃａｓｐａｓｅ３）および切断ＰＡＲＰ（ｃ−ＰＡＲＰ）の量を示す２つのイムノブロットである。 １１ｍＭグルコースまたは２５ｍＭグルコース（２４時間）（それぞれ上の図および下の図）で培養し、かつ４８時間、０または０．５μｇ／ｍＬの可溶性ＭＡＮＦ（それぞれ、左の図および右の図）で処理した後、小胞体においてＥｒｏＧＦＰの還元型を含有するＩＮＳ１ ８３２／１３細胞（膵臓β細胞株）のパーセンテージを示す、蛍光指標式細胞分取データのグラフである。細胞は、４７３ｎｍの波長と５１０ｎｍの発光スペクトルを使用して励起した。
本発明は、少なくとも一部は、可溶性ＭＡＮＦがストレスを受けた膵臓β細胞よって分
泌されること、また、可溶性ＭＡＮＦが小胞体ストレス由来膵臓β細胞アポトーシス細胞
死を遅延させ、小胞体ストレスを誘発する薬剤または条件に暴露された膵臓β細胞におけ
る小胞体の酸化還元状態の変動を減少することに関する発見に基づく。これらの発見に鑑
み、膵臓β細胞障害を診断する方法、対象の膵臓β細胞障害を発症するリスクを予測する
方法、対象（例えば、膵臓β細胞障害を発症するリスクのある対象）における膵臓β細胞
機能および膵臓β細胞量をモニターする方法、対象における膵臓β細胞病気の処置の有効
性をモニターする方法、膵臓β細胞障害を発症するリスクが高い対象を同定する方法、膵
臓β細胞障害を処置するための対象を選択する方法、臨床試験に参加する対象を選択する
方法、および膵臓β細胞における小胞体ストレスを検出する方法を提供する。これらの方
法は、可溶性ＭＡＮＦ（例えば、対象由来の生体試料中、または培地中のもの）の少なく
とも１つのレベルを決定することを包含する。
また、対象の膵臓β細胞障害を処置するかその発症を遅延させ、膵臓β細胞における小
胞体ストレスを減少し、２個以上の膵臓β細胞の集団における小胞体ストレス由来アポト
ーシス細胞死を減少するか遅延させる方法も提供する。これらの方法は、対象への有効量
の可溶性ＭＡＮＦもしくはアポモルヒネの投与、または膵臓β細胞もしくは膵臓β細胞の
集団を可溶性ＭＡＮＦと接触させることを包含する。一部の実施形態において、例えば、
本方法がアポモルヒネの投与を含んでいる場合、対象は勃起不全またはパーキンソン病に
罹患していない。
さらに、対象の膵臓β細胞障害を処置するかその発症を遅延させるのに有用な候補化合
物をスクリーニングし、膵臓β細胞における小胞体ストレスを減少し、または膵臓β細胞
における小胞体ストレス由来アポトーシス細胞死を減少するか遅延させる方法も提供する
。一部の実施形態において、これらの方法は、膵臓β細胞を提供し、膵臓β細胞を候補化
合物と接触させ、候補化合物の存在下で膵臓β細胞によって産生される可溶性ＭＡＮＦの
レベルを決定し、膵臓β細胞によって産生される可溶性ＭＡＮＦのレベルを可溶性ＭＡＮ
Ｆの基準レベルと比較することを含む。一部の実施形態において、これらの方法は、Ｂｉ
Ｐシグナル配列、酸化還元感受性蛍光タンパク質（例えば、酸化還元感受性緑色蛍光タン
パク質または酸化還元感受性黄色蛍光タンパク質）、およびＫＤＥＬのアミノ酸配列を含
有するレポータータンパク質を発現する哺乳動物細胞（例えば、膵臓β細胞）を提供し；
細胞を試験化合物と接触させ；細胞に存在する酸化型レポータータンパク質の量の決定し
；細胞に存在する酸化型レポータータンパク質の量を基準レベルと比較することを含むも
のであって、基準レベルと比較して細胞中の酸化型レポータータンパク質のレベルが増加
したということは、候補化合物が対象の膵臓β細胞障害を処置するかその発症を遅延させ
、膵臓β細胞における小胞体ストレスを減少し、かつ／または膵臓β細胞における小胞体
ストレス由来アポトーシス細胞死を減少するか遅延させるのに有用であり得ることを示す
。一部の実施形態において、これらの方法は、ＢｉＰシグナル配列、酸化還元感受性蛍光
タンパク質（例えば、酸化還元感受性緑色蛍光タンパク質または酸化還元感受性黄色蛍光
タンパク質）、およびＫＤＥＬのアミノ酸配列を含有するレポータータンパク質を発現す
る哺乳動物細胞（例えば、膵臓β細胞）を提供し；細胞を試験化合物と接触させ；細胞に
存在する還元型レポータータンパク質の量の決定し；細胞に存在する還元型レポータータ
ンパク質の量を基準レベルと比較することを含むものであって、基準レベルと比較して細
胞中の還元型レポータータンパク質のレベルが減少したということは、候補化合物が対象
の膵臓β細胞障害を処置するかその発症を遅延させ、膵臓β細胞における小胞体ストレス
を減少し、かつ／または膵臓β細胞における小胞体ストレス由来アポトーシス細胞死を減
少するか遅延させるのに有用であり得ることを示す。
膵臓β細胞障害
膵臓β細胞障害は、対象の膵臓β細胞機能不全または膵臓β細胞量の段階的な減少を特
徴とする疾患の分類である。膵臓β細胞障害に罹患している対象において減少の可能性の
ある膵臓β細胞機能としては、限定するものではないが、インスリンの産生および分泌、
Ｃペプチドの産生および分泌、ならびに膵島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰ）の産生
および分泌が挙げられる。膵臓β細胞障害の非限定的な例としては、１型糖尿病（真性糖
尿病）、２型糖尿病、およびウルフラム症候群が挙げられる。膵臓β細胞障害は、すべて
の年齢のヒト、例えば幼児、小児、成人および高齢の対象において発症し得る。例えば、
膵臓β細胞障害は、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８
５または９０歳を超える年齢の対象で発症し得る。
医療専門家（例えば、医師、看護師、医師助手、看護助手、または検査技師）は、対象
における１つまたは複数（例えば、２、３、４または５つ）の膵臓β細胞障害の症状を評
価することによって膵臓β細胞障害に罹患している対象を診断することができる。対象の
膵臓β細胞障害の非限定的な症状としては、健康な個体または個体群と比較した血糖レベ
ル（例えば、空腹時血糖レベル）の有意な増加（例えば、１００ｍｇ／ｄＬを超えるか、
または１２０ｍｇ／ｄＬを超える空腹時血糖レベル）、健康な個人または集団と比較した
糖化ヘモグロビンレベル（ヘモグロビンＡ１Ｃレベル）の有意な増加（例えば、６．５％
を超える、７．０％を超える、または８．０％を超えるヘモグロビンＡ１Ｃレベル）、渇
きの増大、頻尿、極端な空腹感、原因不明の体重減少、尿中ケトンの存在、疲労、目のか
すみ、治癒の遅い傷、軽度の高血圧、および頻繁な感染症が挙げられる。医療専門家は、
一部において、さらに対象の膵臓β細胞障害の家族歴に関する診断をベースとすることも
できる。医療専門家は、医療施設（例えば、クリニックまたは病院）への対象の来院の際
に、膵臓β細胞障害に罹患していると対象を診断することができる。場合によっては、医
療専門家は、対象が介護付き医療施設に入院している間に、膵臓β細胞障害に罹患してい
ると対象を診断することができる。典型的には、医師は、対象における１つまたは複数の
症状の観察または検出後に、対象における膵臓β細胞障害を診断する。
医療専門家はまた、以下の１つまたは複数の要因に基づいて、膵臓β細胞障害を発症す
るリスクが高い対象を同定することができる。
本願はさらに、対象（例えば、膵臓β細胞障害の１つもしくは複数の症状を示す対象、
または膵臓β細胞障害の症状を示さない対象（例えば、診断未確定および／または無症候
性の対象）の膵臓β細胞障害を診断するさらなる方法を提供する。さらに、膵臓β細胞障
害を発症するリスクが高い対象を同定するさらなる方法も提供する。さらに、本願は、対
象の膵臓β細胞障害を処置する方法も提供する。
中脳星状細胞由来神経栄養因子（ＭＡＮＦ）
本願に記載されている、可溶性ＭＡＮＦタンパク質の内因性レベルは、例えば、膵臓β
細胞障害を診断するためのマーカー、対象の膵臓β細胞障害を発症するリスクを予測する
ためのマーカー、対象（例えば、膵臓β細胞障害を発症するリスクのある対象）における
膵臓β細胞機能または膵臓β細胞量をモニターするためのマーカー、膵臓β細胞障害を発
症するリスクが高い対象を同定するためのマーカー、膵臓β細胞障害を処置するための対
象を選択するためのマーカー、臨床試験に参加する対象を選択するためのマーカー、およ
び膵臓β細胞における小胞体ストレスを検出するためのマーカーとして、本願に記載され
ているいずれかの方法で検出することができる。精製、単離し、かつ／または組換え型で
ある可溶性ＭＡＮＦタンパク質はまた、対象の膵臓β細胞障害を処置するかその発症を遅
延させ、膵臓β細胞における小胞体ストレスを減少し、２個以上の膵臓β細胞の集団にお
ける小胞体ストレス由来アポトーシス細胞死を減少するか遅延させる方法において使用す
ることができる。
ＭＡＮＦタンパク質は、その後切断され、細胞（例えば、膵臓β細胞）から可溶性タン
パク質として放出される、前駆体タンパク質として翻訳される。完全長（前駆体）ヒトＭ
ＡＮＦタンパク質およびヒト可溶性ＭＡＮＦタンパク質を以下に示す。前駆体ヒトＭＡＮ
Ｆタンパク質中の２５個のアミノ酸シグナル配列に対してアンダーラインを付している。
また、ヒト前駆体ＭＡＮＦタンパク質をコードするｍＲＮＡを下記に示す。
ヒト前駆体ＭＡＮＦタンパク質（配列番号１）
MRRMWATQGLAVALALSVLPGSRALRPGDCEVCISYLGRFYQDLKDRDVTFSPATIENELIKFCREARGKENRLCYYIGA
TDDAATKIINEVSKPLAHHIPVEKICEKLKKKDSQICELKYDKQIDLSTVDLKKLRVKELKKILDDWGETCKGCAEKSDY
IRKINELMPKYAPKAASARTDL
ヒト可溶性ＭＡＮＦタンパク質（配列番号２）
LRPGDCEVCISYLGRFYQDLKDRDVTFSPATIENELIKFCREARGKENRLCYYIGATDDAATKIINEVSKPLAHHIPVEK
ICEKLKKKDSQICELKYDKQIDLSTVDLKKLRVKELKKILDDWGETCKGCAEKSDYIRKINELMPKYAPKAASARTDL
ヒトＭＡＮＦのｍＲＮＡ（配列番号３）
ggaggcggtg cggcgcggcg ggtgcggttc agtcggtcgg cggcggcagc ggaggaggag gaggaggagg agg
aggagga ggatgaggag gatgtgggcc acgcaggggc tggcggtggc gctggctctg agcgtgctgc cgggca
gccg ggcgctgcgg ccgggcgact gcgaagtttg tatttcttat ctgggaagat tttaccagga cctcaaaga
c agagatgtca cattctcacc agccactatt gaaaacgaac ttataaagtt ctgccgggaa gcaagaggca a
agagaatcg gttgtgctac tatatcgggg ccacagatga tgcagccacc aaaatcatca atgaggtatc aaag
cctctg gcccaccaca tccctgtgga gaagatctgt gagaagctta agaagaagga cagccagata tgtgagc
tta agtatgacaa gcagatcgac ctgagcacag tggacctgaa gaagctccga gttaaagagc tgaagaagat
tctggatgac tggggggaga catgcaaagg ctgtgcagaa aagtctgact acatccggaa gataaatgaa ct
gatgccta aatatgcccc caaggcagcc agtgcacgga ccgatttgta gtctgctcaa tctctgttgc acctg
agggg gaaaaaacag ttcaactgct tactcccaaa acagcctttt tgtaatttat tttttaagtg ggctcctg
ac aatactgtat cagatgtgaa gcctggagct ttcctgatga tgctggccct acagtacccc catgagggga
ttcccttcct tctgttgctg gtgtactcta ggacttcaaa gtgtgtctgg gattttttta ttaaagaaaa aaa
atttcta gctgtccttg cagaattata gtgaatacca aaatggggtt ttgccccagg aggctcctaa aaaaaa
aaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa
さらに、ウシ、ラット、マウス、ブタ、ハエ、およびゼブラフィッシュの可溶性ＭＡＮ
Ｆタンパク質配列も記載し、下記に示す。
ウシ可溶性ＭＡＮＦ（配列番号４）
LRQGDCEVCISYLGRFYQDLKDRDVTFSPASIEKELIKFCREARGKENRLCYYIGATEDAATKIINEVSKPLSHHIPVEK
ICEKLKKKDSQICELKYDKQIDLSTVDLKKLRVKELKKILDDWGETCKGCAEKSDYIRKINELMPKYAPKAASSRTDL
ラット可溶性ＭＡＮＦ（配列番号５）
LRPGDCEVCISYLGRFYQDLKDRDVTFSPATIEEELIKFCREARGKENRLCYYIGATDDAATKIINEVSKPLAHHIPVEK
ICEKLKKKDSQICELKYGECD
マウス可溶性ＭＡＮＦ（配列番号６）
LRPGDCEVCISYLGRFYQDLKDRDVTFSPATIEEELIKFCREARGKENRLCYYIGATDDAATKIINEVSKPLAHHIPVEK
ICEKLKKKDSQICELKYDKQIDLSTVDLKKLRVKELKKILDDWGEMCKGCAEKSDYIRKINELMPKYAPKAASARTDL
ブタ可溶性ＭＡＮＦ（配列番号７）
LRPGDCEVCISYLGRFYQDLKDRDVTFSPASIEKELTKFCREARGKENRLCYYIGATDDAATKIINEVSKPLAHHIPVEK
ICEKLKKKDSQICELKYDKQIDLSTVDLKKLRVKELKKILDDWGETCKGCAEKSDYIRKINELMPKYAPKAASSRTD
キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）可溶性ＭＡＮＦ（配列番号８）
LKEEDCEVCVKTVRRFADSLDDSTKKDYKQIETAFKKFCKAQKNKEHRFCYYLGGLEESATGILNELSKPLSWSMPAEKI
CEKLKKKDAQICDLRYEKQIDLNSVDLKKLKVRDLKKILNDWDESCDGCLEKGDFIKRIEELKPKYSRSEL
ゼブラフィッシュ可溶性ＭＡＮＦ（配列番号９）
LKDGECEVCVGFLQRLYQTIQENNVKFDSDSIEKALLKSCKDAKGKENRFCYYIGATSDAATKITNEVSKPMSYHVPVEK
ICEKLKKKDSQICELKYDKQVDLSSVDLKKLKVKDLKKILEEWGESCKGCVEKSDFIRKINELMPKYAPSAAKARTDL
哺乳動物の可溶性ＭＡＮＦタンパク質は高度に保存されており、ヒトとウシの可溶性Ｍ
ＡＮＦタンパク質は９６％の同一性を有し、ヒトとマウスの可溶性ＭＡＮＦタンパク質は
９９％の同一性を有し、ヒトとブタの可溶性ＭＡＮＦタンパク質は９７％の同一性を有し
ている。さらに、ヒト可溶性ＭＡＮＦタンパク質は、ゼブラフィッシュ可溶性ＭＡＮＦタ
ンパク質と７２％の同一性を共有し、８８％の類似性を共有する。
診断方法
本願は、対象における膵臓β細胞障害を診断する方法を提供する。これらの方法は、対
象由来の生体試料中の可溶性ＭＡＮＦのレベルを決定（アッセイ）することと、生体試料
中の可溶性ＭＡＮＦのレベルを可溶性ＭＡＮＦの基準レベルと比較することとを含む。こ
れらの方法において、可溶性ＭＡＮＦの基準レベルと比較して生体試料中の可溶性ＭＡＮ
Ｆのレベルが増加したということは、対象が膵臓β細胞障害に罹患していることを示し、
また、可溶性ＭＡＮＦの基準レベルと比較して生体試料中の可溶性ＭＡＮＦのレベルが減
少したか有意な変化がないということは、対象が膵臓β細胞障害に罹患していないことを
示す。
本願のすべて部分で記載されている、「可溶性ＭＡＮＦの基準レベル」とは、可溶性Ｍ
ＡＮＦの閾値レベル、対照対象もしくは対象群（例えば、疾患に罹患していると診断され
ない対象または被検体群（健康な対象または対象群）は、膵臓β細胞障害の１つもしくは
複数の症状を有しておらず、かつ／または膵臓β細胞障害の家族歴を有していない）に存
在する可溶性ＭＡＮＦのレベル、または同一対象における初期の時点の可溶性ＭＡＮＦの
レベルであり得る。
可溶性ＭＡＮＦのレベルは、当技術分野で公知の方法を利用して決定することができる
。例えば、可溶性ＭＡＮＦのレベルは、可溶性ＭＡＮＦに特異的に結合する抗体を利用す
る、当技術分野で公知の多数の技術（例えば酵素免疫吸着測定法）を使用して検出するこ
とができる。ヒト可溶性ＭＡＮＦに特異的に結合する多数の抗体は市販されている（例え
ば、Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈおよびＰｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈから入手できるウサギ抗
ヒト可溶性ＭＡＮＦ抗体）。
本願に記載のいずれかの方法は、対象由来の試料（例えば、体液、例えば尿、血液、血
漿、血清、または脳脊髄液を含有する生体試料）を取得または収集することをさらに含ん
でいてもよい。本願に記載のいずれかの方法において、生体試料は、可溶性ＭＡＮＦのレ
ベルの決定前に、一定期間（例えば、少なくとも１時間または少なくとも２４時間）保管
することができる（例えば、１０℃以下での保管）。
本願に記載のいずれかの方法は、医療施設（例えば病院、クリニックまたは介護付き医
療施設）に来院する患者に対して実施することができる。対象は、膵臓β細胞障害の１つ
または複数の症状（例えば、本願に記載の膵臓β細胞障害のいずれかの症状）を示し得る
。対象は、膵臓β細胞障害に罹患している疑いがあり得る。また対象は、症状なしで（無
症候性の対象）または膵臓β細胞障害の症状をわずかに１つ示す場合がある。対象は、膵
臓β細胞障害（例えば２型糖尿病）の家族歴を有している可能性がある。また対象は、膵
臓β細胞障害の発症のリスクが高い可能性がある。対象は、幼児、小児、十代の若者、成
人または高齢者である場合がある。
一部の実施形態において、本方法は、検出可能もしくは観察可能な膵臓β細胞量を有し
ており、かつ／または検出可能もしくは観察可能な量の膵臓β細胞機能を有する対象（例
えば、膵臓β細胞量または膵臓β細胞機能を完全に喪失していない対象）に対して行われ
る。膵臓β細胞機能の検出方法は本願に記載されている。膵臓β細胞量は、対象における
膵臓β細胞機能を観察することにより、または当技術分野で公知の方法（例えば、米国特
許出願公開第２０１１０１２３４４３号に記載されている方法）を使用することにより間
接的に検出することができる。
本願に記載の診断方法は、任意の医療専門家（例えば、医師、検査技師、看護師、医師
助手および看護助手）により実施可能である。本願に記載の診断方法は、当技術分野で公
知の、または本願に記載の１つまたは複数の追加診断試験方法（例えば、対象の膵臓β細
胞障害の１つまたは複数の症状に関する知見または評価、例えば、血糖モニタリング、糖
化ヘモグロビン分析、インスリンのレベル、ＩＡＰＰのレベル、Ｃペプチドのレベルまた
は尿中ケトン）と組み合わせて使用することができる。本願に記載の診断方法は、膵臓β
細胞障害を発症するリスクが高いと同定された対象（例えば、本願に記載のいずれかの方
法を使用して、膵臓β細胞障害を発症するリスクが高いと同定された対象）に対して行う
ことができる。一部の実施形態において、本願に記載の診断方法は、膵臓β細胞障害を発
症するリスクが高いと同定された対象に対して、定期的に（例えば、少なくとも１か月、
２か月、６か月または１年毎に１回）行うことができる。一部の実施形態は、対象由来の
生体試料の収集をさらに含む。
一部の実施形態は、膵臓β細胞障害に罹患している、または同障害を発症するリスクが
あると同定された対象に、膵臓β細胞障害の処置を施すこと（例えば、単離、精製された
、もしくは組換え型である可溶性ＭＡＮＦタンパク質、ピオグリタゾン、ＧＬＰ−１、ま
たはＤＰＰ−４阻害剤（例えば、シタグリプチン、ビルダグリプチン、サクサグリプチン
、リナグリプチン、デュトグリプチン、ジェミグリプチンおよびアログリプチン）、ある
いは、本願に記載のいずれかの組成物、例えば、治療有効用量の配列番号２に少なくとも
９０％同一である配列を含有する可溶性ＭＡＮＦタンパク質および／またはアポモルヒネ
）をさらに含む。一部の実施形態は、対象における膵臓β細胞障害の診断を確認する追加
試験を行うことをさらに含む。一部の実施形態は、定期的にグルコースをモニターする（
例えば、グルコメーターを使用して定期的に自己血糖をモニターする）対象を選択するこ
と、または、本願に記載のいずれかのモニタリング方法を含む。一部の実施形態は、医師
または医療専門家による定期的な医学的評価（例えば、少なくとも１年に１回、少なくと
も６か月に１回、少なくとも３か月に１回、少なくとも２か月に１回、または少なくとも
１か月に１回の定期的訪問）のための対象を選択することをさらに含む。一部の実施形態
は、対象の医療記録に診断試験の結果を記録すること、または、本願に記載の方法を使用
して膵臓β細胞障害に罹患していると診断された対象の１人もしくは複数の直系家族の膵
臓β細胞障害について診断試験を行うことをさらに含む。
膵臓β細胞障害を発症するリスクを予測する方法
さらに、対象の膵臓β細胞障害を発症するリスクを予測する方法を提供する。これらの
方法は、対象由来の生体試料中の可溶性ＭＡＮＦのレベルを決定（アッセイ）し、生体試
料中の可溶性ＭＡＮＦのレベルを可溶性ＭＡＮＦの基準レベルと比較することを含む。可
溶性ＭＡＮＦの基準レベルと比較して生体試料中の可溶性ＭＡＮＦのレベルが増加したと
いうことは、対象が膵臓β細胞障害を発症するリスクが高いことを示し、また、基準レベ
ルと比較して生体試料中の可溶性ＭＡＮＦのレベルが減少したか有意な変化がないという
ことは、対象が膵臓β細胞障害を発症するリスクが低いか有意なリスクがないことを示す
。本願に記載の可溶性ＭＡＮＦの任意の基準レベルを、これらの方法で使用することがで
きる。一部の実施形態は、対象由来の生体試料を取得することをさらに含む。
可溶性ＭＡＮＦのレベルは、当技術分野で公知の方法を利用して決定することができる
。例えば、可溶性ＭＡＮＦのレベルは、可溶性ＭＡＮＦに特異的に結合する抗体を利用す
る、当技術分野で公知の多数の技術（例えば酵素免疫吸着測定法）を使用して検出するこ
とができる。一部の実施形態において、本方法は、対象由来の試料（例えば、体液、例え
ば尿、血液、血漿、血清、または脳脊髄液を含有する生体試料）を取得または収集するこ
とをさらに含む。
本願に記載のいずれかの方法は、医療施設（例えば、病院、クリニックまたは介護付き
医療施設）に来院する患者に対して実施することができる。一部の実施形態において、本
方法は、医療専門家によって定期的な身体検査の一部として対象に対して行われる。対象
は、膵臓β細胞障害の１つまたは複数の症状（例えば、本願に記載の膵臓β細胞障害のい
ずれかの症状）を示し得る。対象は、膵臓β細胞障害に罹患している疑いがあり得る。ま
た対象は、症状なしで（無症候性の対象）、または膵臓β細胞障害の症状をわずかに１つ
示す場合がある。対象は、膵臓β細胞障害（例えば、２型糖尿病）の家族歴を有している
可能性がある。対象は、幼児、小児、十代の若者、成人または高齢者である可能性がある
。
本願に記載のこれらの方法は、任意の医療専門家（例えば、医師、検査技師、看護師、
医師助手および看護助手）により実施可能である。これらの方法は、膵臓β細胞障害を発
症するリスクのある対象を同定するための当技術分野で公知の任意の追加方法と組み合わ
せて使用することができる（例えば、以下の１つまたは複数の要因の評価：体重増加、無
気力、膵臓β細胞障害の家族歴、人種、年齢、多嚢胞性卵巣症候群の診断、高血圧、高密
度リポタンパク質レベルの減少（例えば３５ｍｇ／ｄＬ未満）、およびトリグリセリドレ
ベルの増加（例えば２５０ｍｇ／ｄＬ超））。膵臓β細胞障害を発症するリスクが高いと
同定された対象は、本願に記載のいずれかの方法を使用してモニターすることができる（
例えば、次のセクションを参照）。
一部の実施形態は、膵臓β細胞障害を発症するリスクが高いと同定された対象に、膵臓
β細胞障害の処置を施すこと（例えば、単離、精製された、もしくは組換え型である可溶
性ＭＡＮＦタンパク質、ピオグリタゾン、ＧＬＰ−１、またはＤＰＰ−４阻害剤（例えば
、シタグリプチン、ビルダグリプチン、サクサグリプチン、リナグリプチン、デュトグリ
プチン、ジェミグリプチンおよびアログリプチン）、あるいは、本願に記載のいずれかの
組成物、例えば、治療有効用量の配列番号２に少なくとも９０％同一である配列を含有す
る可溶性ＭＡＮＦタンパク質および／またはアポモルヒネ）をさらに含む。一部の実施形
態は、定期的にグルコースをモニターする（例えば、グルコメーターを使用して定期的に
自己血糖をモニターする）ための膵臓β細胞障害を発症するリスクが高いと同定された対
象を選択することを含む。一部の実施形態は、医師または医療専門家による定期的な医学
的評価（例えば、少なくとも１年に１回、少なくとも６か月に１回、少なくとも３か月に
１回、少なくとも２か月に１回、または少なくとも１か月に１回の定期的訪問）のための
膵臓β細胞障害を発症するリスクが高いと同定された対象を選択することを含む。一部の
実施形態は、対象の医療記録に試験の結果を記録すること、または、本願に記載の方法を
使用して、膵臓β細胞障害を発症するリスクが高いと同定された対象の１人もしくは複数
の直系家族における膵臓β細胞障害を発症するリスクを決定する類似の試験または任意の
当技術分野で公知の試験を行うことをさらに含む。
膵臓β細胞機能不全および膵臓β細胞量をモニターする方法
さらに、対象（例えば、膵臓β細胞障害を発症するリスクのある対象、膵臓β細胞障害
に罹患している対象、または膵臓β細胞移植を受けた対象）の膵臓β細胞機能不全をモニ
ターする方法を提供する。これらの方法は、第１の時点での対象由来の生体試料中の可溶
性ＭＡＮＦのレベルを決定（アッセイ）し、第２の時点での対象由来の生体試料中の可溶
性ＭＡＮＦのレベルを決定（アッセイ）し、第２の時点での生体試料中の可溶性ＭＡＮＦ
のレベルを第１の時点での生体試料中の可溶性ＭＡＮＦのレベルと比較することを含む。
第１の時点での可溶性ＭＡＮＦのレベルと比較して第２の時点での生体試料中の可溶性Ｍ
ＡＮＦのレベルが増加したということは、膵臓β細胞機能が減少している（例えば、有意
な、観察可能な、または検出可能な減少）、または対象の膵臓β細胞量が減少しているこ
とを示す。第１の時点での生体試料中の可溶性ＭＡＮＦのレベルと比較して第２の時点で
の生体試料中の可溶性ＭＡＮＦのレベルが減少したか有意な変化がないということは、対
象の膵臓β細胞機能または膵臓β細胞量に変化がない、または増加していることを示す。
一部の実施形態において、本方法は、第１の時点および第２の時点で、検出可能もしく
は観察可能な膵臓β細胞量を有しており、かつ／または検出可能もしくは観察可能な量の
膵臓β細胞機能を有する対象（例えば、第１の時点および第２の時点で膵臓β細胞量また
は膵臓β細胞機能を完全に喪失していない対象）に対して行われる。
一部の実施形態において、第２の時点は、第１の時点の少なくとも６時間（例えば、少
なくとも１２時間、１８時間、２４時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週間
、２週間、３週間、１か月、２か月、３か月、６か月、１年、２年、３年、４年または５
年）後であってもよい。一部の実施形態において、第１の時点は、医療機関への入院時で
あってもよく、または、膵臓β細胞障害の少なくとも１つの症状を最初に診察した１週間
以内であってもよい。
一部の実施形態において、本方法は、１つまたは複数のさらなるより遅い時点で、対象
由来の生体試料中の可溶性ＭＡＮＦのレベルを決定（アッセイ）することをさらに含む。
これらの方法において、（早い日付順の時点で収集した）より早い時点の（例えば、直前
の）試料中の可溶性ＭＡＮＦのレベルと比較して、（後の日付順の時点で収集した）より
遅い時点の試料中の可溶性ＭＡＮＦのレベルが増加したということは、対象の膵臓β細胞
機能における減少（例えば、有意な、観察可能な、または検出可能な減少）、または膵臓
β細胞量における減少を示す。同様に、（早い日付順の時点で収集した）初期の（例えば
、直前の）試料中の可溶性ＭＡＮＦのレベルと比較して、（後の日付順の時点で収集した
）より遅い時点の試料中の可溶性ＭＡＮＦのレベルが減少するか有意な変化がないという
ことは、対象の膵臓β細胞機能または膵臓β細胞量に変化がないことまたは増加があるこ
とを示す。一部の実施形態において、これらの方法は、第１、第２の時点および１つまた
は複数のさらなる時点で、検出可能もしくは観察可能な膵臓β細胞量を有し、かつ／また
は検出可能もしくは観察可能な量の膵臓β細胞機能を有する対象（例えば、第１、第２の
時点および１つまたは複数のさらなる時点で、膵臓β細胞量または膵臓β細胞機能が完全
に喪失していない対象）に対して行われる。
一部の実施形態において、対象は事前に膵臓β細胞移植を受けていることができ、こう
いった場合、これらの方法は、一つには、対象へ移植された膵臓β細胞の膵臓β細胞機能
および膵臓β細胞量をモニターする。一部の実施形態において、移植された膵臓β細胞は
、自家移植、同種移植、または異種移植された膵臓β細胞である。一部の実施形態におい
て、移植された膵臓β細胞は、デバイス内に存在するか、または生体適合性ポリマーによ
り内包されているか、または生体適合性ポリマー内に配置されている。一部の実施形態に
おいて、移植された膵臓β細胞は、膵臓以外の組織内（例えば、肝臓組織）に存在する。
一部の実施形態において、これらの方法は、膵臓β細胞移植の１週間、２週間、３週間、
１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、または１年以内に対象において実施
される。一部の実施形態において、第１の時点は、移植術の直後（例えば、１週間または
２週間以内）である。
可溶性ＭＡＮＦのレベルは、当技術分野で公知の方法を用いて決定することができる。
例えば、可溶性ＭＡＮＦのレベルは、可溶性ＭＡＮＦに特異的に結合する抗体を利用する
、当技術分野で公知の多数の技術（例えば酵素免疫吸着測定法）を使用して検出すること
ができる。一部の実施形態において、本方法は、対象由来のある１つの試料または少なく
とも２つの試料（例えば、体液、例えば尿、血液、血漿、血清、または脳脊髄液を含有す
る生体試料）を取得または収集することを含む。
本願に記載のいずれかの方法は、医療施設（例えば、病院、クリニックまたは介護付き
医療施設）に来院する患者に対して実施することができる。一部の実施形態において、本
方法は、医療専門家による定期検査の一部として対象に対して行われる。対象は、膵臓β
細胞障害の１つまたは複数の症状（例えば、本願に記載の膵臓β細胞障害のいずれかの症
状）を示し得る。また対象は、症状を示さない場合があり（無症候性の対象）または膵臓
β細胞障害の症状をわずかに１つ示す場合がある。対象は、膵臓β細胞障害（例えば、２
型糖尿病）の家族歴を有している可能性がある。対象は、幼児、小児、十代の若者、成人
または高齢者である場合がある。
これらの方法は、任意の医療専門家（例えば、医師、検査技師、看護師、医師助手、お
よび看護助手）によって行われる。膵臓β細胞機能に減少（例えば、有意な、観察可能な
、または検出可能な減少）対象、または膵臓β細胞量に減少があると同定された対象には
、膵臓β細胞障害の処置を施すことができる（例えば、単離、精製された、もしくは組換
え型である可溶性ＭＡＮＦタンパク質、ピオグリタゾン、ＧＬＰ−１、またはＤＰＰ−４
阻害剤（例えば、シタグリプチン、ビルダグリプチン、サクサグリプチン、リナグリプチ
ン、デュトグリプチン、ジェミグリプチン、およびアログリプチン）、あるいは、本願に
記載のいずれかの組成物、例えば、治療有効用量の配列番号２に少なくとも９０％同一で
ある配列を含有する可溶性ＭＡＮＦタンパク質および／またはアポモルヒネ）。一部の実
施形態において、例えば、本方法がアポモルヒネの投与を含んでいる場合、対象は勃起不
全またはパーキンソン病に罹患していない。
一部の実施形態は、対象の膵臓β細胞機能不全の１つまたは複数の（例えば２、３また
は４つの）別のマーカー（例えば、Ｃペプチド産生および分泌の減少、インスリン産生お
よび分泌の減少、ＩＡＰＰ産生および分泌の減少、血糖レベルの増加、糖化ヘモグロビン
レベルの増加、ならびに対象の体液（例えば、尿中）のケトンの存在）の追加検出または
評価をさらに含む。膵臓β細胞機能不全の１つまたは複数の追加マーカーの検出方法は、
当技術分野で公知である。
一部の実施形態は、膵臓β細胞機能の減少対象または膵臓β細胞量の減少があると同定
された対象に、膵臓β細胞障害の処置を施すこと（例えば、単離、精製された、もしくは
組換え型である可溶性ＭＡＮＦタンパク質、ピオグリタゾン、ＧＬＰ−１、またはＤＰＰ
−４阻害剤（例えば、シタグリプチン、ビルダグリプチン、サクサグリプチン、リナグリ
プチン、デュトグリプチン、ジェミグリプチンおよびアログリプチン）、あるいは、本願
に記載のいずれかの組成物、例えば治療有効用量の配列番号２に少なくとも９０％同一で
ある配列を含有する可溶性ＭＡＮＦタンパク質および／またはアポモルヒネ）をさらに含
む。一部の実施形態は、定期的にグルコースをモニターする（例えばグルコメーターを使
用して定期的に自己血糖をモニターする）ための膵臓β細胞機能の減少対象または膵臓β
細胞量の減少があると同定された対象を選択することを含む。一部の実施形態は、医師ま
たは医療専門家による定期的な医学的評価（例えば、少なくとも１年に１回、少なくとも
６か月に１回、少なくとも３か月に１回、少なくとも２か月に１回、または少なくとも１
か月に１回の定期的訪問）のための膵臓β細胞機能の減少対象または膵臓β細胞量の減少
があると同定された対象を選択することをさらに含む。一部の実施形態は、対象の医療記
録に試験結果を記録すること、または、膵臓β細胞機能の減少もしく対象は膵臓β細胞量
の減少があると同定された対象の１人もしくは複数の直系家族の膵臓β細胞機能もしくは
膵臓β細胞量をモニターする類似の試験もしくは任意の当技術分野で公知の試験を行うこ
とをさらに含む。一部の実施形態は、膵臓β細胞移植のための膵臓β細胞機能の減少対象
または膵臓β細胞量の減少がある対象を選択することをさらに含む。
膵臓β細胞障害の処置の有効性をモニターする方法
さらに、対象（例えば、膵臓β細胞障害に罹患していると診断された対象）における膵
臓β細胞機能不全の処置の有効性をモニターする方法を提供する。これらの方法は、第１
の時点での対象由来の生体試料中の可溶性ＭＡＮＦのレベルを決定（アッセイ）し、第２
の時点での対象由来の生体試料中の可溶性ＭＡＮＦのレベルを決定（アッセイ）し、第２
の時点での生体試料中の可溶性ＭＡＮＦのレベルを第１の時点での生体試料中の可溶性Ｍ
ＡＮＦのレベルと比較することを含むものであって、（ｉ）第１の時点が処置前であり、
第２の時点が処置開始後の任意の時点であるか、（ｉｉ）第１の時点が処置開始後であり
、第２の時点が処置中または処置後のより遅い時点であり；第１の時点での生体試料中の
可溶性ＭＡＮＦのレベルと比較した第２の時点での生体試料中の可溶性ＭＡＮＦのレベル
の減少は、対象において処置が有効であったことを示す。一部の実施形態において、膵臓
β細胞障害の処置は、インスリン（例えば、本願に記載のインスリンのいずれかの形態）
、ピオグリタゾンおよびＴＵＤＣＡの１つまたは複数の投与である。一部の実施形態にお
いて、処置は、対象（例えば、本願に記載のような対象）への膵臓β細胞の移植である。
第１の時点での可溶性ＭＡＮＦのレベルと比較した第２の時点での生物試料中の可溶性
ＭＡＮＦのレベルの減少は、対象における処置の有効性を示す。第１の時点での可溶性Ｍ
ＡＮＦのレベルと比較した第２の時点での生物試料中の可溶性ＭＡＮＦのレベルの増加ま
たは実質的な変化がないことは、処置が有効でなかったこと、および／または本処置が終
了されるべきであること、および／または代替療法を被検体に施すべきであることを示す
。一部の実施形態において、第１の時点での可溶性ＭＡＮＦのレベルと比較した第２の時
点での生物試料中の可溶性ＭＡＮＦのレベルの増加または実質的な変化がないことは、投
与量を増やして対象に処置を施すべきであること、または、頻度および／もしくは期間を
増やして処置を施すべきであることを示す。
一部の実施形態において、本方法は、第１の時点および第２の時点で、検出可能もしく
は観察可能な膵臓β細胞量を有し、かつ／または検出可能もしくは観察可能な量の膵臓β
細胞機能を有している対象（例えば、第１の時点および第２の時点で膵臓β細胞量または
膵臓β細胞機能を完全に喪失していない対象）に対して実施される。一部の実施形態にお
いて、本方法は、膵臓β細胞障害に罹患していると事前に同定または診断された対象に対
して行われる。一部の実施形態は、膵臓β細胞障害に罹患している対象を選択することを
さらに含む。一部の実施形態は、対象由来の試料を取得することをさらに含む。一部の実
施形態は、１回または複数の用量の処置を対象に施すことをさらに含む。
一部の実施形態において、第２の時点は、第１の時点の少なくとも６時間（例えば、少
なくとも１２時間、１８時間、２４時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週間
、２週間、３週間、１か月、２か月、３か月、６か月、１年、２年、３年、４年または５
年）後であってもよい。一部の実施形態において、第１の時点は、医療機関への入院時で
あってもよく、または、膵臓β細胞障害の少なくとも１つの症状を最初に診察した１週間
以内であってもよい。
一部の実施形態において、本方法は、１つまたは複数のさらなるより遅い時点で、対象
由来の生体試料中の可溶性ＭＡＮＦのレベルを決定（アッセイ）することをさらに含む。
これらの方法において、（早い日付順の時点で収集した）初期の（例えば、直前の）試料
中の可溶性ＭＡＮＦのレベルと比較して、（後の日付順の時点で収集した）より遅い時点
の試料中の可溶性ＭＡＮＦのレベルの減少は、対象における処置の有効性を示す。同様に
、（早い日付順の時点で収集した）より早い時点の（例えば、直前の）試料中の可溶性Ｍ
ＡＮＦのレベルと比較して、（後の日付順の時点で収集した）より遅い時点の試料中の可
溶性ＭＡＮＦのレベルの増加または有意な変化がないということは、対象における処置が
有効でなかったことを示す。一部の実施形態において、これらの方法は、第１の時点、第
２の時点、および１つまたは複数のさらなる時点で、検出可能もしくは観察可能な膵臓β
細胞量を有し、かつ／または、検出可能もしくは観察可能な量の膵臓β細胞機能を有する
対象（例えば、第１の時点、第２の時点、および１つまたは複数のさらなる時点で、膵臓
β細胞量または膵臓β細胞機能が完全に喪失していない被検体）に対して行われる。
一部の実施形態において、対象は事前に膵臓β細胞移植を受けていることができ、こう
いった場合、これらの方法は、一つには、対象における膵臓β細胞移植の効果細胞量をモ
ニターする。一部の実施形態において、移植された膵臓β細胞は、自家移植、同種移植、
または異種移植された膵臓β細胞である。一部の実施形態において、移植された膵臓β細
胞は、デバイス内に存在するか、または生体適合性ポリマーにより内包されているか、ま
たは生体適合性ポリマー内に配置されている。一部の実施形態において、移植された膵臓
β細胞は、膵臓以外の組織内（例えば、肝臓組織）に存在する。一部の実施形態において
、これらの方法は、膵臓β細胞移植の１週間、２週間、３週間、１か月、２か月、３か月
、４か月、５か月、６か月、または１年以内に対象において実施される。一部の実施形態
において、第１の時点は、移植術の直後（例えば、１週間または２週間以内）である。
可溶性ＭＡＮＦのレベルは、当技術分野で公知の方法を用いて決定することができる。
例えば、可溶性ＭＡＮＦのレベルは、可溶性ＭＡＮＦに特異的に結合する抗体を利用する
、当技術分野で公知の多数の技術（例えば酵素免疫吸着測定法）を使用して検出すること
ができる。一部の実施形態において、本方法は、対象由来のある１つの試料または少なく
とも２つの試料（例えば、体液、例えば尿、血液、血漿、血清、または脳脊髄液を含有す
る生体試料）を取得または収集することを含む。本願に記載のいずれかの方法は、医療施
設（例えば、病院、クリニックまたは介護付き医療施設）に来院する患者に対して実施す
ることができる。一部の実施形態において、本方法は、医療専門家による定期検査の一部
として対象に対して行われる。対象は、膵臓β細胞障害であると事前に診断されている可
能性があるか、膵臓β細胞障害の１つまたは複数の症状（例えば、本願に記載の膵臓β細
胞障害のいずれかの症状）を示し得る。対象は、幼児、小児、十代の若者、成人または高
齢者である場合がある。
これらの方法は、任意の医療専門家（例えば、医師、検査技師、看護師、医師助手、お
よび看護助手）によって行われる。一部の実施形態は、対象の膵臓β細胞障害の１つまた
は複数の（例えば２、３または４つの）別のマーカーの追加検出または評価をさらに含む
（例えば、第１の時点の対応するレベルと比較して第２の時点で、Ｃペプチド産生および
分泌の増加、インスリン産生および分泌の増加、ＩＡＰＰ産生および分泌の増加、血糖レ
ベルの減少、糖化ヘモグロビンレベルの減少、ならびに対象の体液（例えば、尿中）のケ
トンの欠如また有意なレベルがない場合、処置が有効であることをさらに示す）。膵臓β
細胞障害の１つまたは複数のさらなるマーカーの検出方法は、当技術分野で公知である。
処置するための対象を選択する方法
さらに、膵臓β細胞障害を処置するための対象を選択する方法を提供する。これらの方
法は、対象由来の生体試料中の可溶性ＭＡＮＦのレベルを決定（アッセイ）し；生体試料
中の可溶性ＭＡＮＦのレベルを可溶性ＭＡＮＦの基準レベルと比較し；基準レベルと比較
して生体試料の可溶性ＭＡＮＦのレベルが増加した対象を膵臓β細胞障害の処置のために
選択することを含む。これらの方法において、基準レベルと比較して生体試料中の可溶性
ＭＡＮＦのレベルが減少しているか、有意な変化がない対象は、膵臓β細胞障害の処置の
ために選択されない。
一部の実施形態は、膵臓β細胞障害の１つまたは複数のさらなるマーカーのレベルを評
価または決定することをさらに含み、膵臓β細胞障害の１つまたは複数のさらなるマーカ
ーの検出は、対象が膵臓β細胞障害の処置のために選択されものとすることをさらに示す
。膵臓β細胞障害のこれらの１つまたは複数のさらなるマーカーとしては、対象由来の生
体試料中のＣペプチドレベルの減少、対象由来の生体試料中のＩＡＰＰレベルの減少、対
象由来の生体試料中のインスリンレベルの減少、対象の１種もしくは複数の血糖レベルの
増加、対象の糖化ヘモグロビンレベルの増加、または対象由来の生体試料中（例えば、尿
中）のケトンの検出が挙げられる。対象由来の生体試料中のＣペプチド、ＩＡＰＰ、イン
スリン、血糖、糖化ヘモグロビンおよびケトンのレベルを検出する方法は、当技術分野で
公知である。
可溶性ＭＡＮＦのレベルは、当技術分野で公知の方法を使用して決定することができる
。例えば、可溶性ＭＡＮＦのレベルは、可溶性ＭＡＮＦに特異的に結合する抗体を利用す
る、当技術分野で公知の多数の技術（例えば酵素免疫吸着測定法）を使用して検出するこ
とができる。一部の実施形態において、本方法は、対象由来の試料（例えば、体液、例え
ば尿、血液、血漿、血清、または脳脊髄液を含有する生体試料）を取得または収集するこ
とをさらに含む。本方法は、任意の医療専門家（例えば、医師、看護師、医師助手、検査
技師、または看護助手）により実施可能である。
対象は、膵臓β細胞障害の１つまたは複数の症状（例えば、本願に記載の膵臓β細胞障
害のいずれかの症状）を示し得る。また対象は、症状なしで、または膵臓β細胞障害のを
わずかに１つ示す場合がある。対象は、膵臓β細胞障害に罹患していることが疑われ得る
か、または対象は膵臓β細胞障害を発症する増加したリスクを有し得る。対象は、膵臓β
細胞障害（例えば２型糖尿病）の家族歴を有している可能性がある。対象は、膵臓β細胞
障害に罹患していると事前に診断することができる。
一部の実施形態において、本方法は、検出可能もしくは観察可能な膵臓β細胞量を有し
ており、かつ／または、検出可能もしくは観察可能な量の膵臓β細胞機能を有する対象（
例えば、膵臓β細胞量または膵臓β細胞機能を完全に喪失していない対象）に対して実施
される。
対象に施すことが可能な膵臓β細胞障害の処置としては、限定するものではないが、次
のものが挙げられる：可溶性ＭＡＮＦ（例えば、配列番号２、すなわち配列番号２の完全
長に少なくとも８０％同一である配列を含有する可溶性ＭＡＮＦタンパク質）、アポモル
ヒネ、速効型インスリン（例えば、アスパルトまたはリスプロインスリン）、短時間作用
型（例えば、レギュラーインスリン）、中間型インスリン（例えば、中性プロタミンハー
ゲドルンまたはＮＰＨインスリン）、長時間型インスリン（例えば、ウルトラレンテイン
スリン）、インスリングラルギン、インスリンデテミル、プラムリンタイド、インクレチ
ンミメティックス（例えば、エクセナチド）、スルホニル尿素（例えば、クロルプロパミ
ド、グリピジド、グリブリドおよびグリメピリド）、メグリチニド（例えば、レパグリニ
ドおよびナテグリニド）、ビグアナイド（例えば、メトホルミン）、チアゾリジンジオン
（例えば、ロシグリタゾンおよびピオグリタゾン）、α−グルコシダーゼ阻害剤（例えば
、アカルボースおよびメグリトール（meglitol）、およびＤＰＰ−４阻害剤（例えば、シ
タグリプチンおよびサクサグリプチン）。膵臓β細胞障害の処置は、任意の組合せで使用
される、１つまたは複数の（例えば、２、３または４つの）上記薬剤を包含し得る。一部
の実施形態において、例えば、本方法がアポモルヒネの投与を含んでいる場合、対象は勃
起不全またはパーキンソン病に罹患していない。
これらの方法の一部の実施形態は、対象に膵臓β細胞障害に関する少なくとも１種（例
えば、２、３、または４種）の処置（例えば、本願に記載の、または当技術分野で公知の
１種または複数の膵臓β細胞障害の処置）を施すことをさらに含む。例えば、これらの方
法の一部の実施形態は、少なくとも１（例えば、少なくとも２、４、６、８、または１０
）用量の本願に記載のいずれかの医薬組成物を投与することをさらに含む。膵臓β細胞障
害の処置は、少なくとも１週間、１か月、６か月、１年、２年、３年、４年、５年、また
は１０年の期間にわたって継続することが可能である。処置は、対象に定期的に施すこと
ができる（例えば、１日１回、１日２回、１日３回、１日４回、週に１回、週に２回、週
に３回、週に４回、月に１回、月に２回、月に３回、または月に４回）。
一部の実施形態において、基準レベルと比較して、可溶性ＭＡＮＦのレベルが増加した
対象は、医師または医療専門家による定期的な医学的評価（例えば、少なくとも１年に１
回、少なくとも６か月に１回、少なくとも３か月に１回、少なくとも２か月に１回、また
は少なくとも１か月に１回、または少なくとも週に１回の定期的訪問）のために選択され
る。一部の実施形態は、対象の医療記録に、対象が膵臓β細胞障害の１種または複数の処
置（例えば、本願に記載のいずれかの例示的な処置）を施されるか処方されるよう記録す
ることをさらに含む。一部の実施形態において、基準レベルと比較して可溶性ＭＡＮＦの
レベルが増加した対象は、膵臓β細胞を移植するために選択される。
膵臓β細胞障害を発症するリスクのある対象を同定する方法
さらに、膵臓β細胞障害を発症するリスクのある対象を同定する方法を提供する。これ
らの方法は、対象由来の生体試料中の可溶性ＭＡＮＦのレベルを決定し；対象由来の生体
試料中の可溶性ＭＡＮＦのレベルを可溶性ＭＡＮＦの基準レベルと比較することを含む。
対象由来の生体試料中の可溶性ＭＡＮＦのレベルが基準レベルと比較して増加した場合、
対象は、膵臓β細胞障害を発症するリスクが高いと同定される。基準レベルと比較して、
対象由来の生体試料中の可溶性ＭＡＮＦのレベルが減少したか有意に変化していない場合
、対象は膵臓β細胞障害を発症するリスクが低いと同定される。
本願に記載のいずれかの方法において、増加したリスクは、可溶性ＭＡＮＦのレベルに
おける有意なまたは観察可能な増加のない対象（例えば、本願に記載のいずれかの方法を
使用して、膵臓β細胞障害に罹患していると診断されない対象、健康な対象は疾患に罹患
していると診断されない、または、膵臓β細胞障害の症状のない対象、もしくは膵臓β細
胞障害の家族歴のない対象）と相対的である。
可溶性ＭＡＮＦのレベルは、標準的な方法（例えば、当技術分野で公知の抗体に基づく
いずれかの方法）を使用して決定することができる。本方法は、任意の医療専門家（例え
ば、医師、看護師、医師助手、検査技師、または看護助手）によって行われる。
対象は、膵臓β細胞障害の１つまたは複数の症状（例えば、本願に記載の膵臓β細胞障
害のいずれかの症状）を示し得る。対象はまた、膵臓β細胞障害に罹患していることが疑
われ得る。また対象は、症状を示さないことがあり、または膵臓β細胞障害の症状をわず
かに１つ示す場合がある。対象は、膵臓β細胞障害（例えば、２型糖尿病）の家族歴を有
している可能性がある。
一部の実施形態において、本方法は、検出可能もしくは観察可能な膵臓β細胞量を有し
ており、かつ／または検出可能もしくは観察可能な量の膵臓β細胞機能を有する対象（例
えば、膵臓β細胞量または膵臓β細胞機能が完全に喪失していない対象）に対して実施さ
れる。
膵臓β細胞障害を発症するリスクが高いと同定された対象には、膵臓β細胞障害の処置
（例えば、本願に記載のいずれかの処置）を施すことができるか、または、膵臓β細胞障
害に対する新規処置もしくは代替処置を施すことができる。膵臓β細胞障害を発症するリ
スクが高いと同定された対象は、さらに侵襲性な治療的処置を受けることもできる（例え
ば、クリニックまたは病院の定期的訪問の増加）。
一部の実施形態は、膵臓β細胞障害を発症するリスクが高いと同定された対象に、膵臓
β細胞障害の処置を施すこと（例えば、単離、精製された、もしくは組換え型である可溶
性ＭＡＮＦタンパク質、ピオグリタゾン、ＧＬＰ−１、またはＤＰＰ−４阻害剤（例えば
、シタグリプチン、ビルダグリプチン、サクサグリプチン、リナグリプチン、デュトグリ
プチン、ジェミグリプチンおよびアログリプチン）、あるいは、本願に記載のいずれかの
組成物、例えば、治療有効用量の配列番号２に少なくとも９０％同一である配列を含有す
る可溶性ＭＡＮＦタンパク質および／またはアポモルヒネ）をさらに含む。一部の実施形
態は、グルコースをモニターする（例えば、グルコメーターを使用して定期的に自己血糖
をモニターする）ための膵臓β細胞障害を発症するリスクの高い対象を選択することを含
む。一部の実施形態は、医師または医療専門家による定期的な医学的評価（例えば、少な
くとも１年に１回、少なくとも６か月に１回、少なくとも３か月に１回、少なくとも２か
月に１回、または少なくとも１か月に１回の定期的訪問）のための対象を選択することを
さらに含む。一部の実施形態は、対象の医療記録に試験結果を記録すること、または、本
願に記載の方法を使用して、膵臓β細胞障害を発症するリスクが高いと同定された対象の
１人もしくは複数の直系家族における膵臓β細胞障害を発症するリスクを決定する類似の
試験もしくは任意の当技術分野で公知の試験を実施することをさらに含む。
臨床試験に参加する対象を選択する方法
さらに、臨床試験に参加する対象を選択する方法を提供する。これらの方法は、対象由
来の生体試料中の可溶性ＭＡＮＦのレベルを決定し；対象由来の生体試料中の可溶性ＭＡ
ＮＦのレベルを可溶性ＭＡＮＦの基準レベルと比較し、臨床試験に参加するための、基準
レベル（例えば、本願に記載の可溶性ＭＡＮＦのいずれかの基準レベル）と比較して生体
試料中の可溶性ＭＡＮＦのレベルが増加したか、または減少したかもしくは有意な変化の
ない対象を選択することを含む。
可溶性ＭＡＮＦのレベルは、標準的な分子生物学的方法（例えば、本願に記載の抗体に
基づくいずれかの方法）を使用して決定することができる。本方法は、任意の医療専門家
（例えば、医師、看護師、医師助手、検査技師、または看護助手）により実施することが
できる。
一部の実施形態において、対象は、膵臓β細胞障害の１つまたは複数の症状（例えば、
本願に記載の膵臓β細胞障害のいずれかの症状）をもって来院し得る。一部の実施形態に
おいて、対象はまた、症状を示さない場合もあり、または膵臓β細胞障害の症状をわずか
に１つ示す場合がある。一部の実施形態において、対象は、膵臓β細胞障害（例えば、２
型糖尿病）の家族歴を有している可能性がある。一部の実施形態において、対象は既に膵
臓β細胞障害に罹患していると診断され得る。一部の実施形態において、対象は、膵臓β
細胞障害の処置を受けている。一部の実施形態において、対象には、臨床試験の間に、膵
臓β細胞障害の新規処置または代替処置が施される。
膵臓β細胞における小胞体ストレスを検出する方法
さらに、膵臓β細胞によって産生される可溶性ＭＡＮＦのレベルを決定し、産生される
可溶性ＭＡＮＦのレベルを可溶性ＭＡＮＦの基準レベル（例えば、本願に記載の可溶性Ｍ
ＡＮＦのいずれかの基準レベル）と比較することを含む、膵臓β細胞の小胞体ストレスを
検出する方法を提供する。可溶性ＭＡＮＦの基準レベルと比較して、膵臓β細胞により産
生される可溶性ＭＡＮＦのレベルが増加したということは、膵臓β細胞における小胞体ス
トレスの増加を示す。可溶性ＭＡＮＦの基準レベルと比較して、膵臓β細胞によって産生
される可溶性ＭＡＮＦのレベルが減少したか有意な変化がないということは、膵臓β細胞
が検出可能なレベルの小胞体ストレスを受けていないことを示す。
可溶性ＭＡＮＦのレベルは、標準的な分子生物学的方法（例えば、本願に記載の抗体に
基づくいずれかの方法）を使用して決定することができる。本方法は、任意の医療専門家
（例えば、医師、看護師、医師助手、検査技師、または看護助手）または科学者によって
行われる。
一部の実施形態において、膵臓β細胞は哺乳動物（例えばヒト）にあり、膵臓β細胞に
よって産生される可溶性ＭＡＮＦのレベルは、哺乳動物由来の生体試料（例えば、血液、
血清または血漿を含む試料）から決定することができる。一部の実施形態において、膵臓
β細胞は、内因性膵臓β細胞であってもよいし、移植された膵臓β細胞（例えば自家移植
、同種移植または異種移植された膵臓β細胞）であってもよい。一部の実施形態において
、膵臓β細胞は、遺伝学的に改変された自家移植型膵臓β細胞である）。一部の実施形態
において、膵臓β細胞は、哺乳動物の膵臓内に存在し得るか、膵臓以外の組織（例えば肝
臓）に存在し得る。一部の実施形態において、膵臓β細胞は、デバイス、または生体適合
性材料もしくはポリマーに存在し得る。
一部の実施形態において、膵臓β細胞は、インビトロにおいて（例えば、組織培養物に
おいて）存在する。例えば、哺乳動物から回収された初代膵臓β細胞はエクスビボで培養
することができる。一部の実施形態において、培養された膵臓β細胞は、初代哺乳動物（
例えば、ヒト、ラット、モンキー、ウシ、またはブタ）の膵臓β細胞株である。一部の実
施形態において、培養された哺乳動物の膵臓β細胞は、遺伝学的に操作することができる
か（例えば、１つまたは複数のタンパク質を発現するように遺伝学的に改変することがで
きるか、１つまたは複数のタンパク質の発現を減少するように遺伝学的に改変することが
できる）、または化学的に（例えば、１つまたは複数の増殖因子で）処理することができ
る。一部の実施形態において、膵臓β細胞は、１つまたは複数の生体適合性ポリマーまた
は生合成材料（例えば、哺乳動物（例えば、ヒト）への膵臓β細胞の移植を促進するポリ
マーまたは材料）の存在下で培養することができる。様々な生体適合性ポリマーおよび生
合成材料が当技術分野で公知である。
一部の実施形態において、対象内の膵臓β細胞における小胞体ストレスの検出は以下の
１つまたは複数により行われる：対象の膵臓β細胞における小胞体ストレスのレベルが増
加した対象の同定、治療薬（例えば、膵臓β細胞における小胞体ストレスを減少する薬剤
、例えば、本願に記載のいずれかの可溶性ＭＡＮＦタンパク質および／またはアポモルヒ
ネ）の投与；対象の膵臓β細胞機能のモニタリング（例えば、本願に記載の膵臓β細胞機
能をモニターするいずれかの方法）；および、病院訪問の頻度または対象のヘルスモニタ
リングレベルの増加（例えば、血糖検査の頻度の増加）。一部の実施形態において、例え
ば、本方法がアポモルヒネの投与を含んでいる場合、対象は勃起不全またはパーキンソン
病に罹患していない。
一部の実施形態において、インビトロでの膵臓β細胞における小胞体ストレスの増加の
検出は、膵臓β細胞を治療薬（例えば、膵臓β細胞における小胞体ストレスを減少する薬
剤、例えば、本願に記載のいずれかの可溶性ＭＡＮＦタンパク質またはアポモルヒネ）と
接触させ、かつ／または膵臓β細胞機能をモニターする（例えば、本願に記載の膵臓β細
胞機能をモニターするいずれかの方法）ことによって行われる。本願に記載のいずれかの
方法において、膵臓β細胞は、少なくとも１つの別の細胞型または少なくとも１つの別の
細胞株と共にインビトロで培養させることができる（例えば、共培養またはフィーダー培
養）。
処置の方法
さらに、対象に有効量の可溶性ＭＡＮＦ（例えば、精製、単離し、または組換え型であ
る可溶性ＭＡＮＦタンパク質（例えば、本願に記載のいずれかの可溶性ＭＡＮＦタンパク
質））および／またはアポモルヒネを投与することを含む、対象の膵臓β細胞障害を処置
するかその発症を遅延させる方法を提供する。一部の実施形態において、処置によって、
対象の膵臓β細胞障害の症状（例えば、本願に記載のいずれかの症状）の数が減少するか
、または、膵臓β細胞障害の１つもしくは複数の症状（例えば、本願に記載のいずれかの
症状）の重症度、強度もしくは頻度が減少する可能性がある。一部の実施形態において、
処置によって、発症または１つもしくは複数の症状を遅延させることができる（処置を受
けている対象と比較して、処置を受けていない対象における１つまたは複数の症状の実際
的な発症の時間が増加）。例えば、処置によって下記の１つまたは複数が生じ得る：対象
の血糖レベル（複数可）の減少、対象の糖化ヘモグロビンのレベルの減少、対象のインス
リン産生の喪失割合の減少、対象の膵臓β細胞機能の喪失割合の減少、および対象の膵臓
β細胞量の喪失割合の減少。一部の実施形態において、例えば、本方法がアポモルヒネ（
apomorpine）の投与を含んでいる場合、対象は勃起不全またはパーキンソン病に罹患して
いない。
可溶性ＭＡＮＦ
例えば、一部の実施形態において、対象に投与される可溶性ＭＡＮＦは、配列番号２お
よび４〜７のいずれか１つ、すなわち、配列番号２または４〜７の完全長に少なくとも８
０％同一（例えば、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５
％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一）である配列を含有し、場合に
よっては、（本願に記載の）可溶性ＭＡＮＦタンパク質の生物活性を有していてもよい。
一部の実施形態において、対象に投与される可溶性ＭＡＮＦは、配列番号２（ヒト可溶性
ＭＡＮＦ）に、すなわち、配列番号２の完全長に少なくとも９５％同一（例えば、少なく
とも９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一）である配列を含有し、場合に
よっては、（本願に記載の）可溶性ＭＡＮＦタンパク質の生物活性を有していてもよい。
一部の実施形態において、対象に投与される可溶性ＭＡＮＦは、配列番号２または可溶性
ＭＡＮＦの内因性形態（野性型）である。これらのいずれかの実施形態において、可溶性
ＭＡＮＦは精製または単離することができる。これらのいずれかの実施形態において、可
溶性ＭＡＮＦは組換え型タンパク質であり得る。
配列の比較および２つの配列間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを用
いて行われる。２つのアミノ酸の配列間の同一性パーセントは、（インターネット上のｇ
ｃｇ．ｃｏｍで利用可能な）ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムに組み
込まれている、Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol., 48:444-453, 1970）アルゴリズ
ムを使用し、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれ
かを使用し、ギャップ加重１６およびギャップ長加重１を用いて決定される。２つのヌク
レオチド配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（これもまたイン
ターネット上のｇｃｇ．ｃｏｍで利用可能）のＧＡＰプログラムを使用し、ＮＷＳｇａｐ
ｄｎａ．ＣＭＰマトリックス、ギャップ加重４０、およびギャップ長加重１を用いて決定
される。
一般に、本願に記載されているアミノ酸配列間の同一性パーセントは、米国バイオテク
ノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information、ＮＣＢＩ）
のウェブサイトで一般に利用可能なＢＬＡＳＴ２．０プログラムを用いて決定されている
。配列比較はギャップのないアラインメントを使用するとともに、デフォルトパラメータ
（Ｂｌｏｓｓｕｍ６２マトリックス、ギャップ伸長コスト１１、残基当たりのギャップコ
スト１、およびラムダ比０．８５）を使用して行われる。ＢＬＡＳＴプログラムにおいて
使用される数学的アルゴリズムは、Altschul et al., Nucleic Acids Research 25:3389-
3402, 1997に記載されている。
本願で述べているように、可溶性ＭＡＮＦの哺乳動物形態は、高度な配列同一性を有し
ている。一般に、生物活性（例えば、対象の膵臓β細胞障害を処置するかその発症を遅延
させる、または、膵臓β細胞における小胞体ストレスを減少する、または、２個以上の膵
臓β細胞の集団における小胞体ストレス由来アポトーシス細胞死を減少するか遅延させる
能力）を有する可溶性ＭＡＮＦの異型体を取得するためには、可溶性ＭＡＮＦの様々な哺
乳動物種間で保存されていない残基を改変または除去することができる一方、高度に保存
されている残基は改変または除去してはならないことは、当業者には理解されよう。当技
術分野で公知であるように、当業者は、本願で提供されている哺乳動物可溶性ＭＡＮＦタ
ンパク質に関する各種配列をアラインメントさせて、高度に保存されているそれらの残基
と、保存されていないそれらの残基を同定することができる。
可溶性ＭＡＮＦの各種形態の生物活性は、本願に記載の様々な生物活性アッセイまたは
当技術分野で公知のアッセイを実施することによって試験することができる。例えば、可
溶性ＭＡＮＦタンパク質の生物活性は、可溶性ＭＡＮＦ（例えば、本願に記載のいずれか
の可溶性ＭＡＮＦタンパク質）の存在下または非存在下で培養された膵臓β細胞を処理し
、膵臓β細胞における小胞体ストレスを誘発する薬剤で膵臓β細胞を刺激することによっ
て試験することができる。生物活性を有する可溶性ＭＡＮＦは、可溶性ＭＡＮＦと接触さ
せず、薬剤で処理した細胞と比較すると、可溶性ＭＡＮＦおよび薬剤と接触させた細胞で
観察された小胞体ストレスまたは小胞体ストレス由来アポトーシスの量を減少する。例え
ば、生物活性を有する可溶性ＭＡＮＦは、可溶性ＭＡＮＦで処理せず、薬剤で処理した細
胞と比較すると、小胞体ストレスを誘発する薬剤で処理した細胞における小胞体ストレス
の１つまたは複数のマーカーを減少することができる（例えば、グルコース調節タンパク
質７８（ｇｒｐ７８またはＢｉＰとしても公知である）の誘発またはｂｃｌ−２関連ａｔ
ｈａｎｏｇｅｎｅ−１（ｂａｇ−１）発現の減少；活性化、ゴルジ転座、プロテアーゼ切
断、または転写因子６（ＡＴＦ６）活性化の核移行の減少；プロテインキナーゼＲＮＡ様
小胞体キナーゼ（ＰＥＲＫ）活性化、オリゴマー化、または自己リン酸化（autohosphory
lation）の減少；ＩＲＥ１の活性化の減少；ｅＩＦ２αリン酸化の減少；ＸＢＰ１ ｍＲ
ＮＡのイントロン処理の減少；ＪＮＫシグナル経路活性化の減少；プロカスパーゼ４の活
性化および切断の防止；ならびに小胞体酸化還元環境におけるシフトの防止または減少（
例えば、実施例に記載したように、酸化還元感受性ｅｒｏＧＦＰタンパク質を使用して測
定））。
対象に投与される可溶性ＭＡＮＦは、１つまたは複数の（例えば２、３、４、５、６、
７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５）の挿入、付加、欠失または修飾
を含有することができる。例えば、可溶性ＭＡＮＦは、対象における可溶性ＭＡＮＦの半
減期を有意に延長するか、（例えば保管中に）可溶性ＭＡＮＦの熱安定性を高める化学的
成分（例えば、タンパク質（例えばアルブミン）、糖（例えば、Ｎ結合型糖鎖またはＯ結
合型糖鎖、例えばマンノース）（例えば、Sola et al., J. Pharm. Sci. 98:1123-1245,
2009を参照）、またはポリマー（例えば、ポリエチレングリコール））に共有結合させる
ことができる。これらの方法で用いられる可溶性ＭＡＮＦタンパク質は、ＨＩＶ ｔａｔ
タンパク質または可溶性ＭＡＮＦタンパク質の細胞透過性を増加させる任意の他の成分を
含むこともできる。
分子生物学および細胞培養技術を用いた組換えタンパク質（例えば、組換え型可溶性Ｍ
ＡＮＦ）を産生するためのいくつかの方法は、当技術分野で公知である。例えば、ｍＲＮ
Ａ配列（例えば、配列番号３に少なくとも８０％同一である（例えば、少なくとも８５％
、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％
または１００％同一である）配列を含有するｍＲＮＡ）によってコードされている可溶性
ＭＡＮＦは、細菌細胞、酵母細胞または哺乳動物細胞に（タンパク質発現プラスミドまた
はウイルス系ベクターを使用して）トランスフェクトすることができ、トランスフェクト
細胞によって可溶性ＭＡＮＦを発現させることができる。トランスフェクト細胞または培
地は回収可能で、組換え型可溶性ＭＡＮＦタンパク質は、当技術分野で公知の方法を利用
して精製することができる。別の哺乳動物の可溶性ＭＡＮＦタンパク質をコードしている
多数のさらなる核酸（ｍＲＮＡ）は、当技術分野で公知である。
一部の実施形態において、まず、対象は、本願に記載のいずれかの診断方法、または、
本願に記載の、もしくは当技術分野で公知の膵臓β細胞障害を発症するリスクがある対象
を予測するいずれかの方法を用いて、処置のために同定または選択される。
対象には、少なくとも１（例えば、少なくとも２、３、４、または５）用量の可溶性Ｍ
ＡＮＦ（例えば、本願に記載のいずれかの可溶性ＭＡＮＦタンパク質）および／またはア
ポモルヒネを投与することができる。可溶性ＭＡＮＦおよび／またはアポモルヒネは、少
なくとも１日に１回（例えば１日に２回、１日に３回、および１日に４回）、少なくとも
週に１回（例えば、週に２回、週に３回、週に４回）、および／または少なくとも月に１
回、対象に投与することができる。対象は長期間（例えば、少なくとも１か月、２か月、
６か月、１年、２年、３年、４年、または５年）処置することができる（例えば、定期的
に可溶性ＭＡＮＦを投与することができる）。本願に詳細に記載しているように、対象に
投与する可溶性ＭＡＮＦおよび／またはアポモルヒネの投与量は、医師によって、多数の
生理学的要因、例えば、限定するものではないが、対象の性別、対象の体重、対象の年齢
および他の病状の存在などに配慮して決定することができる。可溶性ＭＡＮＦおよび／ま
たはアポモルヒネは、経口投与、静脈内投与、動脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、頭蓋
内投与、または脳脊髄液への注射によって対象に投与することができる。同様に、薬剤は
固体（例えば経口投与用）として、または生理学上許容できる液状担体（例えば生理食塩
水）（例えば、静脈内投与、動脈内投与、皮下投与、筋内投与または脳脊髄投与用）とし
て処方できる。
一部の実施形態において、対象には、膵臓β細胞障害の少なくとも１つの（例えば２、
３、４、または５つ）の他の処置（例えば、本願に記載の膵臓β細胞障害に関するいずれ
かの処置、例えば、本願に記載のいずれかのインスリン）がさらに施される。一部の実施
形態において、可溶性ＭＡＮＦおよび／またはアポモルヒネは、膵臓β細胞障害の少なく
とも１つの（例えば２、３または４つの）他の処置と一緒に処方される（例えば、全身投
与用の生理学上許容できるバッファーまたは媒体中で処方される）（例えば、本願に記載
のいずれかの医薬組成物）。
膵臓β細胞における小胞体ストレスを減少する方法
さらに、膵臓β細胞における小胞体ストレスを減少する方法を提供する。これらの方法
は、膵臓β細胞を有効量の１つまたは複数の（例えば２または３つの）の可溶性ＭＡＮＦ
（例えば、本願に記載のいずれかの可溶性ＭＡＮＦタンパク質、例えば、配列番号２に少
なくとも８０％同一である配列を含有する、組換え型、精製、または単離された可溶性Ｍ
ＡＮＦタンパク質）、アポモルヒネ、およびピオグリタゾンと接触させることを含む。一
部の実施形態において、膵臓β細胞はインビトロにある（組織培養物）。一部の実施形態
において、膵臓β細胞は対象内にあり得る。これらの実験において使用される膵臓β細胞
は、本願に記載のいずれかの膵臓β細胞であり得る。
一部の実施形態において、膵臓β細胞は、１つまたは複数の（例えば、２または３つの
）可溶性ＭＡＮＦ、アポモルヒネおよびピオグリタゾンと、長時間（例えば、少なくとも
１５分、３０分、１時間、２時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間または２４時間
）の間、接触させることができる。一部の実施形態において、膵臓β細胞は、数用量の１
つまたは複数の（例えば、２または３つの）可溶性ＭＡＮＦ、アポモルヒネおよびピオグ
リタゾン（例えば、少なくとも２用量、３用量、４用量、または５用量）と、例えば、定
期的な時間間隔で（例えば、約１日１回、週に１回、または月に１回）接触させる。
小胞体ストレスの減少は、細胞における小胞体ストレスを検出するための（例えば、本
願に記載の小胞体ストレスのいずれかのマーカーを検出またはアッセイするための）当技
術分野で公知の任意の方法を用いて決定することができる。例えば、小胞体ストレスの減
少は、細胞における小胞体ストレスの１つまたは複数のマーカーの減少によって検出する
ことができる。一部の実施形態において、小胞体ストレスの減少は、以下の１つまたは複
数の事象によって観察することができる：ｇｒｐ７８（ＢｉＰ）またはｂａｇ−１発現の
誘発の減少；活性化、ゴルジ転座、プロテアーゼ切断、またはＡＴＦ６の核移行の減少；
ＰＥＲＫ活性化、オリゴマー化、または自動リン酸化の減少；ＩＲＥ１活性化の減少；ｅ
ＩＦ２αリン酸化の減少；ＸＢＰ１ ｍＲＮＡのイントロン処理の減少；ＪＮＫシグナル
経路活性化の減少；プロカスパーゼ４の活性化および切断の減少；ならびにＥＲストレス
誘発剤に暴露させることにより誘発される小胞体の酸化還元環境におけるシフトの減少（
例えば、ＥＲストレス誘発剤に暴露させるが、１つまたは複数（例えば２または３つ）の
可溶性ＭＡＮＦ、アポモルヒネおよびピオグリタゾンで処理されていない対照の膵臓β細
胞と比較した場合）。小胞体の酸化還元環境におけるシフトの減少は、酸化還元感受性色
素またはタンパク質、例えば、実施例に記載のレポータータンパク質を使用して測定する
ことができる。一部の実施形態において、膵臓β細胞における小胞体ストレスの減少は、
１つまたは複数の可溶性ＭＡＮＦ、アポモルヒネおよびピオグリタゾンと接触させていな
い膵臓β細胞において観察または検出した小胞体ストレスの量と、それぞれ（例えば、イ
ンビトロで、または対象において）比較することができる。一部の実施形態において、膵
臓β細胞における小胞体ストレスの減少は、可溶性ＭＡＮＦタンパク質、アポモルヒネま
たはピオグリタゾンと接触させていないが、小胞体ストレス誘発剤（例えば、タプシガル
ギン）と接触させる対照の膵臓β細胞と相対的である。
これらの方法は、医療専門家（例えば、本願に記載のいずれかの医療専門家）または科
学者により実施され得る。
小胞体ストレス由来アポトーシスを減少するか遅延させる方法
小胞体ストレスのある膵臓β細胞は、細胞内のアポトーシス経路を活性化し得る。本願
はまた、膵臓β細胞の集団を有効量の１つまたは複数の（例えば２または３つの）可溶性
ＭＡＮＦ（例えば、本願に記載のいずれかの可溶性ＭＡＮＦタンパク質）、アポモルヒネ
およびピオグリタゾンと接触させることを含む、２個以上の膵臓β細胞の集団における小
胞体ストレス由来アポトーシスを減少するか遅延させる方法を提供する。
一部の実施形態において、膵臓β細胞はインビトロにある（組織培養物）。一部の実施
形態において、膵臓β細胞は対象内に（例えば、移植した生体適合性材料またはポリマー
内に）あり得る。これらの方法において使用される膵臓β細胞は、本願に記載のいずれか
の膵臓β細胞であり得る。一部の実施形態において、膵臓β細胞は、１つまたは複数の（
例えば、２または３つの）可溶性ＭＡＮＦ、アポモルヒネおよびピオグリタゾンと、長時
間（例えば、少なくとも１５分、３０分、１時間、２時間、６時間、８時間、１０時間、
１２時間または２４時間）の間、接触させることができる。一部の実施形態において、膵
臓β細胞は、数用量の１つまたは複数の（例えば、２または３つの）可溶性ＭＡＮＦ、ピ
オグリタゾンおよびアポモルヒネおよび（例えば、少なくとも２用量、３用量、４用量、
または５用量）と、例えば、定期的な時間間隔で接触させる。
膵臓β細胞の集団におけるアポトーシスの発現およびタイミングは、本願に記載の方法
または当技術分野で公知のいずれかの方法を用いて決定することができる。膵臓β細胞の
集団と１つまたは複数の（例えば、２または３つの）可溶性ＭＡＮＦ、アポモルヒネおよ
びピオグリタゾンとの接触は、アポトーシス（例えば、小胞体ストレス由来アポトーシス
）を受ける細胞の集団内の膵臓β細胞の割合の減少を介在し得るか、膵臓β細胞の集団内
のアポトーシスの発現を遅延させることができる。一部の実施形態において、１つまたは
複数の（例えば、２または３つの）可溶性ＭＡＮＦ、アポモルヒネおよびピオグリタゾン
で処理された細胞における小胞体ストレス由来アポトーシスの減少または遅延は、１つま
たは複数の（例えば、２または３つの）可溶性ＭＡＮＦ、アポモルヒネおよびピオグリタ
ゾンで処理されていない細胞膵臓β細胞の集団と比較することができる。一部の実施形態
において、１つまたは複数の（例えば、２または３つの）可溶性ＭＡＮＦ、アポモルヒネ
およびピオグリタゾンで処理した細胞における小胞体ストレス由来アポトーシスの減少ま
たは遅延は、１つまたは複数の（例えば、２または３つの）可溶性ＭＡＮＦ、アポモルヒ
ネおよびピオグリタゾンで処理されていないが、小胞体ストレス誘発剤（例えばタプシガ
ルギン）と接触させた膵臓β細胞の集団の対照群と比較することができる。
アポトーシス細胞死を検出する方法は当技術分野で周知であり、限定するものではない
が、細胞カスパーゼ（例えば、プロカスパーゼ−３およびプロカスパーゼ−４）の切断、
Ｈｏｅｓｃｈｔおよび７−アミノ−アクチノマイシンの取り込み、ＴｄＴ介在性ｄＵＴＰ
ニック末端標識アッセイ、ならびにアネキシン膜染色が挙げられる。アポトーシス細胞死
を検出するための様々なキットは市販されている。
医薬組成物
さらに、本願は、少なくとも１つの可溶性ＭＡＮＦ（例えば、本願に記載のいずれかの
可溶性ＭＡＮＦタンパク質、例えば、精製、単離された、または組換え型である可溶性Ｍ
ＡＮＦ）および／またはアポモルヒネと、膵臓β細胞障害に対する少なくとも１つの他の
処置（例えば、本願に記載のいずれかの膵臓β細胞障害の処置、例えばピオグリタゾン、
ＴＵＤＣＡ、および本願に記載のいずれかのインスリンの１つまたは複数）とを含有する
医薬組成物を提供する。
一部の実施形態において、本組成物は薬学的に許容できる担体と処方される。医薬組成
物および処方物は、非経口投与、経口投与または局所投与によって、例えば、エアロゾル
により、または経皮的に投与することができる。本医薬組成物は、任意の方法で処方する
ことができ、状態または疾患および病気の程度、各患者の一般的な病状、好ましい結果が
得られる投与方法などに応じて、様々な単位剤形で投与することができる。処方および医
薬品の投与に関する技術の詳細は、科学文献および特許文献に十分に記載されているが、
例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st ed., 2005を参照さ
れたい。
本願で提供する医薬組成物は、ヒト用または獣医学用の薬で使用するための任意の都合
のよい方法で、投与用に処方することができる。浸潤剤、乳化剤および潤滑剤、例えば、
ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウム、ならびに、着色料、剥離剤、
コーティング剤、甘味剤、フレーバー剤および芳香剤、保存剤、ならびに抗酸化剤もまた
本組成物中に存在し得る。
本発明の組成物の処方物は、皮内投与、吸入投与、経口／経鼻投与、局所投与、および
／または非経口投与に適したものが含まれる。本処方物は、単位剤形で提供されるのが都
合よく、薬学の分野で周知の任意の方法によって調製することができる。担体材料と組み
合わせて単回投与剤形を産生することができる有効成分（例えば、可溶性ＭＡＮＦおよび
／またはアポモルヒネ、ならびに１つまたは複数の膵臓β細胞障害の追加治療薬）の量は
、処置しようとする宿主、特定の投与方法、例えば、皮内投与または吸入投与に応じて変
わり得る。担体材料と組み合わせて単回投与剤形を産生することができる有効成分の量は
、一般に、処置の有効性（例えば、本願に記載の１つまたは複数のいずれかの処置の有効
性）が得られる化合物の量である。
本発明の医薬処方物は、医薬品を製造するための分野で公知のいずれかの方法によって
調製することができる。このような薬物は、甘味剤、フレーバー剤、着色剤および保存料
を含有し得る。処方物は、製造に適した無毒で薬学的に許容できる添加剤と混合すること
ができる。処方物は、１つまたは複数の希釈剤、乳化剤、保存剤、バッファー、添加剤な
どを含んでいてもよく、液剤、粉末剤、エマルジョン剤、凍結乾燥粉末剤、スプレー剤、
クリーム剤、ローション剤、制御放出処方物、錠剤、丸剤、ゲル剤、貼付剤、インプラン
トなどの形態で提供することができる。
経口投与用の医薬処方物は、適切かつ好適な投薬量で、当技術分野で周知である薬学的
に許容できる担体を用いて処方することができる。そのような担体は、医薬品を、対象に
よる服用に適した、錠剤、丸剤、粉末剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ロゼンジ、ゲル剤
、シロップ剤、スラリー、懸濁液剤などの単位剤形で処方することを可能にする。経口使
用のための医薬製剤は、任意に、錠剤または糖衣錠コアを得るために、所望ならば、得ら
れた混合物を粉砕し、適切なさらなる化合物を加えた後、顆粒の混合物を加工し、固体添
加剤として処方することができる。適切な固体添加剤は炭水化物またはタンパク質充填剤
であり、例えば、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールをはじめと
する糖；トウモロコシ、コムギ、コメ、ジャガイモ、または他の植物由来のデンプン；セ
ルロース、例えば、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロースまたはカ
ルボキシ−メチルセルロースナトリウム；アラビアゴムおよびトラガカントゴムを含むゴ
ム類；ならびにタンパク質、例えばゼラチンおよびコラーゲンが挙げられる。崩壊剤また
は可溶化剤は、例えば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸、またはその塩、
例えばアルギン酸ナトリウムを添加することができる。プッシュフィットカプセルは、充
填剤または結合剤と混合した活性剤、例えば、ラクトースまたはデンプン、潤滑剤、例え
ば、タルクまたはステアリン酸マグネシウム、また必要に応じて、安定剤を含有すること
ができる。軟カプセル剤において、活性剤は、安定剤とともに、または安定剤なしで、適
切な液体、例えば、脂肪油、流動パラフィン、または液体ポリエチレングリコール中に溶
解または懸濁させることができる。
水性懸濁液剤は、活性剤（例えば、可溶性ＭＡＮＦおよび／またはアポモルヒネ、なら
びに１つまたは複数の膵臓β障害の追加の治療薬）を、水性懸濁液剤、例えば水性皮内注
射剤の製造に適した添加剤との混合剤中に含有することができる。そのような添加剤とし
ては、懸濁化剤、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、
ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、
トラガカントゴムおよびアラビアゴム、ならびに分散剤もしくは浸潤剤、例えば、天然の
ホスファチド（例えばレシチン）、アルキレンオキシドと脂肪酸との縮合物（例えばポリ
オキシエチレンステアレート）、エチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合物（
例えばヘプタデカエチレンオキシセタノール）、エチレンオキシドと脂肪酸由来の部分エ
ステルおよびヘキシトールとの縮合物（例えば、ポリオキシエチレンソルビトールモノオ
レエート）、またはエチレンオキシドと脂肪酸由来の部分エステルおよびヘキシトール無
水物との縮合物（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）などが挙げら
れる。水性懸濁液剤はまた、１つまたは複数の保存剤、例えば、エチルまたはｎ−プロピ
ルｐ−ヒドロキシベンゾエート、１つまたは複数の着色剤、１つまたは複数のフレーバー
剤、および１つまたは複数の甘味剤、例えばショ糖、アスパルテームまたはサッカリンを
含有することもできる。処方物は、浸透圧を調節することができる。
一部の実施形態において、油性薬剤が投与に使用される。油性懸濁液剤は、植物油、例
えばラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油もしくはヤシ油中に、または鉱油、例えば流動パ
ラフィン中に、あるいはこれらの混合物中に活性剤を懸濁することによって処方すること
ができる。例えば、バイオアベイラビリティを増加させ、また、経口投与される疎水性医
薬化合物の個体間および個体内の変動性を減少するために精油または精油成分を使用する
ことを記載している、米国特許第５，７１６，９２８号を参照されたい（さらに米国特許
第５，８５８，４０１号も参照されたい）。油性懸濁液剤は、蜜蝋、固形パラフィン、ま
たはセチルアルコールなどの増粘剤を含有することができる。甘味剤、例えばグリセロー
ル、ソルビトール、またはスクロースなどを添加して、口当たりのよい経口製剤を提供す
ることができる。これらの処方物は、アスコルビン酸などの抗酸化剤の添加により保存す
ることができる。注射用の油性ビヒクルの例としては、Minto, J. Pharmacol. Exp. Ther
. 281:93-102, 1997を参照されたい。
医薬処方物はまた、水中油型エマルジョンの形態をとっていてもよい。油相は、上述の
植物油もしくは鉱油、またはこれらの混合物であり得る。適切な乳化剤としては、天然の
ゴム、例えばアラビアゴムおよびトラガカントゴム、天然のホスファチド、例えば大豆レ
シチン、エステル、または脂肪酸由来の部分エステルおよびヘキシトール無水物類、例え
ばソルビタンモノオレエート、ならびにこれらの部分エステルとエチレンオキシドとの縮
合物、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートが挙げられる。エマルジョン
はまた、シロップ剤およびエリキシル剤の処方物の場合、甘味剤およびフレーバー剤を含
有することができる。またこのような処方物は、粘滑剤、保存剤、または着色剤を含有す
ることができる。代替の実施形態において、本発明のこれらの注射可能な水中油型エマル
ジョンは、パラフィン油、ソルビタンモノオレエート、エトキシル化ソルビタンモノオレ
エート、および／またはエトキシル化ソルビタントリオレエートを含む。
さらに医薬化合物は、ガス注入、粉末剤、およびエアロゾル処方物を含む鼻腔内または
眼内経路で投与することができる（ステロイド吸入薬の例については、例えば、Rohatagi
, J. Clin. Pharmacol. 35:1187-1193, 1995；Tjwa, Ann. Allergy Asthma Immunol. 75:
107-111, 1995を参照されたい）。
一部の実施形態において、医薬化合物は、アプリケータースティック、液剤、懸濁液剤
、エマルジョン剤、ゲル剤、クリーム剤、軟膏剤、ペースト剤、ゼリー剤、ペイント剤、
粉末剤およびエアロゾル剤として処方され、局所経路によって、経皮的に送達することが
できる。
一部の実施形態において、また医薬化合物は、体内で徐放するためのミクロスフェアと
して送達され得る。例えば、ミクロスフェアは、皮下でゆっくりと放出される薬物の皮内
注射によって投与することができる；Rao, J. Biomater Sci. Polym. Ed. 7:623-645, 19
95を参照；生分解性および注射用ゲル処方物の場合、例えば、Gao, Pharm. Res. 12:857-
863, 1995を参照；または、経口投与用のミクロスフェアの場合、例えば、Eyles, J. Pha
rm. Pharmacol. 49:669-674, 1997を参照されたい。
一部の実施形態において、医薬化合物は、非経口投与、静脈内（ＩＶ）投与、筋肉内投
与、腹腔内投与、もしくは皮下投与などによって投与することができるか、または、対象
の体腔、器官の内腔、もしくは脳脊髄液への投与により投与することができる。これらの
処方物は、薬学的に許容できる担体中に溶解された活性剤の溶液を含むことができる。使
用可能な許容さできるビヒクルおよび溶媒は、水およびリンガー溶液、または等張性塩化
ナトリウムである。さらに、滅菌不揮発性油は、溶媒または懸濁媒体として用いることが
できる。この目的のために、合成モノまたはジグリセリドをはじめとする、任意の無菌不
揮発性油を使用することができる。さらに、オレイン酸などの脂肪酸が、注射剤の調製に
同様に使用することができる。これらの溶液は無菌であり、一般的に望ましくない物質は
含まれない。これらの処方物は、従来の周知の滅菌技術によって滅菌され得る。本処方物
は、生理学的条件に近づけるために必要とされる薬学的に許容できる補助物質、例えば、
ｐＨ調整剤および緩衝剤、毒性調整剤、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化
カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどを含有していてもよい。これらの処方物
における活性剤の濃度は、広範囲で変化し得る。また、選択される特定の投与方法および
患者のニーズに従って、主として液量、粘度、体重などに基づき選択される。ＩＶ投与の
場合、処方物は、滅菌注射用水性または油性懸濁液として無菌注射用製剤とすることがで
きる。この懸濁液は、適切な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤を用いて処方することが
できる。滅菌注射用製剤はまた、非毒性の非経口的に許容できる希釈剤または溶媒、例え
ば１，３−ブタンジオール溶液中の懸濁液であってもよい。本投与は、ボーラス投与また
は連続的投与（例えば、一定時間の血管への実質的な連続導入）によって行うことができ
る。
一部の実施形態において、医薬化合物および処方物は凍結乾燥することができる。可溶
性ＭＡＮＦおよび／またはアポモルヒネと、１つまたは複数の膵臓β細胞障害の追加の治
療薬を含む安定性凍結乾燥処方物は、可溶性ＭＡＮＦおよび／またはアポモルヒネと、１
つまたは複数の膵臓β細胞障害の追加の治療薬、および増量剤、例えばマンニトール、ト
レハロース、ラフィノース、スクロース、またはそれらの混合物を含む溶液を凍結乾燥す
ることにより製造することができる。安定性凍結乾燥処方物を調製するための方法は、約
２．５ｍｇ／ｍＬのタンパク質、約１５ｍｇ／ｍＬのスクロース、約１９ｍｇ／ｍＬのＮ
ａＣｌ、ｐＨが５．５よりも大きく６．５未満であるクエン酸ナトリウムバッファーの溶
液を凍結乾燥することを含み得る。例えば、ＵＳ２００４／００２８６７０を参照された
い。
本組成物および処方物は、リポソームの使用によって送達することができる。リポソー
ムの使用によって、特にリポソーム表面が標的細胞に特異的なリガンドを担持しているか
、または特定の器官に優先的に指向される場合、インビボにおいて標的細胞への活性剤の
送達を集中させることができる。例えば、米国特許第６，０６３，４００号および同第６
，００７，８３９号；Al-Muhammed, J. Microencapsul. 13:293-306, 1996；Chonn, Curr
. Opin. Biotechnol. 6:698-708, 1995；およびOstro, Am. J. Hosp. Pharm. 46:1576-15
87, 1989を参照されたい。
本発明の処方物は、予防的および／または治療的処置のために投与することができる。
一部の実施形態において、処置的用途に関しては、本願に記載の障害のリスクがあるか障
害に罹患している対象に、障害またはその合併症の臨床症候を治癒、緩和または部分的に
停止するのに十分な量で、組成物が投与される；これは、治療有効量と呼ぶことができる
。例えば、一部の実施形態において、本発明の医薬組成物は、対象における症状の数を減
らすか、または膵臓β細胞障害の１つもしくは複数の症状の重症度、持続期間、もしくは
頻度を減少するのに十分な量で投与される。
これを達成するのに適切な医薬組成物の量は、治療有効用量である。この使用に有効な
投与計画と量、すなわち投与レジメンは、様々な要因によって決まり、例えば、疾患また
は状態の段階、疾患または状態の重症度、患者の全体的な健康状態、患者の身体状態、年
齢などである。患者に対する投薬レジメンを計算する際に、投与方法も考慮される。
また投薬レジメンは、当技術分野で周知の薬物動態パラメータ、すなわち、活性剤の吸
収率、バイオアベイラビリティ、代謝、クリアランスなどを考慮に入れる（例えば、Hida
lgo-Aragones, J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 58:611-617, 1996；Groning, Pharmazi
e 51:337-341, 1996；Fotherby, Contraception 54:59-69, 1996；Johnson, J. Pharm. S
ci. 84:1144-1146, 1995；Rohatagi, Pharmazie 50:610-613, 1995；Brophy, Eur. J. Cl
in. Pharmacol. 24:103-108, 1983；Remington: The Science and Practice of Pharmacy
, 21st ed., 2005を参照されたい）。技術水準により、臨床医は、それぞれの個別患者に
対する投薬レジメン、活性剤、および処置する疾患または状態を決定することができる。
医薬品として使用される類似の組成物のために提供されているガイドラインは、投薬レジ
メンを決定するための指針として使用することができ、すなわち、本発明の用量スケジュ
ールおよび投薬量レベル、実施した実行方法が正確で適切であることｗ決定するための指
針として使用することができる。
処方物の単回または複数回投与は、例えば、患者により必要とされ、許容される投薬量
および頻度などに応じて行うことができる。処方物は、状態、疾患、または症状を効果的
に処置、予防し、または改善するための活性剤の十分な量を提供するものとする。
代替の実施形態において、経口投与用の医薬処方物は、１日につき体重１キログラム当
たり約１〜１００ｍｇの間またはそれ以上の１日量である。低投与量は、経口投与とは異
なり、血流中に、体腔内または器官の内腔に使用することができる。実質的な高投与量は
、局所投与もしくは経口投与、または粉末剤、スプレー剤、もしくは吸入剤による投与に
用いることができる。非経口的または経口的に投与可能な処方物を調製するための実際的
な方法は、当業者には公知または明白であり、Remington: The Science and Practice of
Pharmacy, 21st ed., 2005などの刊行物により詳細に記載されている。
キット
さらに、可溶性ＭＡＮＦタンパク質（例えば、本願に記載のいずれかの可溶性ＭＡＮＦ
タンパク質）に特異的に結合する、少なくとも１つの抗体または抗原結合性抗体フラグメ
ント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ｄｉ−ｓｃＦｖ、または
ｓｄＡｂ）と、膵臓β細胞障害の１つの別のマーカー（例えば、インスリン、Ｃタンパク
質およびＩＡＰＰ）に特異的に結合する少なくとも１つの（例えば２、３または４つの）
抗体または抗原結合性抗体フラグメントを含有するキットを提供する。一部の実施形態に
おいて、キットに含まれる抗体または抗原結合性抗体フラグメントは、基質上に局在して
いる（例えば酵素免疫吸着測定法）。一部の実施形態において、キットは、単離、精製さ
れた、または組換え型である可溶性ＭＡＮＦタンパク質（例えば、本願に記載のいずれか
の可溶性ＭＡＮＦタンパク質）をさらに含むことができる。一部の実施形態において、１
つまたは複数の抗体または抗原結合性抗体フラグメントは標識化されている（例えば、放
射性同位元素、フルオロフォア、または結合性タンパク質（例えばアビジン））。これら
のキットは、例えば、膵臓β細胞障害の診断、対象における膵臓β細胞を発症するリスク
にある対象の同定、または対象の膵臓β細胞機能もしくは膵臓β細胞量のモニタリングに
有用であり得る。一部の実施形態において、キットは、本願に記載のいずれかの方法を実
施するための説明書をさらに含有することができる。
レポータータンパク質
本願で提供する方法は、結合タンパク質（ＢｉＰ）シグナル配列（例えば、マウスまた
はヒトＢｉＰシグナル配列）、酸化還元感受性蛍光タンパク質（例えば、酸化還元感受性
緑色蛍光タンパク質および酸化還元感受性黄色蛍光タンパク質）、およびアミノ酸配列Ｋ
ＤＥＬ（Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ）を含有するレポータータンパク質を使用する
。一部の実施形態において、ＢｉＰのシグナル配列はＮ末端にあり、酸化還元感受性蛍光
タンパク質はＢｉＰシグナル配列に対してＣ末端側であり、アミノ酸配列ＫＤＥＬは酸化
還元感受性蛍光タンパク質に対してＣ末端側である。一部の実施形態において、レポータ
ータンパク質に存在する２つ以上の個別のタンパク質エレメント（例えば、ＢｉＰのシグ
ナル配列、酸化還元感受性蛍光タンパク質、およびＫＤＥＬ配列）の間に、１〜１００個
のアミノ酸（例えば、１〜５０、１〜４０、１〜３０、１〜２５、１〜２０、１〜１５お
よび１〜１０個のアミノ酸）がある。酸化還元感受性緑色蛍光タンパク質のアミノ酸配列
を下記に記載する。
酸化還元感受性緑色蛍光タンパク質（配列番号１０）
MSKGEELFTG VVPILVELDG DVNGHKFSVS GEGEGDATYG KLTLKFIVTT GKLPVPWPTL VTTFXLQCFA RYP
DHMKRHD FFKSAMPEGY VQERTIFFKD DGNYKTRAEV KFEGDTLVNR IELKGIDFKE DGNILGHKLE YNYNSH
CVYI VADKQKNGIK VNFKIRHNIE DGSVQLADHY QQNTPIGDGP VLLPDNHYLC YQSALSKDPN EKRDHMVLL
E FVTAAGITHG MDELYK
本願に記載のレポータータンパク質は、（得られるタンパク質がその酸化還元感受性蛍
光特性を維持する限り）配列番号１０に少なくとも８０％同一である（例えば、少なくと
も８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％
、または９９％）配列を含有する。例えば、酸化還元感受性緑色蛍光タンパク質または酸
化還元感受性黄色蛍光タンパク質に導入された突然変異は、システインに突然変異を含ん
でいないものとする。一部の実施形態において、酸化還元感受性蛍光タンパク質は、酸化
還元感受性黄色蛍光タンパク質である（例えば、ｒｘＹＦＰ；Ostergaard et al., EMBO
J. 20:5853-5862, 2001に記載されている）。酸化還元感受性蛍光タンパク質のさらなる
例は、Merksamer et al. (Cell 135:933-947, 2008)およびDooley et al. (J. Biol. Che
m. 279:22284-22293, 2004)に記載されている。
レポータータンパク質に存在することができる例示的なヒトおよびマウスＢｉＰシグナ
ル配列を以下に示す。本願に記載されている方法で使用されるレポータータンパク質は、
任意の哺乳動物のＢｉＰシグナル配列を含有することができる（例えば、ヒトまたはマウ
スのＢｉＰシグナル配列）。
一部の実施形態において、レポータータンパク質およびこれらのレポータータンパク質
をコードする核酸は、無傷の膵臓β細胞内の酸化還元環境における微妙な変動を高感度に
（例えば、大幅に改善された）検出を行うための手段を提供する。
ヒトＢｉＰシグナル配列（配列番号１２）
MKLSLVAAMLLLLSAARA
マウスＢｉＰシグナル配列（配列番号１３）
MMKFTVAAALLLLGAVRA
一部の実施形態において、レポータータンパク質は、配列番号１４の配列（以下に示す
）を含有するレポータータンパク質に少なくとも８０％同一である（例えば、少なくとも
８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、
９９％、または１００％同一である）配列を含有する。一部の実施形態において、レポー
タータンパク質は、配列番号１５に少なくとも８０％同一である（例えば、少なくとも８
５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９
９％、または１００％同一である）配列を含有する核酸によってコードされている。例え
ば、配列番号１４のレポータータンパク質中の突然変異は、システインに突然変異を含ん
でいないものとする。配列番号１４の各種突然変異型は、その突然変異型がそれらの酸化
還元依存性の蛍光特性を維持しているかどうかを決定するために、本願に記載のいずれか
の方法を使用して試験することができる。配列番号１４（ＭＥＲＯＳ−ＧＦＰ）に少なく
とも８０％同一である配列を含有するタンパク質の特異的酸化還元依存性蛍光特性は、実
施例に詳細に記載している。
ＭＥＲＯＳ−ＧＦＰタンパク質（配列番号１４）
MMKFTVVAAALLLLGAVRAEEEDPPVATMSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFISTTGK
LPVPWPTLVTTFSYGVQCFSRYPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKE
DGNILGHKLEYNYNCHKVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLKTCSALSKDPN
EKRDHMVLLERVTAAGITHGMDELYKTSGGPPPTGEEDTSEKDEL
ＭＥＲＯＳ−ＧＦＰ ｍＲＮＡ（配列番号１５）
atgatgaagttcactgtggtggcggcggcgttgctgctgctgggcgcggtgcgggccgaggaggaggatccaccggtcgc
caccatgagtaaaggagaagaacttttcactggagttgtcccaattcttgttgaattagatggtgatgttaatgggcaca
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tagtggaggccctcccccaactggtgaagaggatacatcagaaaaagatgagttgtag
候補薬剤のスクリーニング方法
また、以下の１つまたは複数について有用な候補化合物のスクリーニング方法を提供す
る：対象の膵臓β細胞障害を処置するかその発症を遅延させること、膵臓β細胞における
小胞体ストレスを減少すること、および膵臓β細胞における小胞体ストレス由来アポトー
シス細胞死を減少するか遅延させること。これらの方法は、膵臓β細胞を提供し、膵臓β
細胞と候補化合物と接触させ、候補化合物の存在下で膵臓β細胞によって産生される可溶
性ＭＡＮＦのレベルを決定し、可溶性ＭＡＮＦの基準レベルと膵臓β細胞によって産生さ
れる可溶性ＭＡＮＦのレベルを比較することを含む。これらの方法において、基準レベル
と比較した膵臓β細胞により産生される可溶性ＭＡＮＦのレベルの増加は、試験化合物が
、以下の１つまたは複数に有用であり得る：対象の膵臓β細胞障害を処置するかその発症
を遅延させること、膵臓β細胞における小胞体ストレスを減少すること、および膵臓β細
胞における小胞体ストレス由来アポトーシス細胞死を減少するか遅延させること。
これらの方法において使用される膵臓β細胞（複数可）は、本願に記載のいずれかの膵
臓β細胞（例えば、膵臓β細胞株（例えば、本願に記載のいずれかの膵臓β細胞株）また
は初代膵臓β細胞）であり得る。
可溶性ＭＡＮＦのレベルは、標準的な分子生物学的方法（例えば、本願に記載の抗体に
基づくいずれかの方法）を用いて決定することができる。本方法は、任意の医療専門家（
例えば医師、看護師、医師助手、検査技師または看護助手）または科学者により実施する
ことができる。
一部の実施形態において、基準レベルは、候補化合物の非存在下で膵臓β細胞により産
生される可溶性ＭＡＮＦのレベルである。一部の実施形態において、基準レベルは、膵臓
β細胞障害に罹患していない、または膵臓β細胞障害の症状を有していない、または膵臓
β細胞障害の家族歴を有してない対象に存在する可溶性のＭＡＮＦのレベルである。一部
の実施形態において、基準レベルは、哺乳動物または哺乳動物膵臓β細胞株由来の初代膵
臓β細胞において産生される可溶性ＭＡＮＦのレベルである。一部の実施形態において、
基準レベルは可溶性ＭＡＮＦの閾値である。
さらに、対象の膵臓β細胞障害を処置するかその発症を遅延させ、膵臓β細胞における
小胞体ストレスを減少し、かつ／または膵臓β細胞における小胞体ストレス由来アポトー
シス細胞死を減少するか遅延させるのに有用な候補化合物をスクリーニングする方法を提
供する。これらの方法は、ＢｉＰシグナル配列、酸化還元感受性蛍光タンパク質、および
アミノ酸配列ＫＤＥＬを含有するレポータータンパク質を発現する哺乳動物細胞（例えば
、哺乳動物の膵臓β細胞または膵臓β細胞株）を提供し；細胞を試験化合物と接触させ；
細胞に存在する酸化型レポータータンパク質の量を決定し；基準レベルと比較して、細胞
に存在する酸化型レポータータンパク質の量を比較することを含むものであって；基準レ
ベルと比較した細胞中の酸化型レポータータンパク質のレベルの増加は、候補化合物が、
対象の膵臓β細胞障害を処置するかその発症を遅延させ、膵臓β細胞における小胞体スト
レスを減少し、かつ／または膵臓β細胞における小胞体ストレス由来アポトーシス細胞死
を減少するか遅延させるのに有用であり得ることを示す。一部の実施形態において、基準
レベルは、候補薬剤の非存在下で哺乳動物細胞に存在する酸化型レポータータンパク質の
量である。一部の実施形態において、細胞を、候補薬剤とＥＲストレス誘発剤の両方と接
触させ、基準レベルは、ＥＲストレス誘発剤で単独処理した、細胞に存在する酸化型レポ
ータータンパク質のレベルである。ＥＲストレス誘発剤の非限定的な例は、本願に記載さ
れている。ＥＲストレス誘発剤のさらなる例は当技術分野で公知である。一部の実施形態
において、基準レベルは酸化型レポータータンパク質の閾値である。使用する細胞は、ヒ
ト、マウス、ラット、ブタ、モンキーまたはウシの細胞であり得る。細胞は、本願に記載
されているか、当技術分野で公知のいずれかの膵臓β細胞株であり得る。一部の実施形態
において、レポータータンパク質は、配列番号１４であるか、配列番号１４に少なくとも
８０％同一である（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８
％または９９％同一である）配列を含有するタンパク質である。
さらに、対象の膵臓β細胞障害を処置するかその発症を遅延させ、膵臓β細胞における
小胞体ストレスを減少し、かつ／または膵臓β細胞における小胞体ストレス由来アポトー
シス細胞死を減少するか遅延させるのに有用な候補化合物をスクリーニングする方法を提
供する。これらの方法は、ＢｉＰシグナル配列、酸化還元感受性蛍光タンパク質、および
アミノ酸配列ＫＤＥＬを含有するレポータータンパク質を発現する哺乳動物細胞（例えば
、哺乳動物の膵臓β細胞）を提供し；細胞を試験化合物と接触させ；細胞に存在する還元
型レポータータンパク質の量を決定し；基準レベルと比較して、細胞に存在する還元型レ
ポータータンパク質の量を比較することを含むものであって；基準レベルと比較した細胞
中の還元型レポータータンパク質のレベルの増加は、候補化合物が、対象の膵臓β細胞障
害を処置するかその発症を遅延させ、膵臓β細胞における小胞体ストレスを減少し、かつ
／または膵臓β細胞における小胞体ストレス由来アポトーシス細胞死を減少するか遅延さ
せるのに有用であり得ることを示す。一部の実施形態において、基準レベルは、候補薬剤
の非存在下で哺乳動物細胞に存在する還元型レポータータンパク質の量である。一部の実
施形態において、細胞を、候補薬剤とＥＲストレス誘発剤の両方と接触させ、基準レベル
は、ＥＲストレス誘発剤で単独処理した、細胞に存在する還元型レポータータンパク質の
レベルである。ＥＲストレス誘発剤の非限定的な例は、本願に記載されている。ＥＲスト
レス誘発剤のさらなる例は当技術分野で公知である。一部の実施形態において、基準レベ
ルは還元型レポータータンパク質の閾値である。使用する細胞は、ヒト、マウス、ラット
、ブタ、モンキーまたはウシの細胞であり得る。細胞は、本願に記載されているか、当技
術分野で公知のいずれかの膵臓β細胞株であり得る。一部の実施形態において、レポータ
ータンパク質は、配列番号１４であるか、または配列番号１４に少なくとも８０％である
（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同
一である）配列を含有するタンパク質である。
一部の実施形態において、決定は、細胞のレポータータンパク質の１つまたは複数の蛍
光特性を検出することにより行われる（例えば、レポータータンパク質の還元形態または
酸化形態に特有のスペクトルの特徴を検出する）。一部の実施形態において、レポーター
タンパク質の還元形態または酸化形態のレベルは、蛍光プレートリーダーを使用して、ま
たは蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）を使用して決定される。
例えば、レポータータンパク質を発現する膵臓β細胞（例えば、ＩＮＳ−１ ８３２／
１３）を６ウェルプレートにプレーティングし、候補化合物と接触させ、トリプシン処理
によって回収することができる。リン酸緩衝生理食塩水で洗浄した後、細胞を適切な媒体
（例えば、１１ｍＭのグルコースハンクス緩衝塩溶液）中に懸濁させ、ＬＳＲＩＩ（ＢＤ
）を用いてＦＡＣＳを行い、細胞に存在するレポータータンパク質の還元形態または酸化
形態のレベルを決定する。
一部の実施形態において、蛍光プレートリーダーを用いて、細胞に存在するレポーター
タンパク質の還元形態または酸化形態のレベルを決定することができる。例えば、膵臓β
細胞株（例えばＩＮＳ−１ ８３２／１３細胞）を９６ウェルプレートへプレーティング
し、候補薬剤で処理することができる。レポータータンパク質の還元形態または酸化形態
のレベルは、蛍光プレートリーダーを用いて検出することができる。そのような実施形態
において、バックグラウンドシグナルの減算は、レポータータンパク質の還元形態または
酸化形態のレベルを決定する前に行うものとする。
一部の実施形態において、レポータータンパク質は、配列番号１４、または配列番号１
４に少なくとも８０％同一である配列を含有するタンパク質を含有する。これらの実施形
態において、レポータータンパク質の還元形態は、４７３ｎｍの励起波長および５１０ｎ
ｍの発光波長を有しており、レポータータンパク質の酸化形態は、３９４ｎｍの励起波長
および５１０ｎｍの発光波長を有する。
これらの方法の一部の実施形態において、細胞内のレポータータンパク質の酸化形態の
レベルとレポータータンパク質の還元形態のレベルの比を決定することができる。これら
の方法において、計算された比は、基準比と比較することができる。基準比は、候補薬剤
で処理されていない細胞から得た比であり得る。基準比はまた、閾値比とすることができ
る。一部の実施形態において、細胞を、候補薬剤とＥＲストレス誘発剤と接触させ、細胞
内のレポータータンパク質の酸化形態のレベルとレポータータンパク質の還元形態のレベ
ルの比を決定し、その細胞における比は、ＥＲストレス誘発剤で単独処理された細胞から
得た基準比と比較される。これらの方法において、基準比と比較して、細胞内の比を減少
する候補薬剤は、対象における膵臓β細胞障害を処置するための候補薬剤として同定され
る。
上記の方法の一部の実施形態は、膵臓β細胞障害の動物モデルにおいて候補化合物を試
験する（例えば、候補化合物の投与が、動物モデルにおける膵臓β細胞障害の１つもしく
は複数の症状を処置（例えば、重症度、頻度、または持続期間の減少）するかどうか、ま
たは動物モデルにおける膵臓β細胞障害の１つもしくは複数の症状の発症を遅延させるか
どうかを決定する）ことをさらに含む。２型糖尿病の非限定的な動物モデルとしては、Ｚ
ｕｃｋｅｒ脂肪ラット（ＺＦＲ）、ｏｂ／ｏｂ（肥満）マウス、ｃｐ（肥満形質）ラット
、Ｚｕｃｋｅｒ糖尿病肥満（ＺＤＦ）ラット、ホリネズミ（Psammomys obesus）、肥満ア
カゲザル、ＫＫマウス、およびＫＫ−Ａｙマウスが挙げられる（Srinivasan et al., Ind
ian J. Med. Res. 125:451-472, 2007に記載されている）。１型糖尿病の非限定的な動物
モデルとしては、非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウスおよびバイオ育種（ＢＢ）ラットが挙げ
られる（Rees et al., Diabetic Med. 22:359-370, 2005に記載されている）。膵臓β細
胞障害の１つまたは複数の症状の重症度または発症は、本願に記載の方法または当技術分
野で公知の方法を使用して、これらの動物において決定または観察することができる。
上記方法の一部の実施形態は、候補化合物が膵臓β細胞の集団における小胞体ストレス
由来アポトーシス細胞死を減少または遅延させるかどうかを試験することをさらに含む（
例えば、候補薬剤および小胞体ストレス誘発剤で処理した膵臓β細胞の集団における小胞
体ストレス由来アポトーシス細胞死の、候補薬剤の非存在下において小胞体ストレス誘発
剤で処理した膵臓β細胞群と比較した減少または遅延）。アポトーシス細胞死を検出する
方法は当技術分野で周知であり、限定するものではないが、細胞カスパーゼ（例えばプロ
カスパーゼ−３およびプロカスパーゼ−４）の切断、Ｈｏｅｓｃｈｔおよび７−アミノ−
アクチノマイシン取り込み、ＴｄＴ介在性ｄＵＴＰニック末端標識アッセイ、ならびにア
ネキシン膜染色が挙げられる。アポトーシス細胞死を検出する様々なキットは市販されて
いる。
上記の方法の一部の実施形態は、候補化合物が膵臓β細胞における小胞体ストレスの別
のマーカーの誘発を防止または遅延させるかどうかを試験することをさらに含む（例えば
、候補化合物がｇｒｐ７８（ＢｉＰ）もしくはｂａｇ−１発現の誘発を減少するか否か；
活性化、ゴルジ転座、プロテアーゼ切断、もしくはＡＴＦ６核移行を減少するか否か；Ｐ
ＥＲＫ活性化、オリゴマー化、もしくは自動リン酸化を減少するか否か；ＩＲＥ１の活性
化を減少するか否か；ｅＩＦ２αのリン酸化を減少するか否か；ＸＢＰ１ ｍＲＮＡのイ
ントロン処理を減少するか否か；ＪＮＫシグナル経路の活性化を減少するか否か；プロカ
スパーゼ４の活性化および切断を防止するか否か；ならびに／または小胞体酸化還元環境
のシフトを防止または減少するか否か（例えば、本願に記載のいずれかのレポータータン
パク質を使用して測定される））。ＢｉＰおよびＢａｇ−１の発現レベルは、ＢｉＰのま
たはＢａｇ−１の部分にハイブリダイズするように設計されたプライマーのセットを用い
て定量的リアルタイムＰＣＲを用いて決定することができる。ＢｉＰ、Ｂａｇ−１、ＰＥ
ＲＫ、ＩＲＥ１、ｅＩＦ２α、ＸＢＰ１およびＡＴＦ６の発現レベルまたは処理、活性化
、リン酸化もしくは細胞の局在化は、当技術分野で公知の方法を使用して、１つのＢｉＰ
、Ｂａｇ−１、ＰＥＲＫ、ＩＲＥ１、ｅＩＦ２α、ＸＢＰ１、またはＡＴＦ６に特異的に
結合する抗体を使用して決定することができる。一部の実施形態において、候補薬剤およ
び小胞体ストレス誘発剤で処理した細胞中の小胞体ストレスの１つまたは複数のマーカー
における防止または遅延は、候補薬剤の非存在下において小胞体ストレス誘発剤で処理さ
れた膵臓β−細胞（複数可）と比較される。
いずれかの種類の候補化合物は、上記の方法において使用することができる。候補化合
物は、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）、無機化合
物、脂質、オリゴ糖、またはそれらの任意の組合せであり得る。上記の方法において使用
することができる候補化合物のライブラリーは市販されている。スクリーニングされる候
補化合物は、当技術分野で公知のコンビナトリアルライブラリー法において、多数の手法
のうちのいずれかを用いて取得することが可能であり、例えば次のものが挙げられる：生
物学的ライブラリー；空間的アドレス可能平行固相または溶液相ライブラリー（spatiall
y addressable parallel solid phase or solution phase libraries）；デコンボリュー
ションを必要とする合成ライブラリー法；「１ビーズ１化合物」ライブラリー法；および
アフィニティークロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリー法。生物学的ライブラ
リー手法はペプチドライブラリーに限定されるが、他の４つの手法はペプチド、非ペプチ
ドオリゴマー、または化合物の小分子ライブラリーに適用することができる（Lam, Antic
ancer Drug Des., 12:145, 1997）。
分子ライブラリーの合成方法の例は、例えば、以下の文献で確認することができる：De
Witt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90:6909, 1993；Erb et al., Proc. Nat
l. Acad. Sci. U.S.A., 91:11422, 1994；Zuckermann et al., J. Med. Chem., 37:2678,
1994；Cho et al., Science 261:1303, 1993；Carrell et al., Angew. Chem. Int. Ed.
Engl., 33:2059, 1994；Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 33:2061, 1994
；およびGallop et al., J. Med. Chem., 37:1233, 1994。
化合物のライブラリーは、溶液中に提示され得るか（例えば、Houghten, Bio/Techniqu
es, 13:412-421, 1992）、ビーズ上に提示され得るか（Lam, Nature, 354:82-84, 1991）
、チップ上に提示され得るか（Fodor, Nature 364:555-556, 1993）、細菌上に提示され
得るか（米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子上に提示され得るか（米国特許第５，
５７１，６９８号；同第５，４０３，４８４号；および同第５，２２３，４０９号）、プ
ラスミド上に提示され得るか（Cull et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89:1865-
1869, 1992）、またはファージ上に提示され得る（Scott and Smith, Science, 249:386-
390, 1990；Devlin, Science, 249:404-406, 1990；Cwirla et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. U.S.A., 87:6378-6382, 1990；およびFelici, J. Mol. Biol., 222:301-310, 1991
）。
実施例
可溶性ＭＡＮＦ発現は、膵臓β細胞においてＥＲストレス時に増加される
実験は、可溶性ＭＡＮＦの発現が小胞体ストレスに応答して膵臓β細胞で誘発されるか
どうかを決定するために行った。これらの実験は、齧歯類膵臓β細胞株（ＩＮＳ−１ ８
３２／１３およびＭＩＮ６）、初代マウスおよびヒト膵島、ならびに小胞体ストレスを誘
発する２つの異なる化学薬剤（タプシガルギンおよびツニカマイシン）を使用して行った
。ＩＮＳ−１ ８３２／１３細胞を、１０％ウシ胎児血清、ペニシリン、ストレプトマイ
シン、ピルビン酸ナトリウム、および０．１％β−メルカプトエタノールを含有するＲＰ
ＭＩ−１６４０中で培養した。初代膵島はＰｒｏｄｏから取得し、８０４Ｇ細胞によって
産生されるラミニンＶでプレコートした６ウェルプレートにプレーティングし、ウシ胎児
血清、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、および抗生物質を補充したＣＭＲＬ培地
中で培養した。
可溶性ＭＡＮＦタンパク質は、タプシガルギン（５０ｎＭ）で処理した後の培養ラット
膵臓β細胞株（ＩＮＳ−１ ８３２／１３）の培地で検出した（図１）。ＭＡＮＦのｍＲ
ＮＡレベルの増加は、５μＭツニカマイシンまたは２０ｎＭタプシガルギンで２４時間処
理した後の同一細胞株で検出した（図２）。
マウス初代膵島を使用して行った実験から得たデータは、６時間０．５μＭタプシガル
ギンによるマウス膵島の処理は、ＭＡＮＦのｍＲＮＡ発現の有意な増加をもたらすことを
さらに示す（図３）。第２の一連の実験は、２名のヒトのドナーから得たヒト初代膵島を
用いて行った。これらのデータもまた、タプシガルギン（０．２５μＭ）でヒト膵島を処
理するとＭＡＮＦ ｍＲＮＡの発現と（図４）、可溶性ＭＡＮＦタンパク質の細胞外培地
への産生および放出（図５および６）に有意な増加が生じることを示す。
実験は、可溶性ＭＡＮＦが小胞体ストレスから膵臓β細胞を保護するかどうかを決定す
るために行った。第１の一連の実験では、ＭＡＮＦの発現は、ＭＡＮＦ ｍＲＮＡを標的
とする３つの異なるｓｉＲＮＡ構築物の１つを使用してノックダウンした。製造者のプロ
トコルに従って、リポフェクタミン２０００を使用してトランスフェクションを行った。
これらの実験のデータからは、ＭＡＮＦ発現のノックダウンは、細胞をツニカマイシン（
２μＭ）で２４時間処理した場合に、コントロールｓｉＲＮＡでトランスフェクトされ、
同レベルのツニカマイシンで処理した対照細胞と比較して、（ＢｉＰ ｍＲＮＡレベルの
増加によって明らかなように）小胞体ストレスを増加させた（図７）ことが示される。こ
れらのデータは、可溶性ＭＡＮＦが膵臓β細胞における小胞体ストレスの防止または減少
に役割を果たすことを示す。
さらなる実験は、可溶性ＭＡＮＦが小胞体ストレス誘発化学薬剤で処理した膵臓β細胞
の小胞体ストレス由来アポトーシスを減少または遅延させるか否かを決定するために行っ
た。これらの実験から得たデータからは、可溶性ＭＡＮＦによるマウス膵臓β細胞株（Ｍ
ＩＮ６）の処理が、ツニカマイシン処理（１μＭ、２４時間）後の細胞で観察されたカス
パーゼ−３切断量を有意に減少したことが明らかである（図８）。これらのデータは、可
溶性ＭＡＮＦが、膵臓β細胞における小胞体ストレス由来アポトーシス細胞死を防止また
は遅延させることができることを示唆している。
ＥＲにおける酸化還元状態をモニターするためのシステム
細胞内のＥＲの酸化還元状態をモニターするための新規システムを開発した。このシス
テムでは、マウスＢｉＰのシグナル配列および哺乳動物ＥＲ回収シグナル（ＫＤＥＬ）を
、酸化還元感受性緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のＮ末端およびＣ末端のそれぞれに付加
した（図９Ａ）。組換えタンパク質はＭＥＲＯＳ−ＧＦＰと命名した（哺乳動物小胞体局
在型酸化還元感受性ＧＦＰ）。蛍光顕微鏡検査の使用により、ＭＥＲＯＳ−ＧＦＰがＥＲ
に局在していることが確認された（図９Ｂ）。ＭＥＲＯＳ−ＧＦＰは、３９４ｎｍおよび
４７３ｎｍにて極大で、ＮＳＣ３４細胞の完全酸化型および還元型種の個別の励起スペク
トルを示す（図１０Ａ）。ＮＳＣ３４細胞は、１０％ウシ胎児血清、ペニシリン、および
ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭで培養した。
個別の２つの励起波長、５０８ｎｍおよび５１０ｎｍの発光スペクトルは同程度であっ
た（図１０Ｂおよび１０Ｃ）。共焦点顕微鏡分析では、強力還元剤ジチオスレイトール（
ＤＴＴ）で処理した細胞においては、４０５ｎｍで蛍光がわずかに減少したが、４７６ｎ
ｍ励起の蛍光では有意な増加が確認された（図１１）。
野生型の未処理細胞に対して標準化した、励起４７３ｎｍの蛍光と３９４ｎｍの蛍光の
間の比は、ＭＥＲＯＳ−ＧＦＰ比と呼ぶ。ＭＥＲＯＳ−ＧＦＰ比は、蛍光プレートリーダ
ーを用いて決定した。これらの実験において、ＩＮＳ−１ ８３２／１３細胞を５０，０
００個／ウェルで９６ウェルプレートにプレーティングし、細胞を３０分間、様々な濃度
のＨ２Ｏ２またはＤＴＴで処理し、励起波長４７３ｎｍの蛍光および発光波長５１０ｎｍ
の蛍光（ＭＥＲＯＳ−ＧＦＰの還元に関して）、または励起波長３９４ｎｍの蛍光および
発光波長５１０ｎｍの蛍光（ＭＥＲＯＳ−ＧＦＰの酸化に関して）を測定した。ＭＥＲＯ
Ｓ−ＧＦＰ比は、バックグラウンドシグナルの減算後に決定した。このデータからは、酸
化剤、Ｈ２Ｏ２はＭＥＲＯＳ−ＧＦＰ比を変化させなかったことが明らかであり、このこ
とは、ＭＥＲＯＳ−ＧＦＰがインビボにおいてほぼ１００％酸化されていることを示唆し
ている（図１２）。反対に、ＤＴＴ処理は、用量依存的にＭＥＲＯＳ−ＧＦＰ比を増加さ
せた（図１２）。
ＭＥＲＯＳ−ＧＦＰ比がインビボでの酸化還元状態の変化を反映していることを確認す
るため、さらなる実験を行った。これらの実験において、ＭＥＲＯＳ−ＧＦＰの酸化還元
状態は、チオール−アルキル化試薬、４−アセトアミド−４’−マレイミジルスチルベン
−２，２’−ジスルホン酸（ＡＭＳ）と組み合わせた非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して
モニターした。これらの実験において、２ｍＭのＤＴＴで処理したか、未処理のままのＩ
ＮＳ−１ ８３２／１３細胞を２−β−メルカプトエタノール含有または非含有の２５ｍ
Ｍ ＡＭＳを含有する１×ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料バッファーに溶解させ、１０分間９５℃
で沸騰させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して電気泳動を行い、抗ＧＦＰ抗体を使用してイム
ノブロットを行った。予想通りに、ＤＴＴ処理細胞から得た溶解物の非還元ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥが、ＭＥＲＯＳ−ＧＦＰのゆるやかな移行形態のたった１つを示した。このことは、
ＤＴＴ処理がインビボにおいてＭＥＲＯＳ−ＧＦＰを完全に還元したことを示唆している
（図１３）。
さらに、ＭＥＲＯＳ−ＧＦＰ比も、ＤＴＴ処理細胞において異なる時点でモニターした
。図１４は、ＥＲがＤＴＴ処理の数分以内に還元され、ＤＴＴ排出の１分以内に酸化型環
境に戻すことができることを示す。これらの結果は、ＭＥＲＯＳ−ＧＦＰを用いて、哺乳
動物細胞のＥＲ内の酸化還元状態をリアルタイムでライブモニターすることができること
を示唆している。
フローサイトメトリーを用いて、インビボにおけるＭＥＲＯＳ−ＧＦＰ比を正確にモニ
ターした。これらのデータは、膵臓β細胞株ＩＮＳ−１ ８３２／１３のＤＴＴ処理が４
８８ｎｍ対４０５ｎｍの励起の蛍光比に用量依存的増加をもたらすことを示す（図１５お
よび１６）。さらにこの知見を分析するため、平均ＭＥＲＯＳ−ＧＦＰ比をＤＴＴ処理細
胞にて調べた。データは、ＤＴＴ処理が用量依存的に平均ＭＥＲＯＳ−ＧＦＰ比を増加さ
せることを示す（図１７）。しかし、Ｈ２Ｏ２処理ではＭＥＲＯＳ−ＧＦＰ比に変化はな
く（図１８）、このことは、ＭＥＲＯＳ−ＧＦＰが基底レベルでＥＲでの酸化がほぼ完全
であったことを示唆している。さらに、平均ＭＥＲＯＳ−ＧＦＰ比は、ツニカマイシンお
よびタプシガルギン、ブレフェルジンＡ、ＭＧ１３２（図１９および２０）、慢性高グル
コース（図２１）、血清欠乏およびグルコース除去（図２２）、パルミチン酸塩、ヒト膵
島アミロイドポリペプチド（ｈＩＡＰＰ）、ならびに炎症性サイトカイン（図２３および
２４）をはじめとする、ＥＲストレスの実験的および生理的誘発剤によって増加した。
ＥＲストレス細胞におけるＥＲ酸化還元状態の不均一性
個別の２つの細胞の集団について、パルミチン酸塩（膵臓β細胞に対する強力ＥＲ誘発
剤）でＩＮＳ−１ ８３２／１３細胞を処理した後に、フローサイトメトリーにより観察
した：１つは酸化型ＥＲ状態を維持することができ、もう１つは高度還元型ＥＲであった
（図２５および２６）。細胞のこれらの不均一群をさらに研究するため、ＭＥＲＯＳ−Ｇ
ＦＰ比が２よりも大きい細胞を「還元型細胞」として分類した。さらに、これらの異なる
２つの細胞の集団についても、慢性高グルコース（図２７）、血清欠乏およびグルコース
除去（図２８）、ならびにヒトＩＡＰＰ（図２９）をはじめとする、膵臓β細胞に対する
別の既知のＥＲストレス誘発剤で処理した後に観察した。ストレス誘発剤のうち、パルミ
チン酸塩処理は、高度還元型ＥＲのある細胞の集団を最大限に増加する。興味深いことに
、パルミチン酸塩誘発細胞機能不全に対して保護的であることがこれまでに明らかにされ
てきた、不飽和脂肪酸、オレイン酸およびリノール酸は、還元型ＥＲを形成するパルミチ
ン酸塩の能力を有意に抑制した（図３０）。これらのデータは、ＥＲストレス細胞がそれ
らの酸化還元状態で不均一であることを示唆している。
還元型ＥＲのある細胞における小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）の活性化
ＵＰＲと酸化還元状態の不均一性との関係を研究するために実験を行った。これらの実
験において、酸化還元状態とＵＰＲの活性化レベルの両方を同一細胞内でモニターした。
これを達成するため、ヒトＢｉＰプロモーターによって作動される、赤色蛍光タンパク質
ｍＣｈｅｒｒｙをコードするＵＰＲレポーター遺伝子を構築した。ＢｉＰプロモーターは
３つの小胞体ストレス応答エレメント（ＵＰＲＥ）を含有し、ＵＰＲの活性化レベルを効
率的に反映することが明らかにされている。このＢｉＰ−ｍＣｈｅｒｒｙレポータープラ
スミドをＭＥＲＯＳ−ＧＦＰを発現するＩＮＳ−１ ８３２／１３細胞へトランスフェク
トし、ＦＡＣＳ分析を用いて、同一細胞におけるＭＥＲＯＳ−ＧＦＰ比とＢｉＰ−ｍＣｈ
ｅｒｒｙを介したＵＰＲの活性化レベルをモニターした（図３１）。ＢｉＰ−ｍＣｈｅｒ
ｒｙの活性化レベルとＭＥＲＯＳ−ＧＦＰ比は、ＥＲストレス誘発後にモニターした。こ
れらの実験において、ＭＥＲＯＳ−ＧＦＰを発現するＩＮＳ−１ ８３２／１３細胞を６
ウェルのプレート上にプレーティングし、提示した時間に各化合物で処理し、次いで、ト
リプシン処理することによって回収した。リン酸緩衝生理食塩水で洗浄した後、細胞を１
１ｍＭのグルコース−ハンクス緩衝食塩溶液に再懸濁した。フローサイトメトリー分析は
、ＬＳＲＩＩ（ＢＤ）で行った。
データによれば、還元型ＥＲのある細胞の集団（ＭＥＲＯＳ−ＧＦＰ比＞２．０）は、
酸化型ＥＲを維持可能な細胞と比較して、高度還元型ＥＲ細胞の集団でのＵＰＲの活性化
を示す、ＢｉＰ−ｍＣｈｅｒｒｙの活性化レベルがより増加したことが明らかである（図
３２および３３）。
これらのデータを確認するため、さらなる実験を行った。これらの実験において、酸化
型ＥＲと高度還元型ＥＲのある細胞をパルミチン酸塩で処理した後、ＦＡＣＳにより選別
し（図３４および３５）、ＵＰＲマーカーＢｉＰとスプライスＸＢＰ−１の発現はリアル
タイムＰＣＲを使用して測定した。これらの実験において、還元型細胞および酸化型細胞
はＦＡＣＳによって選別し、全ＲＮＡはＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）によって抽
出した。逆転写酵素と定量的ＰＣＲは、ＳＹＢＲ緑色色素を使用し、ＢｉｏＲａｄ ｉＱ
５を用いて行った。
データによれば、ＢｉＰおよびスプライスＸＢＰ−１の発現レベルは、酸化型ＥＲの細
胞におけるレベルと比較して、高度還元型ＥＲの細胞で増加したことが明らかである（図
３６）。これらのデータは、還元型ＥＲおよび酸化型ＥＲの細胞内での発現プロファイリ
ングによってさらに確認した（図３７）。これらの実験は、２４時間、０．５ｍＭパルミ
チン酸塩で処理した、ＦＡＣＳ選別ＩＮＳ−１ ８３２／１３細胞を使用して行った。全
ＲＮＡは、ＲＮＡｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）で抽出した。次いで、精製ＲＮＡは、
製造業者のプロトコルに従って、ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｒａｔ Ｇｅｎｅ １．０ ＳＴア
レイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）にアプライした。これらのデータは、高度還元型ＥＲを保
持する細胞が、おそらく調節機序として、ＵＰＲを高度に活性化したことを示唆している
。
還元環境から酸化環境へＥＲをシフトする化合物に対する小分子スクリーニング
上記のデータは、酸化環境に向けてＥＲをシフトする化学化合物および生物製剤がＥＲ
ストレスおよびＥＲ機能不全に関連する疾患の処置に有効であり得ることを示唆している
。この可能性の調査については、２つのＦＤＡ承認薬、ピオグリタゾン（Ａｃｔｏｓ）と
タウロウルソデオキシコール酸（ＴＵＤＣＡ）がＥＲの酸化還元状態に影響を及ぼし、Ｅ
Ｒ疾患の細胞モデルにおける細胞死を改善する可能性がある。ピオグリタゾンは、２型糖
尿病患者を処置するために承認され、ウォルフラム症候群のマウスモデルにおける膵臓β
細胞機能を維持することが示されている。ピオグリタゾンは、タプシガルギン（で処理し
た膵臓β細胞において酸化環境にＥＲをシフトし図３８、右図）、細胞死からこれらの細
胞を保護する（図３８、左図）ことを示した。別の小分子、ＴＵＤＣＡは、胆石の処置お
よび胆汁性肝硬変のために使用され、糖尿病のマウスモデルにおいてＥＲストレスを緩和
することが示されている。ＴＵＤＣＡはまた、酸化環境に向けてＥＲをシフトし（図３８
、右図）、ＥＲストレス条件下で細胞を死滅から保護する（図３８、左図）ことを示した
。
酸化環境に向けてＥＲをシフトする薬剤がＥＲストレスに対する保護を付与することが
できるという知見に基づき、ハイスループット手法を使用する、還元型ＥＲの新規の小分
子抑制剤を同定するための新たなスクリーニングアッセイを開発することができる。１２
８０種の化合物ライブラリー（ＭｉｃｒｏＳｏｕｒｃｅ）、１，０４０種の米国医薬品お
よび２４０種の国際医薬品コレクション（図３９）のパイロットスクリーニングを実施し
た。この実験において、ＭＥＲＯＳ−ＧＦＰを安定的に発現するＩＮＳ−１ ８３２／１
３細胞は、ブラックオプティカル９６ウェルプレートに播種した（２０，０００個／ウェ
ル）。２４時間後、各化合物の２μＬを、ＴｅＭｏ液体処理ロボットを用いて添加した。
さらに２４時間後、細胞を２時間、０．２ｍＭのＤＴＴ、強力還元剤で刺激し、次いで、
ＭＥＲＯＳ−ＧＦＰ比を計算した。未処理細胞の平均比は０．０３７（Ｓ．Ｄ．＝０．０
０３）であり、ＤＴＴ処理細胞の平均比は０．０６９（Ｓ．Ｄ．＝０．００６）であった
。陽性化合物は０．０５未満のＭＥＲＯＳ−ＧＦＰ比を維持することができるというもの
であった。この基準を用いて、２０種の陽性化合物をスクリーニングで同定した。
第２のスクリーニングは、ＥＲストレスを誘発する２０ｍＭグルコースと組み合わせた
０．４ｍＭパルミチン酸塩を使用して行った。両スクリーニング間で、９種の一般的な陽
性化合物が同定され、そのうちの５種は自己蛍光により除かれた。偽陽性をさらに除去す
るため、ＭＥＲＯＳ−ＧＦＰを安定的に発現するＩＮＳ−１ ８３２／１３細胞を、残り
の４種の一般化合物で前処理し、２４時間、０．５ｍＭパルミチン酸塩で刺激し、ＦＡＣ
Ｓを使用してＭＥＲＯＳ−ＧＦＰ比を測定した。この追加ステップにより、２つの化合物
が偽陽性として除かれた。残りの２つの化合物は、臨床で使用されている薬剤のアポモル
ヒネとグリセオフルビンであった。グリセオフルビンはスクリーニングアッセイで陽性と
して同定されたが、ＩＮＳ−１ ８３２／１３細胞において強い毒作用を有していた。
アポモルヒネは、酸化環境に向けてＥＲをシフトし、ＥＲストレスに対する保護を付与
する
さらなる実験を行って、アポモルヒネが還元環境から酸化環境へＥＲをシフトすること
ができることを確認した。これらの実験において、ＭＥＲＯＳ−ＧＦＰを発現するＩＮＳ
−１ ８３２／１３細胞をアポモルヒネで２４時間処理し、次いで、２４時間パルミチン
酸塩で刺激した。データからは、アポモルヒネ処理が還元型ＥＲの細胞の集団を減少した
ことが明らかである（図４０）。パルミチン酸塩で処理したＩＮＳ−１ ８３２／１３細
胞における細胞生存率とミトコンドリア膜ポテンシャルは、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）
およびＭｉｔｏＰｒｏｂｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）染色をそれぞれ使用して測定した。
アポモルヒネは、ミトコンドリア膜ポテンシャルの低い細胞の集団を減少し（図４１）、
ＥＲストレス由来細胞死を抑制した（図４２）。さらにアポモルヒネは、強力ＥＲストレ
ス誘発剤のタプシガルギンによって誘発されたＥＲストレス介在性細胞死からＩＮＳ−１
８３２／１３細胞を保護した（図４３）。総体として、これらのデータは、アポモルヒ
ネが酸化環境に向けてＥＲをシフトし、ＥＲストレスに対する保護を付与することを示す
。
酸化環境に向けてＥＲをシフトする小分子は、ＥＲストレスの細胞モデルの病変を軽減
することができる
上記のデータからは、アポモルヒネおよびピオグリタゾンが、酸化環境に向けてＥＲを
シフトし、ＥＲストレスに対する保護を付与する能力を有していることは明らかである。
さらなる実験を行って、アポモルヒネとピオグリタゾンがＥＲストレス介在性細胞死から
ヒト膵島を保護することができるか否かを決定した。データは、アポモルヒネとピオグリ
タゾンの両方がタプシガルギン介在性細胞死からヒト膵島を保護できたことを示す（図４
４、左図）。
ＩＮＳ−１ ８３２／１３由来のドキシサイクリン誘発性ＷＦＳ１ノックダウン細胞、
ウルフラム症候群の細胞モデルを使用してさらなる実験を行った。このモデルを使用して
、アポモルヒネとピオグリタゾンが細胞死を防止できるか否かを試験した。以前に報告さ
れているように、ｓｈＲＮＡ介在性ＷＦＳ１ノックダウンは、カスパーゼ−３の切断を伴
って、細胞死をもたらした（Riggs et al., Diabetologia 48:2313-2321, 2005）。この
モデルにおいて、アポモルヒネとピオグリタゾンは両方とも、カスパーゼ３の切断、およ
びカスパーゼ３の基質、ポリ（ＡＤＰ）−リボシル化酵素（ＰＡＲＰ）の切断を抑制し、
ＷＦＳ１−ノックダウンβ細胞を細胞死から保護することができた（図４４、右図）。ま
とめると、これらのデータからは、酸化環境に向けてＥＲをシフトする小分子がＥＲ疾患
の細胞モデルの病態を緩和することができることが明らかである。
可溶性ＭＡＮＦは、ＥＲストレスおよびＥＲストレス由来アポトーシス細胞死から膵臓
β細胞を保護する
可溶性ＭＡＮＦが、小胞体ストレス誘発剤に暴露した際に、膵臓β細胞の小胞体におけ
る酸化還元環境の変動を防止することができるか否かを決定するため、さらなる実験を行
った。実験は、ＭＥＲＯＳ−ＧＦＰを発現するレンチウイルスベクターでトランスフェク
トしたＩＮＳ−１ ８３２／１３細胞（膵臓β細胞株）を用いて行った。細胞は１１ｍＭ
または２５ｍＭのグルコース中で培養し、未処理のままとするか、０．５μｇ／ｍＬの可
溶性ＭＡＮＦで処理した。次いで、トランスフェクト細胞中の還元型ＥｒｏＧＦＰ由来の
蛍光性発光を特異的に検出することができる、４６０〜４９５ｎｍの間の励起スペクトル
と５２０〜５７０ｎｍの間の発光スペクトル（ＦＩＴＣ−Ａ光学フィルター）を用いてＦ
ＡＣＳ分析により細胞を分析した。データからは、可溶性ＭＡＮＦ処理によって、検出可
能なレベルの還元型ＭＥＲＯＳ−ＧＦＰを含有する細胞数が減少したことが明らかである
（図４５；右下図対左下図）。上記のデータと一致して、これらのデータは、可溶性ＭＡ
ＮＦで膵臓β細胞を処理すると、酸化環境に向けてＥＲをシフトすることができ、しかも
、対象の膵臓β細胞障害の処置またはその進行の防止に使用することができることを示す
。
別の実施形態
本発明をその詳細な説明と併せて説明してきたが、前述の説明は例示であり、添付の特
許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定するものではないことを理解された
い。他の態様、利点、および変更は、以下の特許請求の範囲内にある。

Claims (26)

  1. 対象における膵臓β細胞障害を診断する方法であって、
    対象由来の生体試料中の可溶性中脳星状細胞由来神経栄養因子（ＭＡＮＦ）のレベルを
    決定し；
    生体試料中の可溶性ＭＡＮＦのレベルを可溶性ＭＡＮＦの基準レベルと比較する
    ことを含み、
    基準レベルと比較した生体試料中の可溶性ＭＡＮＦのレベルの増加は、対象が膵臓β細
    胞障害に罹患していることを示す、方法。
  2. 対象の膵臓β細胞障害を発症するリスクを予測する方法であって、
    対象由来の生体試料中の可溶性中脳星状細胞由来神経栄養因子（ＭＡＮＦ）のレベルを
    決定し；
    生体試料中の可溶性ＭＡＮＦのレベルを可溶性ＭＡＮＦの基準レベルと比較する
    ことを含み、
    基準レベルと比較した生体試料中の可溶性ＭＡＮＦのレベルの増加は、対象が膵臓β細
    胞障害を発症するリスクが高いことを示し、基準レベルと比較した生体試料中の可溶性Ｍ
    ＡＮＦのレベルの減少または有意な差がないことは、対象が、膵臓β細胞障害を発症する
    リスクが普通であるか低いことを示す、方法。
  3. 対象の膵臓β細胞機能または膵臓β細胞量をモニターする方法であって、
    第１の時点での対象由来の生体試料中の可溶性中脳星状細胞由来神経栄養因子（ＭＡＮ
    Ｆ）のレベルを決定し、
    第２の時点での対象由来の生体試料中の可溶性ＭＡＮＦのレベルを決定し、
    第２の時点での生体試料中の可溶性ＭＡＮＦのレベルを第１の時点での生体試料中の可
    溶性ＭＡＮＦのレベルと比較する
    ことを含み、
    第１の時点での生体試料中の可溶性ＭＡＮＦのレベルと比較した第２の時点での生体試
    料中の可溶性ＭＡＮＦのレベルの増加は、対象の膵臓β細胞機能の減少または膵臓β細胞
    量の減少を示し、第１の時点での生体試料中の可溶性ＭＡＮＦのレベルと比較した第２の
    時点での生体試料中の可溶性ＭＡＮＦのレベルの減少または有意な変化がないことは、対
    象の膵臓β細胞機能に変化がないか増加を示し、または膵臓β細胞量に変化がないか増加
    を示す、方法。
  4. 膵臓β細胞障害を処置するための対象を選択する方法であって、
    対象由来の生体試料中の可溶性中脳星状細胞由来神経栄養因子（ＭＡＮＦ）のレベルを
    決定し；
    生体試料中の可溶性ＭＡＮＦのレベルを可溶性ＭＡＮＦの基準レベルと比較し；
    基準レベルと比較して生体試料中の可溶性ＭＡＮＦのレベルが増加した対象を、膵臓β
    細胞障害を処置するために選択する
    ことを含む、方法。
  5. 膵臓β細胞障害が１型糖尿病、２型糖尿病およびウルフラム症候群からなる群から選択
    される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 基準レベルが可溶性ＭＡＮＦの閾値である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法
    。
  7. 基準レベルが健康な対象の可溶性ＭＡＮＦのレベルである、請求項１〜４のいずれか１
    項に記載の方法。
  8. 対象に、配列番号２に少なくとも８０％同一である配列を含む可溶性中脳星状細胞由来
    神経栄養因子（ＭＡＮＦ）またはアポモルヒネの有効量を投与することを含む、対象の膵
    臓β細胞障害を処置するかその発症を遅延させる方法。
  9. 膵臓β細胞における小胞体ストレスを減少する方法であって、
    膵臓β細胞を、配列番号２に少なくとも８０％同一である配列を含む可溶性中脳星状細
    胞由来神経栄養因子（ＭＡＮＦ）またはアポモルヒネの有効量と接触させることを含む、
    方法。
  10. 膵臓β細胞が対象内にある、請求項９に記載の方法。
  11. ２個以上の膵臓β細胞の集団における小胞体ストレス由来アポトーシス細胞死を減少す
    るか遅延させる方法であって、膵臓β細胞の集団を、配列番号２に少なくとも８０％同一
    である配列を含む可溶性中脳星状細胞由来神経栄養因子（ＭＡＮＦ）またはアポモルヒネ
    の有効量と接触させることを含む、方法。
  12. 膵臓β細胞の集団が対象内にある、請求項１１に記載の方法。
  13. 対象がヒトである、請求項１〜４、８、１０および１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 対象における膵臓β細胞障害の処置の有効性をモニターする方法であって、
    第１の時点での対象由来の生体試料中の可溶性中脳星状細胞由来神経栄養因子（ＭＡＮ
    Ｆ）のレベルを決定し、
    第２の時点での対象由来の生体試料中の可溶性ＭＡＮＦのレベルを決定し、
    第２の時点での生体試料中の可溶性ＭＡＮＦのレベルを、第１の時点での生体試料中の
    可溶性ＭＡＮＦのレベルと比較する
    ことを含み、
    （ｉ）第１の時点が処置前であり、第２の時点が処置開始後の任意の時点であるか、（
    ｉｉ）第１の時点が処置開始後であり、第２の時点が処置中または処置後のより遅い時点
    であり、
    第１の時点での生体試料中の可溶性ＭＡＮＦのレベルと比較した第２の時点での生体試
    料中の可溶性ＭＡＮＦのレベルの減少が、対象での処置が有効であったことを示す、方法
    。
  15. 対象の膵臓β細胞障害の処置またはその発症の遅延に有用な候補化合物をスクリーニン
    グする方法であって、
    膵臓β細胞を準備し；
    膵臓β細胞を試験化合物と接触させ；
    試験化合物の存在下で膵臓β細胞によって産生される可溶性中脳星状細胞由来神経栄養
    因子（ＭＡＮＦ）のレベルを決定し；
    膵臓β細胞によって産生される可溶性ＭＡＮＦのレベルを可溶性ＭＡＮＦの基準レベル
    と比較し；
    基準レベルと比較した膵臓β細胞によって産生される可溶性ＭＡＮＦのレベルの増加に
    関連している化合物を、対象の膵臓β細胞障害を処置またはその発症を遅延させるための
    候補化合物として選択する
    ことを含む、方法。
  16. 基準レベルが候補薬剤の非存在下における膵臓β細胞によって産生される可溶性ＭＡＮ
    Ｆのレベルである、請求項１５に記載の方法。
  17. 基準レベルが可溶性ＭＡＮＦの閾値である、請求項１５に記載の方法。
  18. 対象の膵臓β細胞障害を処置またはその発症を遅延に有用な候補化合物をスクリーニン
    グする方法であって、
    ＢｉＰシグナル配列、酸化還元感受性蛍光タンパク質、およびアミノ酸配列ＫＤＥＬを
    含有するレポータータンパク質を発現する哺乳動物細胞を準備し；
    細胞を試験化合物と接触させ；
    細胞に存在する酸化型レポータータンパク質の量の決定し；
    細胞に存在する酸化型レポータータンパク質の量を基準レベルと比較し；
    基準レベルと比較して細胞中の酸化型レポータータンパク質のレベルの増加に関連する
    試験化合物を、対象の膵臓β細胞障害を処置またはその発症を遅延させるための候補化合
    物として選択する
    ことを含む、方法。
  19. 基準レベルが候補薬剤の非存在下における哺乳動物細胞に存在する酸化型レポータータ
    ンパク質の量である、請求項１８に記載の方法。
  20. 基準レベルが酸化型レポータータンパク質の閾値である、請求項１８に記載の方法。
  21. 対象の膵臓β細胞障害の処置またはその発症の遅延に有用な候補化合物をスクリーニン
    グする方法であって、
    ＢｉＰシグナル配列、酸化還元感受性蛍光タンパク質、およびアミノ酸配列ＫＤＥＬを
    含有するレポータータンパク質を発現する哺乳動物細胞を準備し；
    細胞を試験化合物と接触させ；
    細胞に存在する還元型レポータータンパク質の量の決定し；
    細胞に存在する還元型レポータータンパク質の量を基準レベルと比較し；
    基準レベルと比較して細胞中の還元型レポータータンパク質のレベルの減少に関連する
    試験化合物を、対象の膵臓β細胞障害を処置またはその発症を遅延させるための候補化合
    物として選択する
    ことを含む、方法。
  22. 基準レベルが候補薬剤の非存在下における哺乳動物細胞に存在する還元型レポータータ
    ンパク質の量である、請求項２１に記載の方法。
  23. 基準レベルが還元型レポータータンパク質の閾値である、請求項２１に記載の方法。
  24. 可溶性ＭＡＮＦに特異的に結合する抗体または抗原結合性抗体フラグメントと；
    インスリン、Ｃタンパク質および膵島アミロイドポリペプチドの群から選択されるタン
    パク質に結合する、少なくとも１つの抗体または抗原結合性抗体フラグメントと
    を含むキット。
  25. 配列番号２に少なくとも８０％同一である配列を含む可溶性ＭＡＮＦタンパク質または
    アポモルヒネと；
    膵臓β細胞障害を処置するための少なくとも１つの追加薬剤と
    を含む医薬組成物。
  26. 少なくとも１つの追加薬剤がインスリンである、請求項２５に記載の組成物。
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